KR20230148241A - 알로락토스의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주를 적용하여 알로락토스를 포함하는 조성물을 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알로락토스를 포함하는 식품의 제조를 위한 상기 균주의 용도 및 식품 중 알로락토스의 함량을 증가시키기 위한 상기 균주의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알로락토스 및 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주를 포함하는 식품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 알로락토스의 제조방법에 관한 것이다.
기능적이고 건강한 식품과 장내 미생물군에 미치는 이의 영향은 전 세계 소비자로부터 점점 더 많은 관심을 받고 있다.
기능성 식품은 영양소와 에너지를 제공하는 것 외에도 특정 생리적 반응을 강화하거나 질병 위험을 줄여 신체의 하나 이상의 목표 기능을 유익하게 조절하는 식이 품목으로 정의할 수 있다(Nicoletti, 2012).
장내 미생물총의 주목할 만한 특성으로는 기능성과 복원성이 있다. 장내 미생물총의 구성 및/또는 기능을 조절하기 위한 여러 전략이 제안되었다. 그러한 전략 중 하나는 프로바이오틱스 및 기타 살아있는 미생물, 프리바이오틱스 및 신바이오틱스와 같은 기능성 식품을 적용하여 장내 미생물총의 구성 및/또는 기능을 조절하는 것이다. 프리바이오틱스의 현재 과학적 정의는 "건강상의 이점을 제공하는 숙주 미생물에 의해 선택적으로 활용되는 기질"이다. 따라서 이 개념에는 물질, 생리학적으로 유익한 효과, 및 메커니즘이라는 세 가지 필수 부분이 포함된다.
프리바이오틱스 활성이 있는 갈락토올리고당(GOS) 비소화성 섬유. 이들은 비소화성 올리고당이며 2~20개의 갈락토스 분자와 1개의 글루코스 분자로 구성된다. GOS는 장내 유산균과 비피도박테리아의 증식을 자극하는 중요한 프리바이오틱스로 인식되고 있다. 따라서 이들은 건강상의 이점을 제공하는 다양한 위장 미생물(프로바이오틱스)의 성장 및/또는 활동을 선택적으로 자극하여 숙주에게 유익한 영향을 미친다. GOS는 일반적으로 비피도박테리아와 유산균의 증가 및 덜 바람직한 미생물의 감소를 포함하는 건강한 균형을 향한 결장 미생물총의 조절에 유용한 것으로 입증되었다.
알로락토스는 락토스와 유사한 이당류이며 일반적인 GOS로 간주된다. 이것은 락토스의 β1-4 결합 대신 β1-6 글리코시드 결합을 통해 연결된 단당류인 D-갈락토스와 D-글루코스로 구성된다. 알로락토스는 β-갈락토시다제에 의한 락토스의 트랜스글리코실화로 인해 발생할 수 있다.
전 세계 소비자의 기능성 및 건강 식품에 대한 수요가 높다는 점을 고려하여, 다양한 제품, 특히 신선한 유제품의 기능성 성분인 알로락토스와 같은 GOS를 생산하려는 식품 산업에 대한 상업적 관심이 커지고 있다. 알로락토스 자체의 생산도 중요하지만, 업계에는 더 큰 요구사항, 예를 들어 알로락토스가 제품에 적극적으로 첨가되는 것이 아니라 알로락토스가 실제로 제품에서 직접 생산되는. 신선한 유제품에 대한 수요가 훨씬 더 높다. GOS를 포함하는 신선한 유제품과 같은 식품에 더해, 건강한 식품은 저칼로리의 단맛이 나는 식품도 포함된다.
예를 들어 신선한 유제품과 같은 발효 식품의 설탕은 아스파탐, 아세설팜 K, 수크랄로스, 사카린과 같은 감미료로 대체되는 경우가 많아 칼로리 섭취를 낮추면서 단맛을 제공할 수 있다. 최근 몇 년 동안 인공 감미료의 단점에 대한 소비자 인식이 높아져 천연 감미료만 함유하거나 바람직하게는 감미료가 첨가되지 않은 발효유 제품에 대한 수요가 증가하였다. 신선한 유제품과 같이 자연적인(내재적인) 단맛이 높은 식품을 개발하는 것은 특별한 도전이 되고 있다.
상기에 기초하여, (i) 알로락토스 및 (ii) 증가된 천연 단맛을 동시에 포함하고, 알로락토스 함량 및 증가된 천연의 단맛이 주로 발효 중에 제품에서 직접 생성되는, 신선한 유제품과 같은 발효 식품을 얻을 수 있는 방법을 제공할 필요가 있다.
발명의 요약
상기 목적은 특히 적어도 하나의 글루코스 결핍 유산균 균주를 사용함으로써 알로락토스를 포함하는 조성물을 얻는 방법을 제공하는 본 발명에 의해 달성된다. 본 발명은 또한 상기 균주를 사용하여 발효 식품, 특히 알로락토스를 포함하는 신선한 유제품과 같은 조성물을 얻는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 알로락토스 및 상기 균주를 포함하는 조성물, 및 상기 균주를 사용하여 조성물에서 알로락토스의 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
따라서, 한 측면에서 본 발명은 알로락토스를 포함하는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음 단계, 즉:
a) 락토스를 포함하는 기질에 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주를 접종하는 단계로서, 여기서, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 것인 단계; 및
b) 상기 접종된 기질을 발효시켜 알로락토스를 포함하는 조성물을 얻는 단계
를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻은 알로락토스를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 적어도 0.04% w/w 알로락토스를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 여기서 상기 조성물은 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주를 추가로 포함하되, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 기인한다.
본 발명의 또 다른 측면은 알로락토스를 포함하는 조성물의 제조를 위한 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주의 용도에 관한 것으로, 여기서 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 기인한다.
본 발명의 추가 측면은 조성물 중 알로락토스의 함량을 증가시키기 위한 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주의 용도에 관한 것으로, 여기서 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 기인한다.
본 발명을 더욱 상세하게 설명하기에 앞서, 일련의 용어 및 관례를 먼저 정의한다:
"속(genus)"이라는 용어는 웹사이트 www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy에 정의된 속을 의미한다. 본원에 사용된 박테리아 "균주(strain)"는 성장하거나 증식할 때 유전적으로 변하지 않은 채로 남아 있는 박테리아를 의미한다. 다수의 동일한 박테리아가 포함된다.
본 발명의 문맥상, 용어 "돌연변이체" 또는 "돌연변이 균주"는 예를 들어 유전 공학, 방사선 및/또는 화학적 처리에 의해 본 발명의 균주(또는 모 균주)로부터 유래된 균주, 또는 유래될 수 있는 균주로 이해되어야 한다. 돌연변이체는 그것이 유래된 균주와 기능적으로 동등한, 즉, 예를 들어 질감, 전단 응력, 점도, 겔 견고성, 구강태 코팅(mouth coating), 향미, 산성화 후, 산성화 속도 및/또는 파지 견고성 등의 기타 특성과 관련하여 실질적으로 동일하거나 개선된 특성을 갖는 돌연변이체인 것이 바람직하다. 이러한 돌연변이체는 본 발명의 일부이다. 특히, "돌연변이체"라는 용어는 본 발명의 균주를 에탄 메탄 설포네이트(EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(NTG)과 같은 화학적 돌연변이 유발물질, 자외선르로 처리하는 것을 포함하여 통상적으로 사용되는 임의의 돌연변이 유발 처리를 하여 얻은 균주, 또는 자발적으로 발생하는 돌연변이체를 의미한다. 돌연변이체는 여러 번의 돌연변이 유발 처리를 받았을 수 있지만 (단일 처리는 한 번의 돌연변이 유발 단계에 이어 스크리닝/선택 단계가 뒤따르는 것으로 이해되어야 함), 현재로서는 20회 이하, 10회 이하 또는 5회 이하(또는 스크리닝/선택 단계)로 처리되는 것이 바람직하다. 현재 바람직한 돌연변이체에서는, 모균주와 비교하여 다른 뉴클레오티드로 이동되거나 결실된 박테리아 게놈 내 뉴클레오티드는 5% 미만, 1% 미만 또는 심지어 0.1% 미만이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 돌연변이체는 모균주일 수도 있다.
본 맥락에서, 용어 "변이체" 또는 "변종 균주"는 본 발명의 균주와 기능적으로 동등한 균주, 예를 들어 질감, 산성화 속도, 점도, 겔 견고성, 구강내 코팅, 향미, 산성화 후 및/또는 파지 견고성과 같은 속성 또는 특징이 실질적으로 동등하거나 개선된 균주로 이해되어야 한다. 적절한 스크리닝 기술을 사용하여 식별할 수 있는 이러한 변이체는 본 발명의 일부이다.
본 발명의 목적을 위해, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 정도는, 바람직하게는 버전 3.0.0 이상의 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. (2000) Trends in Genetics 16: 276-277)의 Needle 프로그램에서 실행되는 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 결정된다. 사용되는 선택적 매개변수는 갭 개방 페널티 10, 갭 확장 페널티 0.5 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 행렬이다. "가장 긴 동일성"(-no brief 옵션을 사용하여 얻은)이라고 표시되는 Needle의 아웃풋이 동일성 백분율로 사용되며 다음과 같이 계산된다:
(동일한 잔기 x 100) / (정렬 길이 - 정렬의 총 간격 수)
본 명세서 및 청구범위에서는 아미노산 잔기에 대한 통상적인 한 글자 및 세 글자 코드가 사용된다. 참조의 편의를 위해, 본 발명의 돌연변이체 및 변이체의 아미노산 변경은 다음 명명법을 사용하여 기술된다: 모 효소의 아미노산 잔기; 위치; 치환된 아미노산 잔기(들). 이 명명법에 따르면, 예를 들어 위치 20의 알라닌 잔기가 글리신 잔기로 치환되는 것은 Ala20Gly 또는 A20G로 표시된다. 동일한 위치의 알라닌 결실은 Ala20* 또는 A20*으로 표시된다. 추가 아미노산 잔기(예컨대 글리신)의 삽입은 Ala20AlaGly 또는 A20AG로 표시된다. 연속적인 아미노산 잔기의 결실(예를 들어 위치 20의 알라닌과 위치 21의 글리신 사이의 결실)은 DELTA(Ala20-Gly21) 또는 DELTA(A20-G21)로 표시된다. 모 효소 서열이 그러한 위치(예를 들어, 결실된 위치 20의 알라닌)에 삽입 번호를 매기는 데 사용된 효소 서열과 비교하여 결실을 포함하는 경우 *20Ala 또는 *20A로 표시된다. 여러 돌연변이는 더하기 기호나 슬래시로 구분된다. 예를 들어, 알라닌과 글루탐산을 각각 글리신과 세린으로 대체하는 위치 20과 21의 두 돌연변이는 A20G+E21S 또는 A20G/E21S로 표시된다. 주어진 위치의 아미노산 잔기가 2개 이상의 대체 아미노산 잔기로 치환되는 경우, 이들 잔기는 쉼표 또는 슬래시로 구분된다. 예를 들어, 위치 20의 알라닌이 글리신 또는 글루탐산으로 치환된 것은 A20 G,E 또는 A20G/E, 또는 A20G, A20E로 표시된다. 변형에 적합한 위치가 임의의 특정 변형이 제안되지 않은 채 본원에서 확인되는 경우, 임의의 아미노산 잔기가 해당 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 대체할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어, 위치 20의 알라닌의 변형이 언급되었지만 명시되지 않은 경우, 알라닌은 결실되거나 임의의 다른 아미노산 잔기(즉, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V)로 치환될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 맥락에서, 유전자의 돌연변이(유전자 돌연변이)는 유기체의 표현형에 변화를 초래하는, 상기 유기체 게놈의 뉴클레오티드 서열의 변경으로 이해되어야 하며, 여기서 변경은, 뉴클레오티드의 결실, 다른 뉴클레오티드에 의한 뉴클레오티드의 치환, 뉴클레오티드의 삽입, 또는 프레임시프트일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 결실은 유기체 게놈의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드의 제거를 초래하는 유전적 돌연변이로 이해되어야 하며; 삽입은 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드를 추가하는 것으로 이해되어야 하고; 치환(또는 점 돌연변이)은 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환되는 유전적 돌연변이로 이해되어야 하며; 프레임시프트는 3으로 나눌 수 없는 뉴클레오티드 서열에서 다수의 뉴클레오티드가 삽입 또는 삭제되어 판독 프레임이 변경되어 원래 판독 프레임과 완전히 다른 번역이 발생함으로써 발생하는 유전적 돌연변이로 이해된다; 정지 코돈의 도입은 조기 정지 코돈을 초래하는 DNA 서열의 점 돌연변이로 이해되어야 하며; 인코딩된 단백질의 기질 결합의 억제는 기질이 단백질의 촉매 부위에 결합하는 것을 방지하는 단백질 서열의 변화를 초래하는 뉴클레오티드 서열의 임의의 돌연변이로 이해되어야 한다. 더욱이, 녹아웃 돌연변이는 유기체의 게놈으로부터 전체 유전자 또는 전체 오픈 리딩 프레임과 같은 유전자의 제거 또는 결실을 초래하는 유전적 돌연변이로 이해되어야 한다.
본 명세서의 설명 및 청구범위에서는 전술한 아미노산 명명법에 대해 설명된 것과 유사한 원칙에 따라 뉴클레오티드에 대한 전통적인 한 글자 코드가 사용된다.
서열을 정렬하고 이들 사이의 서열 동일성 정도를 결정하는 알고리즘은 해당 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 목적을 위해, 표준 매개변수를 적용하여 미국 국립 생명공학 정보 센터(NCBI)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)에 의해 제공되는 blastn을 사용하여 뉴클레오티드 서열을 정렬하기 위한 프로세스가 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "돌연변이 박테리아" 또는 "돌연변이 균주"는 야생형 DNA에는 없는 게놈(DNA)에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 천연(자발적, 자연 발생) 돌연변이 박테리아 또는 유도된 돌연변이 박테리아를 의미한다. "유도된 돌연변이체"는 화학적 돌연변이원, UV 또는 감마 방사선 등을 이용한 처리와 같은 인위적 처리에 의해 돌연변이가 유도된 박테리아이다. 이에 반해, "자발적 돌연변이체" 또는 "자연 발생 돌연변이체"는 돌연변이가 인간에 의해 유발되지 않은 것이다. 여기서 돌연변이 박테리아는 비-GMO(비유전자 변형 유기체), 즉 재조합 DNA 기술에 의해 변형되지 않은 것이다.
알로락토스는 β1-6 글리코시드 결합을 통해 연결된 단당류 D-갈락토스와 D-글루코스로 구성된 이당류로 이해되어야 한다.
프럭토스, 갈락토스, 글루코스, 수크로스, 락토스 및 알로락토스의 양은 실시예 1에 개시된 바와 같이 측정된다.
락토바실러스 속의 균주와 관련하여, "CFU"라는 용어는 37℃에서 3일 동안 혐기성 조건에서 배양된 MRS 한천 플레이트에서의 성장(콜로니 형성)에 의해 구해지는 콜로니 형성 단위를 의미한다. MRS 한천의 조성은 다음과 같다(g/l):
박토 프로 테오스 펩톤 3호: 10.0
박토 쇠고기 추출물: 10.0
박토 효모 추출물: 5.0
글루코스: 20.0
소르비탄 모노올리에이트 복합체: 1.0
구연산암모늄: 2.0
아세트산나트륨: 5.0
황산마그네슘: 0.1
황산망간: 0.05
이염기성 인산칼륨: 2.0
박토 한천: 15.0
Milli-Q 물: 1000ml.
L. 람노서스, L. 카세이 및 L. 파라카세이의 경우 pH를 6.5로 조정한다. 기타 모든 락토바실러스 종의 경우, pH는 5.4로 조정된다. 특히 L. 델브루에키 subsp., 불가리쿠스; L. 아시도필러스 및 L. 헬베티쿠스의 경우, pH는 5.4로 조정된다. L. 람노서스, L. 카세이 및 L. 파라카세이의 경우, pH는 6.5로 조정된다.
S. 써모필러스(S. thermophilus)와 관련하여, "CFU"라는 용어는 37℃에서 3일 동안 호기성 조건에서 배양된 M17 한천 플레이트에서의 성장(콜로니 형성)에 의해 결정되는 콜로니 형성 단위를 의미한다. M 17 한천의 조성은 다음과 같다(g/l):
트립톤: 2.5g
고기의 소화물(peptic digest): 2.5g
대두박의 소화물(papaic digest): 5.0g
효모 추출물: 2.5g
고기 추출물 : 5.0g
락토스: 5.0g
나트륨- 글리세로 -인산염: 19.0g
황산마그네슘, 7 H2 0: 0.25g
아스코르브산: 0.5g
한천: 15.0g
Milli-Q 물: 1000ml.
pH는 최종 pH 7.1±0.2(25℃)로 조정된다.
본원에 사용된 용어 "유산균"은 주로 생성되는 산인 젖산, 아세트산 및 프로피온산을 비롯한 산을 생성하면서 당을 발효시키는 그람 양성, 미호기성(microaerophilic) 또는 혐기성 세균을 지칭한다. 산업적으로 가장 유용한 유산균은 "Lactobacillales" 목에서 발견되며, 여기에는 락토코커스 spp., 스트렙토코커스 spp., 락토바실러스 spp., 류코노스톡 spp., 페디오코커스 spp., 브레비박테리움 spp., 엔테로코커스 spp., 프로피오니박테리움 spp가 포함된다. 락토바실러스 sp. 종 스트렙토코커스 써모필러스 종의 박테리아를 포함한 유산균은 일반적으로 대량 스타터 증식을 위한 냉동 또는 동결 건조 배양물로서 또는 발효유 제품과 같은 유제품 생산을 위해 발효 용기나 통(vat)에 직접 접종하기 위한 소위 "Direct Vat Set" (DVS) 배양체로서 낙농 산업에 공급된다. 이러한 배양체는 일반적으로 "스타터 컬쳐" 또는 "스타터"라고 한다.
본 발명자들은 놀랍게도 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주를 적용하여 알로락토스를 포함하는 조성물을 얻는 방법을 발견하였으며, 여기서 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK의 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 발생하는 것으로 이에 의해 알로락토스를 얻는 것이 놀랍게도 가능하였다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 알로락토스를 포함하는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음 단계, 즉:
a) 락토스를 포함하는 기질에 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주를 접종하는 단계로서, 여기서, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 것인 단계; 및
b) 상기 접종된 기질을 발효시켜 알로락토스를 포함하는 조성물을 얻는 단계
를 포함한다.
L. 불가리쿠스와 관련하여 본 명세서에서 "2-데옥시글루코스에 대해 내성"이라는 용어는 특정 돌연변이 박테리아 균주가 20mM 2-데옥시글루코스를 함유하는 M17 배지 플레이트에 스트리킹되어 40℃에서 20 시간 동안 인큐베이션된 후 콜로니로 성장할 수 있는 능력을 갖는 것으로 정의된다. 배양 배지에 2-데옥시글루코스가 존재하면 돌연변이되지 않은 균주의 성장을 방지하는 반면, 돌연변이된 균주의 성장은 영향을 받지 않거나 크게 영향을 받지 않는다. 따라서 선택 목적을 위해 2-데옥시글루코스를 선택 과정에 적용할 수 있다.
본 문맥에서 용어 "갈락토스 양성 균주", "gal 양성 균주" 또는 "gal+ 균주"는 갈락토스를 대사할 수 있는 균주/갈락토스에서 성장할 수 있는 균주/성장을 위해 갈락토스를 활용할 수 있는 균주로 정의된다. 갈락토스는 락토스의 가수분해 또는 갈락토스의 세포 내 수송을 통해 얻을 수 있다.
본 문맥에서 "갈락토오스 발효 균주" 또는 "gal-발효 균주"라는 용어는 유일한 탄수화물로서 2% 갈락토오스가 첨가된 M17에 최소 104개 세포/ml의 양으로 접종되어 37℃에서 16시간 배양시, pH를 1.0 이상 감소시키는 균주로 정의된다.
galK 유전자에 의해 인코딩된 갈락토키나제는 α-갈락토스를 갈락토스-1-인산염으로 전환시키는 갈락토스 대사를 위한 Leloir 경로의 효소이다.
본 명세서에서 사용된 "돌연변이가 글루코키나제 단백질을 불활성화시킨다"는 표현은 "불활성화된 글루코키나제 단백질", 즉 세포 내에 존재하는 경우 정상적인 기능을 발휘할 수 없는 글루코키나제 단백질을 초래하는 돌연변이뿐만 아니라 글루코키나제 단백질의 형성을 방해하거나 글루코키나제 단백질의 분해를 초래하는 돌연변이를 의미한다. 특히, 불활성화된 글루코키나제 단백질은 기능성 글루코키나제 단백질에 비해 글루코스가 글루코스-6-인산으로의 인산화를 촉진하지 못하거나, 현저히 감소된 속도로 글루코스의 글루코스-6-인산으로의 인산화를 촉진하는 단백질이다. 기능성 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 유전자와 비교하여 이러한 불활성화된 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 유전자는 유전자의 ORF(오픈 리딩 프레임)에 돌연변이를 포함하며, 상기 돌연변이는 결실, 프레임시프트 돌연변이, 단백질의 기능적 특성을 변화시키는 아미노산 치환을 초래하는 정지 코돈 또는 돌연변이의 도입, 또는 유전자의 전사 또는 번역을 감소시키거나 폐지하는 프로모터 돌연변이를 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "기능성 글루코키나제 단백질"은 세포에 존재하는 경우 글루코스의 글루코스-6-포스페이트로의 인산화를 촉진하는 글루코키나제 단백질을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 돌연변이는 글루코키나제 단백질의 활성(글루코스에서 글루코스-6-포스페이트로의 인산화율)을, glcK 유전자의 DNA 서열에 돌연변이가 없는 균주와 비교할 때 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 감소시킨다.
따라서, 인코딩된 글루코키나제 단백질이 돌연변이로 인해 불활성되는 경우, glcK 유전자의 DNA 서열에 돌연변이를 보유하지 않는 S. 써모필러스 균주와 비교할 때 단백질의 활성이 100% 감소된다. 반면에 돌연변이가 유전자 발현에 부정적인 영향을 미치는 경우 글루코키나제 단백질의 활성은 glcK 유전자의 DNA 서열에 돌연변이를 보유하지 않는 S. 써모필러스 균주와 비교할 때 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90%, 또는 적어도 95% 감소한다.
글루코키나제 활성은 문헌 [Pool 외, (2006) Metabolic Engineering 8; 456-464]에 의해 기술된 글루코키나제 효소 분석에 의해 결정될 수 있다.
본 방법은 다음 단계를 더 포함하는 것이 바람직할 수 있다 :
c) 알로락토스를 포함하는 조성물을 농축하여 농축 전의 조성물에 비해 알로락토스의 양이 증가된 조성물을 얻는 단계.
단계 c)의 농축은 비제한적인 예로서 정용여과, 막 여과, 원심분리, 침강, 증발 및/또는 크로마토그래피와 같은 여과를 사용하여 수행할 수 있으며, 당업계에 적용 가능한 임의의 방법을 이러한 목적으로 사용할 수 있다.
알로락토스의 적용에 따라, 방법은 다음 단계를 추가로 포함할 수 있다:
d) 알로락토스를 포함하는 조성물을 정제하여 정제 전의 조성물에 비해 알로락토스의 순도가 증가된 조성물을 얻는 단계.
정제는 비제한적인 예로서 정용여과, 막 여과, 원심분리, 침강, 증발 및/또는 크로마토그래피와 같은 여과를 사용하여 수행할 수 있으며, 당업계에 적용 가능한 임의의 방법을 이러한 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명에 의해 얻어지는 알로락토스를 포함하는 조성물은 발효식품, 보다 구체적으로는 발효유제품 등의 발효물일 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주는 갈락토스 양성이다.
일 구현예에서, 하나 이상의 하나 이상의 글루코스-결핍 유산균 균주는 갈락토키나제 단백질을 인코딩하는 galK 유전자에 돌연변이를 보유한다.
일 구현예에서, 하나 이상의 글루코스-결핍 유산균 균주는 갈락토스-발효성이다.
하나 이상의 글루코스-결핍 유산균 균주는 글루코스의 세포 내로의 수송을 감소시키거나 불활성화시키는 돌연변이를 보유하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 유산균은 글루코스의 세포 내로의 수송을 감소시키거나 불활성화시키는 돌연변이를 보유하는 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus)이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포 내로의 글루코스 수송을 감소시키는 돌연변이"는 글루코스 수송에 관여하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 돌연변이를 의미하며, 이는 세포 환경에 글루코스가 축적되는 결과를 가져온다. S. 써모필러스 균주 또는 L. 불가리쿠스 균주의 배양 배지 내 글루코스 수준은 당업자에게 공지된 방법에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "돌연변이가 글루코스 수송체를 불활성화한다"라 함은 "불활성화된 글루코스 수송체", 즉 세포에 존재하는 경우 정상적인 기능을 발휘할 수 없는 글루코스 수송체 단백질을 초래하는 돌연변이 뿐만 아니라, 글루코스 수송 단백질의 형성을 방해하거나 글루코스 수송 단백질의 분해를 초래하는 돌연변이를 의미한다.
하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주는 또한 글루코스 수송체의 성분을 인코딩하는 유전자에 돌연변이를 보유할 수 있으며, 여기서 돌연변이는 글루코스 수송체를 감소시키거나 불활성화시키거나 유전자의 발현에 부정적인 영향을 미친다.
본 명세서에 사용된 용어 "기능성 글루코스 수송 단백질"은 세포에 존재하는 경우 원형질막을 통한 글루코스 수송을 촉진하는 글루코스 수송 단백질을 의미한다.
용어 "글루코스-결핍"은 세포 성장 또는 세포 생존력 유지를 위한 공급원으로서 글루코스를 사용하는 능력을 부분적으로 또는 완전히 상실한 유산균(LAB)을 특성화하기 위해 본 발명의 맥락에서 사용된다. 글루코스 대사의 각각의 결핍은 예를 들어 글루코키나제 단백질 및/또는 글루코스 흡수를 담당하는 글루코스 수송 단백질의 발현 또는 활성을 억제하거나 불활성화시키는 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다.
글루코스 대사가 부족한 LAB는 락토스를 탄수화물 공급원으로 사용하여 배양할 때 배양 배지의 글루코스 농도를 증가시킬 수 있다. 글루코스의 증가는 글루코스 결핍 LAB의 글루코스 분비로 인해 발생한다. 배양 배지 내 글루코스 농도의 증가는 예를 들어 Dionex CarboPac PA 20 3* 150mm 컬럼 (Thermo Fisher Scientific, 품번 060142)을 사용하여 HPLC 분석으로 확인할 수 있다.
용어 "글루코스-발효"는 세포 성장을 위한 공급원으로서 글루코스를 사용하거나 세포 생존력을 유지하는 능력을 부분적으로 또는 완전히 유지하는 LAB를 특성화하기 위해 본 발명의 맥락에서 사용된다.
따라서, S. 써모필러스 균주 및/또는 일부 락토바실러스 균주와 같은 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주는 갈락토스와 글루코스를 모두 발효할 수 있다. 한 균주가 갈락토스와 글루코스를 모두 발효할 수 있는 경우, 이 균주가 세포 내로 글루코스의 수송을 감소시키거나 불활성화시키는 돌연변이를 보유하는 것이 바람직할 수 있다. 이들 균주는 락토스를 포함하는 기질에서 배양시, 글루코스 대사를 위해 글루코스를 우유 공급원으로부터 세포로 수송하지 않거나 적어도 낮은 정도로 수송하며 - 이와 반대로, 락토스를 세포 내로 수송하여, 이를 글루코스와 갈락토스로 대사하고, 갈락토스를 추가로 대사하여 글루코스를 환경으로 분비하여 배양 배지의 글루코스 농도를 더욱 증가시키고 이에 따라 제품의 "본질적인 단맛"도 증가시킨다.
마찬가지로, 하나 이상의 글루코스-결핍 유산균 균주가 글루코스/만노스 포스포트랜스퍼라제 시스템을 코딩하는 DNA 서열에 돌연변이를 보유하는 것이 바람직할 수 있다.
보다 구체적인 구현예에서, 비제한적인 예로서 S. 써모필러스 균주와 같은 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주는 PTS 만노스/글루코스/프럭토스 서브유닛 IIC(글루코스/만노스 포스포트랜스퍼라제 시스템의 IIC Man 단백질로도 지칭될 수 있으며, 따라서 이 두 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용됨)를 인코딩하는 manM 유전자의 DNA 서열에 돌연변이를 가지며, 여기서 돌연변이는 IICMan 단백질을 불활성화시키거나 유전자 발현에 부정적인 영향을 미친다. 바람직한 구현예에서, 돌연변이는 그러한 돌연변이가 없는 세포와 비교할 때 세포 내로의 글루코스의 수송을 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 감소시킨다.
세포 내로의 글루코스 수송은 문헌 [Cochu et al. (2003) Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432]에 의해 기술된 글루코스 흡수 분석에 의해 결정될 수 있다.
추가 구현예에서 비제한적인 예로서 S. 써모필러스 균주와 같은 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균은, 106 - 107 CFU/ml 농도로 우유 기질에 접종되어 43℃에서 18시간 동안 배양시 알로락토스를 적어도 0.04% w/w 우유에 해당하는 양으로 생산할 수 있으며, 여기서 우유 기질은 4% 단백질, 1.5% 지방 및 0.1% 첨가된 수크로스를 포함한다. 우유 기질은 실시예 1에 개시된 바와 같이 제조되었다.
추가 구현예에서 비제한적인 예로서 S. 써모필러스 균주와 같은 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균은, 적어도 하나의 추가 유산균 균주(혼합 컬쳐)와 함께 106 - 107 CFU/ml 농도로 우유 기질에 접종되어 43℃에서 pH 4.55에 이를 때까지 배양시 알로락토스를 적어도 0.04% w/w 우유에 해당하는 양으로 생산할 수 있으며, 여기서 우유 기질은 4% 단백질 및 1.5% 지방을 포함한다. 우유 공급원은 실시예 2에 개시된 바와 같이 제조된다.
일 구현예에서, 하나 이상의 글루코스 결핍 균주는: 스트렙토코커스 및 락토바실러스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서 스트렙토코커스는 스트렙토코커스 써모필러스이다.
또 다른 구현예에서 락토바실러스는 락토바실러스 델브루에키 아종, 불가리쿠스, 락티카세이바실러스 람노서스 및 락토바실러스 헬브티쿠스, 락티카세이바실러스 파라카세이 아종 파라카세이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 일 구현예에서 스트렙토코커스는 스트렙토코커스 서모필러스이고 락토바실러스는 락토바실러스 델브루에키 아종. 불가리쿠스이다.
바람직한 일 구현예에서, 글루코스-결핍 S. 써모필러스는 DSM 25850, DSM 26722, DSM 28889, DSM 33719, DSM 32227 및 DSM 33762 및 그로부터 유래된 돌연변이 균주로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 돌연변이 균주는 기탁된 균주 중 하나를 출발 물질로 사용하여 수득되며, 돌연변이체는 상기 기탁된 균주의 락토스 발효 특성 및/또는 글루코스 분비 특성을 유지하거나 추가로 개선한다.
락토바실러스 델브루에키 아종. 불가리쿠스와 같은 글루코스 결핍 락토바실러스는 9.5% B 우유에 106-107 CFU/ml의 농도로 접종되어 40℃에서 최소 20시간 배양시, 9.5% B 우유에서 알로락토스를 적어도 0.04% w/w B 우유의 양으로 생산한다.
마찬가지로, 락토바실러스 델브루에키 아종. 불가리쿠스와 같은 글루코스 결핍 락토바실러스는 적어도 하나의 추가 유산균 균주(혼합 컬쳐)와 함께 9.5% B 우유에 106-107 CFU/ml의 농도로 접종되어 40℃에서 최소 20시간 배양시, 9.5% B 우유에서 알로락토스를 적어도 0.04% w/w B 우유의 양으로 생산한다.
본 발명에 따른 방법에서는 하나 이상의 글루코스 결핍 S. 써모필러스 및/또는 적어도 하나의 글루코스 결핍 L. 불가리쿠스 균주를 하나 이상의 비-글루코스 결핍 S. 써모필러스 균주 또는 적어도 하나의 비-글루코스 결핍 L. 불가리쿠스 균주와 함께 a) 단계에서 접종하는 것을 고려할 수 있으며 여기서 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발된다.
요구르트와 같은 유제품과 같은 조성물의 신맛, 맛, 질감의 최상의 조합을 얻기 위해 S. 써모필러스와 L. 불가리쿠스의 조합이 종종 적용된다.
본 발명의 방법의 단계 a)에서 기질에 다음을 접종하는 것을 고려할 수 있다:
i. DSM 25850, DSM 26722, DSM 28889 and DSM 28910DSM 28910, DSM 32227 and DSM 33762;
ii. DSM 25850, DSM 26722, DSM 28889, DSM 28910 및 DSM 33720; 또는
iii. DSM 28910, DSM 32227 및 DSM 33719.
마찬가지로, 본 발명의 조성물은 다음을 포함하는 것으로 고려될 수 있다:
i. DSM 25850, DSM 26722, DSM 28889 및 DSM 28910;
ii. DSM 28910, DSM 32227 및 DSM 33762;
iii. DSM 25850, DSM 26722, DSM 28889, DSM 28910 및 DSM 33720; 또는
iv. DSM 28910, DSM 32227 및 DSM 33719.
프로바이오틱 박테리아 균주가 발효 전 또는 후에 본 발명의 방법에 첨가될 수 있다. 발효 전에 첨가될 경우 프로바이오틱 박테리아 균주는 발효 박테리아로도 작용한다.
"프로바이오틱 박테리아"라 함은 소비자에게 건강증진 효과를 얻을 목적으로 적당량을 섭취하여 소비자에게 투여하는 생존 가능한 박테리아를 말한다. 프로바이오틱 박테리아는 섭취 후 위장관 상태 에서 생존할 수 있으며 소비자의 장에 정착할 수 있다.
락토바실러스 속 분류법은 2020년에 업데이트되었다. 새로운 분류법은 Zheng et al. 2020에 설명되어 있으며 달리 명시하지 않는 본 발명에서도 이를 이용한다. 본 발명의 목적 상, 본 발명과 관련된 일부 락토바실러스 종의 신구 명칭을 아래 표에 나타내었다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 프로바이오틱 균주는 락토바실러스 아시도필러스, 락티카세이바실러스 파라카세이, 락티카세이바실러스 람노서스, 락티카세이바실러스 카세이, 락토바실러스 델브루에키, 락토바실러스 락티스, 락티플란티바실러스 플란타룸, 리모시락토바실러스 류테리 및 락토바실러스 존스니와 같은 락토바실러스 속, 비피도박테리움 롱엄, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레비, 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 비피도박테리움 덴티움, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 앙굴라툼, 비피도박테리움 마그눔, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 및 비피도박테리움 인판티스와 같은 비피도박테리움 속 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 프로바이오틱 락토바실러스 균주는 락토바실러스 아시도필러스, 락티카세이바실러스 파라카세이, 락티카세이바실러스 람노서스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 델브루에키, 락토바실러스 락티스, 락티플란티바실러스 플란타룸, 리모시락토바실러스 류테리 및 락토바실러스 존스니로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 프로바이오틱 균주는 DSM 13241로 기탁된 락토바실러스 아시도필러스 (LA-5®) 이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 프로바이오틱 락토바실러스 균주는 락티카세이바실러스 람노서스 균주 및 락티카세이바실러스 파라카세이 균주로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 특정 구현예에서, 프로바이오틱 균주는 ATCC 53103으로 기탁된 락티카세이바실러스 바실러스 균주 LGG®이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 프로바이오틱 균주는 ATCC 55544로 기탁된, 락티카세이바실러스 파라카세이 균주 CRL 431이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 프로바이오틱 비피도박테리움 균주는 비피도박테리움 롱엄, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레비, 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 비피도박테리움 덴티움, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 앙굴라툼, 비피도박테리움 마그눔, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 및 비피도박테리움 인판티스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 특정 구현예에서, 프로바이오틱 비피도박테리움 프로바이오틱 균주는 DSM 15954로 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 BB-12®이다.
알로락토스를 포함하는 조성물의 성질에 따라, 락토스를 포함하는 기질이 동물 및/또는 식물 유래 기질인 것이 바람직할 수 있다. 락토스를 포함하는 기질은 우유 기질과 같은 유제품 기질인 것이 바람직할 수 있다.
"우유(milk)"라는 용어는 소, 양, 염소, 물소 또는 낙타와 같은 포유동물의 젖을 짜서 얻은 젖 분비물로 이해되어야 한다. 바람직한 구현예에서, 우유는 소젖이다. 우유라는 용어에는 부분적으로 또는 전적으로 식물 재료로 만들어진 단백질/지방 용액도 포함된다.
예를 들어, 콩과 식물(예컨대 대두), 견과류(예컨대 코코넛), 곡물(예컨대 귀리)에서 추출한 식물성 우유를 사용하여 우유 성분을 부분적으로 식물 재료로 대체할 수 있다.
"콩과 식물"이라는 용어는 콩과(Fabaceae family)에 속하는 모든 식물을 의미한다. 콩은 일반적으로 콩과, 완두콩과, 콩과 또는 펄스과로 알려진 크고 경제적으로 중요한 꽃 식물 과이다. 다양한 콩류를 섭취할 수 있다. 콩과 식물에는 일반적으로 콩과 식물의 씨앗이 익었을 때 두 개의 봉합선을 따라 열리는 꼬투리 또는 껍질이 있다.
본 명세서에 사용된 "견과류"라는 용어는 나무나 관목에서 나온 진정한 견과류이거나, 핵과성 견과류이거나 견과류와 유사한 씨앗일 수 있는 요리용 견과류일 수 있다. 식물 용어로, 견과류는 열매가 열리지 않는 건조한 씨앗 하나짜리 과일 이다(즉, 씨앗이 성숙시 명확한 솔기를 따라 갈라지지 않음). 요리용 견과류는 식물학적으로 견과류로 분류되지는 않지만 비슷한 모양과 요리 역할을 하는 견과류이다. 많은 요리용 견과류는 여기서 핵과성 견과류라고 불리는 핵과의 씨앗이다. 핵과는 외부의 다육질 부분이 단일 껍질(구덩이 또는 돌)로 굳어진 내과피를 둘러싸고 내부에 씨앗이 들어 있는 열리지 않는 과일이다. 핵과 견과류는 핵과의 씨앗이다.
"곡물(cereal)"이라는 용어는 진정 곡류와 슈도곡물(Pseudocereal)을 모두 의미한다. 진정곡물은 벼과(Poaceae family)의 식물 씨앗을 의미한다. 슈도곡물은 벼과에 속하지 않지만 곡물과 거의 같은 방식으로 사용되는 식물의 씨앗이다.
기질이 전적으로 식물 유래 기질인 경우, 락토스를 포함하는 기질을 얻기 위해 락토스를 첨가한다. 락토스은 낙농 산업의 일 측면으로부터 얻을 수 있다.
"우유 기질"이라는 용어는 본 발명의 방법에 따라 발효될 수 있는 임의의 원유 및/또는 가공 우유 물질일 수 있다. 따라서, 유용한 우유 기질에는 전유 또는 저지방 우유, 탈지유, 버터밀크, 환원 분유, 농축 우유, 분유, 유청과 같은 단백질을 포함하는 우유 또는 우유 유사 제품의 용액/현탁액, 유청 퍼미에이트, 락토스, 락토스 결정화로 인한 모액, 유청 단백질 농축물 또는 크림이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 분명히, 우유 기질은 임의의 포유동물, 예를 들어 실질적으로 순수한 포유류 우유로부터 유래될 수 있거나, 재구성 분유 또는 우유 기질은 식물 재료로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 우유 기질 내 단백질의 적어도 일부는 (i) 포유동물 우유에서 자연적으로 발생하는 단백질, 예를 들어 카제인 또는 유장 단백질 또는 (ii) 식물성 우유에서 자연적으로 발생하는 단백질이다. 그러나 단백질의 일부는 우유에서 자연적으로 발생하지 않는 단백질일 수 있다.
발효에 앞서, 우유 기질은 당업계에 공지된 방법에 따라 균질화되고 저온살균될 수 있다.
본원에 사용된 "균질화"는 가용성 현탁액 또는 에멀젼을 얻기 위해 집중적으로 혼합하는 것을 의미한다. 발효 전에 균질화를 실시할 경우에는 유지방을 더 작은 크기로 쪼개어 우유와 더 이상 분리되지 않도록 균질화를 실시할 수도 있다. 이는 작은 구멍을 통해 우유를 고압으로 밀어냄으로써 달성될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "저온살균"은 미생물과 같은 살아있는 유기체의 존재를 감소시키거나 제거하기 위해 우유 기질을 처리하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 특정 기간 동안 특정 온도를 유지함으로써 저온살균이 달성된다. 지정된 온도는 일반적으로 가열을 통해 달성된다. 유해 박테리아 등 특정 박테리아를 사멸하거나 불활성화시키기 위해 온도와 지속 시간을 선택할 수 있다. 급속 냉각 단계가 이어질 수 있다.
발효유 제품의 생산에 사용되는 발효 공정은 잘 알려져 있으며, 당업자는 온도, 산소, 미생물(들)의 양 및 특성 및 공정 시간과 같은 적합한 공정 조건을 선택하는 방법을 알 것이다. 분명히, 발효 조건은 본 발명의 성취를 뒷받침하도록, 즉 발효 제품, 예를 들어 유제품 또는 유제품 유사 제품을 고체 또는 액체 형태(발효유 제품)로 얻도록 선택된다.
락토스를 포함하는 조성물은 요구르트(세트형, 스터드 또는 드링킹 요구르트), 버터밀크, 사워 밀크, 사워 크림, 케피어, 쿼크, 트바로그 및 치즈로 구성된 군으로부터 선택된 발효 유제품과 같은 발효 제품일 수 있다. 일 구현예에서 치즈는 신선한 치즈, 크림 치즈 또는 파스타 필라타로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
제품 및 의도된 소비자에 따라 알로락토스를 포함하는 조성물은 과일 농축물, 시럽, 프로바이오틱 박테리아 균주 또는 배양물, 착색제, 증점제, 향미제, 보존제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 성분을 더 포함할 수 있다.
마찬가지로, 효소는 발효 전, 도중 및/또는 후에 락토스를 포함하는 기질에 첨가될 수 있으며, 효소는 단백질을 가교시킬 수 있는 효소, 트랜스글루타미나제, 아스파르트산 프로테아제, 락타제, 키모신, 레넷 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
알로락토스를 포함하는 발효물과 같은 알로락토스를 포함하는 조성물은 스터드, 세트형, 드링킹형 등의 형태일 수 있다.
본 발명의 일 측면은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻은 알로락토스를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 적어도 0.04% w/w, 적어도 0.06% w/w, 적어도 0.08% w/w, 적어도 0.10% w/w, 적어도 0.15% w/w, 적어도 0.20% w/w, 적어도 0.25% w/w, 적어도 0.30% w/w, 적어도 0.35% w/w, 적어도 0.40% w/w, 적어도 0.45% w/w, 적어도 0.50% w/w, 적어도 0.55% w/w, 적어도 0.60% w/w, 적어도 0.65% w/w, 적어도 0.70% w/w, 적어도 0.75% w/w, 적어도 0.80% w/w, 적어도 0.85% w/w, 적어도 0.90% w/w, 적어도 0.95% w/w, 적어도 1% w/w, 또는 0.04% w/w - 1% w/w, 0.06% w/w - 0.95% w/w, 0.08% w/w - 0.90% w/w, 0.10% w/w - 0.85% w/w, 0.15% w/w - 0.80% w/w, 0.20% w/w - 0.75% w/w, 0.25% w/w - 0.70% w/w, 0.30% w/w - 0.65% w/w, 0.35% w/w - 0.60% w/w, 0.40% w/w - 0.55% w/w, 또는 0.45% w/w - 0.50% w/w 범위의 알로락토스를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 여기서 상기 조성물은 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주를 추가로 포함하되, 여기서, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 것이다.
본 발명의 조성물은 여러 형태로 제공될 수 있다. 즉 조성물은 분말, 알약 또는 정제일 수 있다. 이는 동결 형태, 건조 형태, 동결 건조 형태 또는 액체 형태일 수 있다. 따라서, 일 구현예에서 조성물은 동결, 건조, 동결 건조 또는 액체 형태이다.
본 발명의 조성물은 동결방지제(cryoprotectants), 냉동방지제(lyoprotectants), 항산화제, 영양분, 충전제, 향미제 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 바람직하게는 동결방지제, 냉동방지제, 항산화제 및/또는 영양분 중 하나 이상, 더욱 바람직하게는 동결방지제, 냉동방지제 및/또는 항산화제, 가장 바람직하게는 동결방지제 또는 냉동방지제, 또는 둘 다를 포함한다. 동결방지제 및 냉동방지제와 같은 방지제의 사용은 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 동결방지제 또는 냉동방지제에는 단당류, 이당류, 삼당류 및 다당류(예컨대 글루코스, 만노스, 자일로스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 말토덱스트린, 전분 및 아라비아 검 (아카시아) 등), 폴리올(예컨대 에리트리톨, 글리세롤, 이노시톨, 만니톨, 소르비톨, 트레이톨, 자일리톨 등), 아미노산(예컨대 프롤린, 글루타민산), 복합 물질(예컨대 탈지유, 펩톤, 젤라틴, 효모 추출물) 및 무기 화합물(예컨대 트리폴리인산나트륨)이 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 이노신-5'-모노포스페이트(IMP), 아데노신-5'-모노포스페이트(AMP), 구아노신-5'-모노포스페이트(GMP), 우라노신-5'-모노포스페이트(UMP), 시티딘-5'-모노포스페이트(CMP), 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신, 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘, 하이포잔틴, 잔틴, 하이포잔틴, 오로티딘, 티미딘, 이노신 및 그러한 화합물의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동결방지제(들)를 포함할 수 있다. 적합한 항산화제에는 아스코르브산, 시트르산 및 이의 염, 갈레이트, 시스테인, 소르비톨, 만니톨, 말토스가 포함된다. 적합한 영양소에는 설탕, 아미노산, 지방산, 미네랄, 미량 원소, 비타민(예컨대 비타민 B군, 비타민 C)이 포함된다. 조성물은 선택적으로 충전제(예컨대 락토스, 말토덱스트린) 및/또는 향미제를 비롯한 추가 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 동결방지제는 동결보호성에 더하여 부스터 효과를 갖는 제제 또는 제제의 혼합물이다.
"부스터 효과"라는 표현은 동결방지제가 발효 또는 전환될 배지에 접종될 때 해동되거나 재구성된 배양물에 증가된 대사 활성(부스터 효과)을 부여하는 상황을 설명하는 데 사용된다. 생존력(viability)과 대사 활성(metabolic activity)은 동의어 개념이 아니다. 상업용 냉동 또는 동결 건조 배양균은 대사 활성의 상당 부분을 상실하더라도 생존력을 유지할 수 있다. 예를 들어 배양체는 짧은 기간 동안 보관하면 산 생성(산성화) 활성을 상실할 수 있다. 따라서 생존력과 부스터 효과는 다양한 분석을 통해 평가되어야 한다. 생존력은 콜로니 형성 단위 결정과 같은 생존력 분석으로 평가하는 반면, 부스터 효과는 배양물의 생존력에 비해 해동되거나 재구성된 배양물의 관련 대사 활성을 정량화하여 평가된다. "대사 활성"이라는 용어는 배양물의 산소 제거 활성, 즉 산 생성 활성, 즉 예컨대 젖산, 아세트산, 포름산 및/또는 프로피온산의 생성, 또는 예를 들어 아세트알데히드(α-아세토락테이트, 아세토인, 디아세틸 및 2,3-부틸렌 글리콜(부탄디올))와 같은 방향 화합물의 생산과 같은 대사산물 생성 활성을 가리킨다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 물질의 % w/w로 측정되는 동결방지제 또는 제제의 혼합물을 0.2% 내지 20% 함유하거나 포함한다. 그러나, 동결방지제 또는 제제 혼합물을 동결 물질의 % w/w 중량으로 측정시 0.2% 내지 15%, 0.2% 내지 10%, 0.5% 내지 7%, 및 1% 내지 6% 범위의 양으로(1% 내지 5% 범위를 포함) 첨가하는 것이 바람직하다. 바람직한 일 구현예에서, 배양물은 물질의 중량%(% w/w)로 측정시 대략 3%의 동결방지제 또는 동결방지제 혼합물을 포함한다. 약 3%의 동결방지제의 양은 100mM 범위의 농도에 해당한다. 본 발명의 구현예의 각 측면에 대해 범위는 설명된 범위의 증분일 수 있음을 인식하여야 한다.
본 발명의 맥락에서 "x% 내지 y%"라는 용어는 끝점을 포함한다는 의미이므로 "x%에서 y%까지"라는 용어와 동일하다.
추가 측면에서, 본 발명의 조성물은 예를 들어 (실질적인) 우레아제 음성 박테리아 세포와 같은 S. 써모필러스 에 속하는 세포와 같은 박테리아 세포의 경우, 부스터(예컨대 성장 촉진제 또는 산성화 부스터)로서 암모늄 염(예컨대 유기산의 암모늄 염(예컨대 포름산 암모늄 및 구연산 암모늄) 또는 무기산의 암모늄 염)을 함유하거나 포함한다. "암모늄염", "포름산 암모늄 " 등의 용어는 염의 공급원 또는 이온의 조합으로 이해되어야 한다. 예를 들어 "포름산암모늄 " 또는 "암모늄염"의 "공급원"이라는 용어는 세포 배양물에 첨가될 때 포름산 암모늄 또는 암모늄염을 제공하는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 의미한다. 일부 구현예에서, 암모늄 공급원은 암모늄을 성장 배지로 방출하는 반면, 다른 구현예에서는 암모늄 공급원이 대사되어 암모늄을 생성한다. 일부 바람직한 실시예에서, 암모늄 공급원은 외인성이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 암모늄은 유제품 기질에 의해 제공되지 않는다. 물론, 암모늄염 대신에 암모니아가 첨가될 수도 있다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 암모늄염이라는 용어는 암모니아(NH3), NH4OH, NH4+ 등을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 증점제 및/또는 안정화제, 예컨대 펙틴(예를 들어 HM 펙틴, LM 펙틴), 젤라틴, CMC, 대두 섬유/대두 중합체, 전분, 변성 전분, 카라기난, 알기네이트 및 구아검을 포함할 수 있다.
산성화된 유제품에서 고/로피(high/ropy) 질감을 유발하는 다당류(예컨대 EPS)를 미생물이 생산하는 일 구현예에서, 펙틴(예컨대 HM 펙틴, LM 펙틴), 젤라틴, CMC, 대두 섬유/대두 중합체, 전분, 변성 전분, 카라기난, 알지네이트 및 구아 검과 같은 증점제 및/또는 안정제를 실질적으로 첨가하지 않거나 전혀 첨가하지 않고 산성화된 유제품이 생산된다. 실질적으로 없다라고 함은 생성물이 증점제 및/또는 안정제를 0% 내지 20% (w/w) (예컨대 0% 내지 10%, 0% 내지 5% 또는 0% 내지 2% 또는 0% 내지 1%)의 양으로 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 방법과 관련하여 개시된 모든 구현예는 본 발명의 조성물의 측면 및 구현예에 동일하게 적용 가능하다.
본 발명의 또 다른 측면은 알로락토스를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 하나 이상의 글루코스 결핍 균주의 용도에 관한 것으로, 여기서 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발된다.
추가 측면에서, 본 발명은 조성물 중 알로락토스의 함량을 증가시키기 위한 하나 이상의 글루코스 결핍 균주의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발된다.
말할 필요도 없이, 본 발명의 방법 및 본 발명의 조성물과 관련하여 개시된 모든 구현예는 본 발명의 다양한 용도의 측면 및 구현예에 동일하게 적용 가능하다.
본 발명을 설명하는 맥락에서(특히 다음 청구범위의 맥락에서) 용어 "a", "an" 및 "the" 및 유사한 지시어의 사용은 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 여기에 달리 명시되거나 문맥상 명백히 모순되는 경우. "포함하는", "갖는", "포함하는" 및 "함유하는"이라는 용어는 달리 명시되지 않는 한 개방형 용어(즉, "포함하지만 이에 국한되지 않음"을 의미)로 해석된다. 본 명세서에서 값의 범위를 언급하는 것은 본 명세서에서 다르게 표시되지 않는 한 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법의 역할을 하도록 의도되었으며, 각각의 개별 값은 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본 명세서에 기술된 모든 방법은 본 명세서에 달리 명시되지 않거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않다. 명세서의 어떤 언어도 청구되지 않은 요소를 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 명세서에서 분명히 이전에 출판된 문서의 목록이나 논의는 해당 문서가 최신 기술의 일부이거나 일반적인 일반 지식이라는 점을 반드시 인정하는 것으로 받아들여져서는 아니된다.
본 발명의 주어진 측면, 특징 또는 매개변수에 대한 선호사항, 옵션 및 실시예는 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 모든 다른 측면, 특징 및 매개변수에 대한 임의의 및 모든 선호사항, 옵션 및 실시예와 조합하여 개시된 것으로 간주되어야 한다. 이는 지방 캡슐화 미생물 배양 및 그 모든 특징에 대한 설명에 특히 해당되며, 이는 본원에 기술된 방법에 의해 얻은 최종 조성물 또는 제품의 일부일 수 있다. 본 발명의 구현예 및 특징은 다음 항목에서도 설명된다.
항목
A1. 알로락토스를 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 락토스를 포함하는 기질에 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주를 접종하는 단계로서, 여기서, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 것인 단계; 및
b) 상기 접종된 기질을 발효시켜 알로락토스를 포함하는 조성물을 얻는 단계
를 포함하는 것인 방법.
A2. 항목 A1에 있어서:
c) 알로락토스를 포함하는 조성물을 농축하여 농축 전의 조성물에 비해 알로락토스의 양이 증가된 조성물을 얻는 단계
를 더 포함하는 방법.
A3. 항목 A1 또는 A2 중 어느 하나에 있어서:
d) 알로락토스를 포함하는 조성물을 정제하여 정제 전의 조성물에 비해 알로락토스의 순도가 증가된 조성물을 얻는 단계
를 더 포함하는 방법.
A4. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 알로락토스를 포함하는 조성물이 식품, 보다 구체적으로 발효유제품인 방법.
A5. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 c)가 비제한적인 예로서 정용여과, 막 여과, 원심분리, 침강, 증발 및/또는 크로마토그래피와 같은 여과를 사용하여 수행되는 방법.
A6. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 균주가 갈락토스 양성인 방법.
A7. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 균주가 갈락토키나제 단백질을 인코딩하는 galK 유전자에 돌연변이를 보유하는 방법.
A8. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 균주가 갈락토스 발효성인 방법.
A9. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 균주가 세포 내로 및/또는 세포 밖으로 글루코스의 수송을 감소시키거나 불활성화시키는 돌연변이를 유전자에 보유하는 방법.
A10. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 유전자가 글루코스 수송체 시스템의 구성요소를 인코딩하는 방법.
A11. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 글루코스 수송체 시스템이 글루코스/만노스 포스포트랜스퍼라제 시스템인 방법.
A12. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 균주가 106 - 107 CFU/ml 농도로 우유 기질에 접종되어 43℃에서 18시간 동안 배양시 알로락토스를 적어도 0.04% w/w 우유에 해당하는 양으로 생산하며, 여기서 우유 기질은 4% 단백질, 1.5% 지방 및 0.1% 첨가된 수크로스를 포함하는 방법.
A13. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 글루코스 결핍 균는 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 락토바실러스(Lactobacillus)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
A14. 선행하는 항목에 있어서, 스트렙토코커스는 스트렙토코커스 서모필러스이고 락토바실러스는 락토바실러스 델브루에키 아종. 불가리쿠스인 방법.
A15. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 DSM 25850, DSM 26722, DSM 28889, DSM 33719, DSM 32227 및 DSM 33762 및 그로부터 유래된 돌연변이 균주로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 돌연변이 균주는 기탁된 균주 중 하나를 출발 물질로 사용하여 수득되며, 돌연변이체는 상기 기탁된 균주의 락토스 발효 특성 및/또는 글루코스 분비 특성을 유지하거나 추가로 개선하는 방법.
A16. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 글루코스 결핍 S. 써모필러스 및/또는 적어도 하나의 글루코스 결핍 L. 불가리쿠스 균주를 적어도 하나의 비-글루코스 결핍 S. 써모필러스 균주 또는 적어도 하나의 비-글루코스 결핍 L. 불가리쿠스 균주와 함께 a) 단계에서 접종하되, 여기서 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 것인 방법.
A17. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 제1항의 단계 a)에서 기질에
i. DSM 25850, DSM 26722, DSM 28889 및 DSM 28910DSM 28910, DSM 32227 및 DSM 33762;
ii. DSM 25850, DSM 26722, DSM 28889, DSM 28910 및 DSM 33720; 또는
iii. DSM 28910, DSM 32227 및 DSM 33719
가 접종되는 방법.
A18. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 조성물 중 알로락토스의 양이 적어도 0.04% w/w인 방법.
A19. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 락토스를 포함하는 기질이 동물 및/또는 식물 유래 기질인 방법.
A20. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 락토스를 포함하는 기질이 유제품 기질인 방법.
A21. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 발효 유제품이 요구르트(세트형, 스터드형 또는 드링킹형), 버터밀크, 사워 우유, 사워 크림, 케피르, 쿼크, 트 바로그 및 치즈로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
A22. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 치즈가 신선한 치즈, 크림 치즈 또는 파스타 필라타로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
A23. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 발효된 신선 유제품과 같은 알로락토스를 포함하는 제품이 과일 농축물, 시럽, 프로바이오틱 박테리아 균주 또는 배양물, 착색제, 증점제, 향미제, 보존제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 성분을 추가로 포함하는 방법.
A24. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 발효 전, 동안 및/또는 후에 효소가 락토스를 포함하는 기질에 첨가되고, 상기 효소는 단백질을 가교시킬 수 있는 효소, 트랜스글루타미나제, 아스파르트산 프로테아제, 키모신, 레넷 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 방법.
A25. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 발효산물이 스터드형 제품, 세트형 제품 또는 드링킹형 제품의 형태인 방법.
B1. 항목 A12-A25 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된 알로락토스를 포함하는 조성물.
C1. 적어도 0.04% w/w 알로락토스를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주를 추가로 포함하며, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 것인 조성물 .
D1. 알로락토스를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 하나 이상의 글루코스 결핍 균주의 용도로서, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 것인 용도.
E1. 조성물 중 알로락토스의 함량을 증가시키기 위한 하나 이상의 글루코스 결핍 균주의 용도로서, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 것인 용도.
기탁 및 전문가 솔루션
출원인은 아래 표에 명시된 기탁 미생물 샘플을 특허가 부여되는 날짜까지 전문가에게만 제공할 수 있도록 요청한다.
실시예
실시예 1 - 단일 균주에 의한 알로락토스 생산.
테스트된 모든 배양물은 크리스찬 한센 사(Chr. Hansen)에서 냉동 펠릿으로 제공되었다.
탈지분유, 반탈지유 및 수크로스를 완전히 수화될 때까지 혼합하여 단백질 4%, 지방 1.5% 및 0.1%의 첨가 수크로스를 함유하는 우유를 제조하였다. 우유를 저온살균하고 200mL 병에 부었다.
접종 전에 Chr. Hansen사의 권장 사항에 따라 배양물을 녹이고 우유에 미리 희석하였다. 배양물을 0.01%의 접종률(106 - 107의 CFU에 해당)로 우유에 첨가하였다. 접종된 우유를 43℃에서 18시간 동안 배양하고 6℃로 냉각한 후 화학적 분석을 위해 샘플링하였다. 탄수화물 분석을 위한 발효유 샘플은 샘플 1g을 계량하여 10mL 원심분리 튜브에 넣은 후 얼음처럼 차가운 96% 에탄올 2mL를 첨가하여 준비하였다. 샘플을 보텍스 상에서 혼합하고 분석할 때까지 -50℃에서 보관하였다.
프럭토스, 갈락토스, 글루코스, 수크로스, 락토스 및 알로락토스의 농도는 펄스형 전류 측정 검출 기능을 갖춘 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAE-PAD)로 측정되었다. 샘플을 EtOH 96%로 켄칭하였다. 샘플로부터 분석물(즉, 탄수화물)을 추출하고 단백질의 단백질이 제거되었다. 정량화의 동적 범위에 맞도록 샘플을 추가로 희석하였다. 푸코스를 내부 표준으로서 추가하였다. 희석된 샘플은 분석용 음이온 교환 컬럼과 펄스 전류 측정 검출기(PAD)를 사용하여 Dionex ICS-5000, 6000 또는 Integrion 시스템(Thermo Fischer Scientific, Waltham(MA), USA)으로 분석되었다. 정량화를 위해 8점 교정 곡선이 사용되었다. 내부 표준(푸코스)으로 정규화한 후 크로마토그래피 피크 높이를 기준으로 농도를 계산하였다.
결과는 배양물에 글루코스 결핍 균주가 존재하면 측정 가능한 수준의 알로락토스를 생성하는 반면, 배양물에 글루코스 결핍 균주가 없으면 알로락토스가 생성되지 않는다는 것을 명확하게 보여준다.
실시예 2 - 본 발명의 배양물에 의해 생산된 알로락토스
4.0% 단백질, 1.5% 지방 및 다양한 수준의 수크로스를 함유하도록 반탈지유, 탈지분유, 수크로스를 혼합하여 제조한 우유 베이스에 권장 용도 및 접종률(0.2U/L)에 따라 배양물을 접종하였다(표 2 참조). 접종된 우유 샘플은 pH 4.55에 도달할 때까지 43℃에서 배양한 후 6℃로 냉각하고 화학적 분석을 위해 샘플링하였다. 샘플을 준비하고 실시예 1에 개시된 바와 같이 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 수크로스, 락토스의 농도를 측정하였다.
결과는 글루코스 결핍 균주를 포함하지 않는 대조군 배양 프리미엄 1.0과 비교하여 글루코스 결핍 균주를 포함하는 배양물로 생산된 샘플에서 알로락토스가 더 많이 존재함을 분명히 보여준다.
실시예 3 - 다양한 조합 및 비율의 균주로 발효된 우유의 우유 산성화 및 탄수화물 분석.
발효에 앞서 두 가지 다른 우유 베이스를 생산하였다. 탈지분유와 수크로스를 우유에 첨가하고 교반 없이 2시간 동안 수화시킨 다음 균질화 후 80℃ 이상에서 1분간 저온살균을 실시하였다. 우유 베이스 1에는 수크로스 0.1%, 단백질 4%(탈지 분유로 조정), 지방 1.5%(크림 9%로 조정된 지방 우유 1.5%)가 포함되어 있다. 우유 베이스 2에는 수크로스 5%, 단백질 4%(탈지분유로 조정) 및 지방 1.5%(크림 9%로 조정된 지방 우유 1.5%)가 포함되어 있다.
우유 베이스를 200mL 젖병에 옮겼다. B-우유에 용해된 냉동 펠렛(F-DVS)으로부터 제조된 100X 액체 희석액을 젖병에 접종하였다. 각 균주에 대해 개별 희석액을 준비하였다. 블렌드를 만들기 위해 여러 균주를 서로 다른 비율과 용량으로 1개의 CINAC 병에 접종하였다. 혼합물의 최종 접종률은 1E+6 - 1E+8 CFU/ mL에 해당한다.
배양물 2에 사용된 DSM 33762를 제외하고 모든 균주는 F-DVS에서 생성된 첫 번째 희석액으로 접종되었다. DSM 33762 접종 물질을 준비하기 위해 4% 수크로스와 카제인 펩톤이 과량 함유된 1mL M17 BK 배지에 DSM 33762 스크랩을 접종하고 43℃에서 적어도 18시간 동안 호기적으로 배양하였다.
접종된 병을 수조에 넣고 43℃로 가열하였다. 혼합물이 최종 pH 4.55에 도달할 때까지 CINAC 하드웨어 및 소프트웨어를 사용하여 선행 기술에 따라 pH를 43℃에서 모니터링하였다.
알로락토스 분석을 위해 1g +/-0.5g의 무게를 측정하여 10mL 원심분리 튜브에 넣어 발효유 샘플을 준비하였다. 얼음처럼 차가운 96% 에탄올 2mL를 첨가하고 샘플을 휘저어 혼합한 후 분석할 때까지 -50℃에 두었다. 알로락토스의 농도는 실시예 1에 기재된 방법에 따라 분석하였다.
실험은 우유 베이스 1에서 수행되었다. 배양물 3과 배양물 4에 대한 결과는 서로 다른 블렌드로부터 얻었다. 즉, 8개의 배양물 3 블렌드 각각은 동일한 균주를 포함하지만 그 양과 비율이 다르다.
발효 시간과 알로락토스의 농도는 배양에 따라 달라진다. 알로락토스는 본 발명의 배양물인 배양물 1, 배양물 3 및 배양물 4에 의해 생산되는 반면, 요구르트 배양물 프리미엄 1.0 및 YF-L904(양자 모두 Chr. Hansen A/S/사에서 판매함)를 사용하면 알로락토스가 검출되지 않았다. 블렌드 변종의 균주 비율이 다르면 발효 시간이나 알로락토스 수준이 달라질 수 있다. 따라서 배양물과 블렌드의 조성은 최종 발효 제품에 필요한 특정 요구 사항을 충족하도록 적절하게 조정될 수 있다.
표는 배양물 1과 배양물 2(블렌드 1-6)를 이용하여 얻은 결과를 보여준다. 블렌드 1-6은 동일한 균주를 포함하지만 양과 비율이 다른 6가지 블렌드 변형이다. 발효시간과 알로락토스의 농도가 배양물과 우유 베이스에 따라 달라지는 것을 알 수 있다.
실시예 4 - 배양물 내 다양한 비율의 균주가 발효유 제품의 특성을 변화시킨다.
실시예 3에 기재된 바와 같이 발효유를 생산하고 분석하였다.
배양물 4 변종들(S03b, S03 및 P07)에서 균주 비율이 다르면 발효 시간과 알로락토스 농도가 달라진다. 우유 베이스 1에서 배양물 4 변종은 배양물 1에 비해 더 높은 알로락토스 수준을 생성한다. 그러나 이는 우유 베이스 2에서 역전되ㄴ는데, 여기서 배양물 4 변종은 배양물 1에 비해 더 높은 알로락토스 수준을 생성한다. 생성된 알로락토스 수준은 배양물 조성 및 우유 베이스에 따라 다르다.
Claims (15)
- 알로락토스를 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 락토스를 포함하는 기질에 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주를 접종하는 단계로서, 여기서, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 것인 단계; 및
b) 상기 접종된 기질을 발효시켜 알로락토스를 포함하는 조성물을 얻는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제1항에 있어서:
c) 알로락토스를 포함하는 조성물을 농축하여 농축 전의 조성물에 비해 알로락토스의 양이 증가된 조성물을 얻는 단계
를 더 포함하는, 방법. - 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 균주는 갈락토스 양성인, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 균주는 갈락토키나제 단백질을 인코딩하는 galK 유전자에 돌연변이를 보유하는, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 균주는 갈락토스 발효성인, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 균주는 세포 내로 및/또는 세포 밖으로 글루코스의 수송을 감소시키거나 불활성화시키는 유전자에 돌연변이를 보유하는, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 유전자는 글루코스 수송체 시스템의 구성요소를 인코딩하는, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 글루코스 결핍 균주는 스트렙토코커스 및 락토바실러스로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스 결핍 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 DSM 25850, DSM 26722, DSM 28889, DSM 33719, DSM 32227 및 DSM 33762 및 그로부터 유래된 돌연변이 균주로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 돌연변이 균주는 기탁된 균주 중 하나를 출발 물질로 사용하여 수득되며, 돌연변이체는 상기 기탁된 균주의 락토스 발효 특성 및/또는 글루코스 분비 특성을 유지하거나 추가로 개선하는 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 제1항의 단계 a)에서 기질에
i. DSM 25850, DSM 26722, DSM 28889 및 DSM 28910DSM 28910, DSM 32227 및 DSM 33762;
ii. DSM 25850, DSM 26722, DSM 28889, DSM 28910 및 DSM 33720; 또는
iii. DSM 28910, DSM 32227 및 DSM 33719
를 접종하는, 방법. - 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 알로락토스의 양은 적어도 0.04% w/w인, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 얻은 알로락토스를 포함하는 조성물.
- 적어도 0.04% w/w 알로락토스를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 하나 이상의 글루코스 결핍 유산균 균주를 추가로 포함하며, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 조성물.
- 알로락토스를 포함하는 조성물을 생산하기 위한 하나 이상의 글루코스 결핍 균주의 용도로서, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 것인 용도.
- 조성물에서 알로락토스의 함량을 증가시키기 위한 하나 이상의 글루코스 결핍 균주의 용도로서, 상기 균주의 글루코스 결핍은 글루코키나제 단백질을 인코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열의 돌연변이에 의해 유발되는 것인 용도.
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