CN102781900A - 从含有琥珀酸铵的发酵液纯化琥珀酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于从含有琥珀酸铵的发酵液纯化琥珀酸的方法。本发明中描述的用于纯化琥珀酸的方法包括使用离子交换树脂以分解发酵液中的琥珀酸铵。在发酵液流经阳离子型离子交换树脂期间，琥珀酸铵分解成铵阳离子和琥珀酸根阴离子。将树脂表面上的质子交换铵离子，并且琥珀酸根阴离子还原成琥珀酸，而质子从离子交换树脂释放。在添加强酸如硫酸时，结合的铵从树脂释放并且因而再生离子交换树脂用于后续使用。因这种方法的再生步骤产生的硫酸铵副产物可以用作肥料来源。用于从含有琥珀酸铵的发酵液分离琥珀酸的这种方法也可以用阴离子型离子交换树脂实施，其中所述琥珀酸根阴离子滞留在离子交换树脂的表面上并且随后在再生步骤期间从所述离子交换树脂释放。

Description

从含有琥珀酸铵的发酵液纯化琥珀酸
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年12月31日提交的美国临时申请系列号61/335,189的优先权。
背景技术
我们在微生物生物化学途径中进行遗传操作的能力方面取得的进展，连同发酵方法技术的改善，已经有可能利用农业和林业可再生原料产生商业上大量的琥珀酸。经工程化以产生琥珀酸的全部微生物在一个狭窄pH范围内部达到它们的最大生产率。出于这个原因，在琥珀酸的发酵生产期间，通过添加某些中和性碱化合物补偿培养基pH的降低，将发酵培养基的pH维持在接近中性pH。这导致琥珀酸在发酵培养基中以琥珀酸碱式盐的形式积累。因而根据所用的中和性碱的性质，琥珀酸在发酵培养基中积累为琥珀酸钠或琥珀酸钾或琥珀酸钙或琥珀酸铵。因此，发酵液的进一步下游加工需要从含有琥珀酸碱式盐的发酵液提取出纯琥珀酸。从发酵液回收琥珀酸同时释放中和剂的下游加工方法是以商业成功方式制造琥珀酸时需要的。
已经按照几种不同方法以从发酵液纯化有机酸，所述方法包括沉淀、蒸汽蒸馏、液-液萃取、逆流萃取、酯化和电渗析与萃取组合。通常，将发酵液进行微滤和超滤以在经历回收琥珀酸的任何特定方法之前移除细胞碎片。
已经报道了用于从含有琥珀酸碱式盐的发酵液回收琥珀酸的众多方法。对于以商业规模从发酵液产生琥珀酸而言，发现用于从发酵液回收琥珀酸的全部这些已知方法是冗长和昂贵的。
转让给密歇根生物技术学院（Michigan Biotechnology Institute）的美国专利号5,034,105提供了一种用于从含有琥珀酸钠的发酵液制备琥珀酸的方法。这种方法包括步骤：使培养液经历常规电渗析以制备含水但不饱和的琥珀酸盐溶液，使所述不饱和琥珀酸盐溶液经历水分解电渗析以产生超饱和琥珀酸溶液并且随后使琥珀酸从所述超饱和溶液结晶。这种方法不适于以大规模从发酵液中纯化琥珀酸，如这种方法在其存在的最后二十年期间缺少商业利用所证实。
转让给Applied CarboChemicals的美国专利号5,958,744和6,265,190提供了一种用于从含有琥珀酸钙的发酵液回收琥珀酸的方法。根据这种方法，发酵液通过添加硫酸来酸化。作为这种酸化方法的结果，琥珀酸根阴离子从琥珀酸钙释放，获得质子，并且从发酵液沉淀所得到的琥珀酸。将所得到的沉淀物过滤并且用醇洗涤以获得琥珀酸。仍待观察如此产生的琥珀酸是否满足所要求的纯度水平。此外，硫酸钙(石膏)的处置带来环境担忧。
转让给Roquette Freres的最近公开的美国专利申请公开号US2010/0297715描述了一种用于从含有琥珀酸镁的发酵液分离和纯化琥珀酸的方法。在这份公开的专利申请中描述的分离方法是复杂和昂贵的。该分离方法包括双极电渗析、蒸发性结晶和高温处理以出于循环目的的回收试剂。由于参与从发酵液回收琥珀酸的这些方法步骤，以商业规模使用这种方法产生琥珀酸的成本正在变得十分昂贵。
转让给BASF的最近的美国专利申请公开号2007/011294已经公开了一种用于从发酵液酯化琥珀酸的反应性蒸馏方法。然而，这份专利申请公开没有提供用于从实际的发酵液中回收琥珀酸的任何实际方法。
也已经进行众多工作以使用涉及离子交换树脂的方法从发酵液回收羧酸。离子交换树脂以两种不同方式用于从包含羧酸盐的发酵液分离羧酸中。根据一种方法，离子交换树脂以离子排阻模式使用。在另一种方法中，离子交换树脂化学地与发酵液中羧酸的盐相互作用以实现从羧酸盐分离羧酸。第一种方法称作离子排阻层析，并且第二种方法称作离子交换层析。
美国专利号5,132,456提供了一种用于从含水原料回收羧酸的方法，在所述方法中，羧酸是首先吸附到碱性固体吸附剂或适当碱性的离子交换树脂上，并且随后通过以下方式从吸附剂释放：用含水烷基胺或氨处理所述吸附剂，从而导致烷基铵或羧酸铵形成，所述烷基铵或羧酸铵分解成所需的羧酸和烷基胺或氨。
美国专利号5,143,834提供了一种用于从发酵液回收琥珀酸的方法，其使用脱盐性电解和水分解电解，随后使用强酸性离子交换剂移除任何钠离子或其他阳离子和游离碱形式的弱碱性离子交换剂移除任何硫酸根离子或硫酸，以获得高度纯化的琥珀酸产物。
美国专利号5,168,055提供了一种用于从含有琥珀酸钙的发酵液回收琥珀酸的方法。在第一阶段，将发酵液酸化以从琥珀酸钙释放琥珀酸。使如此释放的琥珀酸通过强酸性离子交换树脂和弱碱性离子交换剂以获得高度纯化的琥珀酸产物。在通过阳离子交换剂期间，移除钙和其他阳离子。在随后通过含有阴离子交换树脂的第二柱期间，移除阴离子杂质如硫酸盐和其他含氮杂质。
美国专利号5,641,406提供了一种通过在强酸性阳离子交换树脂上离子交换层析，从含有乳酸盐的发酵液提取纯乳酸的方法。在这种方法的第一阶段，在含有H+形式的弱酸性阳离子交换剂的一个或多个“初步柱”中借助真实离子交换，将乳酸盐转化成游离酸。在这种方法的第二阶段，通过使用一个或多个“分离柱”中的强酸性离子交换树脂，将游离的乳酸与发酵溶液中存在的糖类和其他杂质分开。该方法在高于50°C的温度并且优选地在70°C至80°C之间实施。
美国专利号5,068,418和5,068,419提供一种使用吸附剂从发酵液分离有机酸的方法，其中所述吸附剂包含拥有叔胺或吡啶官能团的水不溶性大网状或凝胶型弱碱性阴离子交换树脂或拥有季胺官能团的强碱性阴离子交换树脂。用水或稀无机酸如硫酸使有机酸从离子交换树脂解吸。
美国专利号5,786,185提供了用于产生乳酸的改进发酵方法。就这种方法本身而言，将包含游离乳酸的发酵液与有效量的含有吡啶基的固相聚合物接触以在乳酸积累时吸附它，并且使处理的流体发酵液返回至发酵容器。
美国专利号6,160,173描述了水不互溶性阴离子交换剂从包含乳酸和乳酸盐混合物的进料溶液中回收乳酸的用途。在第一步骤中，将进料溶液与阴离子交换剂接触，并且形成阴离子交换剂-乳酸加合物。从该阴离子交换剂-乳酸加合物中，经缩合反应产生乳酸酯或胺。
转让给Roquette Freres的美国专利号6,280,985公开了一种使用离子排阻层析法以阳离子交换树脂从发酵液分离和纯化乳酸的方法。除了经阳离子交换树脂的层析分离之外，这种方法包括几个单元操作。因而，原始发酵液在第一阶段浓缩，接着用浓酸酸化以实现游离乳酸/乳酸铵比率85/15。使酸化的培养液通过与至少4%二乙烯基苯交联的聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂以获得具有最大25%乳酸盐的级分。在第一级分中通过用水洗脱去除全部杂质，如未耗尽的糖和蛋白质和多价离子钙、镁的无机酸盐类型和与发酵液中任何解离的乳酸盐相对应的任何碱。下一个级分含有游离形式和以原始发酵液中存在的乳酸盐干重计最多25%的乳酸。这个级分进一步经历双极分级分离电渗析以获得纯化的浓缩乳酸。
美国专利号6,284,904公开了使用阴离子交换层析法纯化有机酸的方法，其中有机酸如琥珀酸与阴离子树脂结合，随后有机酸由强碱性阴离子溶液或这样的酸置换，所述酸具有比与阴离子树脂结合的有机酸的pKa更低的pKa。
美国专利号6,319,382教导了一种用于从含有乳酸铵的发酵液回收乳酸的方法，其中所述方法包括纳米过滤步骤、使用主要移除二价阳离子如钙和镁的螯合树脂的离子交换和一个终末两步骤电渗析过程。
美国专利7,238,837提供了一种用于从含有乳酸盐的水溶液回收乳酸的方法，通过使用阳离子交换树脂的方法，乳酸钠至乳酸的转化效率是56%。
美国专利7,439,392提供了一种使用吸附剂从发酵液分离柠檬酸的方法，其中所述吸附剂包含水不溶性大网状或凝胶、拥有季胺或叔胺官能团的强碱性或弱碱性阴离子交换剂树脂、具有交联的丙烯酸树脂或苯乙烯树脂基质的阴离子交换树脂和包含水或稀硫酸的解吸附剂。维持进料的pH低于柠檬酸的第一电离常数(pKa1)以维持选择性。
美国专利申请公开号2006/0276674描述了一种用于从发酵液纯化琥珀酸的方法。根据这种方法，可以通过使用某个量的H型强酸性阳离子树脂的离子交换法与结晶方法组合，高效地移除含有琥珀酸的液体中的杂质，旨在以良好产率产生高纯度琥珀酸。
在专利合作条约下公布的国际申请号WO 2007/040458提供了一种用于在从含有乳酸的发酵液回收乳酸的过程中使用离子交换树脂移除阳离子杂质和阴离子杂质的方法。铵离子使用强阳离子交换树脂移除，并且阴离子交换树脂用来移除硫酸盐杂质。
专利合作条约下公布并转让给Amylum Belgium的国际申请号WO98/30712提供了一种使用阳离子交换树脂从天冬氨酸铵回收晶状天冬氨酸的方法。
迄今检验过的从发酵液回收有机酸的多种方法已经表现出局限性并且因而为改善提供机会。因而本发明的目的是提供用于从包含琥珀酸铵的发酵液回收琥珀酸的商业可行方法。
附图简述
图1琥珀酸下游回收方法的程序框图。在经历连续离子交换(CIX)过程之前，发酵液经历微滤和超滤。来自连续离子交换过程的琥珀酸级分(SAC)经历纳米过滤/精加工步骤，随后经历蒸发和后续结晶步骤以回收晶体形式的琥珀酸。来自连续离子交换过程的硫酸铵(AMS)级分经历蒸发过程以回收硫酸铵晶体。
图2阳离子交换和琥珀酸铵在阳离子离子交换树脂表面上转化成琥珀酸的示意图。在阳离子交换树脂的表面上，琥珀酸铵分解成琥珀酸根阴离子和铵阳离子。将铵阳离子与阳离子交换树脂表面上的质子交换，质子的释放形成阳离子交换树脂。如此释放的质子与琥珀酸根阴离子合并，从而导致琥珀酸的形成。
图3用H2SO4再生阳离子交换树脂以产生硫酸铵的示意图。在从含有琥珀酸铵的发酵液回收琥珀酸的方法的第一步骤中，使发酵液与阳离子交换树脂接触。琥珀酸铵在阳离子交换树脂的表面上分解，并且所得到的铵阳离子与阳离子交换树脂表面上的质子交换。在第二再生步骤中，使用强酸如硫酸使与阳离子交换树脂表面结合的铵释放。采用硫酸处理，将树脂表面上的铵离子与质子交换。从树脂表面如此释放的铵离子与因硫酸解离产生的硫酸根离子组合，从而导致硫酸铵的形成。
图4澄清含有琥珀酸铵的发酵液的方案。所用的缩写：PF=进料压力；PIN=入口膜压力；POUT=出口膜压力(接近于F)；PPERM=渗透压(由阀门开口调节)；DP=PIN-POUT：压力降(大约1.5巴)；TMP=(PIN+POUT)/2-PPERM：跨膜压力。
图5含有琥珀酸铵的发酵液在含有Dowex G-26H树脂的层析柱上的层析图谱。阳离子型离子交换树脂的再生用5%(w/w)H2SO4进行。导入进料流的时间点和缓慢冲洗、快速冲洗、回洗及硫酸添加的起始点由X-轴上的下指箭头显示，所述X-轴显示以分钟为单位的时间。Y-轴上显示从层析柱流出的样品的折射率值。在该实验中获得的洗脱图中见到两个不同的峰。在第一峰中，可以容易地识别两个不同的子峰。呈扁平的第一子峰对应于琥珀酸的洗脱。高于第一子峰的第二子峰对应于从柱流出的未解离的琥珀酸铵级分。在本图中仅部分形成的第二峰对应于硫酸铵级分。
图6含有琥珀酸铵的发酵液在含有Dowex G-26H树脂的层析柱上的层析图谱。阳离子型离子交换树脂的再生用10%(w/w)H2SO4进行。导入进料流的时间点和缓慢冲洗、快速冲洗、回洗及硫酸添加的起始点由X-轴上的下指箭头显示，所述X-轴显示以分钟为单位的时间。Y-轴上显示从层析柱流出的样品的折射率值。呈扁平的第一子峰对应于琥珀酸的洗脱。高于第一子峰的第二子峰对应于从柱流出的未解离的琥珀酸铵级分。在本图中仅充分形成的第二峰对应于硫酸铵级分。
图7含有琥珀酸铵的发酵液在含有Dowex G-26H树脂的层析柱上的层析图谱。阳离子型离子交换树脂的再生用10%(w/w)H2SO4进行。本图中显示与为后续分析所收集的五个不同层析级分相对应的色谱图的部分。
图8含有琥珀酸铵的发酵液在含有Lanxess S100H阳离子树脂的层析柱上的多重层析图谱。阳离子型离子交换树脂的再生用10%(w/w)H2SO4进行。使用如表5中所显示不同的进料体积，从实验1、2、3、4、5和6获得六个不同的层析图谱。缓慢冲洗和快速冲洗用1个柱体积的去离子水进行。两个柱体积的10%(w/w)硫酸用来再生树脂，随后以缓慢冲洗模式添加3个柱体积的去离子水并以快速冲洗模式添加6个柱体积的去离子水。
图9含有琥珀酸铵的发酵液在含有Lanxess S100H阳离子树脂的层析柱上的层析图谱。阳离子型离子交换树脂的再生用10%(w/w)H2SO4进行。将1.5个柱体积的进料加载到柱上。缓慢冲洗和快速冲洗用1个柱体积的去离子水进行。两个柱体积的10%(w/w)硫酸用来再生树脂，随后以缓慢冲洗模式添加3个柱体积的流体并以快速冲洗模式添加6个柱体积的去离子水。
图10采用阴离子型离子交换树脂时从含有琥珀酸铵的发酵液分离琥珀酸的连续离子交换层析法的模块。连续离子交换工序在10根装填有阴离子树脂(每根0.4L)的柱上进行。试验分成4个区域，每个区域由1至3根柱组成。每个工序分成如本图中所显示的2个步骤。琥珀酸盐在阴离子树脂上截获并且在酸再生期间释放。再生以顺流模式(co-current mode)进行。在萃余液中回收硫酸铵，并且在提取物中回收琥珀酸。试验期间，连续离子交换过程在50°C进行以避免任何琥珀酸进入离子交换柱中结晶。
图11从含有琥珀酸铵的发酵液回收琥珀酸时纳米过滤方法的渗透流速。X-轴中显示体积浓度系数，并且在Y-轴上是流速（L/m2/hr）和温度。
图12从含有琥珀酸铵的发酵液获得的琥珀酸结晶的冷却图。将琥珀酸在85°C浓缩直至420g/L。结晶用纯的琥珀酸晶种(80μm)启动。在20小时内实现从85°C至20°C的温度转变。
图13从采用阴离子型离子交换树脂的连续离子交换层析设备获得的琥珀酸晶体的扫描电子显微镜照片。在左侧显示在没有涉及纳米过滤的精加工步骤情况下所获得的晶体的扫描电子显微镜照片。在该图右侧显示在涉及纳米过滤的精加工步骤后所获得的晶体的扫描电子显微镜照片。
图14从涉及含有琥珀酸铵的发酵液的离子交换层析过程中回收的硫酸铵晶体的扫描电子显微镜照片。
发明概述
本发明的目的是从含有琥珀酸中性盐形式的2至10%琥珀酸的发酵液中回收至少90%(w/w)琥珀酸。如此回收的琥珀酸将具有白色晶体的外观并且具有99.5%(w/w)或更高纯度。琥珀酸级分中优选的硫酸盐浓度是100ppm以下。在如根据本发明方法所获得的琥珀酸级分中最优选的硫酸盐浓度是30ppm以下。本发明提供了用于从发酵液中存在的琥珀酸铵盐制备琥珀酸的方法。本发明的方法包括在以商业有意义的量回收纯形式的琥珀酸中使用离子交换树脂。虽然本发明详细地描述了用于从含有琥珀酸铵的发酵液回收琥珀酸的方法，但是从生物原料产生有机酸的领域的技术人员能够将本发明的层析方法应用于从含有除琥珀酸铵之外的盐形式的琥珀酸的发酵液中回收琥珀酸，以及应用于以商业有意义的量以具备成本效益的方式从发酵液回收任何其他有机酸盐。
在本发明中，离子交换树脂用来介导盐分解反应，目的是从发酵液中存在的琥珀酸铵释放琥珀酸。本发明的盐分解反应可以使用阴离子型或阳离子型离子交换树脂实现。
在本发明的一个方面，从含有琥珀酸铵的溶液纯化琥珀酸的离子交换过程使用阳离子型离子交换树脂。使用阳离子型离子交换树脂从含有琥珀酸铵的水溶液纯化琥珀酸的方法包括以下步骤：(a)提供包含琥珀酸铵盐的水溶液；(b)使阳离子型离子交换树脂与包含琥珀酸铵盐的水溶液接触；(c)在水溶液中将所述琥珀酸铵盐转化成琥珀酸和铵阳离子；(d)将铵阳离子从水溶液分离，从而使琥珀酸留在水溶液中；和(e)回收水溶液中的琥珀酸。一旦与阳离子型离子交换树脂接触，琥珀酸铵分解成铵离子和琥珀酸根离子。从盐分解反应中如此产生的铵离子结合到阳离子树脂的表面，从而阳离子型离子交换树脂因而转化成铵盐形式。随后，铵盐形式的阳离子型离子交换树脂通过用强酸如盐酸或硫酸洗涤而再生成其初始形式。因阳离子型离子交换树脂的再生步骤产生的铵盐可以进行商业利用或再循环至发酵过程。为了实现从含有琥珀酸铵的水溶液中分离琥珀酸的最佳效率，使用阳离子型离子交换树脂的连续方法优于涉及使用阳离子型离子交换树脂的常规柱层析的分批方法。
在本发明的又一个实施方案中，基于使用阴离子型离子交换树脂的离子交换方法用来从含有琥珀酸铵的水溶液回收琥珀酸。如同涉及阳离子型离子交换树脂的离子交换层析那样，使用阴离子型离子交换树脂从含有琥珀酸铵的水溶液纯化琥珀酸包括盐分解反应。琥珀酸铵在阴离子型离子交换树脂的表面上分解成铵阳离子和琥珀酸根阴离子，并且如此产生的琥珀酸根阴离子与树脂表面上的阴离子种类交换。因而，琥珀酸阴离子在树脂的表面上捕获，而从阴离子型离子交换树脂释放的阴离子与铵阳离子组合以产生替代水溶液中的原初琥珀酸铵盐的新铵盐。新形成的铵盐从离子交换柱洗脱至萃余液级分中。与阴离子型离子交换树脂结合的琥珀酸根离子随后在添加强无机酸时从离子交换树脂释放。从离子交换树脂释放琥珀酸之外还涉及强无机酸的这个洗涤步骤使阴离子型离子交换树脂再生成其原初形式，从而一旦再次添加含有琥珀酸铵的新水溶液时，所述树脂可以介导盐分解反应。
从含有琥珀酸铵的发酵过程回收琥珀酸的离子交换过程以分批模式或以连续模式操作。以连续模式操作这个离子交换过程优于分批模式。
可以将涉及离子交换树脂的这种连续或分批方法中所用的发酵液加工，随后以一种或其他方式用于离子交换过程中以改善琥珀酸的回收。在本发明的一个方面，发酵液经历涉及有机溶剂的脱水方法。在本发明的另一个方面，含有琥珀酸铵的发酵液经历微滤和超滤，以移除发酵液中的颗粒物质，目的在于改善酸形式的琥珀酸的回收。
从离子交换过程获得的琥珀酸经历结晶过程以获得晶体形式的琥珀酸。作为离子交换过程中副产物所回收的硫酸铵还经历结晶或浓缩过程。
在本发明的另一个实施方案中，从离子交换过程回收的琥珀酸经历精加工过程以改善从发酵液回收的琥珀酸的品质。在本发明的一个方面，从离子交换过程回收的琥珀酸经历纳米过滤，从而纳米过滤过程后获得的琥珀酸晶体具有所需的颜色和最小水平的污染物。
发明详述
图1提供了从如本发明中所述的包含琥珀酸铵的发酵液中回收琥珀酸的程序框图。已经报道众多微生物在它们依赖生物原料的发酵生长期间产生显著量的琥珀酸。这些微生物中的一些已经进行基因修饰以实现以商业有意义的量产生琥珀酸。例如，在专利合作条约下以公开号WO2008/115958和2010/115067公布的国际专利申请中描述的大肠杆菌(Escherichia coli)KJ122菌株据报道在其发酵生长期间产生商业有意义量的琥珀酸。KJ122菌株在如Jantama等人(2008a、2008b)描述的几个不同阶段经过众多理性设计的遗传操作和代谢进化过程从大肠杆菌C菌株(ATCC 8739)衍生。
大肠杆菌KJ122菌株理想用于通过发酵途径产生琥珀酸。KJ122据报道具有在发酵容器中每升产生70至90克琥珀酸的能力。除KJ122之外，如美国专利号5,770,435、6,159,738、6,455,284和7,223,567和美国专利申请公开号2007/011294中所述的经基因修饰以产生琥珀酸的其他大肠杆菌菌株也用于以商业有意义的量产生琥珀酸。来自全部这些大肠杆菌菌株的以琥珀酸的中性盐形式含有琥珀酸的发酵液适用于本发明中。
除了这些基因修饰的大肠杆菌菌株外，也已经鉴定和开发了众多天然存在的产琥珀酸微生物用于以商业有意义的量发酵产生琥珀酸。例如，在专利合作条约下以公开号WO 2009/065778和WO 2009/065780公布的国际专利申请中描述了黑曲霉(Aspergillus niger)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的产琥珀酸菌株。已经报道以显著量产生琥珀酸的其他微生物的名单包括琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogens)、产琥珀酸曼氏溶血杆菌(Mannheimia succiniproducens)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、黄短杆菌(Brevibacterium flavum)和产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirilum succiniproducens)。由这些微生物中任一者在其发酵生长期间产生的琥珀酸可以使用本发明中描述的一种或多种方法，以高的纯度水平回收。
归因于琥珀酸的酸性性质，琥珀酸在微生物生长培养基中的持续积累预期降低培养基的pH并最终导致生物生长速率和琥珀酸产率下降。通过基于需要添加某种pH中和碱至微生物生长培养基，克服这种局限。添加中和碱至微生物生长培养基导致琥珀酸以中性盐形式积累。因而当使用氢氧化铵作为碱以中和因琥珀酸产生所致的pH下降时，琥珀酸铵在发酵容器中积累。
在发酵运行结束时，培养液含有琥珀酸盐、重金属、有色物质、代谢副产物、微生物细胞及细胞碎片和无机盐。因此，直接利用发酵液是不可能的，并且需要另外的加工步骤以从发酵液提取纯的琥珀酸。
在用于从发酵液回收纯琥珀酸的方法的第一步骤中，需要借助萃取水浓缩培养液。这种浓缩步骤将减少待加工流体的体积并且最终帮助降低回收纯琥珀酸所需要的每一个后续单元操作的成本。含有琥珀酸盐的发酵液可以通过使用低分子量仲胺和季胺如三乙胺、二异丙胺、N,N-二乙胺及其混合物移除显著量的水予以浓缩。在30°C至50°C温度范围，这些有机胺可以从稀的水溶液如含有琥珀酸盐的发酵液提取大量的水。在这个低温范围，有机胺相含有20-35%的水和明显降低量的发酵盐类。通过升高所述温度并从而允许所述胺再循环和再使用来提取额外的水，可以从胺中逐步缩减水。通过使用这种方法，可以使用常规多级、逆流提取步骤从含有3%琥珀酸铵的发酵液提取82.5%的水，从而导致产生浓缩五倍的含有15%琥珀酸铵的发酵液。
在本发明的实施中，将包含琥珀酸盐的发酵液澄清以除去发酵液中存在的颗粒物质。可以通过在80°C至90°C高温处理移除发酵液中的细胞组分和蛋白质组分。高温处理可以伴随碱处理以杀死微生物和使蛋白质凝固。因这些高温处理和碱处理产生的不溶性物质可以通过过滤或离心移除。
使用微滤和/或超滤装置，可以进一步澄清因高温处理和碱处理产生的发酵液。用于微滤和超滤微生物发酵液的技术是工业微生物学领域熟知的。适于微滤和超滤微生物发酵液的膜是从众多供应商可商业获得的。离心步骤可以替代微滤步骤。来自离心步骤的上清液可以经历超滤步骤。将来自这些过滤方法的截留液弃去或再循环，并且在接下来的阶段中使用琥珀酸盐富化的渗透物(渗透液)作为利用离子交换树脂纯化琥珀酸的来源。来自微滤和/或超滤方法步骤的渗透物可以如美国专利号6,319,382中所述，在经离子交换树脂处理之前任选地通过主要结合二价离子如钙和镁的螯合树脂。
作为解释从发酵液回收琥珀酸的本发明方法的方式，首先提供在描述本发明时使用的多个术语的以下定义。
“层析”指用于混合物和各组分的化学分离的任何分析技术，所述化学分离依赖于将混合物的各组分选择性吸引至固相。实例包括吸附层析、离子交换层析和离子排阻层析。本发明重点在于使用离子交换层析并且不涉及离子排阻层析。作为区分离子排阻层析和离子交换层析的方式，提供以下定义。
离子排阻是用来描述下述机制的术语，其中离子交换树脂借助所述机制用于中性种类和离子种类的分级分离。样品中待分级分离的离子化合物被树脂排斥，并且它们洗脱于柱的空体积中。非离子或弱离子性物质渗入填充材料的孔，并且因而当它们在树脂粒子内部和外部的液体之间分配时，实现分离。离子排阻层析也由几个其他名称提到，包括离子排阻分配层析、离子层析-排阻模式和Donnan排阻层析。
如本发明中所用的术语“离子交换或离子交换层析”用来描述这样的机制，其中借助所述机制，中性化学分子与离子交换树脂相互作用时分解成其带电荷组分。从中性分子产生带电荷种类的这种现象定义为盐分解。基于正在使用的树脂的性质，因盐分解反应产生的离子组分之一与树脂结合，并且另一分子从树脂粒子流走。当使用阳离子交换树脂时，因盐分解反应产生的带正电荷的离子将与离子交换树脂结合，并且带负电荷的种类从树脂流走。另一方面，当使用阴离子交换树脂时，因盐分解反应产生的带负电荷的离子与阴离子交换树脂结合，并且带正电荷的种类从树脂流走。下文用从含有琥珀酸铵的发酵液回收琥珀酸的方法解释本发明的这种离子交换过程。
当琥珀酸铵分子与阳离子型离子交换树脂接触时，琥珀酸铵分子分解成带正电荷的铵阳离子和带负电荷的琥珀酸根阴离子。铵阳离子与树脂结合，替换来自树脂表面的氢离子。从阳离子型离子交换树脂表面如此释放的氢离子与琥珀酸根阴离子合并以产生琥珀酸分子。与树脂表面结合的铵离子随后因强酸而从树脂表面释放，所述强酸还使离子交换树脂再生成原初形式。
当琥珀酸铵分子与阴离子型离子交换树脂接触时，琥珀酸铵分子分解成带正电荷的铵阳离子和带负电荷的琥珀酸根阴离子。带负电荷的琥珀酸根阴离子与树脂表面结合并且从而替换带负电荷的阴离子，如来自树脂表面的硫酸根。从树脂表面释放的带负电荷的硫酸根阴离子与铵阳离子反应以产生进入萃余液级分的硫酸铵。与树脂表面结合的琥珀酸根离子因强酸处理而从树脂表面释放，所述强酸除了使所述树脂再生成原初形式之外，还使琥珀酸根离子从树脂的表面作为琥珀酸释放。硫酸和盐酸适于这种目的。
“吸附剂”在本文中通常用来指在层析中所用的固相，流动相组分对其显示选择性亲和力。因为这种亲和力可以采取除吸附之外的多种形式，包括大小排阻，所以该术语指吸附混合物组分的固相并且指这样的固相，所述固相在技术上不吸附来自流动相的组分，但是却通过减慢一种组分相对于层析系统中另一组分的迁移速率而像吸附剂那样发挥作用。本发明中使用的离子交换树脂是吸附剂的实例。本发明的离子交换吸附剂的特殊能力在于，它可以将吸附于其表面上的中性分子化学地分解成该分子的离子组分并且基于电荷化学地结合所述离子组分之一。
术语“纯化的”指其相对浓度(组分或级分的重量除以混合物中全部组分或级分的重量)增加至少20%的组分或级分。当组分或级分从中纯化的组分的相对浓度(从中纯化的组分或级分的重量除以混合物中全部组分或级分的重量)下降至少20%时，也可以称该组分或级分被纯化。
“进料混合物”是含有待通过层析方法分离的一种或多种提取物组分和一种或多种萃余液组分的混合物。术语“进料流”表示传到在所述方法中使用的吸附剂的进料混合物流。
“提取物组分”是被吸附剂更选择性吸附的组分或类型，而“萃余液组分”是更少选择性吸附的化合物或化合物类型。
术语“解吸剂材料”应当通常意指能够解吸提取物组分的材料。换而言之，与离子交换树脂结合的带电荷材料因解吸剂材料而从离子交换树脂的表面释放。术语“解吸剂流”或“解吸剂输入流”表示解吸剂材料经其传到吸附剂的流。
术语“萃余液流”或“萃余液输出流”意指经其从吸附剂移除萃余液组分的流。萃余液流的组成可以从基本上100%解吸剂材料至基本上100%萃余液组分变动。
术语“提取物流”或“提取物输出流”应当意指提取材料已经由解吸剂材料解吸的流从吸附剂中移除。提取物流的组成可以从基本上100%解吸剂材料至基本上100%提取物组分变动。
提取物流的和优选来自层析柱的萃余液流的至少一部分经过分离装置如级分收集器，在其中分离至少一部分的解吸剂材料以产生提取物产物和萃余液产物。术语“提取物产物”和“萃余液产物”意指由所述方法产生的产物，其分别含有浓度比提取物流和萃余液流中存在的那些提取物组分和萃余液组分更高的提取物组分和萃余液组分。
已经认识到吸附剂的某些特征对于任何层析过程的成功运行是必需的。吸附剂的合乎需要的特征是：(1)吸附剂的吸附量、(2)吸附剂的选择性和(3)吸附和解吸附的速率。
吸附剂吸附特定体积提取物组分的能力是一项重要特征。吸附剂吸附提取物组分的能力越高，吸附剂越好。随着吸附剂的能力增加，可以减少为分离特定进料混合物中所含有的已知浓度的提取物组分所需要的吸附剂的量。
第二个必需吸附剂特征是吸附剂分离进料组分的能力。吸附剂将一种组分与其他组分分离的这种能力称作吸附选择性。相对选择性可以不仅对一种进料组分与另一组分相比时表现，而且也可以在任何进料混合物组分和解吸剂材料之间表现。如此处所用的吸附剂选择性定义为在平衡条件下，两种组分在吸附相上的比率对相同两种组分在非吸附相中的比率。在两种组分的选择性逼近1.0的情况下，不存在吸附剂相对于一种组分而优先吸附另一种组分；它们均彼此以大约相同的程度被吸附(或不吸附)。当选择性变得小于或大于1.0，存在对一种组分相对于另一种组分的优先吸附。当吸附剂对提取物组分相对于萃余液组分的选择性大于1时，尽管提取物组分与萃余液组分的分离在理论上是可能的，然而优选的选择性接近值2。
吸附剂的第三个合乎需要的特征与吸附剂交换提取物组分的速率相关。理想的吸附剂必须不仅能够以较大速率吸附提取物组分，与此同时还应当具有在适宜的解吸剂附存在下轻易解吸结合的提取物组分的能力。较快的交换速率减少为去除提取物组分所需的解吸剂材料的量并且因此允许降低方法的运行成本。在交换速率较快的情况下，可以将较少的解吸剂材料泵送经过该过程并且与提取物流分离用于该过程中的再利用。
为了选择适于特定分离方案的吸附剂，可以利用动态测试装置，将一组吸附剂进行脉冲试验。通过实施脉冲试验，可以在参考所选择吸附剂的吸附容量、选择性和交换速率的情况下，确定它们的特征。
用于实施脉冲试验的装置可以具有简单的结构。该装置由填充有试验吸附剂的吸附剂室组成。吸附剂室可以是直柱或螺旋柱。吸附剂室可以在环境温度运行或可以维持在温度受控的环境内。需要在最佳条件下进行层析分离。吸附剂室的最佳温度将提供树脂分离容量的增加。最佳温度还将改善吸附剂的有效容量。除了温度环境之外，吸附剂柱可以与压力控制设备连接以按照恒定的预定压力运行吸附剂室。定量及定性分析性仪器如折射仪、旋光仪和UV/可见光分光光度计可以与吸附剂室的出口管线连接并且用来定量地检测离开吸附剂室的流出液流中的一种或多种组分。
通过使特定解吸剂材料经过吸附剂室，将吸附剂室中的吸附剂用所述解吸剂材料填充至平衡。在便利的时间，注入含有已知浓度示踪剂和已知浓度特定提取物组分或萃余液组分或这两者(均稀释于解吸剂中)的进料脉冲持续几分钟时间。示踪剂是已知与吸附剂具有确定相互作用的组分。恢复解吸剂流动，并且洗脱示踪剂和提取物组分或萃余液组分(或这两者)。流出液可以进行流上(on-stream)分析，或备选地，可以定期收集流出液样品并稍后分析。
从脉冲试验的结果中，可以确定吸附剂的吸附容量、吸附剂对特定提取物组分的选择性和交换吸附剂表面上特定提取物组分的速率。通过确定提取物组分在进料混合物中和在萃余液流中的量并且计算吸附剂在吸附剂室中的量，可以确定特定吸附剂相对于特定提取物组分的吸附容量。
可以从提取物组分峰值包迹和示踪剂峰值包迹(或其他参比点)的中心之间距离与萃余液组分峰值包迹和示踪剂峰值包迹的中心之间相应距离的比率，确定吸附剂相对于萃余液组分对特定提取物组分的选择性。
提取物组分与解吸剂交换的速率可以通常以峰值包迹在一半强度时的宽度为特征。峰值宽度越窄，解吸速率越快。解吸速率也可能以示踪剂峰值包迹的中心之间的距离和刚刚解吸的提取物组分消失为特征。这种距离再次是这个时间间隔期间所泵送的解吸剂的体积。
为从包含琥珀酸铵的发酵液层析分离琥珀酸所选择的吸附剂可以用于具有密实紧凑床的常规柱层析中。在这种紧凑固定床层析中，可以使用在固定床流体-固体接触中所用的任何常规装置。在这种紧凑床层析中，使吸附剂备选地与进料混合物和解吸剂材料接触。在本发明的一个实施方案中，吸附剂以单个固定床的形式使用，并且该方法仅是半连续的，因为进料仅在萃余液流和解吸剂流轮替的间隔期中施加至吸附剂。
在密实紧凑固定床层析的另一个实施方案中，可以在与适宜阀门接触的固定床中使用一组两个或更多个固定床，从而使进料混合物经过一个或多个吸附剂床，同时可以使解吸剂材料经过该组中的一个或多个其他床。进料混合物和解吸剂材料的流可以是向上或向下穿过解吸剂。
与单柱洗脱层析相关的问题之一在于，柱材料在分离段(即其中组分分解的柱段)中未得到有效使用。分离段实际上随组分流过而收缩。一种克服这种局限的方式是在柱顶部依次添加多份样品。然而，这种依次的添加要求在载入之间小心定时的延迟以避免与先前样品重叠，并且仅提供有效柱分离段的略微增加。固相仍大多利用不足，并且该方法还要求过多量的溶剂。与单柱洗脱层析相关的这些局限可以通过使用连续离子交换层析来克服。
连续离子交换层析比固定的吸附剂床系统更高效并且是实施本发明的优选实施方案。在连续离子交换层析中，吸附和解吸操作连续地进行，并且因此，存在进料的连续使用，伴随提取物的连续产生。
连续交换层析可以按几种不同方式实施。适于本发明的连续离子交换层析可以在两个不同的模式下运行，即(1)移动端口系统和(2)移走柱系统。移动端口系统由再分成众多互连区室的垂直柱组成，并且每个区室的流体入口和出口受特别设计的旋转式主阀门控制。移走柱系统包含安装在旋转式转盘上的多个层析柱。
在本发明方法中待使用的吸附剂将包含强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂和弱酸性阳离子交换树脂。
适于实施本发明的阴离子交换树脂拥有交联聚合物基质(例如二乙烯苯交联的丙烯酸基或苯乙烯树脂)中的季铵、叔胺或吡啶官能团。以珠形式产生时，它们是特别合适的，并且具有高度均匀的聚合孔隙度并且显示化学和物理稳定性．树脂可以是凝胶状(或“凝胶”)或“大网状的”。适用于本发明中的阴离子的交换树脂的名单包括Amberlite IRA 400和900系列吸附剂、由Rohm and Haas Company制造的XE 275(IRA-35)和IRA-68吸附剂、由BioRad制造的AG1、AG2、AGMP-1、AG3-X4A和AG4-X4树脂和由Dow Chemical Company出售的相当的树脂如Dowex 1、2、11、MSA-1和MSA-2。
本发明的强阳离子交换层析材料优选地包含一个或多个层析支持物材料(即，固定相)。合适的层析支持物材料包括，但不限于矾土、硅酸镁、二氧化硅、玻璃、孔径受控玻璃、碳、多孔石墨碳、磷酸锆、羟基磷灰石、磷酸钙、碳酸镁和聚合物或树脂。合适的聚合物或树脂包括，但不限于羟烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯(polymacrylate)、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯苯共聚物、聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)、聚(乙烯醇)、聚(醋酸乙烯酯)和(乙烯基吡啶)。优选聚合物或树脂。更优选苯乙烯-二乙烯苯共聚物。
本发明的强阳离子交换层析材料还包含选自适用于强离子交换的一个或多个官能团中的多种配体。这些官能团包括但不限于磺酸、烷基磺酸、苯磺酸、烷基苯基磺酸及其盐。优选的是磺酸官能团及其盐。
可以使用的酸性阳离子交换聚合物或树脂的具体实例包括：AMBERLITE 200、AMBERLITE IR-118H、AMBERLITE IR-120PLUS、AMBERLITE IR-122、AMBERLITE IR-130C、AMBERLITE I6641、AMBERLITE IRP-69、DOWEX 50X1-100、DOWEX 50X2-100、DOWEX50X2-200、DOWEX 50X2-400、DOWEX 50X4-100、DOWEX 50X4-200、DOWEX 50X4-200R、DOWEX 50X4-400、DOWEX 18880、DOWEX50X8-100、DOWEX 50X8-200、DOWEX 50X8-400、DIAION 1-3561、DIAION 1-3565、DIAION 1-3570、DIAION 1-3573、DIAION 1-3577、DIAION 1-3581、DUOLITE D 5427和DUOLITE D 5552，它们从Sigma-Aldrich,St.Louis Missouri,(美国)可获得；DIAION HPK25、DIAION PK208、DIAION PK228、DIAION SK1B、DIAION SK1BS、DIAION SK104、DIAION SK112、DIAION SK116、DOWEX HCR-S、DOWEX HCR-W2、DOWEX MSC-1、DOWEX 650C、DOWEX G-26H、DOWEX 88、DOWEX MONOSPHERE 88、DOWEX MONOSPHERE99K/320、DOWEX MONOSPHERE 99K/350、DOWEX MONOSPHERE99Ca/320、DOWEX MONOSPHERE 99Ca/350、DOWEX Marathon C、DOWEX-032、DOWEX-406、DOWEX-437、DUOLITE C-280和DUOLITE C-291，它们从Supelco,Inc.,Bellefonte,Pennsylvania(美国)可获得；AMBERLITE IR-120、AMBERLITE IR-120B、AMBERLITEIR-200C、AMBERLITE CG 6000、DIAION SK-1B、DOWEX XUS40406.00、DOWEX XUS 43518和DOWEX C500ES。优选AMBERLITEIR-120、AMBERLITE IR-120B、AMBERLITE IR-200C、DOWEXC500ES、DOWEX XUS 43518和DOWEX XUS 40406.00。最优选的是DOWEX XUS 40406.00、LEWATITTM S100、S109、SP112、SP120(由Bayer制造)等。具体而言，具有窄粒度分布的工业层析用强酸性阳离子交换树脂，如UBK-530、UBK-550(由itsubishi Chemical Cooperation制造)。
根据本发明，层析柱中的吸附剂以离子交换模式发挥作用。当层析柱中的吸附剂作为离子交换树脂发挥作用时，可以直接使用包含琥珀酸铵或琥珀酸任何其他盐的发酵液，无需任何化学处理。琥珀酸盐在吸附剂的表面上经历“盐分解”反应，并且根据所用树脂的化学性质，在萃余液流中或在提取物流中回收在该过程中释放的琥珀酸。因而根据本发明，将含有琥珀酸盐的发酵液直接施加至含有离子交换树脂的层析柱。这与离子排阻层析中的要求相反。在用于分离琥珀酸的离子排阻层析中，含有琥珀酸盐的发酵液首先酸化以使琥珀酸沉淀，并且基于吸附剂的电荷排斥程度，将所产生的琥珀酸与酸化发酵液中的其余组分分开。
图2和图3说明在阳离子型离子交换树脂表面上的盐分解反应。琥珀酸铵经水相发酵产生，目的是在分离和纯化步骤后产生琥珀酸分子。在本发明方法中，进料流中存在的琥珀酸铵经过氢形式的阳离子交换树脂柱。当进料流流经该柱时，阳离子交换发生，其中树脂“分解”琥珀酸铵盐，并且释放的铵阳离子(NH4+)与树脂结合，同时最初在树脂上的氢离子(H+)释放至溶液中。图2中显示这种离子交换反应的示意图。
一旦从阳离子型离子交换树脂释放，氢离子与琥珀酸根阴离子合并，从而形成琥珀酸。如此产生的琥珀酸经水冲洗工序流出该柱进入层析峰级分中。
在“盐分解”离子交换层析的第二步骤中，结合的铵阳离子通过通入稀硫酸溶液而从树脂释放。这个过程再生阳离子型离子交换树脂用于后续使用。在这个再生步骤期间，发生第一离子交换步骤的逆转；来自充分电离的硫酸溶液的氢离子与树脂结合，同时释放先前结合的铵阳离子。释放的铵阳离子随后与电离的硫酸的硫酸根阴离子合并，在溶液中产生硫酸铵。借助一系列纯水洗涤，随后将硫酸铵从柱中洗出至其自身的层析峰级分中。图3中显示阳离子交换树脂再生伴以产生硫酸铵的方案。
吸附剂对发酵液中存在的琥珀酸铵分子实施‘盐分解’反应的能力由吸附剂和琥珀酸铵分子的酸解离常数值决定。酸解离常数也称作“pKa”，并且它与酸在水溶液中解离成其组分阳离子和阴离子的平衡常数相关。在本发明的一个实施方案中，包含琥珀酸铵的水溶液与酸性离子交换树脂接触，其中所述酸性离子交换树脂具有比琥珀酸铵的酸解离常数小至少0.5的pKa值。因“盐分解”反应而释放的铵阳离与离子交换树脂结合。与离子交换树脂结合的铵离子可以因涉及酸的洗涤步骤而释放，其中所述酸具有比处于其盐形式的离子交换树脂的pKa值小至少0.5的pKa值。
在本发明的另一个实施方案中，使用阴离子型离子交换树脂作为吸附剂。在反应的第一阶段，源自琥珀酸铵的琥珀酸阴离子通过在琥珀酸分子和树脂上的离子交换位点之间形成离子键而吸附至强阴离子交换树脂。在这个阶段，大部分中性或阳离子材料或大分子或细胞碎片穿过树脂。在下一个阶段，树脂用水洗涤以移除离子交换树脂中截留的未结合污染物。在这个洗涤步骤后，通过将吸附的琥珀酸离子交换为更强的无机离子，从树脂移出琥珀酸阴离子。从该柱移出琥珀酸后，通过使树脂上的阴离子交换位点再生，将阴离子交换树脂准备用于琥珀酸吸附的进一步循环。这通过用强酸如硫酸或盐酸处理树脂完成，所述强酸引起无机阴离子交换成琥珀酸根阴离子。使用阴离子交换树脂连同含有琥珀酸铵的发酵液的净结果是分离出纯化的琥珀酸。
通过层析方法从发酵液如此回收的琥珀酸可以进一步经纳米过滤法纯化。
实施例
实施例1
发酵液的澄清
对孔径0.1μM的适于微滤(MF)的膜和截断值150kDa的适于超滤(UF)的另一个膜测试它们在澄清包含琥珀酸铵的发酵液方面的效率。下表1中显示这两种不同膜的特征。
图4中提供了采用这两种膜的澄清中试方案。将渗透液流速测量为每种膜的跨膜压力(TMP)的函数。对于这个步骤，进料培养液流经所述膜并且通过开启渗透环路变动TMP。将渗余物和渗透液恒定地再循环以保持体积浓度系数(VCF)处于1。用两种膜获得的渗透液是清亮的，不过采用最宽膜(截断值:0.1μM)时的流速较高。在TMP=0.8巴时，具有0.1μM孔直径的膜显示流速250l/h/m2。在TMP=1.6巴时，用于超滤的具有150kDa截断值的另一种膜显示流速300l/h/m2。
使用150kDa截断值膜，在35-39°C以分批模式随后澄清包含琥珀酸铵的发酵液，以确保良好渗透液质量并限制腐坏风险。在TMP>2巴，在中试规模达到浓度系数VCF:10，平均流速143l/h/m2。在VCF=10时澄清后，估计的琥珀酸盐回收率87%。额外的渗滤帮助增加琥珀酸盐回收率直至94%。在工业规模，可以用以下参数实现直至99%的琥珀酸盐回收率：空柱体积(FCV)=20和渗滤比率水/渗余物=4.5/1(表2)。
实施例2
阳离子离子交换层析
在本发明方法中，使用含有强酸阳离子交换树脂如Dowex G-26H或Lanxess Lewit MonoPlus S 100H的制备性层析柱(1.6cm直径x 100cm长度)以分解琥珀酸铵分子并且为每琥珀酸盐分子提供两个(2)氢离子(H+)。也可以使用Lanxess树脂108H替代Lanxess树脂S 100H。这种方法产生在溶液中的琥珀酸，所述琥珀酸随后经‘缓慢’和‘快速’纯水冲洗工序从该柱洗出。
当琥珀酸铵分子借助强酸阳离子交换树脂分解时，铵阳离子(NH4 +)与阳离子交换树脂。在纯水冲洗已经实施以洗出琥珀酸后，树脂床用适宜浓度的硫酸洗涤以使阳离子树脂珠再生。在这个步骤中，来自硫酸的氢离子((H+)与先前结合的铵离子(NH4 +)交换，从而产生在溶液中的硫酸铵(NH4)2SO4。硫酸铵随后经‘缓慢’和‘快速’纯水冲洗工序从该柱洗出至该柱自身的层析峰级分中。
这种方法的操作循环包含以下步骤：(1)以适宜的体积并且以适宜的流速添加进料。可以按1.0个柱体积(CV)至2.5CV的体积施加进料。在优选的实施方案中，进料以1.2CV至2.2CV添加，并且在最优选的实施方案中，进料以1.5CV至1.7CV添加。应当牢记，待添加的进料的体积十分依赖于进料中琥珀酸铵的浓度和正在使用的离子交换树脂的吸附容量。基于发酵液中存在的琥珀酸铵的浓度和正在使用的离子交换树脂的吸附容量，可以计算出待添加的进料的合适体积，从而进料中存在的全部量的琥珀酸铵在离子交换树脂的表面上分解，并且取决于正在使用的离子交换树脂的类型和萃余液流中琥珀酸铵的过流，不存在离子交换树脂被铵或琥珀酸盐饱和的问题。类似地，进料流速可以在每小时2至4个床体积的范围内(BVH)。在优选的实施方案中，进料流速可以在2.5至3.5BVH范围内，并且在最优选的实施方案中，进料流速在2.9至3.2BVH范围内。(2)其中层析柱用1至4个CV的水洗涤的缓慢冲洗步骤，所述水以流速1至4BVH添加；(3)快速冲洗步骤，其中层析柱用1至4个CV的水洗涤，所述水以流速5-10BVH添加；在优选的实施方案中，快速冲洗以流速7至9BVH实施。(4)再生步骤，其中柱用1至4CV适宜浓度的强酸以流速1-4BVH洗涤。适于本发明的强有机酸选自盐酸、硝酸、硫酸和磷酸。以如此方式选择强酸的浓度，从而离子交换树脂在短时间内完全再生，如层析图谱所证实。(5)缓慢冲洗步骤，其中柱用1-4CV的水以流速1-4BVH洗涤；和(6)快速冲洗步骤，其中柱用6-10CV的水以流速5-10BVH洗涤。仅提供这些运行条件作为实例。可以适当地修改这些运行条件以实现琥珀酸的最大回收，伴以极高的纯度水平。
来自含有阳离子交换树脂的柱的流体经过折射仪(带有控制单元CBM-28的Shimadzu RID-10)以测量来自层析柱的流体的折射率(图5)。来自折射仪的流体管线也经过UV二极管阵列分光光度计以检测210nm处的吸光度。除了对来自层析柱的流体进行这些光学测量外，还对从层析柱收集的级分进行化学分析。在305分钟时程期间从层析柱收集五个不同级分，如表3中和图7中显示。
分析如表3中所述那样收集的五个不同级分的琥珀酸、乙酸、SO4 2-和NH4 +含量。在配有BioRad Aminex HPX-87H柱的Agilent 1200HPLC装置上分析在发酵液中存在的琥珀酸和其他有机酸杂质。使用BioRadMicroguard阳离子H+作为保护柱。在0.008N硫酸中制备HPLC分析用标准物。HPLC柱温维持在50°C。使用0.008N浓度的硫酸作为流速0.6ml/分钟的流动相。通过测量多种组分在210nm处的吸收，进行所述组分的定量。
使用具有能够以mv报道的计量仪的Mettler Toledo联合NH4 +离子选择性电极(ISE)，测量铵离子浓度。通过将硫酸铵溶解于水中，制备标准溶液(5000、500、50和5ppm铵)。通过在纯水中溶解已知量的琥珀酸晶体制备试样。
使用如美国俄亥俄州辛辛那提美国环境保护署的研究开发办公室的环境监测系统实验室提供的用于离子层析法测定无机离子的方法300.0(修订2.1，1993年8月)，进行硫酸盐分析。
采用Dowex G-26H树脂的初步开发工作集中在优化针对用水快速冲洗后再生Dowex G-26H树脂所要求的硫酸浓度上。图5和图6显示来自以下实验的结果，所述实验用于优化涉及琥珀酸铵的初始盐分解反应后用于离子交换树脂再生的硫酸需求。这两个图显示了两个不同实验中初始160分钟期间，来自层析柱的溶液的折射率的图谱。在层析运行期间，还在不同时间进行琥珀酸、乙酸、SO4 2-和甘油的测量。
将使用大肠杆菌KJ122菌株所获得的具有65g/L初始琥珀酸铵浓度的发酵液装载在具有Dowex G-26H树脂的层析柱上。将2.36CV的进料添加至该层析柱。在图5中描述的实验中，在60分钟洗脱的级分中观察到峰值琥珀酸浓度64.69g/L。在相同时间点，在从该柱洗脱的级分中，发现甘油浓度是1.67g/L并且发现乙酸浓度是3.94g/L。然而，折射值继续增加直至80分钟，并且在60和80分钟之间存在一个不同的峰。在60和80分钟之间的第二个峰代表突破峰，所述突破峰可归因于阳离子交换树脂被源自头60分钟期间盐分解反应的铵阳离子充分饱和后琥珀酸铵的洗脱。如本发明中所定义，术语“突破峰”对应于离子交换树脂被硫酸根离子饱和后从柱中洗脱的级分。换而言之，突破峰基本上含有进料溶液的原始组分。在64分钟从柱洗脱的级分中，发现硫酸盐浓度是167.7ppm，并且在77分钟洗脱的级分中，硫酸盐是检测不到的。在85分钟洗脱的级分中，琥珀酸浓度是0.44g/L并且琥珀酸浓度下降至0.11g/L的水平。这个观察结果表明，通过优化适宜的进料浓度，可以消除因进料材料中过量的琥珀酸铵所致的第二峰。
我们在图6内描述的实验中观察到相似的层析图谱。两个不同的峰是在分离的头80分钟内是可检测的。第一峰归因于琥珀酸的洗脱，如在较早时间点的级分中存在高浓度琥珀酸所证实。在45分钟洗脱的级分中，发现琥珀酸浓度是72.45g/L，该浓度在55分钟洗脱的级分中下降至66.12g/L的水平并且在72分钟洗脱的级分中降至0.55g/L的水平。在92分钟洗脱的级分中，发现琥珀酸浓度是0.07g/L。在45分钟洗脱的级分中，发现硫酸盐浓度是810ppm，所述硫酸盐浓度在72分钟洗脱的级分中下降至18.2ppm水平。这些观察结果共同表明，在图5和图6内所报道的实验中，第二峰归因于硫酸铵的洗脱，所述硫酸铵没有经历在阳离子离子交换树脂表面上的盐分解反应，这归咎于阳离子离子交换树脂被源自琥珀酸铵分解的硫酸根离子所饱和。
在5图所示的实验中，作为使阳离子交换树脂再生的方式，在110分钟添加2CV的5%(w/w)硫酸以启动再生过程。这种再生过程预期释放硫酸铵，如添加硫酸后来自层析柱的流体的折射率增加所证实。如在160分钟的折射率所示，在160分钟用5%硫酸洗涤时，硫酸铵的释放不完全。在150分钟洗脱的级分中，发现硫酸盐浓度是9585ppm。然而，如图6中所示，通过增加硫酸浓度至10%，可以实现阳离子交换树脂的完全再生，如折射率值达到基础水平所证实。在10%(w/w)硫酸用于再生阳离子离子交换树脂的情况下，发现在92分钟洗脱的级分中的硫酸盐浓度是20128ppm。在139分钟洗脱的级分中，发现硫酸盐浓度是2664ppm，并且在221分钟，硫酸盐浓度下降至水平36.6ppm。
在确定10%硫酸浓度对于实现完全再生阳离子交换树脂是最佳后，使用Dowex G-26H树脂实施另外七项实验(实验4-10)。7图中显示了这七项实验中的一项实验的折射率图谱。图7还显示了与收集的多个级分相对应的折射率图谱区。表4提供了用Dowex G-26H树脂进行的实验4-10的级分F2中琥珀酸的纯度和回收百分比。
在优化再生阳离子交换树脂所需要的硫酸浓度后，用另一种阳离子交换树脂Lanxess S100H进行实验以优化进料体积以实现将琥珀酸峰与突破峰分开。如表5中所示，使用1.5至2.16CV范围内不同体积的进料材料实施六个不同实验。
图8中显示这六个不同实验的折射率图谱。如8图中所示，通过降低进料体积至1.5CV，可以消除突破峰并且以不同的单峰实现琥珀酸回收。为清晰起见，图9仅显示使用1.5CV进料，采用Lanxess S100H阳离子交换树脂的试验5的折射率图谱。表6提供了定量分析在8图内所示峰1和峰2级分中的琥珀酸、乙酸、SO4 2-和NH4 +含量的结果。如图8和表6中所示的结果显示，通过控制进料体积，可以消除突破峰并且以单峰实现琥珀酸回收。这还由以下事实证实：在试验5中，添加1.5CV进料的情况下，以单峰回收琥珀酸是可能的。这个峰显示NH4+的最小值。NH4+在试验5的峰1级分中的量比来自其余试验的峰1级分中的NH4+含量低100倍，其中在所述其余试验中使用更高体积的进料。此外，峰1级分的SO42-值在全部试验中是较低的，表明在这些实验中使用的冲洗方案对于用下一轮进料添加引发柱之前除去全部杂质是最佳的。
实施例3
阴离子交换树脂层析的脉冲试验结果
为了选择待用于连续离子交换层析中的阴离子交换树脂，用发酵液和三种不同的阴离子交换树脂实施脉冲试验。发酵液具有如表7中所示的组成。
表8中提供了本发明中所测试的三种不同阴离子交换树脂的化学特征。表9中提供使用这三种阴离子交换树脂中每一种的样品洗脱顺序图谱。柱(最初在硫酸盐形式下)用具有表9中所提供体积的原始培养液过载以估计最大树脂容量。柱用水冲洗，随后是包括用10%硫酸洗涤和用水冲洗的再生步骤。表10中提供本发明中所测试的三种树脂的每一者的性能总结。树脂XA 3121显示在琥珀酸盐容量方面的不良效率。在第一循环期间，树脂XA 4122和XA 3114产生总交换容量或所需冲洗体积方面十分接近的结果。
在评审来自采用三种不同阴离子交换树脂的脉冲试验的结果后，选择XA 3114用于连续离子交换试验。选择XA 3114树脂用于连续离子交换操作是基于以下两个理由：(1)在工业规模上，再生速率受限于使化学品消耗最小化。为了保持处于琥珀酸盐进入萃余液的可接受泄漏值，与实验室规模下测量的最大容量相比，可以降低树脂的工作容量。因而，可以用比XA4122具有更大容量的XA 3114实现更大的离子交换容量。(2)XA 3114是有助于增加分离效率和最小化冲洗水体积的单球体型树脂。
实施例4
采用阴离子交换树脂的连续离子交换层析
与分批模式相比，连续离子交换允许增加琥珀酸级分的纯度、降低总体化学组成和降低水消耗。连续离子交换层析在10根装填有阴离子树脂(0.4L/柱)的柱上进行。试验分成4个区域，每个区域由1至3根柱组成。每个工序分成如图10中所显示的2个步骤。琥珀酸盐在阴离子树脂上截获并且在酸再生期间释放。再生以顺流模式(co-current mode)进行。在萃余液中回收硫酸铵，并且在提取物中回收琥珀酸。
试验期间，连续离子交换过程在50°C进行以避免进入离子交换柱的琥珀酸的任何结晶。
在正常基础上，将入口和出口从一个柱至下一个柱布置在下游以模拟树脂的逆流置换。例如，在图10上，在步骤结束时，1号柱变成用于下一个工序的4号柱。
进行与六种不同设定相对应的六个不同试验以达到回收和纯度目标。注入产物的体积和进料及再生剂的浓度对于每种设定是不同的。表11提供使用阴离子树脂的连续离子交换的顺序描述。
对于设定1至3，将再生的出口切成两个部分：第一部分收集为提取物产物，而收集物的末尾送至稀的再生剂(DRG)流。对于设定4至6，将完整的出口再生物收集为提取物产物。
将再生剂浓度固定在80g/LH2SO4以避免过高琥珀酸浓度进入提取物级分，这可能导致酸结晶至柱中。此外，柱恒温保持在50°C。
表12中报告了与先前设定中每一者相对应的不同流的组成。
对于设定1至5，进料琥珀酸盐浓度是55-60g/L。从设定6起，将进料产物稀释至50g/L琥珀酸盐，以改善与阴离子树脂上的硫酸盐交换并且减少琥珀酸盐丢失至萃余液中。后一种设定在萃余液中产生80g/L硫酸铵，伴以2.8g/L琥珀酸盐泄漏。将提取物浓缩至41g/L琥珀酸并且掺杂有少量其他阴离子(低于1g/L硫酸盐)。
稀的进料浓度是2g/L琥珀酸铵，但是含有3g/L的硫酸根阴离子。这可以用作澄清步骤中的渗滤水。
在稀的再生剂中，硫酸盐浓度达到35g/L。这种稀的再生剂可以直接用作再次制备再生剂的溶剂。它含有大约2g/L琥珀酸盐，所述琥珀酸盐随后再循环至柱，并且不丢失。质量平衡总体上平衡并且的确证实所述结果。对于浓缩较少的乙酸盐，质量平衡更难以建立。表13总结了对每种设定计算的性能。
应当指出，琥珀酸载量和回收速率将因采用氯化物形式的树脂工作并且用HCl代替H2SO4进行再生而更高。实际上，均为二价的琥珀酸盐和硫酸盐之间在树脂上的竞争是高的。这导致较多琥珀酸盐泄漏至萃余液中，原因是两个种类之间的交换在生产模式下更困难。另一方面，琥珀酸盐和氯化物之间的竞争有利于琥珀酸盐，因为树脂对二价种类亲和力比一价种类亲和力更大。因此，用HCl再生树脂将导致较少琥珀酸盐泄漏至萃余液和高的回收率。此外，H2SO4被视为一种非完全解离的酸，这意味树脂需要比完全解离的HCl更高的H2SO4再生速率以实现相同的再生效率。
实施例5
精加工试验
精加工试验的目的是确定确保优异琥珀酸晶体质量的必需设计。这个步骤包括使用纳米过滤(NF)，并且精加工步骤的最终目的是获得99.5%纯度的白色琥珀酸晶体。离子交换提取物由NF处理以在输送产物至结晶步骤之前除去颜色。将NF渗透液(脱色的琥珀酸)输送至结晶步骤。在表15中提供纳米过滤中使用的滤器的特征。
使用来自离子交换提取设定6的进料产物作为精加工试验期间的原料。当达到FCV=31时，实验因低渗余物水平而终止。进行两个终末渗滤(水/渗余物比=各自1/1)以增加琥珀酸盐回收率。图11中报道渗透液流发展。如图11中所示，精加工试验展示了不寻常的行为。在显示标准下降趋势之前，流速显示流速增加。这可以由平行发生的和在相对恒定的渗余物组成下发生的温度增加的两种效应解释。
表16中提供流出液组成。如在420nm的光密度测量，在进料和渗透液之间存在因纳米过滤产生的86%光密度减少。
如预期那样，在渗透液中回收大部分琥珀酸。表17中显示估计的停留率和渗透液级分，所述渗透液级分代表回收至渗透液中的进料内容物级分。
大多处于其缔合酸形式的弱有机酸(琥珀酸和乳酸)存在于pH2.5处。因此，它们是大多未电离的，并且它们的水溶剂化数（water salvationnumber）很低。作为小分子它们可以容易地穿过NF膜至渗透液流；故它们的停留率低(或对于乳酸，甚至为负)。在VCF=31处的运行允许回收96%的琥珀酸。额外的渗滤帮助实现98%的回收。该比率可以再次容易地改进。
盐(硫酸盐和铵)在离子形式下更多地溶剂化并且随后占据更大的体积，尤其是二价硫酸根阴离子。另外，考虑到溶液的电中性，硫酸盐和铵仍保持偶联。它们的停留率均高。
实施例6
琥珀酸的蒸发和结晶
蒸发从连续离子交换层析回收的琥珀酸以达到足够的琥珀酸浓度以启动结晶步骤。琥珀酸具有253°C的沸点，而琥珀酸制备物中其他可能的有机酸杂质如乙酸和乳酸具有较低沸点。乙酸的沸点是118°C并且乳酸的沸点是122°C。因而，使用一个蒸发步骤，除了移除一些乙酸和乳酸杂质外，还将琥珀酸浓缩至多到420g/L。
通过冷却容器，使浓缩的琥珀酸结晶。以下方案用于结晶：(1)在85°C浓缩琥珀酸至多到420g/L。(2)用80μm直径的纯琥珀酸晶种启动结晶。(3)根据图12中所示的图谱，将产物经20小时从85°C冷却至20°C。(4)用饱和的纯琥珀酸溶液洗涤最终晶体。
采用以下三种不同的琥珀酸制备物实施结晶过程。(1)来自连续离子交换层析的未精加工的提取物；(2)来自连续离子交换层析的NF精加工的提取物；(3)含有25g/L硫酸根阴离子的合成性琥珀酸制备物。表18提供了三种不同的琥珀酸制备物进行的结晶实验的结果。如表20中所示结果显示，对于测试的全部三种样品，均实现多于99.85%的晶体纯度。结晶产率是89%至93%。
通过测量过滤的100g/L终产物溶液的光密度，确定晶状琥珀酸的颜色(表19)。从离子交换层析的未精加工提取物产生的琥珀酸晶体为棕色。晶体为针形，长度1-2mm。如图13内的扫描电子显微镜照片中所示，NF精加工的晶体是白色的，并且与来自未精加工的提取物中的晶体相比，在尺寸上较大。
实施例7硫酸铵流出液的结晶
使用以设定2-4产生的萃余液混合物作为盐流出液结晶试验的原料。开始结晶之前，在95°C通过恒定蒸发，将萃余液浓缩50倍。以两个步骤进行萃余液的浓缩。在第一步骤中，使用反渗透以将萃余液从80g/L硫酸铵浓度浓缩至160g/L硫酸铵浓度。在第二步骤中，借助蒸发实现进一步浓缩。
表20汇总了从萃余液获得的硫酸铵晶体的组成，其中以连续离子交换层析的设定2-4产生所述萃余液。在晶体中检测不到有机盐。晶体为棕色并且具有如图14内的扫描电子显微镜照片中所示的不同的形状。
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参考文献
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Claims (12)

1.一种用于从含有琥珀酸铵的发酵液回收琥珀酸的方法，其中所述方法包括步骤：
(a)提供包含琥珀酸铵盐的水溶液；
(b)将酸性离子交换树脂与包含琥珀酸铵盐的水溶液接触；
(c)在水溶液中将所述琥珀酸铵盐转化成琥珀酸和铵阳离子；
(d)将铵阳离子从水溶液分离到离子交换树脂的表面上用于交换质子，从而使琥珀酸留在水溶液中；并且
(e)回收水溶液中的琥珀酸；
其中如下完成所述转化及分离步骤(c)和(d)：将包含琥珀酸铵盐的水溶液与具有比琥珀酸的酸解离常数小至少0.5的酸解离常数(pKa)的酸性离子交换树脂接触，以形成包含琥珀酸的水溶液和含有非水铵阳离子的酸性离子交换树脂。
2.权利要求1的方法，还包括步骤：
(a)用酸洗涤含有铵阳离子的酸性离子交换树脂，所述酸具有比离子交换树脂的酸解离常数小至少0.5的酸解离常数(pKa)；并且
(b)回收铵盐，其包含所述铵阳离子和洗涤酸的共轭碱。
3.权利要求1的方法，其中用于洗涤含有铵阳离子的酸性离子交换树脂的酸选自硫酸、磷酸、盐酸和硝酸。
4.一种用于从含有琥珀酸铵的发酵液回收琥珀酸的方法，其中所述方法包括步骤：
(a)提供含有琥珀酸铵的发酵液和阴离子型离子交换树脂；
(b)将阴离子型离子交换树脂与含有琥珀酸铵的发酵液接触；
(c)使发酵液中的琥珀酸铵转化成琥珀酸根阴离子和铵阳离子；
(d)将琥珀酸根阴离子与所述离子交换树脂上的阴离子交换；
(e)在合适条件下洗涤所述离子交换树脂以除去与所述离子交换树脂结合的琥珀酸根阴离子之外的物质；
(f)通过用含有比来自离子交换树脂的琥珀酸根阴离子更强的阴离子的酸以有效置换所述琥珀酸根阴离子的量洗涤所述树脂，将所述琥珀酸根阴离子置换为琥珀酸；并且
(g)收集含有琥珀酸的级分。
5.权利要求4的方法，其中用于洗涤含有铵阳离子的酸性离子交换树脂的酸选自硫酸、磷酸、盐酸和硝酸。
6.如权利要求1或4中所述的用于从含有琥珀酸铵的发酵液回收琥珀酸的方法，其中所述离子交换树脂和所述发酵液之间的接触以分批模式实现。
7.如权利要求1或4中所述的用于从含有琥珀酸铵的发酵液回收琥珀酸的方法，其中所述离子交换树脂和所述发酵液之间的接触以连续离子交换模式实现。
8.权利要求1或4的方法，还包括步骤：使用选自离心、高温处理、碱性处理、微滤、超滤和渗滤的方法澄清包含琥珀酸铵的水溶液。
9.权利要求1或4的方法，还包括精加工回收的琥珀酸的步骤，其中回收的琥珀酸经纳米膜过滤以实现脱色。
10.权利要求1或4的方法，还包括蒸发步骤，其中将回收的琥珀酸蒸发以实现至少100g琥珀酸/升的浓度。
11.权利要求1或4的方法，还包括结晶步骤，其中将含水形式的回收的琥珀酸转化成晶体形式。
12.权利要求1或4的方法，其中从所述方法回收的琥珀酸具有小于100ppm的硫酸盐浓度。
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