KR20180117190A

KR20180117190A - 3-에피머화 효소 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드

Info

Publication number: KR20180117190A
Application number: KR1020187028940A
Authority: KR
Inventors: 산융 왕; 춘룽 리; 스레이 한; 밍 옌; 먀오 웨이; 성 천; 즈린 장
Original assignee: 랑나이 바이오테크 컴퍼니 리미티드; 엘 엔드 피 푸드 인그리디언트 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2016-04-01
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2018-10-26
Also published as: CN105821027A; US20190136282A1; US10781467B2; CN105821027B; EP3438256A1; KR102068113B1; MX2018011980A; WO2017167255A1; EP3438256A4; EP3438256B1

Abstract

본 발명은 3-에피머화 효소, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성물, 벡터, 숙주 세포 및 상기 3-에피머화 효소를 생성하는 방법을 제공하고, 또한 상기 3-에피머화 효소의 용도를 제공한다.

Description

3-에피머화 효소 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드

본 발명은 3-에피머화 효소 활성을 가진 폴리펩티드 또는 단백질, 3-에피머화 효소 활성을 가진 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성물 또는 발현 벡터, 상기 효소를 생성하는 방법, 및 상기 효소의 다양한 산업에서의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 3-에피머화 효소 활성을 가진 폴리펩티드 또는 단백질을 사용하여 과당, 글루코스, 전분당 등의 단당 또는 혼합당을 D-알룰로스로 전환하는 방법, 및 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 사용하여 소르보스, 전분당 등의 단당 또는 혼합당을 D-타가토스로 전환하는 방법에 관한 것이다.

건강한 식생활에 대한 관심이 증가됨에 따라, 식품 업계에서는 건강하고 안전한 저칼로리 기능성 감미료를 중점적으로 연구하고 있다. D-알룰로스 및 D-타가토스는 자연계에 존재하는 희소한 천연 저칼로리 기능성 감미료로서, 중점 연구 대상으로 되었다.

D-알룰로스(D-allulose)는 D-리보스-2-케토헥소스라고도 하는데, D-과당의 C-3위의 에피머이다. D-알룰로스는 천연적으로 존재하는 희소한 저칼로리 기능성 감미료로서, 감미도가 수크로스의 70%이고, 칼로리가 수크로스의 0.3%에 불과하여 저칼로리 다이어트 식품의 감미료로 사용할 수 있으며, 아울러 D-알룰로스는 또한 간장 지질이 관련 효소를 합성하는 활성을 억제하는 기능을 가지고 있어 복부 지방의 축적을 감소하는데 도움이 되고, 체중을 어느 정도 제어할 수 있으며, 건강 식품 등 다양한 기능성 식품에 사용할 수 있다. 또한, D-알룰로스는 식품의 맛, 외관 등을 개선하여 식품의 유통기한을 연장할 수도 있다. 따라서, D-알룰로스와 같은 건강하고 안전한 저칼로리 기능성 감미료는 더욱더 많은 학자의 관심을 받게 되었고, 시장 경쟁력이 가장 높은 신규 감미료의 하나로 되었다.

D-알룰로스는 희소한 천연 단당이므로 자연계에서 추출되는 양이 적고 원가가 높아 저칼로리 건강 감미료로서의 요구를 만족하기 어렵고, 산업상의 대량생산에도 적절하지 않기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해 고효율적인 D-알룰로스 생산 방법이 필요하다. 전형적인 D-알룰로스 생산방법은 주로 화학법인데, 생산과정에서 비용이 많이 들고 수많은 부산물과 오염물이 발생한다. 그러나, 생물법은 D-알룰로스의 제조에서 반응 특이성이 강하며, 생성물 성분이 간단하고 쉽게 정제되며, 천연 제품에 속하는 등 특점이 있어 연구 중점 대상으로 되었다.

생물법을 통해 D-알룰로스를 제조하는 가장 효과적인 방법은 과당을 D-알룰로스로 전환시킬 수 있는 효소를 찾아내는 것이다. 그러나, 기존의 알룰로스-3-에피머화 효소는 고온에서 안정성이 떨어지거나 또는 활성이 낮고 반응 속도가 느리는 등 문제가 있어 D-알룰로스의 산업 생산의 원가 관리에 불리하다. 따라서, 고온 안정성이 우수하고 활성이 높은 알룰로스-3-에피머화 효소를 개발하여 산업 생산 요구를 만족하여야 한다.

D-타가토스(D-Tagatose)는 D-소르보스의 C-3위의 에피머이다. D-타가토스는 천연적으로 존재하는 희소한 저칼로리 기능성 감미료로서, 감미도가 수크로스의 92%이고 체내 흡수율이 20% ~ 25%로 낮아 생체 혈당 수치를 현저하게 변화시키지 않으므로 당뇨병 환자가 식용하기에 적절하며, 또한 대부분 타가토스는 직접 결장에 들어가 그 안에 있는 미생물 세균총에 의해 선택적으로 발효되어 유익균의 증식을 촉진하고 유해균의 성장을 억제함으로써 장내 세균총을 현저히 개선하는 작용을 하는 우수한 프리바이오틱스로서, 건강 식품 등 다양한 기능성 식품에 사용할 수 있다. 또한, D-타가토스는 식품의 맛, 외관 등을 개선할 수도 있다. 따라서, D-타가토스와 같은 건강하고 안전한 저칼로리 기능성 감미료는 더욱더 많은 학자의 관심을 받게 되었고, 시장 전망이 좋은 신규 감미료의 하나로 되었다.

소르보스를 D-타가토스로 이성화시키는 생물법은 D-타가토스를 제조하는 가장 효과적인 방법 중의 하나이며, 이러한 방법의 포인트는 소르보스를 D-타가토스로 전환시킬 수 있는 효소를 찾아내는 것이다. 기존의 타가토스-3-에피머화 효소는 고온에서 안정성이 떨어지거나 또는 활성이 낮고 반응 속도가 느리는 등 문제가 있어 D-타가토스의 산업 생산의 원가 관리 및 규모 확대에 불리하다. 따라서, 고온 안정성이 우수하고 활성이 높은 타가토스-3-에피머화 효소를 개발하여 산업 생산의 요구를 만족하여야 한다.

본 발명자는 Thermogemmatispora carboxidivorans 균종에서 3-에피머화 효소 활성을 가진 신규 단백질을 발견하였다. 이에 따라, 본 발명은 3-에피머화 효소 활성을 가진 신규 단백질, 및 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 알룰로스-3-에피머화 효소 활성 및 타가토스-3-에피머화 효소 활성을 가진다. 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 양호한 활성과 우수한 열안정성을 가지고 있는데, 이것은 고온에서 D-알룰로스 및 D-타가토스를 생산하는데 있어서 우수한 성능이다.

본 발명은 (a) 아미노산 서열이 SEQ ID No: 2와 적어도 70%의 서열 동일성을 가진 단백질 또는 폴리펩티드;

(b) 중간-고 엄격성 조건하에서, (i) SEQ ID No: 1의 폴리펩티드 코딩 서열, (ii) SEQ ID No: 1의 폴리펩티드 코딩 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전체 길이의 상보사슬;과 교잡하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO: 1의 단백질 또는 폴리펩티드 코딩 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 가진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 폴리펩티드가 하나 또는 복수(몇개)의 아미노산의 치환, 결핍 및/또는 삽입으로 이루어진 변이체;

(e) SEQ ID No: 2를 포함하거나 또는 SEQ ID No: 2로 구성된 (a), (b) 또는 (c) 중의 어느 하나의 단백질 또는 폴리펩티드; 및

(f) 알룰로스-3-에피머화 효소 활성 및 타가토스-3-에피머화 효소 활성을 가진 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)에 따른 단백질 또는 폴리펩티드의 단편;으로 이루어진 군에서 선택되는 알룰로스-3-에피머화 효소 활성 및 타가토스-3-에피머화 효소 활성을 가진 분리한 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성물, 발현 벡터, 재결합 숙주 세포 및 폴리뉴클레오티드 생성 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 효소법을 통해 D-알룰로스 및 D-타가토스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

정의

알룰로스-3-에피머화 효소 활성: 용어 “알룰로스-3-에피머화 효소 활성”은 과당의 C-3위를 D-알룰로스로 이성화하는 활성을 의미한다.

타가토스-3-에피머화 효소 활성: 용어 “타가토스-3-에피머화 효소 활성”은 소르보스의 C-3위를 D-타가토스로 이성화하는 활성을 의미한다.

분리한 단백질 또는 폴리펩티드: 용어 “분리한 단백질 또는 폴리펩티드”는 자연계의 단백질 또는 폴리펩티드에 대해 인위적으로 수식한 폴리펩티드를 의미한다. 하나의 측면에서, 폴리펩티드는 예를 들어 SDS-PAGE에 의해 측정되며, 그 순도는 적어도 1%, 예컨대 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%이다.

분리한 단백질 또는 폴리펩티드는 (1) 비천연적으로 존재하는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드; (2) 적어도 자연계에서 상호 결합한 하나, 복수 또는 모든 천연적으로 존재하는 성분으로부터 부분적으로 분리한 임의의 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩티드 또는 보조 인자를 포함하나 이에 제한되는 않는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드; (3) 자연계의 단백질 또는 폴리펩티드에 대해 인위적으로 수식한 임의의 단백질 또는 폴리펩티드; 또는 (4) 천연적으로 상호 결합한 다른 성분에 대해 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 양을 증가함으로써 수식되는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드;를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 분리한 단백질 또는 폴리펩티드는 발효액 샘플에 존재할 수 있다.

기본적으로 순수한 단백질 또는 폴리펩티드: 용어 “기본적으로 순수한 단백질 또는 폴리펩티드”는 단백질 또는 폴리펩티드의 제조물을 의미하며, 상기 단백질 또는 폴리펩티드 제조물은 최대 10 중량%의 그와 천연적으로 결합하거나 또는 재결합하는 다른 단백질 또는 폴리펩티드 재료를 포함한다. 바람직하게는, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 제조물에 존재하는 모든 단백질 또는 폴리펩티드 재료에 대해 적어도 90 중량%이다. 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 기본적으로 순수한 것이 바람직하는데, 예를 들어 공지된 재결합 방법 또는 전형적인 정제방법을 통해 폴리펩티드를 제조함으로써 이루어질 수 있다.

서열 동일성: 파라미터 “서열 동일성”은 2개의 아미노산 서열 사이 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 의미한다.

본 발명에 있어서, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성은 EMBOSS 소프트웨어 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 등, 2000, Trends in Genetics 16: 276-277)(바람직하게는 3.0.0버전 또는 더 높은 버전)와 같은 Needle 프로세스에서 수행되는 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman와 Wunsch, 1970，J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 측정한다. 사용되는 옵션 파라미터는 끊김 벌점(gap open penalty) 10, 끊김 확장 벌점(gap extension penalty) 0.5, EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. Needle에서 “최대의 동일성(longest identity)”으로 표시한 출력결과(-nobrief 옵션을 사용하여 획득)를 동일성 백분율로 사용하고, 다음과 같이 계산한다.

(동일한 잔기×100)/(대조 길이-대조 시 끊김의 총수)

본 발명에 있어서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성은 EMBOSS 소프트웨어 패키지(EMBOSS: The European Molecular Bi010 Open Software Suite, Rice 등, 전술한 내용 참조)(바람직하게는 3.0.0버전 또는 더 높은 버전)와 같은 Needle 프로세스에서 수행되는 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman와 Wunsch, 1970, 전술한 내용 참조)을 사용하여 측정한다. 사용되는 옵션 파라미터는 끊김 벌점 10, 끊김 확장 벌점 0.5, EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS버전) 치환 매트릭스한다. Needle에서 “최대의 동일성”으로 표시한 출력결과(-nobrief 옵션을 사용하여 획득)를 동일성 백분율로 사용하고, 다음과 같이 계산한다.

(동일한 디옥시리보뉴클레오티드×100)/(대조 길이-대조 시 끊김의 총수)

단편: 용어 “단편”은 성숙 폴리펩티드의 아미노기 및/또는 카복실기 말단에서 하나 또는 복수(몇개)의 아미노산이 결실된 폴리펩티드를 의미하며, 여기서 상기 단편은 3-에피머화 효소 활성을 가지고 있다.

대립 유전자 변이체(allelic variant): 용어 “대립 유전자 변이체”는 동일한 염색체 좌위를 차지하는 유전자의 임의의 2개 또는 2개 이상의 선택 가능한 형식을 의미한다. 대립 유전자 변이는 돌연 변이에 의해 자연적으로 발생되고, 개체군 내의 다형성을 야기할 수 있다. 유전자 돌연 변이는 침묵 변이(코딩된 폴리펩티드에서 변화되지 않음)일 수 있거나 또는 변화한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체는 유전자의 대립 유전자 변이체로 코딩한 폴리펩티드이다.

분리한 폴리뉴클레오티드: 용어 “분리한 폴리뉴클레오티드”는 자연계의 폴리뉴클레오티드에 대해 인위적으로 수식한 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 하나의 측면에서, 분리한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 아가로스겔 전기영동에 의해 측정되며, 순도가 1% 내지 95%이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 게놈, cDNA, RNA, 반합성, 합성의 근원 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

기본적으로 순수한 폴리뉴클레오티드: 용어 “기본적으로 순수한 폴리뉴클레오티드”는 다른 외부의 뉴클레오티드 또는 원하지 않는 뉴클레오티드를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드 제조물을 의미하고, 상기 폴리뉴클레오티드 제조물은 유전공학의 단백질 생산 시스템에 사용하는데 적절한 형태이다. 따라서, 기본적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 0.5 중량% 내지 10 중량%의 그와 천연적으로 결합하거나 또는 재결합하는 다른 폴리뉴클레오티드 재료를 포함한다. 그러나, 기본적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 천연적으로 존재하는 프로모터 및 터미네이터와 같은 5' 비해석부위 및 3' 비해석부위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 기본적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 90중량% 내지 99.5중량%이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 기본적으로 순수한 형태인 것이 바람직하다.

코딩 서열: 용어 “코딩 서열”은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 직접 정의하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일반적으로, 코딩 서열의 경계는 개방형 해독틀에 의해 결정되며, 상기 개방형 해독틀은 일반적으로 GTG 및 TTG와 같은 ATG 개시 코돈 또는 선택 가능한 개시 코돈으로 시작하여 TAA, TAG 및 TGA와 같은 종료 코돈으로 종결된다. 코딩 서열은 DNA, cDNA, 합성 또는 재결합한 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

cDNA: 용어 “cDNA”는 역전사를 통해 진핵 세포로부터 얻은 성숙하고 스플라이싱한 mRNA 분자로 제조할 수 있는 DNA 분자를 의미한다. cDNA는 해당 게놈 DNA에 일반적으로 존재하는 인트론 서열이 없다. 초기(initial)의 1차 RNA 전사물은 mRNA의 전구체이고, 일련의 단계(스플라이싱 포함)를 거친 후 성숙하고 스플라이싱한 mRNA로 나타낸다.

핵산 구성물: 용어 “핵산 구성물”은 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 분자를 의미하며, 천연적으로 존재하는 유전자로부터 분리되거나, 핵산 부분을 포함하도록 자연계에 존재하지 않는(not otherwise exist) 방식으로 수식하거나 또는 합성될 수 있다. 상기 핵산 구성물이 본 발명의 코딩 서열을 발현하는데 필요하는 조절 서열을 포함하는 경우, 용어 “핵산 구성물”은 용어 “발현 카세트”의 의미와 동일하다.

조절 서열(control sequence): 용어 “조절 서열”은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 대해 필수적인 모든 요소를 의미한다. 각 조절 서열은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 외부에서 유래하거나 또는 천연적인 것일 수 있고, 또는 서로에 대해 외부에서 유래하거나 또는 천연적인 것일 수 있다. 이러한 조절 서열들은 선도 서열, 폴리아데닐레이션 서열, 프로펩타이드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열 및 전사 터미네이터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 조절 서열은 적어도 프로모터, 전사 및 번역한 종료 신호를 포함한다. 조절 서열은 특이성 제한 부위를 인입하기 위한 링커와 함께 제공될 수 있으며, 상기 특이성 제한 부위는 조절 서열과 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코드 영역의 연결을 촉진한다.

조작 가능하게 연결: 용어 “조작 가능하게 연결”은 이러한 구성을 의미하며, 여기서 조절 서열을 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에 대한 적절한 위치에 설치하여 코딩 서열의 발현을 유도한다.

발현: 용어 “발현”은 폴리펩티드를 생성하는 모든 단계와 관련되며, 전사, 전사후 수식, 번역, 번역후 수식 및 분비를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

발현 벡터: 용어 “발현 벡터”는 선형 또는 환형 DNA 분자를 의미하고, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 그를 발현시키기 위한 별도의 뉴클레오티드와 조작 가능하게 연결된다.

숙주 세포: 용어 “숙주 세포”는 임의의 세포 유형을 의미하며, 상기 세포 유형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성물 또는 발현 벡터에 의한 전환, 트랜스펙션, 형질 도입 등에 대해 민감(susceptible)한 것이다. 용어 “숙주 세포”는 임의의 모세포의 자손을 포함하며, 복제과정에서 발생한 돌연 변이로 인해 모세포와 다르다.

변이체: 용어 “변이체”는 3-에피머화 효소 활성을 가진 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하며, 하나 또는 복수(몇개)의 위치에서 변화, 즉 하나 또는 복수(몇개)의 아미노산 잔기의 치환, 삽입과/또는 결핍을 포함한다. 치환은 상이한 아미노산으로 어느 위치에 있는 아미노산을 대체하는 것을 의미하고, 결핍은 어느 위치에 있는 아미노산을 분리하는 것을 의미하며, 삽입은 어느 위치에 있는 아미노산에 인접하게 1 ~ 3개의 아미노산을 첨가하는 것을 의미한다.

본 발명자는 Thermogemmatispora carboxidivorans 균 유래 에피머화 효소의 폴리펩티드의 특성을 연구하였으며, 과당을 D-알룰로스로 전환하고 소르보스를 D-타가토스로 전환하는 실험을 진행할 때, 상기 폴리펩티드가 과당 및 소르보스의 C-3위를 에피머화하여 D-알룰로스 또는 D-타가토스로 전환하는 기능을 가지고 있는 것을 발견하였다. 상기 실험은 Thermogemmatispora carboxidivorans 균 유래 에피머화 효소 유전자를 합성하며, 상기 유전자 발현 벡터를 포함하는 미생물을 배양하고 상기 폴리펩티드를 과발현하는 단계를 통해 진행한다. 실험에 따르면, 상기 폴리펩티드는 양호한 알룰로스-3-에피머화 효소 활성 및 타가토스-3-에피머화 효소 활성과 우수한 열안정성을 가지고 있는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 알룰로스-3-에피머화 효소 활성 및 타가토스-3-에피머화 효소 활성을 가진 폴리펩티드, 그리고 상기 알룰로스-3-에피머화 효소 활성 및 타가토스-3-에피머화 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 이용하여 D-알룰로스 또는 D-타가토스를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 에피머화 효소의 폴리펩티드의 특성을 확인하기 위해, 본 발명에서는 유전자 합성을 통해 Thermogemmatispora carboxidivorans 균주에서 상기 에피머화 효소로 표시한 폴리펩티드의 유전자를 획득하고, 표시한 에피머화 효소 유전자는 그 기능적 특징에 따라 정의된 것이 아니라 단지 DNA 염기 서열에 따라 정의된 것이다. 그 후, 획득한 에피머화 효소 유전자를 적절한 발현 벡터에 삽입하여 에피머화 효소 유전자를 포함하는 재결합 벡터를 생성하고, 상기 재결합 벡터를 적절한 미생물로 전환한다. 상기 전환한 미생물을 발효 배양기에 넣어 배양하고, 상기 미생물에서 상기 에피머화 효소 유전자의 폴리펩티드 생성물을 과발현한 후 상기 에피머화 효소 유전자의 폴리펩티드 생성물을 분리하고 정제하여 비축한다. 실험에 따르면, 상기 폴리펩티드는 알룰로스-3-에피머화 효소 활성 및 타가토스-3-에피머화 효소 활성을 가지고 있어 과당을 D-알룰로스로 전환할 수 있고, 또한 소르보스를 D-타가토스로 전환할 수 있는 것을 발견하였다.

본 발명의 방법에 의해 생성한 신규 3-에피머화 효소 활성을 가진 폴리펩티드는 이러한 아미노산 서열을 가질 수 있는데, 상기 서열은 SEQ ID No: 2의 아미노산 서열에 제한되지 않고 SEQ ID No: 2의 아미노산 서열 중의 일부 아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 결핍에 의해 형성한 아미노산 서열을 포함하며, 이러한 아미노산이 수식된 단백질 또는 폴리펩티드가 알룰로스-3-에피머화 효소 활성 및 타가토스-3-에피머화 효소 활성을 가지고 있으면 과당 또는 소르보스를 D-알룰로스 또는 D-타가토스로 전환할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서, 재결합 발현 벡터를 생성할 수 있는 발현 벡터는 유전자 재결합 기술에 일반적으로 사용되는 임의의 발현 벡터일 수 있고, 또한 예를 들어 pET-22b(+)일 수 있다. 재결합 발현 벡터에 의해 전환될 수 있는 미생물은 대장균(E. coli) BL21(DE3)일 수 있다. 그러나, 상기 미생물은 필요한 유전자를 포함하는 재결합 발현 벡터를 통해 전환한 후 상기 유전자를 발현하고, 과발현에 의해 활성 단백질 또는 폴리펩티드를 생성할 수 있는 것이라면 제한되지 않는다.

더욱 상세하게, 전환한 미생물을 배양하고 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 과발현을 유도하는 과정은 본 발명에서 보여준 실험방안에 따라 다음과 같이 수행할 수 있다. 저온에서 보존한 재결합 대장균을 50mL의 LB 배양기가 담겨져 있는 250mL 플라스크에 접종하고, 상기 균주를 600nm에서의 흡광도가 2.0에 도달할 때까지 37℃로 유지한 진탕기에서 배양한다. 상기 배양액을 15g/L 펩톤, 25g/L 효모 추출물, 10g/L 염화나트륨, 2g/L 글루코스, 3g/L 락토스로 이루어진 5L의 발효 배양기가 담겨져 있는 7L 발효조에 넣고, 상기 혼합물을 상기 발효조에 넣어 배양하여 본 발명의 단백질의 과발현을 유도한다. 발효 과정에서, 교반 속도는 500rpm, 환기량은 1.0vvm, 배양 온도는 37℃이고, 상기 배양 조건은 3-에피머화 효소의 대규모 생산에 유리하다.

과발현에 의해 생성한 단백질을 정제하기 위해, 상기 재결합 대장균 배양액을 6,000×g, 4℃에서 30분간 원심시킨 후 0.85% NaCl로 두번 세척한다. 그 후, 상기 세포를 다시 50mM의 pH 8.0 인산 나트륨 완충 용액(300mM의 NaCl을 포함)에 현탁하고, 상기 세포를 포함하는 완충 용액을 아이스 배스에 30분간 방치한다. 고압 균질기를 이용하여 상기 완충 용액 중의 세포를 분쇄하며, 분쇄한 세포를 13,000×g, 4℃에서 20분간 원심시키고 제거하여 상층액을 포어 크기가 0.45um인 여과막을 통해 여과한 후 저온에서 고속 단백질 액체 크로마토그래피를 통해 정제한다. 본 발명의 단백질을 포함하는 여액을 300mM의 NaCl과 10mM의 이미다졸을 포함하는 50mM의 pH 8.0 인산 나트륨 완충 용액으로 평형화한 HisTrap HP 컬럼에 넣는다. 그 후, 동일한 인산 나트륨 완충 용액으로 상기 HisTrap HP 컬럼을 세척하고, 농도 기울기가 10mM 내지 200mM인 이미다졸을 포함하는 동일한 인산 나트륨 완충 용액을 이용하여 1mL/min 유속으로 상기 컬럼에 부착한 단백질을 씻어낸다. 본 발명의 단백질을 포함하는 용리액을 50mM의 pH 7.5 인산 나트륨 완충 용액으로 평형화한 HiPrep 16/60 수지 컬럼에 넣어 이미다졸을 제거한 후 6mL/min의 속도로 상기 단백질을 용리한다. 이렇게 수집한 단백질 용액을 0.15M NaCl을 포함하는 50mM의 pH 7.5 인산 나트륨 완충 용액으로 평형화한 Sephacryl S-100 HR 컬럼에 넣어 6mL/min 유속으로 상기 단백질을 용리하고, 마지막으로 용리한 단백질을 50mM의 인산 나트륨 완충 용액에 넣어 투석한다.

이와 같이 획득한 본 발명의 단백질은 3-에피머화 효소이고, 상기 3-에피머화 효소의 단량체 분자량은 31770Da이다. 상기 3-에피머화 효소는 금속 효소이고, 금속 이온은 그의 활성을 현저하게 촉진한다.

본 발명의 다른 하나의 실시형태에 따르면, 3-에피머화 효소는 금속 이온 존재하에서 반응함으로써 과당으로 D-알룰로스를 생산하는 생산량을 향상시킬 수 있고, 소르보스로 D-타가토스를 생산하는 생산량을 향상시킬 수도 있다. 상기 금속 이온은 망간, 마그네슘 및 코발트로 이루어진 군에서 선택되며, 그 농도 범위는 0.5 ~ 5mM이고, 예컨대 1mM이다. 상기 금속 이온의 농도가 0.5 mM보다 낮으면, 전환율을 향상시키는 작용이 현저하지 못하고, 상기 금속 이온의 농도가 5mM보다 높으면 전환율에 현저한 차이가 없다.

상기 3-에피머화 효소와 과당 또는 소르보스 간의 반응은 농도 10 ~ 75%(w/w), pH 6 ~ 8, 온도 50 ~ 90℃인 기질(즉, 과당 또는 소르보스 용액)를 이용하여 진행할 수 있다. 상기 기질, 즉 과당 또는 소르보스의 농도가 10 ~ 75%(w/w) 범위일 때 D-알룰로스 또는 D-타가토스의 생산량이 양호하고 전환율이 높으며, 상기 범위의 pH와 온도는 3-에피머화 효소 활성에 대한 최적화의 pH와 온도 범위이다.

상기 3-에피머화 효소는 우수한 열안정성을 가지고 있으며, 60℃에서 12시간 보온한 후에도 활성이 저하되지 않고, 80℃에서 12시간 보온한 후에도 활성이 80% 이상을 유지하며, 90℃에서 8시간 보온한 후에도 50%의 잔여 활성이 있다. 상기 3-에피머화 효소의 우수한 열안정성은 고온에서 D-알룰로스와 D-타가토스를 생산하는데 있어서 양호한 성능이다.

본 발명의 다른 하나의 실시형태에 따르면, 상기 3-에피머화 효소가 과당을 D-알룰로스로 전환하고 소르보스를 D-타가토스로 전환하는 반응은 반응 과정에서 3-에피머화 효소를 벡터에 고정함으로써 진행할 수 있는데, 이것은 벡터에 고정한 3-에피머화 효소는 효소 활성을 장기적으로 유지하고 반복 사용할 수 있기 때문이다. 본 발명의 실시형태에 사용되는 벡터는 효소에 고정하는 용도의 임의의 공지된 벡터일 수 있고, 예를 들어 알긴산나트륨일 수 있다. 알긴산나트륨은 천연 콜로이드 다당으로서, 조류의 세포벽에 많이 존재하고, β-1,4 결합에 의해 무작위로 연결되는 β-D-만누론산 잔기와 α-L-글루론산 잔기를 포함한다. 따라서, 알긴산나트륨은 3-에피머화 효소를 안정적으로 고정하고 D-알룰로스 또는 D-타가토스의 높은 생산량을 구현하는데 유리하다. D-알룰로스 또는 D-타가토스의 최대 생산량을 구현하기 위해, 알긴산나트륨을 사용하여 3-에피머화 효소를 고정할 수 있으며, 그 농도는 1.5 ~ 4%(w/v)이고, 예를 들어 2.5%(w/v)이다. 알긴산나트륨을 3-에피머화 효소를 고정하는 벡터로 사용하는 경우, 상기 3-에피머화 효소 용액을 체적이 그의 1배 또는 2배인 알긴산나트륨 수용액에 넣은 후 시린지 펌프 및 진공 펌프를 이용하여 상기 혼합물을 0.2M 칼슘 이온 용액에 한 방울씩 적하하여 3-에피머화 효소-알긴산나트륨 복합체 볼을 형성한다. 이러한 3-에피머화 효소-알긴산나트륨 복합체 볼은 과당을 D-알룰로스로 전환하고 소르보스를 D-타가토스로 전환하는 반응에 직접 사용할 수 있다.

본 발명의 3-에피머화 효소는 과당 및 소르보스에 대해 모두 양호한 활성과 우수한 열안정성을 가지고 있으며, 이것은 고온에서 D-알룰로스 및 D-타가토스를 생산하는데 있어서 우수한 성능이다. 본 발명의 실시형태에 따른 D-알룰로스 및 D-타가토스 생산 방법은 미생물 유래 효소를 사용하므로 친환경적인 방법이며, 또한 간단한 효소 고정화 과정을 요구하고 D-알룰로스 및 D-타가토스의 생산량과 생산 효율을 현저하게 향상하므로 생산 원가를 낮추고 생산 효율을 최대화한다.

이렇게 생산한 D-알룰로스 및 D-타가토스는 식품 또는 약물의 첨가제로 유용할 수 있다.

본 발명의 3-에피머화 효소는 과당 및 소르보스에 대해 모두 양호한 활성과 우수한 열안정성을 가지고 있으며, 이것은 고온에서 D-알룰로스 및 D-타가토스를 생산하는데 있어서 우수한 성능이다. 본 발명의 실시형태에 따른 D-알룰로스 및 D-타가토스의 생산 방법은 미생물 유래 효소를 사용하므로 친환경적인 방법이며, 또한 간단한 효소 고정화 과정을 요구하고 D-알룰로스 및 D-타가토스의 생산량과 생산 효율을 현저하게 향상하므로 생산 원가를 낮추고 생산 효율을 최대화한다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 3-에피머화 효소를 생산하는 흐름도이다.
도 2-1은 본 발명의 실시예 5에서 3-에피머화 효소 활성에 대한 pH의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2-2는 본 발명의 실시예 5에서 3-에피머화 효소 활성에 대한 온도의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 6의 온도-활성 관계도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 7에서 3-에피머화 효소를 이용하여 과당을 D-알룰로스로 전환하는 전환율 모식도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 11에서 3-에피머화 효소를 이용하여 소르보스를 D-타가토스로 전환하는 전환율 모식도이다.

이하, 구체적인 실시예를 참고하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이러한 실시예들은 예시에 불과하고, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.

시험 실시예에서, 과당 및 소르보스를 기질로 이용하여 그 효소 활성을 측정하였다. 그 효소 활성을 측정하기 위해, 3-에피머화 효소와 10% 과당 또는 소르보스를 포함하는 50mM의 pH 7.5 인산 나트륨 완충 용액을 혼합하고, 60℃에서 20분간 반응시킨 후 100℃에서 상기 반응 용액을 15분간 가열하여 상기 반응을 종지한다. 상기 과당 또는 소르보스를 포함하는 인산 나트륨 완충 용액은 과당 또는 소르보스를 60 ~ 70%(w/v) 농도로 pH 7 ~ 8 인산 나트륨 완충 용액에 용해하여 제조한 것이고, 상기 과당 또는 소르보스를 포함하는 인산 나트륨 완충 용액을 60℃로 유지한 생물 반응기에 지속적으로 넣는다. 그 효소 활성을 편리하게 비교하기 위해, 단위 알룰로스-3-에피머화 효소를 pH 7.5, 60℃ 조건하에서 1분간당 1몰의 D-알룰로스를 생산하는데 필요하는 알룰로스-3-에피머화 효소의 양으로 정의하고, 단위 타가토스-3-에피머화 효소를 pH 7.5, 60℃ 조건하에서 1분간당 1몰의 D-타가토스를 생산하는데 필요하는 타가토스-3-에피머화 효소의 양으로 정의한다. 과당, D-알룰로스, 소르보스, D-타가토스의 농도는 BP-100 칼슘 이온 탄화수소 컬럼과 RI 검출기를 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정되며, 컬럼 온도가 80℃이고, 이동상이 초순수이며, 유속이 0.5 mL/min이다.

실시예 1: 3-에피머화 효소의 생산

3-에피머화 효소 유전자는 Thermogemmatispora carboxidivorans에서 에피머화 효소로 표시한 폴리펩티드의 유전자를 합성함으로써 획득한 것이며, 상기 에피머화 효소 유전자는 그 기능적 특징이 아니라 단지 서열에 따라 정의된 것이다. 제한 효소 NdeI 및 XhoI를 이용하여 획득한 에피머화 효소 유전자를 발현 벡터 pET-22b(+)에 삽입함으로써 재결합 발현 벡터 pET-22b(+)/에피머화 효소를 생성한다(도 1 참조). 일반적인 전환 방법을 통해 상기 재결합 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)로 전환한다. 전환하여 얻은 재결합 대장균 BL21(DE3)을 -80℃의 초저온 냉장고에 보존한다.

그 후, 상기 재결합 대장균을 50mL의 LB 배양기가 담겨져 있는 250mL의 삼각 플라스크에 접종하고, 배양액을 파장 600nm에서의 흡광도가 2.0에 도달할 때까지 37℃의 진탕기에서 배양하고 활성화시킨다. 상기 배양액을 5L의 발효 배양기가 담겨져 있는 7L의 발효조에 넣고 발효 배양하여 3-에피머화 효소의 대규모 생산을 구현한다. 발효 과정에서, 교반 속도를 500rpm, 환기량을 1.0vvm, 배양 온도를 37℃로 유지한다.

실시예 2: 3-에피머화 효소의 정제

3-에피머화 효소의 성질을 정의하기 위해, 친화 크로마토그래피(HisTrap HP 컬럼), HiPrep 16/60 컬럼 및 Sephacryl S-100 HR 컬럼을 이용하여 3-에피머화 효소를 정제한다.

상기 정제한 3-에피머화 효소의 분자량을 측정한 결과, 상기 3-에피머화 효소 단량체 분자량이 31770Da인 것을 발견하였다. 상기 3-에피머화 효소의 아미노산 서열이 NCBI 등록 번호 WP_052889376의 아미노산 서열과 동일한 것을 확인하였다.

실시예 3: 3-에피머화 효소의 금속 의존성

실시예 3에서, 상기 3-에피머화 효소에 대한 금속 이온의 영향을 연구하기 위해, 상이한 금속 이온 존재하에서 과당을 기질로 하여 그 활성에 대한 영향을 측정하는데, 측정은 EDTA로 상기 3-에피머화 효소를 처리한 후 3-에피머화 효소 용액에 1mM의 하기 표 1에 나타낸 각종 금속 이온을 넣어 진행한다. 상기 3-에피머화 효소는 0.04U/mL의 3-에피머화 효소 및 10%(w/v)의 과당을 포함하는 50 mM의 pH 7.5 Tris 완충 용액에서 60℃로 20분간 반응한 후 상기 반응 용액을 100℃에서 15분간 가열하여 상기 반응을 종지함으로써 상기 3-에피머화 효소의 활성을 측정한다.

그 결과, 상기 3-에피머화 효소가 금속 의존성을 가지고 있고, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 마그네슘, 망간 및 코발트 이온은 그 효소 활성을 증가하고, 구리 및 아연 이온은 그 효소 활성을 억제한다.

표 1

실시예 4: 3-에피머화 효소의 기질 특이성

상기 3-에피머화 효소는 0.04U/ml의 상기 3-에피머화 효소 및 10mM의 하기 표 2에 나타낸 각종 단독적인 단당을 포함하는 50mM의 인산 나트륨 완충 용액에서 pH 7.5, 60℃로 20분간 반응한 후，각 반응 용액을 100℃에서 15분간 가열하여 상기 반응을 종지함으로써 각 반응 용액에서의 상기 3-에피머화 효소의 활성을 측정한다.

그 결과, 상기 3-에피머화 효소는 D-과당, D-알룰로스, D-소르보스, D-타가토스에 대해 모두 활성을 가지고 있으며, 상기 3-에피머화 효소는 D-알룰로스를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 D-타가토스를 생산할 수도 있다.

표 2

실시예 5: 3-에피머화 효소 활성에 대한 pH 및 온도의 영향

실시예 5에서, 서로 다른 pH 및 온도가 상기 3-에피머화 효소 활성에 대한 영향을 연구하기 위해, 서로 다른 온도 및 pH 조건하에서 과당을 기질로 하여 그 활성에 대한 영향을 측정하고, 서로 다른 온도 및 pH 조건하에서의 효소 활성을 비교하였다. pH의 작용을 연구하기 위해, 상기 3-에피머화 효소를 0.04U/mL의 상기 3-에피머화 효소 및 10%(w/v)의 과당을 포함하는 50mM의 pH 범위가 6.0 ~ 8.5 인산 나트륨 완충 용액에서 반응시킨다. 여기서, 각 반응을 60℃, 금속 이온 무첨가의 조건하에서 20분간 진행한 후 100℃에서 15분간 가열하여 상기 반응을 종지하고 그 효소 활성을 측정한다. 그 결과는 도 2-1과 같다.

온도의 작용을 연구하기 위해, 상기 반응을 0.04U/mL의 상기 3-에피머화 효소 및 10%(w/v)의 과당을 포함하는 50mM의 인산 나트륨 완충 용액에서 온도 범위 40 ~ 90℃, pH 7.5로 20분간 진행한다. 100℃에서 15분간 가열하여 상기 반응을 종지하고 그 효소 활성을 측정한다. 그 결과는 도 2-2와 같다.

그 결과, 상기 3-에피머화 효소의 최적 pH 및 온도는 각각 7.5와 90℃이다.

도 2-1은 본 발명의 실시형태의 조건하에서 3-에피머화 효소 활성에 대한 pH의 영향을 나타낸 그래프이다.

도 2-2는 본 발명의 실시형태의 조건하에서 3-에피머화 효소 활성에 대한 온도의 영향을 나타낸 그래프이다.

실시예 6: 3-에피머화 효소의 열안정성

실시예 6에서, 상기 3-에피머화 효소의 열안정성을 연구하기 위해 상기 3-에피머화 효소를 각각 서로 다른 온도 조건하에서 보온하고, 상이한 시간에 샘플링하여 과당을 기질로 하여 그 잔여 활성을 측정한다. 측정은 상기 3-에피머화 효소를 각각 50℃, 60℃, 70℃, 80℃ 및 90℃의 워터 배스에서 보온한 후 1시간마다 샘플링함으로써 진행된다. 상기 3-에피머화 효소는 0.04U/mL의 3-에피머화 효소 및 10%(w/v)의 과당을 포함하는 50mM의 pH 7.5 인산 나트륨 완충 용액에서 반응한 후 상기 반응 용액을 100℃에서 15분간 가열하여 상기 반응을 종지함으로써 상기 3-에피머화 효소의 활성을 측정한다. 그 결과는 도 3과 같다.

그 결과, 상기 3-에피머화 효소는 우수한 열안정성을 가지고 있으며, 60℃에서 12시간 보온한 후에도 활성이 저하되지 않고, 80℃에서 12시간 보온한 후에도 활성이 80% 이상을 유지하며, 90℃에서 8시간 보온한 후에도 50%의 잔여 활성이 있다.

실시예 7: 3-에피머화 효소를 이용하여 과당을 D-알룰로스로 전환하는 전환율

실시예 7에서, 상기 3-에피머화 효소를 0.04U/mL의 상기 3-에피머화 효소, 1mM의 코발트 이온 및 10%(w/v)의 과당을 포함하는 50mM의 pH 7.5 인산 나트륨 완충 용액에서 온도 범위 40 ~ 90℃ 조건으로 12시간 충분히 반응시킨다. 그 후, 100℃에서 15분간 가열하여 상기 반응을 종지하여 샘플에서의 과당 및 D-알룰로스의 함유량을 측정한다. 그 결과는 도 4와 같다.

그 결과, 12시간 후 상기 3-에피머화 효소가 과당을 D-알룰로스로 전환하는 전환율은 90℃일 때 39%로 가장 높고, 50℃일 때 22%로 가장 낮으며, 60℃일 때 37%이다.

실시예 8: 3-에피머화 효소에 의한 D-알룰로스의 생산

고농도의 D-알룰로스를 생산하기 위해, 상기 반응을 10U/mL의 상기 3-에피머화 효소, 1mM의 코발트 이온 및 700g/L의 과당을 포함하는 50mM의 pH 7.5 인산 나트륨 완충 용액에서 60℃로 진행한다. 그 후, 상이한 반응 시점에서 샘플링하고, 100℃에서 15분간 가열하여 상기 반응을 종지함으로써 샘플에서의 D-알룰로스의 농도를 측정한다. 상이한 반응 시간에 따른 D-알룰로스 생산량은 하기 표 3과 같다.

표 3

결과에 따르면, 6시간 반응한 후 259g/L의 D-알룰로스를 생성하고, 그 전환율이 약 37%이다.

실시예 9: 효소 고정화에 의한 D-알룰로스의 생산

상기 D-알룰로스 생산방법의 효율을 연구하기 위해, 상기 3-에피머화 효소를 고정화한다. 고정화한 3-에피머화 효소의 생산량을 측정하고, 이를 고정하지 않는(유리하는) 3-에피머화 효소의 생산량과 비교한다.

벡터에 고정한 3-에피머화 효소에 대해 3-에피머화 효소-알긴산나트륨 복합체 볼을 사용하는데, 상기 볼은 3-에피머화 효소 용액을 체적이 그의 1.5배인 2.5%(w/v)의 알긴산나트륨 용액에 넣은 후 시린지 펌프 및 진공 펌프를 이용하여 상기 혼합물을 0.2M 칼슘 이온 용액에 첨가함으로써 제조된다.

고정된 3-에피머화 효소를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 7과 동일하게 상기 반응을 진행한다. 상기 반응에 사용되는 3-에피머화 효소의 양은 10U/mL이고, D-알룰로스 생산율을 측정한다. 그 결과는 하기 표 4와 같다.

표 4

결과에 따르면, 고정화된 3-에피머화 효소는 8시간 반응한 후 최대 생산량이 258g/L에 도달하고 전환율이 약 37%이며, 유리하는 3-에피머화 효소에 비해 반응 속도가 약간 느리지만 연속 생산에 더 유리하고 D-알룰로스의 고효율 생산을 구현한다.

실시예 10: 생물 반응기에서의 D-알룰로스의 생산량

하기 반응을 생물 반응기에서 진행하여 실시예 9의 고정화된 3-에피머화 효소의 생산량을 검증한다.

먼저, 실시예 9와 동일하게 상기 고정화된 3-에피머화 효소 및 과당을 제조하며, 과당을 상기 고정화된 3-에피머화 효소에 첨가하고 상기 혼합물의 체적을 100mL로 조절한 후 상기 고정화된 3-에피머화 효소와 과당의 혼합물로 높이 100cm, 직경 2.6cm의 생물 반응기를 채우고 유속 10mL/h, 60℃에서 상기 반응을 진행한다. 사용하는 3-에피머화 효소의 양은 500U이고, 사용하는 과당의 농도는 600g/L로 제한되는데, 이것은 장시간의 처리 과정에서 과량의 과당이 침전될 수 있기 때문이다. 그 결과는 하기 표 5와 같다.

표 5

결과에 따르면, 3-에피머화 효소와 과당 간의 반응은 30일 동안의 시험 주기에서 안정적이고, 과당에서 D-알룰로스로의 전환율이 37%이며, 생성물인 D-알룰로스의 농도가 220g/L이다. 그 생산량은 당류의 대규모 생산 요구를 만족할 수 있다.

따라서, 본 발명은 산업상의 대규모 생산을 구현할 수 있는 생물 반응기를 이용하는 D-알룰로스 생산 시스템을 제공할 수 있다.

실시예 11: 3-에피머화 효소를 이용하여 소르보스를 D-타가토스로 전환하는 전환율

실시예 11에서, 상기 3-에피머화 효소를 0.04U/mL의 상기 3-에피머화 효소, 1mM의 코발트 이온 및 10%의 소르보스를 포함하는 50mM의 pH 7.5 인산 나트륨 완충 용액에서 온도 범위 40 ~ 90℃로 12시간 충분히 반응시킨다. 그 후, 100℃에서 15분간 가열하여 상기 반응을 종지하고, 샘플에서의 소르보스와 D-타가토스의 함유량을 측정한다. 그 결과는 도 5와 같다.

결과에 따르면, 12시간 후 상기 3-에피머화 효소가 소르보스를 D-타가토스로 전환하는 전환율은 90℃일 때 36%로 가장 높고, 50℃일 때 29%로 가장 낮으며, 60℃일 때 34%이다.

실시예 12: 3-에피머화 효소에 의한 D-타가토스의 생산

고농도의 D-타가토스를 생산하기 위해, 상기 반응을 20U/mL의 상기 3-에피머화 효소, 1mM의 코발트 이온 및 500g/L의 소르보스를 포함하는 50mM의 pH 7.5 인산 나트륨 완충 용액에서 60℃로 진행한다. 그 후, 상이한 반응 시점에서 샘플링하고, 100℃에서 15분간 가열하여 상기 반응을 종지함으로써 샘플에서의 D-타가토스의 농도를 측정한다. 상이한 반응 시간에 따른 D-타가토스의 생산량은 하기 표 6과 같다.

표 6

결과에 따르면, 8시간 반응한 후 171g/L의 D-타가토스를 생산하고, 전환율이 약 34%이다.

실시예 13: 효소의 고정화에 의한 D-타가토스의 생산

상가 D-타가토스 생산방법의 효율을 연구하기 위해, 상기 3-에피머화 효소를 고정화시킨다. 고정화된 3-에피머화 효소의 생산량을 측정하고, 고정하지 않는(유리하는) 3-에피머화 효소의 생산량과 비교한다.

벡터에 고정한 3-에피머화 효소에 대해 3-에피머화 효소-알긴산나트륨 복합체 볼을 사용하는데, 상기 볼은 3-에피머화 효소 용액을 체적이 그의 1.5배인 2.5%(w/v)의 알긴산나트륨 용액에 첨가한 후 시린지 펌프 및 진공 펌프를 이용하여 상기 혼합물을 0.2M 칼슘 이온 용액에 첨가함으로써 제조된다.

상기 반응은 고정화된 3-에피머화 효소를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 12와 동일하게 진행한다. 상기 반응에 사용되는 3-에피머화 효소의 양은 20U/mL이고, D-타가토스의 생산율을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 7과 같다.

표 7

결과에 따르면, 고정화된 3-에피머화 효소는 10시간 반응한 후 170g/L의 최대 생산량을 달성하고 전환율이 약 34%이며, 유리하는 3-에피머화 효소에 비해 반응 속도가 약간 느리지만 연속 생산에 더욱 유리하고 D-타가토스의 고효율 생산을 구현한다.

실시예 14: 생물 반응기에서의 D-타가토스의 생산량

생물 반응기에서 하기 반응을 진행하여 실시예 13의 고정화된 3-에피머화 효소의 생산량을 검증한다.

먼저, 실시예 13과 동일하게 상기 고정화된 3-에피머화 효소 및 소르보스를 제조하며, 소르보스를 상기 고정화된 3-에피머화 효소에 첨가하고 상기 혼합물의 체적을 100mL로 조절한 후, 상기 고정화된 3-에피머화 효소와 소르보스의 혼합물로 높이 100cm, 직경 2.6 cm의 생물 반응기를 채우고, 유속 10mL/h, 60℃에서 상기 반응을 진행한다. 사용되는 3-에피머화 효소의 양은 400U이고, 사용되는 소르보스의 농도는 400g/L이다. 그 결과는 하기 표 8과 같다.

표 8

결과에 따르면, 3-에피머화 효소와 소르보스 간의 반응은 30일 동안의 시험 주기에서 안정적이며, 소르보스에서 D-타가토스로의 전환율은 34%이고, 생성물인 D-타가토스의 농도는 170g/L이다. 그 생산량은 당류의 대규모 생산 요구를 만족할 수 있다.

따라서, 본 발명은 산업상의 대규모 생산을 구현할 수 있는 생물 반응기를 이용하는 D-타가토스 생산 시스템을 제공할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> LANGNAI BIOTECH CO., LTD <120> 3-EPIMERASE AND POLYNUCLEOTIDE ENCODING SAME <130> 2016 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 873 <212> DNA <213> Thermogemmatispora carboxidivorans <400> 1 atgaagcaga aaatcggtat tcacgcgttc gtgtgggttg gtggctggag cgaggaagag 60 tgccgtcaag cgctggagag cagccgtgcg agcggttacg acctgatcga gattccgctg 120 ctggaaccgg cggcgatcga tgtggcgctg acccgtagcc tgctggagaa gaccggtctg 180 gaagcgacct gcaccctggc gctgaccccg gaaaccgaca tcagcagcac cgatgaggcg 240 attgttgcgc gtggtgaacg tctgctgcac gacgcgctgg cggtggcgcg tgatctgggt 300 gcgagctacc tgggtggcgt tattttcggc gcgctgaccc gttatcgtga gccgctggcg 360 ccggcgggtc gtctgaacag catgcgtgtg ctggcgcgtc tggcggaaca ggcggcggtt 420 aacggtatgc aactgggcct ggaagtggtt aaccgttacg aaagcaactt tctgaacacc 480 gcggagcagg cgctgaacct gatcgaagag attggcgcgc cgaacctggt ggttcacctg 540 gacacctatc acatgaacat cgaagaggaa aacttcgtga agccggtggt tgcgtgcggt 600 aaacgtctgg gctacgtgca cgttggtgaa agccaccgtg gctatctggg taccggcacc 660 gtggattttc cgggtttctt tcgtgcgctg cgtcaggcgg gttatcaagg cccggttacc 720 ttcgagagct ttagccgtgc gcaagaaatc gcgaacctga gcggtagcct ggcgatttgg 780 cgtcacacct ggaccgaccg tttcgatctg gcgcgtcagg cgcgtgcgtt tattgcggcg 840 ggtctggagg cgaccgacac ccaagaagat taa 873 <210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Thermogemmatispora carboxidivorans <400> 2 Met Lys Gln Lys Ile Gly Ile His Ala Phe Val Trp Val Gly Gly Trp 1 5 10 15 Ser Glu Glu Glu Cys Arg Gln Ala Leu Glu Ser Ser Arg Ala Ser Gly 20 25 30 Tyr Asp Leu Ile Glu Ile Pro Leu Leu Glu Pro Ala Ala Ile Asp Val 35 40 45 Ala Leu Thr Arg Ser Leu Leu Glu Lys Thr Gly Leu Glu Ala Thr Cys 50 55 60 Thr Leu Ala Leu Thr Pro Glu Thr Asp Ile Ser Ser Thr Asp Glu Ala 65 70 75 80 Ile Val Ala Arg Gly Glu Arg Leu Leu His Asp Ala Leu Ala Val Ala 85 90 95 Arg Asp Leu Gly Ala Ser Tyr Leu Gly Gly Val Ile Phe Gly Ala Leu 100 105 110 Thr Arg Tyr Arg Glu Pro Leu Ala Pro Ala Gly Arg Leu Asn Ser Met 115 120 125 Arg Val Leu Ala Arg Leu Ala Glu Gln Ala Ala Val Asn Gly Met Gln 130 135 140 Leu Gly Leu Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Ser Asn Phe Leu Asn Thr 145 150 155 160 Ala Glu Gln Ala Leu Asn Leu Ile Glu Glu Ile Gly Ala Pro Asn Leu 165 170 175 Val Val His Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Glu Asn Phe 180 185 190 Val Lys Pro Val Val Ala Cys Gly Lys Arg Leu Gly Tyr Val His Val 195 200 205 Gly Glu Ser His Arg Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Thr Val Asp Phe Pro 210 215 220 Gly Phe Phe Arg Ala Leu Arg Gln Ala Gly Tyr Gln Gly Pro Val Thr 225 230 235 240 Phe Glu Ser Phe Ser Arg Ala Gln Glu Ile Ala Asn Leu Ser Gly Ser 245 250 255 Leu Ala Ile Trp Arg His Thr Trp Thr Asp Arg Phe Asp Leu Ala Arg 260 265 270 Gln Ala Arg Ala Phe Ile Ala Ala Gly Leu Glu Ala Thr Asp Thr Gln 275 280 285 Glu Asp 290

Claims

(a) 아미노산 서열이 SEQ ID No: 2와 적어도 70%, 예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 심지어 100%의 서열 동일성을 가진 폴리펩티드 또는 단백질;
(b) 중간-고 엄격성 조건하에서, (i) SEQ ID No: 1의 폴리펩티드 코딩 서열, (ii) SEQ ID No: 1의 폴리펩티드 코딩 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전체 길이의 상보사슬;과 교잡하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질;
(c) SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드 코딩 서열과 적어도 70%, 예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 심지어 100%의 서열 동일성을 가진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질;
(d) SEQ ID NO: 2의 폴리펩티드 또는 단백질이 하나 또는 복수(몇개)의 아미노산의 치환, 결핍 및/또는 삽입으로 이루어진 변이체;
(e) 아미노산 서열이 SEQ ID No: 2를 포함하거나 또는 SEQ ID No: 2로 구성된 (a), (b) 또는 (c) 중의 어느 하나의 폴리펩티드 또는 단백질; 및
(f) 3-에피머화 효소 활성을 가진 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)에 따른 폴리펩티드 또는 단백질의 단편;으로 이루어진 군에서 선택되는 신규 3-에피머화 효소.
제1항에 있어서,
SEQ ID No: 2의 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70%, 예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 심지어 100%의 서열 동일성을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 분리한 폴리펩티드 또는 단백질.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID No: 2를 포함하거나 또는 SEQ ID No: 2로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리한 폴리펩티드 또는 단백질.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 분리한 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 분리한 폴리뉴클레오티드.
상기 폴리펩티드 또는 단백질이 발현 벡터에서 생성하도록 유도하는 하나 또는 복수(몇개)의 조절 서열에 조작 가능하게 연결되는 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성물 또는 발현 벡터.
상기 폴리펩티드 또는 단백질의 생성을 유도하는 하나 또는 복수(몇개)의 조절 서열에 조작 가능하게 연결되는 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재결합 숙주 세포.
(a) 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 생성에 도움이 되는 조건하에서 세포를 배양하고, 야생형으로 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 분리한 폴리펩티드 또는 단백질을 생성하는 방법.
(a) 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 생성에 도움이 되는 조건하에서 제6항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 분리한 폴리펩티드 또는 단백질을 생성하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 단백질 및 다른 효소를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 제9항에 따른 조성물의 D-알룰로스 생산공정에서의 용도.
제1항 내지 제3항에 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 제9항에 따른 조성물의 D-타가토스 생산공정에서의 용도.
과당, 글루코스 및 전분당 등의 혼합당을 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 단백질의 수용액과 접촉시켜 D-알룰로스를 생산하는 것을 포함하는 D-알룰로스 생산 방법.
소르보스 및 전분당 등의 혼합당을 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 단백질의 수용액과 접촉시켜 D-타가토스를 생산하는 것을 포함하는 D-타가토스 생산 방법.