SU519470A1

SU519470A1 - Способ получени литических ферментов

Info

Publication number: SU519470A1
Application number: SU1962088A
Authority: SU
Inventors: Любовь Николаевна Шинкаренко; Юлия Семеновна Бабенко; Евгений Федорович Григорьев
Priority date: 1973-09-28
Filing date: 1973-09-28
Publication date: 1976-06-30
Also published as: FR2246637B1; US3963577A; CA1028967A; FR2246637A1; GB1472611A

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

ЗУ против растворител . Диализат высушивают |При 0° под вакуумом.

Получаемые таким способом литические ферменты характеризуютс устойчивостью в широком диапазоие рН среды: 4,5-9,5 (оптимум 7-8), активны при 25-40° С (оптимум 37° С). Длительно сохран ют активность при -1-4° С и при нагревании до 60° С (в течение 30 мин).

Используемый штамм Actinomyces recifensis var. lyticus 2435 выделен из суглинистой почвы Днепропетровского ботанического сада путем культ1 вировани на селективной среде, содержапдей клетки Staphylococcus aureus 142а в качестве единственного источника углеродного и азотн-ого питали , и имеет следующую характеристику.

Морфологи .

Диаметр воздушного мицели 0,7-0,9 мк, Спороносцы короткие, неспиральные, .почти пр мые, у .молодой культуры чуть волнистые, расположены скученно, метелкой. Споры овальные, оболочка гладка . Воздушный мицелий серо-зеленоватый, окрашиваютс колонии , но не среды.

Окраска субстратного мицели более интенсивна , чем у воздушного.

Культуральные признаки.

Среда Чалека: рост обильный, колонии сеpoiBaTbie , поверхность бархатиста .

Крахлгально-аммиачна среда: рост хороший , колонии зеленовато-серые с желтоватым оттенком.

Среда Гаузе I с минеральным источником азота: рост хороший, колонии бархатистые, воздушный мицелий серо-зеленый, субстратный - серо-коричневый.

Среда Гаузе П с органическим источником азота: рост х.ороший, воздушный ми-целий серо-зеленый , субстратный - красно-коричневый . Бурое веш,ество не образуетс .

.МПА. Дрожжевой агар с мальтозой: рост обильный, колонии буро-зеленоватые. Воздушный мицелий серо-желтоватый.

Полусинтетическа среда дл глубинного культивировани продуцента, обеспечивающа высокий выход литического комплекса: соева мугка - 10 г/л, КХОз - 0,5 г/л, глюксза - 5 г/л, К2НРОл-0,1 г, клетки индуктора Stanh. aureus I42a.

Мицелий на данной среде образуетс ,в виде спутанных клубков нитей с небольшим коли ч с ст в о м р а зв е ТВ л е н и и.

Физиологические свойства.

Желатина разжижаетс быстро, молоко лептонизируетс . Крахллал гидрол-изуетс относительно слабо. Нитраты восстанавливаютс , тирозиназа не образуетс . На клетчатке рост есть. Хорошо усваиваютс практиче-. ски все сахара, но их .присутствие в среде в зна чительных |Количествах снижает синтез литических ферментов. Растет в пределах 14- 45° С (оптимум 28°С). Синтез литических ферментов 1;нгибируетс Zn+, Си+, Мп++, Fe++; активируетс , Mg++.

Продукци ферментов возможна в диапазоне рН среды от 4,5 до 9,5; оптимум 6,0 и 9,0.

Слаб.ый антагонист. Незначительно пода.вл ет рост отдельных грамлоложительных ба|ктерий и дрожжей, совершенно не угнетает грамотрицательные формы.

Продуцируемые ферменты глубоко лизируют клетки организмов, относ щихс к родам Staphylococcus, .Diplococcus, Micrococcus, Bacillus, Escherichiae, Salmonellae, Vibrio Corynebacterium, Saccharomyces, Shizosaccharcmyces , Candida.

С помощью данного штамма возможно

5 осуществл ть натравленный синтез, т. е. получать ферменты, обладающие определенными заранее заданными литическими свойствами , благодар введению в среду требуемого индукто.ра.

0 Способ по сн етс следующими примерами .

Пример 1. Среду Л 6, содержащую в 1 л дистиллированной воды 0,1 г К2НРО4, 0,5 г KNOs, 5 г глюкозы и 10 г соевой муки,

5 засевают культурой продуцента блоками 7-

10 суточного штамма Actinomyces recifensis

,var. lyficus 2435, выросшего на твердой среде

Чапека. В среду одновременно с лосевным

материалом внос т клетки индуктора - п,ро0 автоклавированную 1взвесь Staphylococcus aureus 142а, содержащую 15 10® кл/мл. Взвесь добавл ют в количестве 0,1 мл на 1 мл среды.

Культивирование велось при активной аэ5 ращии и перемеши вании среды .при 27-28° С в течение 3 суток.

После окончани инкубации культуральную жидкость освобождают от мицели и не1тслользованных остатков питательной среды

0 :дентрифугированием при 6000 об/мин в течение 15-20 мин.

Прозрачную культура.льную жидкость, содержащую сырой литический фермент, насыщают до 0,4 сернистым аммонием; получен5 лый солевой раствор оставл ют при 4° С на 16-18 час дл формировани осадка. Осадок зыпавшего. белка собирают фильтрованием под ва.куумом (.при пониженной температуре), промывают холодным ацетоном, подсушивают до удалени ацетона и раствор ют н ацетатном буфере рН 5,5 (0,1М), вз том в количестве 0,1 от исходного объема культуральной жидкости. Нерастворимый осадок отдел ют в ечение 10 мин центрифугированием .при

55 5000 об/мин.

В полученном растворе белка определ ют литическую активность.

К 2 жл взвеси живых клеток Staphylococcus aureus добавл ют 1 мл ферментного раствора белка. На ФЭК-М при желтом светофильтре измер ют исходную плотность суспензии (не должна превышать 2), затем взвесь термостатируют при 37° С в течение 35 час и снова измер ют ллотность раствора.

65 Эффективность лизиса определ ют по глубине лизиса исходной взвеси за 3,5 час, т. е. по соотношению плотностей в исходном и конечном растворе, выраженном в процентах.

Таблица 1

МИ табл. 2 примера 1) литической активности от природы индуктора.

Таблица 3

Глубина лизиса . %

Литическую а,ктнвность данного фермент- is ного раствора аналогичным образом исследуют и в отношении р да других микроорганизмов . Результаты этих исследований представлемы в табл. 2. Глубина лизиса лживых клеток Staph. aureus прин та за Ю0%. Т а б л 1 ц а 2

Пример 2. К среде Л 6 в качестве индуктора добавл ют прогретую взвесь клеток Bacillus mycoides в количестве 0,1 мл на 1 мл среды.

:Выраш,ивание и обработку культуральной жидкости ведут, как указано в примере 1.

Литическую активность ферментного раствора белка провер ют з отношении живых и прогретых Клеток Staphylococcus aureus и Bacillus mycoides.

Результаты представлены в табл. 3, где показана зазиснмость (в сравнении с данны3 .Способ по пп. 1-2, отличающийс тем, что в качестве индуктора используют микроорганизмы, относ ш;иес к виду Staphyiococcus aureus.

4.Способ по пп. , о т лИ чЯ ю щ и и с тем, мз вида Staphylococcus aureus используют штамм 142а.

5.Cinoco6 по пп. 1-4, отличающийс тем, что в качестве источника углерода и азота в среде используют соответственно глюкозу и соевую , а из солей - азот: скислый кал й и дзузамещенный фосфорнокисTaiKHM образом, применение в качестве индуктора Staph. aureus обеспечивает широкий спектр литической активности ферментдв. Вас. mycoides лизнруетс этим ферментом на 80% 7 лый калий, лри этом указанные компоненты введены в следующих количествах, Соева мука10 Глюкоза55 Азотнокислый калий0,5 8 ДвузамещенНый фос форнокислый калий 0,1 6. Способ по п,п. , отличающийс тем, что при выделении фермента из среды сульфатом аммони , его ввод т до 40% насы .щени .