JP5052884B2 - 海藻分解物の調製方法および海藻分解物の調製のための組成物 - Google Patents
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Description
(項目1) マイクロブルビファー属(Microbulbifer)に属する細菌と海藻を接触させる工程を包含する、海藻分解物を調製する方法。
(項目2) 以下の菌学的特徴:
形態的性質
細胞の形状:桿菌
細胞の大きさ:約1.0μm(幅)×約3.2μm(長さ)
運動性の有無:有り
胞子の有無:なし
培養的性質
MarineAgar 2216
色素を産生せず、コロニー中心部にくぼみを形成し、周辺部がヒダ状に拡がる。
良好に増殖し、30℃、48時間培養でフロックを形成する。
生理学的性状
グラム染色:グラム陰性
色素の生成:生成せず
オキシダーゼ:陽性
カタラーゼ:陽性
生育の範囲:4℃で生育せず。30℃で良好に生育。50℃で生育可
酸素に対する態度:好気性
OFテスト:O型(海洋細菌用に開発されたHughloifsonの培地:MOF培地による)
NaClの要求性:0〜1%NaClで生育せず。2.5〜5.0%で生育。生育にNaClを要求する。菌体外酵素の多糖分解酵素活性
アルギン酸:陽性
フコイダン:陰性
ラミナラン:陰性
寒天:陽性(強力:寒天平板培地にて寒天平板を液状化する)
を有する細菌と海藻を接触させる工程を包含する、海藻分解物を調製する方法。
(項目3) 配列番号1に記載の核酸配列からなる16S rRNA配列を有する細菌と海藻を接触させる工程を包含する、海藻分解物を調製する方法。
(項目4) 前記細菌がマイクロブルビファー属6532A株(受託番号 FERM BP-10930)で
ある、項目1〜3いずれか一項に記載の方法。
(項目5) 前記海藻が、褐藻類海藻である、項目1〜3いずれか一項に記載の方法。
(項目6) 前記海藻が、ワカメ、コンブまたはカジメである、項目1〜3いずれか一項に記載の方法。
(項目7) 海藻分解物を調製するための組成物であって、マイクロブルビファー属(Microbulbifer)に属する細菌を含有する、組成物。
(項目8) 海藻分解物を調製するための組成物であって、以下の菌学的特徴:
形態的性質
細胞の形状:桿菌
細胞の大きさ:約1.0μm(幅)×約3.2μm(長さ)
運動性の有無:有り
胞子の有無:なし
培養的性質
MarineAgar 2216
色素を産生せず、コロニー中心部にくぼみを形成し、周辺部がヒダ状に拡がる。
良好に増殖し、30℃、48時間培養でフロックを形成する。
生理学的性状
グラム染色:グラム陰性
色素の生成:生成せず
オキシダーゼ:陽性
カタラーゼ:陽性
生育の範囲:4℃で生育せず。30℃で良好に生育。50℃で生育可
酸素に対する態度:好気性
OFテスト:O型(海洋細菌用に開発されたHughloifsonの培地:MOF培地による)
NaClの要求性:0〜1%NaClで生育せず。2.5〜5.0%で生育。生育にNaClを要求する。菌体外酵素の多糖分解酵素活性
アルギン酸:陽性
フコイダン:陰性
ラミナラン:陰性
寒天:陽性(強力:寒天平板培地にて寒天平板を液状化する)
を有する細菌を含有する、組成物。
(項目9) 海藻分解物を調製するための組成物であって、配列番号1に記載の核酸配列からなる16S rRNA配列を有する細菌を含有する、組成物。
(項目10) 前記細菌がマイクロブルビファー属6532A株(受託番号 FERM BP-10930)
である、項目7〜9いずれか一項に記載の組成物。
(項目11) 前記海藻が、褐藻類海藻である、項目7〜9いずれか一項に記載の組成物。
(項目12) 前記海藻が、ワカメ、コンブまたはカジメである、項目7〜9いずれか一項に記載の組成物。
(項目13) 項目1〜3いずれか一項に記載の方法によって調製された海藻分解物を含有する、飲食用組成物。
(項目14) 項目1〜3いずれか一項に記載の方法によって調製された海藻分解物を含有する飲食用組成物であって、以下:
飲料、飲料調製用粉末、サプリメント、スープ、調味料、バター、ジャム、マーガリン、ドレッシング、マヨネーズ、蒲鉾、珍味、および、菓子、
からなる群から選択される飲食品の調製に使用するための、組成物。
(項目15)
項目1〜3いずれか一項に記載の方法によって調製された海藻分解物を含有する、皮膚外用剤。
(項目16)
項目15に記載の皮膚外用剤であって、化粧品、保湿剤、化粧水、クリーム、ゲル、軟膏、乳液、美容液、パック、洗顔料、クレンジング剤、ヘアケア剤、石鹸、浴用剤、シャンプー、リンス、リップスティック、口紅、および、ファンデーションからなる群から選択される、皮膚外用剤。
(項目17)
項目1〜3いずれか一項に記載の方法によって調製された海藻分解物を含有する、飲食用添加物。
(項目18)
以下の菌学的特徴:
形態的性質
細胞の形状:桿菌
細胞の大きさ:約1.0μm(幅)×約3.2μm(長さ)
運動性の有無:有り
胞子の有無:なし
培養的性質
MarineAgar 2216
色素を産生せず、コロニー中心部にくぼみを形成し、周辺部がヒダ状に拡がる、
寒天平板培地を液状化する、
MarineBroth 2216
良好に増殖し、30℃、48時間培養でフロックを形成する、
生理学的性状
グラム染色:グラム陰性
色素の生成:生成せず
オキシダーゼ:陽性
カタラーゼ:陽性
生育の範囲:4℃で生育せず、30℃で良好に生育、50℃で生育可、
酸素に対する態度:好気性
OFテスト:O型(海洋細菌用に開発されたHughloifsonの培地:MOF培地による)
NaClの要求性:0〜1%NaClで生育せず、2.5〜5.0%で生育、生育にNaClを要求する、菌体外酵素の多糖分解酵素活性
アルギン酸:陽性
フコイダン:陰性
ラミナラン:陰性
寒天:陽性(強力:寒天平板培地にて寒天平板を液状化する)
を有する細菌より調製された、粗酵素液。
(項目19)
項目18に記載の粗酵素液と海藻を接触させる工程を包含する、海藻分解物を調製する方法。
(項目20)
前記海藻が、褐藻類海藻である、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記海藻が、ワカメ、コンブまたはカジメである、項目19に記載の方法。
(項目22)
海藻分解物を調製するための組成物であって、項目18に記載の粗酵素液を含有する、組成物。
(項目23)
前記海藻が、褐藻類海藻である、項目22に記載の組成物。
(項目24)
前記海藻が、ワカメ、コンブまたはカジメである、項目22に記載の組成物。
細胞の形状:桿菌
細胞の大きさ:約1.0μm(幅)×約3.2μm(長さ)
運動性の有無:有り
胞子の有無:なし
という性質を有する。
グラム染色:グラム陰性
色素の生成:生成せず
オキシダーゼ:陽性
カタラーゼ:陽性
生育の範囲:4℃で生育せず。30℃で良好に生育。50℃で生育可。
OFテスト:O型(海洋細菌用に開発されたHughloifsonの培地:MOF培地による)
NaClの要求性:0〜1%NaClで生育せず。2.5〜5.0%で生育。生育にNaClを要求する。
という性質を示す。
アルギン酸:陽性
フコイダン:陰性
ラミナラン:陰性
寒天:陽性(強力:寒天平板培地にて寒天平板を液状化する)
という性質を示す。
日本海沿岸28箇所より、海岸に打ち上げられた海藻を124サンプル採取した。これらのサンプルを分離源として海洋細菌のスクリーニングを行った。
更に、純粋培養したコロニーを、1%ワカメ葉体(約9.0〜15.0mm角)添加人工海水培地に摂取し、海藻に対する分解能力を調べた。30℃で振蘯培養を行い、ワカメ葉体の分解や粒子化が見られる微生物を選抜した。
本細菌株の海藻分解能力を調べるために、平均9.0〜15.0mm角のワカメ葉体を重量比で2%添加した人工海水培地(NaCl 30.0g、KCl 0.7g、MgCl2・6H2O 10.8g、MgSO4・7H2O 5.4g、CaCl2・2H2O 1.0g、NH4NO3 1.0g、K2HPO4 0.02g、Yeast Extract 0.5g / 蒸留水 1000ml)に本微生物を摂取し、30℃で振蘯培養行った。結果を図1に示す、写真右側は菌未接種のコントロールを、写真左側は6532A株を接種した結果を示す。6532A株を接種した場合、培養3日目より海藻の断片化が生じ、5日目では、かなりの海藻の粒子化が観察された。これら海藻粒子は細胞が切り離され単細胞化しており、培養液中で均一に懸濁する特徴を有していた。また、海藻粒子は微細であるため沈降しにくい特徴を有していた。これら本微生物の作用により得られる海藻の粒子を調べたところ、約8μmの単細胞性の海藻粒子であった(図2)。
原料となる海藻の種類を調べるために、ワカメ、コンブ、カジメ、アカモク、モズクの5種類の海藻について分解能試験を実施した。人工海水培地にそれぞれの海藻を1%になるように添加し、オートクレーブにて滅菌した。この海藻添加人工海水培地に6532A株を接種し、30℃で14日間振蘯培養を行った。その結果、ワカメ、コンブ及びカジメ葉体の単細胞化による海藻の粒子化が確認された。一方、アカモク、モズクに対しては葉体の分解等は確認できなかった。
本発明細菌株の海藻多糖類への分解酵素の有無を調べた。まず、ワカメ葉体粉末を2%w/v添加した人工海水培地に6532A株を摂取し、5日間培養した後、その上清を粗酵素液とした。アルギン酸ナトリウム(片山化学工業(株)製、粘度:500cps)、フコイダン(Sigma社製)、ラミナラン(Sigma社製)の各多糖類について、0.5%溶液(0.1Mリン酸バッファーpH7.0)を調整し、この基質溶液と粗酵素液を3:1に混合し、30℃で1時間反応させた。その後、Somogyi-Nelson法にて還元糖の増加量を測定した。その結果、アルギン酸に対する分解活性が確認された。
このようにして得られた海藻分解菌について、種々の海藻多糖、即ちアルギン酸、フコイダン、ラミナランに対する分解酵素活性を測定した。測定方法はそれぞれの海藻多糖類に細菌培養液上清を作用させ、還元糖の増加量を測定することにより、酵素活性を測定した。
細胞の形状:桿菌
細胞の大きさ:1.0μm(幅)×3.2μm(長さ)
運動性の有無:有り
胞子の有無:なし
(2.培養的性質)
Marine Agar2216
色素を産生せず、コロニー中心部にくぼみを形成し、周辺部がヒダ状に拡がる。寒天平板培地を液状化する。
Marine Broth2216
良好に増殖し、30℃、48時間培養でフロックを形成する。
グラム染色:グラム陰性
色素の生成:生成せず
オキシダーゼ:陽性
カタラーゼ:陽性
生育の範囲:4℃で生育せず。30℃で良好に生育。50℃で生育可。
酸素に対する態度:好気性
OFテスト:O型(海洋細菌用に開発されたHughloifsonの培地:MOF培地による)
NaClの要求性:0〜1%NaClで生育せず。2.5〜5.0%で生育。すなわち、生育にNaClを要求する。
アルギン酸:陽性
フコイダン:陰性
ラミナラン:陰性
寒天:陽性(強力:寒天平板培地にて寒天平板を液状化する)。
ワカメ葉体粉末を2%w/v添加した人工海水培地に海藻分解菌を摂取し、5日間培養した後、その上清を粗酵素液とした。アルギン酸、フコイダン、ラミナランそれぞれについて0.5%溶液(0.1Mリン酸バッファーpH7.0)を調整し、この基質溶液と粗酵素液を3:1に混合し、30℃で1時間反応させた。その後、Somogyi-Nelson法にて還元糖の増加量を測定し、酵素活性の強さとして多糖類分解活性を調べた。その結果、アルギン酸に対する分解活性が確認された。
上記の菌学的性質を有する微生物の16S rRNA配列を決定し、BLAST及びCLUSTAL W(日本RNAデータバンク(DDBJ)ホームページ)を用いて相同性検索と分類学的位置の解析を行った。
本細菌株の海藻分解能力を調べるために、約9.0〜15.0mm角のワカメ葉体を重量比で2%添加した人工海水培地に本微生物を摂取し、30℃で振蘯培養行った。その結果、培養3日目で海藻の断片化が確認され、培養5日目で単細胞状態まで粒子化された海藻が見られた(図1)。ここで得られた海藻懸濁液を調べると、これら海藻粒子はほぼ全ての細胞が切り離され単細胞化しており、培養液中で均一に懸濁する特徴を有していた。また、微細粒子であるため沈降しにくい特徴も有していた。また、これら本微生物の作用により得られる海藻の粒子を調べたところ、約8μmの単細胞性の海藻粒子であった(図2)。
原料となる海藻の種類を調べるために、ワカメ、コンブ、カジメ、アカモク、モズクの5種類の海藻について分解能試験を実施した。その結果、ワカメ、コンブ及びカジメ葉体の単細胞化による海藻の粒子化が確認された。一方、アカモク、モズクに対しては葉体の分解等は確認できなかった。
乾燥ワカメ1kgを3%食塩水20Lと混合し、膨潤させた。121℃、15分滅菌処理し、これに本発明菌培養液100mlを接種し、30℃で5日間、振蘯培養を行い海藻分解物を調製した。尚、発明菌の培養液は以下の組成培地(乾燥ワカメ20.0g、NaCl30.0g、KCl 0.7g、MgCl2・6H2O 10.8g、MgSO4・7H2O 5.4g、CaCl2・2H2O 1.0g、NH4NO3 1.0g、K2HPO4 0.02g、Yeast Extract 0.5g / Distilled Water 1000ml)を30℃、24時間振蘯培養することにより調整した。
特許2772772号で製造される分解物のサイズは、5〜10μmと記載されている。この結果と比較して、本発明が優れたものであることを以下の実験によって示す。
1)菌株
・6532A分離株(受託番号 FERM BP-10930)
・FERM−BP5024(AR06株:中央水研、特許2772772号)
・FERM−P12346(Alteronas sp.No.4778:マルハ(株)、特許3079183号)
2)材料
ア)ワカメ微粉末(理研ビタミン、若みどり)
イ)ワカメ葉体(理研ビタミン、カットワカメNo.12、ワカメ片:約1.0cm角)
3)方法
ア)人工海水培地中の2%ワカメ微粉末(またはワカメ葉体)に各微生物を植菌した。植菌用の微生物は、MarineBroth 2216培地(組成については、以下に示す)にて24時間培養後、吸光度が0.1になるように調製した菌液100μlを添加した
イ)120rpm、30℃にて振とう培養し、一定時間培養後、海藻成分液1mlをサンプリングした
ウ)得られたサンプルを10分間煮沸し、測定開始まで4℃保存した
エ)測定機器には、HORIBA レーザー回折/散乱式粒度分布測定装置 LA−920を用いた(測定粒子径範囲:0.1〜2000μm)。
1)ワカメ微粉末への作用
図5、6、および7の結果から、6532Aがワカメ微粉末を最も細かく粒子化したことが判明した。さらに、図8は、粒子の平均径と標準偏差を示しているが、6532Aは他と比べて粒子の平均径が小さく、標準偏差が非常に小さい。従って、本発明の菌株によって、バラつきが少なく均一に粒子化された海藻分解物が生成された。
図9〜11の結果から、6532A株によるワカメ葉体の分解は、他の菌と比較して、非常に強く、1週間ほどの培養で充分に粒子化が進んだ。AR06株、12346株は、たとえ培養期間を長くしても、海藻の粒子化はほとんど進まなかった。この結果より、6532A株は、他の株と比較して、明らかにワカメ葉体を分解する能力が高い。
以上の結果より、分離菌株6532A株は、従来公知の菌株と比較して、海藻粒子化能力が高く、かつ、バラつきが少なく均一化された分解物を生成できることが判明した。
Claims (18)
- マイクロブルビファー属6532A株(受託番号 FERM BP-10930)の細菌と海藻を接触させる工程を包含する、海藻分解物を調製する方法。
- 前記海藻が、褐藻類海藻である、請求項1に記載の方法。
- 前記海藻が、ワカメ、コンブまたはカジメである、請求項1に記載の方法。
- 海藻分解物を調製するための組成物であって、マイクロブルビファー属6532A株(受託番号 FERM BP-10930)の細菌を含有する、組成物。
- 前記海藻が、褐藻類海藻である、請求項4に記載の組成物。
- 前記海藻が、ワカメ、コンブまたはカジメである、請求項4に記載の組成物。
- 請求項1〜3いずれか一項に記載の方法によって調製された海藻分解物を含有する、飲食用組成物。
- 請求項1〜3いずれか一項に記載の方法によって調製された海藻分解物を含有する飲食用組成物であって、以下:
飲料、飲料調製用粉末、サプリメント、スープ、調味料、バター、ジャム、マーガリン、ドレッシング、マヨネーズ、蒲鉾、珍味、および、菓子、
からなる群から選択される飲食品の調製に使用するための、組成物。 - 請求項1〜3いずれか一項に記載の方法によって調製された海藻分解物を含有する、皮膚外用剤。
- 請求項9に記載の皮膚外用剤であって、化粧品、保湿剤、化粧水、クリーム、ゲル、軟膏、乳液、美容液、パック、洗顔料、クレンジング剤、ヘアケア剤、石鹸、浴用剤、シャンプー、リンス、リップスティック、口紅、および、ファンデーションからなる群から選択される、皮膚外用剤。
- 請求項1〜3いずれか一項に記載の方法によって調製された海藻分解物を含有する、飲食用添加物。
- マイクロブルビファー属6532A株(受託番号 FERM BP-10930)の細菌より調製された、粗酵素液。
- 請求項12に記載の粗酵素液と海藻を接触させる工程を包含する、海藻分解物を調製する方法。
- 前記海藻が、褐藻類海藻である、請求項13に記載の方法。
- 前記海藻が、ワカメ、コンブまたはカジメである、請求項13に記載の方法。
- 海藻分解物を調製するための組成物であって、請求項12に記載の粗酵素液を含有する、組成物。
- 前記海藻が、褐藻類海藻である、請求項16に記載の組成物。
- 前記海藻が、ワカメ、コンブまたはカジメである、請求項16に記載の組成物。
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