CN113293109A - 一种耐重金属铜的伯克霍尔德氏菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种耐重金属的伯克霍尔德氏菌及应用。本发明提供了一种伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)HXC‑1，所述伯克霍尔德氏菌HXC‑1对铜的最高耐受浓度大于150mg/L，且能够有效去除重金属污染环境中的铜，去除率高达92.57％，能够实现重金属污染土壤的修复；所述的伯克霍尔德氏菌HXC‑1对铜污染下紫花苜蓿幼苗生长有促生作用，能够显著促进紫花苜蓿幼苗茎长和株高，且在铜浓度为450mg/L时，用所述的伯克霍尔德氏菌HXC‑1处理紫花苜蓿幼苗后，其茎长和株高为未经菌处理的46倍和2.89倍；在铜浓度为500mg/L时，用所述的伯克霍尔德氏菌HXC‑1处理紫花苜蓿幼苗，其茎长和株高为未经菌处理的67.96倍、2.44倍，具有显著的促生作用，应用前景广阔。

Description

一种耐重金属铜的伯克霍尔德氏菌及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种耐重金属的伯克霍尔德氏菌及应用。

背景技术

近年来，工业的发展和人类活动导致土壤的重金属污染情况日益严重。重金属在土壤中不能自行分解，残留时间长、危害大，且容易被农作物吸收进而影响人类身体健康。铜污染是常见的重金属污染，铜矿的开采、尾矿的堆积、工业废水的排放、含铜农药的使用等因素都会使得土壤中铜元素积累过多。而铜元素被植物吸收后停留在根部，阻碍根系对其它成分特别是对铁元素的吸收，导致植物生长不良。而且过多的铜元素进入人体内会导致人体出现恶心、呕吐、上腹疼痛、急性溶血和肾小管变形等中毒现象。

目前对于重金属土壤污染的修复技术主要包括物理修复、化学修复、植物修复、微生物修复、联合修复等。传统的物理修复方式工程量大、成本高，而且难以应用到大面积的土壤修复治理中；化学修复的操作过程相对复杂，同时会破坏土壤结构，导致土壤肥力下降，可能存在二次污染；植物修复因其成本低廉，是一种绿色环保的土壤重金属污染修复技术，但因其生物量小、生长周期长等缺点，导致，单一的植物修复很难达到理想的效果。因此，采用微生物修复技术来改善重金属土壤污染是目前常用的方法。

伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)隶属于变形菌门、β-变形菌纲，具有丰富的代谢多样性及较强的适应能力，在环境中分布广泛。目前有关伯克霍尔德氏菌的报道主要集中在生物防治、分解有毒物质和植物促生等方面。其中专利CN101671636B提供了一种具有重金属铅、镉、铜、锌抗性的伯克霍尔德氏菌D54，虽然所述伯克霍尔德氏菌D54对铜离子的最高耐受浓度为150mg/L，但是对于环境中铜离子的去除率以及在高铜污染环境下对植株的促生作用并无报道。

本发明从含羞草根瘤中筛选出了一种耐重金属铜离子的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)HXC-1，所述伯克霍尔德氏菌HXC-1对铜离子的最高耐受浓度大于150mg/L；且所述伯克霍尔德氏菌HXC-1能够有效去除重金属污染环境中的铜离子，去除率高达92.57％，能够实现重金属污染土壤的修复；所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1对铜污染下紫花苜蓿幼苗生长有促生作用，能够显著促进紫花苜蓿幼苗茎长和株高，且在铜离子为450mg/L时，用所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1处理紫花苜蓿幼苗后，其茎长和株高为未经菌处理的46倍和2.89倍；在铜离子浓度为500mg/L时，用所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1处理紫花苜蓿幼苗后，其茎长和株高为未经菌处理的67.96倍和2.44倍，具有显著的促生作用，应用前景广泛。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一株耐重金属的伯克霍尔德氏菌及应用，具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)HXC-1，所述伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)HXC-1于2021年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61644。

第二方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的伯克霍尔德氏菌)HXC-1，或伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂在重金属污染土壤修复中的应用。

优选地，所述重金属为铜。

第三方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1，或伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂在促进植物生长中的应用。

优选地，所述植物为紫花苜蓿。

第四方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1，或伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂在提高植物对重金属胁迫环境耐受性中的应用。

优选地，所述植物为紫花苜蓿。

优选地，所述重金属为铜。

第五方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1，或伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂在促进重金属胁迫环境下植物生长中的应用。

优选地，所述植物为紫花苜蓿。

优选地，所述重金属为铜。

第六方面，本发明提供了一种植物促生剂，所述植物促生剂含有上述第一方面所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1，或伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂。

优选地，所述植物促生剂用为重金属胁迫下的植物促生剂。

优选地，所述重金属为铜。

优选地，所述植物为紫花苜蓿。

第七方面，本发明提供了一种土壤修复剂，所述土壤修复剂含有上述第一方面所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1或伯克霍尔德氏菌HXC-1菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂。

优选地，所述土壤修复剂用于修复重金属污染的土壤。

优选地，所述重金属为铜。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1对铜离子的最高耐受浓度高于150mg/L；且所述伯克霍尔德氏菌HXC-1能够有效去除重金属污染环境中的铜离子，去除率高达92.57％，能够实现对重金属污染土壤的修复；

(2)所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1对铜污染下紫花苜蓿幼苗生长有促生作用，能够显著促进紫花苜蓿幼苗茎长和株高，且在铜离子为450mg/L时，用所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1处理紫花苜蓿幼苗后，其茎长和株高为未经菌处理的46倍和2.89倍；在铜离子浓度为500mg/L时，用所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1处理紫花苜蓿幼苗后，其茎长和株高为未经菌处理的67.96倍和2.44倍，具有显著的促生作用，应用前景广阔。

附图说明

图1伯克霍尔德氏菌HXC-1的革兰氏染色图；

图2伯克霍尔德氏菌HXC-1的电泳图；

图3伯克霍尔德氏菌HXC-1的H₂O₂酶活性测定结果；

图4伯克霍尔德氏菌HXC-1菌株的刚果红实验结果；

图5伯克霍尔德氏菌HXC-1的水解淀粉实验结果；

图6伯克霍尔德氏菌HXC-1的甲基红实验结果；

图7伯克霍尔德氏菌HXC-1的肉汁实验结果；

图8伯克霍尔德氏菌HXC-1的BTB实验结果；

图9伯克霍尔德氏菌HXC-1对Cu²⁺的耐受性测定结果；

图10伯克霍尔德氏菌HXC-1对Cu²⁺的吸附和去除作用；

图11各种铜浓度下无菌和染菌处理后植物根长变化情况；

图12各种铜浓度下无菌和染菌处理后植物茎长变化情况；

图13各种铜浓度下无菌和染菌处理后植物株高变化情况；

图14各种铜浓度下染菌处理后植物根、茎和株高增加的倍数。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的保护范围进行详细的阐述，但是，应当说明的是，本发明的保护范围并不受以下实施例的限制。

本发明以下实施例所述的YMA培养基组成：甘露醇6g、酵母浸膏1.6g、K₂HPO₃ 0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.08g、NaCl 0.04g、CaCl₂ 0.02g、琼脂8.8g、Rh微量元素1.6mL、蒸馏水400mL；pH 6.8～7.0。(Rh微量元素液：H₃BO₃ 5g、Na₂MnO₄ 5g；H₂O 1000mL)。

实施例1伯克霍尔德氏菌HXC-1的分离和保藏

1.伯克霍尔德氏菌HXC-1的分离和培养

取来自广东省潮州市市郊采集的含羞草(Mimosa pudica Linn.)，去掉茎、叶后，将根部用清水清洗，在根部选取个大、饱满、新鲜的根瘤，洗去杂质，冲洗干净，用95％乙醇浸泡5min后，用0.1％的HgCl₂表面灭菌5min，然后在无菌条件下，用无菌水冲洗10次。在紫外灯灭菌后的超净工作台上，将最后一次冲洗根瘤流下来的无菌水摇匀，取少量于YMA培养基中进行均匀涂布，在28℃下倒置培养3～5天，观察培养基上的菌株生长情况。如无菌落出现，则证明根瘤已经清洗消毒干净，否则应分析出现菌落的原因，重新进行根瘤的清洗和消毒。

在超净工作台无菌条件下，将单个根瘤切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向YMA培养基放置，每个培养皿中均匀放置4个切半的根瘤，在28℃下倒置培养3～5天。出现菌落后，挑取多个符合根瘤菌形态的、单个的菌落进行纯化培养，再对获得的单克隆菌株经过3次纯化培养获得纯培养物，将其中的一株菌株命名为HXC-1。

菌株HXC-1的最适生长温度为28℃，最适pH为6-7；在28℃下，24-48h即能长成菌落，生长快；菌落为光滑、圆形半透明、粘性大的乳白色鼻涕状隆起。

2.菌株HXC-1的革兰氏染色鉴定

对上述1纯化获得的菌株HXC-1进行革兰氏染色法鉴定，具体步骤如下：

(1)从圆形半透明、乳白色鼻涕状的菌株HXC-1单个菌落中，用接种环挑取少许菌，均匀涂布在滴有无菌水的载玻片上，将菌落涂布均匀，自然干燥后，在酒精灯上过火2-3次以固定；

(2)滴加结晶紫染液染色1～2min，以细水流洗去染液，用滤纸吸去残水；

(3)用碘液媒染1min，水洗；

(4)用滤纸吸去残水，将玻片倾斜，用滴管流加95％的乙醇脱色20～30s，直至流出的乙醇无色，立即水洗；

(5)用番红染液染色1min，水洗；

(6)干燥后进行镜检。

革兰氏染色鉴定结果如图1所示，所述菌株HXC-1为短杆状、革兰氏阴性菌(红色)，为革兰氏阴性短杆菌。

3.菌株HXC-1的16S rDNA测序鉴定

(1)基因组DNA提取：

在酒精灯火焰旁取培养基上的菌株于研钵，液氮研磨；将研磨好的菌加入1.5mL离心管中，标记菌株名称，加入0.6mLTE(pH 8.0)，用枪头吸打均匀，使菌体充分悬浮；加入250μL10％的SDS，轻轻倒转混匀；加入3μL蛋白酶K(20ng/μL)，轻轻混匀，37℃水浴1h；加入150μL5mol/L的NaCl，轻轻混匀；加入150μL 2％的CTAB，轻轻混匀，65℃水浴20min；12000rpm，常温离心20min；小心吸取上清至新的1.5mL离心管，加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置30min，12000rpm，4℃离心10min；吸掉上清，在吸水纸上控干液体，加750μL70％的乙醇，轻弹管壁，使沉淀悬浮并反复颠倒几次，12000rpm，4℃离心2min；每管加入30μL纯化水溶解沉淀(水中加Rnase，终浓度10ng/μL)，用手轻弹管壁，4℃溶解过夜。

(2)DNA电泳检测：

PCR扩增：

16s引物序列：Primer1(27f)：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；Primer2(1492R)：TACGGYTACCTTGTTACGACTT；

反应体系：H₂O，17.8μL；Buffer，3μL；dNTP，2μL；Primer1，3μL；Primer2，3μL；DNA模板，1μL；酶，0.2μL；总体积30μL；

反应条件：95℃，5min；95℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；35cycle；72℃，10min；12℃，forever；

(3)结果

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果如图2所示，其中1对应条带为菌株HXC-1，其余为本实施例中筛选的其他菌株。电泳条件：3μL样品+1％琼脂糖凝胶；Marker条带组成：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp；750bp条带浓度为60ng/3μL，显示为加亮带，其余条带浓度均为30ng/3μL。

获得菌株HXC-1的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

经序列测定及BLAST同源性对比与进化分析，结果表明所述菌株HXC-1与伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)SWF66029亲源关系最近，因此，判定菌株为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)，其全称为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)HXC-1，所述伯克霍尔德氏菌HXC-1于2021年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61644；保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；联系电话：020-87137633。

在以下实施例中，将伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)HXC-1简称为伯克霍尔德氏菌HXC-1。

实施例2伯克霍尔德氏菌HXC-1的生理生化特性

1.H₂O₂酶活性测定

将所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1菌株接种于YMA固体培养基上，28℃培养3d，取1mL3％H₂O₂滴在菌苔上，每个处理重复三次；若在5min内出现气泡为阳性，无气泡则为阴性。结果如图3所示，菌苔加入H₂O₂后快速产生了较多气泡，表明伯克霍尔德氏菌HXC-1菌株H₂O₂酶活性较高。

2.刚果红实验

刚果红实验用于检测细胞表面成分中是否含纤维素。刚果红能将纤维素染成红色复合物，故菌落变红，为阳性反应，显示细胞表面有纤维素；菌落颜色不变，则为阴性反应，细胞表面无或少纤维素。

将所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1菌株接种于刚果红培养基上，28℃培养3d，每个处理重复三次。结果如图4所示，刚果红染色反应显示所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1菌落颜色由白色变为红色，吸收了刚果红染料，表明细胞表面成分中纤维素的含量较多。

3.甲基红实验(MR实验)

MR实验可检测伯克霍尔德氏菌HXC-1是否产生有机酸。一些微生物在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基变成酸性，其pH下降至4.2或更低，当加入甲基红指示剂后，培养液由橘黄色(pH6.3)变为红色(pH4.2)，为甲基红实验阳性反应；如果微生物在代谢过程中不产生各种有机酸如甲酸、乙酸、乳酸，则加入甲基红指示剂后，培养液不变色(仍为黄色)，为甲基红实验阴性反应。甲基红的变色范围为pH4.2(红色)至pH6.3(黄色)。

将伯克霍尔德氏菌HXC-1接种于甲基红液体培养基内，28℃培养3d；结果如图5所示，伯克霍尔德氏菌HXC-1培养液仍为黄色，表明伯克霍尔德氏菌HXC-1在糖代谢过程中，丙酮酸没有进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等。

4.水解淀粉实验

水解淀粉实验可检测伯克霍尔德氏菌HXC-1中淀粉酶的活性。淀粉酶使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，遇碘液不变蓝色，并且在培养基上会形成透明圈。如果出现透明圈，则为阳性反应；无透明圈则为阴性反应。

将伯克霍尔德氏菌HXC-1接种于淀粉培养基上，28℃培养3d，每个处理三个重复，滴加适量碘液，观察结果。结果如图6所示，伯克霍尔德氏菌HXC-1菌落上没有出现白色透明圈，表明伯克霍尔德氏菌HXC-1不含淀粉酶或淀粉酶活性较低。

5.肉汁实验

检测所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1在肉汁蛋白胨上的生长情况。将所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1接种于肉汁蛋白胨生长培养基上，28℃培养3d，观察结果。结果如图7所示，所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1液体培养基很澄清，菌落很少几乎是无增殖，表明所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1不适合在肉汁培养基上生长。

6.BTB实验

BTB是一元有机弱酸，可表示为HIn，在酸性溶液里，分子HIn是其存在的主要形式，使溶液呈黄色；在碱性溶液里，离子In^-是其存在的主要形式，故溶液呈蓝色。

将所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1接种在含0.5％的溴麝香草酚蓝的YMA培养基上，置于28℃的恒温培养箱中培养3d，每个处理三个重复；观察结果。BTB实验结果如图8所示，所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1的培养基变为黄色，显示在生长过程中产生酸性物质。

综上可知，所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1的H₂O₂酶活性较高；刚果红染色反应阳性(细胞表面纤维素含量较多)；MR实验阴性，即代谢中其丙酮酸没有进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等；菌体中含有淀粉酶较少或活性较低；伯克霍尔德氏菌HXC-1不适合在肉汁培养基上生长；伯克霍尔德氏菌HXC-1在生长过程中产生了一定的酸性物质，结果如表1所示。

表1伯克霍尔德氏菌HXC-1生理生化特性检测结果

注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

实施例3伯克霍尔德氏菌HXC-1对金属铜的耐受性测定

(1)激活伯克霍尔德氏菌HXC-1：首先将伯克霍尔德氏菌HXC-1菌株在固体YMA培养基上划线进行接种，然后在温度条件为28℃的培养箱里培养3d至菌苔丰满；

(2)制备菌悬液：在培养丰满的菌苔里用接种环挑选一环菌落于80mL的YMA液体培养基中(250mL锥形瓶)，并用摇床(转速为120r/min，温度为28℃)充分振荡15h，得到菌悬液；

(3)对铜的最高耐受浓度测定

配置含有铜(0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600mg/L)的YMA固体培养基，备用；

取1mL步骤(2)制备获得的菌悬液分别滴加到含有上述含有铜的YMA固体培养基中涂布培养，每4h观察一次菌落生长情况，检测伯克霍尔德氏菌HXC-1对铜的耐受性。

结果如图9所示，当铜浓度为50mg/L时，伯克霍尔德氏菌HXC-1菌株生长较好，培养16h的菌落量为72％，培养20h的菌落量达到90％，培养24-48h的菌落量达到95％以上；当铜浓度为100mg/L时，菌落量有所下降，培养24-36h的菌落量为5-25％，培养40-48h的菌落量为50-70％；当铜浓度为150mg/L时，菌落量有所下降，培养24-36h的菌落量不足25％，培养40-48h的菌落量为45-68％；当铜浓度为200mg/L，无菌生长；因而，本发明所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1对铜的耐受浓度大于150mg/L。

实施例4伯克霍尔德氏菌HXC-1对金属铜的吸附和去除作用

(1)激活伯克霍尔德氏菌：首先将伯克霍尔德氏菌HXC-1菌株在固体YMA培养基上划线进行接种，然后在温度条件为28℃的培养箱里培养3d至菌苔丰满。

(2)制备菌悬液：在培养丰满的菌苔里用接种环挑选一环菌落于80mL YMA的液体培养基中(250mL锥形瓶)，并用摇床(转速为120r/min，温度为28℃)充分振荡15h，得到菌悬液。

(3)重金属离子去除率的测定：

铜胁迫下伯克霍尔德氏菌HXC-1菌悬液的制备：将步骤(2)所述菌悬液分别加入到100mL含金属铜的液体培养基中(铜浓度为：0、25、50、75、100、125、150mg/L)，摇床培养24h(转速为120r/min，温度为28℃)。

铜标准储备液的制备：配置0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL的铜标准储备液，并分别取出7mL的标准储备液于离心管。(离心管使用之前先用10％的硝酸浸泡12-24h，用清水冲洗，再用去离子水润洗备用)。

样液的稀释：将培养24h(稳定期)含不同浓度重金属(铜)的菌培养液取出，以0.45μm的微孔滤膜过滤，菌液中重金属铜浓度是0-150mg/L。

铜含量的测定：将标准溶液放入火焰原子吸收光谱仪进行测定铜的含量及绘制出标准曲线。将含铜的样液在火焰原子吸收光谱仪测定OD值。

根据测定得到的标准溶液OD值获得标准曲线公式为：y＝0.0121X+0.0019，根据标准曲线公式及测出的吸光度，计算出24h后铜浓度，并利用以下公式计算出伯克霍尔德氏菌HXC-1对铜的去除率：

结果如图10所示，伯克霍尔德氏菌HXC-1在重金属铜浓度为25-150mg/L的范围内，随着重金属铜浓度的增大，去除率逐渐降低；伯克霍尔德氏菌HXC-1对铜的最大去除率可达92.57％；且在重金属铜浓度为150mg/L时，伯克霍尔德氏菌HXC-1对铜去除率仍高于50％。表明伯克霍尔德氏菌HXC-1能够有效去除重金属污染环境中的铜离子。

综上所述，本发明所请求保护的伯克霍尔德氏菌HXC-1制备的菌剂能够耐受一定浓度的铜污染，并且能够有效去除环境中的重金属铜浓度；可用于重金属铜污染土壤的修复。

实施例5伯克霍尔德氏菌HXC-1对受铜离子污染的植物的促生作用

1.种子消毒

先将紫花苜蓿种子用0.1％的HgCl₂溶液消毒5min，再用95％酒精消毒5min，在无菌操作台中，接着用无菌水冲洗5次，最后已灭菌的吸水纸吸干。含羞草种子做打破休眠处理：75℃的温水浸泡15min。

在培养丰满的菌苔里用接种环挑选一环菌落于80mL YMA的液体培养基中(250mL锥形瓶)，并用摇床(转速为120r/min，温度为28℃)充分振荡15h，得到菌悬液。

拌种：将接菌组种子置于菌悬液中浸泡6小时，浸泡过程中保持与空气有接触，之后自然阴干1h。

2.重金属胁迫

设计重金属铜的浓度梯度为：0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500mg/L；通过加入植物生长营养液模拟种子适宜生长的条件。重金属每个浓度设置3个重复，伯克霍尔德氏菌HXC-1空白对照组3个重复，每个重复30颗处理好的种子。用滤纸和培养皿制作简易的培养环境。在配置重金属溶液的浓度时，先浓缩一倍进行配置，之后和稀释好的植物营养液按照1:1的比例进行配置，重金属在培养液中的浓度即为所设浓度。对照组只加入植物营养液，培养液刚好没过滤纸为宜。

3.植物生长实验

实验组先加入和对照组等量植物培养液，培养24h后，待伯克霍尔德氏菌HXC-1接种入种子，按照重金属：植物营养液＝1:1的比例混匀，等量加入实验组和对照组，盖上皿盖(为避免植物营养液母液被稀释，重金属母液浓度为所设置浓度的两倍)，每两天换一次滤纸以及重金属和营养液的混合培养液。培养种子和幼苗条件为：在智能人工气候箱中保持通气良好，光照时间10h/d，温度28℃，相对湿度50％。

4.结果分析

在各种铜离子浓度处理下，无菌和染菌后紫花苜蓿种子萌发率无显著差异(P>0.05)，显示该菌对种子萌发无促进作用。

伯克霍尔德氏菌HXC-1对紫花苜蓿幼苗生长的促生作用结果如图11-13所示。结果表明，在无重金属铜污染时，无染菌的紫花苜蓿幼苗茎长(1.533cm)显著大于染菌后的茎长(0.967cm)(P<0.001)，根长和株高在无染菌和染菌处理之间差异较小(P>0.05)；当重金属铜浓度为50mg/L时，染菌后紫花苜蓿幼苗的根长(1.022cm)显著大于无染菌的紫花苜蓿幼苗的根长(0.47cm)(P<0.05)；茎长和株高在无菌和染菌处理之间差异较小(P>0.05)；当铜离子为150mg/L，染菌后紫花苜蓿幼苗的根长、茎长、株高分别是无染菌下的1.67倍、1.52倍、1.39倍(P<0.05)；当重金属铜浓度为200mg/L，染菌后紫花苜蓿幼苗的茎长、株高分别是无染菌的1.34倍、1.44倍；当重金属铜浓度为250mg/L，染菌后紫花苜蓿幼苗的茎长、株高分别是无染菌的1.74倍、1.48倍(P<0.05)；当重金属铜浓度为300mg/L，染菌后紫花苜蓿幼苗的茎长、株高分别是无染菌下的1.93倍、1.71倍(P<0.05)；当重金属铜浓度为350mg/L，染菌后紫花苜蓿幼苗的茎长、株高分别是无染菌的3.024倍、2.21倍(P<0.05)；当重金属铜浓度为400mg/L，染菌后紫花苜蓿幼苗的茎长和株高显著大于无染菌处理，染菌后紫花苜蓿幼苗的茎长、株高分别是无染菌的3.67倍、2.19倍(P<0.05)；当铜离子为450mg/L，染菌后紫花苜蓿幼苗的茎长、株高分别是无染菌的46倍、2.89倍(P<0.05)；当重金属铜浓度为500mg/L，染菌后紫花苜蓿幼苗的茎长、株高分别是无染菌下的67.96倍、2.44倍(P<0.05)。

上述结果表明，本发明所述伯克霍尔德氏菌HXC-1对铜胁迫下紫花苜蓿幼苗生长有促生作用，尤其促进茎长和株高的生长，能有效减缓重金属铜对幼苗生长的影响。

序列表

<110> 韩山师范学院

<120> 一种耐重金属铜的伯克霍尔德氏菌及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 含羞草(Mimosa pudica Linn.)

<400> 1

tttgcggctg cttaacatgc aagtcggacg gcagcgcggg cttcggcctg gcggcgagtg 60

gcgaacgggt gagtaataca tcggaacgtg tcctggagtg ggggatagcc cggcgaaagc 120

cggattaata ccgcatacgc tctgaggagg aaagcggggg atcttcggac ctcgcgctca 180

aggggcggcc gatggcagat tagctagttg gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc 240

tgtagctggt ctgagaggac gaccagccac actgggactg agacacggcc cagactccta 300

cgggaggcag cagtggggaa ttttggacaa tgggggcaac cctgatccag caatgccgcg 360

tgtgtgaaga aggccttcgg gttgtaaagc acttttgtcc ggaaagaaaa cttcgccgcc 420

aataccggtg gaggatgacg gtaccggaag aataagcacc ggctaactac gtgccagcag 480

ccgcggtaat acgtagggtg cgagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgtgcgcag 540

gcggttcgct aagaccgatg tgaaatcccc gggcttaacc tgggaactgc attggtgact 600

ggcgggctag agtatggcag aggggggtag aattccacgt gtagcagtga aatgcgtaga 660

gatgtggagg aataccgatg gcgaaggcag ccccctgggc caatactgac gctcatgcac 720

gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgcccta aacgatgtca 780

actagttgtc gggtcttcat tgacttggta acgtagctaa cgcgtgaagt tgaccgcctg 840

gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg 900

atgatgtgga ttaattcgat gcaacgcgaa aaaccttacc tacccttgac atgtacggaa 960

ccttgccgag aggtgagggt gcccgaaagg gagccgtaac acaggtgctg catggctgtc 1020

gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcccta 1080

gttgctacgc aagagcactc tagggagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaagt cctcatggcc cttatgggta gggcttcaca cgtcatacaa tggtcggaac 1200

agagggttgc caagccgcga ggtggagcca atcccagaaa accgatcgta gtccggatcg 1260

cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320

ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggttttac 1380

cagaagtggc tagtctaacc gcaaggagga cggtcaccac gtagatcttc t 1431

Claims (10)

1.一种伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)HXC-1，所述伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)HXC-1于2021年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61644。

2.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1，或伯克霍尔德氏菌HXC-1菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂在重金属污染土壤修复中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重金属为铜。

4.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1，或伯克霍尔德氏菌HXC-1菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂在促进植物生长中的应用。

5.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1，或伯克霍尔德氏菌HXC-1菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂在提高植物对重金属胁迫环境耐受性中的应用。

6.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1，或伯克霍尔德氏菌HXC-1菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂在促进重金属胁迫环境下植物生长中的应用。

7.如权利要求4-6任一所述的应用，其特征在于，所述植物为紫花苜蓿。

8.如权利要求5-6任一所述的应用，其特征在于，所述重金属为铜。

9.一种植物促生剂，其特征在于，所述植物促生剂含有权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1，或伯克霍尔德氏菌HXC-1菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂。

10.一种土壤修复剂，其特征在于，所述的土壤修复剂含有权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌HXC-1，或伯克霍尔德氏菌HXC-1菌悬液，或含有伯克霍尔德氏菌HXC-1的菌剂。

Images