WO2024101063A1 - ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents

ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 Download PDF

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WO2024101063A1
WO2024101063A1 PCT/JP2023/037027 JP2023037027W WO2024101063A1 WO 2024101063 A1 WO2024101063 A1 WO 2024101063A1 JP 2023037027 W JP2023037027 W JP 2023037027W WO 2024101063 A1 WO2024101063 A1 WO 2024101063A1
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acid
ctg
pha
gaa
cag
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PCT/JP2023/037027
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丈治 柘植
シヴァシャンカリ エム ラマムザイ
佑宜 宮原
智義 山本
優 小澤
Original Assignee
国立大学法人東京工業大学
帝人株式会社
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  • the present invention relates to a method for producing polyhydroxyalkanoic acid by a microorganism using a specific class I polyhydroxyalkanoic acid polymerase gene, and to a mutant polyhydroxyalkanoic acid polymerase derived from Plesiomonas shigelloides.
  • PHAs Polyhydroxyalkanoates
  • PHA a homopolymer with (R)-3-hydroxybutanoic acid (3HB) as a constituent unit
  • P(3HB) a homopolymer with (R)-3-hydroxybutanoic acid
  • P(3HB) a homopolymer with (R)-3-hydroxybutanoic acid
  • P(3HB) a homopolymer with (R)-3-hydroxybutanoic acid
  • P(3HB) is crystalline, which allows for shorter processing times, but it is hard and brittle, making it less practical.
  • the polymer deteriorates during molding processing, for example by becoming low molecular weight when melted, making it unsuitable for industrial production.
  • various copolymers of 3HB and other monomers have been developed (Non-Patent Documents 1-4).
  • PHA synthases are important enzymes involved in the polymerization of 3-hydroxyalkanoic acids (Non-Patent Document 5) and are classified into four classes based on their substrate specificity and subunit composition (Non-Patent Document 6).
  • Class I PHA synthases and class II PHA synthases are homodimers of PHA synthase subunits.
  • class I PHA synthases derived from Ralstonia eutropha mainly polymerize short chain-length monomers (3-5 carbon atoms)
  • class II PHA synthases derived from Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas putida polymerize medium chain-length monomers (6-14 carbon atoms).
  • class III PHA synthases from Allochromatium vinosum and Synechocystis sp. PCC 6803, and class IV PHA synthases from Bacillus megaterium and Bacillus cereus are composed of two heterosubunits and polymerize short-chain length monomers.
  • Aeromonas caviae-derived PHA synthase (hereinafter, appropriately referred to as "PhaC Ac ”) can synthesize a copolymer of 3HB and 3-hydroxyhexanoic acid (hereinafter, appropriately referred to as "P(3HB-co-3HHx)”) from vegetable oils and fatty acids (Non-Patent Documents 7 to 11). Aeromonas caviae-derived PHA synthase has a broad substrate specificity and is capable of synthesizing high molecular weight PHA, making it one of the excellent polymerases and widely used in the synthesis of PHA. In addition, a mutant in which a mutation has been introduced into Aeromonas caviae-derived PHA synthase has also been developed (Non-Patent Document 10), making it possible to increase the production of PHA.
  • PhaC Ac Aeromonas caviae-derived PHA synthase
  • P(3HB-co-3HHx) 3-hydroxyhexanoic acid
  • Sudesh K Abe H, Doi Y., Prog Polym Sci 2000; 25: 1503-55.
  • a specific class I PHA synthase can synthesize a high molecular weight PHA as compared with the PHA synthase derived from Aeromonas caviae, and have completed the present invention.
  • the PHA synthase derived from Plesiomonas shigelloides hereinafter, appropriately referred to as "PhaC Ps ”
  • mutant PhaC Ps having specific mutations introduced therein are particularly excellent as PHA synthases in that they have a relatively broad substrate specificity and a high polymerization ability, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following: (1) A method for producing polyhydroxyalkanoic acid, comprising the steps of introducing a gene for a class I polyhydroxyalkanoic acid polymerase (excluding polyhydroxyalkanoic acid polymerase derived from Aeromonas caviae) into a microorganism and culturing the microorganism into which the gene has been introduced in the presence of a carbon source. (2) The method according to (1), wherein the class I polyhydroxyalkanoate synthase is selected from the group consisting of the genus Ferrimonas, the genus Shewanella, the genus Plesiomonas, and the genus Vibrio.
  • the class I polyhydroxyalkanoate synthase is selected from the group consisting of Ferrimonas marina, Shewanella pealeana, Plesiomonas shigelloides, and Vibrio metschnikovii.
  • the class I polyhydroxyalkanoate synthase gene has a sequence identity of less than 60% with a polyhydroxyalkanoate synthase gene derived from Aeromonas caviae.
  • the class I polyhydroxyalkanoate synthase is a polyhydroxyalkanoate synthase derived from Plesiomonas shigelloides.
  • the class I polyhydroxyalkanoate synthase is a polyhydroxyalkanoate synthase derived from Plesiomonas shigelloides and has an N175G mutation.
  • the microorganism is a microorganism selected from the group consisting of the genera Escherichia, Pseudomonas, Aeromonas, Alcaligenes, Bacillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Serratia, and Vibrio, or a hydrogen-oxidizing bacterium.
  • the microorganism is Escherichia coli.
  • Figure 1 shows a phylogenetic tree of class I PHA synthases.
  • the PHA synthase sequences were aligned using Clustal W, and a neighbor-joining tree was generated using Genetyx software.
  • PHA synthases from Aeromonas caviae (BAA21815), as well as those from Ferrimonas marina (WP_067661665), Plesiomonas shigelloides (WP_116546999), and Vibrio metschnikofii (WP_154168902)
  • PHA synthases from Delftia acidovorans BAA33155
  • Halomonas elongate WP_013333150
  • Ralstonia eutropha WP_011615085
  • Shewanella pirina (WP_012154995) were used.
  • FIG. 2 shows the sequence alignment of PHA synthase genes derived from F. marina, S. pealeana, P. shigelloides, and V. metschnikovii, and the PHA synthase gene (PhaC Ac ) derived from Aeromonas caviae.
  • the # symbol indicates the active site of the synthase, which is cysteine (C 319 ), aspartic acid (D 475 ), and histidine (H 503 ), respectively.
  • the * symbol indicates the site where the mutation is introduced.
  • FIG. 3 shows the chemical structures of representative PHAs and their precursors.
  • FIG. 4 is a diagram showing the structure of the plasmid (pBBR1-phaCsAB Re J Ac ).
  • phaC represents the PHA synthase (phaC) gene
  • phaA Re represents the 3-ketothiolase gene derived from R. eutropha H16
  • phaB Re represents the acetoacetyl-CoA reductase gene derived from R. eutropha H16
  • T Re represents the terminator region of the pha operon derived from R. eutropha H16
  • phaJ Ac represents the (R)-specific enoyl-CoA hydratase gene derived from A. caviae
  • SD represents the SD sequence
  • P lac represents the lac promoter region derived from A.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the structure of an expression cassette in which a mutation (N175G) has been introduced into the phaC Ps gene.
  • P pha_Re indicates the pha promoter region derived from Ralstonia eutropha H16
  • SD indicates the SD sequence
  • phaC Ps indicates the PHA synthase gene derived from P. shigelloides
  • phaA Re indicates the 3-ketothiolase gene derived from R. eutropha H16.
  • the present invention relates to a method for producing polyhydroxyalkanoic acid, which comprises the steps of introducing a gene for a class I PHA polymerase other than polyhydroxyalkanoic acid polymerase derived from Aeromonas caviae into a microorganism and culturing the transformant into which the gene has been introduced in the presence of a carbon source and, if necessary, a precursor of a second monomer.
  • PHA polymerases other than the PHA polymerase derived from Aeromonas caviae are not particularly limited as long as they are class I PHA polymerases, and examples thereof include PHA polymerases derived from species selected from the group consisting of the genera Ferrimonas, Shewanella, Plesiomonas, and Vibrio. from the genus Pherimonas, for example, Pherimonas marina, F. balearica; from the genus Shewanella, for example, S. pealeana, S. algae, S. amazonensis, S. aquimarina, S. baltica, S. benthica, S. colwelliana, S. decolorationis, S. denitrificans, S.
  • examples of the genus Plesiomonas include Plesiomonas shigelloides; examples of the genus Vibrio include Vibrio metschnikovii, V. cholerae, V. vulnificus, V. multiplinnatiensis, V. fluvialis, V. furnissii, V. mimicus, and V. parahaemolyticus.
  • PHA synthases are classified as class I synthases, the same as the PHA synthase derived from Aeromonas caviae, their amino acid sequences have low sequence identity or homology of less than 60% with the PHA synthase derived from Aeromonas caviae.
  • the "identity" of two amino acid sequences to be compared refers to the ratio of identical amino acid residues appearing at corresponding positions when both amino acid sequences are aligned
  • the “homology” of two amino acid sequences refers to the ratio of similar amino acid residues appearing at corresponding positions when both amino acid sequences are aligned, and is obtained by appropriately aligning the two amino acid sequences to be compared, determining the identical residues present in each sequence, determining the number of matching sites, and then dividing the number of matching sites by the total number of residues in the sequence region to be compared, and multiplying the obtained number by 100.
  • it can be obtained using the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program (Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10) or the like.
  • mutants of PHA synthase can also be preferably used in terms of increasing the amount of PHA produced.
  • Such mutants have an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the wild-type PHA synthase, and have PHA polymerization activity.
  • Such mutants have a sequence identity or homology of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and even more preferably 99% or more to the amino acid sequence of the wild-type PHA synthase.
  • the wild-type PHA synthase derived from Plesiomonas shigelloides contains a serine at position 153, which corresponds to position 149 of the mutant (N149S) of the PHA synthase derived from Aeromonas caviae.
  • an example of a mutant of PHA synthase derived from Plesiomonas shigelloides is a mutant in which asparagine (N) at position 175, which corresponds to position 171 of a mutant (D171G) of PHA synthase derived from Aeromonas caviae, is replaced with an aliphatic amino acid, such as glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), or isoleucine (I).
  • G glycine
  • A alanine
  • V valine
  • L leucine
  • I isoleucine
  • an example of a mutant is one in which asparagine at position 175 is replaced with glycine.
  • SEQ ID NO: 4 shows the base sequence encoding a mutant in which asparagine at position 175 is replaced with glycine.
  • the PHA synthesized by the manufacturing method of the present invention is a homopolymer of PHA, i.e., P(3HB), in the absence of a precursor.
  • the PHA synthesized by the manufacturing method of the present invention is a copolymer of 3HB and a second monomer in the presence of a precursor.
  • the "second monomer” refers to a monomer other than 3HB among the components constituting the copolymer with 3HB produced by the manufacturing method of the present invention.
  • the second monomer one or more monomers selected mainly from monomers having 3 to 6 carbon atoms can be used.
  • Examples of the second monomer are 3-hydroxypropionic acid (3HP), 3-hydroxy-2-methylbutanoic acid (3H2MB), 3-hydroxy-4-methylvaleric acid (3H4MV), 3-hydroxypivalic acid (3HPi), 3-hydroxyhexanoic acid (3HHx), 3-hydroxy-2-methylpropionic acid (3H2MP), etc.
  • Some monomers with 3 to 6 carbon atoms have isomers due to the asymmetric center at the C2 and/or C3 positions, such as 3-hydroxy-4-methylvaleric acid, 3-hydroxy-2-methylbutanoic acid, and 3-hydroxyhexanoic acid, and such isomers are also included in the second monomer.
  • precursor refers to a precursor of said second monomer.
  • the precursor of the second monomer 3-hydroxypropionic acid (3HP) is, for example, propionic acid
  • the precursor of the second monomer 3-hydroxy-4-methylvaleric acid (3H4MV) is, for example, 4-methylvaleric acid
  • the precursor of the second monomer 3-hydroxypivalic acid (3HPi) is, for example, 3-hydroxypivalic acid
  • the precursor of the second monomer 3-hydroxyhexanoic acid (3HHx) is, for example, hexanoic acid
  • the precursor of the second monomer 3-hydroxy-2-methylpropionic acid (3H2MP) is, for example, 3-hydroxy-2-methylpropionic acid.
  • the precursor of 3H2MP may also be methacrylic acid.
  • Methacrylic acid is metabolized to methacrylic-CoA
  • methacrylic-CoA is metabolized to 3H2MP-CoA.
  • Precursors to the second monomer, 3-hydroxy-2-methylbutanoic acid (3H2MB) include, for example, tiglic acid ((E)-2-methyl-2-butenoic acid), angelic acid, 2-methylbutanoic acid, 3-hydroxy-2-methylbutanoic acid, isoleucine, or mixtures thereof.
  • examples of copolymers of 3HB and a second monomer include copolymers of 3-hydroxybutanoic acid and 3-hydroxyhexanoic acid (P(3HB-co-3HHx)), copolymers of 3-hydroxybutanoic acid and 3-hydroxy-4-methylvaleric acid (P(3HB-co-3H4MV)), copolymers of 3-hydroxybutanoic acid and 3-hydroxy-2-methylbutanoic acid (P(3HB-co-3H2MB)), copolymers of 3-hydroxybutanoic acid and 3-hydroxypivalic acid (P(3HB-co-3HPi)), and copolymers of 3-hydroxybutanoic acid and 3-hydroxy-2-methylpropionic acid (P(3HB-co-3H2MP)) ( Figure 3).
  • the precursors may be added to the culture medium together with the carbon source or after several hours of culture in the presence of the carbon source.
  • Precursors are generally highly toxic to cells, thus inhibiting cell growth and reducing PHA accumulation in microorganisms.
  • it is preferred to introduce the precursors into the culture medium several hours after substantial cell growth has been achieved (Furutate S, Kamoi J, Nomura CT et al., NPG Asia Mater 2021; 13: 1-11. DOI: 10.1038/s41427-021-00296-x).
  • the amount of the precursor added is preferably in the range of about 0.1 to about 5.0 g/L, more preferably in the range of about 0.5 to about 2.0 g/L. In addition, it is preferable to add these amounts intermittently in several portions to enable better uptake of the precursor for the accumulation of the second monomer and to eliminate or reduce unexpected effects on the cells.
  • a transformant into which the PHA polymerase gene of the present invention has been introduced can be produced by any method.
  • a plasmid vector or artificial chromosome into which the PHA polymerase gene of the present invention has been introduced may be introduced into a host microorganism, or the PHA polymerase gene of the present invention may be introduced into DNA such as a chromosome, plasmid, or megaplasmid carried by the host microorganism using known gene recombination techniques.
  • the former method involves inserting the PHA polymerase gene of the present invention and a known monomer supply gene into a broad host range vector for expressing a gene of interest in the host to obtain a plasmid, which is then introduced into the host microorganism.
  • Phasin is known to co-localize with PHA granules in bacterial cells, and is thought to be involved in the formation and stabilization of PHA granules.
  • mutants having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid region from the N-terminus to the 20th amino acid are also preferably used.
  • Feicin mutants similarly improve PHA productivity.
  • the feicin gene in the present invention is not particularly limited as long as it is a feicin gene derived from a biological species different from the host of the transformed microorganism in the present invention.
  • the feicin gene may be derived from organisms of the genera Ralstonia, Cupriavidus, Woutersia, Alcaligenes, Aeromonas, or Pseudomonas, or may be a mutant thereof.
  • the feicin gene is derived from a microorganism of the genus Aeromonas, or a mutant thereof, and more preferably, the feicin gene is derived from Aeromonas caviae, or a mutant thereof.
  • the mutant may be a base sequence encoding a feicin in which one or more amino acid residues have been deleted, added, inserted, or substituted.
  • Such a mutant has a sequence identity or identity of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and even more preferably 99% or more to the amino acid sequence of wild-type feicin.
  • a broad-host-range vector for expressing a gene of interest in a host a known vector having a promoter, a ribosome-binding site, a gene cloning site, a terminator, etc. can be used. Examples include vectors pBBR1MCS-2, pJRD215, and pLA2917, which have a mob region with mobilizing activity.
  • Known monomer supply genes include, for example, phbA, phbB, phaA, and phaB from Ralstonia eutropha (Peoples, O. P. and Sinskey, A. J., J. Biol. Chem. 264: 15293-15297 (1989)) and phaJ from Aeromonas caviae (Fukui, T. and Doi, Y., J. Bacteriol. 179: 4821-4830 (1997)).
  • glucose when glucose, a sugar, is used as a carbon source in the absence of a precursor, glucose is converted to pyruvic acid and then to acetyl-CoA, which is then dimerized (PhaA) by ⁇ -ketothiolase (PhaA) and reduced by acetoacetyl-CoA reductase (PhaB) to be converted to 3HB-CoA, resulting in the synthesis of a homopolymer of 3-hydroxybutanoic acid (P(3HB)).
  • PhaA dimerized
  • PhaA dimerized
  • PhaA ⁇ -ketothiolase
  • PhaB acetoacetyl-CoA reductase
  • tiglic acid when glucose is used as a carbon source in the presence of tiglic acid as a precursor, for example, tiglic acid is converted to tiglyl-CoA, which is then converted to 3H2MB-CoA by enoyl-CoA hydratase (PhaJ).
  • PhaJ enoyl-CoA hydratase
  • the monomers supplied via the 3HB-CoA synthesis pathway and the 3H2MB-CoA synthesis pathway are used as substrates for PHA synthase (PhaC), synthesizing P(3HB-co-3H2MB).
  • the host microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it has good growth properties when sugars or fats and oils are used as carbon sources, the strain has high stability, and the cells can be relatively easily separated from the culture medium.
  • microorganisms of the genera Escherichia, Pseudomonas, Aeromonas, Ralstonia, Alcaligenes, Bacillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Serratia, and Vibrio are preferred. More preferably, the genus Escherichia.
  • An example of a microorganism of the genus Escherichia is Escherichia coli (hereinafter referred to as "E. coli" where appropriate).
  • the host microorganism used in the present invention may be a hydrogen-oxidizing bacterium (also called “hydrogen bacteria”).
  • “Hydrogen-oxidizing bacteria” refers to bacteria that oxidize free hydrogen and perform carbon dioxide assimilation by utilizing the energy generated by the reaction.
  • Examples of hydrogen-oxidizing bacteria include Ralstonia genus bacteria such as Ralstonia eutropha, Alcaligenes genus bacteria such as Alcaligenes latus, and Hydrogenovibrio genus bacteria such as Hydrogenovibrio marinus.
  • Ralstonia eutropha is preferred because it can grow under conditions in which gaseous carbon dioxide or carbonate is the sole carbon source, its entire genome information has been analyzed, and a gene recombination method has been established (Cramm, R. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 16, 38-52(2009)).
  • Examples of Ralstonia eutropha include the Ralstonia eutropha strain H16 (ATCC17699) and the Ralstonia eutropha strain PHB - 4 (DSM541).
  • Carbon sources that can be used include, for example, sugars, carboxylic acids, oils and fats, and carbon dioxide.
  • sugars include glucose, fructose, galactose, xylose, arabinose, saccharose, maltose, starch, and starch hydrolysates.
  • carboxylic acids include acetic acid and lactic acid.
  • oils and fats are vegetable oils, such as soybean oil, corn oil, cottonseed oil, peanut oil, coconut oil, palm oil, palm kernel oil, and fractionated oils thereof, such as palm double olein oil (low boiling fraction obtained by fractionating palm oil twice without a solvent), palm kernel oil olein (low boiling fraction obtained by fractionating palm kernel oil once without a solvent), and synthetic oils obtained by chemically or biochemically treating these oils and fats or their fractions, or mixed oils thereof.
  • oils and fats are vegetable oils, such as soybean oil, corn oil, cottonseed oil, peanut oil, coconut oil, palm oil, palm kernel oil, and fractionated oils thereof, such as palm double olein oil (low boiling fraction obtained by fractionating palm oil twice without a solvent), palm kernel oil olein (low boiling fraction obtained by fractionating palm kernel oil once without a solvent), and synthetic oils obtained by chemically or biochemically treating these oils and fats or their fractions, or mixed oils thereof.
  • carbon dioxide examples include air that is bubbled and enriched with carbon dioxide.
  • a mixed gas containing hydrogen (H 2 ), oxygen (O 2 ), and carbon dioxide (CO 2 ) can be used as the carbon dioxide.
  • the mixed gas may contain other components such as ammonia, nitrogen, hydrocarbons, carbon monoxide, formaldehyde, water vapor, etc.
  • the proportion of carbon dioxide in the mixed gas is, for example, 1 to 20% (v/v), preferably 3 to 20% (v/v), more preferably 5 to 15% (v/v).
  • glucose concentrations may cause catabolic repression of PHA biosynthetic genes induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) (Furutate S, Kamoi J, Nomura CT et al., NPG Asia Mater 2021; 13: 1-11. DOI: 10.1038/s41427-021-00296-x), so it is preferable to keep the glucose concentration at a minimum to promote cell growth only.
  • the amount of glucose added is preferably in the range of about 1 to about 20 g/L, more preferably in the range of about 3 to about 10 g/L, and even more preferably in the range of about 3 to about 8 g/L. In addition, it is preferable to add these amounts intermittently in several portions to enable better uptake of precursors for second monomer accumulation and to eliminate or reduce unexpected effects on the cells.
  • the culture temperature is a temperature at which the bacteria can grow, preferably 15 to 40°C, particularly preferably 20 to 40°C, and further preferably 28 to 34°C.
  • the culture time is not particularly limited, but for example, 1 to 7 days is preferable for batch culture, and continuous culture is also possible.
  • the culture medium is not particularly limited as long as it can be utilized by the host of the present invention.
  • a medium containing a nitrogen source, inorganic salts, other organic nutrient sources, and the like in addition to a carbon source can be used.
  • the nitrogen source include ammonia, ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, and diammonium hydrogen phosphate, peptone, meat extract, and yeast extract.
  • inorganic salts examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, monosodium phosphate, dibasic sodium phosphate, magnesium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, and hydrates thereof.
  • Metal salts containing cobalt, iron, calcium, nickel, chromium, copper, etc. may also be added as trace metal components.
  • Other organic nutrient sources include, for example, amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline; vitamins such as vitamin B1, vitamin B12, biotin, nicotinamide, pantothenic acid, and vitamin C.
  • the PHA of the present invention can be recovered from the bacterial cells, for example, by the following method. After the cultivation is completed, the bacterial cells are separated from the culture medium using a centrifuge or the like, washed with distilled water, methanol, or the like, and then dried. The copolymer is then extracted from the dried bacterial cells using an organic solvent such as chloroform. Next, bacterial components are removed from the organic solvent solution containing the copolymer by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate the copolymer. The supernatant is removed from the precipitated copolymer by filtration or centrifugation, and the copolymer can be recovered by drying. The obtained copolymer can be analyzed by, for example, gas chromatography, nuclear magnetic resonance, or the like.
  • the polydispersity (PDI) of a polymer is an important factor in determining the suitability of a polymer for a particular application, such as a biodegradable plastic material, and from a strength standpoint, a polymer with a high molecular weight and low PDI is generally desirable, whereas a molecular weight that is too high limits the options for molding methods due to the high melt viscosity of the polymer.
  • the PHA synthase of the present invention can synthesize a PHA having a weight average molecular weight (Mw) of about 20 ⁇ 10 5 to about 60 ⁇ 10 5 and a PDI in the range of about 1.3 to about 5.
  • PhaC from Plesiomonas shigelloides and its N175G mutant can synthesize P(3HB) or a copolymerized PHA of 3HB and a second monomer with a Mw of more than 30 ⁇ 10 5 and a PDI of less than 1.5. Therefore, it is expected that the PHA synthesized by the production method of the present invention can be industrially used for the above-mentioned applications.
  • the class I PHA polymerases used were those from Aeromonas caviae (accession number BAA21815), Delftia acidovorans (accession number BAA33155), Pherimonas marina (accession number WP_067661665), Halomonas elongate (accession number WP_013333150), Plesiomonas shigelloides (accession number WP_116546999), Ralstonia eutropha (accession number WP_011615085), Shewanella pirina (accession number WP_012154995), and Vibrio metschnikoffii (accession number WP_154168902).
  • PhaC box sequence is typically written as G-X-C-X-G-G (X is any amino acid), and a cysteine (Cys319 in PhaC Ac ) is the active center (Nambu Y, Ishii-Hyakutake M, Harada K et al., FEBS Lett 2020; 594: 710-6.DOI: 10.1002/1873-3468.13651).
  • PhaC Ac the active center Cys319, Asp475, and His503 are known to form a catalytic triad (Tsuge T, Watanabe S, Sato S et al., Macromolecul Biosci 2007; 7: 846-54. DOI: 10.1002/mabi.200700023), which are conserved in all PhaCs.
  • PhaC from Plesiomonas shigelloides has a protein size that is approximately 30 amino acid residues larger than other PhaCs and shows relatively low sequence identity in the C-terminal region.
  • Nucleotide sequence of PhaC from Shewanella pealeana (SEQ ID NO:2) ATG GAG AGC AAA AGC CCG TTT CAG GAC GCC ATT GAT AAT GCG ATG CAA TTC GGT CAA GCA TGG ATG GAC TCC TTT GGC CAG TCT GCG CAG TCA TCC ATC GTT GAG ACT CAG GCC GAA GAT TGG GCC CAG TGG ATG CGT TCC AGT GTT GAG CAT CCA GTG AAC TCT ATC GAA CAA CAA ATG GAT TGG TGG GGT CAG CAA GTG AAC CTG TTT AAC GAC TGC ATT ATG TCG AGC CCG GCG GAG AAA GAG ACA GAT CGG CGC TTT AAA GAT CCA GCG TGG AAC GAA CAA GCG CTG TAC AAG TAT ATT AAG GAA TCG TGT AAT AAC ATT CAG GCA AGC ATT ATG TCG AGC C
  • Nucleotide sequence of mutant PhaC derived from Plesiomonas shigelloides SEQ ID NO: 4
  • E. coli LSBJ (a fadB fadJ knockout mutant of E. coli LS5218 [fadR601, atoC(Con)] (Tappel RC, Wang Q, Nomura CT, J Biosci Bioeng 2012; 113:480-6. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2011.12.004)), which allows greater control of the repeating units in PHA biosynthesis, was used as a host for PHA biosynthesis.
  • Plasmids The plasmid pBBR1-phaCsAB Re J Ac ( FIG. 4 ) was prepared by introducing each phaC gene, the lac promoter region derived from A. caviae, the (R)-specific enoyl-CoA hydratase gene (phaJ Ac ), the 3-ketothiolase gene derived from Ralstonia eutropha H16 (phaA Re ), and the acetoacetyl-CoA reductase gene derived from Ralstonia eutropha H16 (phaB Re ) into the broad-host-range plasmid pBBR1MCS - 2 (Kovach ME, Elzer PH, Hill DS et al., Gene 1995; 166: 175-6.
  • LB medium and modified M9 medium were prepared as follows.
  • Antibiotics kanamycin: final concentration 50 ⁇ g/mL, and carbenicillin: final concentration 50 ⁇ g/mL
  • kanamycin final concentration 50 ⁇ g/mL
  • carbenicillin final concentration 50 ⁇ g/mL
  • Modified M9 medium 17.1 g of Na2HPO4.12H2O , 3 g of KH2PO4 , 0.5 g of NaCl, and 2.5 g of bacto-yeast extract (Difco Laboratories) were dissolved in 1 L of deionized water and autoclaved for 20 minutes at 121° C. 2 mL of 1 M MgSO4, 0.1 mL of 1 M CaCl2, 50 mg of kanamycin, and 50 mg of carbenicillin were added after autoclaving the liquid medium.
  • PHA biosynthetic gene expression was induced using 1 mM isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • P(3HB) homopolymer was synthesized by adding 20 g/L glucose at the beginning of cell culture and incubating for 72 h at 30° C.
  • the total incubation time was set to 76 h, with an initial incubation (130 rpm) of 4 h at 30° C. before adding IPTG, precursor, and glucose and culturing for an additional 72 h.
  • hexanoic acid, 4-methylvaleric acid, trans-2-methylbut-2-enoic acid (tiglic acid), 2,2-dimethyl-3-hydroxypropionic acid (3-hydroxypivalic acid), and 3-hydroxy-2-methylpropionic acid were pre-converted into their respective sodium salts and used as precursors for the second monomer components: 3HHx, 3H4MV, 3H2MB, 3HPi, and 3H2MP, respectively (Tanadchangsaeng N, Pattanasupong A., Polym 2022; 14: 428.
  • the structures of the precursors and copolymers used are shown in Figure 3. These precursors are known to inhibit cell growth, and high concentrations of glucose can repress PHA biosynthetic genes induced by IPTG.
  • glucose and precursors were added intermittently to the medium (4, 28, and 52 h). A total of 7.5 g/L glucose (2.5 g/L each time) and 0.6 g/L precursors (0.2 g/L each time) were added throughout the main incubation period. Finally, cells were harvested by centrifugation and lyophilized for further analysis.
  • the culture medium was centrifuged at 6,000 ⁇ g for 10 minutes at room temperature three times (once to discard the medium and twice to wash off the remaining salt with water), and then the dry cell weight was measured and freeze-dried for about 3 days.
  • the freeze-dried product was subjected to the following analysis.
  • the methanolylated sample was cooled to room temperature, and 1 mL of deionized water was added to separate polar components from nonpolar components.
  • the nonpolar components including 3HA-methyl ester, were filtered, and an equal volume of chloroform solution containing 0.1% (w/v) methyl-n-octane as an internal standard was added to prepare the final sample for GC analysis.
  • the sample was injected through a GC capillary column InertCap 1 (30 m x 0.25 mm, GL Science). The column temperature was first held at 90°C for 2 min, then increased to 110°C at a rate of 5°C/min, and then further increased to 280°C at a rate of 20°C/min.
  • the total PHA content and 3HA monomer composition were calculated from the obtained signal peak areas.
  • Example 1 Production of P(3HB) in E. coli expressing PhaC
  • P(3HB) was synthesized using a total of five PhaCs, including four PhaCs and a mutant (N175G) of PhaC derived from Plesiomonas shigelloides. The results are shown in Table 2.
  • Table 2 also shows the results using PhaC derived from Aeromonas caviae and its double mutant (NSDG).
  • Plesiomonas shigelloides-derived PhaC and its N175G mutant were found to have a high Mw of more than 3 ⁇ 10 6 and a relatively low PDI of less than 1.5.
  • Example 2 Preparation of copolymers of 3HB and a second monomer in E. coli expressing PhaC Copolymers of 3HB and a second monomer were synthesized in the same manner as in Example 1, except that the precursors hexanoic acid, 4-methylvaleric acid, tiglic acid, or 3-hydroxypivalic acid were further added. The precursors were added intermittently to the culture medium 4 hours after substantial cell growth was achieved (0.2 g/L x 3 times). Glucose was also added intermittently (2.5 g/L x 3 times). The results are shown in Tables 3 to 6. These tables also show the results using PhaC from Aeromonas caviae and its NSDG mutant.
  • Example 3 Preparation of a Copolymer of 3HB and a Second Monomer in E. coli Expressing PhaC
  • the precursor of the second monomer, 3-hydroxy-2-methylpropionic acid was synthesized as follows. Methyl-(R)-(-)-3-hydroxyisobutanoic acid and methyl-(S)-(+)-3-hydroxyisobutanoic acid (3 g) were dissolved in 15 mL of methanol, and 2 mol equivalents of sodium hydroxide were added on ice and stirred. The mixture was then stirred in a water bath at 40°C until white powder of 3-hydroxyisobutanoic acid sodium salt was precipitated. The resulting white powder was dried at room temperature to obtain 3-hydroxy-2-methylpropionic acid.
  • the resulting powder was dissolved in ultrapure water and the pH was adjusted to 7.0-7.4 with 1M HCl.
  • the resulting solution was filtered through a 0.45 ⁇ m cellulose acetate filter to prepare a monomer precursor to be added to the culture solution. Except for using 3-hydroxy-2-methylpropionic acid as the precursor, the copolymerized PHA was synthesized in the same manner as in Example 2. The results are shown in Table 7.
  • Tables 3-7 show that all PhaCs except for PhaC from Shewanella pirina were able to copolymerize all second monomers.
  • PHAs containing ⁇ -carbon methylation units are potentially attractive biobased materials, it is very interesting that almost all PhaCs have the ability to incorporate 3H2MB, 3HPi, or 3H2MP.
  • Plesiomonas shigelloides PhaC and its N175G mutant are overall superior to Aeromonas caviae PhaC in terms of high PHA content and broad substrate specificity.
  • Example 4 Production of PHA in Recombinant Hydrogen-Oxidizing Bacteria Expressing PhaC PHA was synthesized in the same manner as in Example 2, except that a recombinant hydrogen-oxidizing bacterium (Ralstonia eutropha PHB - 4/pBBREE"_P Ac Psh) was used as the host instead of E. coli LSBJ, and fructose was used instead of glucose.
  • Ralstonia eutropha PHB - 4/pBBREE"_P Ac Psh was constructed as follows.
  • the pBBREE"P Ac NSDG vector (7.5 kb) (Watanabe Y, Ichinomiya Y, Shimada D, Saika A, Abe H, Taguchi S, Tsuge T, J. Biosci. Bioeng., 2012, 113:286-292, DOI: 10.1016/j.jbiosc.2011.10.015) was digested with restriction enzymes NdeI and BamHI, and the chemically synthesized phaC Ps gene was inserted into the NdeI and BamHI sites. This gave pBBREE"_P Ac phaC Ps , a plasmid for PHA polymerization.
  • the obtained plasmid was transformed into Ralstonia eutropha PHB - 4 (a mutant strain lacking PHB polymerization ability) to construct Ralstonia eutropha PHB - 4/pBBREE"_P Ac phaC Ps .
  • Table 8 shows that PhaC derived from Plesiomonas shigelloides can synthesize P(3HB-co-3H2MB) or P(3HB-co-3H4MV) with a second monomer fraction equal to or greater than that of PhaC derived from the Aeromonas caviae NSDG mutant, even in hosts other than E. coli.
  • Table 9 shows that PHA having an ultrahigh molecular weight of 22 ⁇ 10 5 to 58 ⁇ 10 5 can be produced by using PhaC derived from Plesiomonas shigelloides.
  • Example 6 Production of PHA in Recombinant Hydrogen-Oxidizing Bacterium Expressing PhaC (1) Preparation of Ralstonia eutropha H16 ⁇ phaC1::phaC Ps (a) Construction of Plasmid pk18-phaC Ps In order to insert the phaC Ps gene represented by SEQ ID NO:3 into Ralstonia eutropha H16 ⁇ phaC1 strain (a PHA polymerization-deficient strain), the plasmid pk18-phaC Ps was constructed. Using the chemically synthesized phaC Ps gene as a template, PCR amplification was performed with primers 5 and 6 to amplify a phaC Ps gene fragment (1.9 kb).
  • the obtained DNA fragment was inserted into the SphI and EcoRI sites of pK18mobsacB (DOI: 10.1016/0378-1119(94)90324-7) to construct the plasmid pk18-phaC Ps .
  • Forward primer 5 5'-AGAGACAATCAAATCATGGCAAGTGCGAATCAGTT-3' (SEQ ID NO: 10)
  • Reverse primer 6 5'-GCACTCATGCAAGCGTCATGCCGCGTTTTCCTCGG-3' (SEQ ID NO: 11)
  • Forward primer 7 5'-aaaGAATTCCGGGCAAGTACCTTGCCGACAT-3' (SEQ ID NO: 12)
  • Reverse primer 8 5'-CACTTGCCATGATTTGATTGTCTCTCTGCCGTCAC-3' (SEQ ID NO: 13)
  • Forward primer 9 5'-CGCGGCATGACGCTTGCATGAGTGCCGGCGTGCGT-3' (SEQ ID NO: 14)
  • Reverse primer 10 5'-aaaGCATGCACTCGGCGCGCGACAGGGCGCGCTTG-3' (SEQ ID NO: 15)
  • the transformant was inoculated into LB medium (5.0 g/L yeast extract, 10 g/L bacto-tryptone, 10 g/L NaCl) containing 50 ⁇ g/mL kanamycin, and cultured overnight at 37° C. with shaking. Meanwhile, the Ralstonia eutropha H16 strain was inoculated into NR medium (2.0 g/L yeast extract, 10 g/L bacto-tryptone, 10 g/L bonito extract) and cultured overnight at 30° C. with shaking. Next, 2 mL of the culture medium of the transformant of E.
  • LB medium 5.0 g/L yeast extract, 10 g/L bacto-tryptone, 10 g/L NaCl
  • NR medium 2.0 g/L yeast extract, 10 g/L bacto-tryptone, 10 g/L bonito extract
  • coli S17-1 strain and the culture medium of Ralstonia eutropha H16 strain were collected and centrifuged at 10,000 ⁇ g for 2 minutes to prepare a cell pellet.
  • the cells were washed three times with 1 mL of NR medium to remove the antibiotic contained in the medium.
  • the washed cell pellet was suspended in 50 ⁇ L of NR medium to prepare a cell suspension in which the two types of cells were mixed. 100 ⁇ L of the cell suspension was dropped onto the NR agar medium and incubated at 30° C. for 24 hours to perform conjugation transfer.
  • the cultured cells were suspended in physiological saline, inoculated onto Son citric acid agar medium (2 g/L trisodium citrate dihydrate, 5.0 g/L NaCl, 1.0 g/L KH 2 PO 4 , 1.0 g/L NH 4 H 2 PO 4 , 0.2 g/L MgSO 4 .7H 2 O) containing 200 ⁇ g/mL kanamycin and 10 ⁇ g/mL gentamicin, and cultured for 2 days at 30° C.
  • the formed colonies were inoculated onto NR medium (2 mL) containing 200 ⁇ g/mL kanamycin, and cultured overnight at 30° C.
  • the culture solution was suspended in saline to prepare a diluted solution, which was then inoculated into MSY medium (MS medium (see Miyahara Y, Wang Chih-Ting, Ishii-Hyakutake M, Tsuge T, Bioengineering 2022, 9(10), 586. DOI: https://doi.org/10.3390/bioengineering9100586) containing 150 g/L of sucrose) and cultured at 30 ° C. for 2 days. The formed colonies were collected and colony PCR was performed using primers 7 and 10 to confirm the construction of the Ralstonia eutropha H16 ⁇ phaC1::phaC Ps strain.
  • R. eutropha H16 refers to the Ralstonia eutropha H16 strain (ATCC17699)
  • PHB - 4/pBBR1phaC Re refers to a strain obtained by introducing the plasmid pBBR1::phaCAB Re into the Ralstonia eutropha PHB - 4 strain (a mutant strain lacking PHB polymerization ability) (Miyahara Y., et al., Bioengineering 2022, 9, 586. https://doi.org/10.3390/bioengineering9100586).
  • a mass flow controller was used to supply a mixed gas of the desired gas composition.
  • the gas composition ratio was set to a hydrogen concentration of 75 vol% or more and an oxygen concentration of 7 vol% or less to avoid explosions due to hydrogen.
  • Table 10 shows that by using PhaC derived from Plesiomonas shigelloides, PHA having an ultra-high molecular weight of 50 x 105 can be produced from carbon dioxide as the sole carbon source.
  • Example 7 Production of PHA using Ralstonia eutropha H16 ⁇ phaC1::phaC Ps
  • the Ralstonia eutropha H16 ⁇ phaC1::phaC Ps strain prepared in Example 6(1) was inoculated into NR liquid medium and cultured overnight at 30°C to prepare a preculture solution. 1% of the preculture solution was inoculated into 100 mL of MS medium containing 0.5 g/L ammonium chloride, 10 g/L fructose and 1.0 g/L 3-hydroxypivalic acid as nitrogen sources and incubated at 30°C for 72 hours. Finally, the cells were collected by centrifugation and lyophilized for further analysis. The results are shown in Table 11. For comparison, the results of PHA biosynthesis using Ralstonia eutropha H16 strain (ATCC17699) are also shown for "R. eutropha H16".
  • Table 11 shows that by inserting the PhaC gene derived from Plesiomonas shigelloides into the genome of Ralstonia eutropha H16, the strain is capable of copolymerizing 3-hydroxypivalic acid and has high PHA productivity.
  • the PHA synthase of the present invention can be applied to the industrial production of various relatively high molecular weight PHAs, and the relatively high molecular weight PHAs produced can be effectively used as plastic materials such as for films.

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Abstract

広い基質特異性を有し、かつ比較的高分子量のＰＨＡの合成を可能にするＰＨＡ重合酵素を提供すること。　クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素（但し、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素を除く）遺伝子を微生物に導入し、前記遺伝子が導入された微生物を炭素源存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法、及び配列番号４の塩基配列によってコードされる、プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）由来の変異型ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素。

Description

ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
　本発明は、特定のクラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子を用いる、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法、及びプレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）由来の変異型ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素に関する。
　ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は微生物が細胞内に蓄積するバイオポリエステルである。近年では、生分解性プラスチック素材としてのみならず、バイオマス由来のプラスチック素材として注目されている。
　最も一般的なＰＨＡである、（Ｒ）－３－ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）を構成単位とするホモポリマー（以下、適宜「Ｐ（３ＨＢ）」と表記）は結晶性であるため、加工時間を短縮できる一方、硬くて脆く、実用性に乏しい。また、溶融時にポリマーが低分子量化してしまうなど成型加工時の劣化が問題となり、工業生産には向いていない。この物性を改善する手段の一つとして、３ＨＢと他のモノマーとの共重合体が種々開発されてきた（非特許文献１～４）。
　ＰＨＡ重合酵素は３－ヒドロキシアルカン酸の重合化に関連する重要な酵素であり（非特許文献５）、その基質特異性及びサブユニットの組成に基づいて４つのクラスに分類される（非特許文献６）。クラスＩ　ＰＨＡ重合酵素及びクラスＩＩ　ＰＨＡ重合酵素は、ＰＨＡ重合酵素サブユニットのホモダイマーである。例えばラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）に由来するクラスＩ　ＰＨＡ重合酵素は、主に短鎖長モノマー（炭素原子数３～５）を重合化し、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）に由来するクラスＩＩ　ＰＨＡ重合酵素は、中程度の鎖長モノマー（炭素原子数６～１４）を重合化する。
　一方、アロクロマティウム・ビノサム（Allochromatium vinosum）及びシネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp.）ＰＣＣ　６８０３などのクラスＩＩＩ　ＰＨＡ重合酵素、並びにバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）及びバチルス・セレウス（Bacillus cereus）に由来するクラスＩＶ　ＰＨＡ重合酵素は、２つのヘテロサブユニットからなり、短鎖長モノマーを重合化する。
　広い基質特異性を有するＰＨＡ重合酵素はＰＨＡ合成には魅力的な酵素である。本発明者らは、植物油及び脂肪酸から、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のＰＨＡ重合酵素（以下、適宜「ＰｈａＣＡｃ」と表記）が３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体（以下、適宜「Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）」と表記）を合成できることを報告している（非特許文献７～１１）。アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素は広範な基質特異性を有し、かつ高分子量のＰＨＡを合成可能なことから、優れた重合酵素の１つであり、ＰＨＡの合成に広く使用されている。また、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素に変異を導入した変異体も開発されており（非特許文献１０）、ＰＨＡの増産を可能にしている。
　しかしながら、広い基質特異性を有するＰＨＡ重合酵素は未だ数が少なく、所望のＰＨＡの工業的製造を妨げている。また、高分子量のＰＨＡを合成可能なＰＨＡ重合酵素が商業的に入手できることは重要であるが、現在入手可能なＰｈａＣＡｃは、Ｅ．コリなどの細菌の代謝物でありかつ重合化反応の連鎖移動剤として働くエタノールに高い感受性を有するため（非特許文献１１、非特許文献１２）、合成されるＰＨＡが比較的低分子量となってしまうとの問題がある。
Tsuge T, Yano K, Imazu SI et al., Macromol Biosci 2005; 5: 112-7. DOI: 10.1002/mabi.200400152 Mizuno K, Ohta A, Hyakutake M et al., Polym Degrad Stab 2010; 95: 1335-9. DOI: 10.1016/j.polymdegradstab.2010.01.033 Furutate S, Kamoi J, Nomura CT et al., NPG Asia Mater 2021; 13: 1-11. DOI: 10.1038/s41427-021-00296-x Mierzati M, Mizuno S, Tsuge T., Polym Degrad Stab 2020; 178: 109193. DOI: 10.1016/j.polymdegradstab.2020.109193. Sudesh K, Abe H, Doi, Y., Prog Polym Sci 2000; 25: 1503-55. DOI: 10.1016/S0079-6700(00)00035-6 Rehm BH., Biochem J 2003; 376: 15-33. DOI: 10.1042/bj20031254 Shimamura E, Kasuya K, Kobayashi G et al., Macromolecules 1994; 27: 878-80 Kobayashi G, Shiotani T, Shima Y et al., Stud J Polym Sci 1994; 12: 410-6. DOI: 10.1016/B978-0-444-81708-2.50044-0G Doi Y, Kitmura S, Abe, H., Macromolecules 1995; 28: 4822-8. DOI: 10.101/ma00118a007 Tsuge T, Watanabe S, Sato S et al., Macromolecul Biosci 2007; 7: 846-54. DOI: 10.1002/mabi.200700023 Tsuge T., Polym J 2016; 48: 1051-7. DOI: 10.1038/pj.2016.78 Hiroe A, Shiraishi M, Mizuno K et al., Polym J 2015; 47: 767-70. DOI: 10.1038/pj.2015.53
　従って、広い基質特異性を有し、かつ比較的高分子量のＰＨＡの合成を可能にするＰＨＡ重合酵素の探索が求められている。
　本発明者らは、斯かる実状に鑑み鋭意検討した結果、特定のクラスＩ　ＰＨＡ重合酵素が、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素と比べて、高分子量のＰＨＡを生合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。クラスＩ　ＰＨＡ重合酵素の中でも、特にプレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）由来のＰＨＡ重合酵素（以下、適宜「ＰｈａＣＰｓ」と表記）、及び特定の変異を導入した変異型ＰｈａＣＰｓは、比較的広い基質特異性及び高い重合化能力を有する点でＰＨＡ重合酵素として優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を提供する。
　（１）クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素（但し、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素を除く）遺伝子を微生物に導入し、前記遺伝子が導入された微生物を炭素源存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
　（２）前記クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素が、フェリモナス（Ferrimonas）属、シュワネラ（Shewanella）属、プレジオモナス（Plesiomonas）属、及びビブリオ（Vibrio）属からなる群より選択される、（１）に記載の製造方法。
　（３）前記クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素が、フェリモナス・マリナ（Ferrimonas marina）、シュワネラ・ピリナ（Shewanella pealeana）、プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、及びビブリオ・メチニコフィイ（Vibrio metschnikovii）からなる群より選択される、（１）に記載の製造方法。
　（４）前記クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子に対して６０％未満の配列同一性を有する、（１）に記載の製造方法。
　（５）前記クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素が、プレジオモナス・シゲロイデス由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素である、（１）に記載の製造方法。
　（６）前記クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素が、プレジオモナス・シゲロイデス由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素であって、Ｎ１７５Ｇの変異を有する、（１）に記載の製造方法。
　（７）前記微生物が、エシェリキア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アエロモナス（Aeromonas）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、セラチア（Serratia)属、及びビブリオ（Vibrio）属からなる群より選ばれる微生物、又は水素酸化細菌である、（１）に記載の製造方法。
　（８）前記微生物がエシェリキア・コリ（Escherichia coli）である、（１）に記載の製造方法。
　（９）前記微生物が水素酸化細菌である、（１）に記載の製造方法。
　（１０）前記水素酸化細菌が、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）である、（９）に記載の製造方法。
　（１１）前記炭素源が、糖、及び／又は二酸化炭素である、（１）に記載の製造方法。
　（１２）前記糖がグルコース又はフルクトースである、（１１）に記載の製造方法。
　（１３）炭素源存在下で培養する工程の後に、第２モノマーの前駆物質の存在下で培養する工程を更に含む、（１）に記載の製造方法。
　（１４）前記二酸化炭素が、二酸化炭素を１～２０％（ｖ／ｖ）の範囲で含む混合ガスである、（１１）に記載の製造方法。
　（１５）前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシブタン酸のホモポリマー、又は、３－ヒドロキシブタン酸と炭素原子数３～６の３－ヒドロキシアルカン酸とのコポリマーである、（１）～（１４）のいずれか１に記載の製造方法。
　（１６）前記コポリマーが、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシヘキサン酸とのコポリマー、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシ－４－メチル吉草酸とのコポリマー、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシ－２－メチルブタン酸とのコポリマー、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシピバル酸とのコポリマー、及び３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸とのコポリマーから成る群より選択される、（１５）に記載の製造方法。
　（１７）前記ポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が２０×１０５～６０×１０５の範囲である、（１）に記載の製造方法。
　（１８）配列番号４の塩基配列によってコードされる、プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）由来の変異型ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素。
　特定のクラスＩ　ＰＨＡ重合酵素を用いることにより、各種のＰＨＡを高分子量で製造することができる。
図１は、クラスＩ　ＰＨＡ重合酵素の系統樹を示す図である。ＰＨＡ重合酵素の配列をＣｌｕｓｔａｌ　Ｗを用いてアラインし、Ｇｅｎｅｔｙｘソフトウェアを用いて近隣結合樹を作成した。アエロモナス・キャビエ（ＢＡＡ２１８１５）由来のＰＨＡ重合酵素、並びにフェリモナス・マリナ（ＷＰ＿０６７６６１６６５）、プレジオモナス・シゲロイデス（ＷＰ＿１１６５４６９９９）、ビブリオ・メチニコフィイ（ＷＰ＿１５４１６８９０２）由来のＰＨＡ重合酵素に加えて、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）（ＢＡＡ３３１５５）、ハロモナス・エロンガタ（Halomonas elongate）（ＷＰ＿０１３３３３１５０）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）（ＷＰ＿０１１６１５０８５）、及びシュワネラ・ピリナ（ＷＰ＿０１２１５４９９５）由来のＰＨＡ重合酵素を使用した。 図２は、フェリモナス・マリナ（F. marina）、シュワネラ・ピリナ（S. pealeana）、プレジオモナス・シゲロイデス（P. shigelloides）、及びビブリオ・メチニコフィイ（V. metschnikovii）由来のＰＨＡ重合酵素遺伝子、並びにアエロモナス・キャビエ（A. caviae）由来ＰＨＡ重合酵素遺伝子（ＰｈａＣＡｃ）の配列アラインメントを示す図である。＃印は、重合酵素の活性部位を示し、順にシステイン（Ｃ３１９）、アスパラギン酸（Ｄ４７５）、ヒスチジン（Ｈ５０３）である。＊印は、変異が導入される箇所を示す。 図３は、代表的なＰＨＡ及びその前駆物質の化学構造を示す図である。 図４は、プラスミド（ｐＢＢＲ１-ｐｈａＣｓＡＢＲｅＪＡｃ）の構造を模式的に示す図である。図中、「ｐｈａＣ」はＰＨＡ重合酵素（ｐｈａＣ）遺伝子を、「ｐｈａＡＲｅ」はラルストニア・ユートロファ（R. eutropha）Ｈ１６由来の３-ケトチオラーゼ遺伝子を、「ｐｈａＢＲｅ」はラルストニア・ユートロファＨ１６由来のアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を、「ＴＲｅ」はラルストニア・ユートロファＨ１６由来のｐｈａオペロンのターミネーター領域を、「ｐｈａＪＡｃ」はアエロモナス・キャビエ（A. caviae）由来の（Ｒ）特異的エノイル-ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を、「ＳＤ」はＳＤ配列を、「Ｐｌａｃ」はアエロモナス・キャビエ由来のｌａｃプロモーター領域を、「Ｋｍｒ」はカナマイシン耐性遺伝子を、「Ｐｐｈａ_Ｒｅ」はラルストニア・ユートロファＨ１６由来のｐｈａプロモーター領域をそれぞれ示す。 図５は、ｐｈａＣＰｓ遺伝子に変異（Ｎ１７５Ｇ）を導入した発現カセットの構造を模式的に示す図である。図中、「Ｐｐｈａ_Ｒｅ」はラルストニア・ユートロファＨ１６由来のｐｈａプロモーター領域を、「ＳＤ」はＳＤ配列を、「ｐｈａＣＰｓ」はプレジオモナス・シゲロイデス（P. shigelloides）由来のＰＨＡ重合酵素遺伝子を、「ｐｈａＡＲｅ」はラルストニア・ユートロファ（R. eutropha）Ｈ１６由来の３-ケトチオラーゼ遺伝子をそれぞれ示す。
　以下、具体的な実施態様に即して本発明を詳細に説明する。但し、本発明は決して以下の実施態様に束縛されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。
　本発明は、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素以外のクラスＩ　ＰＨＡ重合酵素の遺伝子を微生物に導入し、前記遺伝子が導入された形質転換体を、炭素源及び必要に応じて第２モノマーの前駆物質の存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
　アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素以外のＰＨＡ重合酵素としては、クラスＩ　ＰＨＡ重合酵素であれば特に制限されないが、例えば、フェリモナス（Ferrimonas）属、シュワネラ（Shewanella）属、プレジオモナス（Plesiomonas）属、及びビブリオ（Vibrio）属からなる群より選択されるものに由来するＰＨＡ重合酵素が挙げられる。フェリモナス属としては、例えばフェリモナス・マリナ（F. marina）、フェリモナス・バレアリカ（F. balearica）など；シュワネラ属としては、例えばシュワネラ・ピリナ（S. pealeana）、シェワネラ・アルガエ（S. algae）、シェワネラ・アマゾネンシス（S. amazonensis）、シェワネラ・アクイマリナ（S. aquimarina）、シェワネラ・バルティカ（S, baltica）、シェワネラ・ベンシカ（S. benthica）、シェワネラ・コルウェリアナ（S. colwelliana）、シェワネラ・デコロラティオニス（S. decolorationis）、シェワネラ・デニトリフィカンス（S. denitrificans）、シェワネラ・ドクドネンシス（S. dokdonensis）、シェワネラ・フィデリス（S. fidelis）など；プレジオモナス属としては、例えばプレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）；ビブリオ属としては、例えばビブリオ・メチニコフィイ（Vibrio metschnikovii）、ビブリオ・コレレ（V. cholerae）、ビブリオ・バルニフィカス（V. vulnificus）、ビブリオ・シンシナチエンシス（V. cincinnatiensis）、ビブリオ・フルビアリス（V. fluvialis）、ビブリオ・ファーニシ（V. furnissii）、ビブリオ・ミミカス（V. mimicus）、ビブリオ・パラへモリティカス（V. parahaemolyticus）などが挙げられる。
　これらの中でも、特にフェリモナス・マリナ（Ferrimonas marina）（Katsuta A, Adachi K, Matsuda S et al., Int J Syst Evol Microbiol 2005; 55: 1851-5. DOI: 10.1099/ijs.0.63689-0）、プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）（Ferguson WW, Henderson ND., J Bacteriol Res 1947; 54: 179-81. DOI: 10. 1128/jb.54.2.179-181.1947；Janda, JM, Abbott SL, McIver CJ., Clin Microbiol Rev 2016; 29: 349-74. DOI: 10.1128/CMR.00103-15）、シュワネラ・ピリナ（Shewanella pealeana）（Leonardo MR, Moser DP, Barbieri E et al., Int J  Syst Evol Microbiol 1999; 49: 1341-51. DOI: 10.1099/00207713-49-4-1341）、及びビブリオ・メチニコフィイ（Vibrio metschnikovii）（Lee JV, Donovan TJ, Furniss al., Int J Syst Evol Microbiol 1978; 28:99-111. DOI: 10.1099/00207713-28-1-99）由来のＰＨＡ重合酵素が好ましい。これらの細菌由来のＰＨＡ重合酵素（野生型）は周知であるが、実際にＰＨＡを産生する能力や基質特異性についてはこれまで知られていなかった。
　上記の４つのＰＨＡ重合酵素は、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素と同じクラスＩに分類される重合酵素でありながら、そのアミノ酸配列はアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素と６０％未満と配列同一性又は相同性が低い。
　ここで、比較する２つのアミノ酸配列の「同一性」（identity）とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率、２つのアミノ酸配列の「相同性」（homology）とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に類似のアミノ酸残基が現れる比率を指し、比較対象の２つのアミノ酸配列を適切に整列化させ、それぞれの配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、次いで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、上記適合部位の数を割り、得られた数値に１００を掛けることによって得られる。例えばＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10）等を用いて求めることが可能である。
　また、ＰＨＡ重合酵素は、ＰＨＡの生産量の増加の点から、その変異体も好ましく使用できる。このような変異体は、野生型のＰＨＡ重合酵素のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列からなり、かつＰＨＡ重合活性を有する。かかる変異体は、野生型のＰＨＡ重合酵素のアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の配列同一性又は相同性を有する。配列アラインメント（図２）によれば、野生型のプレジオモナス・シゲロイデス由来のＰＨＡ重合酵素は、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素の変異体（Ｎ１４９Ｓ）の位置１４９に対応する位置１５３にセリンを含んでいる。そのため、プレジオモナス・シゲロイデス由来のＰＨＡ重合酵素の変異体として、例えば、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素の変異体（Ｄ１７１Ｇ）の位置１７１に対応する位置１７５のアスパラギン（Ｎ）を脂肪族アミノ酸、例えばグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、又はイソロイシン（Ｉ）に置換した変異体が例示される。具体的には位置１７５のアスパラギンをグリシンに置換した変異体が例示される。配列番号４は位置１７５のアスパラギンをグリシンに置換した変異体をコードする塩基配列を示す。
　本発明の製造方法によって合成されるＰＨＡは、前駆物質が非存在の場合にはＰＨＡのホモポリマー、すなわちＰ（３ＨＢ）である。
　本発明の製造方法によって合成されるＰＨＡは、前駆物質の存在下では３ＨＢと第２モノマーとのコポリマーである。本発明において、「第２モノマー」とは、本発明の製造方法によって製造される３ＨＢとのコポリマーを構成する成分のうち、３ＨＢ以外のモノマーを言う。第２モノマーとしては、主に炭素原子数３～６のモノマーから選択される１つ又は２つ以上のモノマーを使用することができる。第２モノマーの例は、３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）、３－ヒドロキシ－２－メチルブタン酸（３Ｈ２ＭＢ）、３－ヒドロキシ－４－メチル吉草酸（３Ｈ４ＭＶ）、３－ヒドロキシピバル酸（３ＨＰｉ）、３－ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）、３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（３Ｈ２ＭＰ）などである。
　炭素原子数３～６のモノマーの中には、３－ヒドロキシ－４－メチル吉草酸、３－ヒドロキシ－２－メチルブタン酸、３－ヒドロキシヘキサン酸などのように、Ｃ２位及び／又はＣ３位の不斉中心によって異性体が存在するものがあるが、このような異性体も第２モノマーに含まれる。
　本明細書における「前駆物質」とは、前記第２モノマーの前駆物質を言う。
　第２モノマーである３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）の前駆物質としては例えばプロピオン酸、第２モノマーである３－ヒドロキシ－４－メチル吉草酸（３Ｈ４ＭＶ）の前駆物質としては例えば４－メチル吉草酸、第２モノマーである３－ヒドロキシピバル酸（３ＨＰｉ）の前駆物質としては例えば３－ヒドロキシピバル酸、第２モノマーである３－ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）の前駆物質としては例えばヘキサン酸、第２モノマーである３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（３Ｈ２ＭＰ）の前駆物質としては例えば３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸が挙げられる。また、３Ｈ２ＭＰの前駆物質としてはメタクリル酸でもよい。メタクリル酸はメタクリル－ＣｏＡに代謝され、メタクリル－ＣｏＡは３Ｈ２ＭＰ－ＣｏＡに代謝される。
　第２モノマーである３－ヒドロキシ－２－メチルブタン酸（３Ｈ２ＭＢ）の前駆物質としては、例えば、チグリン酸（（Ｅ）－２－メチル－２－ブテン酸）、アンゲリカ酸、２－メチルブタン酸、３－ヒドロキシ－２－メチルブタン酸、イソロイシン、又はこれらの混合物が挙げられる。
　したがって、３ＨＢと第２モノマーとのコポリマーとしては、例えば、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシヘキサン酸とのコポリマー（Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシ－４－メチル吉草酸とのコポリマー（Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ４ＭＶ））、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシ－２－メチルブタン酸とのコポリマー（Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＢ））、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシピバル酸とのコポリマー（Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＰｉ））、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸とのコポリマー（Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＰ））である（図３）。
　前駆物質は、本発明の製造方法において、炭素源と一緒に培養培地に添加しても、又は炭素源存在下で数時間培養した後に培養培地に添加してもよい。前駆物質は、一般に、細胞に対して毒性が高いために、細胞成長を阻害し、微生物におけるＰＨＡ蓄積を低下させる。このような前駆物質によって誘発される毒性のリスクを排除又は低減するために、実質的な細胞成長が達成された数時間後に前駆物質を培養培地に導入することが好ましい（Furutate S, Kamoi J, Nomura CT et al., NPG Asia Mater 2021; 13: 1-11. DOI: 10.1038/s41427-021-00296-x）。
　前駆物質の添加量は、約０．１～約５．０ｇ／Ｌの範囲が好ましく、約０．５～約２．０ｇ／Ｌの範囲がより好ましい。また、第２モノマー蓄積のためのより良好な前駆物質の取り込みを可能にし、細胞に対する予期せぬ影響を除くか又はより少なくするために、これらの量を数回に分けて断続的に添加することが好ましい。
　本発明のＰＨＡ重合酵素遺伝子が導入された形質転換体は、任意の方法を利用して作製することができる。例えば、本発明のＰＨＡ重合酵素遺伝子を導入したプラスミドベクター又は人工染色体を宿主の微生物に導入してもよいし、公知の遺伝子組換え技術を用いて、本発明のＰＨＡ重合酵素遺伝子を、宿主となる微生物が保有する染色体、プラスミド、メガプラスミドなどのＤＮＡ上に導入してもよい。前者の方法としては、具体的には、宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターに、本発明のＰＨＡ重合酵素遺伝子及び公知のモノマー供給遺伝子を挿入して、プラスミドを得、当該プラスミドを宿主の微生物に導入する。
　ＰＨＡ重合酵素遺伝子の上流には、フェイシン（ｐｈａｓｉｎ）と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子が導入される（例えば、特開２０１３－４２６９７号参照）。フェイシンは、細菌の細胞内でＰＨＡ顆粒に共局在することが知られており、ＰＨＡ顆粒の形成、安定化などに関わると考えられている。
　フェイシンとしては、Ｎ末端から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列を有する変異体も好ましく用いられる。例えば、フェイシンのＮ末端から４番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換してなる変異体が挙げられる（例えば、特開２０１３－４２６９７号参照）。フェイシンの変異体は、同様にＰＨＡの生産性を向上させる。本発明におけるフェイシン遺伝子は、本発明における形質転換微生物の宿主とは異なる生物種由来のフェイシン遺伝子であれば特に限定されない。当該フェイシン遺伝子としては、ラルストニア（Ralstonia）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ワウテルシア（Woutersia）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アエロモナス（Aeromonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属に類する生物に由来するフェイシン遺伝子や、それらの変異体などが挙げられ、好ましくは、アエロモナス属の微生物に由来するフェイシン遺伝子、又はその変異体、より好ましくは、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）に由来するフェイシン遺伝子、又はその変異体である。当該変異体としては、１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたフェイシンをコードする塩基配列などを用いることができる。かかる変異体は、野生型のフェイシンのアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の配列同一性又は同一性を有する。
　宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターとしては、プロモーター、リボゾーム結合部位、遺伝子クローニング部位、ターミネーターなどを有する公知のベクターを用いることができる。例えば、移動能を有するｍｏｂ領域を持つベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２、ｐＪＲＤ２１５、ｐＬＡ２９１７が挙げられる。
　公知のモノマー供給遺伝子としては、例えば、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来のｐｈｂＡ、ｐｈｂＢ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ（Peoples, O. P. and Sinskey, A. J., J. Biol. Chem. 264: 15293-15297 (1989)）、アエロモナス・キャビエ由来のｐｈａＪ（Fukui, T. and Doi, Y., J. Bacteriol. 179: 4821-4830 (1997)）などが挙げられる。
　本発明の製造方法において、前駆物質の非存在下に炭素源として例えば糖類の１つであるグルコースを用いた場合には、グルコースはピルビン酸、次いでアセチル－ＣｏＡに変換された後、このアセチル－ＣｏＡはβ－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）により２量化（ＰｈａＡ）され、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）によって還元されて、３ＨＢ－ＣｏＡに変換されるため、３－ヒドロキシブタン酸のホモポリマー（Ｐ（３ＨＢ））が合成される。また、例えば、前駆物質としてのチグリン酸の存在下に炭素源としてグルコースを用いた場合には、チグリン酸はチグリル－ＣｏＡに変換され、チグリル－ＣｏＡは、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＰｈａＪ）により３Ｈ２ＭＢ－ＣｏＡに変換される。３ＨＢ－ＣｏＡ生成経路、３Ｈ２ＭＢ－ＣｏＡ生成経路の各々で供給されたモノマーはＰＨＡ重合酵素（ＰｈａＣ）の基質として利用され、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＢ）が合成される。
　本発明で使用される宿主微生物は、糖類や油脂類を炭素源として使用した場合の増殖性が良好で、菌株の安定性が高く、菌体と培養液との分離が比較的容易なものであれば特に制限されないが、例えば、エシェリキア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アエロモナス（Aeromonas）属、ラルストニア（Ralstonia）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、セラチア（Serratia）属、又はビブリオ（Vibrio）属の微生物が好ましい。より好ましくは、エシェリキア（Escherichia）属である。エシェリキア属の微生物としては、例えばエシェリキア・コリ（Escherichia coli）（以下、適宜、「Ｅ．ｃｏｌｉ」と表記）である。
　本発明で使用される宿主微生物は、水素酸化細菌（「水素細菌」とも称される）でもよい。「水素酸化細菌」とは、遊離の水素を酸化し、その反応によって生じるエネルギーを利用して、炭酸同化を行う細菌を意味する。水素酸化細菌としては、例えば、ラルストニア・ユートロファなどのラルストニア属細菌、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｌａｔｕｓ）などのアルカリゲネス属細菌、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ　ｍａｒｉｎｕｓ）などのヒドロゲノビブリオ属細菌が挙げられる。この中で、気体状の二酸化炭素や炭酸塩を唯一の炭素源とした条件で増殖可能な点、全ゲノム情報が解析されている点、及び遺伝子組換え法が確立されている（Cramm, R.et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 16, 38-52(2009)）点で、ラルストニア・ユートロファが好ましく、その一例としてラルストニア・ユートロファＨ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９）、ラルストニア・ユートロファＰＨＢ－４株（ＤＳＭ５４１）が挙げられる。
　炭素源としては、例えば、糖類、カルボン酸、油脂類、二酸化炭素などを用いることができる。糖類としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、サッカロース、マルトース、でんぷん、でんぷん加水分解物などが挙げられる。カルボン酸としては、酢酸、乳酸などが挙げられる。油脂類としては、植物油が好ましく、例えば大豆油、コーン油、綿実油、落花生油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、又はこられの分別油、例えばパームＷオレイン油（パーム油を２回無溶媒分別した低沸点画分）、パーム核油オレイン（パーム核油を１回無溶媒分別した低沸点画分）、又はこれらの油脂やその画分を化学的もしくは生化学的に処理した合成油、あるいはこれらの混合油が挙げられる。二酸化炭素を使用する場合には、バブルする空気を二酸化炭素で富化したものが例示できる。
　宿主微生物として水素酸化細菌を用いる場合には、二酸化炭素としては、水素（Ｈ２）、酸素（Ｏ２）及び二酸化炭素（ＣＯ２）を含む混合ガスを使用することができる。更に、当該混合ガスは、他の成分、例えばアンモニア、窒素、炭化水素、一酸化炭素、ホルムアルデヒド、水蒸気などを含み得る。混合ガス中の二酸化炭素の割合は、例えば１～２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは３～２０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは５～１５％（ｖ／ｖ）である。
　炭素源としてグルコースなどの糖類を用いる場合、グルコース濃度が高いと、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導されるＰＨＡ生合成遺伝子の異化抑制を引き起こす可能性があるため（Furutate S, Kamoi J, Nomura CT et al., NPG Asia Mater 2021; 13 : 1-11. DOI: 10.1038/s41427-021-00296-x）、グルコース濃度は細胞成長のみを促進するために最小限に維持することが好ましい。グルコースの添加量は、約１～約２０ｇ／Ｌの範囲が好ましく、約３～約１０ｇ／Ｌの範囲がより好ましく、約３～約８ｇ／Ｌの範囲が更に好ましい。また、第２モノマー蓄積のためのより良好な前駆物質の取り込みを可能にし、細胞に対する予期せぬ影響を除くか又はより少なくするために、これらの量を数回に分けて断続的に添加することが好ましい。
　培養温度は、菌の生育可能な温度、好ましくは１５～４０℃、特に好ましくは２０～４０℃、更に好ましくは２８～３４℃である。培養時間は、特に限定されないが、例えばバッチ培養では１～７日間が好ましく、また連続培養も可能である。培養培地は、本発明の宿主が利用できるものである限り特に限定されない。炭素源に加えて、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源などを含有する培地を使用することができる。
　窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウムなどのアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが挙げられる。
　無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸第一ナトリウム、リン酸第二ナトリウム、リン酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、およびそれらの水和物などが挙げられる。また、微量金属成分として、コバルト、鉄、カルシウム、ニッケル、クロム、銅などを含有する金属塩を添加してもよい。
　その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンなどのアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣなどのビタミン類などが挙げられる。
　本発明のＰＨＡの菌体からの回収は、例えば、次の方法によって行うことができる。培養終了後、遠心分離器などで培養液から菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノールなどにより洗浄した後、乾燥させた後、この乾燥菌体から、クロロホルムなどの有機溶媒を用いて共重合体を抽出する。次いで、この共重合体を含む有機溶媒溶液から、濾過などによって菌体成分を除去し、その濾液にメタノール、へキサンなどの貧溶媒を加えて共重合体を沈殿させる。沈殿した共重合体から、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させ、共重合体を回収することができる。得られた共重合体の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法、核磁気共鳴法などにより行うことができる。
　ポリマーの多分散性（ＰＤＩ）は、生分解性プラスチック材料などの特定の用途に対するポリマーの適合性を決定する際に重要な因子であり、強度の点から、一般に高い分子量かつ低いＰＤＩを有するポリマーが望ましい。一方で、高すぎる分子量はポリマーの溶融粘度を高くするために成形法の選択肢を限定する。
　本発明におけるＰＨＡ重合酵素は、約２０×１０５～約６０×１０５の重量平均分子量（Ｍｗ）及び約１．３～約５の範囲のＰＤＩを有するＰＨＡを合成することができる。
　特にプレジオモナス・シゲロイデス由来のＰｈａＣ及びそのＮ１７５Ｇ変異体は、３０×１０５超のＭｗかつ１．５未満のＰＤＩを有する、Ｐ（３ＨＢ）又は３ＨＢと第２モノマーとの共重合ＰＨＡを合成することができる。
　そのため、本発明の製造方法によって合成されるＰＨＡは、上記の用途に工業的に利用できることが期待される。
　次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
１．ＰｈａＣの探索
　クラスＩ　ＰＨＡ重合酵素のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＷ（https://www.ddbj.nig.ac.jp/services/clustalw.html）を用いてアラインし、Ｇｅｎｅｔｙｘソフトウェア（Genetyx Co. Ltd.）を用いて系統樹を作成した（図１）。使用したクラスＩ　ＰＨＡ重合酵素は、アエロモナス・キャビエ（アクセッション番号ＢＡＡ２１８１５）、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）（アクセッション番号ＢＡＡ３３１５５）、フェリモナス・マリナ（アクセッション番号ＷＰ＿０６７６６１６６５）、ハロモナス・エロンガタ（Halomonas elongate）（アクセッション番号ＷＰ＿０１３３３３１５０）、プレジオモナス・シゲロイデス（アクセッション番号ＷＰ＿１１６５４６９９９）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）（アクセッション番号ＷＰ＿０１１６１５０８５）、シュワネラ・ピリナ（アクセッション番号ＷＰ＿０１２１５４９９５）、及びビブリオ・メチニコフィイ（アクセッション番号ＷＰ＿１５４１６８９０２）由来のＰＨＡ重合酵素である。図１は、フェリモナス・マリナ由来のＰＨＡ重合酵素がアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素と非常に近接しており、プレジオモナス・シゲロイデス及びシュワネラ・ピリナ由来のＰＨＡ重合酵素と進化的に離れていることを示す。
　次に、鋳型配列として、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ重合酵素（ＰｈａＣＡｃ；アクセッション番号ＢＡＡ２１８１５）のアミノ酸配列を用いて、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）及びDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）データベースのサブセクションをＢＬＡＳＴＰ検索した。ＰｈａＣＡｃと比較的高い配列同一性を示す４つのＰｈａＣを更なる評価のために選択した。選択したＰｈａＣは、フェリモナス・マリナ（Ferrimonas marina）（Katsuta A, Adachi K, Matsuda S et al., Int J Syst Evol Microbiol 2005; 55: 1851-5. DOI: 10.1099/ijs.0.63689-0）、プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）（Ferguson WW, Henderson ND., J Bacteriol Res 1947; 54: 179-81. DOI: 10. 1128/jb.54.2.179-181.1947；Janda, JM, Abbott SL, McIver CJ., Clin Microbiol Rev 2016; 29: 349-74. DOI: 10.1128/CMR.00103-15）、シュワネラ・ピリナ（Shewanella pealeana）（Leonardo MR, Moser DP, Barbieri E et al., Int J  Syst Evol Microbiol 1999; 49: 1341-51. DOI: 10.1099/00207713-49-4-1341）、及びビブリオ・メチニコフィイ（Vibrio metschnikovii）（Lee JV, Donovan TJ, Furniss al., Int J Syst Evol Microbiol 1978; 28:99-111. DOI: 10.1099/00207713-28-1-99）由来のものである。
　ＰｈａＣＡｃのアミノ酸配列と上記の４つのＰｈａＣのアミノ酸配列とのアラインメントにより、全てのＰｈａＣは、ＰｈａＣＡｃと約６０％未満の同一性を示すことが判明した（表１）。なお、本明細書において、表１中の「類似性」（similarity）とは、先に定義した「相同性」と同義である。
　ＰｈａＣの多重配列アラインメントを図２に示す。全てのＰｈａＣは、活性部位にＰｈａＣボックス配列を有する。ＰｈａＣボックス配列は典型的にはＧ－Ｘ－Ｃ－Ｘ－Ｇ－Ｇ（Ｘは任意のアミノ酸である）と記載され、システイン（ＰｈａＣＡｃにおけるＣｙｓ３１９）は活性中心である（Nambu Y, Ishii-Hyakutake M, Harada K et al., FEBS Lett 2020; 594: 710-6.DOI: 10.1002/1873-3468.13651）。ＰｈａＣＡｃにおいて、活性中心Ｃｙｓ３１９、Ａｓｐ４７５及びＨｉｓ５０３は、触媒三残基を形成することが知られており（Tsuge T, Watanabe S, Sato S et al., Macromolecul Biosci 2007; 7: 846-54. DOI: 10.1002/mabi.200700023）、これらは全てのＰｈａＣにおいて保存されている。一方、プレジオモナス・シゲロイデス由来のＰｈａＣは、他のＰｈａＣよりも約３０アミノ酸残基大きいタンパク質サイズを有し、Ｃ末端領域に比較的低い配列同一性を示す。
２．材料及び調製方法
（１）細菌株及びプラスミド
　（ａ）細胞株
　上記４つのＰｈａＣについて、その遺伝子をエシェリキア・コリのための最適化されたコドン使用頻度で化学合成したものをＥｕｒｏｆｉｎｓ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．から入手した。その塩基配列を示す。
フェリモナス・マリナ（Ferrimonas marina）由来のＰｈａＣの塩基配列（配列番号１）
ATG AGC TCA GGC TCG TAC AAG CAG TTA CTG GAT AGC CTC ATG CAC TGT AAC GAG CAG TTG CTG GAA CTG GCG AAG AAC CAG GGG CAG CAT ACC TCG CAG GCG ATG ATG CAG AAG AGC CTG GAG GAT GTG TCG AAA GCG ATG AAC GAA GGC ATG AAA CAT CCG GAA AAC CTT ATC GAA CAC CAA GTG AAC TGG TGG CAG TCA CAA TTA CAG TTA TTT CAA AAC GCG ATG CTG AAA CAA GCG GGT CAG GAA ATT GAT CCC GTA ATT CAG CCG CCG AAA GGT GAT CGC CGC TTT CGT GAC CCG CAG TGG GAA GAT AAT CCG TGG TAC GAT TAC ATC AAA CAA GCG TAT CTG CTG ACG GCC AAG AAC TTA CTG GAA ACC GTT GAC CAA TTT GAG GAC CTG GAT GAA GAG TCA AAA GAA CGG CTC CGT TTC TTT ACC CGT CAA GCC GTG AAT GCT CTC GCC CCA AGC AAC TTC ATT GGT TCC AAT CCG GAA CTG CTT CAG TTA ACC ATG GAA TCT GGA GGC GAC AAC CTG GTT CGC GGA CTT AAA CAG ATG GCA AAA GAC ATG ATG CGC TCT GCC GGC ACC CTG AAT GTT AGC ATG ACC GAT GAA TCC GTG TTT ACC CTT GGA GAG GAT CTG GCA TCG ACT CCA GGG AAA GTG GTT CAC CAG AGC CGT CTG TAT GAG CTG CTT CAA TAT TCC CCG TCT ACC GAA ACG GTG GCG AAG CGC CCC ATT CTG ATT GTA CCG CCG TTT GTG AAC AAA TAC TAC ATT TTG GAT CTG CGC CCG GAG AAC TCA CTG GTT AAA TAC CTG GTT GAC CAA GGC CAT ACG GTG CTC ATG ATT AGC TGG GTA AAC CCG GAC CTC TCT CAT GCT GAC GTA GAT TTC GAA GAT TTC GTT GTC GAT GGT GTC ATC GAT GCA TTA CTG GCG GTG GAA AAG GTA ACG GGC GAA GCC GAA GTC AAT GCA GTT GGT TAT TGC ATT GGT GGC ACA GCT CTG ACC ACC GCT CTG GCA TAT ATG GCC GCG AAA CGC ATG AAA TCC CGC GTT AAA AGT GCC ACG CTG TTC ACT ACC ATT CTG GAC TTT GCG CAG CCA GGT GAA TTA GGG GTG TTT ATC AAC GAT GCC GTG GTC ACG GCT ATG GAA CAG CAG AAT GCG GAA CAA GGC GTG ATG GAC GGC CGC CAG TTG GCG GTC ACA TTC AGT TTA CTG CGT GAA AAT AAC TTG TAT TGG AAT TAC TAT GTG GAT GGG TAC CTG AAA GGC AAA AGT CCG GTG GCC TTC GAC CTG TTG CAC TGG AAT TGC GAT AAT ACT AAC GTC GCA GGC AAA ACT CAT AGC ACC ATG CTT CGC CGC TTC TAT TTG AAT AAC GAG CTC ATC CAA CCT GGT GCG TTT ACG GTC CGT GGC ACT AAA ATC GAT CTG GGT AAG ATC ACA ACG CCC ACT TAT TTT GTC AGT ACC GTG GAT GAC CAC ATT GCC CTG TGG AAA GGT AAC TAT GAA GGC ATG CGT CAG CTG GGC GGT AAG AAA ACA TTT GTT CTG GGA GAG TCG GGC CAT ATT GCC GGG ATT ATT AAT CCG CCT GGT GGA AAA TAT GGT CAT TAC ATC GCT AGT GGG GCA GAC GAA TTG AAT GCG GAT GAA TGG CTT GCG CAG GCC AAA CAC AAT GAG GGC TCC TGG TGG CCA GCA TGG AAT CAG TGG TTG GGC AGC CTG ACC AAA GCT AAA CCT GTC CCA GCA CGT GAA CTG AAC GAG GCA CTG CCT GAT GCG CCG GGT GAA TAT GTA CAG GTT CGG CTC AAC TCT ACG ACC GCC AAA GAT GAA GAG GCG ATC TGA
シュワネラ・ピリナ（Shewanella pealeana）由来のＰｈａＣの塩基配列（配列番号２）
ATG GAG AGC AAA AGC CCG TTT CAG GAC GCC ATT GAT AAT GCG ATG CAA TTC GGT CAA GCA TGG ATG GAC TCC TTT GGC CAG TCT GCG CAG TCA TCC ATC GTT GAG ACT CAG GCC GAA GAT TGG GCC CAG TGG ATG CGT TCC AGT GTT GAG CAT CCA GTG AAC TCT ATC GAA CAA CAA ATG GAT TGG TGG GGT CAG CAA GTG AAC CTG TTT AAC GAC TGC ATT ATG TCG AGC CCG GCG GAG AAA GAG ACA GAT CGG CGC TTT AAA GAT CCA GCG TGG AAC GAA CAA GCG CTG TAC AAG TAT ATT AAG GAA TCG TAC AAA CTG GCG TGT AAT AAC ATT CAG GCA AGC ATT AAC AAT ACT GAA GGC CTT GAT GAT GAA ACC CGT CAA CGT CTG TCG TTC TTT AGC CGT CAG TAC CTG AAT GCC ATG TCA CCG AGC AAC TTT GTG GCA ACT AAC CCG GAA ATT ATG AAA CTG ACC ATC GAA TCG AAA GGT CAA AAC TTG ATC AAA GGG CTG GAA CAG CTG CAA CAG GAC CTT GAG CAA TCT GTG GAC ACC TTG AAT ATC CGC ATG ACC GAT AAA ACC GCT TTT ACC GTG GGC AAG AAC ATC GCT ACG ACG CCT GGC AAA GTT GTC TTT AAG AAC GAT CTG TTT GAA CTG ATT CAG TAT CAG GCC ACG ACC GAA CAG GTG TAC AAG CGG CCG TTG TTA GTG GTA CCG CCT TTT GTC AAC AAA TTC TAC ATT ATG GAT CTC AGC CCT GAA CGC AGC TAT ACG CAG TGG TTA GTC AGC CAG GGT CAT ACC GTA TTT ATG ATT TCT TGG GTG AAT CCG AAT GCA GAG ATG GCG GCA ACG GAT TTC GGT GAC TAT GTC ACG CAG GGC GTA ATC CTG GCC TTA GAC GCG ATT GAA GCA GAA ACG GGC GAA CGC GAA GTT AAT GGC ATT GGG TAT TGC ATT GGT GGG ACC CTT CTG ACG GCG GCC ATG GCG TAC TTA GCC GGA AAA CGT CGC AAA CAG CGT GTC AAA TCT GCG ACT TTG CTG ACC ACA ATC CTG GAT TTC GGC CAA CCG GGT GAA CTC GGG GTG TTT ATC AAC GAT CCG CTG ATC AGT AGT ATT GAA GCG CAG AAT AAC GCA CGT GGA TAT ATG GAT GGT CGC CAA ATG GCA GTA TCA TTC AGC CTC TTA CGC GAG AAT AGT CTG TAT TGG AAC TAT TAT GTG ACC AAC TAC CTC AAA GGC GAA TCT CCC GTT GCC TTC GAC TTG TTG CAC TGG AAT TGT GAC AAT ACA AAC ATC ACT GCC GCG ACC CAT AAC CAG ATT CTG CGC CAG ATG TAT CTG GAG AAT AAG CTC AAA GAA CCG GGA GGG ATT ACC GTT GAT GGT GTG AAA GTT GAC CTG AGT AAA GTC AAG AGC CCG TGC TAT TTT CTG TCG GCC ATT GAG GAC CAC ATC GCA GTT TGG GAG GGC ACA TTC CGC GGC ACT GAA CTG CTG AAC GGC GAT AAC ACC TTC GTA TTA GCG GAA TCC GGT CAC ATT GCC GGT CCC ATG AAT CCG CCG AGT TCG AAC AAA TAC GGA TTT TGG ACC AAT TCC GAT AAT GCT CAG TCA CCC GCG AAA TGG CTG GCT GAG GCG GAT AAT CAC TCC GGT TCA TGG TGG CCA CAT TGG CAG TCG TGG GTT GAC GAA CGC AAT TTC AGT GAT AAA ATC GCT GCA CGC AGC CTG ACG GGC AAA CTT GAC GCT CCA GGC GAA TAC GTG AAA CAG CGC ATT GAA GAT GTG ATT GCT CCT AAA GAA GAA GTC CGT CAT GAT ACA TGA
プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）由来のＰｈａＣの塩基配列（配列番号３）
ATG GCA AGT GCG AAT CAG TTT AAC GGC GCG CTG GAC GCT CTG GCC GAT CTC AAT CGG AAA CTG GTC GAA CTG TAC CTC TCC CGC TCA ACG GCC CAA GGC CCG CTG AAT CAG GTT CTC ATG CAG GCC AAT ATG AAC GAT GCA AAT CGC TTC TTC GAA CAT GCG TTC GGT CAA CCA AAT GCC TTA GTT GAA CAG CAG CTG AAA TGG TGG CAG CAA CAG CTG GAA CTG TCC CAG CAC GCA GTG CTG CGC CTG TTT GGC CAG CCT AGT GAG CCG GTG ATC CAG CCC GAT CGT TCT GAT CGT CGC TTT ACT TCT GAC AAG TGG CAG CAG AAT ATC CTG TTC GAT TAC CTG AAG CAG TCC TAT CTT CTG ACG ACA CAA AAT GTC TTA GGT TCC ATT AAC CAG CTG GAA ACG CTG GAC GAG GAA ACC CGT AAG CGC CTG GAG TTC TTC ACG CGT CAG TAT CTG AGC GCG TTA TCG CCG TCG AAC TAT CTG CTG TCA AAC CCG GAA TTG CTG AAA GTG ACC TTG GAG AAC AAT GGT CAA AAC TTA GTG AAA GGC ATG GAA CTG CTT GTC GAA GAT ATG GAG AAG TCA GCG GAC ACC CTG AAT ATT CGC ATG ACA GAT CAG TCG AGC TTT CGT CCT GGT GAC AAC CTG GCG ACC ACA CCC GGT AAA GTA ATC TTT CGC AAT CAT CTG TTC GAG TTA ATT CAG TAC GTC CCG ACT ACC GAA GAA GTC TTA CAA CGC CCT CTG TTG ATT GTG CCA CCG TTC ATC AAC AAA TTT TAC ATC CTT GAT TTA CAA GCG CAA AAT AGC TTT GTT CGG TGG GCC GTA AGC CAG GGT CAT ACG GTC TTT ATG ATG AGC TGG GTG AAC GCC ACC CCG GAA CAC AAA GAC ATC ACC TTC GAA GAT TAC GTG ATT GAC GGT GTA TTA GCT GCA CTT GAT GCC ATC GAA ACG GCG ACC GGG GAG AAA GAG GTG AAT GGC ATC GGC TAT TGC ATT GGA GGC ACC CTT CTT TCG GTC ACC ATG GCG TAT CTG GCG GCA CGT CGC ATG AAA CAA CGT ATT CGT ACT GGC ACT CTG TTC ACG ACC TTA CTC GAT TTT GCC AAA CCG GGT GAC ATT GGC GTG TTT ATC AAC GAA GAA ACC GTG TCA GCT GTT GAG ACT CAG AAT CAA ATC AAA GGG TAT ATG GAC GGT CGC CAA ATT GCG GTG AGC TTC AGC CTT CTC CGC GAA AAC TCG CTG TAC TGG AAT TAT TTT GTG GAT AAC TAT CTG AAG GGC AAA TCT CCA ATG GCG TTT GAC ATT CTG TAT TGG AAC TGT GAT TCC ACC AAC GTT CCC GCA GCC TGC CAT AAC TTT CTC TTG CGT CAG TGC TAT TTG GAA AAC CAG CTG ATT ATG CCG GGC GGC ATT TCA ATC CGC GGA ACC GCG ATC GAT TTG AAC AAA ATC AAA CTG CCG TTG TAT TTC CTG AGT GCC GCC GAA GAT CAC ATT GCT TTG TGG GAT GCA ACG TAC GAT GGC GCG AAA GTC ATT GGA AAA GAC AAT TCC CAT GTT ACA TTT GTT CTC GGT GAA AGC GGC CAT ATT GCG GGT GTT GTA AAT CCA CCG GAG AAA GGG AAA TAC GGC TAT TGG TGT AAT CCC GAT AAC AGC TTT CTG CCG GAT GAT TCT CAA GCT TGG CTG AAC GCC GCT GAA CAC CAC AAA GGA AGC TGG TGG CCT CAT TGG CAG CAA TGG CTG GTG AGT CAT CTG CCG GAA GGT TCT AAA CCG GTA CCA GCT CGT CAG CCG GTT GCA CGC GAA AAC CAA CCG TTG CTC GGG GAC GCG CCT GGG GAA TAC GTG AAA GTA CGC ATT TCG GAT ATT GAC CAG CAG ATT AAG GCA AGC CTG CTG CAC CCA AGT TCT GAA AAG AGT GCC GAG GAA AAC GCG GCA TGA
プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）由来の変異型ＰｈａＣの塩基配列（配列番号４）
ATG GCA AGT GCG AAT CAG TTT AAC GGC GCG CTG GAC GCT CTG GCC GAT CTC AAT CGG AAA CTG GTC GAA CTG TAC CTC TCC CGC TCA ACG GCC CAA GGC CCG CTG AAT CAG GTT CTC ATG CAG GCC AAT ATG AAC GAT GCA AAT CGC TTC TTC GAA CAT GCG TTC GGT CAA CCA AAT GCC TTA GTT GAA CAG CAG CTG AAA TGG TGG CAG CAA CAG CTG GAA CTG TCC CAG CAC GCA GTG CTG CGC CTG TTT GGC CAG CCT AGT GAG CCG GTG ATC CAG CCC GAT CGT TCT GAT CGT CGC TTT ACT TCT GAC AAG TGG CAG CAG AAT ATC CTG TTC GAT TAC CTG AAG CAG TCC TAT CTT CTG ACG ACA CAA AAT GTC TTA GGT TCC ATT AAC CAG CTG GAA ACG CTG GAC GAG GAA ACC CGT AAG CGC CTG GAG TTC TTC ACG CGT CAG TAT CTG AGC GCG TTA TCG CCG TCG AAC TAT CTG CTG TCA AAC CCG GAA TTG CTG AAA GTG ACC TTG GAG AAC GGC GGT CAA AAC TTA GTG AAA GGC ATG GAA CTG CTT GTC GAA GAT ATG GAG AAG TCA GCG GAC ACC CTG AAT ATT CGC ATG ACA GAT CAG TCG AGC TTT CGT CCT GGT GAC AAC CTG GCG ACC ACA CCC GGT AAA GTA ATC TTT CGC AAT CAT CTG TTC GAG TTA ATT CAG TAC GTC CCG ACT ACC GAA GAA GTC TTA CAA CGC CCT CTG TTG ATT GTG CCA CCG TTC ATC AAC AAA TTT TAC ATC CTT GAT TTA CAA GCG CAA AAT AGC TTT GTT CGG TGG GCC GTA AGC CAG GGT CAT ACG GTC TTT ATG ATG AGC TGG GTG AAC GCC ACC CCG GAA CAC AAA GAC ATC ACC TTC GAA GAT TAC GTG ATT GAC GGT GTA TTA GCT GCA CTT GAT GCC ATC GAA ACG GCG ACC GGG GAG AAA GAG GTG AAT GGC ATC GGC TAT TGC ATT GGA GGC ACC CTT CTT TCG GTC ACC ATG GCG TAT CTG GCG GCA CGT CGC ATG AAA CAA CGT ATT CGT ACT GGC ACT CTG TTC ACG ACC TTA CTC GAT TTT GCC AAA CCG GGT GAC ATT GGC GTG TTT ATC AAC GAA GAA ACC GTG TCA GCT GTT GAG ACT CAG AAT CAA ATC AAA GGG TAT ATG GAC GGT CGC CAA ATT GCG GTG AGC TTC AGC CTT CTC CGC GAA AAC TCG CTG TAC TGG AAT TAT TTT GTG GAT AAC TAT CTG AAG GGC AAA TCT CCA ATG GCG TTT GAC ATT CTG TAT TGG AAC TGT GAT TCC ACC AAC GTT CCC GCA GCC TGC CAT AAC TTT CTC TTG CGT CAG TGC TAT TTG GAA AAC CAG CTG ATT ATG CCG GGC GGC ATT TCA ATC CGC GGA ACC GCG ATC GAT TTG AAC AAA ATC AAA CTG CCG TTG TAT TTC CTG AGT GCC GCC GAA GAT CAC ATT GCT TTG TGG GAT GCA ACG TAC GAT GGC GCG AAA GTC ATT GGA AAA GAC AAT TCC CAT GTT ACA TTT GTT CTC GGT GAA AGC GGC CAT ATT GCG GGT GTT GTA AAT CCA CCG GAG AAA GGG AAA TAC GGC TAT TGG TGT AAT CCC GAT AAC AGC TTT CTG CCG GAT GAT TCT CAA GCT TGG CTG AAC GCC GCT GAA CAC CAC AAA GGA AGC TGG TGG CCT CAT TGG CAG CAA TGG CTG GTG AGT CAT CTG CCG GAA GGT TCT AAA CCG GTA CCA GCT CGT CAG CCG GTT GCA CGC GAA AAC CAA CCG TTG CTC GGG GAC GCG CCT GGG GAA TAC GTG AAA GTA CGC ATT TCG GAT ATT GAC CAG CAG ATT AAG GCA AGC CTG CTG CAC CCA AGT TCT GAA AAG AGT GCC GAG GAA AAC GCG GCA TGA
　変異型では、配列番号３の塩基配列の５２３～５２５位（下線部）のＡＡＴ（Ａｓｎ１７５に相当）がＧＧＣ（Ｇｌｙに相当）に置換されている。
ビブリオ・メチニコフィイ（Vibrio metschnikovii）由来のＰｈａＣの塩基配列（配列番号５）
ATGCTCCAACACTTCTTCAGTGATTACCTGGTGAAACTGCAGGAAACTAACCAGCAGTGGTGGCAGGATTTTGAGGCCAATAAGATGGCCGCGAATAGCCCGCTGAATCAGGCAATTCAAGCGGTTAACTTTGAAGATTCTGCGAAATTCTTTGAGCAGGCAGTAAATCAGCCAACAGCCCTACTGCAACTTCAAACCCAGTGGTGGGAACAACAGATGCAGATCTGGCAGCAAGTGGTCTTAAGCGGCAACACCCAAAGCGTTATCGAAGCGGAAAAAGGCGATAAACGCTTTATCGATGAAACGTGGCAGAGTCAAGCGATGTATAACTTCATTAAACAGTCCTATCTGCTCTTCTGCAAAACCTACATGGAGACTATCAATGCAATCGAAGGAGTGGATGAAAAAACCAAAGAGCGTATCTCGTTCTTTAGTCGGCAGATGATCAATGCGATGTCTCCGTCTAATTTCATTGCTACGAACCCTGAACTGTTGAAGCTGACCATAGAGAACAACGGTCAAAACTTACTGAAAGGCATGGAGCTGCTGAAAGAAGATTTGCAGTCAAGCGCGGATATACTGAAAGTGCGTATGACGAACGAACAGGCCTTTCGCTTGGGCGAAGAGATCGCTTCTACTGAGGGCAAAGTGGTGTATCGGAATGAACTTTTCGAACTGATCCAGTATACCCCTGTTACCGAACAGGTTAAAGCCACTCCGCTGCTAATTGTACCCCCGTTTATCAACAAGTACTATATCCTGGATCTCACGAAAAAGAACAGTATGGTGCGCTGGCTGGTTGAGCAGGGTCATTGTGTCTTCATGATCTCTTGGAGAAATCCAGGTAAAGCCCAAAGCGAGATTGGGTTCGATAACTACGTCCTCGATGGTGTGGTACAGGCAGTGAGCGTTATTGAGGACATCACAGGCCAGGAACAAATCAACGCTGCGGGATATTGCATTGGTGGTACCGCACTTGCATCAGCGATTGCCTATTATGCCGCGAAACGTATGAAGAAACGCATCAAGAGTGCCAGCTTTTTTACAACGCTGCTTGACTTTAGCCAACCAGGTGAAGTGGGGGCTTACATTAACGATACCATTATCTCCGCAATTGAAGCTCAGAATAGCGCCCAAGGCTTCATGGATGGGCGTTCGCTGTCAGTCACTTTTTCCCTGTTACGCGAGAATTCCCTGTATTGGAACTATTACATTGACAACTATCTGAAAGGAACATCTCCGGTAGACTTTGACTTGCTTTACTGGAATTCGGATAGCACCAACGTTGCCGCAAACACCCACAATTTTCTGTTGCGTGAATTGTACCTGAACAACCAGTTAGTCCAGGACAAAGGCGTTAAGATTGGAGGCGTTTGGATTGATCTGAATAAAATCCGCATTCCGTCCTACTTTATTAGCGCGAAAGACGATCACATAGCGCTGTGGCAGGGCACGTATCGAGGTGCTCTCGCAATGGGGGGCAATAAAACGTTTGTGCTCGGCGAATCGGGTCATATTGCCGGGATTGTCAACCCACCTGCGAAAAACAAATACGGCTACTGGGTCAATGACAGTTTAGATGAATCGGCGGATGAATGGCTGGCTAATGCACAACGTGCGGAAGGTTCATGGTGGACGCATTGGGACCAATGGCTGGACCAGTTCAATCCGGAATCCTTAGTACCGGCCTATCCGATTGGTTCGGACAACTTTCCGGCGTTAGAAGCGGCTCCCGGCTCATATGTGAAACAGACCTTGCCGATTGTGGAATGA
　ＰＨＡの生合成における反復単位のより高い制御を可能にする、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＬＳＢＪ（E. coli LS5218のfadB fadJノックアウト変異株［fadR601, atoC(Con)］（Tappel RC, Wang Q, Nomura CT, J Biosci Bioeng 2012; 113 :480-6. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2011.12.004））をＰＨＡ生合成のための宿主として使用した。
　（ｂ）プラスミド
　広宿主範囲プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（Kovach ME, Elzer PH, Hill DS et al., Gene 1995; 166: 175-6. DOI: 10.1016/0378-1119(95)00584-1）に、各ｐｈａＣ遺伝子、アエロモナス・キャビエ（A. caviae）由来のｌａｃプロモーター領域、（Ｒ）特異的エノイル-ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）Ｈ１６由来の３-ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈａＡＲｅ）、及びラルストニア・ユートロファＨ１６由来のアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼ遺伝子（ｐｈａＢＲｅ）を導入したプラスミドｐＢＢＲ１－ｐｈａＣｓＡＢＲｅＪＡｃ（図４）を使用した。ｐｈａＡＢ発現のために、ラルストニア・ユートロファｐｈａプロモーター及びターミネーター領域は、それぞれ、それらの遺伝子の上流及び下流に位置させた。
　３ＨＨｘ、３Ｈ４ＭＶ、３Ｈ２ＭＢ、３ＨＰｉ、及び３Ｈ２ＭＰの各モノマーの供給を増強するために、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｐｃｔ）遺伝子を含むＮｈｅ　Ｉ－Ｍｕｎ　Ｉ断片を、ＰＣＲ法によってｐＴＶｐｃｔＣ１ＳＴＱＫＡＢＲｅから増幅し、次いで、当該断片をｐＴＴＱ１９のＸｂａ　Ｉ－ＥｃｏＲ　Ｉ部位に挿入することによって、ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを作製した（Furutate et al., J. Polym. Res. 2017, 24: 221）。当該ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴは、メガスフェラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ　ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のｐｃｔ遺伝子を有している（同文献）。
　次に、プラスミドｐＢＢＲ１－ｐｈａＣｓＡＢＲｅＪＡｃ及びプラスミドｐＴＴＱ１９－ＰＣＴをＥ．ｃｏｌｉ　ＬＳＢＪに導入し、組換えＥ．ｃｏｌｉ　ＬＳＢＪを作製した。
３．培養条件
　上記（ｂ）で作製した組換えＥ．ｃｏｌｉ　ＬＳＢＪを、２０ｍＬのＬｙｓｏｇｅｎｙ　Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地を含む５０ｍＬバッフル付きフラスコに接種し、往復振盪機（１６０ｒｐｍ）を用いて３７℃で一晩インキュベートし、種培養物を作製した。
　次に、９５ｍＬのＭ９改変培地を含有する５００ｍＬの振盪フラスコに、種培養物５ｍＬを接種した（最終容量１００ｍＬ、接種物の５％）。
　ＬＢ培地及びＭ９改変培地は以下のようして調製した。
　（１）Ｌｙｓｏｇｅｎｙ　Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地
　ｂａｃｔｏ－ｔｒｙｐｔｏｎ（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）１０ｇ、ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔエキス（Difco Laboratories）５ｇ、ＮａＣｌ　１０ｇを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した。抗生物質（カナマイシン：終濃度５０μｇ／ｍＬ、及びカルベニシリン：終濃度５０μｇ／ｍＬ）は、液体培地のオートクレーブ処理後に添加した。
　（２）Ｍ９改変培地
　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ　１７．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　３ｇ、ＮａＣｌ　０．５ｇｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔエキス（Difco Laboratories）２．５ｇを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した。１Ｍ　ＭｇＳＯ４　２ｍＬ、１Ｍ　ＣａＣｌ２　０．１ｍＬ、カナマイシン５０ｍｇ、及びカルベニシリン５０ｍｇは、液体培地のオートクレーブ処理後に添加した。
　更に、１ｍＭのイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて、ＰＨＡ生合成遺伝子発現を誘導した。
　Ｐ（３ＨＢ）ホモポリマーは、細胞培養の開始時に２０ｇ/Ｌグルコースを加え、３０℃で７２時間インキュベーションすることによって合成した。３ＨＢとのコポリマーの合成については、合計インキュベーション時間を７６時間に設定し、ＩＰＴＧ、前駆物質、グルコースを加え、更に７２時間培養する前に、３０℃で４時間の初期培養（１３０ｒｐｍ）を行った。
　前駆物質であるヘキサン酸、４-メチル吉草酸、ｔｒａｎｓ－２-メチルブト－２-エン酸（チグリン酸）、２，２－ジメチル－３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ヒドロキシピバリン酸）、及び３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を各々のナトリウム塩に予め変換し、第２モノマー成分：３ＨＨｘ、３Ｈ４ＭＶ、３Ｈ２ＭＢ、３ＨＰｉ、３Ｈ２ＭＰの前駆物質としてそれぞれ使用した（Tanadchangsaeng N, Pattanasupong A., Polym 2022; 14: 428. DOI: 10.3390/polym14030428、Watanabe Y, Ishizuka K, Furutate S et al., RSC Adv 2015; 5: 28679-85. DOI: 10.1039/C5RA08003G、Fuchtenbusch B, Fabritius D, Waltermann M, et al., FEMS Microbio Let  1998; 159: 85-92. DOI:10.1111/j.1574-6968.1998.tb12845.x）。使用した前駆物質及びコポリマーの構造を図３に示す。
　これらの前駆物質は細胞成長を阻害することが知られており、高濃度のグルコースはＩＰＴＧによって誘導されるＰＨＡ生合成遺伝子を抑制することができる。したがって、低濃度のグルコース及び前駆物質を培地に断続的に添加した（４、２８、及び５２時間）。合計７．５ｇ/Ｌのグルコース（毎回２．５ｇ/Ｌ）及び０．６ｇ/Ｌの前駆物質（毎回０．２ｇ/Ｌ）を、主インキュベーション期間を通して添加した。
　最後に、遠心分離によって細胞を回収し、更なる分析のために凍結乾燥した。
４．部位特異的変異誘発
　オーバーラップ・エクステンションＰＣＲを用いてｐｈａＣＰｓ遺伝子に変異（Ｎ１７５Ｇ）を導入した（図５）（Warrens AN, Jones M, Lechler RI., Gene 1997; 186: 29-35. DOI: 10.1016/S0378-1119(96)00674-9）。アミノ酸置換のために、以下のプライマーを化学合成した。
　5’-GGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCGGGGCAA-3（配列番号６）（フォワードプライマー、図５で「１」と表記）
　5’-CACTAAGTTTTGACCGCCGTTCTCCAAGGT-3’（配列番号７）（リバースプライマー、図５で「３」と表記）
　5'-GTGACCTTGGAGAACGGCGGTCAAAACTT-3'（配列番号８）（フォワードプライマー、図５で「４」と表記）
　5’-GCGCTTGGAGGCCGGCACCG-3’（配列番号９）（リバースプライマー、図５で「２」と表記）
　下線部はＡｓｎ１７５（AAT）をＧｌｙ（GGC）で置換するためのコドンを示す。変異遺伝子を有するプラスミドをｐＴＴＱ１９－ＰＣＴと共にＥ．ｃｏｌｉ　ＬＳＢＪに導入した。
５．ＰＨＡの分析
　培養培地を６，０００×ｇで１０分間、室温で３回（培地を捨てるために１回、残りの塩を水で洗い流すために２回）遠心分離した後、乾燥細胞重量を測定し、約３日間凍結乾燥した。凍結乾燥したものを以下の分析に供した。
　（１）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）
　ＰＨＡ含量、ＰＨＡ収率、及びＰＨＡ構成モノマー（適宜、「３ＨＡモノマー」又は「３ＨＡ」と表記）組成は、火炎イオン化検出器を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ　ＧＣ－２０１４ｓ装置（Shimadzu, Kyoto, Japan）を使用するＧＣによって測定した。凍結乾燥した細胞をメタノール化して、ＧＣ分析のために１５％硫酸の存在下でＰＨＡを３ＨＡ-メチル成分に変換した。メタノール分解反応は３Ｈ２ＭＢを除いて１００℃で１４０分間行い、３Ｈ２ＭＢの分解反応は、１００℃で８時間に設定した。メタノール化した試料を室温まで冷却し、１ｍＬの脱イオン水を添加して、非極性成分から極性成分を分離した。３ＨＡ-メチルエステルを含む非極性成分を濾過し、内部標準として０．１％（ｗ／ｖ）メチル-ｎ-オクタンを含む等容量のクロロホルム溶液を加えて、ＧＣ分析用の最終試料を調製した。試料をＧＣキャピラリーカラムＩｎｅｒｔＣａｐ　１（３０ｍ×０．２５ｍｍ，GL Science）を通して注入した。カラム温度は最初に９０℃で２分保持し、その後５℃／分の速度で１１０℃に上昇させ、更にその後２０℃／分の速度で２８０℃に上昇させた。得られたシグナルピーク面積から、合計ＰＨＡ含有量及び３ＨＡモノマー組成を計算した。
　（２）ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）
　種々のＰｈａＣを用いて合成したＰ（３ＨＢ）の分子量をＧＰＣにより、ＲＩ－５０４屈折率検出器（Shodex）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ　Ｎｅｘｅｒａ　ＧＰＣシステムを用いて、２つのＫＦ－４０６－ＬＨＱジョイント部カラム（４０℃、Shodex）を装備して測定した。移動相溶媒としてクロロホルムを流量０．３ｍＬ/分で使用した。試料濃度及び注入量は、それぞれ１ｍｇ/ｍＬ及び１０μＬに設定した。低い多分散性（ＰＤＩ）（ＰＤＩ＝Ｍｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量））を有するポリスチレンスタンダードも、検量線を構築するための参照標準として分析した。
実施例１　ＰｈａＣを発現するＥ．ｃｏｌｉにおけるＰ（３ＨＢ）の製造
　２０ｇ/Ｌのグルコース存在下で、４つのＰｈａＣ及びプレジオモナス・シゲロイデス由来のＰｈａＣの変異体（Ｎ１７５Ｇ）の合計５つのＰｈａＣを用いて、Ｐ（３ＨＢ）を合成した。結果を表２に示す。表２には、アエロモナス・キャビエ由来のＰｈａＣ及びその二重変異体（ＮＳＤＧ）を用いた結果を併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記表から、約３８ｗｔ％～約６４ｗｔ％の範囲のＰ（３ＨＢ）が蓄積されたことが示された。特に、プレジオモナス・シゲロイデス由来のＰｈａＣのＮ１７５Ｇ変異体は、最も高いＰ（３ＨＢ）蓄積量を示した。このことは、全てのＰｈａＣがＰ（３ＨＢ）製造のための生体触媒として大きな可能性を有することを示唆する。
　また、分子量は、様々な商業的使用のための材料の適合性を決定する際の重要な因子であり、重量平均分子量（Ｍｗ）は数平均分子量（Ｍｎ）よりも材料特性により密接に関連している。上記５つのＰｈａＣを用いて得られたＰ（３ＨＢ）はいずれも、アエロモナス・キャビエ由来のＰｈａＣ又はそのＮＳＤＧ変異体と比べて高分子量を有することが明らかとなった。
　上記５つのＰｈａＣの中で、特にプレジオモナス・シゲロイデス由来のＰｈａＣ及びそのＮ１７５Ｇ変異体は、３×１０６超の高いＭｗかつ１．５未満の比較的低いＰＤＩを有することが判明した。
実施例２　ＰｈａＣを発現するＥ．ｃｏｌｉにおける３ＨＢと第２モノマーとのコポリマーの製造
　前駆物質であるヘキサン酸、４-メチル吉草酸、チグリン酸、又は３-ヒドロキシピバリン酸を更に添加する以外は、実施例１と同様にして３ＨＢと第２モノマーとのコポリマーを合成した。前駆物質は、実質的な細胞成長が達成された４時間後に培養培地に断続的に添加した（０．２ｇ／Ｌ×３回）。また、グルコースも断続的に添加した（２．５ｇ／Ｌ×３回）。結果を表３～６に示す。これらの表には、アエロモナス・キャビエ由来のＰｈａＣ及びそのＮＳＤＧ変異体を用いた結果を併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例３　ＰｈａＣを発現するＥ．ｃｏｌｉにおける３ＨＢと第２モノマーとのコポリマーの製造
　第２モノマーの前駆物質である３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸は以下のようにして合成した。
　メチル－（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシイソブタン酸及びメチル－（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシイソブタン酸（３ｇ）を１５ｍＬのメタノールに溶解させ、氷上で２ｍｏｌ当量の水酸化ナトリウムを添加して攪拌した。次いで、白色粉末の３－ヒドロキシイソブタン酸ナトリウム塩が析出するまで、４０℃の水浴中で攪拌した。得られた白色粉末を室温で乾燥させ、３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を得た。得られた粉末を超純水に溶解させ、１Ｍ　ＨＣｌでｐＨを７．０～７．４に調製した。得られた溶液を０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターでろ過し、培養液に添加するモノマー前駆物質を調製した。
　前駆物質として３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を用いる以外は、実施例２と同様にして、共重合ＰＨＡを合成した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表３～７は、シュワネラ・ピリナ由来のＰｈａＣを除く全てのＰｈａＣが、全ての第２モノマーを共重合することができたことを示している。
　特に、α炭素メチル化単位を含有するＰＨＡは、潜在的に魅力的なバイオベース材料であるため、ほとんど全てのＰｈａＣが３Ｈ２ＭＢ、３ＨＰｉ、又は３Ｈ２ＭＰを組み込む能力を有することは非常に興味深い。また、プレジオモナス・シゲロイデス由来のＰｈａＣ及びそのＮ１７５Ｇ変異体は、高いＰＨＡ含量及び広い基質特異性の点で、総合的にアエロモナス・キャビエ由来のＰｈａＣより優れている。
実施例４　ＰｈａＣを発現する組換え水素酸化細菌におけるＰＨＡの製造
　宿主としてＥ．ｃｏｌｉ　ＬＳＢＪの代わりに組換え水素酸化細菌（ラルストニア・ユートロファＰＨＢ－４／ｐＢＢＲＥＥ”＿ＰＡｃＰｓｈ）を、グルコースの代わりにフルクトースを用いる以外は実施例２と同様にして、ＰＨＡを合成した。
　ラルストニア・ユートロファＰＨＢ－４／ｐＢＢＲＥＥ”＿ＰＡｃＰｓｈは以下のようにして作製した。
　ｐＢＢＲＥＥ”ＰＡｃＮＳＤＧベクター（７．５ｋｂ）（Watanabe Y, Ichinomiya Y, Shimada D, Saika A, Abe H, Taguchi S, Tsuge T, J. Biosci. Bioeng., 2012, 113:286-292, DOI: 10.1016/j.jbiosc.2011.10.015）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、化学合成したｐｈａＣＰｓ遺伝子をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩサイトに挿入した。これにより、ＰＨＡ重合用プラスミドであるｐＢＢＲＥＥ”＿ＰＡｃｐｈａＣＰｓを得た。得られたプラスミドでラルストニア・ユートロファＰＨＢ－４（ＰＨＢ重合能を欠損した変異株）に形質転換し、ラルストニア・ユートロファＰＨＢ－４／ｐＢＢＲＥＥ”＿ＰＡｃｐｈａＣＰｓを構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８より、大腸菌以外の異なる宿主でもプレジオモナス・シゲロイデス由来のＰｈａＣは、アエロモナス・キャビエＮＳＤＧ変異体由来のＰｈａＣを用いた場合と同等又はそれ以上の第２モノマー分率を有する、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＢ）又はＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ４ＭＶ）を合成できることが判明した。
　上記Ｒｕｎ　１～４で合成したＰＨＡの分子量を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９は、プレジオモナス・シゲロイデス由来のＰｈａＣを用いることにより、２２×１０５～５８×１０５の超高分子量を有するＰＨＡを製造できることを示している。
実施例６　ＰｈａＣを発現する組換え水素酸化細菌におけるＰＨＡの製造
　（１）ラルストニア・ユートロファＨ１６ΔｐｈａＣ１：：ｐｈａＣＰｓの作製
　（ａ）プラスミドｐｋ１８－ｐｈａＣＰｓの構築
　ラルストニア・ユートロファＨ１６ΔｐｈａＣ１株（ＰＨＡ重合能欠損株）に配列番号３で表されるｐｈａＣＰｓ遺伝子を挿入するために、プラスミドｐｋ１８－ｐｈａＣＰｓを構築した。
　化学合成したｐｈａＣＰｓ遺伝子をテンプレートとして、プライマー５及びプライマー６を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐｈａＣＰｓ遺伝子断片（１．９ｋｂ）を増幅した。次いで、ラルストニア・ユートロファＨ１６のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマー７～１０を用いて、ゲノム上のｐｈａＣ１遺伝子の上流及び下流０．８～１ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
　次に、取得したＤＮＡ断片をテンプレートとしてオーバーラップＰＣＲを行った。これにより、ラルストニア・ユートロファＨ１６のｐｈａＣ１遺伝子の上流及び下流遺伝子とｐｈａＣＰｓ遺伝子とを繋げた断片（３．７ｋｂ）（配列番号１６）を取得した。得られたＤＮＡ断片をｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（DOI: 10.1016/0378-1119(94)90324-7）のＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩサイトに挿入し、プラスミドｐｋ１８－ｐｈａＣＰｓを構築した。
　フォワードプライマー ５：5’-AGAGACAATCAAATCATGGCAAGTGCGAATCAGTT-3’（配列番号１０）
　リバースプライマー ６：5’-GCACTCATGCAAGCGTCATGCCGCGTTTTCCTCGG-3’（配列番号１１）
　フォワードプライマー ７：5’-aaaGAATTCCGGGCAAGTACCTTGCCGACAT-3’（配列番号１２）
　リバースプライマー ８：5’-CACTTGCCATGATTTGATTGTCTCTCTGCCGTCAC-3’（配列番号１３）
　フォワードプライマー ９：5’-CGCGGCATGACGCTTGCATGAGTGCCGGCGTGCGT-3’（配列番号１４）
　リバースプライマー １０：5’-aaaGCATGCACTCGGCGCGCGACAGGGCGCGCTTG-3’（配列番号１５）
　オーバーラップＰＣＲで取得した３．７ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号１６）
aaagaattcCGGGCAAGTACCTTGCCGACATCTATGCGCTGGCGCGCACGCGCCTGGCGCGCGCCGGCTGTACCGAGGTCTACGGCGGCGACGCCTGCACCGTGGCCGACGCCGGTCGCTTCTACTCCTATCGGCGCGATGGCGTGACCGGCCGCATGGCCAGCCTGGTCTGGCTGGCGGACTGAGCCCGCCGCTGCCTCACTCGTCCTTGCCCCTGGCCGCCTGCGCGCGCTCGGCTTCAGCCTTGCGTCGGCGGCGGCCGGGCGTGCCCATGATGTAGAGCACCAGCGCCACCGGCGCCATGCCATACATCAGGAAGGTGGCAACGCCTGCCACCACGTTGTGCTCGGTGATCGCCATCATCAGCGCCACGTAGAGCCAGCCAATGGCCACGATGTACATCAAAAATTCATCCTTCTCGCCTATGCTCTGGGGCCTCGGCAGATGCGAGCGCTGCATACCGTCCGGTAGGTCGGGAAGCGTGCAGTGCCGAGGCGGATTCCCGCATTGACAGCGCGTGCGTTGCAAGGCAACAATGGACTCAAATGTCTCGGAATCGCTGACGATTCCCAGGTTTCTCCGGCAAGCATAGCGCATGGCGTCTCCATGCGAGAATGTCGCGCTTGCCGGATAAAAGGGGAGCCGCTATCGGAATGGACGCAAGCCACGGCCGCAGCAGGTGCGGTCGAGGGCTTCCAGCCAGTTCCAGGGCAGATGTGCCGGCAGACCCTCCCGCTTTGGGGGAGGCGCAAGCCGGGTCCATTCGGATAGCATCTCCCCATGCAAAGTGCCGGCCAGGGCAATGCCCGGAGCCGGTTCGAATAGTGACGGCAGAGAGACAATCAAATCATGGCAAGTGCGAATCAGTTTAACGGCGCGCTGGACGCTCTGGCCGATCTCAATCGGAAACTGGTCGAACTGTACCTCTCCCGCTCAACGGCCCAAGGCCCGCTGAATCAGGTTCTCATGCAGGCCAATATGAACGATGCAAATCGCTTCTTCGAACATGCGTTCGGTCAACCAAATGCCTTAGTTGAACAGCAGCTGAAATGGTGGCAGCAACAGCTGGAACTGTCCCAGCACGCAGTGCTGCGCCTGTTTGGCCAGCCTAGTGAGCCGGTGATCCAGCCCGATCGTTCTGATCGTCGCTTTACTTCTGACAAGTGGCAGCAGAATATCCTGTTCGATTACCTGAAGCAGTCCTATCTTCTGACGACACAAAATGTCTTAGGTTCCATTAACCAGCTGGAAACGCTGGACGAGGAAACCCGTAAGCGCCTGGAGTTCTTCACGCGTCAGTATCTGAGCGCGTTATCGCCGTCGAACTATCTGCTGTCAAACCCGGAATTGCTGAAAGTGACCTTGGAGAACAATGGTCAAAACTTAGTGAAAGGCATGGAACTGCTTGTCGAAGATATGGAGAAGTCAGCGGACACCCTGAATATTCGCATGACAGATCAGTCGAGCTTTCGTCCTGGTGACAACCTGGCGACCACACCCGGTAAAGTAATCTTTCGCAATCATCTGTTCGAGTTAATTCAGTACGTCCCGACTACCGAAGAAGTCTTACAACGCCCTCTGTTGATTGTGCCACCGTTCATCAACAAATTTTACATCCTTGATTTACAAGCGCAAAATAGCTTTGTTCGGTGGGCCGTAAGCCAGGGTCATACGGTCTTTATGATGAGCTGGGTGAACGCCACCCCGGAACACAAAGACATCACCTTCGAAGATTACGTGATTGACGGTGTATTAGCTGCACTTGATGCCATCGAAACGGCGACCGGGGAGAAAGAGGTGAATGGCATCGGCTATTGCATTGGAGGCACCCTTCTTTCGGTCACCATGGCGTATCTGGCGGCACGTCGCATGAAACAACGTATTCGTACTGGCACTCTGTTCACGACCTTACTCGATTTTGCCAAACCGGGTGACATTGGCGTGTTTATCAACGAAGAAACCGTGTCAGCTGTTGAGACTCAGAATCAAATCAAAGGGTATATGGACGGTCGCCAAATTGCGGTGAGCTTCAGCCTTCTCCGCGAAAACTCGCTGTACTGGAATTATTTTGTGGATAACTATCTGAAGGGCAAATCTCCAATGGCGTTTGACATTCTGTATTGGAACTGTGATTCCACCAACGTTCCCGCAGCCTGCCATAACTTTCTCTTGCGTCAGTGCTATTTGGAAAACCAGCTGATTATGCCGGGCGGCATTTCAATCCGCGGAACCGCGATCGATTTGAACAAAATCAAACTGCCGTTGTATTTCCTGAGTGCCGCCGAAGATCACATTGCTTTGTGGGATGCAACGTACGATGGCGCGAAAGTCATTGGAAAAGACAATTCCCATGTTACATTTGTTCTCGGTGAAAGCGGCCATATTGCGGGTGTTGTAAATCCACCGGAGAAAGGGAAATACGGCTATTGGTGTAATCCCGATAACAGCTTTCTGCCGGATGATTCTCAAGCTTGGCTGAACGCCGCTGAACACCACAAAGGAAGCTGGTGGCCTCATTGGCAGCAATGGCTGGTGAGTCATCTGCCGGAAGGTTCTAAACCGGTACCAGCTCGTCAGCCGGTTGCACGCGAAAACCAACCGTTGCTCGGGGACGCGCCTGGGGAATACGTGAAAGTACGCATTTCGGATATTGACCAGCAGATTAAGGCAAGCCTGCTGCACCCAAGTTCTGAAAAGAGTGCCGAGGAAAACGCGGCATGACGCTTGCATGAGTGCCGGCGTGCGTCATGCACGGCGCCGGCAGGCCTGCAGGTTCCCTCCCGTTTCCATTGAAAGGACTACACAATGACTGACGTTGTCATCGTATCCGCCGCCCGCACCGCGGTCGGCAAGTTTGGCGGCTCGCTGGCCAAGATCCCGGCACCGGAACTGGGTGCCGTGGTCATCAAGGCCGCGCTGGAGCGCGCCGGCGTCAAGCCGGAGCAGGTGAGCGAAGTCATCATGGGCCAGGTGCTGACCGCCGGTTCGGGCCAGAACCCCGCACGCCAGGCCGCGATCAAGGCCGGCCTGCCGGCGATGGTGCCGGCCATGACCATCAACAAGGTGTGCGGCTCGGGCCTGAAGGCCGTGATGCTGGCCGCCAACGCGATCATGGCGGGCGACGCCGAGATCGTGGTGGCCGGCGGCCAGGAAAACATGAGCGCCGCCCCGCACGTGCTGCCGGGCTCGCGCGATGGTTTCCGCATGGGCGATGCCAAGCTGGTCGACACCATGATCGTCGACGGCCTGTGGGACGTGTACAACCAGTACCACATGGGCATCACCGCCGAGAACGTGGCCAAGGAATACGGCATCACACGCGAGGCGCAGGATGAGTTCGCCGTCGGCTCGCAGAACAAGGCCGAAGCCGCGCAGAAGGCCGGCAAGTTTGACGAAGAGATCGTCCCGGTGCTGATCCCGCAGCGCAAGGGCGACCCGGTGGCCTTCAAGACCGACGAGTTCGTGCGCCAGGGCGCCACGCTGGACAGCATGTCCGGCCTCAAGCCCGCCTTCGACAAGGCCGGCACGGTGACCGCGGCCAACGCCTCGGGCCTGAACGACGGCGCCGCCGCGGTGGTGGTGATGTCGGCGGCCAAGGCCAAGGAACTGGGCCTGACCCCGCTGGCCACGATCAAGAGCTATGCCAACGCCGGTGTCGATCCCAAGGTGATGGGCATGGGCCCGGTGCCGGCCTCCAAGCGCGCCCTGTCGCGCGCCGAGTgcatgcttt
　（ｂ）ラルストニア・ユートロファＨ１６ΔｐｈａＣ１：：ｐｈａＣＰｓ株の構築
　ラルストニア・ユートロファＨ１６株のｐｈａＣ１遺伝子を、配列番号３で表されるｐｈａＣＰｓ遺伝子に置換するために、プラスミドｐｋ１８－ｐｈａＣＰｓを用いて相同組換えを行った。
　まず、大腸菌Ｓ１７－１株に、ヒートショック法にて、プラスミドｐｋ１８－ｐｈａＣＰｓを導入し、大腸菌Ｓ１７－１株を形質転換した。この形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地（５．０ｇ／Ｌ　酵母エキス、１０ｇ／Ｌ　バクト・トリプトン（ｂａｃｔｏ－ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、１０ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振とう培養を行った。
　一方、ラルストニア・ユートロファＨ１６株を、ＮＲ培地（２．０ｇ／Ｌ　酵母エキス、１０ｇ／Ｌ　バクト・トリプトン、１０ｇ／Ｌ　カツオエキス）に接種して、３０℃で一晩振とう培養を行った。
　次いで、大腸菌Ｓ１７－１株の形質転換体の培養液及びラルストニア・ユートロファＨ１６株の培養液をそれぞれ２ｍＬ回収し、１００００×ｇで２分間遠心分離を行い、菌体ペレットを調製した。１ｍＬのＮＲ培地で３回洗浄を行い、培地に含まれる抗生物質を取り除いた。洗浄後の菌体ペレットを５０μＬのＮＲ培地に懸濁し、２種類の菌体を混合した菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液１００μＬをＮＲ寒天培地に滴下して、３０℃で２４時間インキュベートして、接合伝達を行った。
　続いて、培養後の菌体を生理食塩水に懸濁し、２００μｇ／ｍＬのカナマイシン及び１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むシモンズクエン酸寒天培地（２ｇ／Ｌ　クエン酸三ナトリウム二水和物、５．０ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、０．２ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）に接種し、３０℃で２日間培養を行った。形成されたコロニーを２００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＮＲ培地（２ｍＬ）に接種し、３０℃で一晩培養を行った。培養液を生理食塩水に懸濁して、希釈溶液を調製し、１５０ｇ／Ｌのスクロースを含むＭＳＹ培地（ＭＳ培地（Miyahara Y, Wang Chih-Ting, Ishii-Hyakutake M, Tsuge T, Bioengineering 2022, 9(10), 586. DOI: https://doi.org/10.3390/bioengineering9100586参照）に１．０ｇ／Ｌの酵母エキスを添加した培地）に接種し、３０℃で２日間培養を行った。形成されたコロニーを回収し、プライマー７及びプライマー１０を用いてコロニーＰＣＲを行い、ラルストニア・ユートロファＨ１６ΔｐｈａＣ１：：ｐｈａＣＰｓ株の構築を確認した。
　（２）ラルストニア・ユートロファＨ１６ΔｐｈａＣ１：：ｐｈａＣＰｓを用いるＰＨＡの製造
　（１）で作製したラルストニア・ユートロファＨ１６ΔｐｈａＣ１：：ｐｈａＣＰｓ株をＮＲ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養し、前培養液を調製した。窒素源として塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムを含有する５ＬのＭＳ培地を含む防爆型１０Ｌのジャーファーメンターに５％の前培養液を接種し、二酸化炭素、酸素及び水素を含む混合ガスを所定の流量で当該ジャーファーメンターに供給し、３０℃で１２０時間、独立栄養培養を行った。結果を表１０に示す。比較のために、「Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ　Ｈ１６」及び「ＰＨＢ－４／ｐＢＢＲ１ｐｈａＣＲｅ」を用いたＰＨＡの生合成の結果を併せて示す。「Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ　Ｈ１６」はラルストニア・ユートロファＨ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９）を、「ＰＨＢ－４／ｐＢＢＲ１ｐｈａＣＲｅ」は、プラスミドｐＢＢＲ１：：ｐｈａＣＡＢＲｅをラルストニア・ユートロファＰＨＢ－４株（ＰＨＢ重合能を欠損した変異株）に導入することによって得られた菌株をそれぞれ示す（Miyahara Y., et al., Bioengineering 2022, 9, 586. https://doi.org/10.3390/bioengineering9100586参照）。
　なお、所望のガス組成の混合ガスを供給するためにマスフローコントローラーを用いた。ガス組成比は、水素による爆発を避けるために、７５ｖｏｌ％以上の水素濃度、かつ７ｖｏｌ％以下の酸素濃度とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０は、プレジオモナス・シゲロイデス由来のＰｈａＣを用いることにより、単一炭素源としての二酸化炭素から５０×１０５の超高分子量を有するＰＨＡを製造できることを示している。
実施例７　ラルストニア・ユートロファＨ１６ΔｐｈａＣ１：：ｐｈａＣＰｓを用いるＰＨＡの製造
　実施例６の（１）で作製したラルストニア・ユートロファＨ１６ΔｐｈａＣ１：：ｐｈａＣＰｓ株をＮＲ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養し、前培養液を調製した。窒素源として０．５ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、１０ｇ／Ｌのフルクトース及び１．０ｇ／Ｌの３－ヒドロキシピバル酸を含む１００ｍＬのＭＳ培地に１％の前培養液を接種し、３０℃で７２時間インキュベートした。最後に、遠心分離によって細胞を回収し、更なる分析のために凍結乾燥した。結果を表１１に示す。比較のために、「Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ　Ｈ１６」はラルストニア・ユートロファＨ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９）を用いたＰＨＡの生合成の結果を併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１１は、プレジオモナス・シゲロイデス由来のＰｈａＣ遺伝子をラルストニア・ユートロファＨ１６株のゲノムに挿入することにより、ラルストニア・ユートロファＨ１６株が３－ヒドロキシピバル酸を共重合可能であると共に、高いＰＨＡ生産性を有していることを示している。
　本発明のＰＨＡ重合酵素は、比較的高分子量の種々のＰＨＡの工業的製造に適用可能であり、製造された比較的高分子量のＰＨＡはフィルムなどのプラスチック材料として有効に利用できる。

Claims (18)

  1. 　クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素（但し、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素を除く）遺伝子を微生物に導入し、前記遺伝子が導入された微生物を炭素源存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  2. 　前記クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素が、フェリモナス（Ferrimonas）属、シュワネラ（Shewanella）属、プレジオモナス（Plesiomonas）属、及びビブリオ（Vibrio）属からなる群より選択される、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素が、フェリモナス・マリナ（Ferrimonas marina）、シュワネラ・ピリナ（Shewanella pealeana）、プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、及びビブリオ・メチニコフィイ（Vibrio metschnikovii）からなる群より選択される、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　前記クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子に対して６０％未満の配列同一性を有する、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　前記クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素が、プレジオモナス・シゲロイデス由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素である、請求項１に記載の製造方法。
  6. 　前記クラスＩポリヒドロキシアルカン酸重合酵素が、プレジオモナス・シゲロイデス由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素であって、Ｎ１７５Ｇの変異を有する、請求項１に記載の製造方法。
  7. 　前記微生物が、エシェリキア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アエロモナス（Aeromonas）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、セラチア（Serratia)属、及びビブリオ（Vibrio）属からなる群より選ばれる微生物、又は水素酸化細菌である、請求項１に記載の製造方法。
  8. 　前記微生物がエシェリキア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１に記載の製造方法。
  9. 　前記微生物が水素酸化細菌である、請求項１に記載の製造方法。
  10. 　前記水素酸化細菌が、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）である、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　前記炭素源が、糖、及び／又は二酸化炭素である、請求項１に記載の製造方法。
  12. 　前記糖がグルコース又はフルクトースである、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　第２モノマーの前駆物質の存在下で培養する工程を更に含む、請求項１に記載の製造方法。
  14. 　前記二酸化炭素が、二酸化炭素を１～２０％（ｖ／ｖ）の範囲で含む混合ガスである、請求項１１に記載の製造方法。
  15. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシブタン酸のホモポリマー、又は、３－ヒドロキシブタン酸と炭素原子数３～６の３－ヒドロキシアルカン酸とのコポリマーである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
  16. 　前記コポリマーが、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシヘキサン酸とのコポリマー、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシ－４－メチル吉草酸とのコポリマー、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシ－２－メチルブタン酸とのコポリマー、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシピバル酸とのコポリマー、及び３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸とのコポリマーから成る群より選択される、請求項１５に記載の製造方法。
  17. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が２０×１０５～６０×１０５の範囲である、請求項１に記載の製造方法。
  18. 　配列番号４の塩基配列によってコードされる、プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）由来の変異型ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素。
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