CN101831483B - L-蛋氨酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
L-蛋氨酸的制备方法，采用以下步骤：1)乙酰化D，L-蛋氨酸的消旋混合物；2)酰基转移酶解该乙酰化混合物，所述的酶裂解反应产物进行超滤以分离酶；3)将步骤2)得到的产物流采用荷负电纳滤膜进行过滤，得到截留液和透过液；4)对步骤3)得到的透过液进行结晶并分离由此制得的L-蛋氨酸；5)离子交换纯化步骤3)所得的截留液；6)乙酰化步骤4)所得的结晶母液，并循环至步骤2)中进行酶解；7)外消旋步骤5)纯化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸，并将该外消旋产物循环至步骤2)进行酶解。
Description
技术领域：本发明涉及一种L-蛋氨酸的制备方法。特别是，本发明包括制备L-蛋氨酸的循环酶法。
背景技术：L-蛋氨酸主要用于营养学领域，例如，在渗析溶液中的肠外注入液或作为饲料添加剂和食物添加剂。对于本领域技术人员，已知有多种方法制备L-蛋氨酸。然而适用于工业化的的制备方法却很少。现有技术中制备L-蛋氨酸的工业化方法均包括至少一个酶法步骤。现有为公众所知的工业化方法为：酶拆分外消旋的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸和酶裂解外消旋的D，L-甲基硫乙基己内酰胺(US6114163和US6524837)。在这些方法中，酰基转移酶路线已被实现，从而在工业水平上获得几乎完全纯的对映异构体L-蛋氨酸(WO 97/21 667)。在WO97/21663中，公开了制备L-氨基酸和L-蛋氨酸的优化方法，其中优选将制得的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸通过外消旋步骤循环至乙酰转移酶的酶裂解中，从而利用了所有的原料。中国专利申请CN200610084263.0公开了一种优化的L-蛋氨酸生产方法，其包括：
a)乙酰化D，L-蛋氨酸的外消旋或几乎外消旋的混合物；
b)酶裂解所述混合物；
c)结晶并分离由此制得的L-蛋氨酸；
d)任选地，乙酰化所得的结晶母液；
e)离子交换纯化所得的乙酰化的母液；
f)外消旋在步骤e)中的所述纯化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸；
g)循环步骤乃的外消旋混合物至步骤b)中；
该申请声称其改进的生产方法能够获得原料的高产率以及更少的废物流。但我们发现其工艺所有步骤均为现有技术，而该制备方法是对现有技术的简单组合，并且不能提高原料产率。
发明内容：
本发明提供了一种改进的L-蛋氨酸的制备方法，包括以下步骤
1)乙酰化D，L-蛋氨酸的外消旋或几乎外消旋的混合物；
2)酰基转移酶裂解该乙酰化混合物，所述的酶裂解反应产物进行超滤以分离酶；
3)将步骤2)得到的产物流采用荷负电纳滤膜进行过滤，得到截留液和透过液；
4)对步骤3)得到的透过液进行结晶并分离由此制得的L-蛋氨酸；
5)离子交换纯化步骤3)所得的截留液；
6)乙酰化步骤4)所得的结晶母液，并循环至步骤2)中进行酶解
7)外消旋步骤5)纯化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸，并将该产物循环至步骤2)进行酶解。
尤其是在步骤3)中使用荷负电纳滤膜对L-蛋氨酸与N-乙酰-D-蛋氨酸进行分离，直接降低了两者后期通过重结晶进行分离的难度，提高了L-蛋氨酸成品的纯度，简化了操作工艺。
步骤1)乙酰化D，L-蛋氨酸的外消旋或几乎外消旋的混合物；
L-氨基酸的乙酰化是本领域技术人员所知的。许多文献涉及从游离氨基酸通过Schotten-Baumann或Einhorn-方法获得N-乙酰基氨基酸(Organikum，VEB Deutscher Verlag derWissenschaften，16.Auflage，Berlin 1986，S.407)。同样，蛋氨酸可以被乙酰化(US6114163；WO97/21667)。优选采用固体形式或以30-50％的碱溶液的形式供应D，L-蛋氨酸，采用D，L-蛋氨酸钠盐溶液。另外，也可以使用含有D，(L)-、(D)，L-或D，L-蛋氨酸的母液。通过向D，L-蛋氨酸的水溶液中加入乙酸酐或乙酰氯，和碱(例如氢氧化钠/钾)在20-40℃下进行乙酰化。对于接下来的酶拆分，可以直接使用来自于乙酰化步骤的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸的碱性盐溶液。在此情况中，不需要分离N-乙酰基-D，L-蛋氨酸。
2)酰基转移酶裂解该乙酰化混合物
该步骤对于本领域技术人员来说是已知的，按照US6114163公开的方法进行。优选通过将大约0.4-2.0mol/L的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸的碱性水溶液，优选pH值在6.0和7.5之间的钠盐，与酰基转移酶接触而进行。在此，N-乙酰基-L-蛋氨酸选择性地被酶拆分成乙酸盐和L-蛋氨酸，而N-乙酰基-D-蛋氨酸不受影响。优选酶拆分之前，将pH值被调节为7.0-7.5的来自于外消旋步骤7)的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸盐溶液循环至待酰基转移酶裂解的混合物中，并且所述混合物可以经活性炭和过滤处理。然后将悬浮液在压滤机上过滤，并将澄清滤液收集于罐中。可以加入痕量的氯化锌或氯化钴作为酶拆分反应的催化剂。用水将所述溶液稀释至N-乙酰基-D，L-蛋氨酸碱性盐的浓度为约0.5-1.0mol/L，优选0.6-0.9mol/L，并供应至用于酶裂解反应的反应器中。所述反应器可以包括具有膜的超滤单元，所述膜具有5000-20000道尔顿，优选7500-12000道尔顿的截留值(cut-off)。用泵将所述N-乙酰基-D，L-蛋氨酸盐溶液供入所谓的酶膜反应器(Enzyme Membrane Reactor)(EP1170277及其引用的文献)中，并混合入其中含有酰基转移酶，优选
酰基转移酶或其等价物的浓缩流(concentrate stream)(意指其中存在酶的那部分混合物)中。也可以在酶选择性地裂解N-乙酰基-L-蛋氨酸后再通过过滤器进行过滤。所述酶选择性地裂解N-乙酰基-L-蛋氨酸碱金属盐，优选钠盐，以形成L-蛋氨酸和碱金属乙酸盐。具有分子量为约80000道尔顿的酰基转移酶不能透过超滤膜，因此而留在浓缩流中。所有其它更小的的化合物可以透过所述膜而进入产物流中。该酶促反应有利地在温度为20-40℃和pH值范围为7.0-7.5下进行。
3)将步骤2)得到的产物流采用截留值500-1000道尔顿的荷负电纳滤膜进行过滤，得到截留液和透过液；
所述的荷负电纳滤膜即含有阴离子活性基团，显负电性的的纳滤膜，所述纳滤膜选自交联芳香聚酰胺、交联聚酰胺、交联聚哌嗪酰胺、交联聚哌嗪酰胺、磺化聚砜、聚酰胺、芳香聚酰胺纳滤膜中的一种，所述的阴离子活性基团选自磺酸基(-SO3H)或，羧基(-COOH)，优选磺化聚砜纳滤膜，所述纳滤膜为采用截留值500-1000道尔顿的荷负电纳滤膜，优选截留值为800-1000道尔顿的荷负电纳滤膜，更优选截留值为1000道尔顿的磺化聚砜纳滤膜。所述纳滤膜在过滤时操作压力为0.25-1.2Mpa。截留液与透过液的体积比为1∶4至1∶1，优选1∶1.5至1∶1。通过将步骤2)得到的产物流采用截留值500-1000道尔顿的荷负电纳滤膜进行过滤，得到截留液和透过液，透过液为通过纳滤膜的物质，主要是L-蛋氨酸，而截留液为不能通过纳滤膜的物质，主要是N-乙酰-L-蛋氨酸。在过滤过程中，优选加压进行过滤。
4)对步骤3)得到的透过液进行结晶并分离由此制得的L-蛋氨酸；
将步骤3)得到的透过液在减压条件下泵送入蒸发装置进行结晶，所述的蒸发装置可以是普通的薄膜蒸发器或降膜蒸发器等，类似工艺可以参考US6114163。优选地，在低于会发生外消旋的温度下进行浓缩，尤其是低于90℃。可以通过活性炭和压滤机的过滤纯化所述的透过液以在优选70-90℃之间脱色除杂质。为了得到L-蛋氨酸，可以进行通过微纤维过滤器的过滤，所述过滤器具有至少0.2μm的截留值；也可以通过常规的滤纸或滤布的方法得到。用于此目的优选的膜由聚醚飒或聚丙烯或本领域技术人员已知的其它材料制成。冷却时L-蛋氨酸可以被结晶(US6114163)。随后，它可以通过离心而过滤，经清洗并干燥。优选地，清洗溶液由甲醇水溶液(甲醇含量65-90重量％)构成。清洗溶液可以被回收并且可以通过蒸馏回收甲醇。最优选的是，将获得的晶体悬浮于甲醇溶液中以除去最后的杂质并保证微生物的质量。优选在低于40℃的温度下进行悬浮步骤。悬浮的晶体再一次通过离心而过滤，并用上述的甲醇溶液清洗。可以通过蒸馏再一次循环甲醇清洗溶液。作为产物的L-蛋氨酸含量可以达到98％以上。
5)离子交换纯化步骤3)所得的截留液
步骤3)所得的截留液包括未反应的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸和少量的L-蛋氨酸。为了不浪费后者，必须对该材料进行进一步纯化。有利地，通过阳离子交换方法进行该纯化。为了获得纯化的副产物，对与截留液成分组成类似的混合溶液进行离子交换处理是本领域技术人员已知的(EP 276392；WO 97/21667)。通过将所述截留液经受阳离子交换树脂，未保护的L-蛋氨酸和碱金属离子则被吸附至静态相，而剩余的产物如N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸和乙酸盐被洗脱。在一个优选的方式中，所述溶液被加热到45-80℃并泵送至填充有阳离子树脂的柱上。L-蛋氨酸和碱金属(优选钠)离子被吸附，而N-乙酰基-D，(L)蛋氨酸和乙酸的酸性部分通过该柱。有利地，该过程可以通过三个独立的离子交换柱进行。在第一柱中，来自晶体分离的母液如上述处理以分离L-蛋氨酸和对溶液去矿化。随后，在阴离子树脂和阳离子树脂上成功处理N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸和乙酸部分。阴离子树脂旨在从混合物中除去所有的阴离子，典型的，尤其是在外消旋步骤7)中会损坏不锈钢设备的氯化物。阳离子树脂用来除去会导致步骤7)中不完全外消旋的最后痕量的碱金属离子和L，(D)蛋氨酸。根据本领域技术人员己知的方法，离子交换树脂可以重新载有H+或OH-。含有L-蛋氨酸的部分仍然存在于第一根阳离子柱中，通过本领域技术人员的常识被洗脱、收集。离子交换纯化得到的L-蛋氨酸任选地可以被例如通过结晶分离，优选加入步骤4)中进行结晶。
6)乙酰化步骤4)所得的结晶母液，并将其加入步骤2)进行酶解。
结晶过程步骤4)的母液包括少量的D-蛋氨酸，还有可能存在少量的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸。为了提高收率，D-蛋氨酸有时需要被乙酰化并重新结合进入所述过程。如果存在少量的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸，可以直接将其加入步骤2)进行酶解，也可以进行外消旋后加入步骤2)进行酶解。针对少量的D-蛋氨酸，需要将母液的pH值调节至8.0-12.0，并向此混合物加入相应量的乙酰氯或乙酸酐(己述的Schotten-Baumann-方法)。完成后，浓缩所得的混合物，并将其循环至步骤2)中进行酶解。任选地，外消旋化所述的乙酰化结晶母液混合物，再将其循环至步骤2)中进行酶解。
7)外消旋步骤5)纯化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸，并将该外消旋产物循环至步骤2)
为了相比于外消旋的蛋氨酸，使制得的L-蛋氨酸的比例最大化，必须将分离的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸循环至过程中。然而，为了完成此目的，所述重新结合仅可通过其中在循环的混合物中增加N-乙酰基-L-蛋氨酸的量的步骤而进行，也即必须进行外消旋。外消旋N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸对本领域技术人员来说是已知的(乙酰-D-蛋氨酸消旋工艺的研究，张清玉等，化学工业与工程，2004年3月，第21卷第2期，91-95；WO 97/21650；EP 175840；US6114163)。优选用离子交换过程的各自浓缩和去矿化的部分进行N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸的外消旋。更优选，通过加入少量的乙酸酐外消旋所得到的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸的熔融物以形成N-乙酰基-D，L-蛋氨酸。该混合物被加热至约120-150℃，并随后在稀释的碱金属(优选钠)氢氧化物的溶液中骤冷。或者将在碱金属氢氧化物中的稀释的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸溶液加入步骤2)进行酶解。在使用碱金属氢氧化物的情况中，用于酶拆分的溶液的pH值可以仅通过加入N-乙酰基-D，L-蛋氨酸碱金属氢氧化物溶液进行调节。
或者，在本发明的另一优选的实施方式中，将步骤5)离子交换纯化的L-蛋氨酸溶液加入至步骤4)的结晶溶液。在结晶前，优选在活性炭处理前，将步骤5)离子交换纯化得到L-蛋氨酸溶液被加入至步骤4)的溶液是有利的。本发明的另一优选的变体涉及如下，在酶裂解前，将锌离子和/或钴离子加入至混合物。这种方法明显地增加了酶裂解能力。有利的是，利用每升反应混合物10-3-10-5M的锌离子。在此情形中，使用的钴离子的量可以是每单位酶10-3-10-5的钴离子。为了进一步最小化来自反应过程的废物流，优选在纯化L-蛋氨酸晶体的过程中，收集使用的甲醇清洗溶液和蒸馏可以再利用的甲醇。剩余的重相包括大量的L-蛋氨酸和N-乙酰基-D，L-蛋氨酸。该重相可以任选地被循环至步骤6)的乙酰化过程中。结果是该材料被重新结合至总的L-蛋氨酸的制备过程中。从上述描述的方法可以看出，本发明提供的L-蛋氨酸的制备方法由于其产生最小的废物量和得到极高产率的高质量的产品，可以在技术上高度多样化地运作。方法步骤的结合使获得L-蛋氨酸较高的总收率，这明显优于现有技术，并有助于获得上述有利的结果。
术语，D，(L)-，(D)，L-或D，L-是指具有不同量的D-和L-异构体的对映异构体的混合物。在D，(L)-混合物中，D-对映异构体是相对于L-形式主要存在的。同样，在(D)，L-混合物中，L-对于D-异构体的比例大于1。D，L-混合物是外消旋或几乎外消旋的混合物。
与现有技术不同，本发明提供的L-蛋氨酸制备方法在将酶裂解N-乙酰基-D，L-蛋氨酸的产物经过超滤膜过滤以分离酶等大分子杂质后，再采用纳滤膜进行进一步的过滤，将L-蛋氨酸与N-乙酰-D(L)-蛋氨酸分离开，与现有技术中大量的L-蛋氨酸在离子交换步骤进行回收相比，本发明提供的制备方法提高了L-蛋氨酸的回收率和L-蛋氨酸的质量，同时降低了后续步骤6)中进行离子交换时所用的树脂量及相应的洗脱、再生树脂所用的化学试剂量，因此也降低了生产的成本，通过循环套用步骤7)得到外消旋的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸至步骤2)的酶裂解步骤中，可以使得符合《中国药典》2005版要求的药用级L-蛋氨酸的收率达到95％以上(相对于N-乙酰基-D，L-蛋氨酸的摩尔百分比收率)。
具体实施方式
所述具体实施方式仅为本发明提供L-蛋氨酸制备方法的实施举例，不能解释为对本发明实施方式的限制，本发明提供的制备方法，可以在结合任何公知常识基础上以任何有利的方式进行实施。本实施方式在循环运行后符合中国药典2005版要求的L-蛋氨酸的收率可达95％以上(相对于N-乙酰-D，L蛋氨酸的摩尔收率)。
1)乙酰化D，L-蛋氨酸的消旋混合物
按照US6114163所公开的方法乙酰化D，L-蛋氨酸，得到N-乙酰基-D，L-蛋氨酸。
2)酶裂解该乙酰化混合物
按照US6114163所公开的方法，将N-乙酰-D，L-蛋氨酸配制成pH值为7.0-7.5，浓度为0.6mol/L的钠盐水溶液。按照锌离子浓度为10-3mo/L的比例向N-乙酰-D，L-蛋氨酸钠盐水溶液中加入氯化锌。采用商品名为
的酰基转移酶，酶活力为30000U/g，操作温度为37℃，最终转化率为85％，用截留值为10000道尔顿的超滤膜对最终转化后的反应液进行超滤以将产物流中的酶等大分子化合物除去。
3)将步骤2)得到的产物流采用荷负电纳滤膜进行过滤，得到截留液和透过液；
采用截留分子量为1000的磺化聚砜纳滤膜(NTR7450，Nitto Denko，Japan)对步骤2)得到的产物流进行过滤，得到截留液与透过液，操作压力为0.8Mpa，操作温度为35℃，所述截留液与透过液的体积比为1∶1。
4)对步骤3)得到的透过液进行结晶并分离由此制得的L-蛋氨酸
根据US6114163，将步骤3)和得到的透过液和步骤5)的阳离子树脂洗脱液在70℃条件下用活性炭脱色，脱色液压滤后在减压条件下泵送入薄膜蒸发器进行浓缩结晶，结晶温度低于90℃。所得结晶进行离心过滤，并于常温下用90％甲醇溶液清洗所得的L-蛋氨酸结晶，再一次离心过滤，甲醇回收蒸馏后循环使用，得到L-蛋氨酸结晶减压干燥，干燥温度110℃。得到的L-蛋氨酸含量为98.8％。
5)离子交换纯化步骤3)所得的透过液
将步骤3)所得的透过液按照EP276392；WO97/21667所公开的方法进行离子交换纯化：将透过液被加热到后70℃通过阳离子树脂柱1进行处理，然后将处理过的透过液再分别经过阴离子树脂柱和阳离子树脂柱2进行处理，洗脱阳离子树脂柱1和2，洗脱液中加入到步骤4)活性炭脱色前的溶液中一起进行结晶，制备L-蛋氨酸。洗脱阴离子树脂柱，洗脱液为步骤7)备用。
6)乙酰化步骤4)所得的结晶母液；
将步骤4)得到的结晶母液进行乙酰化，用氢氧化钠将母液的pH值调至10，采用US6114163中公开的方法用乙酸酐进行乙酰化。将酰化后的产物按照张清玉等(乙酰-D-蛋氨酸消旋工艺的研究，化学工业与工程，2004年3月，第21卷第2期，91-95)公开的方法进行。乙酰化后的产物可以加入步骤2)中进行酶解，也可以进行外消旋化处理，并循环至步骤2)中进行酶解。这主要根据步骤4)得到的结晶母液中D-蛋氨酸与L-蛋氨酸之间的比例决定，当D-蛋氨酸较多时就乙酰化后需要进行外消旋化处理，当L-蛋氨酸较多时可以乙酰化后循环至步骤2)中进行酶解。
7)外消旋步骤5)纯化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸，循环进入步骤2)。
将步骤5)阴离子树脂柱中的洗脱液(含有纯化的N-乙酰基-D，(L)-蛋氨酸)按照WO 97/21650；EP 175840；US6 114163和张清玉等(化学工业与工程，2004年3月，第21卷第2期，91-95)公开的方法采用乙酸酐进行外消旋得到几乎外消旋的N-乙酰基-D，L-蛋氨酸。用氢氧化钠溶液和水调节N-乙酰基-D，L-蛋氨酸的浓度为0.6-0.9mol，pH为7.0-8.0，按照锌离子浓度为10-3mo/L加入氯化锌，加入步骤2)进行酶解反应。
Claims (11)
1.一种L－蛋氨酸的制备方法，包括以下步骤
1）乙酰化D,L-蛋氨酸的消旋混合物，所述D,L-蛋氨酸的“D，L”是指外消旋或几乎外消旋的混合物；
2）酰基转移酶裂解该乙酰化混合物，所述的酶裂解反应产物进行超滤以分离酶；
3）将步骤2）得到的产物流采用荷负电纳滤膜进行过滤，得到截留液和透过液，所采用的荷负电纳滤膜的截留值为500-1000道尔顿；
4）对步骤3）得到的透过液进行结晶并分离由此制得的L-蛋氨酸；
5）离子交换纯化步骤3）所得的截留液；
6）乙酰化步骤4）所得的结晶母液，并循环至步骤2）中进行酶解；
7）外消旋步骤5）纯化的N-乙酰基-D, (L)-蛋氨酸，并将该外消旋产物循环至步骤2）进行酶解，所述的N-乙酰基-D,(L)-蛋氨酸中的“D, (L)”是指D-对映异构体是相对于L-形式主要存在的。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是对步骤6）的乙酰化结晶母液的产物进行外消旋化处理，并循环至步骤2）中进行酶解。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是对步骤5）离子交换纯化得到L-蛋氨酸加入步骤4）中进行结晶。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述步骤3）所采用的荷负电纳滤膜的截留值为800-1000道尔顿。
5.如权利要求1或4所述的制备方法，特征是所述步骤3）所采用的荷负电纳滤膜选自交联芳香聚酰胺、交联聚酰胺、交联聚哌嗪酰胺、磺化聚砜、聚酰胺、芳香聚酰胺纳滤膜中的一种。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所述步骤3）所采用的荷负电纳滤膜为磺化聚砜纳滤膜。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所述步骤3）所采用的荷负电纳滤膜为截留值为1000道尔顿的磺化聚砜纳滤膜。
8.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是所述步骤3）中截留液与透过液的体积比为1：4至1：1。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征是所述步骤3）中截留液与透过液的体积比为1：1.5至1：1。
10.如权利要求3所述的制备方法，其特征是所述步骤3）中截留液与透过液的体积比为1：4至1：1。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征是所述步骤3）中截留液与透过液的体积比为1：1.5至1：1。
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