CN107012157A

CN107012157A - 一种菊粉酶基因及其应用

Info

Publication number: CN107012157A
Application number: CN201710281040.1A
Authority: CN
Inventors: 杨江科; 陈光军
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2017-08-04

Abstract

本发明公开了一种菊粉酶基因及其应用，涉及生物技术领域。本发明公开的菊粉酶基因，其适于编码菊粉酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该菊粉酶基因采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，并通过对次高频密码子的选用消除了基因中富含AT或GC的区域以及脂肪酶中的蛋白酶作用位点，大大地提高了该菊粉酶基因在毕赤酵母细胞中菊粉酶的表达量。

Description

一种菊粉酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种菊粉酶基因及其应用。

背景技术

近年来，随着消费水平及消费文化的改变，居民大量摄入富含果葡糖浆的食品，果糖的摄入也随之增多。果糖存在于蜂蜜、花朵、浆果及大多数根类蔬菜等天然食物中。果糖作为水溶性最好的一类单糖，口感好、甜度高、升糖指数底，被称为“健康糖”；菊粉作为储藏性多糖广泛存在于菊科植物中，来源广，价格低廉。考虑其廉价易得，菊粉水解产物分为低聚果糖和果糖两大类，这两类物质对人类健康均有益处，故以菊粉为原料国内外都被广泛应用。

现在工业生产中制备果糖浆，一是通过直接利用淀粉酶将淀粉水解成葡萄糖，在葡萄糖异构酶的作用下将葡萄糖异构成果糖，二通过酸法和酶法将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，然后通过离子排斥层析从葡萄糖中分离果糖。

另外，菊粉(又称菊糖)作为果糖聚合物是果糖制备的理想材料。通过外切菊粉酶酶水解菊粉以产生果糖是一种有效的、绿色的和较先进的技术。

自然界中较多微生物可以产生菊粉酶，但从自然界中筛选的菌株产酶能力较低且酶活力不高，天然生产菌株最高菊粉酶产量为288.78U/ml。

也有利用基因工程技术在宿主细胞中异源表达菊粉酶基因，得到菊粉酶。例如王建华构建的高效表达外切菊粉酶的巴斯德毕赤酵母重组菌株CGMCC No.0763，其产生的菊粉酶酶活力达到577U/ml，吕红等利用鹰嘴豆克鲁维酵母Y179U表达体系，构建的一株基因工程菌的菊粉酶酶活力为2500U/ml。

毕赤酵母表达系统是目前广泛使用的真核生物表达体系。它具有生物安全性好、遗传元件稳定、高密度发酵工艺成熟以及目的蛋白分离纯化简便等优点，是异源蛋白质工业化生产的理想宿主。

然而，由于受到毕赤酵母对异源基因密码子使用偏好性、mRNA二级结构的复杂性、基因中富含A/T或G/C区段、蛋白酶切割位点以及基因在宿主中的丰度等因素影响，异源基因在毕赤酵母中难以获得高效表达。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菊粉酶基因，其适于编码菊粉酶，该菊粉酶基因经过密码子优化，采用了适用于毕赤酵母进行转录翻译表达出菊粉酶的高频密码子，有利于提高该菊粉酶基因在毕赤酵母细胞中菊粉酶的表达量。

本发明的另一目的在于提供一种表达盒，该表达盒含有上述的菊粉酶基因。

本发明的另一目的在于提供一种载体，其含有上述的表达盒。

本发明的另一目的在于提供一种重组细胞，其含有上述的载体。

本发明的另一目的在于提供上述菊粉酶基因在生产菊粉酶中的应用，该应用能够高效率、高产量地生产出菊粉酶。

本发明的另一目的在于提供上述菊粉酶基因在生产果糖中的应用，该应用可高收率地得到果糖。

本发明是这样实现的：

一种菊粉酶基因，其适于编码菊粉酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种表达盒，其含有上述的菊粉酶基因。

一种载体，其含有上述的表达盒。

一种重组细胞，含有上述的载体。

上述菊粉酶基因在生产菊粉酶中的应用。

上述菊粉酶基因生产果糖中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的菊粉酶基因，其适于编码菊粉酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该菊粉酶基因采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，并通过对次高频密码子的选用消除了基因中富含AT或GC的区域以及脂肪酶中的蛋白酶作用位点，大大地提高了该菊粉酶基因在毕赤酵母细胞中菊粉酶的表达量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的pAO-INU载体的图谱；

图2为本发明实施例1提供的pAO-INU载体的双酶切后的凝胶电泳图；

图3为本发明实施例2提供的pAO-INU-DU载体的图谱；

图4为本发明实施例3提供的pAO-INU-DU-HAC1载体图谱；

图5为本发明实施例4提供的不同类型酵母菌发酵液的酶活性检测结果；

图6为本发明实施例5提供的不同类型酵母菌发酵液的酶活性检测结果；

图7为本发明实施例6提供的不同类型酵母菌发酵上清液的SDS-PEGE结果；

图8为本发明实施例7提供的不同类型酵母菌发酵上清液的SDS-PEGE结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

现有阶段，有研究从自然界筛选天然产菊粉酶的基因，也有研究人员通过基因工程的手段构建的菊粉酶基因，通过提高基因剂量或以相关的内质网分泌相关蛋白辅助表达来提高表达水平，但是在表达水平还不够高，在工业生产上难以应用。本发明也在此研究的基础上，通过这两种方法的结合，获得了菊粉酶基因的高效表达。

下面对本发明实施例的一种菊粉酶基因及其应用进行具体说明。

一方面，本发明提供一种菊粉酶基因，其适于编码菊粉酶，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。其所编码的菊粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明以马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)外切型菊粉酶的氨基酸序列为出发材料，人工优化了编码该酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:4所示)，通过密码子优化，人工合成并获得高产的菊粉酶基因(SEQ ID NO:1所示)，实现了高效的异源表达。

该菊粉酶基因采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，并通过对次高频密码子的选用消除了基因中富含AT或GC的区域以及脂肪酶中的蛋白酶作用位点，提高了该菊粉酶基因在毕赤酵母细胞中菊粉酶的表达量。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其含有上述的菊粉酶基因。

容易理解，该表达盒包括了用于驱动上述菊粉酶基因表达的启动子，启动子位于该菊粉酶基因的上游。该启动子的类型可以是强表达型启动子、组织特异性启动或诱导型启动子，在实际中，可根据实际情况选择相应的启动子来进行驱动表达。

优选地，在本发明的一些实施方案中，表达盒包括了诱导型启动子，更优选地，该诱导型启动为甲醇诱导型启动子，在甲醇的诱导下，该启动子驱动上述的菊粉酶基因转录表达出菊粉酶。

优选地，在本发明的一些实施方案中，该表达盒还包括了信号肽序列，该信号肽序列位于启动子的下游与该菊粉酶基因的上游之间，用于引导菊粉酶的跨膜转移。

另一方面，本发明提供一种载体，其含有上述的表达盒，或者其含有上述的菊粉酶基因。

优选地，在本发明的一些实施方案中，单个载体上的表达盒的拷贝数为多个，可增加上述菊粉酶基因的表达量，进一步提高菊粉酶的表达量。

更优选地，在本发明的一些实施方案中，表达盒的拷贝数为两个。

优选地，在本发明的一些实施方案中，上述的载体为pAO815表达载体。上述的表达盒通过双酶切或单酶切后连接至pAO815表达载体上。

当外源基因毕赤酵母内大量表达时，外源蛋白由于无法及时折叠、加工而聚集在内质网中无法分泌到胞外，从而影响外源蛋白的分泌表达。内质网压力响应蛋白(HAC1)是UPR(unfolded protein reponse,UPR)过程中重要的信号传递分子，HAC1能与UPRE(Unfolded protein response element)结合，此时细胞会激活内质网非折叠蛋白质反应，促进UPRE目的基因持续表达；从而间接帮助蛋白分泌。

基于此，在本发明的一些实施方案中，上述载体还含有内质网压力响应蛋白基因，该内质网压力响应蛋白基因为HAC1基因。

将HAC1基因与上述的菊粉酶基因构建至同一个表达载体上，形成共表达载体，通过提高内质网折叠加工新生多肽链、分解未折叠和错误折叠蛋白的能力，进一步提高菊粉酶的表达量。

另一方面，本发明提供含有上述载体的重组细胞。

需要说明的是，该重组细胞可以是大肠杆菌，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞例如动物细胞等。其均属于本发明的保护范围。

优选地，在本发明的一些实施方案中，上述重组细胞由上述载体导入毕赤酵母菌后得到。

外源基因的异源表达，由于酵母宿主对异源基因密码子的偏好性，异源基因在毕赤酵母中难以获得高效表达。本发明通过密码子优化后，人工合成菊粉酶基因(SEQ ID NO:1)，使得该异源基因在毕赤酵母中获得高效表达。

再一方面，本发明提供上述菊粉酶基因在生产菊粉酶中的应用。

进一步地，上述应用包括：培养含有上述菊粉酶基因的重组细胞。例如，将含有上述pAO815表达载体(含上述菊粉酶基因)的毕赤酵母进行培养发酵，用相应诱导剂例如甲醇进行诱导后，再经过提纯即可得到菊粉酶。

还有一方面，本发明提供上述基因在生产果糖中应用。

进一步地，上述应用包括：采用由上述菊粉酶基因表达得到的菊粉酶与菊粉接触。通过菊粉酶对菌粉的水解作用得到果糖。

优选地，菊粉酶对菊粉的水解参数为：pH 5.0，温度50℃，菊粉浓度为15％，菊粉酶/菊粉比为5000U/g(即酶活力单位与底物质量比为5000U/g)，水解时间为4小时。

现在工业生产中制备果糖浆，一者是通过直接利用淀粉酶将淀粉水解成葡萄糖，在葡萄糖异构酶的作用下将葡萄糖异构成果糖，二者通过酸法和酶法将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，然后通过离子排斥层析从葡萄糖中分离果糖。本发明在前者的基础上对酶法制备果糖浆进行了深入的研究，并在制备工艺上进行了优化。可高效便捷且获得高纯度的果糖浆，产物中含有95％的果糖和5％的蔗糖。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

构建含菊粉酶单拷贝载体的菌株，方法如下。

1.1以马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)为出发材料，基于该外切型菊粉酶基因(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，将该基因的核苷酸序列进行密码子优化，并人工合成优化后的菊粉酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示，相应编码的菊粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本实施例通过密码子优化，该菊粉酶基因在密码子使用频率、RNA二级结构的复杂性等方面具有明显的改善。经过重新设计后，有效地提高了菊粉酶基因中含量较高氨基酸密码子的使用频率。同时，通过优化，有效地降低了mRNA二级结构的复杂性，有利于菊粉酶表达量的提高。

1.2根据SEQ ID NO:1，在合成的菊粉酶基因片段两端分别引入Kpn I和Xba I酶切位点，用Kpn I和Xba I双酶切菊粉酶基因片后、在T4连接酶的作用下，16℃过夜，将酶切后的菊粉酶基因片段连接到经相同酶切后的经胶回收后的毕赤酵母表达载体pAO815上，得到菊粉酶基因单拷贝载体，命名为pAO-INU，pAO-INU表达载体的图谱如图1所示。

该菊粉酶基因由甲醇型诱导子AOX1驱动表达，由AOX1TT终止子终止表达。

1.3利用电转仪将该pAO-INU载体转化入毕赤酵母中，然后在YPD平板(含氨苄(Ampicillin))上筛选得到阳性转化子，经PCR验证为准确的阳性转化子。得到含pAO-INU载体的单拷贝酵母菌株。提取质粒pAO-INU载体，进行Kpn I和Xba I双酶切验证，结果如图2所示(图中：M为DL5000DNA Marker，INU代表未酶切的pAO-INU载体，Digest代表双酶切的pAO-INU载体)。由图2可知，在1600bp位置有条带，表明菊粉酶基因成功连接至pAO815表达载体上。

实施例2

构建多拷贝菊粉酶基因表达载体

2.1通过同尾酶双酶切法获得菊粉酶的表达盒片段(AOX1启动子-菊粉酶基因-AOX1TT终止子)，再将表达盒片段连接到单拷贝菊粉酶基因表达载体(pAO-INU)上获得含有两拷贝菊粉酶基因的表达载体。具体方法如下。

2.1.1用Bgl II和BamH I双酶切实施例1得到的pAO-INU表达载体，获得含菊粉酶基因的表达盒5’AOX1-INU-3’AOX TT；酶切体系：40μL的载体、1.5μL的Bgl II、1.5μL的BamHI、20μL的10×Buffer、ddH₂O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h左右。琼脂糖凝胶电泳后、胶回收小片段即获得表达盒5’AOX1-INU-3’AOXTT；

2.1.2用BglII单酶切实施例1得到的pAO-INU载体，琼脂糖凝胶电泳、胶回收，获得酶切后的线性化的pAO-INU载体片段；

2.1.3在T4连接酶的作用下，16℃过夜，将得到的表达盒5’AOX1-INU-3’AOX TT连接至酶切后的线性化的pAO-INU载体片段上，得到具有两拷贝菊粉酶基因的表达载体，命名为pAO-INU-DU，pAO-INU-DU表达载体的图谱如图3所示。

2.1.4将pAO-INU-DU表达载体转到毕赤酵母感受态细胞中，筛选得到阳性克隆子，获得含pAO-INU-DU表达载体的两拷贝酵母菌株。

2.1.5在其他的实施例中，可根据上述方法，得到多拷贝菊粉酶基因的表达载体，分别转到毕赤酵母感受态细胞中，筛选得到阳性克隆子，获得多拷贝菊粉酶基因重组表达菌株。

实施例3

构建菊粉酶基因与内质网压力响应蛋白基因HAC1的共表达载体，HAC1基因的碱基序列如SEQ ID NO:3所示。

3.1.1根据HAC1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)，合成HAC1基因，将HAC1基因连接至pAO815表达载体上，得到pAO-HAC1表达载体(方法参考步骤1.2)。

3.1.2用Bgl II和BamH I双酶切得到的pAO-HAC1表达载体，获得含表达盒5’AOX1-HAC1-3’AOX TT，(方法参考步骤2.1.1)。

3.1.3在T4连接酶的作用下，16℃过夜，将得到的表达盒5’AOX1-HAC1-3’AOX TT连接至Bgl II单酶切后的pAO-INU载体片段上，得到两拷贝数的菊粉酶基因与HAC1基因共表达的表达载体，命名为pAO-INU-DU-HAC1，pAO-INU-DU-HAC1表达载体的图谱如图4所示。

3.1.4将pAO-INU-DU-HAC1表达载体转化到毕赤酵母感受态细胞，筛选得到阳性克隆子，得到含pAO-INU-DU-HAC1表达载体的共表达酵母菌株。

3.1.5经鉴定，上述得到的各种重组毕赤酵母菌种细胞呈白色球形，为好氧型酵母菌，生长过程中温度为28℃，产菊粉酶需要以甲醇为碳源进行诱导且最适温度为25℃，碳源和氮源分别为甲醇和蛋白胨。

实施例4

本实施例提供了一种生产菊粉酶的方法，如下。

将实施例1提供的含pAO-INU载体的单拷贝酵母菌、实施例2提供的含pAO-INU-DU载体的两拷贝酵母菌、实施例3提供的含pAO-INU-DU-HAC1载体的共表达酵母菌分别接种于装有30mL YPD培养基的250mL容量瓶中，28℃、170r/min恒温振荡培养。当OD₆₀₀约为3.0-6.0时，5000r/min离心5min收集菌体，加入25mL培养基BMGY，悬浮菌体，每24h加入甲醇进行诱导，并于25℃下继续培养96h，得到含菊粉酶的发酵液。

期间，于不同的时间点(第24/48/72/96/120h，接种时作为发酵起始点第0h)取发酵液，10000rpm，离心5min，取上清液并检测各上清液的酶活力，具体操作可参考文献[Sengupta S,Jana ML,Sengupta D,et al.A note on the estimation of microbialglycosidase activities by dinitrosalicylic acid reagent[J].AppliedMicrobiology and Biotechnology,2000,53(6):732-735]。结果如图5所示(图中：纵坐标表示酶活，单位为U/mL；横坐标为不同的时间点；INU代表单拷贝酵母菌，INU-DU代表两拷贝酵母菌，INU-DU-HAC1代表共表达酵母菌)。

由图5可看出，在第48h，两拷贝酵母菌的发酵液酶活性较高，在第72h、第96h、第120h，共表达酵母菌的发酵液酶活较高。

实施例5

本实施例提供了一种生产菊粉酶的方法，具体如下。

发酵在500-L台式发酵罐(江苏科海生物工程设备有限公司，型号：GB150-2011)中进行。将实施例3提供的含pAO-INU-DU-HAC1载体的共表达酵母菌接种于400mL YPD培养基，28℃、200r/min培养24h，得种子液。

再以体积比1/50的比例将种子液接种于基础盐发酵培养基(BSM)中。发酵前期营养生长阶段罐体温度为28℃、pH 6.0；甲醇诱导阶段罐体温度为25℃、pH6.0。甲醇流加阶段的前36h，甲醇流加速度为0.5-2.5mL/(L·h)；甲醇流加阶段的第36-72h，甲醇流加速度为2.0mL/(L·h)。发酵96h，结束发酵。期间于不同的是时间点(24h、48h、72h、96h)取发酵液，10000rpm，离心5min，取上清液并检测其菊粉酶活性。结果如图6所示(图中：纵坐标代表酶活，单位为U/mL，横坐标为不同的时间点)。

由图6可以看出，随着发酵时间的增加，发酵液的菊粉酶活性随之增加，表明菊粉酶的表达量也增加。

实施例6

不同类型酵母菌的菊粉酶表达量比较

6.1将马克思克鲁维酵母的外切型菊粉酶基因(SEQ ID NO:4，命名为菊粉酶起始基因，INU-1)连接至pAO815表达载体，并转化入毕赤酵母中，然后在YPD平板(含氨苄(Ampicillin))上筛选得到阳性转化子，经PCR验证为准确的阳性转化子。得到含pAO-INU-1载体的酵母菌(具体构建方法可参考实施例1)。

6.2培养含pAO-INU-1载体的酵母菌，获取上清(方法可参考实施例4)进行SDS-PEGE。

6.3培养含pAO-INU载体的单拷贝酵母菌，获取上清(方法同参考实施例4)，进行SDS-PEGE。结果如7所示(图中：M为蛋白Marker，1/2/3/4均代表含pAO-INU载体的单拷贝酵母菌的上清液，5/6/7/8均代表含pAO-INU-1载体的酵母菌的上清液，上样量均为5μL)。

由图7可看出，含pAO-INU载体的单拷贝酵母菌的发酵上清液的条带颜色较深，其中的菊粉酶含量较高，表明在酵母细胞中，本发明提供的经人工设计改造后的菊粉酶基因(SEQ ID NO:1)的表达量高于改造前的菊粉酶起始基因(SEQ ID NO:4)的表达量。

实施例7

分别取含pAO-INU载体的单拷贝酵母菌、含pAO-INU-DU载体的两拷贝酵母菌、含pAO-INU-DU-HAC1载体的共表达酵母菌以及含pAO-INU-1载体的酵母菌的发酵上清液进行SDS-PEGE，结果图8所示(图中：M为蛋白Marker，1为含pAO-INU-1载体的酵母菌的发酵上清液，2为含pAO-INU载体的单拷贝酵母菌的发酵上清液，3为含pAO-INU-DU载体的两拷贝酵母菌的发酵上清液，4为含pAO-INU-DU-HAC1载体的共表达酵母菌的发酵上清液，上样量均为5μL)。

由图8可看出，共表达酵母菌的发酵上清液中的菊粉酶含量最高，高于两拷贝酵母菌、单拷贝酵母菌以及含pAO-INU-1载体的酵母菌，说明，菊粉酶基因拷贝数的增加及其与HAC1基因共表达可以提高菊粉酶的表达量。

实施例9

本实施例提供了一种生产果糖的方法，具体如下。

本实施例采用由实施例5得到的菊粉酶接触菊粉，通过对菊粉的水解作用得到果糖。

优化反应体系：

9.1菊粉浓度对水解的影响；在pH 5.0，温度50℃，实施例5提到的酶液用量与菊粉底物的体积比为1:1，水解时间为0.5h，在一系列的菊粉浓度分别为8％，10％，15％，30％，50％条件下，通过TLC检测水解产物，发现底物浓度对菊粉的水解率有显著影响，当底物浓度为15％时，水解率接近100％，底物浓度高于15％，水解率下降明显。采用15％的菊粉用于以下实验。

9.2酶活力单位与菊粉质量比对菊粉水解率的影响；在pH 5.0，温度50℃，反应菊粉底物浓度15％，水解时间0.5h的条件下，设定了一系列不同的菊粉酶酶活力单位与菊粉底物重量比(U/g)，分别是：25000、12000、10500、7500、5000和4000，检测各比例下的菊粉的水解率。

结果显示，随着菊粉酶的增加，菊粉的水解率提高。同时，当酶量从5000变为12000时，其中的水解速率非常相似。考虑到水解时间设定为0.5小时，选择5000U/g的比例用于后续实验。

9.3水解时间对菊粉水解率的影响。在pH5.0，温度50℃，底物浓度为15％，酶/菊粉比为10000U/g的条件下，研究了水解时间对菊粉水解速率的影响。当反应时间为2小时，约95％的菊糖水解，当时间延长至大于4小时后，菊糖几乎100％地被水解成单糖。

9.4根据上述优化试验，菊粉的最佳水解参数为pH 5.0，温度50℃，菊糖浓度为15％，酶/菊粉比为5000U/g，水解时间为4小时。

9.5进一步通过将水解混合物放大到500mL来调节参数，并通过HPLC检查产物。在4小时水解后，具有不同链长的果糖聚合物的混合物完全水解，并且产物仅含有两种组分，果糖回收率为95％，其他物质葡萄糖至多为5％。

综上，本发明通过增加基因拷贝数和与内质网分泌相关蛋白共表达的方法，与已报道在自然界筛选产外切菊粉酶的菌株，通过基因工程的手段获得外切菊粉酶基因或将内切菊粉酶基因和外切菊粉酶基因共表达相比。提高了蛋白的表达水平和分泌效率。本发明构建的菌株与已报道的现有的菌株相比，酶活力具有更高的优势。

本发明对菊粉酶在水解菊粉制备果糖的工艺条件进行优化。与传统的果糖制备方法相比，获得果糖的方法更高效，环保，且纯度更高，果糖含量高达95％。

总之，本发明提供的适于编码菊粉酶的菊粉酶基因即菊粉酶基因(SEQ ID NO:1)，采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，并通过对次高频密码子的选用消除了基因中富含AT或GC的区域以及脂肪酶中的蛋白酶作用位点，大大地提高了该菊粉酶基因在毕赤酵母细胞中菊粉酶的表达量。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉轻工大学

<120> 一种菊粉酶基因及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1668

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaaattcg cgtactctct gctgctgccg ctggcgggtg tttctgcgtc tgttatcaac 60

tacaaacgtg acggtgactc taaagcgatc accaacacca ccttctctct gaaccgtccg 120

tctgttcact tcaccccgtc tcacggttgg atgaacgacc cgaacggtct gtggtacgac 180

gcgaaagaag aagactggca cctgtactac cagtacaacc cggcggcgac catctggggt 240

accccgctgt actggggtca cgcggtttct aaagacctga cctcttggac cgactacggt 300

gcgtctctgg gtccgggttc tgacgacgcg ggtgcgttct ctggttctat ggttatcgac 360

tacaacaaca cctctggttt cttcaactct tctgttgacc cgcgtcagcg tgcggttgcg 420

gtttggaccc tgtctaaagg tccgtctcag gcgcagcaca tctcttactc tctggacggt 480

ggttacacct tcgaacacta caccgacaac gcggttctgg acatcaactc ttctaacttc 540

cgtgacccga aagttttctg gcacgaaggt gaaaacggtg aagacggtcg ttggatcatg 600

gcggttgcgg aatctcaggt tttctctgtt ctgttctact cttctccgaa cctgaaaaac 660

tggaccctgg aatctaactt cacccaccac ggttggaccg gtacccagta cgaatgcccg 720

ggtctggtta aagttccgta cgactctgtt gttgactctt ctaactcttc tgactctaaa 780

ccggactctg cgtgggttct gttcgtttct atcaacccgg gtggtccgct gggtggttct 840

gttacccagt acttcgttgg tgacttcaac ggtacccact tcaccccgat cgacggtcag 900

acccgtttcc tggacatggg taaagactac tacgcgctgc agaccttctt caacaccccg 960

aacgaaaaag acgtttacgg tatcgcgtgg gcgtctaact ggcagtacgc gcagcaggcg 1020

ccgaccgacc cgtggcgttc ttctatgtct ctggttcgtc agttcaccct gaaagacttc 1080

tctaccaacc cgaactctgc ggacgttgtt ctgaactctc agccggttct gaactacgac 1140

gcgctgcgta aaaacggtac cacctactct atcaccaact acaccgttac ctctgaaaac 1200

ggtaaaaaaa tcaaactgga caacccgtct ggttctctgg aattccacct ggaatacgtt 1260

ttcaacggtt ctccggacat caaatctaac gttttcgcgg acctgtctct gtacttcaaa 1320

ggtaacaacg acgacaacga atacctgcgt ctgggttacg aaaccaacgg tggtgcgttc 1380

ttcctggacc gtggtcacac caaaatcccg ttcgttaaag aaaacctgtt cttcacccac 1440

cagctggcgg ttaccaaccc ggtttctaac tacaccacca acgttttcga cgtttacggt 1500

gttatcgaca aaaacatcat cgaactgtac ttcgacaacg gtaacgttgt ttctaccaac 1560

accttcttct tctctaccaa caacgttatc ggtgaaatcg acatcaaatc tccgtacgac 1620

aaagcgtaca ccatcaactc tttcaacgtt acccagttca acgtttaa 1668

<210> 2

<211> 555

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Phe Ala Tyr Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ala Gly Val Ser Ala

1 5 10 15

Ser Val Ile Asn Tyr Lys Arg Asp Gly Asp Ser Lys Ala Ile Thr Asn

20 25 30

Thr Thr Phe Ser Leu Asn Arg Pro Ser Val His Phe Thr Pro Ser His

35 40 45

Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr Asp Ala Lys Glu Glu

50 55 60

Asp Trp His Leu Tyr Tyr Gln Tyr Asn Pro Ala Ala Thr Ile Trp Gly

65 70 75 80

Thr Pro Leu Tyr Trp Gly His Ala Val Ser Lys Asp Leu Thr Ser Trp

85 90 95

Thr Asp Tyr Gly Ala Ser Leu Gly Pro Gly Ser Asp Asp Ala Gly Ala

100 105 110

Phe Ser Gly Ser Met Val Ile Asp Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Phe Phe

115 120 125

Asn Ser Ser Val Asp Pro Arg Gln Arg Ala Val Ala Val Trp Thr Leu

130 135 140

Ser Lys Gly Pro Ser Gln Ala Gln His Ile Ser Tyr Ser Leu Asp Gly

145 150 155 160

Gly Tyr Thr Phe Glu His Tyr Thr Asp Asn Ala Val Leu Asp Ile Asn

165 170 175

Ser Ser Asn Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp His Glu Gly Glu Asn

180 185 190

Gly Glu Asp Gly Arg Trp Ile Met Ala Val Ala Glu Ser Gln Val Phe

195 200 205

Ser Val Leu Phe Tyr Ser Ser Pro Asn Leu Lys Asn Trp Thr Leu Glu

210 215 220

Ser Asn Phe Thr His His Gly Trp Thr Gly Thr Gln Tyr Glu Cys Pro

225 230 235 240

Gly Leu Val Lys Val Pro Tyr Asp Ser Val Val Asp Ser Ser Asn Ser

245 250 255

Ser Asp Ser Lys Pro Asp Ser Ala Trp Val Leu Phe Val Ser Ile Asn

260 265 270

Pro Gly Gly Pro Leu Gly Gly Ser Val Thr Gln Tyr Phe Val Gly Asp

275 280 285

Phe Asn Gly Thr His Phe Thr Pro Ile Asp Gly Gln Thr Arg Phe Leu

290 295 300

Asp Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala Leu Gln Thr Phe Phe Asn Thr Pro

305 310 315 320

Asn Glu Lys Asp Val Tyr Gly Ile Ala Trp Ala Ser Asn Trp Gln Tyr

325 330 335

Ala Gln Gln Ala Pro Thr Asp Pro Trp Arg Ser Ser Met Ser Leu Val

340 345 350

Arg Gln Phe Thr Leu Lys Asp Phe Ser Thr Asn Pro Asn Ser Ala Asp

355 360 365

Val Val Leu Asn Ser Gln Pro Val Leu Asn Tyr Asp Ala Leu Arg Lys

370 375 380

Asn Gly Thr Thr Tyr Ser Ile Thr Asn Tyr Thr Val Thr Ser Glu Asn

385 390 395 400

Gly Lys Lys Ile Lys Leu Asp Asn Pro Ser Gly Ser Leu Glu Phe His

405 410 415

Leu Glu Tyr Val Phe Asn Gly Ser Pro Asp Ile Lys Ser Asn Val Phe

420 425 430

Ala Asp Leu Ser Leu Tyr Phe Lys Gly Asn Asn Asp Asp Asn Glu Tyr

435 440 445

Leu Arg Leu Gly Tyr Glu Thr Asn Gly Gly Ala Phe Phe Leu Asp Arg

450 455 460

Gly His Thr Lys Ile Pro Phe Val Lys Glu Asn Leu Phe Phe Thr His

465 470 475 480

Gln Leu Ala Val Thr Asn Pro Val Ser Asn Tyr Thr Thr Asn Val Phe

485 490 495

Asp Val Tyr Gly Val Ile Asp Lys Asn Ile Ile Glu Leu Tyr Phe Asp

500 505 510

Asn Gly Asn Val Val Ser Thr Asn Thr Phe Phe Phe Ser Thr Asn Asn

515 520 525

Val Ile Gly Glu Ile Asp Ile Lys Ser Pro Tyr Asp Lys Ala Tyr Thr

530 535 540

Ile Asn Ser Phe Asn Val Thr Gln Phe Asn Val

545 550 555

<210> 3

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggaaatga ctgattttga actaactagt aattcgcaat cgaacttggc tatccctacc 60

aacttcaagt cgactctgcc tccaaggaaa agagccaaga caaaagagga aaaggaacag 120

cgaaggatcg agcgtatttt gagaaacaga agagctgctc accagagcag agagaaaaaa 180

agactacatc tgcagtatct cgagagaaaa tgttctcttt tggaaaattt actgaacagc 240

gtcaaccttg aaaaactggc tgaccacgaa gacgcgttga cttgcagcca cgacgctttt 300

gttgcttctc ttgacgagta cagggatttc cagagcacga ggggcgcttc actggacacc 360

agggccagtt cgcactcgtc gtctgatacg ttcacacctt cacctctgaa ctgtacaatg 420

gagcctgcga ctttgtcgcc caagagtatg cgcgattccg cgtcggacca agagacttca 480

tgggagctgc agatgtttaa gacggaaaat gtaccagagt cgacgacgct acctgccgta 540

gacaacaaca atttgtttga tgcggtggcc tcgccgttgg cagacccact ctgcgacgat 600

atagcgggaa acagtctacc ctttgacaat tcaattgatc ttgacaattg gcgtaatcca 660

gaagcgcagt caggtttgaa ttcatttgaa ttgaatgatt tcttcatcac ttcatga 717

<210> 4

<211> 1668

<212> DNA

<213> 马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）

<400> 4

atgaagttcg catactccct cttgcttcca ttggcaggag tcagtgcttc agtgatcaat 60

tacaagagag atggtgacag caaggccatc actaacacca cttttagttt gaacagacct 120

tctgtgcatt tcactccatc ccatggttgg atgaacgatc caaatggttt gtggtacgat 180

gccaaggaag aagactggca tttgtactac cagtacaacc cagcagccac gatctggggt 240

actccattgt actggggtca cgctgtttcc aaggatttga cttcctggac agattacggt 300

gcttctttgg gcccaggttc cgacgacgct ggtgcgttca gtggtagtat ggttatcgat 360

tataacaata cttctggttt cttcaacagc tctgtggacc caagacaaag agcagttgca 420

gtctggactt tgtctaaggg cccaagccaa gcccaacaca tcagttactc attggacggt 480

ggttacacct tcgagcacta caccgacaac gccgtgttgg acatcaacag ctccaacttc 540

agagacccta aggtgttctg gcacgagggc gagaacggcg aagatggtcg ttggatcatg 600

gccgttgctg aatcgcaagt gttctctgtg ttgttctact cttctccaaa cttgaaaaac 660

tggaccttgg aatccaactt cacccaccac ggctggactg gtacccaata cgaatgtcca 720

ggtctagtta aggttccata cgacagtgtt gttgactctt cgaactcctc cgactccaag 780

ccagactccg catgggtctt gtttgtctct atcaaccctg gtggtccatt gggtggttcc 840

gttacccaat actttgttgg tgacttcaac ggtactcact tcactccaat cgacggccaa 900

accagattcc tagacatggg taaggactac tacgcactac aaactttctt caacactcca 960

aacgagaagg acgtctacgg tatcgcatgg gcttctaact ggcaatacgc ccaacaagcc 1020

ccaactgacc catggcgttc atctatgagt ttggttagac aattcacatt gaaagacttc 1080

agcacaaacc ctaactccgc tgatgtcgtc ttgaacagtc aaccagtctt gaactatgat 1140

gcattgagaa agaacggtac cacttacagt atcacaaact acaccgtcac ctccgaaaac 1200

ggcaagaaga tcaagctaga caacccatcc ggttctcttg aattccatct tgaatacgtg 1260

tttaacggct ccccagatat caagagcaac gtgttcgctg atctttcctt gtacttcaag 1320

ggtaacaacg acgacaacga atacttgaga ttgggttacg aaaccaacgg tggtgccttc 1380

ttcttggacc gtggccacac caagattcct ttcgtgaagg agaacttgtt cttcacccac 1440

caattggcag ttaccaaccc agtttccaac tacaccacaa acgtcttcga cgtttacggt 1500

gtcattgaca agaacatcat cgaattgtac ttcgataacg gtaacgtcgt ctccaccaac 1560

actttcttct tctctaccaa caacgttatt ggtgaaattg acatcaagtc gccatacgac 1620

aaggcttaca ccattaactc atttaacgtt acccaattta acgtttga 1668

Claims

1.一种菊粉酶基因，其适于编码菊粉酶，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种表达盒，其特征在于，其含有权利要求1所述的菊粉酶基因。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述菊粉酶基因由甲醇诱导型启动子驱动。

4.一种载体，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的表达盒。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述表达盒的拷贝数为多个。

6.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为pAO815表达载体。

7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体还含有内质网压力响应蛋白基因，所述内质网压力响应蛋白基因为HAC1基因。

8.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求4-7中任一项所述的载体。

9.权利要求1所述的菊粉酶基因在生产菊粉酶中的应用。

10.权利要求1所述的菊粉酶基因在生产果糖中的应用。