CN104250627A - 新的环境分离株假单胞菌物种IPB-A36 用于高效产生mcl/lcl-PHA 和特异性PHA 的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以DSM26198保藏于莱布尼茨研究所DSMZ的假单胞菌属(Pseudomonas)微生物。本发明进一步涉及用于产生中等链和长链PHA的方法，所述方法包括在包含碳源的培养基中培育所述微生物并且从微生物分离PHA。已经观察到该微生物允许以高产率产生PHA。此外，本发明的微生物拥有将不饱和脂肪酸和/或芳族修饰的脂肪酸有效掺入所产生的PHA的有价值的能力。因此，本发明的微生物使得产生化学多样的PHA成为可能，为这些物质开辟新的应用领域。

Description

新的环境分离株假单胞菌物种IPB-A36 用于高效产生mcl/lcl-PHA 和特异性PHA 的用途
描述
本发明属于生物合成聚羟基链烷酸酯(PHA)领域。本发明涉及以DSM26198保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心DSMZ莱布尼茨研究所的野生型假单胞菌属(Pseudomonas)微生物。已经证明这种微生物在产生PHA的方法中具有巨大用途。该微生物是非基因修饰的并且已经观察到甚至能够掺入包含不饱和部分和芳族部分的碳源以提供具有可调特性的新PHA品种。本发明是还涉及这种微生物在用于产生中等链或长链PHA的方法中的用途以及涉及通过这类方法可获得的PHA。
背景技术
PHA是聚合物，它们是从可再生资源产生的生物可降解和生物相容性热塑性材料(3-羟基脂肪酸的聚酯)，具有广泛的工业和生物医学应用(Williams和Peoples,1996,Chemtech.26:38-44)。PHA由广泛类型的细菌合成并且已经因它们替代基于石油化学的常规塑料以保护环境免于塑料废弃物有害影响的潜在应用而广泛地受到研究。
PHA可以根据其侧链长度和它们的生物合成途径分成两类。具有短侧链的那些，如PHB，(R)-3-羟基丁酸单元的均聚物，是晶态热塑塑料，而具有长侧链的PHA具有更多弹性。已知晓前者约90年(Lemoigne和Roukhelman,1925,Ann.Des Fermentation,527-536)，而相对新近地发现后一类材料(deSmet等人,1983,J.Bacteriol.154:870-878)。然而，在这个名称之前，已经鉴定到含有(R)-3-羟基丁酸单元和5至16个碳原子的较长侧链(R)-3-羟酸单元的微生物源PHA(Wallen和Rohweder,1974,Environ.Sci.Technol.8:576-579)。已经鉴定到产生(R)-3-羟基丁酸和一种或多种含有5至16个碳原子的长侧链羟基酸单元的共聚物的许多细菌(Steinbüchel和Wiese,1992,Appl.Microbiol.Biotechnol.37:691-697；Valentin等人,1992,Appl.Microbiol.Biotechnol.36:507-514；Valentin等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.1994,40:710-716；Abe等人,1994,Int.J.Biol.Macromol.16:115-119；Lee等人,1995,Appl.Microbiol.Biotechnol.42:901-909；Kato等人,1996,Appl.Microbiol.Biotechnol.45:363-370；Valentin等人,1996,Appl.Microbiol.Biotechnol.46:261-267；美国专利号4,876,331)。这些共聚物可以称作PHB-共聚-HX(其中X是6个或更多个碳的3-羟基链烷酸酯或链烷酸酯或链烯酸酯)。特定双组分共聚物的有用例子是PHB-共聚-3-羟己酸酯(PHB-共聚-3HH)(Brandl等人,1989,Int.J.Biol.Macromol.11:49-55；Amos和McInerey,1991,Arch.Microbiol.155:103-106；美国专利号5,292,860)。
虽然PHA已因其作为可再生资源用于生物可降解热塑性塑料和生物聚合物(如上文所提到)的潜在应用而广泛地研究并且已经商业地开发并销售(Hrabak,1992,FEMS Microbiol.Rev.103:251-256)，但是它们的生产成本比基于石油化学的常规塑料的生产成本高得多，这成为更广泛使用它们的主要障碍(Choi和Lee,1997,Bioprocess Eng.17:335-342)。如上文描述，许多细菌产生PHA，例如真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、协腹产碱杆菌(Alcaligenes latus)、棕色固氮菌(Azotobacter vinlandii)、嗜酸假单胞菌(Pseudomonas acitophila)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleovarans)、大肠杆菌(Eschericha coli)、Rhodococcus eutropha、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)、酒色着色菌(Chromatium vinosum)、泊库岛食烷菌(Alcanivoraxborkumensis)等。本领域已知的产生PHA的全部细菌均产生胞内PHA并且在PHA颗粒中积累它(Steinbüchel,1991,Biomaterials,第123-213页)。造成PHA生产昂贵并且因此与基于石油化学的塑料相比而不利的主要方面在于难以按高产率产生该材料并且从积累它的细菌细胞内部回收产生的PHA。为了降低PHA的总生产成本，认为开发高效回收工艺是必需的，通常着眼于通过i)适宜溶剂、ii)次氯酸盐提取PHA和/或iii)消化非PHA细胞物质来破碎细胞(Lee,1996,Biotech.Bioeng.49:1-14)。
在工业规模，可用微生物仍提供相对少的PHA，这造成采用这些微生物产生PHA在经济上不可行。本领域已知的全部方法在生产期间均需要大量水和额外地需要化学试剂和/或酶用于它们的回收，这是降低生产成本的障碍。因此，迫切需要PHA生产的替代性策略。
最近，已经开发了用于基因修饰产生PHA的微生物的策略，例以使得该微生物产生更高量的PHA成为可能。EP1913135A1描述了已经例如通过敲除基因进行基因修饰的微生物，所述基因以与PHA合酶竞争的方式作用于产生PHA的中间体。通过耗尽酶的微生物，所述酶干扰PHA合酶作用于中间体，可以使中间体转向至PHA。
另一个方案将PHA合酶引入其野生型形式不能够产生PHA的微生物例如大肠杆菌中(参见Qi等人,2007,FEMS Microbiol.Lett.157:155-162)。在这种情况下，当使用癸酸酯作为碳源时，在大肠杆菌LS1298菌株中观察到约15％CDW(细胞干重)的最大PHA积累。
在又一个替代性方案中，通过敲除PHA解聚酶基因增加PHA产生，所述基因敲除在微生物恶臭假单胞菌(P.putida)KT2440中导致产生约4g/l CDW，其中PHA占至多80％的CDW(Cai等人,2009,BioresourceTechn.100:2265-2270)。
尽管取得这些进展，但是这些微生物中产生的PHA的量与产生它们所需的资源相比仍是相对低的。此外，在一些国家，公众对基因修饰微生物存在保留意见，这导致接受这些材料方面的问题。具体对于这些国家而言，拥有以高产率产生PHA的野生型，即非基因修饰微生物将是有利的。
直至现在已经被描述用于PHA产生的大部分微生物仅接受饱和脂肪酸作为碳源用于产生PHA。从常规底物如具有6个至约20个碳原子的链长度的直链脂肪酸产生的PHA通常显示-30℃至-50℃范围的聚合物玻璃转化温度。这限制它们用于与这类玻璃转化温度相容的应用。如果可以扩展由相应微生物接受用于掺入PHA中的底物的范围，这将对从这类微生物可获得的PHA的特性的多样性具有巨大影响。具体而言，如果可获得还可以掺入导致PHA改良特性的碳源的微生物，这将对可以使用该材料作为基于石油化学的常规塑料的可能替代的应用范围具有巨大影响。
本申请满足这些需求。
发明概述
本申请的一个目的是提供以DSM26198保藏于莱布尼茨研究所DSMZ，Inhoffenstr.7B,38124，Braunschweig，德国的非基因修饰(即野生型)假单胞菌属微生物。以石油T138(1％)作为底物，微生物假单胞菌属物种IPB-A36从富集培养物分离，所述富集培养物从来自加拿大和澳大利亚的不同污染(被烃、柴油和石油污染)土壤样品获得。已经出乎意料地观察到这种微生物允许高产率产生PHA并且还能够将非常规底物(包括例如芳族部分和/或不饱和部分)掺入PHA中。
在优化条件下，该微生物提供多于22g/l CDW(细胞干重)的生物质，其中PHA含量为43wt.-％，对应于多于9g/l的PHA总产率。
本申请进一步涉及一种用于产生中等链和/或长链PHA的方法，所述方法包括：
-在包含碳源的培养基中培育以DSM26198保藏于DSMZ的假单胞菌属微生物，和
-从微生物分离PHA。
本申请的其他方面涉及从该方法可获得的PHA，其中PHA优选地包含不饱和部分和/或芳族部分，和上述微生物在用于产生中等链或长链PHA的方法中的用途。
附图简述
图1：在不同进料条件下在C-Y培养基中培养的菌株假单胞菌属物种IPB-A36的透射电子显微(TEM)图像：(1A-B)，27mM C11:1；(2A-B)，27+27mM C11:1；(3A-B)，54mM C11:1。在30℃和200转/分钟温育72小时后，收集细胞用于PHA提取并且分别制备1ml样品用于TEM。
图2：使用10-十一烯酸酯作为底物的菌株假单胞菌属物种IPB-A36补料分批发酵。生物质和PHA产生的动力学(A)、铵消耗(B)和OD550nm量值(C)。值是两次重复的平均值。
发明概述
中等链，在本发明的上下文中使用这个术语时，意指具有5至13个碳原子的羟基酸单元((R)-3-羟基单元)。术语“长链PHA”意在涵盖含有至少14个碳原子/单体的PHA。
在发明人的研究过程中，已经发现用于发酵本发明微生物的培养基对微生物的PHA生产率具有显著影响。从测试的几种生产培养基中，当使用10-十一烯酸酯作为碳源时，用0.1％酵母提取物改良的MM培养基(如Martinez-Blanko等人,1990,J.Biol.Chem.265:7084-7090中所述)提供最低的PHA生产率。在相同条件下，如Reasoner和Geldreich所述的R2A培养基(1985,Appl.Environ.Microbiol.49:1-7)提供显著更高的PHA产率，而Choi等人(1994,Appl.Environ.Microbiol.60:1245-1254)中所描述的C-Y培养基提供就PHA产生而言的最高产量。来自这种培养基的PHA产率超过用MM培养基所获得的产率4倍。在本发明的实施中，因此优选培养基是如Choi等人所述的C-Y培养基。
为了进一步改善生物质产率和PHA产率，改良培养基中氮(N)和碳(C)的含量。将优选的C-Y培养基提供的条件(5mM硫酸铵和27mM10-十一烯酸酯)视为标准条件，验定了两个不同浓度的氮源和碳源。观察到通过氮源和碳源的浓度增加两倍并且维持摩尔C/N比在30，可以进一步增加PHA产生超过2倍。因此，在本申请的又一个优选实施方案中，使用碳源和氮源的浓度均增加的改良C-Y培养基。
本发明的方法不受任何相关限制(如为产生PHA待使用的碳源的担忧)影响。常规用于产生PHA的碳源可以与本申请的微生物在本发明的方法中一起使用，如甘油、糖、丙酮酸和常规脂肪酸，尤其如包含4至20个碳原子和优选地8至18个脂肪碳原子的脂肪酸。然而，已经发现如果使用脂肪酸或它们的混合物作为碳源，则获得以mg/L为单位的最佳PHA产率。因此，本申请的优选方法涉及包含至少一种C4至C20脂肪酸、优选地C8至C18脂肪酸的碳源。在本申请中待用的优选饱和脂肪酸是丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸和花生酸。
已经进一步发现本发明的微生物还接受不饱和脂肪酸如油酸和10-十一烯酸作为底物。本发明方法的优选实施方案因此涉及包含一个或多个不饱和部分、优选地单不饱和部分的脂肪酸作为碳源。代表性不饱和脂肪酸包含肉豆蔻油酸、棕榈油酸、十六碳烯酸(sapienic acid)、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反式亚油酸、α-亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和十一烯酸。
本发明的微生物假单胞菌属物种IPB-A36还允许将包含芳族部分的羧酸掺入PHA中。在本发明的优选方法中，碳源可以因此包含至少一种包含芳族部分的羧酸。这种“羧酸”可以与前文提到的脂肪酸组合使用或作为单一底物使用。
包含芳族部分的羧酸优选地是脂肪酸，更优选地是ω-芳基取代的脂肪酸，和最优选地是ω-苯基取代的脂肪酸。所述脂肪酸优选地在脂肪酸链中包含4至10个碳原子。这种类型的优选脂肪酸因此包括例如4-苯基丁酸、5-苯基戊酸、6-苯基己酸、7-苯基庚酸、8-苯基辛酸、9-苯基辛酸和10-苯基癸酸。令人惊讶地，已经观察到在用于发酵的浓度，这些羧酸对微生物无毒。
如果使用包含芳族部分的羧酸和脂肪酸的混合物，则进一步优选包含芳族部分的羧酸与至少一种C4至C14脂肪酸混合使用并且占据约5％至45％的混合物。已经观察到如果包含芳族部分的芳族羧酸的浓度高于所示范围，则就以g/l和wt.-％计的PHA产生而言，PHA产率显著低于其中包含芳族部分的羧酸占据约5至45wt.-％碳源混合物的相应混合物时的PHA产率。已经进一步观察到如果包含芳族部分的羧酸处于所示范围，则就总PHA产生和相对于细胞干重的含量而言，PHA产率可其中不使用包含芳族部分的羧酸的发酵相当。
除前文提到的羧酸之外，还可能将支链羧酸纳入PHA中，例如结核菌硬脂酸或7-甲基-7-十六烷酸。
在一个优选实施方案中，这些支链羧酸优选地在被至少4个碳原子与羧酸部分分隔、优选地被至少5个碳原子与羧酸部分分隔的碳原子处分枝，同时更靠近羧酸的碳原子是未取代的。
培养基中的碳源可以包含上述碳源中的仅一种或这些羧酸中两种或更多种羧酸的混合物。优选地使用至少一种饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸和至少一种包含一个或多个不饱和部分的羧酸的混合物。在这种情况下，可以按独立部分或作为混合物添加相应的碳源。在发酵中使用多于一种碳源、尤其使用包含饱和部分、不饱和部分和芳族部分的羧酸的混合物的优点在于可以精确地微调所得PHA的特性。
另外可以仅在发酵开始时、在发酵期间以几个分立团块或通过连续共进料混合物，添加碳源的混合物。后一种替代具有以下优点：将碳源在基本上无组成变动的情况下掺入PHA中(即在发酵开始时形成的PHA具有与趋向发酵结束时形成的PHA相同的组成)。因此在本申请的方法中优选共进料碳源。
如果本申请的方法在摇瓶法或分批法的环境下使用，进一步优选培养基中碳氮(C/N)比处于约20至45的范围、优选地处于约25至35的范围。如果(C/N)比小于20或超过45，则所得产物的PHA产率低于优选的范围。
在本申请的一个实施方案中，将碳源在培育开始时作为单个团块添加至培养混合物。在这个方面观察到，如果碳源以例如两个部分添加，其中之一在培养开始时添加，而第二个部分在以后阶段添加，则通常与其中碳源作为单个团块添加的方法相比，以g/l和wt.-％计的PHA产率较低。
在摇瓶或分批法的情况下，进一步优选向培养用混合物添加的碳源的量是这样的，从而获得培养用混合物中约20至60mM范围、尤其约45至55mM范围的碳源浓度。如果添加碳源以提供小于20mM的浓度，则PHA的产率低于其中碳源浓度处于所示范围的发酵的PHA产率。如果碳源浓度超过60mM，则环境变得对细胞越发有毒，这不利地影响它们的生长。
本发明方法的又一个重要参数是培养基中的氮含量，因为氮是微生物的重要养分，并且PHA产生通常在特征为碳过量和例如氮某种程度缺乏的条件下有利。在本发明的优选方法中，使用铵盐作为氮源，例如硫酸铵或氢氧化铵。
在本发明的优选方法中，培养基中的铵浓度(NH4 +)处于约8至30mM范围，尤其处于约10至20mM范围。然而，最终是C/N比，而非氮源实际浓度对菌株的生长和PHA产生具有最大影响。
本申请的又一个重要方面是发酵中的氧浓度，因为微生物消耗氧以转化羧酸成3-羟基羧酸。在本申请的实施中，优选在培养基中氧分压(pO2)维持在约25％和45％之间，优选地在约30％，其中％是摩尔％并且基于溶解于培养基中的总气体计算。
在培育时间方面，本申请不受任何有关规定影响。然而，技术人员将认识到，在培育期间，在某个阶段产生的PHA的量将达到最大值，其后PHA含量下降或不再变化。技术人员将轻易地能够确定其中微生物内PHA积累的量最高的时间。作为经验法则，分批法中的最大PHA积累通常在约40小时后和在约100小时之前达到。因此，培育优选地实施不少于48小时和不多于96小时、优选地不少于60小时至不多于84小时并且最优选地约72小时的时间。
对于本发明微生物，已经确定约30℃温度为PHA产生的最佳温度。因此，本申请的方法优选地在约15℃至45℃和优选地从约20℃至40℃的温度进行。
在不同于上述分批法的一个本申请实施方案中，以补料分批方式(即涉及在发酵初始化时间后补充指数渐增的碳投送量的方式)向培育用培养基供应碳源。基于以下等式从计算指数渐增的碳投送量计算参数：
F ( t ) = μ · Vo · Xo So · Yx / s · e - μset · t
其中F(t)是随着培养进行碳源的流速，V0是培养物的体积，Yx/s是生物质的产率，X0是分批培养后的初始生物量，μset是所需的比生长速率，并且S0是进料中的底物浓度。
μset在本发明的方法中优选地处于约0.05至0.1h-1的范围，更优选地约0.06至0.085h-1的范围。
上述补料分批法允许大幅度减少达到最大产率的发酵时间，其中发酵中的最佳PHA浓度可以降低至约40至48小时的范围。这表示胜过常规分批法的显著优点，在所述常规分批法中最佳PHA浓度通常仅在约72小时后获得。
在前文提到的方法中，优选在添加指数渐增的碳源投量之前，发酵在分批阶段初始化，其中添加初始碳源团块至培育用培养基并且随后将培养物维持足以确保初始碳源完全耗尽的时间。在本发明的实施中，已经观察到将初始分批阶段适当地实施约12至22小时的时间。优选地，补料分批法的初始阶段实施约12至15小时。
在补料分批法中，进一步优选初始碳源团块在培育用培养基中提供约10至20mM、优选地约12至17mM范围的碳源浓度。已经确定这个范围在指数进料过程启动之前提供最佳的初始培养。
发酵混合物的搅拌速率在分批法或补料分批法中不受任何相关限制，例外在于它必需足以维持氧压力处于上文所示的范围。合适的搅拌速率取决于发酵的要求，但是通常处于约200至1400转/分钟范围。
已经出乎意料地发现本发明的微生物显示在发酵期间使PHA颗粒融合成单个颗粒，同时起初形成多个PHA颗粒。
就从微生物分离PHA而言，优选PHA用非氯化溶剂提取，优选地用具有3至8个碳原子的酮提取。与常规的氯化溶剂如氯仿和二氯甲烷相比，非氯化溶剂提供废物处置问题和成本显著较少的优点。用于实施本申请中所提到的酮是丙酮、2-甲乙酮、二乙酮、2-甲基丙基酮等。用于分离PHA的最优选酮是丙酮。
进一步优选在小于约60℃的温度、优选地在约20℃至40℃的温度提取PHA。已经出乎意料地发现，在这些温度提取本发明的微生物提供了与在更高温度的可比较提取基本上相同的PHA产率。认为这是来自单个PHA颗粒在高碳浓度形成和趋向发酵过程结束时可观察到的微生物细胞壁破裂的直接结果。因而，在本发明的微生物中，PHA比常规发酵的微生物中的多个颗粒更容易为溶剂接近。已经进一步观察到可以在提取约0.5至5小时后，获得基本上相同产率的已提取PHA。优选将溶剂提取实施约1至3小时，优选地约1小时时间。
本申请的又一个方面是通过如上文所述的方法可获得的PHA。优选地，该方法涉及掺入包含芳族部分和/或不饱和部分的羧酸。更优选地，通过该方法获得的PHA含有5至20％-mol饱和单体，30至70％-mol不饱和单体和20至60％-mol芳族单体。
本申请的再一个方面是如上文所述的微生物在用于产生中等链或长链PHA的方法中的用途。该方法的优选实施方案与上文针对用于产生中等链或长链PHA的方法所描述的那些实施方案相同。
本申请的最后方面是如在Gene Bank(NCBI)中以登录号JN651419(phaC1)或JN216884(phaC2)保藏的PHA合酶或其类似物用于产生PHA的用途。PHA合酶或其类似物可以单独或或以它们的混合物使用。如这个术语在实施本发明时使用，“类似物”意指这样的肽或蛋白质，其具有至少约80％序列同一性，优选地至少约90％序列同一性，更优选地至少约95％序列同一性，和最优选地至少约98％序列同一性，并且具有可比较特性，在于它能够在适宜条件下合成PHA并接受不饱和羧酸和/或包含芳族部分的羧酸并将它们掺入PHA中。在一个优选实施方案中，该用途是产生包含一个或多个不饱和碳-碳双键和芳族部分、优选地苯基部分的PHA。
在下文中，将以举例方式进一步描述本申请，然而，所述例子不意以任何方式在限制本申请的范围。
实施例1
为了选择用于PHA产生的最佳培养基，将假单胞菌属物种IPB-A36在500ml烧瓶(100ml培养物)中的三种不同培养基(MM+0.1％YE，R2A和C-Y)中在30℃和200转/分钟培养并以10-十一烯酸酯(27mM)作为碳源。
表1使用不同培养基时，来自假单胞菌属物种IPB-A36的生物质和PHA产生
值在30℃和200转/分钟温育72小时后获得并且是三次重复的平均值±标准偏差。
1Martínez-Blanco等人,1990,J.Biol.Chem.265:7084-7090
2Reasoner和Geldreich,1985,Appl.Environ.Microbiol.49:1-7
3Choi等人,1994,Appl.Environ.Microbiol.60:3245-54
在使用培养基C-Y时获得最好结果，分别获得1.69g/l的生物量和48.8wt.-％的PHA积累。
实施例2
为了改善生物质和PHA产率，调节氮(N)和碳(C)的含量。这个实验在含有200ml培养物的1L烧瓶中在30℃和200转/分钟实施。验定了两个不同浓度的氮源(N和2N)和碳源(27mM和54mM)。标准条件采用C-Y培养基中0.66g/l或5mM(NH4)2SO4(N)的氮源和碳源浓度和27mM碳源。在2N中，(NH4)2SO4浓度是1.32g/l或10mM。
表2在不同(C/N)比率时假单胞菌属物种IPB-A36的生物质和PHA产生
(27+27)表示起始碳源浓度是27mM并且在培养24小时后，添加27mM碳源新脉冲。值在30℃和200转/分钟温育72小时后获得并且是二次重复的平均值。
如可以从表2见到，使用54mM C11:1和1.32g/l(NH4)2SO4时，获得最佳产率，这表明通过增加碳和氮的浓度两倍并维持C/N比率在30，显示PHA产生增加两倍。
用显微镜研究采用27mM C11:1、27+27mM C11:1和54mMC11:1和0.66g/l(NH4)2SO2发酵所获得的样品。图1显示碳源在初始阶段和培育72小时后对颗粒形成的影响。当向培养物供应27mM底物时，观察到几种颗粒(图1-1A和1B)，其中在较高的碳源浓度(图1-2A和2B，和图3-3A和3B)，大部分细胞仅含有占据全部细胞质腔隙的单一巨大颗粒。观察到的形态表明颗粒的大小可能有助于细胞裂解。
还研究了氮源浓度对颗粒形成的影响。在1.32g/l(NH4)2SO4(2N)，观察到多个巨大颗粒/细胞并且在初始发酵阶段中，细菌细胞似乎比正常培养基C-Y中培养的细菌细胞更健康。通常，可以观察到良好PHA积累并且图像与表2中报道的定量性结果良好符合。在培养72小时处颗粒形成过程中的变化表明颗粒的尺寸可能积极地影响下游处理期间的PHA回收。
实施例3
将假单胞菌属物种IPB-A36在含有20ml C-Y培养基的100ml烧瓶中在30℃和200转/分钟，使用不同底物培养以研究PHA结构中共底物的影响。在使用10-十一烯酸酯作为对照和两种不同芳族底物[5-苯基戊酸酯(5-PheVal)和8-苯基辛酸酯(8-PheOct)]以及不饱和/芳族底物组合时，验定PHA产生(表3)。
首先对芳族底物测试它们对细菌细胞的细胞毒性。表3显示以5-苯基戊酸酯或8-苯基辛酸酯作为唯一碳源培养时，菌株能够生长和积累PHA。然而，对于5-苯基戊酸酯和8-苯基辛酸酯，分别获得低pHA产率，分别是15-18wt.-％和7wt.-％。当芳族底物随10-十一烯酸酯(14或27mM)共进料时，PHA产率增加多至40-50wt.-％。
表3使用芳族底物时，假单胞菌属物种IBP-A36的生物质和PHA产生
值在30℃和200转/分钟温育72小时后获得。
5-Pheval：5-苯基戊酸酯
8-PheOct：8-苯基辛酸酯
C11:1:10-十一烯酸酯
观察到如果5-苯基戊酸酯与10-十一烯酸酯(27mM)组合使用，则假单胞菌属物种IPB-A36积累含有2至5％芳族单体的PHA聚合物。虽然这个百分数低，但是观察到获得的聚合物的热性能显著变化。
通过NMR-光谱法和GC-MS研究PHA，所述方法提供表4中显示的结果。
表4在使用10-十一烯酸酯和5-苯基-戊酸酯的混合物作为底物时获得的PHA聚合物的单体组成
3OHC11:1：3-羟基-10-十一烯酸酯
3OHC9:1：3-羟基-8-壬烯酸酯
3OHC7:1：3-羟基-6-庚烯酸酯
5-Phe-3OHC5：5-苯基-3-羟基-戊酸酯
8-Phe-3OHC8：8-苯基-3-羟基-辛酸酯
NMR-分析指示存在10-12％经鉴定为3-羟基辛酸酯和3-羟基癸酸酯的饱和单体。饱和单体的存在可能是菌株使用除β-氧化之外的其他代谢途径(例如，脂肪酸从头合成)以合成聚羟基链烷酸酯的结果。当供应2mM5-苯基戊酸酯作为共进料时，芳族单体的相对摩尔％达到26摩尔％，而当供应5mM5-苯基戊酸酯时，该分数增加直至53摩尔％。
当使用5mM8-苯基戊酸酯作为共底物时，聚合物组成移向23摩尔％芳族单体、65摩尔％不饱和单体和12摩尔％饱和(C8:0和C10:0)单体。
下表5中提出所制备的PHA的进一步分析性数据。
表5由菌株IPB-A36产生的不同聚合物的分子量分布
通过GPC(通用校正)确定各值：Mp是峰最大值处的分子量；Mn，以数字为单位的分子量，Mw，以质量为单位的分子量和PDI是多分散性指数。
从不同底物组合所培育的假单胞菌属物种IPB-A36产生的聚合物显示相似的分子量分布，例外是假单胞菌属物种IPB-A36C11:1(14mM)+5PheVal(5mM)具有显著较低分子量并显示最高PDI。表6中显示的DSC分析还提示与所分析的其余PHA聚合物相比，这种聚合物的不同特性。
表6由菌株IPB-A36产生的不同聚合物的热特性
Tg：玻璃转化温度，Tg,c：冷却运行温度，Δcp：热容在Tg时的变化，Td：熔化温度和ΔHd：熔化焓。全部数据均从DSC第二加热运行或第一冷却运行获得。
实施例4
在使用油酸(1％)作为底物的培养基C-Y和C-Y(2N)中培育假单胞菌属物种IPB-A36。当使用C-Y(2N)时，获得生物质CDW(4.5g/l)和PHA(2.1g/l)的最佳产率，不过在两种条件下观察到相似的PHA积累速率(约50wt.-％)。
根据GC-MS和NMR分析，所产生的PHA聚合物由以下构成：8摩尔％的3OHC6:0，44.2摩尔％的3OHC8:0，24.5摩尔％的3OHC10:0，10.7摩尔％的C3OHC12:0和12.6摩尔％的3OHC14:1(3OHC＝3-羟基羧酸，例如14:1的第一数字表示碳原子总数，该编号的第二个数字表示双链数)。下表7中显示这种聚合物的其他特性。
表7由IPB-A36产生的PHA聚合物的分子量分布
通过GPC(通用校正)确定各值：Mp是峰最大值处的分子量；Mn，以数字为单位的分子量，Mw，以质量为单位的分子量和PDI是多分散性指数；Tg：玻璃转化温度，Tg,c：冷却运行温度，Δcp：热容在Tg时的变化，Td：熔化温度和ΔHd：熔化焓。全部均从DSC第二加热运行或第一冷却运行获得。
实施例5
起始搅拌使用400转/分钟、空气流速3L/分钟和固定在30％(相对于溶解于培养基中的总气体)并使用级联控制所维持的氧分压(pO2)，在培养基C-Y(2N)中以补料分批法培育假单胞菌属物种IPB-A36。计算动力学参数并且选择0.075h-1的μset。额外地，添加用于NH4 +进料的外部泵。根据计算，将初始批次延长直至15小时以确保完全碳源耗尽，和随后是44小时的指数进料。
在初始15小时培育后，碳源完全耗尽(如通过HPLC分析所确定)并且启动指数进料。培养物立即反应并且氧需求因更高的代谢活性而增加。搅拌速度增加直至其最大值900转/分钟，并且需要供应纯氧。在空气流中混合的纯氧的百分数不得不增加直至该方法结束并且达到直至28摩尔％的值。
表8中汇总生物质和PHA产生数据。数据显示在40小时培育后，细胞停止生长，但是继续积累，表示伴随氮耗尽的可能问题。
表8补料分批法BR-5.12的生物质和PHA产生和OD量值。
值是两次重复的平均值。
PHA(wt.-％)积累在较早发酵阶段更高，沿整个过程达到45-60wt.-％之间的值。值得注意的是，在这些培养条件下，菌株假单胞菌属物种IPB-A36能够与生长相比合成更多PHA(7.41g/l)，残余生物质(无PHA的生物质)为约4.5g/l。
实施例6
使用400转/分钟起始搅拌、空气流速3L/分钟和使用级联控制固定在30摩尔％的pO2，基本上按照实施例5中使用的相同条件用培养基C-Y(2N)，以又一种改良补料分批法培育假单胞菌属物种IPB-A36。再计算动力学参数并且固定0.075h-1的μset。该方法始于初始14小时分批发酵期间用2.5g/l C11:1分批培养，接着经45小时指数进料。
在初始14小时培育后，碳源完全耗尽(如通过HPLC分析所检测)并且启动指数进料。在培育10小时后，分批培养中的生长过程结束得比预期早。然而，一旦开始指数进料，则培养物立即反应，如通过归因于更高代谢活性的所需搅拌和氧消耗量骤增所观察到。增加搅拌速度直至1,400转/分钟并且气流量需要60％纯氧的混合物以维持pO2在30％。
铵进料直接影响聚合物积累。PHA积累在最大生长阶段期间(在培育24小时和36小时之间)大幅度减少，如图2A中所反映。保持培养基中的铵含量在大约400mg/l(约22mM)以确保细菌生长(图2B)。PHA积累在36小时培养后再次开始，如通过铵消耗量下降所示。
在培育42小时后，观察到泡沫形成增加。在45小时终止培育。分离微生物产生的PHA分别提供22.5g/l的细胞干重和8.9g/l的PHA产率。
实施例7
通过溶剂提取法评价PHA回收中PHA颗粒合并的影响。PHA提取已经在两种不同溶剂(丙酮和氯仿)中，在不同提取温度(室温和80℃)和不同提取时间(1小时和3小时)实施。选择两种不同培养条件，以便评价在颗粒形成时观察到的两种不同形态学：(i)沿细胞质分布的多颗粒形成和(ii)占据细菌细胞全体空间的单一大颗粒的形成。
在30℃和200转/分钟在C-Y培养基中使用两种不同碳源浓度培养假单胞菌属物种IPB-A36：(a)27mM的C11:1和(b)27+27mM，这意味在培养24小时后添加27mM C11:1脉冲。将细胞在培育72小时后收获并冷冻干燥以便稍后使用上文描述的不同提取条件提取。将40mg冻干的生物质样品置于提取管中，重悬于相应的溶剂中并提取。表9中汇总PHA回收的百分数。
表9使用不同提取条件获得的PHA回收百分数。
结果是三次重复的平均值±标准偏差。RT：室温
在两种培养条件下，当使用氯仿作为提取溶剂时获得最高的PHA回收百分数，在采用27mM C11:1的培养物中是44-48％和在采用27+27mM C11:1的培养物中是58-60％。
将经典氯仿提取法(3小时和80℃)视为最大PHA回收百分数(100％)并且作为对照用来计算相对PHA回收百分数以便评价两种颗粒形态学之间是否存在任何差异。与提取时间无关的室温氯仿提取显示两种颗粒形态学之间的轻微差异(大约5％)。在采用27mM C11:1的培养物(多颗粒)情况下，相对回收百分数是95％并且在采用27+27mM C11:1的培养物(单一大颗粒)情况下，相对回收百分数是100％。然而，在80℃使用氯仿时，未观察到相对回收百分数(相对％)的差异。在使用丙酮作为溶剂的情况下，相对回收百分数(85-95相对％)低于采用氯仿所获得的相对回收百分数(95-100相对％)并且在两种形态之间检测到轻微差异(5-8相对％)。发现相对回收百分数的5-8％增量。

Claims (15)

1.一种以DSM26198保藏于DSMZ的假单胞菌属(Pseudomonas)微生物。
2.一种用于产生中等链或长链PHA的方法，所述方法包括
-在包含碳源的培养基中培育以DSM26198保藏于DSMZ的假单胞菌属微生物，和
-从所述微生物分离PHA。
3.根据权利要求2所述的方法，其中培养基是C-Y培养基，优选地是C-Y(2N)培养基。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中碳源包含
-至少一种C4至C20脂肪酸，优选地C8至C18脂肪酸，所述脂肪酸任选地包含一个或多个不饱和部分，
-至少一种包含芳族部分的羧酸，优选地ω-苯基取代的脂肪酸，更优选地在脂肪酸链中包含4至10个碳原子，或其混合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中将饱和脂肪酸和/或不饱和脂肪酸与包含一个或多个不饱和部分的羧酸的混合物共进料至培养基。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中氮在培养基中作为铵盐存在，优选地具有范围在约8至30mM、尤其范围在10至20mM的摩尔铵浓度。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述方法是摇瓶法或分批法，并且培养基中碳氮(C/N)比处于约20至45的范围，优选地处于约25至35的范围。
8.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中将碳源以补料分批方式供应至培育用培养基以在初始分批阶段后提供指数渐增的碳源投量，优选地伴以0.05至0.1h-1范围、更优选地0.06至0.085h-1范围的比生长速率μset。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在分批阶段，将初始碳源团块添加至培养基并且将培养物维持足以确保完全耗尽初始碳源的时间，优选地，其中将初始分批阶段维持12至22小时，更优选地其中将初始分批阶段维持12至15小时。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中初始碳源团块在培育用培养基中提供约10至20mM、优选地约12至17mM范围的碳源浓度。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中PHA用具有3至8个碳原子的酮提取，优选地用丙酮提取。
12.根据权利要求2至11所述的方法，其中在约60℃或更低的温度、优选地在约20℃至40℃提取PHA。
13.通过根据权利要求2至12中任一项所述的方法可获得的PHA，其中PHA优选地含有不饱和部分和/或芳族部分，更优选地具有5％至20％饱和单体、30％至70％不饱和单体和20％至60％芳族单体的相对mol％比。
14.根据权利要求1所述的微生物在产生中等链或长链PHA的方法中的用途。
15.在Gene Bank(NCBI)中以登录号JN651419(phaC1)或JN216884(phaC2)保藏的PHA合酶或其类似物或者这些PHA合酶或其类似物的混合物的用途，用于产生PHA，优选地含有碳-碳双键和/或芳族部分的PHA。
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