CN104250628A - 新的环境分离株假单胞菌属物种IPB-B26 和N-128用于高效高产率产生mcl/lcl-PHA 的用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及新的环境分离株假单胞菌属物种IPB-B26和N-128用于高效高产率产生mcl/lcl-PHA的用途。具体而言，本申请涉及以DSM26199(假单胞菌属物种IPB-B26(Pseudomonas sp.IPB-B26))和DSM26200(假单胞菌属物种N-128)保藏于莱布尼茨研究所DSMZ的假单胞菌属(Pseudomonas)微生物。本申请进一步涉及用于产生中等链长和长链长PHA的方法，所述方法包括在包含碳源的培养基中培育所述微生物并且从微生物分离PHA。已经观察到这些微生物允许以高产率高效产生PHA。此外，本发明的微生物拥有将不饱和脂肪酸掺入所产生的PHA的有价值能力。本发明的微生物因此使得以后修饰PHA以及交联成为可能，因此为这些物质开辟新的应用领域。

Description

新的环境分离株假单胞菌属物种IPB-B26 和N-128用于高效高产率产生mcl/lcl-PHA 的用途

描述

本发明属于生物合成聚羟基链烷酸酯(PHA)领域。本发明涉及以DSM26199(假单胞菌属物种IPB-B26(Pseudomonas sp.IPB-B26))和DSM26200(假单胞菌属物种N-128)保藏于莱布尼茨研究所DSMZ德国微生物保藏中心的假单胞菌属(Pseudomonas)野生型微生物。已经证明这些微生物在产生PHA的方法中具有巨大用途。这些微生物是非基因修饰的并且已经观察到能够非常高效地从多样、相当价廉和可持续的原料如饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸以及甘油产生中等链长(mcl)/长链长(lcl)PHA。在生物反应器中，这些微生物实现高生物质和PHA产生，甚至在中等搅拌条件下和在无额外氧供应的情况下也是如此。取决于使用的实际底物，所产生的PHA可以包含不饱和部分(直至17％和更多)，允许大得多的一系列PHA特性和/或PHA合成后官能化。本发明是还涉及这些微生物在用于产生mcl-PHA和/或lcl-PHA的方法中的用途以及涉及通过这种方法可获得的PHA。

背景技术

PHA是聚合物，它们是从可再生资源产生的生物可降解和生物相容性热塑性材料(3-羟基脂肪酸的聚酯)，具有广泛的工业和生物医学应用(Williams和Peoples,1996,Chemtech26:38-44)。PHA由广泛类型的细菌合成并且已经因它们替代基于石油化学的常规塑料以保护环境免于塑料废弃物有害影响的潜在应用而广泛地受到研究。

PHA可以根据其侧链长度和它们的生物合成途径分成两类。具有短侧链的那些，如PHB，(R)-3-羟基丁酸单元的均聚物，是晶态热塑塑料，而具有长侧链的PHA具有更多弹性。已知晓前者约90年(Lemoigne和Roukhelman,1925,Ann.Des Fermentation,527-536)，而相对新近地发现后一类材料(deSmet等人,1983,J.Bacteriol.154:870-878)。然而，在这个名称之前，已经鉴定到含有(R)-3-羟基丁酸单元和5至16个碳原子的较长侧链(R)-3-羟酸单元的微生物源PHA(Wallen和Rohweder,1974,Environ.Sci.Technol.8:576-579)。已经鉴定到产生(R)-3-羟基丁酸和一种或多种含有5至16个碳原子的长侧链羟基酸单元的共聚物的许多细菌(Steinbuchel和Wiese,1992,Appl.Microbiol.Biotechnol.37:691-697；Valentin等人,1992,Appl.Microbiol.Biotechnol.36:507-514；Valentin等人,1994,Appl.Microbiol.Biotechnol.40:710-716；Abe等人,1994,Int.J.Biol.Macromol.16:115-119；Lee等人,1995,Appl.Microbiol.Biotechnol.42:901-909；Kato等人,1996,Appl.Microbiol.Biotechnol.45:363-370；Valentin等人,1996,Appl.Microbiol.Biotechnol.46:261-267；美国专利号4,876,331)。这些共聚物可以称作PHB-共聚-HX(其中X是6个或更多个碳的3-羟基链烷酸酯或链烷酸酯或链烯酸酯)。特定双组分共聚物的可用实例是PHB-共聚-3-羟己酸酯(PHB-共聚-3HH)(Brandl等人,1989,Int.J.Biol.Macromol.11:49-55；Amos和McInerey,1991,Arch.Microbiol.155:103-106；美国专利号5,292,860)。

虽然PHA已经因为它们作为可再生资源用于生物可降解热塑性塑料和生物聚合物的潜在应用(如上文所提到)而广泛地研究并且已经商业地开发并销售(Hrabak,1992,FEMS Microbiol.Rev.103:251-256)，但是它们的生产成本比基于石油化学的常规塑料的生产成本高得多，这成为更广泛使用它们的主要障碍(Choi和Lee,1997,Bioprocess Eng.17:335-342)。如上文描述，许多细菌产生PHA，例如真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、协腹产碱杆菌(Alcaligeneslatus)、棕色固氮菌(Azotobacter vinlandii)、嗜酸假单胞菌(Pseudomonas acitophila)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleovarans)、大肠杆菌(Eschericha coli)、Rhodococcus eutropha、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)、酒色着色菌(Chromatium vinosum)、泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)等。本领域已知的产生PHA的全部细菌均产生胞内PHA并且在PHA颗粒中积累它(Steinbüchel,1991,Biomaterials,第123-213页)。造成PHA生产昂贵并且因此与基于石油化学的塑料相比而不利的主要方面在于难以以高产率产生该材料并且从积累它的细菌细胞内部回收产生的PHA。为了降低PHA的总生产成本，认为开发高效回收工艺是必需的，通常着眼于通过i)适宜溶剂、ii)次氯酸盐提取PHA和/或iii)消化非PHA细胞物质来破碎细胞(Lee,1996,Biotech.Bioeng.49:1-14)。

在工业规模，可用微生物仍提供相对少的PHA，这造成采用这些微生物产生PHA在经济上不可行。本领域已知的全部方法在生产期间均需要大量水和额外地需要化学试剂和/或酶用于它们的回收，这是降低生产成本的障碍。因此，迫切需要PHA生产的替代性策略。

最近，已经开发了用于基因修饰产生PHA的微生物的策略，例以使得该微生物产生更高量的PHA成为可能。EP1913135A1描述了已经通过敲除基因进行基因修饰的微生物，所述基因以与PHA合酶竞争的方式作用于产生PHA的中间体。通过耗尽微生物的酶，所述酶干扰PHA合酶作用于中间体，可以使中间体转向至PHA。

另一个方案将PHA合酶引入以其野生型形式不能够产生PHA的微生物例如大肠杆菌中(参见Qi等人,2007,FEMS Microbiol.Lett.157:155-162)。在这种情况下，当使用癸酸酯作为碳源时，在大肠杆菌LS1298菌株中观察到约15％CDW(细胞干重)的最大PHA积累。

在又一个替代性方案中，通过敲除PHA解聚酶基因增加PHA产生，所述基因敲除在微生物恶臭假单胞菌(P.putida)KT2440中导致产生约4g/l CDW，其中PHA占至多80％的CDW(Cai等人,2009,BioresourceTechn.100:2265-2270)。

尽管取得这些进展，但是由这些微生物产生的PHA的量与产生它们所需的资源相比仍是相对低的。此外，在一些国家，公众对基因修饰微生物存在保留意见，这导致接受这些材料方面的问题。具体对于这些国家而言，拥有以高产率产生PHA的野生型，即非基因修饰微生物将是有利的。

直至现在已经被描述用于PHA产生的大部分微生物仅接受饱和脂肪酸作为碳源用于产生PHA。从常规底物如具有6个至约20个碳原子的链长度的直链饱和脂肪酸产生的PHA通常显示-30℃至-50℃范围内的聚合物玻璃转化温度。这限制它们用于与这类玻璃转化温度相容的应用。如果可以扩展由相应微生物接受用于掺入PHA中的底物的范围，这将对从这类微生物可获得的PHA的特性的多样性具有巨大影响。此外，如果可以将官能团插入PHA中，这允许产生后修饰，则这将对从这类微生物可获得的PHA产物的多样性具有巨大影响。例如，PHA中存在的不饱和碳-碳双键在获得的材料中提供反应中心，所述反应中心可以用于后续修饰和官能化如接合常规不饱和单体(包括丙烯酸酯和其他乙烯基单体)或交联。PHA因此将允许制造例如弹性体材料或抗冲击改性剂，其中基于石油化学的塑料可能至少部分地由在生物学过程中产生的PHA替换。

本申请满足这些需求。

发明概述

本申请的一个目的是提供以DSM26199(假单胞菌属物种IPB-B26)和DSM26200(假单胞菌属物种N-128)保藏于莱布尼茨研究所DSMZ，Inhoffenstr.7B,38124，Braunschweig，德国的非基因修饰(即野生型)假单胞菌属微生物。使用原油(1％)和橄榄油(1％)作为底物，本发明的微生物假单胞菌属物种IPB-B26和假单胞菌属物种N-128从不同污染(被烃、柴油和石油污染)土壤的富集培养物中分离。以油酸作为底物培育时，在500ml摇瓶中，所述菌株已经显示良好生物质产率和PHA产率，分别是至多6g/l和2.4g/l(约40wt.-％PHA积累)

本申请进一步涉及一种用于产生中等链长和/或长链长PHA的方法，所述方法包括：

-在合适的培养基中和在碳源存在的情况下培育以DSM26199(假单胞菌物种IPB-B26)或DSM26200(假单胞菌物种N-128)保藏于DSMZ的假单胞菌属微生物，并且

-从相应的微生物分离PHA。

本申请的其他方面涉及从该方法可获得的PHA，其中PHA优选地包含不饱和部分，和上述微生物在用于产生mcl-PHA和/或lcl-PHA的方法中的用途。

附图简述

图1使用油酸作为底物，随假单胞菌属物种IPB-B26分批发酵的生物质和PHA产生及铵消耗的动力学曲线。值是两次重复的平均值。在t＝100分钟，上部曲线：CDW(以g/l为单位)；中部曲线：PHA(以g/l为单位)；和下部曲线：铵浓度(以mg/l为单位)。

图2补料分批发酵期间油酸和MgSO₄的进料速率。

图3补料分批发酵期间的油酸及铵消耗。通过HPLC分析确定培养物中存在的油酸浓度。

图4使用假单胞菌属物种IPB-B26并使用油酸作为碳源时补料分批发酵中的生长、生物质和PHA产生。结果是两次重复的平均值。

发明概述

中等链，在本发明的上下文中使用这个术语时，意指具有5至13个碳原子的羟基酸单元((R)-3-羟基酸单元)。术语“长链长PHA”意在涵盖含有至少14个碳原子/单体的PHA。

在发明人的研究过程中，已经发现用于发酵本发明微生物的培养基对微生物的PHA生产率具有显著影响。从测试的几种生产培养基中，当使用油酸(1％)作为碳源时并且当使用假单胞菌属物种IPB-B26作为微生物时，用0.1％酵母提取物改良的MM培养基(如Martinez-Blanko等人,1990,J.Biol.Chem.265:7084-7090中所述)提供最低的PHA生产率。在相同条件下，假单胞菌属物种N-128提供合理的PHA产率。对于菌株假单胞菌属物种IPB-B26，如Choi等人中所述的培养基C-Y(1994,Appl.Environ.Microbiol.60:1245-1254)提供显著更好的产率，当这种培养基中氮的量加倍时，所述产率可以甚至进一步增加。在本申请的实施中，在C-Y培养基中培育假单胞菌属物种IPB-B26因此优选胜过使用MM培养基+0.1％酵母提取物。对于假单胞菌属物种N-128，与MM培养基+0.1％酵母提取物相比，采用C-Y-培养基的产率较低的，但是当C-Y-培养基中的氮浓度加倍以提供可比较量的PHA时，PHA产率恢复。对这个菌株而言，因此优选如果发酵中使用C-Y-培养基，则该培养基应当包含量为Choi等人中所述约2倍的氮含量。对于假单胞菌属菌株N-128和IPB-B26，观察到如Vogel和Borner所述的E2培养基(1956,J.Biol.Chem.218:97-106)提供最好结果。采用这种培养基，使用含有100ml培养物的500ml烧瓶在30℃和200转/分钟，对于两种菌株均获得约2g/l的PHA产率和超过5.1g/l的细胞干重(CDW)。在本申请的实施中，因此优选用于发酵的培养基是如上文所述的E2培养基。

本发明的方法不受任何相关限制(如为产生PHA待使用的碳源的担忧)影响。常规用于产生PHA的碳源可以与本申请的微生物在本发明的方法中一起使用，如甘油、糖、丙酮酸和常规脂肪酸，尤其如包含4至20个碳原子和优选地8至18个脂肪碳原子的脂肪酸。然而，已经发现如果使用脂肪酸作为碳源，则获得就g/l而言的最佳PHA产率。因此，本申请的优选方法涉及包含至少一种C4至C20脂肪酸、优选地C8至C18脂肪酸的碳源。在本申请中待用的优选饱和脂肪酸是丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸和花生酸。

已经进一步发现本发明的微生物还接受不饱和脂肪酸如油酸和10-十一烯酸作为底物。本发明方法的优选实施方案因此涉及包含一个或多个不饱和部分、优选地单不饱和部分的脂肪酸作为碳源。代表性不饱和脂肪酸包含肉豆蔻油酸、棕榈油酸、十六碳烯酸(sapienic acid)、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反式亚油酸、α-亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和十一烯酸。用于本发明方法中的最优选的不饱和脂肪酸是油酸。

如果本申请的方法是摇瓶法或分批法，则进一步优选培养基中碳氮(C/N)比处于约9:1至70:1的范围、优选地处于约15:1至50:1的范围。如果(C/N)比小于9:1或超过70:1，则所得产物的PHA产率通常低于优选的范围。

在本申请的一个实施方案中，将碳源在培育开始时作为单个团块添加至培养混合物。在这个方面观察到，如果碳源例以两个部分添加，其中之一在培养开始时添加，而第二个部分在稍后阶段添加，则与其中碳源已经作为单个团块添加的方法相比，以g/L和wt.-％计的PHA产率较低。

在摇瓶或分批法的情况下，进一步优选向培养用混合物添加的碳源的量是这样的，从而获得培养用混合物中约1至60mM范围内、优选地约10至40mM范围内的碳源浓度。如果添加碳源以提供小于1mM的浓度，则PHA的产率低于其中碳源浓度处于所示范围内的发酵的PHA产率。如果碳源浓度超过60mM，则环境变得对细胞越发有毒，这不利地影响它们的生长。

本发明方法的另一个重要参数是培养基中的氮含量，因为氮是微生物的重要养分，并且PHA产生通常在特征为碳过量和例如氮某种程度缺乏的条件下有利。在本发明的优选方法中，使用铵盐作为氮源，例如硫酸铵或氢氧化铵。

培养基中的铵浓度进一步优选地处于约10至60mM的范围内，尤其处于约15至40mM的范围内。然而，最终是C/N比，而非氮源实际浓度对菌株的生长和PHA产生具有最大影响。

本申请的又一个重要方面是发酵中的氧浓度，因为微生物消耗氧以将羧酸转化成3-羟基羧酸。在本申请的实施中，优选在培养基中氧分压(pO₂)维持在约25％和45％之间，优选地在约30％，其中％是摩尔％并且基于溶解于培养基中的总气体计算。

在培育时间方面，本申请不受任何有关限制影响。然而，技术人员将认识到，在培育期间，在某个阶段产生的PHA的量将达到最大值，其后PHA含量下降或不再变化。技术人员将容易地能够确定其中微生物内PHA积累的量最高的时间。作为经验法则，补料分批法中的最大PHA积累通常在约40小时后和在约100小时之前达到。因此，培育优选地实施不少于40小时和不多于96小时、优选地不少于45小时至不多于60小时并且最优选地约48小时的时间。

对于本发明微生物，已经确定约30℃温度为PHA产生的最佳温度。因此，本申请的方法优选地在约15℃至45℃和优选地从约20℃至40℃的温度进行。

在不同于上述分批法的一个本申请实施方案中，以补料分批方式(即涉及在发酵初始化时间后补充指数渐增的碳投送量的方式)向培育用培养基供应碳源。基于以下等式从计算指数渐增的碳投送量计算参数：

$F\left(t\right)=\mathrm{\μ}\·\frac{\mathrm{Vo}\·\mathrm{Xo}}{\mathrm{So}\·\mathrm{Yx}/s}.e^{-\mathrm{\μset}\·t}$

其中F(t)是随着培养进行碳源的流速，V₀是培养物的体积，Y_x/s是生物质的产率，X₀是分批培养后的初始生物量，μ_set是所需的比生长速率，并且S₀是进料中的底物浓度。

μ_set在本发明的方法中优选地处于约0.05至0.15h^-1的范围内，更优选地约0.08至0.12h^-1的范围内。

上述补料分批法允许大大改善生物质产率和PHA产率，以及减少达到这些最大产率的发酵时间，其中发酵中的最佳PHA浓度可以增加10倍并且在约40至48小时后达到。这表示胜过常规分批法的显著优点(见上文)。

在前文提到的方法中，优选在添加指数渐增的碳源投量之前，发酵在分批阶段初始化，其中添加初始碳源团块至培育用培养基并且随后将培养物维持足以确保初始碳源完全耗尽的时间。在本发明的实施中，已经观察到将初始分批阶段适当地实施约8至24小时、优选地8至12小时的时间。

在补料分批法中，进一步优选初始碳源团块在培育用培养基中提供约2至30mM、优选地约5至15mM范围内的碳源浓度。已经确定这个范围在指数进料过程启动之前提供最佳的初始培养。

发酵混合物的搅拌速率在分批法或补料分批法中不受任何相关限制，例外在于它必需足以维持氧分压(pO₂)处于上文所示的范围内。合适的搅拌速率取决于发酵的要求，但是通常处于约200至1400转/分钟范围内。

已经出乎意料地发现本发明的微生物显示在发酵期间使PHA颗粒融合成单个颗粒，同时起初形成多个PHA颗粒。

就从微生物分离PHA而言，优选PHA用非氯化溶剂提取，优选地用具有3至8个碳原子的酮提取。与常规的氯化溶剂如氯仿和二氯甲烷相比，非氯化溶剂提供废物处置问题和成本显著较少的优点。用于实施本申请中所提到的酮是丙酮、2-甲乙酮、二乙酮、2-甲基丙基酮等。用于分离PHA的最优选酮是丙酮。

进一步优选在小于约60℃的温度、优选地在约20℃至40℃的温度提取PHA。已经出乎意料地发现，在这些温度提取本发明的微生物提供了与在更高温度的可比较提取基本上相同的产率。认为这是来自单个PHA颗粒形成和趋向发酵过程结束可观察到的微生物细胞壁破裂的直接结果。因而，在本发明的微生物中，PHA比常规发酵的微生物中的多个颗粒更容易为溶剂接近。已经进一步观察到可以在提取约0.5至5小时后，获得基本上相同产率的已提取PHA。因此优选将溶剂提取实施约1至3小时，优选地约1小时的时间。

本申请的又一个方面涉及通过如上文所述的方法可获得的PHA。优选地，该方法涉及掺入包含直至17摩尔％或更多不饱和部分的羧酸。

本申请的再一个方面是如上文所述的微生物在用于产生中等链长或长链长PHA的方法中的用途。该方法的优选实施方案与上文针对用于产生中等链长或长链长PHA的方法所描述的那些实施方案相同。

本申请的最后方面是如在Gene Bank(NCBI)中以登录号JN651420(phaC1)或JN216885(phaC2)保藏的PHA合酶或其类似物用于产生PHA的用途。PHA合酶或其类似物可以单独或以它们的混合物使用。如这个术语在实施本发明时使用，“类似物”意指这样的肽或蛋白质，其具有至少约80％序列同一性，优选地至少约90％序列同一性，更优选地至少约95％序列同一性，和最优选地至少约98％序列同一性，并且具有可比较特性，在于其能够在适宜条件下高效合成PHA。

在下文中，将以举例方式进一步描述本申请，然而，所述例子不意以任何方式限制本申请的范围。

实施例1

为了选择用于PHA产生的最佳培养基，将菌株假单胞菌属物种IPB-B26和假单胞菌属物种N-128分别地在30℃以200转/分钟搅拌，在含有100ml相应培养基的500ml烧瓶中培育，所述培养基含有油酸(1％)作为碳源。在培养72小时后收获细胞用于分析。测试以下培养基：

1.如Vogel和Borner,1956,J.Biol.Chem.218:97-106所述的E2培养基。

2.如Martinez-Blanko等人,1990,J.Biol.Chem.265:7084-7090所述的MM培养基+0.1％酵母提取物。

3.如Choi等人,1994,Appl.Environ.Microbiol.60:3245-3254所述的具有常规氮浓度和2倍氮浓度(0.66和1.32g/l(NH₄)₂SO₄)的C-Y培养基。

下表1中提出这些研究的结果。

表1不同培养基中菌株N-128和IPB-B26的生物质和PHA产生。

在30℃和200转/分钟温育72小时后获得结果。值是两次重复的平均值。

在不同培养基中培育两种菌株。如果使用MM+0.1％酵母提取物作为发酵培养基，IPB-B26的PHA产生较低。值得注意的是，在C-Y培养基中菌株IPB-B26提供54wt.-％的PHA积累。然而，对于两个菌株，这种培养基的生物质产量低于测试的其他两种培养基(E2和MM+0.1％酵母提取物)。在提高C-Y培养基中的铵浓度2倍后，可以分别增加假单胞菌属物种N-128和IPB-B26的生物质产量直至3.64g/l和5.03g/l，PHA积累为约48wt.-％和41wt.-％。

通常而言，培养基C-Y(2N)和E2显示PHA产生的最高产率。即使PHA产生是相似的，但是生物质产量在E2培养基中显著更高。因此，将E2视为优选的培养基。

实施例2

用如实施例1中所述的E2培养基重复假单胞菌属物种N-128和IPB-B26的培育，同时将碳源从油酸(1％)变成辛酸(20mM)、甘油(3％)或粗制甘油(3％)。下表2中提出这些研究的结果。

表2E2培养基中菌株N-128和IPB-B26的生物质和PHA产生。

值是三次重复的平均值。

即使甘油和粗制甘油是两个菌株的良好底物，但是采用油酸的PHA产率显著较高。

实施例3

纯化使用油酸和甘油作为底物所获得的PHA聚合物并用NMR和GCMS分析它们。下表3中提出这些研究的结果。

表3菌株IPB-B26和N-128产生的PHA-聚合物单体组成

在从油酸获得的两种PHA之间，由菌株假单胞菌属物种IPB-B26产生的那一种PHA就单体组成而言显示比采用假单胞菌属物种N-128所获得的那一种PHA(含有C4-C14(数字表示碳原子数目)的单体)更大的多样性。令人惊讶的是存在特征在于奇数个碳原子数目的3-羟基戊酸(3OHC5)。通常，源自油酸的两种PHA含有3OHC6(约5摩尔％)、3OHC8(27-32摩尔％)、3OHC10(27-32摩尔％)、3OHC12(9-12摩尔％)和3OHC14:1(10-14摩尔％)(其中14:1表示14个总碳原子和1个不饱和双键。

源自甘油的PHA显示差异(与从油酸获得的PHA相比)，尤其在不饱和单体3OHC12:1和3OHC14:1的含量方面。3OHC8(22.1摩尔％)和3OHC10(42.9摩尔％)仍是主要的单聚体单元。在另一方面，存在3OHC12:1单体的增加(直至12摩尔％)，而在相同的时间，3OHC14:1单体的含量减少(2摩尔％)。

在甘油中培育假单胞菌属物种IPB-B26提供了具有显著较低分子量分布但是具有相似多分散性指数的PHA聚合物(见表4)。

表4由菌株IBP-B26和N-128产生的PHA聚合物的分子量分布

通过GPC(通用校正)确定各值：M_p是峰最大值处的分子量；M_n，以数字为单位的分子量，M_w；以质量为单位的分子量和PDI是多分散性指数。

下表5中提出所获得的聚合物的另外的热特性。

表5菌株IPB-B26和N-128产生的不同聚合物的热特性

T_g：玻璃转化温度，Tg,c：冷却运行温度，Δc_p：热容在T_g时的变化，T_d：熔化温度，ΔH_d：熔化焓。全部均从DSC第二加热运行或第一冷却运行获得。

尽管存在单体组成差异，全部聚合物均具有相似的玻璃转化温度(Tg约(-48℃))和约297-300℃的分解温度(表5)，从而显示存在小于5个碳原子的短链长度单体不影响聚合物的热特性。

实施例4

采用油酸分批发酵假单胞菌属物种IPB-B26

在使用10g/l油酸作为底物的培养基E2中培育假单胞菌属物种IPB-B26。将起始搅拌设定在400转/分钟，温度设定在30℃，空气流速设定在1L/分钟和并且将pO2(氧分压)固定在30％和使用级联控制保持。

在接种后立即启动细胞生长。尽管pO₂在初始4小时内下降60％，但是该过程减缓并且直至培育30小时才不得不通过搅拌调节pO₂，显示出最大代谢活性。图1显示随假单胞菌属物种IPB-B26分批发酵的生物质和PHA产生及消耗量的动力学曲线(值是两次重复的平均值)。根据生长和PHA产生曲线，培育30小时至43小时的间隔时间是生物质和PHA产生速率最高的时间(见图1)。

在培育43小时后，PHA积累达到最大值43％-wt并且随后在110小时培育范围内保持几乎恒定，在40％-wt和43％-wt之间。随该过程未检测到泡沫形成问题。

在培育50小时后获得最高的生物质产率和PHA产率，分别达到5.5g/l和2.4g/l。PHA积累直至43％-wt(图1)。铵在培养36小时后完全耗尽，与PHA产生的最高产率相关，不过上清液的HPLC分析表明在发酵结束时底物并未充分耗尽。

在培养70小时后，添加0.5％油酸脉冲以尽力再增加PHA积累，但是底物未耗尽并且未检测到PHA积累的变化。

实施例5

采用油酸补料分批发酵假单胞菌属物种IPB-B26

菌株-底物的比生长速率(μ)和生物质转化产率(Y_x/s)是需要计算以便根据以下等式设计指数进料的参数：

$F\left(t\right)=\mathrm{\μ}\·\frac{\mathrm{Vo}\·\mathrm{Xo}}{\mathrm{So}\·\mathrm{Yx}/s}.e^{-\mathrm{\μset}\·t}$

其中F(t)是随着培养进行碳源的流速，V_o是培养物的体积(3L工作体积)，Y_x/s是生物质的产率，X_o是分批培养后的初始生物质，并且μ_set是所需的比生长速率。

使用400转/分钟起始搅拌、空气流速3L/分钟和使用级联控制固定在30％的pO₂，在含有3g/l油酸的培养基E2中培育假单胞菌属物种IPB-B26。动力学参数如下：μ_set0.1h^-1，S_o2.67g/l和Y_X/S0.89g/g。发酵用分批培养物在初始12小时期间以3.0g/l油酸启动，接着是24小时期间的指数进料和由线性进料1g/l/h油酸组成的最终步骤。在指数进料期间，使用pHstat控制，将铵以NH₄OH(14％v/v)供应。额外的Mg²⁺以0.033g MgSO₄/1g油酸的比率供应(图2)。

搅拌增加表明细胞立即开始生长。碳源在初始12小时培育后完全耗尽(图3)并且随后24小时实施指数进料。

搅拌速度在整个过程期间保持在800-1,000转/分钟之间，在最大生长阶段(从培育24小时至40小时)更高。在培育38小时之时，停止指数进料和铵供应并且在开始10小时线性进料之前供应3g/l油酸的脉冲。在线性进料后，HPLC分析显碳源和氮源均未完全耗尽并且因此发酵进行直至培养68小时。两种养分在培养68小时后完全耗尽(图3)。然而，在44小时和68小时之间未观察到生物质和聚合物产生的显著变化(表6和图4)。

在发酵48小时后实现最高生物质和PHA产生产率，分别是46.2g/l和25.3g/l。在指数进料期间，主要产生生物质，而最高PHA积累在线性进料期结束时发生，在培养48小时后导致55％wt的PHA积累(表6和图4)。

表6使用菌株假单胞菌属物种IPB-B26并使用油酸作为底物时发酵中的生物质和PHA产生

考虑到在发酵结束时菌株假单胞菌属物种IPB-B26达到的高细胞密度(OD_550nm为250)，在该过程期间较低的需氧量，如历史曲线中所反映(图3)，是特别值得注意的。实际上，优选地通过空气流动和搅拌控制pO₂。可以通过在指数进料阶段结束时添加3mL消泡剂控制泡沫形成。

下表7中，比较来自分批法(实施例4)和补料分批法的结果：

表7使用菌株假单胞菌属物种IPB-B26并使用油酸作为底物时发酵过程的生物质和PHA产率

实验	分批法	补料分批法
			CDW(g/l)	5.5	46.1
PHA(g/l)	2.4	25.3
			PHA(％wt)	43	54.8
培育时间(h)	50	47.5

使用补料分批策略，假单胞菌属物种IPB-B26成功地在5L生物反应器中放大并且在培育48小时后分别获得46g/l和25.3g/l的生物质和PHA产生。这些产率代表与初始培养策略相比增加10倍，表明环境菌株假单胞菌属物种IPB-B26适用于发酵过程中产生PHA。

通过NMR和GC-MS分析确定所获得的聚合物的单体组成。聚合物由以下单体单元构成：C4:0(0.5摩尔％)，C6:0(5.2摩尔％)；C8:0(38.7摩尔％)，C10:0(29.3摩尔％)，C12:0(14.6摩尔％)，C14:0(0.8摩尔％)和C14:1(10.9摩尔％)。归因于C4:0单元的低含量(仅0.5摩尔％)，不能在NMR分析中检测到这种单体，不过随后通过GC-MS分析证实其存在。获得的单体组成与先前对烧瓶实验中这种菌株-底物组合所报道的单体组成相似。

Claims (15)

1.一种以DSM26199(假单胞菌物种(Pseudomonas sp.)IPB-B26)或DSM26200(假单胞菌物种N-128)保藏于DSMZ的假单胞菌属(Pseudomonas)微生物。

2.一种用于产生中等链长或长链长PHA的方法，所述方法包括

-在合适的培养基中和在碳源存在的情况下培育以DSM26199(假单胞菌物种IPB-B26)或DSM26200(假单胞菌物种N-128)保藏于DSMZ的假单胞菌属微生物，并且

-从所述微生物分离PHA。

3.根据权利要求2所述的方法，其中培养基是E2培养基。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中碳源包含至少一种C4至C20脂肪酸，优选地C8至C18脂肪酸，所述脂肪酸优选地包含一个或多个不饱和部分。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中在培育用培养基中，将氧分压(pO₂)维持在25％和45％之间，优选地维持在约30％(％基于溶解于培养基中的总气体)。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中氮在培养基中作为铵盐存在，优选地具有范围在10至50mM、尤其范围在15至40mM的摩尔铵浓度。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中方法是摇瓶法或分批法并且培养基中碳氮(C/N)比处于9:1至70:1的范围，优选地处于15:1至50:1的范围。

8.根据权利要求7中任一项所述的方法，其中将碳源在培育用培养基中作为单个团块在培育开始时添加，优选地以提供范围在5至60mM、尤其10至40mM的碳源浓度的量添加。

9.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中将碳源以补料分批方式供应至培育用培养基以在初始分批阶段后提供指数渐增的碳源投量，优选地伴以0.05至0.15h^-1、更优选地0.08至0.12h^-1的比生长速率μ_set。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在分批阶段中，将初始碳源团块、优选地在培育用培养基中提供2至30mM、更优选地5至15mM范围的碳源浓度的初始碳源团块添加至培养基并且将培养物维持足以确保完全消耗初始碳源的时间，优选地持续8至16小时。

11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中PHA通过用具有3至8个碳原子的酮提取、优选地用丙酮提取进行分离。

12.根据权利要求2至11所述的方法，其中通过在60℃或更低的温度、优选地在20℃至40℃提取，来分离PHA。

13.通过根据权利要求2至12中任一项所述的方法可获得的PHA，其中PHA优选地含有多于10％的不饱和部分。

14.根据权利要求1所述的微生物在产生中等链长或长链长PHA的方法中的用途。

15.如在Gene Bank(NCBI)中以登录号JN651420(phaC1)或JN216885(phaC2)保藏的PHA合酶或其类似物或这些PHA合酶或其类似物的混合物的用途，用于产生PHA，优选地含有碳-碳双键和/或芳族部分的PHA。