KR20150000840A - mcl/lcl-PHA의 효율적인 고수율 제조를 위한, 신규의 환경적 분리 슈도모나스 sp. IPB-B26 및 N-128의 이용 - Google Patents

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드리테 파텐트포트폴리오 베타일리궁스게젤샤프트 엠베하 운트 코. 카게
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Abstract

본 발명은 Leibnitz Institute DSMZ에 DSM26199(슈도모나스 sp. IPB-B26) 및 DSM26200(슈도모나스 sp. N-128)으로 수탁된 슈도모나스 속에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 탄소 공급원을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계 및 상기 미생물로부터 PHA를 분리시키는 단계를 포함하는, 중쇄 및 장쇄 길이의 PHA의 제조방법에 관한 것이다. 상기 미생물이 높은 수율로 효율적으로 PHA를 제조할 수 있게 한다는 것이 관찰되었다. 또한, 본 발명의 미생물은 불포화 지방산을 제조되는 PHA로 혼입시킬 수 있다는 유용한 능력을 가진다. 따라서, 본 발명의 미생물은 상기 PHA를 사후에 개질, 및 가교결합 할 수 있게 하고, 이에 따라 상기 물질들에 대한 새로운 적용분야를 열고 있다.

Description

mcl/lcl-PHA의 효율적인 고수율 제조를 위한, 신규의 환경적 분리 슈도모나스 sp. IPB-B26 및 N-128의 이용{UTILIZATION OF THE NOVEL, ENVIRONMENTAL ISOLATES PSEUDOMONAS SP. IPB-B26 AND N-128 FOR THE EFFICIENT HIGH YIELD PRODUCTION OF MCL/LCL-PHAS}
본 발명은 폴리히드록시알카노에이트(PHA)의 생합성 분야에 속한다. 본 발명은 Leibnitz Institute DSMZ 독일생물자원센터(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에 DSM26199(슈도모나스 sp. IPB-B26) 또는 DSM26200(슈도모나스 sp. N-128)으로 기탁된 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 야생형 미생물에 관한 것이다. 상기 미생물은 PHA의 제조방법에 매우 유용한 것으로 증명되었다. 상기 미생물은 유전자 변형되지 않았으며, 포화 및 불포화 지방산뿐만 아니라 글리세롤과 같은 다양한 값싸고 지속가능한 공급원료로부터 중쇄 길이(mcl)/장쇄 길이(lcl)의 PHA를 매우 효율적으로 제조할 수 있다는 점이 관찰되었다. 생물반응기(bioreactor)에서, 추가적인 산소 공급이 없고 적당하게 교반되는 조건에서도, 상기 미생물은 높은 바이오매스 및 PHA 제조를 달성한다. 사용되는 실제 기질에 따라 제조되는 PHA는 불포화기(최고 17% 이상)를 포함할 수 있으며, 이는 더 넓은 스펙트럼의 PHA 특성 및/또는 PHA의 합성 후 관능화를 가능하게 한다. 또한, 본 발명은 mcl- 및/또는 lcl-PHA의 제조방법에 있어서 상기 미생물의 용도, 및 상기 제조방법에 의해 제조된 PHA에 관한 것이다.
PHA는 넓은 산업적 및 생의학적 응용범위를 갖는 재생가능한 공급원으로부터 제조된 생분해성 및 생체적합성인 열가소성 물질(3-히드록시 지방산의 폴리에스테르)이다(Williams & Peoples, 1996, Chemtech. 26: 38-44). PHA는 광범위한 박테리아에 의해 합성되고, 플라스틱 폐기물의 해로운 효과로부터 환경을 보호하기 위해 종래의 석유화학 기반 플라스틱을 대체하는 잠재적 용도 때문에 광범위하게 연구되어왔다.
PHA는 이들의 측쇄 길이 및 이들의 생합성 경로에 따라 2개의 군으로 분리될 수 있다. (R)-3-히드록시부티르산 유닛의 호모폴리머인 PHB와 같이 짧은 측쇄를 갖는 것들은 결정성 열가소성 플라스틱이고, 반면에 긴 측쇄를 갖는 PHA는 더 높은 탄성을 갖는다. 전자는 약 90년 동안 알려져 왔고(Lemoigne & Roukhelman, 1925, Ann. Des Fermentation, 527-536), 반면에 후자는 상대적으로 최근에 발견되었다(deSmet et al., 1983, J. Bacteriol. 154: 870-878). 그러나, 상기와 같이 지정되기 전에, (R)-3-히드록시부티르산 유닛 및 5 내지 16개의 탄소원자를 포함하는 더 긴 측쇄 (R)-3-히드록시산 유닛을 모두 포함하는 미생물 기원의 PHA가 식별되었다(Wallen & Rohweder, 1974, Environ. Sci. Technol. 8: 576-579). (R)-3-히드록시부티르산 및 5 내지 16개의 탄소원자를 포함하는 하나 이상의 긴 측쇄 히드록산 유닛의 코폴리머를 생산하는 다수의 박테리아가 식별되었다(Steinbuchel & Wiese, 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 691-697; Valentin et al., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 507-514; Valentin et al., 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 710-716 ; Abe et al., 1994, Int. J. Biol. Macromol. 16: 115-119; Lee et al., 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 901-909; Kato et al., 1996, Appl. Microbiol. Biotechnol. 45: 363-370; Valentin et al., 1996, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46: 261-267; US Patent No. 4,876,331). 상기 코폴리머는 PHB-co-HX(여기서, X는 3-히드록시알카노에이트 또는 6개 이상의 탄소의 알카노에이트 또는 알케노에이트임)로 지칭될 수 있다. 구체적인 2성분 코폴리머의 유용한 예는 PHB-co-3-히드록시헥사노에이트(PHB-co-3HH)이다(Brandl et al., 1989, Int. J. Biol. Macromol. 11: 49-55; Amos & McInerey, 1991, Arch. Microbiol. 155: 103-106; US Patent No. 5,292,860).
PHA가 상기한 바와 같이 생분해성 열가소성 플라스틱 및 바이오폴리머를 위한 재생가능한 공급원으로서의 이들의 잠재적 용도 때문에 광범위하게 연구되어왔고, 상업적으로 개발되고 광고되어왔지만(Hrabak, 1992, FEMS Microbiol. Rev. 103: 251-256), 이들의 제조비용은 종래의 석유화학 기반 플라스틱에 비해 매우 높고, 이는 이들이 더욱 널리 사용되는 것에 있어서 주된 장애에 해당한다(Choi & Lee, 1997, Bioprocess Eng. 17: 335-342). 상기한 바와 같이, 다양한 박테리아, 예를 들어 알칼리제네스 유트로푸스 ( Alcaligenes eutrophus ), 알칼리제네스 라투스( Alcaligenes latus ), 아조박터 빈란디 ( Azotobacter vinlandii ), 슈도모나스 액시도필라( Pseudomonas acitophila ), 슈도모나스 올레오바란스( Pseudomonas oleovarans), 대장균( Escherichia coli ), 로도코쿠스 유트로파( Rhodococcus eutropha), 크로모박테리움 비올라세움 ( Chromobacterium violaceum ), 크로마튬 비노섬( Chromatium vinosum ), 알카니보락스 보르쿠멘시스 ( Alcanivorax borkumensis ) 등이 PHA를 생산한다. 해당 분야에 알려진 PHA를 생산하는 모든 박테리아는 세포내 PHA를 생산하고, 이를 PHA 과립에 축적시킨다(Steinbuchel, 1991, Biomaterials, pp. 123-213). PHA 생산을 비싸게 하고, 이에 따라 석유화학-기반 플라스틱에 비해 바람직하지 않게 만드는 주된 문제점은 높은 수율로 물질을 생산하고, 물질이 추적되는 박테리아 세포 내에서 생산된 PHA를 회수하기 어렵다는 점이다. PHA의 총 제조비용을 감소시키기 위해, 일반적으로 i) 적절한 용매, ii) PHA의 차아염소산 추출, 및/또는 iii) 비-PHA 세포물질의 소화에 의한 세포파괴를 목적으로 하는, 효율적인 회수방법의 개발이 필수적인 것으로 생각되었다(Lee, 1996, Biotech. Bioeng. 49: 1-14).
산업규모에서, 이용가능한 미생물은 여전히 상대적으로 적은 PHA를 제공하고, 이는 이와 같은 미생물에 의해 PHA의 제조를 경제적으로 실현불가능하게 한다. 해당분야에 알려진 모든 방법은 제조 동안에 많은 양의 물, 및 추가적으로 이들의 회수를 위한 화학약품 및/또는 효소를 필요로 하고, 이는 제조비용을 감소시키는 것에 있어서 장애물이다. 따라서, PHA 제조를 위한 대체전략이 급히 필요하다.
최근에, 예를 들어 미생물이 더 많은 양의 PHA를 생산할 수 있도록 하기 위해, PHA를 생산하는 미생물의 유전자 변형을 위한 전략이 개발되었다. EP 1 913 135 A1는 PHA 제조를 위한 중간물질에 PHA 신타아제와 경쟁적으로 작용하는 유전자를 녹아웃(knock-out)함으로써 유전자 변형된 미생물을 개시한다. 중간물질을 위한 PHA 신타아제를 방해하는 효소의 미생물을 결핍시킴으로써, 중간물질의 전환이 PHA를 향하도록 할 수 있었다.
다른 방법은, 야생형에서는 PHA를 생산할 수 없는 대장균과 같은 미생물에게 PHA 신타아제를 도입하는 것이다(문헌 [Qi et al., 2007, FEMS Microbiol. Lett. 157: 155-162] 참조). 이와 같은 경우, 데카노에이트가 탄소 공급원으로 사용될 때, 약 15% CDW(세포 건조 중량: cell dry weight)의 최대 PHA 축적이 E. coli LS1298 균주에서 관찰되었다.
또 다른 방법에서는, PHA 디폴리머라제 유전자의 녹아웃에 의해 PHA 제조가 증가되었는데, 이는 미생물 P. putida KT2440에서 약 PHA가 CDW 중에 최고 80%를 차지하는 약 4 g/L CDW의 수율을 달성하였다(Cai et al., 2009, Bioresource Techn. 100: 2265-2270).
상기 발전사항에도 불구하고, 상기 미생물에서 제조된 PHA의 양은 이의 제조에 필요한 자원과 비교하여 여전히 상대적으로 낮다. 또한, 일부 국가에서는 일반적으로 유전자 공학 미생물에 대한 공중의 의구심이 있으며, 이는 상기 물질을 수용하는 측면에서 문제점을 야기한다. 특히, 상기 국가에 대해서는 높은 수율로 PHA를 제조하는, 야생형, 즉 유전자 변형되지 않은 미생물을 갖는 것이 유리하다.
지금까지 PHA 제조에 대해 개시된 대부분의 미생물은 PHA 제조를 위한 탄소 공급원으로서 포화 지방산만을 수용한다. 약 6 내지 20개의 탄소원자의 사슬 길이를 갖는 직쇄 포화 지방산과 같은 보통의 기질로부터 제조된 PHA는 주로 -30℃ 내지 -50℃의 폴리머 유리전이온도를 나타낸다. 이는 상기 유리전이온도와 호환가능한 응용예로 이들의 활용성을 제한한다. PHA 내로 혼입시키기 위한 대응 미생물에 의해 수용되는 기질의 범위가 연장된다면, 이와 같은 미생물로부터 이용가능한 PHA 특성의 다양성에 큰 영향이 있을 것이다. 또한, 관능기가 PHA에 삽입되어 제조 후 개질을 가능하게 할 수 있다면, 상기 미생물로부터 이용가능한 PHA 생성물의 다양성이 큰 영향을 미칠 것이다. 예를 들어, PHA에 존재하는 불포화 탄소-탄소 이중결합은, 아크릴레이트 및 다른 비닐성 모노머를 포함하여 종래의 불포화 모노머의 부착 또는 가교결합과 같은 사후의 개질 및 관능화에 사용될 수 있는 반응성 중심을, 제조된 물질에 제공할 수 있다. 따라서, 상기 PHA는 예를 들어 엘라스토머 물질 또는 충격 조절제를 제조할 수 있게 할 것이며, 이때 석유화학계 플라스틱이 적어도 부분적으로 생물학적 공정에서 제조된 PHA에 의해 대체될 수 있을 것이다.
본 발명은 상기와 같은 필요성에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 Leibnitz Institute DSMZ, Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Germany에 DSM26199(슈도모나스 sp. IPB-B26) 및 DSM26200(슈도모나스 sp. N-128)으로 기탁된 슈도모나스 속의 유전자 변형되지 않은(즉, 야생형) 미생물을 제공하는 것이다. 본 발명의 미생물 슈도모나스 sp. IPB-B26 및 슈도모나스 sp. N-128은 원유(1%) 및 올리브유(1%)를 기질로 사용하여 다양한 (탄화수소, 디젤 및 석유에 의해) 오염된 토양의 농축 배양체로부터 분리되었다. 500 ml의 쉐이크 플라스크에서, 올레산을 기질로 하여 배양된 경우, 상기 균주들은 각각 최고 6 g/L 및 2.4 g/L(약 40 wt%의 PHA 축적률)의 뛰어난 바이오매스 및 PHA 수율을 나타내었다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 중쇄 및/또는 장쇄 길이의 PHA의 제조방법에 관한 것이다:
- 수탁번호 DSM26199(슈도모나스 sp. IPB-B26) 또는 DSM26200(슈도모나스 sp. N-128)으로 DSMZ에 기탁된 슈도모나스 속의 미생물을 적합한 배지에서 탄소 공급원의 존재하에서 배양하는 단계; 및
- PHA를 상기 각 미생물로부터 분리시키는 단계.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로부터 제조될 수 있는 PHA로서 바람직하게는 불포화기를 포함하는 PHA, 및 mcl- 및/또는 lcl-PHA의 제조방법에 있어서 상기 미생물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 중쇄라는 용어는 5 내지 13개의 탄소원자를 갖는 히드록시산 유닛((R)-3-히드록시산 유닛)을 의미하기 위한 것이다. "중쇄 길이의 PHA"라는 용어는 모노머 당 14개 이상의 탄소원자를 갖는 PHA를 포함한다.
본 출원인의 연구에서, 본 발명의 미생물의 발효에 사용된 배지가 미생물의 PHA 생산성에 유의적인 영향을 미친다는 점이 발견되었다. 시험된 다수의 제조 배지로부터, 0.1% 이스트 추출물에 의해 개질된 MM 배지(문헌 [Martinez-Blanko et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 7084-7090]에 개시된 바와 같음)는 올레산(1%)가 탄소 공급원으로서 사용되고 슈도모나스 sp. IPB-B26이 미생물로 사용된 경우에 가장 낮은 PHA 생산성을 제공하였다. 동일한 조건에서, 슈도모나스 sp . N-128은 적당한 PHA 수율을 제공하였다. 균주 슈도모나스 sp . IPB-B26에 대해, 문헌 [Choi et al.](1994, Appl. Environ. Microbiol. 60: 1245-1254)에 기재된 바와 같은 배지 C-Y는 유의적으로 더 뛰어난 수율을 제공하였고, 이는 상기 배지 내의 질소량이 2배로 증가된 경우에 더 증가될 수 있었다. 따라서, 본 발명의 실시에 있어서 C-Y 배지에서 슈도모나스 sp . IPB-B26을 배양시키는 것이 MM 배지 + 0.1% 이스트 추출물을 사용하는 것보다 바람직하다. 슈도모나스 sp . N-128에 있어서, C-Y-배지에 의한 수율은 MM 배지 + 0.1% 이스트 추출물에 비해 더 낮았지만, 유사한 양의 PHA를 제공할 수 있도록 C-Y 배지 내의 질소 농도가 2배로 증가된 경우에 PHA 수율은 회복되었다. 따라서, 상기 균주에 있어서, C-Y 배지가 발효에 사용되는 경우, 상기 배지는 문헌 [Choi et al]에 지시된 양의 약 2배의 함량의 질소를 포함하여야 한다. 슈도모나스 균주 N-128 및 IPB-B26 모두에 있어서, E2 배지(Vogel & Borner에 의해 문헌 [1956, J. Biol. Chem. 218: 97-106]에 개시된 바와 같음)는 최고의 결과를 제공하였다. 상기 배지에 의해, 30℃ 및 200 rpm에서 100 ml의 배양체를 갖는 500 ml-플라스크를 사용함으로써, 약 2 g/L의 PHA 수율 및 5.1 g/L를 초과하는 세포건조중량(CDW)이 양 균주 모두에 대해 획득되었다. 따라서, 본 발명의 실시에 있어서, 발효를 위한 배지는 상기의 E2 배지인 것이 바람직하다.
PHA의 제조를 위해 사용되는 탄소 공급원과 관련하여, 본 발명의 방법은 제한되지 않는다. 글리세롤, 당류, 피루베이트 및 종래의 지방산, 특히 4 내지 20개의 탄소원자, 바람직하게는 8 내 18개의 지방 탄소 원자를 포함하는 지방산과 같이, PHA의 제조를 위해 보통 사용되는 탄소공급원이 본 발명의 방법에서 본 발명의 미생물과 사용될 수 있다. 그러나, 지방산이 탄소 공급원으로서 사용된 경우, 가장 우수한 PHA 수율(단위: g/L)이 획득된다는 점이 발견되었다. 결론적으로, 바람직한 본 발명의 방법은 하나 이상의 C4 내지 C20 지방산, 바람직하게는 C8 내지 C18 지방산을 포함하는 탄소 공급원을 포함한다. 본 발명에 사용되는데 바람직한 포화 지방산은 부티르산, 발레르산, 헥산산, 헵탄산, 카프릴산, 노난산, 데칸산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 헵타데칸산, 스테아르산 및 아라키드산이다.
또한, 본 발명의 미생물은 기질로서 올레산 및 10-운데센산과 같은 불포화 지방산도 수용한다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 방법의 바람직한 구현예는 하나 이상의 불포화기, 바람직하게는 단일 불포화기(unsaturated moiety)를 포함하는 지방산을 탄소 공급원으로서 포함한다. 대표적인 불포화 지방산은 미리스트올레산, 팔미트올레산, 사피엔산(sapienic acid), 올레산, 엘라이드산, 박센산, 리놀레산, 리노엘라이드산, α-리놀레산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산 및 운데센산이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 가장 바람직한 불포화 지방산은 올레산이다.
본 발명의 방법이 쉐이크-플라스크 또는 배치-공정인 경우, 배지 내의 탄소 대 질소비(C/N)는 약 9:1 내지 70:1, 바람직하게는 약 15:1 내지 50:1인 것이 바람직하다. (C/N)비가 9:1 미만 또는 70:1 초과인 경우, 제조된 생성물의 PHA 수율은 보통 바람직한 범위 내에 있는 것보다 더 낮았다.
본 발명의 일 구현예에서, 탄소 공급원은 배양의 초기에 배양 혼합물에 단일 덩어리로 첨가된다. 이와 관련하여, 탄소 공급원이 예를 들어 2개의 부분으로 첨가되는 경우, 즉 하나는 배양의 초기에 첨가되고, 두번째는 그 후의 단계에 첨가되는 경우, 탄소 공급원이 단일 덩어리로 첨가된 공정에 비해 g/L 및 wt% 단위 모두의 PHA 수율이 더 낮았다는 것이 발견되었다.
쉐이크-플라스크 또는 배치-공정에 있어서, 배양 혼합물에 첨가되는 탄소 공급원의 양은 배양 혼합물 내의 탄소 공급원의 농도가 약 1 내지 60 mM, 바람직하게는 약 10 내지 40 mM이 되도록 하는 것이 더욱 바람직하다. 1 mM 미만의 농도를 제공하도록 탄소 공급원이 첨가되는 경우, PHA의 수율은 탄소 공급원의 농도가 지시된 범위 내인 발효에 비해 더 낮았다. 탄소 공급원 농도가 60 mM 초과인 경우, 환경이 세포에 대해 점점이 독성이 되고, 이는 이들의 성장에 부정적인 영향을 미친다.
본 발명의 방법의 다른 중요한 파라미터는 배지 내 질소 함량이고, 이는 질소가 미생물에 있어서 중요한 영양분이고, 탄소가 과잉되고 예를 들어 질소가 결핍되는 조건에서 PHA 제조가 보통 바람직하기 때문이다. 본 발명의 바람직한 방법에서, 예를 들어 황산암모늄 또는 수산화암모늄과 같은 암모늄염이 질소 공급원으로서 사용된다.
배양 배지 내의 암모늄 농도는 더욱 바람직하게는 약 10 내지 60 mM, 특히 약 15 내지 40 mM이었다. 그러나, 균주의 성장 및 PHA 제조에 가장 큰 영향을 미치는 것은 궁극적으로 질소 공급원은 실제 농도보다는 C/N 비이다.
본 발명의 다른 중요한 측면은 발효에서의 산소 농도인데, 이는 미생물이 카르복시산을 3-히드록시카르복시산으로 전환시키기 위해 산소를 소비하기 때문이다. 본 발명의 실시에 있어서, 배양 배지에서 산소 분압(pO2)은 약 25% 내지 45%, 바람직하게는 약 30%로 유지되는 것이 바람직하고, 여기서 %는 mol%이고, 배양 배지에 용해된 기체 전체에 기반하여 계산된다.
배양 시간과 관련하여, 본 발명에는 어떠한 제한도 가해지지 않는다. 그러나, 통상의 기술자라면 배양 동안에 제조된 PHA의 양이 어떤 단계에서 그 후로는 PHA-함량이 감소하거나 더 이상 변화하지 않는 최고점에 도달할 것이라는 점을 인식할 것이다. 통상의 기술자는 미생물 내의 PHA 축적량이 최고가 되는 시간을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 경험에 비추어 보면, 페드-배치 공정에서의 최고 PHA 축적은 보통 약 40시간 후 내지 약 100시간 전에 도달하였다. 따라서, 배양은 바람직하게는 40 h 이상 및 96 h 이하, 바람직하게는 45 h 이상 및 60 h 이하, 가장 바람직하게는 약 48 h 동안 수행된다.
본 발명의 미생물에 있어서, 약 30℃의 온도가 PHA 제조를 위한 최적의 온도로 측정되었다. 따라서, 본 발명의 방법은 바람직하게는 약 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 약 20℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다.
전술한 배치-공정과는 다른 본 발명의 구현예에서, 탄소 공급원은 페드-배치(fed-batch) 방식, 즉 발효의 초기화 시간 후에 지수적으로(exponentially) 증가하는 탄소 투여량이 보충되는 방식으로 배양 배지에 공급된다. 지수적으로 증가하는 탄소 투여량의 계산으로부터의 파라미터는 하기의 식에 기반하여 계산되었다:
Figure pat00001
여기서, F(t)는 배양에 걸친 탄소 공급원의 유량, V0은 배양의 부피, Yx /s는 바이오매스의 수율, X0은 배치 배양 후의 초기 바이오매스, μset은 원하는 비성장속도(specific growth rate) 및 S0은 공급물 내 기질 농도를 나타냄.
본 발명에서, μset은 바람직하게는 약 0.05 내지 0.15 h-1, 더욱 바람직하게는 약 0.08 내지 0.12 h-1이다.
상기 페드-배치 공정은 바이오매스 및 PHA 모두의 수율을 개선시키고 상기 최고 수율에 도달하는 발효 시간을 실질적으로 감소시킬 수 있고, 이때 발효에서 최적의 PHA 농도는 10배 증가될 수 있고, 약 40 내지 48h 후에 도달될 수 있다. 이는 종래의 배치 공정에 비해 유의적인 이점을 나타낸다(상기 참조).
상기 공정에서, 지수적으로 증가하는 탄소 공급원 투여량을 첨가하기 전에, 초기 덩어리의 탄소 공급원이 배양 배지에 첨가되고, 배양체는 그 후 초기 탄소 공급원이 완전히 소비되도록 보장하는 충분한 시간 동안 유지되는 배치 단계에서 발효가 초기화되는 것이 바람직하다. 본 발명을 실시할 때, 초기 배치 단계가 약 8 내지 24 h의 시간, 바람직하게는 8 내지 12 h 동안 적합하게 수행된다는 점이 관찰되었다.
또한, 페드-배치 공정에서, 탄소 공급원의 초기 덩어리는 배양 배치에 약 2 내지 30 mM, 바람직하게는 약 5 내지 15 mM의 탄소 공급원 농도를 제공하는 것이 바람직하다. 상기 범위는 지수적 공급 공정이 시작되기 전에 최적의 초기 배양을 제공하기 위해 결정되었다.
배치 또는 페드-배치 공정에서 발효 혼합물의 교반 속도는 산소 분압(pO2)이 상기에 지시된 범위 내에서 유지되기에 충분해야 한다는 것을 제외하고는, 제한되지 않는다. 적합한 교반 속도는 발효의 요건에 의존하지만, 보통 약 200 내지 1400 rpm이다.
예상외로, 본 발명의 미생물은 초기에 복수의 PHA 과립들이 형성되었지만, 발효 동안에 PHA 과립이 단일 과립으로 융합된다는 것이 발견되었다.
미생물로부터 PHA를 분리함에 있어서, 비-염소화 용매, 바람직하게는 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 케톤에 의해 추출되는 것이 바람직하다. 비-염소화 용매는 클로로포름 및 디클르로메탄과 같은 종래의 염소화 용매와 비교하여 유의적으로 낮은 폐기물 처리 문제 및 비용을 나타낸다는 장점이 있다. 본 발명의 실시를 위해 사용되는 케톤의 예로서는 아세톤, 2-메틸에틸케톤, 디에틸케톤, 2-메틸프로필케톤 등이 있다. PHA의 고립을 위해 사용하기 위한 가장 바람직한 케톤은 아세톤이다.
또한, PHA는 약 60℃ 미만, 바람직하게는 약 20℃ 내지 40℃의 온도에서 추출되는 것이 바람직하다. 상기 온도에서의 본 발명의 미생물의 추출이 더 높은 온도에서의 유사한 추출과 비교하여 실질적으로 동일한 수율을 제공하는 것이 예상외로 발견되었다. 이는 단일 PHA 과립 형성, 및 발효 공정의 말기에 관찰가능한 미생물 세포벽의 파괴로부터의 직접적인 결과라고 여겨진다. 따라서, 본 발명의 미생물에서는, 종래 발효의 미생물의 복수의 과립들보다 상기 용매에 대해 PHA에 접근하는 것이 더 용이하다. 또한, 약 0.5 내지 5 h 동안의 추출 후에는 실질적으로 동일한 수율의 추출된 PHA가 획득될 수 있다는 것이 관찰되었다. 따라서, 용매 추출은 약 1 내지 3 시간, 바람직하게는 약 1 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조될 수 있는 PHA이다. 바람직하게는, 상기 방법은 최고 17 mol% 이상의 불포화기를 포함하는 카르복시산의 혼입을 포함한다.
또한, 본 발명은 중쇄 또는 장쇄 PHA의 제조방법에서 상기 미생물의 용도에 관한 것이다. 상기 방법의 바람직한 구현예는 상기 중쇄 또는 장쇄 길이의 PHA의 제조방법에 대해 기재된 것과 동일하다.
마지막으로, 본 발명은 PHA의 제조에 있어서 유전자 은행(NCBI)에 JN651420(phaC1) 또는 JN216885(phaC2)의 수탁번호로 기탁된 PHA 신타아제 또는 이의 유사체의 용도에 관한 것이다. 상기 PHA 신타아제 또는 이의 유사체는 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 "유사체"라는 용어는 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성을 갖고, 적절한 조건에서 PHA를 효율적으로 합성할 수 있는 유사한 특성을 가지는 펩티드 또는 단백질을 의미한다.
도 1: 기질로서 올레산을 사용한, 슈도모나스 sp . IPB-B26의 배치 발효에 따른 바이오매스 및 PHA 제조, 및 암모늄 소비의 동역학 프로파일. 상기 값들은 2번 측정된 값의 평균임. t = 100 min에서, 상위 곡선: CDW (단위: g/L); 중간 곡선: PHA (단위:g/L); 및 하위 곡선: 암모늄 농도(단위: mg/L).
도 2: 페드-배치 발효 동안 올레산 및 MgSO4에 대한 공급속도.
도 3: 페드-배치 발효 동안 올레산 및 암모늄 소비. 배양체에 존재하는 올레산 농도는 HPLC 분석에 의해 측정됨.
도 4: 슈도모나스 sp . IPB-B26, 및 탄소 공급원으로서 올레산을 사용한, 페드-배치 발효에서의 성장, 바이오매스 및 PHA 제조. 그 결과는 2번 측정된 값의 평균임.
하기에서는, 본 발명이 실시예에 의해 더 설명될 것이지만, 이는 어떻게 든지 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
PHA 제조를 위한 최고의 배지를 선택하기 위해, 균주 슈도모나스 sp . IPB-B26 및 슈도모나스 sp . N-128 모두가 각각 탄소 공급원으로서 올레산(1%)을 포함하는 100 ml의 각 배지를 갖는 500 ml-플라스크에서 30℃에서 200 rpm로 교반함으로써 배양되었다. 세포는 72 h의 배양 후에 분석을 위해 채취되었다. 하기의 배지가 시험되었다:
1. E2 배지, 문헌 [Vogel & Borner, 1956, J. Biol. Chem. 218: 97-106]에 의해 개시된 바와 같음.
2. MM 배지 + 0.1% 이스트 추출물, 문헌 [Martinez-Blanko et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 7084-7090]에 의해 개시된 바와 같음.
3. 정규 및 2배의 질소 농도(0.66 및 1.32 g/L (NH4)2SO4)를 갖는 C-Y 배지, 문헌 [Choi et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60: 3245-3254]에 의해 개시된 바와 같음.
상기 연구의 결과는 하기의 표 1에 나타난다.
다양한 배지에서 균주 N-128 및 IPB-B26의 바이오매스 및 PHA 제조
균주(기질) 배지 CDW (g/L) PHA (g/L) PHA (%wt)
N-128
(올레산 1%) 		E2 5.14 1.90 36.6
MM +0.1% YE 5.51 1.69 29.7
C-Y 2.27 0.94 42.2
C-Y (x2N) 3.64 1.74 47.8
IPB -B26
(올레산 1%) 		E2 6.02 2.32 37.5
MM +0.1% YE 4.44 0.70 15.8
C-Y 3.91 2.16 53.9
C-Y (x2N) 5.03 2.05 41.0
상기 결과는 30℃ 및 200 rpm에서 72 h의 인큐베이션 후에 획득됨. 상기 값들은 2번 측정한 값의 평균임.
양 균주는 다양한 배지에서 성장되었다. MM + 0.1% 이스트 추출물이 발효 배지로서 사용된 경우, PHA 제조는 IPB-B26에 대해 더 낮았다. 놀랍게도, C-Y 배지에서 IPB-B26은 54 wt%의 PHA 축적률을 제공하였다. 그러나, 양 균주 모두에 있어서, 시험된 다른 두 배지 (E2 및 MM + 0.1% 이스트 추출물)에서 보다 상기 배지에서 바이오매스 제조는 더 낮았다. C-Y 배지의 암모늄 농도를 2배로 증가시킨 후에, 슈도모나스 sp. N-128 및 IPB-B26 각각에 대해 바이오매스 제조를 약 48 wt% 및 41 wt%의 PHA 축적률을 갖는 3.64 g/L 및 5.03 g/L로 증가시킬 수 있었다.
일반적으로, 배지 C-Y(2N) 및 E2가 가장 높은 수율의 PHA 제조를 나타내었다. PHA 제조는 유사하였지만, 바이오매스 제조는 E2 배지에서 유의적으로 더 높았다. 이에 따라, E2가 바람직한 배지로 판단된다.
실시예 2
탄소 공급원을 올레산(1%)에서 옥탄산(20 mM), 글리세롤(3%) 또는 미정제(crude) 글리세롤(3%)로 교체하여, 슈도모나스 sp . N-128 및 IPB-B26의 배양이 실시예 1에 기재된 바와 같이 E2 배지에 의해 반복되었다. 상기 연구의 결과는 하기의 표 2에 나타난다.
E2 배지에서 균주 N-128 및 IPB-B26의 바이오매스 및 PHA 제조
균주 기질 CDW (g/L) PHA (g/L) PHA (%wt)
N-128
올레산 (1%) 5.14 1.90 36.6
옥탄산 (20 mM ) 1.77 0.27 15.4
글리세롤 (3%) 3.00 0.50 16.0
미정제 글리세롤 (3%) 3.88 0.80 21.6
IPB -B26
올레산 (1%) 6.02 2.32 37.5
옥탄산 (20 mM ) 1.76 0.14 8.0
글리세롤 (3%) 4.82 1.40 29.0
미정제 글리세롤 (3%) 4.46 1.40 30.5
상기 값들은 3번 측정한 값의 평균임.
글리세롤 및 미정제 글리세롤이 양 균주 모두에 대해 뛰어난 기질이기는 하지만, 올레산에 의해 획득된 PHA 수율이 유의적으로 더 높았다.
실시예 3
올레산 및 글리세롤을 기질로서 사용함으로써 획득된 PHA 폴리머가 정제되고, NMR 및 GCMS에 의해 분석되었다. 상기 연구의 결과는 하기의 표 3에 나타난다.
균주 IPB-B26 및 N-128에 의해 제조된 PHA 폴리머의 모노머 조성
PHA - N128
E2 -올레산 		PHA -B26
E2 -올레산 		PHA -B26
E2 - 글리세롤
PHA (g/L) 1.90 2.32 1.40
모노머 조성
3 OHC4 0.4 0.4 2.0
3 OHC5 2.0
3 OHC6 5.1 4.9 3.7
3 OHC8 40.9 33.5 22.1
3 OHC10 27.5 32.4 42.9
3 OHC12 :0 12.1 9.4 12.2
3 OHC12 :1 0.7 14.7
3 OHC14 :0 6.5
3 OHC14 :1 14.0 10.2 2.3
C4-C14(숫자는 탄소 원자의 수를 나타냄)의 모노머를 포함함에 있어서, 올레산으로부터 제조된 두 PHA 중에서는 균주 슈도모나스 sp. IPB-B26에 의해 제조된 것이 슈도모나스 sp. N-128에 의해 제조된 것보다 모노머 조성의 측면에서 더 큰 다양성을 나타내었다. 놀라운 점은 탄소 원자의 수가 홀수라는 것을 특징으로 하는 3-히드록시발레르산(3OHC5)이 존재한다는 점이다. 일반적으로는, 올레산으로부터 유래된 2개의 PHA 모두 3OHC6(약 5%mol), 3OHC8(27-32%mol), 3OHC10(27-32%mol), 3OHC12(9-12%mol) 및 3OHC14:1(10-14%mol)을 포함하였다(여기서, 14:1은 14개의 총 탄소 원자 및 1개의 불포화 이중결합을 나타냄).
글리세롤로부터 유래된 PHA는 (올레산으로부터 제조된 PHA와 비교하여) 특히 불포화 모노머 3OHC12:1 및 3OHC14:1의 함량에서 차이를 나타낸다. 3OHC8(22.1%mol) 및 3OHC10(42.9%mol)은 여전히 주요 모노머 유닛이다. 반면에, 3OHC12:1 모노머는 증가하였고(12%mol까지), 이와 동시에 3OHC14:1 모노머의 함량은 감소하였다(2%mol).
글리세롤에서 슈도모나스 sp .IPB-B26의 배양은 유의적으로 더 낮은 분자량 분포를 갖지만, 유사한 다분산지수(polydispersity index)를 가지는 PHA 폴리머를 제공하였다(표 4 참조).
균주 IBP-B26 및 N-128에 의해 제조된 PHA-폴리머의 분자량 분포
균주/배지-기질
M n
( kDa ) 		M w
( kDa ) 		M p
( kDa ) 		분산도
PDI
N128 / E2 - 올레산 172 294 241 1.7
IPB -B26/ E2 - 올레산 145 218 185 1.5
IPB -B26/ E2 - 글리세롤 56 100 86 1.8
상기 값들은 GPC(범용 보정(universal calibration))에 의해 측정됨: Mp는 피크 최고점에서의 분자량; Mn는 수평균분자량, Mw은 질량분자량, 및 PDI는 다분산지수(polydispersity index)임.
제조된 폴리머의 추가적인 열적 특성은 하기의 표 5에 나타난다.
균주 IPB-B26 및 N-128에 의해 제조된 다양한 폴리머의 열적 특성
균주/배지-기질 T g ,1
(℃) 		Δ C p ,1
(J g -1 K -1 ) 		T g , c
(℃) 		T d ,1
(℃) 		Δ H d ,1
(J g -1 )
N128 / E2 - 올레산 -49 0.67 -49 297 490
IPB -B26/ E2 - 올레산 -49 0.12 297 460
IPB -B26/ E2 - 글리세롤 -48 0.16 301 575
T g: 유리전이온도, T g,c: 쿨링런(cooling run) 온도, Δcp: T g에서 열용량의 변화, T d: 용해온도, 및 ΔH d: 용해엔탈피. 모든 데이터는 DSC 두번째 히팅런(heating run) 또는 첫번째 쿨링런으로부터 획득됨.
모노머 조성의 차이에도 불구하고, 모든 폴리머들은 유사한 유리전이온도(Tg~(-48℃)) 및 약 297-300℃의 분해 온도를 가지고(표 5 참조), 이는 5개 미만의 탄소 원자를 갖는 단쇄 길이의 모노머의 존재가 폴리머의 열적 거동에 영향을 미치지 않음을 시사한다.
실시예 4
올레산에 의한 슈도모나스 sp . IPB-B26의 배치 발효
슈도모나스 sp . IPB-B26이 기질로서 10 g/L의 올레산을 사용함으로써 배지 E2에서 배양되었다. 초기 교반은 400 rpm, 온도는 30℃, 공기 유량은 1 L/min, 그리고 pO2(산소 분압)는 30%로 설정되었고, 캐스케이드 제어(cascade control)를 사용함으로써 유지되었다.
접종(inoculation) 후에 세포 성장은 즉시 시작되었다. 초기 4 h 내에 pO2는 60% 감소하였음에도 불구하고, 상기 공정은 느려졌고, 배양 30 h이 되어서야 비로소 pO2가 교반에 의해 조절되어야 했으며, 이는 최대의 대사 활성을 나타낸다. 도 1은 슈도모나스 sp . IPB-B26의 배치 발효에 따른 암모늄 소비, 및 바이오매스 및 PHA 제조의 동역학 프로파일을 나타낸다(상기 값들은 2번 측정한 값의 평균임). 성장 및 PHA 제조 곡선에 따르면, 배양 30 h 내지 43 h의 휴식 시간이 바이오매스 및 PHA 제조의 속도가 가장 높은 시간이었다(도 1 참조).
43 h의 배양 후에, PHA 축적률은 43 %wt의 최고점에 도달하였고, 그 후 110 h의 배양에 걸쳐 40 내지 43 %wt로 거의 일정하게 유지되었다. 상기 공정에 걸쳐서 거품 형성의 문제는 검출되지 않았다.
가장 높은 바이오매스 및 PHA 수율은 50 h의 배양 후에 획득되었는데, 각각 5.5 g/L 및 2.4 g/L에 도달하였다. PHA 축적률은 최고 43%wt였다(도 1). 상청액의 HPLC 분석은 기질이 발효 말기에 완전히 소비되지 않았다는 것을 나타내지만, PHA 제조의 수율이 가장 높았다는 것에 연관지어 보면, 암모늄은 36 h의 배양 후에 완전히 소진되었다.
70 h의 배양 후에, PHA 축적률을 증가시키기 위해 0.5%의 올레산 펄스가 첨부되었지만, 기질은 소비되지 않았고, PHA 축적률의 변화는 검출되지 않았다.
실시예 5
올레산에 의한 슈도모나스 sp. IPB-B26의 페드-배치 발효
균주-기질에 대한 비성장속도(μ) 및 바이오매스 전화율(Yx /s)은 지수적 공급을 위하여 하기 방정식에 따라 계산되어야 하는 파라미터이다:
Figure pat00002
상기 식에서, F(t)는 배양에 걸친 탄소 공급원의 유량이고, Vo는 배양체의 부피이고(3 L의 작업부피), Yx /s는 바이오매스의 수율이고, Xo은 배치 배양 후의 초기 바이오매스이고, μset은 원하는 비성장속도이다.
슈도모나스 sp . IPB-B26은 400 rpm의 초기 교반, 3 L/min의 공기 유량 및 캐스케이드를 사용하여 30%에 고정된 pO2를 사용하여, 3 g/L의 올레산을 갖는 배지 E2에서 배양되었다. 동역학적 파라미터는 하기와 같다: μset은 0.1 h-1, So는 2.67 g/L 및 YX /S는 0.89 g/g. 초기 12 h, 그 후 24 h 동안의 지수적 공급, 및 1 g/L/h의 올레산의 선형 공급으로 이루어지는 최종 단계 동안에, 3.0 g/L의 올레산을 갖는 배치 배양체에 의해 발효가 시작되었다. 상기 지수적 공급 동안, ph스탯(pHstat) 제어를 사용하여 암모늄이 NH4OH(14% v/v)로서 공급되었다. 추가적인 Mg2 +이 0.033 g MgSO4/1 g 올레산의 비율로 제공되었다(도 2).
교반의 증가는 세포가 즉시 성장하기 시작했다는 것을 나타낸다. 탄소 공급원은 배양 초기 12 h 후에 완전히 소진되었고(도 3), 지수적 공급은 그 후 24 h 동안 수행되었다. 전체 공정에 걸쳐 교반 속도는 800-1,000 rpm으로 유지되었으며, 최대 성장 단계(배양 24 h 내지 40 h)에서 더 높았다. 배양 38 h에서, 지수적 공급 및 암모늄 공급은 정지되었고, 3 g/L의 올레산 펄스가 10 h의 선형 공급을 시작하기 전에 공급되었다. 상기 선형 공급 후에, HPLC 분석은 탄소 및 질소 공급원이 완전히 소비되지 않았음을 나타내었고, 따라서, 발효는 배양 68 h까지 계속 수행되었다. 양 영양분은 모두 배양 68 h 후에 완전히 소비되었다(도 3). 그러나, 44 내지 68 h에는 바이오매스 및 폴리머 제조의 유의적인 변화가 관찰되지 않았다(표 6 및 도 4).
가장 높은 바이오매스 및 PHA 제조 수율은 발효 48 h 후에 달성되었고, 이는 각각 46.2 g/L 및 25.3 g/L이었다. 지수적 공급 동안에는 주로 바이오매스가 제조되었고, 반면 가장 높은 PHA 축적은 선형 공급 기간의 말기에 일어났고, 배양 48 h 후에 55%wt의 PHA 축적을 야기했다(표 6 및 도 4).
Figure pat00003
시간에 따른 그래프(도 3)에 나타난 바와 같은 상기 공정 동안의 더 낮은 산소 수요(demand)는 발효의 말기에서 균주 슈도모나스 sp . IPB-B26에 의해 달성된 높은 세포 밀도(250의 OD550nm)를 고려하면 특히 주목할만하다. 실제로, pO2는 공기흐름 및 교반에 의해 완벽히 제어되었다. 거품 형성은 지수적 공급 단계의 말기에 3 mL의 소포제를 첨가함으로써 제어될 수 있었다.
하기의 표 7에서는, 배치-공정(실시예 4) 및 페드-배치 공정으로부터의 결과가 비교된다.
균주 슈도모나스 sp. IPB-B26 및 기질로서 올레산을 사용한 발효 공정의 바이오매스 및 PHA 수율
실험 배치 페드 -배치
CDW (g/L) 5.5 46.1
PHA (g/L) 2.4 25.3
PHA (%wt) 43 54.8
배양시간 (h) 50 47.5
슈도모나스 sp . IPB-B26은 페드-배치 전력을 사용하여 5 L의 생물반응기로 성공적으로 확대되었으며, 배양 48 h 후에 각각 46 g/L 및 25.3 g/L의 바이오매스 및 PHA 제조로 전환되었다. 상기 수율을 초기 배양 전략과 비교하여 10배의 증가를 보여주며, 이는 발효 공정에서의 PHA 제조에 있어서 환경적 균주 슈도모나스 sp. IPB-B26의 적합성을 나타낸다.
제조된 폴리머의 모노머 조성은 NMR 및 GC-MS 분석에 의해 측정되었다. 상기 폴리머는 하기의 모노머 유닛으로 구성되었다: C4:0 (0.5 %mol), C6:0 (5.2 %mol); C8:0 (38.7 %mol), C10:0 (29.3 %mol), C12:0 (14.6 %mol), C14:0 (0.8 %mol) 및 C14:1 (10.9 %mol). C4:0의 존재는 GC-MS 분석에 의해 귀납적으로 확인되었지만, C4:0의 낮은 함량(오직 0.5 %mol) 때문에 상기 모노머는 NMR 분석에서 검출될 수 없었다. 획득된 모노머 조성은 플라스크 실험에서 상기 균주-기질에 대해 앞서 보고된 것과 유사하였다.
Leibnitz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM26199 20120724 Leibnitz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM26200 20120724

Claims (15)

  1. 수탁번호 DSM26199(슈도모나스 sp. IPB-B26) 또는 DSM26200(슈도모나스 sp. N-128)으로 DSMZ에 기탁된 슈도모나스 속의 미생물.
  2. 하기 단계를 포함하는, 중쇄 또는 장쇄 길이의 PHA의 제조방법:
    - 수탁번호 DSM26199(슈도모나스 sp. IPB-B26) 또는 DSM26200(슈도모나스 sp. N-128)으로 DSMZ에 기탁된 슈도모나스 속의 미생물을 탄소 공급원의 존재하에 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및
    - 상기 미생물로부터 PHA를 분리시키는 단계.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 배지는 E2 배지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 탄소 공급원은 바람직하게는 하나 이상의 불포화기를 포함하는 하나 이상의 C4 내지 C20 지방산, 바람직하게는 C8 내지 C18 지방산을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지에서 산소 분압 pO2는 25% 내지 45%, 바람직하게는 약 30%로 유지되고, 상기 %는 배지에 용해된 총 기체를 기준으로 나타낸 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    질소가 암모늄 염으로서, 바람직하게는 10 내지 50 mM, 특히 15 내지 40 mM의 암모늄 몰 농도로, 배지에 존재하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 쉐이크-플라스크-공정 또는 배치-공정이고, 배지 내의 탄소 대 질소비(C/N)가 9:1 내지 70:1, 바람직하게는 15:1 내지 50:1인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 탄소 공급원은 배양의 초기에 단일 덩어리로, 바람직하게는 상기 배지에 5 내지 60 mM, 특히 10 내지 40 mM의 탄소 공급원 농도를 제공하는 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 탄소 공급원은, 초기 배치(batch) 시기 이후에 지수적으로 증가하는 탄소 공급원 투여량을 제공하기 위해 페드-배치(fed-batch) 방식으로, 바람직하게는 0.05 내지 0.15 h-1, 더욱 바람직하게는 0.08 내지 0.12 h-1의 비성장속도 μset로, 배지에 공급되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    배치 시기에서, 배지에 바람직하게는 2 내지 30 mM, 더욱 바람직하게는 5 내지 15 mM의 탄소 공급원 농도를 제공하는 탄소 공급원의 초기 덩어리가 배지에 첨가되고, 초기 탄소 공급원을 완전히 소비시키는데 충분한 시간, 바람직하게는 8 내지 16 시간 동안 배양이 유지되는 것을 특징을 하는 제조방법.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PHA는 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 케톤, 바람직하게는 아세톤에 의해 추출을 통해 분리되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PHA는 60℃ 이하, 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도에서 추출을 통해 분리되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조되는 PHA로서,
    바람직하게는 10% 초과의 불포화기를 포함하는 PHA.
  14. 제1항에 따른 미생물을 중쇄 또는 장쇄 길이의 PHA를 제조하는데 사용하는 방법.
  15. 수탁번호 JN651420(phaC1) 또는 JN216885(phaC2)로 유전자은행 NCBI에 기탁된 PHA 신타아제, 이의 유사체, 또는 상기 PHA 신타아제 또는 이의 유사체의 혼합물을, PHA, 바람직하게는 탄소-탄소 이중결합 및/또는 방향족기를 포함하는 PHA를 제조하는데 사용하는 방법.
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