SK18882001A3 - Gény Corynebacterium glutamicum kódujúce stresové, rezistenčné a tolerančné proteíny - Google Patents

Gény Corynebacterium glutamicum kódujúce stresové, rezistenčné a tolerančné proteíny Download PDF

Info

Publication number
SK18882001A3
SK18882001A3 SK1888-2001A SK18882001A SK18882001A3 SK 18882001 A3 SK18882001 A3 SK 18882001A3 SK 18882001 A SK18882001 A SK 18882001A SK 18882001 A3 SK18882001 A3 SK 18882001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
nucleic acid
srt
acid molecule
protein
sequences
Prior art date
Application number
SK1888-2001A
Other languages
English (en)
Inventor
Markus Pompejus
Burkhard Kr�Ger
Hartwig Schrder
Oskar Zelder
Gregor Haberhauer
Heung-Shick Lee
Hyung-Joon Kim
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of SK18882001A3 publication Critical patent/SK18882001A3/sk

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Gény Corynebacterium glutamicum kódujúce stresové, rezistenčné a tolerančné proteíny
Príbuzné prihlášky
Táto prihláška si nárokuje prioritu z predošlej americkej predbežnej patentovej prihlášky US č. 60/141031, podanej 25. júna 1999, americkej predbežnej patentovej prihlášky US č. 60/142692, podanej 1. júla 1999 a tiež z americkej predbežnej patentovej prihlášky US č. 60/151214, podanej 27. augusta 1999. Táto prihláška si taktiež nárokuje prioritu z nemeckej patentovej prihlášky č. 19930429.7 podanej 1. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19931413.6, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931457.8, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19931541.8, podanej 8. júla 1999 nemeckej patentovej prihlášky č.19932209.0, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932230.9 podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932914.1 podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19940764.9 podanej 27. augusta 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19941382.7 podanej 31 .augusta 1999. Celý obsah všetkých vyššie uvedených prihlášok je tu týmto výslovne začlenený formou odkazu.
Oblasť techniky
Vynález sa týka génov Corynebacterium glutamicum kódujúcich stresové, rezistenčné a tolerančné proteíny
Doterajší stav techniky
Určité produkty a vedľajšie produkty prirodzených metabolických pochodov v bunkách majú široké priemyselné uplatnenie, vrátane potravinárskeho, krmovinárskeho, kozmetického a farmaceutického priemyslu. Do tejto skupiny molekúl súhrnne nazývaných ako „špeciálne chemikálie“ („fine chemicals“) patria organické kyseliny, aminokyseliny proteínového, respektíve neproteínového pôvodu, nukleotidy a nukleozidy, lipidy a mastné kyseliny, dioly, sacharidy, aromatické zlúčeniny, vitamíny a kofaktory, a enzýmy. Ich produkcia sa najvhodnejšie uskutočňuje prostredníctvom veľkého počtu kultúr baktérií vyvinutých na výrobu a sekréciu veľkého množstva jednej alebo viacerých požadovaných molekúl. Jedným predovšetkým vhodným organizmom na tieto účely je grampozitívna, nepatogénna baktéria Corynebacterium glutamicum. Pomocou kmeňovej selekcie sa vyvinulo mnoho mutantných kmeňov, ktoré produkujú velký počet požadovaných zlúčenín.
Avšak selekcia kmeňov so zvýšenou produkciou danej molekuly je časovo náročný a ťažký proces.
Podstata vynálezu
Predmetom predloženého vynálezu sú nové molekuly bakteriálnych nukleových kyselín, ktoré majú rôznorodé použitia. Tieto zahŕňajú identifikáciu mikroorganizmov, ktoré sa dajú využiť na produkciu špeciálnych chemikálií, moduláciu produkcie špeciálnych chemikálií v C. glutamicum alebo v príbuzných baktériách, klasifikovanie alebo identifikovanie C. glutamicum alebo príbuzných baktérií, ich použitie ako referenčné body pri mapovaní genómu C. glutamicum a ako markéry transformácie. Tieto nové molekuly nukleových kyselín kódujú proteíny, označované v tomto dokumente ako stresové, rezistenčné a tolerančné (SRT) proteíny.
C. glutamicum je grampozitívna aeróbna baktéria, ktorá sa bežne používa na priemyselnú výrobu rôznych špeciálnych chemikálií vo veľkom rozsahu a tiež na degradáciu uhľovodíkov (ako napríklad v prípadoch ropných únikov) a na oxidáciu terpenoidov. Molekuly SRT nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sa preto dajú využiť na identifikáciu mikroorganizmov, ktoré sa môžu použiť na produkciu špeciálnych chemikálií, napr. pomocou fermentačných procesov. Modulácia expresie SRT nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, alebo modifikácia sekvencie molekúl SRT nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sa môžu použiť na moduláciu produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z mikroorganizmov (napríklad na zlepšenie výťažku alebo produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z druhov Corynebacterium alebo Brevibacterium).
SRT nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu, sa dajú tiež použiť na identifikáciu takého organizmu akým je Corynebacterium glutamicum alebo veľmi príbuzného druhu, alebo na identifikáciu prítomnosti C. glutamicum alebo príbuzného druhu v zmiešanej populácii mikroorganizmov. Vynález poskytuje sekvencie nukleových kyselín mnohých génov C. glutamicum. Skúmaním extrahovanej genómovej DNA jednej kultúry alebo zmiešanej populácie mikroorganizmov v stringentných podmienkach so zameraním sa na takú oblasť C. glutamicum génu, ktorá je charakteristická pre tento organizmus, sa dá zistiť, či je tento organizmus prítomný. Hoci Corynebacterium glutamicum samotná je nepatogénna, dáva sa do súvisu s takými humánnymi patogénnymi druhmi ako Corynebacterium diphtheriae (spôsobujúcimi záškrt); detekcia takýchto organizmov má signifikantný klinický význam.
Molekuly SRT nukleových kyselín podľa predloženého vynálezu sú aj referenčnými bodmi pri mapovaní C. glutamicum genómu alebo genómov príbuzných organizmov. Podobne sú tieto molekuly alebo ich variantné formy alebo ich časti markérmi pri génových manipuláciách s druhmi Corynebacterium alebo Brevibacterium.
SRT proteíny kódované molekulami nových nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú schopné, napríklad umožniť C. glutamicum prežiť v situáciách, ktoré sú pre tento mikroorganizmus rizikové buď z chemického hľadiska, alebo sú rizikové vzhľadom na podmienky prostredia. Tým, že sa v Corynebacterium glutamicum môžu použiť klonovacie vektory, tak ako to opisujú Sinskey a kol. v americkom patentovom spise US 4,649,119, a metódy génovej manipulácie C. glutamicum a príbuzných druhov Brevibacterium (napr. lactofermentum) (Yoshihamama a kol., J. Bacteriol. 162, 591-597 (1985); Katsumata a kol., J. Bacteriol. 159, 306- 311 (1984); aSantamaria a kol., J. Gen. Microbioi. 130, 2237-2246 (1984)), môžu sa molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu využiť pri génových manipuláciách tohto organizmu s cieľom zlepšiť alebo zefektívniť produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií, a to prostredníctvom schopnosti týchto proteínov, ktorá umožňuje rast a rozmnožovanie C. glutamicum (a tiež nepretržitú produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií) v podmienkach, ktoré by normálne brzdili rast tohto organizmu, ako tomu často je počas rastu pri fermentácii vo veľkom rozsahu. Napríklad pomocou nadmernej expresie alebo takého genetického manipulovania proteázovej molekuly indukovanej teplotným šokom, že sa jej aktivita optimalizuje, môže odborník zvýšiť schopnosť baktérie degradovať nesprávne poskladané proteíny, keď na baktériu pôsobia vysoké teploty. Malé množstvo chybne poskladaných (a snáď deregulovaných alebo nefunkčných) proteínov zasahuje do normálnych reakčných mechanizmov v bunke, bunka má tým zvýšenú schopnosť normálneho fungovania pri takejto kultivácii, čo by zase malo zvyšovať jej životaschopnosť. Celkové zvýšenie počtu buniek, ktoré sú životaschopnejšie a majú väčšiu aktivitu pri kultivácii by sa malo tiež prejaviť zvýšeným výťažkom, produkciou a/alebo účinnosťou produkcie jednej alebo viacerých požadovaných špeciálnych chemikálií, a to prinajmenšom vďaka relatívne väčšiemu počtu buniek produkujúcich tieto chemikálie pri kultivácii.
Vynález poskytuje nové molekuly SRT nukleovej kyseliny, ktoré kódujú SRT proteíny, ktoré sú schopné napríklad umožňovať C. glutamicum prežiť v situáciách, ktoré sú pre tento mikroorganizmus rizikové buď z chemického hľadiska, alebo sú rizikové vzhľadom na podmienky prostredia. Molekuly nukleovej kyseliny kódujúce SRT proteín sa v tomto dokumente označujú ako molekuly SRT nukleovej kyseliny. Vo výhodnom uskutočnení sa SRT proteín zúčastňuje na metabolických dráhach, ktoré umožňujú C. glutamicum prežiť v situáciách, ktoré sú pre tento mikroorganizmus rizikové buď z chemického hľadiska, alebo sú rizikové vzhľadom na podmienky prostredia. Príkladmi takýchto proteínov sú tie, ktoré sú kódované génmi uvedenými v tabuľke 1.
Vynález sa ďalej týka molekúl izolovaných nukleových kyselín (napr. cDNA, DNA alebo RNA) s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou SRT proteín alebo jeho biologicky aktívne časti, ako aj fragmentov nukleových kyselín, ktoré sú vhodnými primérmi alebo hybridizačnými sondami na určenie alebo amplifikáciu SRT kódujúcich nukleových kyselín (napr. DNA alebo mRNA). V predovšetkým výhodných uskutočneniach obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny jednu z nukleotidových sekvencií, ktorá je uvedená s nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname (Sequence Listing) (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ....) alebo kódujúcu oblasť alebo komplementárny úsek jednej z týchto nukleotidových sekvencií. V ďalších predovšetkým výhodných uskutočneniach obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu nukleotidovú sekvenciu, ktorá sa hybridizuje na alebo je najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 %, výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % alebo dokonca výhodnejšie na najmenej 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s nukleotidovou sekvenciou uvedenou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7) alebo jej časťou. V iných výhodných uskutočneniach kóduje molekula izolovanej nukleovej kyseliny jednu z aminokyselinových sekvencií uvedených s párne očíslovanými SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname napr. (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8). Výhodne majú SRT proteíny, podľa tohto vynálezu, aspoň jednu z SRT aktivít opísaných v tomto dokumente.V ďalšom uskutočnení kóduje molekula izolovanej nukleovej kyseliny proteín alebo jeho časť, pričom proteín alebo jeho časť obsahuje takú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. takou, ktorá má párne očíslovanú sekvenciu SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), ktorá je napr. dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu tak, že proteín alebo jeho časť si udržuje SRT aktivitu. Proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny alebo jeho časť si výhodne zachováva schopnosť zvýšiť prežitie C. glutamicum v situáciách, ktoré sú pre tento mikroorganizmus rizikové buď z chemického hľadiska, alebo sú rizikové vzhľadom na podmienky prostredia. V jednom uskutočnení je proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny najmenej asi na 50 %, výhodne asi na 60%, predovšetkým výhodne asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a najvýhodnejšie asi najmenej na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s celou sekvenciou aminokyselín vybratou zo sekvencií s párne očíslovanými SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V inom výhodnom uskutočnení má proteín úplnú dĺžku proteínu C. glutamicum, ktorá je v podstate homológna s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (kódovanou systémom otvoreného čítania súboru uvedeného v príslušnom Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7).
V ďalšom výhodnom uskutočnení je molekula izolovanej nukleovej kyseliny odvodená z C. glutamicum a kóduje proteín (napr. SRT fúzny proteín), ktorý obsahuje biologicky aktívnu doménu, ktorá je najmenej asi na 50 % alebo viac homológna s jednou z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. s jednou z aminokyselinových párne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) a má schopnosť zvýšiť prežitie C. glutamicum v situáciách, ktoré sú pre tento mikroorganizmus rizikové buď z chemického hľadiska, alebo sú rizikové vzhľadom na podmienky prostredia, alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sú uvedené v tabuľke 1, a ktoré tiež obsahujú heterológne sekvencie nukleových kyselín kódujúcich heterológne polypeptidové alebo regulačné oblasti.
V ďalšom uskutočnení má izolovaná molekula nukleovej kyseliny dĺžku aspoň 15 nukleotidov a hybridizuje sa v stringentných podmienkach s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s nepárne očíslovanou SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname). Výhodne sa izolovaná molekula nukleovej kyseliny zhoduje s prirodzene sa vyskytujúcou molekulou nukleovej kyseliny. Ešte výhodnejšie usporiadanie je také, v ktorom izolovaná nukleová kyselina kóduje prirodzene sa vyskytujúci SRT proteín C.
glutamicum alebo jeho biologicky aktívnu časť.
Vynález sa ďalej týka vektorov, napr. rekombinantných expresných vektorov obsahujúcich molekuly nukleových kyselín podlá tohto vynálezu, a hostiteľských buniek, do ktorých sa tieto vektory zaviedli. V jednom uskutočnení sa takáto hostiteľská bunka použila na produkciu SRT proteínu, a to kultiváciou hostiteľskej bunky vo vhodnom médiu. SRT proteín sa potom môže izolovať z média alebo z hostiteľskej bunky.
Vynález sa dálej ešte týka geneticky zmeneného mikroorganizmu, do ktorého sa zaviedol SRT gén alebo ktorý sa modifikoval. V jednom uskutočnení sa zmenil genóm mikroorganizmu zavedením molekuly nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, kódujúcej „divý“ (wild) typ sekvencie alebo zmutovanej SRT sekvencie ako transgénu. V dálšom uskutočnení bol endogénny SRT gén v rámci genómu mikroorganizmu zmenený, napr. funkčne narušený homológnou rekombináciou so zmeneným SRT génom. V dálšom uskutočnení sa endogénny alebo zavedený SRT gén v mikroorganizme menil mutáciami, deléciami alebo inverziami v jednom alebo viacerých bodoch, ale stále kódoval funkčný SRT proteín. V ešte dálšom uskutočnení sa jedna alebo viac regulačných oblastí (napr. promótor, represor alebo induktor) SRT génu v mikroorganizme menila (napr. deléciou, trunkáciou, inverziou alebo bodovou mutáciou) tak, že expresia SRT génu sa modulovala. Vo výhodnom uskutočnení patrili mikroorganizmy do rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium, pričom Corynebacterium glutamicum bol predovšetkým výhodný. Vo výhodnom uskutočnení sa mikroorganizmus tiež použil na produkciu požadovanej zlúčeniny, napríklad aminokyseliny, predovšetkým výhodne lyzínu.
Vynález sa dálej týka spôsobu na identifikáciu prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphteriae v subjekte. Tento spôsob sa týka detekcie jednej alebo viacerých sekvencií nukleových kyselín alebo aminokyselín podľa tohto vynálezu (napr. sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname ako SEQ ID NO: 1 až 304) v subjekte, čím sa deteguje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphteriae v subjekte.
Vynález sa ešte ďalej týka izolovaného SRT proteínu alebo jeho časti, napr. jeho biologicky aktívnej časti. Vo výhodnom uskutočnení sa izolovaný SRT proteín alebo jeho časť môže mať schopnosť zvýšiť prežitie C. glutamicum v situáciách, ktoré sú pre tento mikroorganizmus rizikové buď z chemického hľadiska, alebo sú rizikové vzhľadom na podmienky prostredia. V inom výhodnom uskutočnení je izolovaný SRT proteín alebo jeho časť dostatočne homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť zvýšiť prežitie C. glutamicum v situáciách, ktoré sú pre tento mikroorganizmus rizikové buď z chemického hľadiska, alebo sú rizikové vzhľadom na podmienky prostredia.
Vynález tiež poskytuje izolovaný preparát SRT proteínu. Vo výhodných uskutočneniach obsahuje SRT proteín aminokyselinovú sekvenciu podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciu s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V inom výhodnom uskutočnení sa vynález týka celej dĺžky izolovaného proteínu, ktorý je v podstate homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) (ktorá je kódovaná otvoreným systémom čítania prislúchajúcou SEQ ID NO: uvedenou s nepárnym očíslovaním v Sekvenčnom zázname). V ešte inom uskutočnení je proteín najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 % a výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológny s úplnou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V iných uskutočneniach má izolovaný SRT proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je homológna najmenej na 50 % alebo viac s aminokyselinovými sekvenciami podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) a je schopný zlepšovať intenzitu prežívania C. glutamicum v situáciách, ktoré sú pre tento mikroorganizmus rizikové alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sa uvádzajú v tabuľke 1.
Alternatívne môže izolovaný SRT proteín obsahovať takú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach alebo je najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 % a výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológne s jednou nukleotidovou sekvenciou zo súboru s párne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname. Je tiež výhodné, že výhodné formy SRT proteínov majú tiež jednu alebo viac SRT bioaktivít, ktoré sa uvádzajú v tomto dokumente.
SRT polypeptid alebo jeho biologicky aktívna časť sa môže účinne spojiť s polypeptidom, ktorý nemá SRT aktivitu za vzniku fúzneho proteínu. Vo výhodných uskutočneniach má tento fúzny proteín odlišné aktivity v porovnaní so samotným SRT proteínom. V ďalších výhodných uskutočneniach má tento fúzny proteín za následok zvýšené výťažky, produkciu a/alebo účinnosť produkcie požadovaných špeciálnych chemikálií z C. glutamicum. V predovšetkým výhodných uskutočneniach sa integrovaním tohto fúzneho proteínu do hostiteľskej bunky moduluje produkcia požadovanej zlúčeniny bunkou.
Vynález sa ďalej týka spôsobu skríningu molekúl, ktoré modulujú aktivitu SRT proteínu buď pomocou interakcie so samotným proteínom alebo substrátom alebo väzobným partnerom SRT proteínu alebo pomocou modulácie transkripcie alebo translácie molekuly SRT nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu.
Vynález sa ďalej týka spôsobu produkcie špeciálnej chemikálie. Tento spôsob spočíva v kultivácii bunky obsahujúcej vektor, ktorý riadi expresiu molekuly SRT nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu tak, aby sa produkovala špeciálna chemikália. Vo výhodnom uskutočnení tento spôsob v ďalšom zahŕňa krok získania bunky obsahujúcej takýto vektor, pričom pri tomto spôsobe sa bunka transfekuje s vektorom riadiacim expresiu SRT nukleovej kyseliny. V inom výhodnom uskutočnení zahŕňa okrem toho tento spôsob postup získania špeciálnej chemikálie z kultúry. V predovšetkým výhodnom uskutočnení sa použila bunka rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium, alebo sa vybrala z kmeňov, ktoré sú uvedené v Tab. 3.
Vynález sa ďalej týka spôsobov modulovania produkcie molekuly z mikroorganizmu. Takéto spôsoby zahŕňajú spôsoby kontaktovania bunky sagensom, ktorý moduluje aktivitu SRT proteínu alebo expresiu SRT nukleovej kyseliny tak, že bunková aktivita sa mení v porovnaní s rovnakou aktivitou v neprítomnosti agensa. Vo výhodnom uskutočnení sa bunka moduluje na rezistenciu na jednu alebo viacero toxických chemikálií alebo rezistenciu na jeden alebo viac stresov vyvolaných podmienkami prostredia tak, že výťažky alebo rýchlosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie týmto mikroorganizmom sa zvýšia. Agensom, ktorý moduluje aktivitu SRT proteínu môže byť agens, ktorý stimuluje aktivitu SRT proteínu alebo expresiu SRT nukleovej kyseliny. Príkladmi agensov, ktoré stimulujú aktivitu SRT proteínu alebo expresiu SRT nukleovej kyseliny sú malé molekuly, aktívne SRT proteíny a nukleové kyseliny kódujúce SRT proteíny, ktoré boli zavedené do bunky. Príkladmi agensov, ktoré inhibujú SRT aktivitu alebo expresiu sú malé molekuly a nezmyselné (antisense) molekuly SRT nukleovej kyseliny.
Vynález sa ďalej týka spôsobov modulovania výťažkov požadovanej zlúčeniny z bunky, medzi ktoré patrí zavádzanie „divého“ alebo mutovaného typu SRT génu do bunky, buď udržiavaného na separátnom plazmide alebo integrovaného do genómu hostiteľskej bunky. Pri integrácii do genómu môže nastať náhodná integrácia alebo homológna rekombinácia, takže natívny gén sa nahradí zavedenou kópiou a spôsobí produkciu požadovanej zlúčeniny bunkou, ktorá sa má modulovať. Vo výhodnom uskutočnení sú vyššie spomínané zvýšené. V inom výhodnom uskutočnení sú vyššie uvedenými chemikáliami špeciálne chemikálie. V predovšetkým výhodnom uskutočnení sú vyššie uvedenými špeciálnymi chemikáliami aminokyseliny. V obzvlášť výhodných uskutočneniach je uvedenou aminokyselinou L-lyzín.
Podrobný opis vynálezu
Predložený vynález poskytuje SRT nukleovokyselinové a proteínové molekuly, ktoré sú zapojené do procesu prežitia C. glutamicum pri vystavení tohto mikroorganizmu chemickým rizikám alebo rizikám vzhľadom na podmienky prostredia. Molekuly podľa tohto vynálezu, sa môžu využiť pri modulácii produkcie špeciálnych chemikálií z mikroorganizmov, pretože tieto SRT proteíny poskytujú možnosť kontinuálneho rastu a rozmonožovania C. glutamicum v prítomnosti toxických chemikálií alebo v rizikových podmienkach prostredia, ktoré sa vyskytujú počas rastu pri fermentáciách vo veľkých rozmeroch. Pomocou zvyšovania rastovej rýchlosti alebo aspoň udržiavaním normálneho rastu navzdory zlým, i keď netoxickým podmienkam, môže odborník zvýšiť výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie jednej alebo viacerých chemikálií z takejto kultivácie, a to prinajmenšom vďaka relatívne väčšiemu počtu buniek produkujúcich špeciálnu chemikáliu pri kultivácii. Aspekty vynálezu sú vysvetlené v ďalšom texte.
I. Špeciálne chemikálie
Pojem „špeciálne chemikálie“ je zaužívaný technický pojem a zahŕňa molekuly produkované organizmom, ktoré majú rôznorodé priemyselné použitia, v takých priemyselných odvetviach, ale nielen v nich, akými sú farmaceutický, poľnohospodársky a kozmetický priemysel. Tieto zlúčeniny zahŕňajú také organické kyseliny, ako kyselinu vínnu, kyselinu itakonovú a kyselinu diaminopimelovú, aminokyseliny aj proteínového aj neproteínového pôvodu, purínové a pyrimidínové bázy, nukleozidy anukleotidy (ako sa to opisuje napr. v Kuninaka, A. (1966), Nucleotides and related compounds, str. 561-612, v Biotechnology vol. 6, Rehm a kol., eds. VCH, Weinheim a v odkazoch tam uvedených), lipidy, nasýtené aj nenasýtené mastné kyseliny (napr. kyselinu arachidonovú), dioly (napr. propándiol abutándiol), sacharidy (napr. kyselinu hyalurónovú a trehalózu), aromatické zlúčeniny (napr. aromatické amíny, vanilín a indigo), vitamíny a kofaktory (podľa opisu vUllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, „Vitamins“, str.. 443-613 (1996) VCH, Weinheim a v odkazoch tam uvedených avOng, A.S., Niki, E.& Packer, L. (1995) „Nutrition, Lipids, Health and Disease“ Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and Society for Free Radical Research - Asia, konanej 1.-3. septembra 1994 v Penang, Malajzia, AOCS Press, (1995)), enzýmy, polyketidy (Čane a kol., (1998) Science 282, 63-68) a všetky ďalšie chemikálie opísané vGutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN, 0818805086 a v odkazoch tam uvedených. Metabolizmus a použitie určitých špeciálnych chemikálií sú vysvetlené v ďalšom texte.
A. Metabolizmus aminokyselín a použitia
Základnými štruktúrnymi jednotkami všetkých proteínov sú aminokyseliny a ako také sú esenciálne pre normálnu bunkovú činnosť vo všetkých organizmoch. Pojem „aminokyselina“ je zaužívaný technický pojem. Aminokyseliny proteínového pôvodu, ktorých je 20 druhov, sú štrukturálnymi jednotkami proteínov, v ktorých sú viazané peptidovými väzbami, kým aminokyseliny neproteínového pôvodu (ktorých sú známe stovky) sa spravidla nevyskytujú v proteínoch (pozri Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str. 57-97 VCH, Weinheim (1985)). Aminokyseliny môžu byť v D- alebo L-optickej konfigurácii, i keď L- aminokyseliny sú vo všeobecnosti jediný druh, ktorý sa zistil v prirodzene sa vyskytujúcich proteínoch. Biosyntetické a degradačné cesty každej z 20 aminokyselín proteínového pôvodu sú dobre známe v prokaryotických, ako aj v eukaryotických bunkách (pozri napr. Stryer, L. Biochemistry, 3. vydanie, strany 578-590 (1988)). „Esenciálne“ aminokyseliny (histidín, izoleucín, leucín, lyzín, metionín, fenylalanín, treonín, tryptofán avalín), ktoré sú takto nazvané, pretože sú obvykle nutritívnou požiadavkou z dôvodu zložitosti ich biosyntéz, sa ľahko jednoduchými biosyntetickými cestami menia na ostatných 11 „neesenciálnych“ aminokyselín (alanín, arginín, asparagín, aspartát (kyselina asparágová), cysteín, glutamát (kyselina glutámová), glutamín, glycín, prolín, serín a tyrozín). Vyššie živočíchy si udržiavajú schopnosť syntetizovať niektoré z týchto aminokyselín, ale esenciálne aminokyseliny sa musia dodať výživou, aby mohla prebiehať normálna biosyntéza. proteínov.
Bez ohľadu na ich funkciu v biosyntéze proteínov, sú tieto aminokyseliny zaujímavé chemikálie so sebe vlastnými schopnosťami a mnohé našli uplatnenie v rôznych aplikáciách v potravinárskom, krmovinárskom, kozmetickom, poľnohospodárskom a farmaceutickom priemysle. Lyzín je dôležitá aminokyselina nielen vo výžive ľudí, ale aj monogastrických živočíchov ako hydiny a ošípaných. Glutamát sa najčastejšie používa ako chuťová prísada (glutamát sodný, MSG) a vo veľkom rozsahu sa v rámci potravinárskeho priemyslu používa aj aspartát, fenylalanín, glycín a cysteín. Glycín, L-metionín a aj tryptofán sa využívajú vo farmaceutickom priemysle. Glutamín, valín, leucín, izoleucín, histidín, arginín, prolín, serín a alanín sa používajú aj vo farmaceutickom aj v kozmetickom priemysle. Treonín, tryptofán a D/L-metionín sú bežnými kŕmnymi aditívami (Leuchtenberger, W. (1996) Amino aids - technical production and use, str. 466-502 v Rehm a kol. (eds.) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH, Weinheim), Okrem toho sa zistilo, že tieto aminokyseliny sú vhodnými prekurzormi na syntézu syntetických aminokyselín a proteínov, ako N-acetylcysteínu, S-karboxymetyl-L-cysteínu, (S)-5-hydroxytryptofánu a ďalších opísaných v Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str.. 57-97, VCH, Weinheim, 1985.
Biosyntéza týchto prírodných aminokyselín takými organizmami schopnými ich produkcie ako sú baktérie, je dobre známa, (pozri prehľad o bakteriálnej biosyntéze aminokyselín a jej regulácii Umbarger, H. E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47, 533606). Glutamát sa syntetizuje redukčnou amináciou α-ketoglutarátu, medziproduktu v cykle kyseliny citrónovej. Glutamín, aj prolín a arginín vznikajú potom z glutamátu. Biosyntéza serínu je trojkrokový proces, ktorý sa začína od 3-fosfoglycerátu (medziproduktu pri glykolýze) a končí touto aminokyselinou po kroku oxidácie, transaminácie a hydrolýzy. Aj cysteín aj glycín vznikajú zo serínu; cysteín kondenzáciou homocysteínu so serínom a glycín prenosom bočného reťazca βuhlíkového atómu na tetrahydrofolát reakciou, ktorú katalyzuje seríntranshydroxymetyláza. Fenylalanín a tyrozín sa syntetizujú z glykolytických a pentózofosfátových prekurzorov erytrózo-4-fosfátu a fosfoenolpyruvátu 9-krokovou biosyntetickou cestou, ktorá sa líši len v konečných dvoch krokoch po syntéze prefenátu. Tryptofán vzniká tiež z týchto dvoch počiatočných molekúl, ale jeho syntéza je 11 - kroková cesta. Tyrozín sa môže tiež syntetizovať z fenylalanínu reakciou, ktorú katalyzuje fenylalanínhydroxyláza. Alanín, valín a aj leucín sú biosyntetické produkty pyruvátu, konečného produktu glykolýzy. Aspartát vzniká zoxalacetátu, medziproduktu cyklu kyseliny citrónovej. Asparagín, metionín, treonín a aj lyzín vznikajú konverziou aspartátu. Izoleucín vzniká ztreonínu. Zložitá 9-kroková cesta končí vznikom histidínu z 5-fosforibozyl-1-pyrofosfátu, aktivovaného sacharidu.
Viac aminokyselín ako je potrebných na syntézu proteínov sa nemôže uchovávať v bunke a namiesto toho sa degradujú, pričom poskytujú medziprodukty pre hlavné metabolické dráhy bunky (pozri prehľad Stryer, L. Biochemistry 3. ed., Ch. 21 „Annino Acid Degradation and Urea Cycle“str. 495-516 (1988)). Hoci bunka je schopná premieňať nežiaduce aminokyseliny na užitočné metabolické medziprodukty, je produkcia aminokyselín z energetického hľadiska náročná, vyžaduje prekurzorové molekuly a enzýmy na ich syntézu. Tak nie je prekvapujúce, že biosyntéza aminokyselín je regulovaná inhibíciou spätnou väzbou, pri ktorej prítomnosť určitej aminokyseliny spôsobí spomalenie alebo celkom zastavenie jej produkcie (pozri súhrn o mechanizmoch spätnej väzby v aminokyselinových biosyntetických dráhach v Stryer, L. Biochemistry, 3. ed. Ch. 24: Biosynthesis of Amino Acids and Heme“str. 575-600 (1988)). Tak produkcia každej jednotlivej aminokyseliny je ohraničená množstvom tej aminokyseliny, ktorá je prítomná v bunke.
B. Metabolizmus vitamímov, kofaktorov a „nutraceutík“ a použitia
Vitamíny, kofaktory a nutraceutiká predstavujú ďalšiu skupinu molekúl, ktorých schopnosť syntézy vyššie živočíchy stratili, a tak sa musia prijímať potravou, i keď iné organizmy, napríklad baktérie, ich ľahko syntetizujú. Tieto molekuly sú buď bioaktívnymí substanciami, alebo sú prekurzormi biologicky aktívnych látok, ktoré sú prenášačmi elektrónov alebo sú to medziprodukty v rozmanitých metabolických dráhach. Okrem ich nutritívnej hodnoty majú tieto zlúčeniny tiež signifikantnú priemyselnú hodnotu ako farbivá, antioxidanty a katalyzátory alebo iné technologické pomocné látky. (Pozri napr. súhrn o štruktúre, aktivite a priemyselných aplikáciách týchto zlúčenín v Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, „Vitamins“ vol. A27, str. 443-613, VCH, Weinheim, 1966). Pojem „vitamín“ je zaužívaný technický pojem a zahŕňa živiny, ktoré organizmus potrebuje na normálne fungovanie, ale ktoré si organizmus nevie sám syntetizovať. Do skupiny vitamínov možno zahrnúť kofaktory a nutraceutické zlúčeniny. Pojem „kofaktor“ predstavuje zlúčeniny neproteínového pôvodu, ktoré sú potrebné na normálnu enzymatickú aktivitu. Tieto zlúčeniny môžu byť organické alebo anorganické; kofaktorové molekuly v predloženom vynáleze sú výhodne organické. Pojem „nutraceutikum“ zahŕňa potravinové doplnky, ktoré majú užitočný vplyv na zdravotný stav rastlín, zvierat a hlavne ľudí. Príkladmi takýchto molekúl sú vitamíny, antioxidanty a tiež niektoré lipidy (napr. polynenasýtené mastné kyseliny).
Biosyntéza týchto molekúl v organizmoch, ktoré sú schopné ich produkcie, napríklad v baktériách, je zoširoka opísaná (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, „Vitamins“ vol. A27,str. 443-613, VCH, Weinheim, 1966; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways, An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E & Packer, L (1995) „Nutrition, Lipids, Health and Disease“ Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia, konanej 1.- 3. septembra 1994 v Penang, Malajzia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S).
Tiamín (vitamín B^ sa tvorí chemickým viazaním podielov pyrimidínu a tiazolu. Riboflavín (vitamín B2) sa syntetizuje zguanozín-5'-trifosfátu (GTP) aribózo-5'fosfátu. Samotný riboflavín sa využíva na syntézu flavínmononukleotidu (FMN) a flavínadeníndinukleotidu (FAD). Rodina zlúčenín so spoločným názvom „vitamín B6“ (napr. pyridoxín, pyridoxamín, pyridoxal-5'-fosfát a komerčne používaný pyridoxín hydrochlorid) sú všetko deriváty spoločnej štruktúrnej jednotky, 5-hydroxy-6metylpyridínu. Pantotenát (kyselina pantoténová, (R)-(+)-N-(2,4-dihydroxy-3,3dimetyl-1-oxobutyl)^-alanín) sa môže vyrábať buď chemickou syntézou alebo fermentačne. Konečné kroky pri biosyntéze kyseliny pantoténovej pozostávajú z ATP-riadenej kondenzácie β-alanínu a kyseliny pantoovej. Enzýmy zodpovedné za biosyntetické kroky konverzie na kyselinu pantoovú, β-alanín a za kondenzáciu na kyselinu pantoténovú sú známe. Metabolický aktívna forma pantotenátu je koenzým
A, ktorého biosyntéza je 5 krokový enzymatický postup. Pantotenát, pyridoxal-5'fosfát, cysteín a ATP sú prekurzory koenzýmu A. Tieto enzýmy, nielenže katalyzujú tvorbu kyseliny pantoténovej, ale tiež produkujú (R)-pantoovú kyselinu, (R)pantolaktón, (R)-pantenol (provitamín B 5.), pantoteín (a jeho deriváty) a koenzým A.
Biosyntéza biotínu z prekurzorovej molekuly pimeloyl-CoA v mikroorganizmoch sa detailne študovala a identifikovali sa niektoré gény zapojené do tohto procesu. Zistilo sa, že mnohé príslušné proteíny sú zapojené do syntézy Fe-clasteru a sú členmi nifS triedy proteínov. Kyselina lipoová je odvodená z kyseliny oktánovej a je koenzýmom v energetickom metabolizme, ktorý je súčasťou pyruvátdehydrogenázového komplexu a α-ketoglutarátdehydrogenázového komplexu. Foláty sú skupinou látok, ktoré sú všetky derivátmi kyseliny listovej, ktorá je samotná odvodená z kyseliny L-glutámovej, p-aminobenzoovej kyseliny a 6-metylpterínu. Biosyntéza kyseliny listovej a jej derivátov začínajúca sa od metabolických medziproduktov guanozín-5'-trifosfátu (GTP), L-glutámovej kyseliny a kyseliny paminobenzoovej sa podrobne skúmala v určitých mikroorganizmoch.
Korinoidy (ako kobalamíny a predovšetkým vitamín ΒΊ2) a porfyríny patria do skupiny chemikálií vyznačujúcich sa tetrapyrolovým kruhovým systémom. Biosyntéza vitamínu B12 je tak zložitá, že nie je úplne charakterizovaná, ale mnohé enzýmy a substráty zapojené do biosyntézy sú už známe. Kyselina nikotínová (nikotinát) a nikotínamid sú pyridínové deriváty, ktoré sa tiež označujú ako „niacín“. Niacín je prekurzorom dôležitých koenzýmov NAD (nikotínamidadeníndinukleotidu) a NADP (nikotínamidadeníndinukleotidfosfátu) a ich redukovaných foriem.
Výroba týchto chemikálií vo veľkom rozsahu je väčšinou odkázaná na bezbunkové chemické syntézy, i keď niektoré tieto chemikálie, ako riboflavín, vitamín B6, pantotenát a biotín, sa tiež vyrobili kultiváciou mikroorganizmov vo veľkom rozsahu. Len vitamín B12 sa vyrába výhradne fermentačne, a to kvôli zložitosti jeho syntézy. In vitro metodológie vyžadujú značné materiálové vstupy a čas, často pri vysokých nákladoch.
C. Metabolizmus purínov, pyrimidínov, nukleozidov a nukleotidov a použitia
Gény metabolizmu purínov a pyrimidínov a im prislúchajúce proteíny sú významými cieľmi terapie nádorových ochorení a vírusových infekcií. Pojem „purín alebo pyrimidín“ označuje dusíkaté bázy, ktoré sú zložkami nukleových kyselín, koenzýmov a nukleotidov. Názov „nukleotid“ zahrňuje základné štruktúrne jednotky molekúl nukleových kyselín, ktoré pozostávajú z dusíkatej bázy, pentózového sacharidu (v prípade RNA je sacharidom ribóza; v prípade DNA je sacharidom Ddeoxyribóza) a kyseliny fosforečnej. Pojem „nukleozid“ zahŕňa molekuly, ktoré sú prekurzormi nukleotidov, ale ktoré neobsahujú ako zložku kyselinu fosforečnú, túto majú nukleotidy. Inhibovaním biosyntézy týchto molekúl, alebo ich aktivovaním na tvorbu molekúl nukleových kyselín, je možné inhibovať syntézu RNA a DNA; inhibovaním tejto aktivity spôsobom cieleným na karcinogénne bunky sa môže inhibovať schopnosť nádorových buniek deliť sa a replikovať sa. Navyše sú to nukleotidy, ktoré nevytvárajú molekuly nukleových kyselín, ale skôr fungujú ako energetické zásoby (t.j. AMP) alebo ako koenzýmy (t.j. FAD a NAD).
Niekoľko publikácií opisuje použitie týchto chemikálií na lekárske indikácie pomocou ovplyvňovania purínového a/alebo pyrimidínového metabolizmu (napr. Christopherson, R. I. and Lyons, S. D. (1990) „Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents“ Med. Res. Reviews, 10, 505548). Výskumy enzýmov zahrnutých do purínového a pyrimidínového metabolizmu sa zamerali na vývoj nových liečiv, ktoré by sa mohli použiť napríklad ako imunosupresíva alebo antiproliferatiká (Smith, J. L., (1995) „Enzymes in nucleotide synthesis“ Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 752-757; (1995) Biochem Soc. Transact. 23, 877-902). Avšak purínové a pyrimidínové bázy, nukleozidy a nukleotidy majú ďalšie využitia: ako medziprodukty pri biosyntéze viacerých špeciálnych chemikálií (napr. tiamínu, S-adenozyl-metionínu, folátov alebo riboflavínu), ako bunkové energetické prenášače (napr. ATP alebo GTP) a ako samotné chemikálie sa bežne používajú ako prostriedky na zvýraznenie chuti a vône (napr. IMP alebo GMP) alebo vo viacerých lekárskych aplikáciách (pozri napr. Kunianaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology, vol.6, Rehm a kol., VCH, Weiheim, str. 561-612). Taktiež enzýmy, podieľajúce sa na metabolizme purínov, pyrimidínov, nukleozidov alebo nukleotidov čoraz viac slúžia ako ciele, proti ktorým boli vyvinuté chemikálie na ochranu poľnohospodárskych plodín ako fungicídy, herbicídy a insekticídy.
Metabolizmus týchto zlúčenín sa charakterizoval v baktériách (pozri napr. prehľad Zalkin, H. and Dixon, J. E. (1992) „de novo purine nucleotide biosynthesis“, v Progress iri Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic Press, str. 259-287; a Michal, G. (1999) „Nucleotides and Nucleosides“, Chapter8 v Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York). Purínový metabolizmus bol predmetom intenzívneho výskumu a je esenciálny pre normálne fungovanie bunky. Oslabený purínový metabolizmus môže u vyšších živočíchov spôsobovať závažné choroby ako napríklad dnu. Purínové nukleotidy sa syntetizujú z ribózo-5-fosfátu sériovými krokmi cez medziproduktovú zlúčeninu inozín-5'-fosfát (IMP), končiacimi vznikom guanozín-5'-monofosfátu (GMP) alebo adenozín-5'-monofosfátu (AMP), z ktorých sa ľahko vytvárajú trifosfátové formy využiteľné ako nukleotidy. Tieto zlúčeniny sa tiež využívajú ako energetické zdroje, pretože ich degradácia poskytuje energiu pre mnoho rôznych biochemických procesov v bunke. Biosyntéza pyrimidínov pokračuje tvorbou uridín-5'-monofosfátu (UMP) z ribózo-5'-fosfátu. UMP sa zase premení na cytidín-5'-trifosfát (CTP). Deoxyformy všetkých týchto nukleotidov vznikajú jednokrokovou redukčnou reakciou z difosfátribózovej formy nukleotidu na difosfátdeoxyribózovú formu nukleotidu. Na základe fosforylácie sú tieto molekuly schopné podieľať sa na syntéze DNA.
D. Metabolizmus trehalózy a použitia
Trehalóza pozostáva z dvoch glukózových molekúl spojených α,α-1,1 väzbou. Zvyčajne sa používa v potravinárskom priemysle ako sladidlo, aditívum pre sušené alebo mrazené potraviny a v nápojoch. Ale uplatňuje sa tiež vo farmaceutickom, kozmetickom a biotechnologickom priemysle (pozri napr. Nishimoto a kol., (1998) americký patentový spis č. US 5,759,610; Singer, M.A. and Lindquist, S. (1998) Trends Biotech., 16, 460-467; Paiva, C.L.A. a Panek, A:D. (1996) Biotech. Ann. Rev., 2, 293 - 314; a Shiosaka, M. (1977) J. Japan 172, 97 -102). Trehalózu produkujú pomocou enzýmov mnohé mikroorganizmy a prirodzene sa vylučuje do okolitého média, z ktorého sa môže zachytávať metódami známymi v danej oblasti techniky
II. Rezistencia na poškodenie spôsobené chemikáliami, stresom z okolitého prostredia a antibiotikami
Produkcia špeciálnych chemikálií sa väčšinou uskutočňuje pomocou kultivácií baktérií vo veľkých rozmeroch, ktoré sa vyvinuli za účelom produkcie a sekrécie veľkých množstiev týchto molekúl. Avšak pri takomto spôsobe fermentácie sú mikroorganizmy podrobené stresom rôzneho druhu. Tieto stresy zahrňujú stresy pochádzajúce z okolitého prostredia a chemické stresy.
A. Rezistencia na stres pochádzajúci z okolitého prostredia
Príkladmi stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia, ktoré sa väčšinou vyskytujú pri fermentácii kultúr vo veľkom rozsahu sú mechanický stres, teplotný stres, stres spôsobený nedostatkom kyslíka, stres spôsobený kyslíkovými radikálmi, stres z pH a osmotický stres. Mechanizmus miešania, ktorý sa používa vo väčšine veľkokapacitných fermentorov na zabezpečenie prevzdušňovania kultúry produkuje teplo, a teda i zvyšuje teplotu kultúry. Zvyšovaním teploty sa indukuje dobre známa odpoveď na teplotný šok, pri ktorom sa exprimuje súbor proteínov, ktoré nielenže napomáhajú baktériám prežiť navzdory vysokým teplotám, ale tiež zvyšujú prežitie pri pôsobení mnohých iných stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia (pozri Neidhardt, F.C. a kol., eds. (1996) E. coli and Salmonella. ASM Press, Washington, D.C., str. 1382-1399; Wosten, M. M. (1998) FEMS Microbiology Reviews 22(3): 12750; Bahl, H. a kol.. (1995) FEMS Microbiology Reviews 17(3), 341-348; Zimmerman, J.L., Cohill, P.R. (1991) New Biologist 3(7): 641-650; Samali, A., and Orrenius, S. (1998) Celí. Stress Chaperones 3(4): 228-236, a odkazy uvedené v každej z týchto citácií). Špecifické sigma faktory a ďalšie bunkové regulátory génovej expresie napomáhajú v baktériách regulovať odpoveď na teplotný šok (Hecker, M., Volker, U (1998). Molecular Microbiology 29(5), 1129-1136). Jeden z najväčších problémov, ktorému je bunka vystavená pri pôsobení vysokej teploty je ten, že skladanie proteínu je narušené; nascentné proteíny majú pri výskyte vysokej teploty dostatočnú kinetickú energiu, takže pre rastúci polypeptidový reťazec je ťažké zotrvať dosť dlho v stabilnej konformácii potrebnej na to, aby sa správne poskadal. Takto sa počas odpovede na teplotný šok exprimujú dva kľúčové typy proteínov - šaperóny (proteíny, ktoré sprevádzajú iné proteíny pri ich skladaní alebo vyrovnávaní - pozri, napr., Fink, A.L. (1999) Physiol. Rev. 79(2), 425-449), a proteázy, ktoré môžu rozrušiť ktorýkoľvek nesprávne poskladaný proteín. Príkladmi šaperónov exprimujúcich sa počas odpovede na teplotný šok sú GroEL and DNAK a príkladmi proteáz, ktoré sú známe tým, že sa exprimujú počas bunkovej reakcie na teplotný šok sú Lon, FtsH, a CIpB.
Okrem teplotných stresov môžu stresovú odpoveď tiež vyprovokovať ďalšie stresy pochádzajúce z okolitého prostredia. I keď proces miešania vo fermentore sa používa na zavedenie kyslíka do kultúry, kyslíková zásoba môže byť limitovaná, predovšetkým vtedy, keď kultúra progresívne rastie a kyslíková potreba pre kultúru je v dôsledku toho zvýšená; nedostatočný prívod kyslíka je ďalším stresom pre mikroorganizmus. Pri kultivácii vo fermentore sú bunky vystavené mnohým osmotickým stresom; predovšetkým vtedy, keď sa pridávajú živiny do kultúry, čo má za následok vysokú extracelulárnu a nízku intracelulárnu koncentráciu týchto molekúl. Ďalej k osmotickému stresu baktérií môžu prispievať aj veľké množstvá požadovaných molekúl, ktoré produkujú tieto organizmy pri kultivácii. Napokon, pri aeróbnom metabolizme, aký využíva C. glutamicum, vzniká oxid uhličitý ako odpadový produkt, vylučovanie tejto molekuly môže okysličovať živnú pôdu v dôsledku konverzie tejto molekuly na karboxylovú kyselinu. Takto sú baktérie pri kultivácii často vystavené stresu z kyslého pH prostredia. Opak môže byť tiež pravdou vtedy, keď je v živnej pôde vysoký obsah zásaditých odpadových molekúl, ako amóniového radikálu, kedy sú baktérie práve tak vystavené stresu zo zásaditého pH prostredia.
Na potlačenie takýchto stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia majú baktérie špeciálne génové systémy, ktoré sa exprimujú pri vystavení jednému alebo viacerým stresom, napríklad vyššie spomínanému systému teplotného šoku. Gény, ktoré sa exprimovali ako odpoveď na osmotický stres, kódujú napríklad proteíny, ktoré sú schopné transportovať alebo syntetizovať kompatibilné rozpustené látky, takže osmotický vstup alebo výstup príslušnej molekuly je znížený na zvládnuteľné hladiny. Ďalšími príkladmi bakteriálnych proteínov indukovaných stresom sú proteíny zahrnuté do biosyntézy trehalózy, tie, ktoré kódujú enzýmy zahrnuté v metabolizme ppGpp, zahrnuté v signálnej transdukcii, zvlášť tie, ktoré kódujú dvoj-zložkové systémy, ktoré sú citlivé na osmotický tlak a tie, ktoré kódujú transkripčné faktory, ktoré sú citlivé na rôzne stresové faktory (napr., RssB analógy a/alebo sigma faktory). V danej oblasti techniky sú známe aj mnohé ďalšie takéto gény a ich proteínové produkty.
B. Rezistencia na chemický stres
Bez ohľadu na stresy pochádzajúce z okolitého prostredia sú bunky vystavené tiež mnohým chemickým stresom. Tieto patria do dvoch kategórií. Do prvej kategórie patria odpadové produkty metabolizmu a ďalších bunkových procesov, ktoré bunka vylučuje do obklopujúceho média. Do druhej kategórie patria chemikálie, ktoré sú prítomné v extracelulárnom médiu, pričom ale nepochádzajú z bunky. Vo všeobecnosti, keď bunky vylučujú toxické odpadové produkty z koncentrovanej intracelulárnej cytoplazmy do relatívne omnoho zriedejšieho extracelulárneho média, tak tieto produkty sa rozptýlia tak, že extracelulárne hladiny snáď toxickej zlúčeniny sú celkom nízke. Avšak pri fermentačnej kultivácii baktérie vo veľkom rozmere to nie je tento prípad, pretože mnohé baktérie rastú v relatívne malom prostredí a s takou vysokou metabolickou rýchlosťou, že sa odpadové produkty môžu akumulovať v médiu na skoro toxické hladiny. Príkladmi takýchto odpadov sú oxid uhličitý, kovové ióny a reaktívne formy kyslíka ako napríklad peroxid vodíka. Tieto zlúčeniny môžu interferovať s aktivitou alebo štruktúrou bunkových povrchových molekúl, alebo môžu opätovne vnikať do bunky, kde môžu vážne poškodiť proteíny a tak isto nukleové kyseliny. V extracelulárnom médiu sa môžu prirodzene vyskytovať aj určité iné chemikálie, ktoré sú rizikové pre normálne fungovanie buniek. Napríklad, kovové ióny ako ortuť, kadmium, nikel alebo meď sa často zistili vo vodných zdrojoch a môžu vytvárať pevné komplexy s bunkovými enzýmami, ktoré zabraňujú proteínom, aby normálne fungovali.
C. Rezistencia na antibiotiká
V extracelulárnom prostredí sa tiež môžu zistiť baktericídne proteíny alebo antibiotiká, a to buď v dôsledku zásahu výskumníka, alebo môže ísť o prirodzený produkt z iného organizmu použitého za účelom získania konkurenčnej výhody. V danej oblasti techniky sú dobre známe niektoré mechanizmy, ktorými sa mikroorganizmy ochraňujú pred antimikrobiálnymi chemikáliami. Degradácia, modifikácia a export zlúčenín, ktoré sú toxické pre bunku, sú bežné metódy pomocou ktorých mikroorganizmy odstraňujú alebo detoxikujú antibiotiká. Cytoplazmatické “pumpy na vylučovanie” (“efflux-pumps”) sú známe vo viacerých prokaryotoch a sú podobné proteínom tzv. “multiliekovej rezistencie” vyšších eukaryotov (Neyfakh, A. A. a kol., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4781-4785). Príkladmi takýchto proteínov sú emrAB z E. coli (Lomovskaya, O. and K. Lewis (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8938-8942), ImrB z B. subtilis (Kumano, M. a kol., (1997) Microbiology 143, 2775-2782), smr z S. aureus (Grinius, L.G. a kol., (1992) Plasmid 27: 119-129) alebo cmr z C. glutamicum (Kaidoh, K. a kol., (1997) Micro. Drug Resist. 3i 345-350). C. glutamicum samotná je nepatogénna, na rozdiel od niekoľkých iných členov rodu Corynebacteríum, ako C. diphtheríae alebo C. pseudotuberculosis. Vie sa, že niekoľko patogénnych Corynebacteria má multirezistenciu na rôzne antibiotiká, ako
C. jeikeium a C. urealyticum (Soriano, F. a kol., (1995) Antimicrob. Agents
Chemother. 39: 208-214).
Linkozamidy sú uznané ako účinné antibiotiká proti druhom Corynebacterium (Soriano, F. a kol., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 208-214). Neočakávaným výsledkom predloženého vynálezu bola identifikácia génu kódujúceho proteín zodpovedný za rezistenciu na linkozamid (predovšetkým, proteín zodpovedný za rezistenciu na linkomycín). The LMRB proteín z C. glutamicum vykazuje 40 % homológiu s produktom ImrB génu z B. subtilis (pozri Genbankové akcesné č. AL009126), ktorá sa vypočítala pri použití verzie 1.7 programu CLUSTALW (Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson, T. J. (1994) Nucl. Acids Res. 22: 4673-4680) pri použití štandardných parametrov: “(PAIRWISE ALIGNMENT PARAMETERS: slow/accurate alignments: Gap Open Penalty = 10.00, Gap Extension Penalty = 0.10, Proteín weight matrix = BLOSUM 30, DNA weight matrix = IUB, Fast/Approximate alignments: Gap penalty = 3, K-tuple (word) size = 1, No. of top diagonals = 5, Window size = 5, Toggle Slow/Fast pairwise alignments = slow. Multiple alignment parameters: Gap Opening Penalty = 10.00, Gap Extension Penalty = 0.05, Delay divergent sequences = 40%, DNA transitions weight = 0.50, Proteín weight matrix = BLOSUM šerieš, DNA weight matrix = IUB, Use negatíve matrix = OFF)”.
Stres pochádzajúci z okolitého prostredia, chemický stres a antibiotický alebo iný antimikrobiálny stres môžu vplývať na to, ako sa správajú mikroorganizmy počas fermentorovej kultivácie, a môžu ovplyvňovať aj produkciu požadovanej zlúčeniny z týchto organizmov. Napríklad, osmotický stres môže spôsobiť to, že mikroorganizmus neprimerane alebo neprimerane rýchlo prijíma jednu alebo viac zlúčenín, čo môže napokon viesť k bunkovému poškodeniu alebo odumretiu v dôsledku osmotického šoku. Podobne, ak sú v kultúre prítomné chemikálie, ktoré sú buď exogénne pridané (napr. antimikrobiálne zlúčeniny kvôli odstráneniu nežiaducich mikróbov) alebo sú vytvárané samotnými baktériami (napr. odpadové zlúčeniny, ako sú ťažké kovy alebo kyslíkové radikály, alebo dokonca antimikrobiálne zlúčeniny) tieto môžu mať za následok inhibovanie produkcie špeciálnej chemikálie alebo dokonca odumretie organizmu. Gény podľa tohto vynálezu kódujú C. glutamicum proteíny, ktoré pôsobia proti poškodeniu a odumretiu bunky, a to pomocou špecifického pôsobenia na zdroj alebo vplyv okolitého prostredia alebo chemický stres.
III. Pojmy a spôsoby vynálezu
Predložený vynález je založený, aspoň sčasti, na objave nových molekúl, uvádzaných v tomto dokumente ako SRT nukleovokyselinové a proteínové molekuly, ktoré zvyšujú schopnosť C. glutamicum prežiť v situáciách, ktoré sú pre tento mikroorganizmus rizikové pokiaľ ide o chemický stres alebo stres pochádzajúci z okolitého prostredia. V jednom uskutočnení je úlohou SRT molekúl poskytnúť C. glutamicum rezistenciu na jeden alebo viacero stresov pochádzajúcich z okolia alebo rezistenciu na chemické stresy. V predovšetkým výhodnom uskutočnení sú SRT molekuly podľa tohto vynálezu modulované na aktivitu tak, že výťažok, produkcia, a/alebo účinnosť produkcie jednej alebo viacerých chemikálií z C. glutamicum je tiež modulovaná.
Pojem „SRT“ proteín“ alebo „SRT polypeptid“ zahrňuje proteíny, ktoré sa podieľajú na rezistencii C. glutamicum na jeden alebo viacero stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia alebo na rezistencii na chemické stresy. Príklady SRT proteínov zahrňujú tie, ktoré sú kódované SRT génmi, uvedenými v tabuľke 1 a tie, ktoré sú kódované nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO. Pojmy „SRT gén“ alebo „SRT sekvencia nukleovej kyseliny“ zahŕňajú sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce SRT proteín, ktoré sa skladajú z kódujúcej oblasti a tiež príslušných netranslatovaných 5'-a 3'-sekvenčných oblastí. Príklady SRT génov sú uvedené v tabuľke 1. Pojmy „produkcia“ alebo „produktivita“ sú známe v danej oblasti techniky a zahŕňajú koncentráciu fermentačného produktu (napríklad požadovanej špeciálnej chemikálie), ktorý sa vytvoril za stanovený čas a v stanovenom fermentačnom objeme (napr. kg produktu za hodinu na liter). Pojem „účinnosť produkcie“ znamená čas, ktorý je potrebný na to, aby sa dosiahla príslušná produkcia (napríklad, ako dlho trvá bunke dosiahnutie príslušnej rýchlosti produkovania špeciálnej chemikálie). Pojem „výťažok“ alebo „produkt/výťažok uhlíka“ je známy v danej oblasti techniky a znamená účinnosť konverzie zdroja uhlíka na produkt (t.j. špeciálnu chemikáliu). Toto sa bežne uvádza napríklad ako kg produktu na kg zdroja uhlíka. Prostredníctvom zvyšovania výťažku alebo produkcie zlúčeniny sa množstvo získaných molekúl alebo úspešne získaných molekúl tejto zlúčeniny v stanovenom množstve kultúry v priebehu stanoveného času zvyšuje. Pojem „biosyntéza“ alebo „biosyntetická dráha“ sú známe v danej oblasti techniky a znamenajú syntézu zlúčeniny, výhodne organickej zlúčeniny, bunkou z medziproduktových zlúčenín, čo môže byť viackrokový a vysoko regulovaný proces. Pojmy „degradácia“ alebo „degradačná dráha“ sú známe v danej oblasti techniky a znamenajú rozklad zlúčeniny, predovšetkým organickej zlúčeniny, bunkou na degradačné produkty (všeobecne povedané, menšie alebo menej zložité molekuly), ktorý môže byť viackrokový a vysoko regulovaný proces. Pojem „metabolizmus“ je známy v danej oblasti techniky a znamená súhrn biochemických reakcií, ktoré sa uskutočňujú v organizme. Metabolizmus príslušnej zlúčeniny, zahrňuje potom (napr. metabolizmus aminokyseliny ako glycínu) celkové biosyntetické, modifikačné a degradačné dráhy v bunke týkajúce sa tejto zlúčeniny. Pojmy „rezistencia” a „tolerancia” sú známe v danej oblasti techniky a zahŕňajú schopnosť bunky, aby táto nebola ovplyvnená pôsobením chemikálií alebo okolitého prostredia, ktoré by ináč bolo škodlivé pre normálne fungovanie týchto organizmov. Pojmy „stres” alebo “riziko” zahrňujú faktory, ktoré sú škodlivé pre normálne fungovanie buniek, ako napríklad C. glutamicum. Príkladmi stresov sú „chemické stresy”, pri ktorých je bunka vystavená pôsobeniu jednej alebo viacerých chemikálií, ktoré sú škodlivé pre bunku, a „stres z okolitého prostredia”, pri ktorom je bunka vystavená pôsobeniu takých podmienok, na ktoré nie je adaptovaná. Chemické stresy môžu byť spôsobené buď prirodzenými metabolickými odpadovými produktami ako sú reaktívne formy kyslíka alebo oxidu uhličitého, ale nie sú obmedzené len ne alebo chemikáliami, ktoré sú ináč prítomné v okolitom prostredí vrátane iónov ťažkých kovov alebo baktericídnych proteínov ako sú antibiotiká, ale nie sú obmedzené len ne. Stresmi pochádzajúcimi z okolitého prostredia môžu byť napríklad teploty nad normálny rozsah, suboptimálna dostupnosť kyslíka, osmotické tlaky alebo extrémne pH, ale nie sú obmedzené len na ne.
V ďalšom uskutočnení, SRT molekuly podľa tohto vynálezu sú schopné modulovať produkciu takej požadovanej molekuly ako je špeciálna chemikália, v takom mikroorganizme ako C. glutamicum. Použitím metód genetickej rekombinácie sa môže jeden alebo viac SRT proteínov podľa tohto vynálezu upraviť tak, že sa moduluje jeho (ich) funkcia. Takouto zmenou aktivity odpovede na stres, génov rezistencie alebo tolerancie, aby bunka mala zvýšenú toleranciu na jeden alebo viac stresov, sa môže zvýšiť schopnosť bunky rásť a rozmnožovať sa v relatívne stresových podmienkach pri kultivácii vo veľkom rozsahu vo fermentore.
Napríklad, pomocou nadmernej expresie alebo takého genetického manipulovania šaperónovej molekuly, indukovanej teplotným šokom, že sa jej aktivita optimalizuje, môže odborník zvýšiť schopnosť baktérie správne poskladať proteíny, a to i navzdory teplotným podmienkam, ktoré nie sú optimálne. S menším množstvom chybne poskladaných (a snáď deregulovaných alebo nefunkčných) proteínov sa zvyšuje schopnosť bunky normálne fungovať pri takejto kultivácii, čo samotné by malo zvyšovať jej životaschopnosť. Celkové zvýšenie počtu buniek, ktoré sú životaschopnejšie a majú väčšiu aktivitu pri kultivácii by sa malo tiež prejaviť zvýšeným výťažkom, produkciou a/alebo účinnosťou produkcie jednej alebo viacerých požadovaných špeciálnych chemikálií, a to prinajmenšom vďaka relatívne väčšiemu počtu buniek produkujúcich tieto chemikálie pri kultivácii.
Sekvencie izolovaných nukleových kyselín, ktoré sú predmetom tohto vynálezu sú zahrnuté v genóme kmeňa Corynebacterium glutamicum dostupného prostredníctvom americkej zbierky kultúr „Američan Type Culture Collection“ pod označením ATCC 13032. Nukleotidové sekvencie izolovaných C. glutamicum SRT DNA sú uvedené v Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými SEQ ID NO a predpokladané aminokyselinové sekvencie C. glutamicum SRT proteínov sú uvedené v Sekvenčnom zázname s párne očíslovanými SEQ ID NO.
Uskutočnili sa komputerové analýzy, ktoré klasifikujú a/alebo identifikujú tieto nukleotidové sekvencie ako sekvencie, ktoré kódujú stresové proteíny (chemického stresu a stresu pochádzajúceho z okolitého prostredia), rezistenčné a tolerančné proteíny.
Predložený vynález sa tiež týka proteínov, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname). V tomto dokumente sa uvádza, že proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu v podstate homológnu s vybranou sekvenciou aminokyselín je najmenej asi na 50 % homológny s vybranou aminokyselinovou sekvenciou, napr. celou vybranou aminokyselinovou sekvenciou. Proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate homológna s vybranou aminokyselinovom sekvenciou, môže byť tiež najmenej asi na 50-60 %, výhodne najmenej asi na 60-70 % a výhodnejšie najmenej asi na 70-80 %, 80-90 % alebo 90-95 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 96%, 97%, 98%, 99% alebo viac homológny s vybranou sekvenciou aminokyselín. Intervaly alebo identita medziľahlých hodnôt s vyššie uvedenými hodnotami (napr. 70-90 % identické alebo 80-95 % identické 91 -92 % identické) spadajú tiež do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad intervaly identity hodnôt využívajúce kombináciu akýchkoľvek vyššie uvedených hodnôt ako horné a/alebo dolné hranice taktiež spadajú do rozsahu predloženého vynálezu.
SRT proteíny alebo ich biologicky aktívne časti alebo ich fragmenty podľa tohto vynálezu môžu spôsobovať rezistenciu alebo toleranciu na jeden alebo viac chemických stresov alebo stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia, alebo mať jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1.
Rôzne aspekty vynálezu sa detailnejšie opisujú v nasledujúcich odstavcoch.
A. Molekuly izolovaných nukleových kyselín
Vynález sa týka molekúl izolovaných nukleových kyselín, ktoré kódujú SRT polypeptidy alebo ich biologicky aktívne časti, ako aj fragmentov nukleových kyselín vhodných na použitie ako hybridizačné sondy alebo priméry na identifikáciu alebo amplifikáciu SRT-kódujúcich nukleových kyselín (napr. SRT DNA). Pojem „molekula nukleovej kyseliny“, tak ako sa v tomto dokumente používa, označuje molekuly DNA (napr. cDNA alebo genómovú DNA) a molekuly RNA (napr. mRNA) a analógy DNA alebo RNA vytvorené použitím nukleotidových analógov. Tento pojem zahrňuje tiež netranslatovanú sekvenciu na oboch 3'- a 5'- koncoch kódujúcej oblasti génu: najmenej asi 100 nukleotidovú sekvenciu lokalizovanú na 5'- konci kódujúcej oblasti génu proti smeru (upstream) transkripcie a najmenej asi 20 nukleotidovú sekvenciu lokalizovanú na 3'- konci kódujúcej oblasti génu v smere (downstream) transkripcie. Molekula nukleovej kyseliny môže byť jednovláknová alebo dvojvláknová, ale prednostne je dvojvláknová DNA. „Izolovanou“ molekulou nukleovej kyseliny je práve tá, ktorá je separovaná od iných molekúl nukleových kyselín, ktoré sú prítomné v prirodzenom zdroji nukleovej kyseliny. Výhodne, „izolovaná“ nukleová kyselina neobsahuje sekvencie, ktoré prirodzene lemujú nukleovú kyselinu (t.j. sekvencie lokalizované na 5-'a 3'-koncoch nukleovej kyseliny) v genómovej DNA organizmu, z ktorého je nukleová kyselina odvodená. Napríklad, v rôznych uskutočneniach, izolovaná SRT molekula nukleovej kyseliny môže obsahovať menej ako asi 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb alebo 0,1 kb nukleotidových sekvencií, ktoré prirodzene lemujú molekulu nukleovej kyseliny v genómovej DNA bunky, z ktorej je nukleová kyselina odvodená (napr. bunka C. glutamicum). Navyše, „izolovaná“ molekula nukleovej kyseliny, ako DNA molekula, môže byť v podstate bez iného bunkového materiálu alebo kultivačného média, keď sa vytvorila pomocou rekombinantných techník, alebo chemických prekurzorov alebo iných chemikálií, ak sa syntetizovala chemicky.
Molekula nukleovej kyseliny, podlá predloženého vynálezu, napr. molekula nukleovej kyseliny, ktorá má nepárne očíslovanú nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jej časť, sa môže izolovať s použitím štandardných techník molekulárnej biológie a informácií o sekvencií poskytnutých v tomto dokumente. Napríklad, C. glutamicum SRT DNA sa môže izolovať z knižnice C. glutamicum použitím celej sekvencie alebo časti jednej zo sekvencií s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname ako hybridizačná sonda štandardnými hybridizačnými technikami (napr. ako sa to opisuje v Sambrook, J., Fritsh, E. F., a Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Okrem toho, molekula nukleovej kyseliny obsahujúca celú alebo časť jednej zo sekvencií nukleových kyselín podľa tohto vynálezu (napr. s nepárne očíslovanými SEQ ID NO:) sa môže izolovať polymerázovou reťazovou reakciou použitím oligonukleotidových primérov skonštruovaných na základe tejto sekvencie (napr. molekula nukleovej kyseliny obsahujúca celú alebo časť jednej zo sekvencií nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu (napr. s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) sa môže izolovať polymerázovou reťazovou reakciou použitím oligonukleotidových primérov skonštruovaných na základe tejto istej sekvencie). Napríklad, mRNA sa môže izolovať z normálnych endotelových buniek (napr. pomocou guanidínium-tiokyanátovej extrakčnej metódy podľa Chirgwim a kol. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299) a DNA sa môže pripraviť použitím reverznej transkriptázy (napr. Moloney MLV reverznej transkriptázy dostupnej od Gibco/GRL, Bethesda, MD; alebo AMV reverznej transkriptázy dostupnej od Seikagaku America, Inc., St. Petergurg, FL). Syntetické oligonukleotidové priméry pre amplifikáciu polymerázovou reťazovou reakciou sa môžu skonštruovať na základe jednej z nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname. Nukleová kyselina podľa tohto vynálezu sa môže amplifikovať použitím cDNA, alebo alternatívne, genómovej DNA, ako templátu a vhodných oligonukleotidových primérov podľa štandardných PCR amplifikačných techník. Nukleová kyselina takto amplifikovaná sa môže klonovať do vhodného vektora a charakterizovať pomocou vhodnej sekvenčnej analýzy DNA. Okrem toho, oligonukleotidy zodpovedajúce SRT nukleotidovej sekvencií sa môžu pripraviť pomocou štandardných syntetických techník napr.
použitím automatického syntetizéra DNA.
Vo výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu obsahuje jednu z nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname. Sekvencie nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, tak ako sú uvedené v Sekvenčnom zázname, zodpovedajú Corynebacterium glutamicum SRT DNA podľa tohto vynálezu. Táto DNA pozostáva zo sekvencií kódujúcich SRT proteíny (t.j. „kódujúcej oblasti“ indikovanej v každej nepárne očíslovanej sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname), ako aj z 5'-netranslatovaných sekvencií a 3'netranslatovaných sekvencií, ktoré sa tiež indikovali v každej nepárne očíslovanej sekvencií SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname. Alternatívne, molekula nukleovej kyseliny môže obsahovať len kódujúcu oblasť ktorejkoľvek zo sekvencií nukleových kyselín v Sekvenčnom zázname.
Pre účely tejto prihlášky treba rozumieť, že každá zo sekvencií nukleovej kyseliny a aminokyselinových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname je identifikovaná RXA, RXN alebo RXS číslovaním, ktoré má označenie „RXA, „RXN,“ „RXS“ s následnými 5 číslami (t.j. RXA01524, RXN00493 alebo RXS01027 ). Každá zo sekvencií nukleovej kyseliny sa skladá až z troch častí: 5'- protismemej oblasti, kódujúcej oblasti a oblasti v smere transkripcie. Každá z týchto troch oblastí je identifikovaná rovnakým RXA, RXN alebo RXS označeniami, aby sa zabránilo zámene. Slovné spojenie „jedna zo sekvencií s nepárnym číslovaním v Sekvenčnom zázname“ teda odkazuje na ktorúkoľvek zo sekvencií nukleovej kyseliny v Sekvenčnom zázname, ktorá môže byť rozlíšiteľná pomocou ich rozdielnych RXA, RXN alebo RXS označení. Kódujúca oblasť každej z týchto sekvencií je translatovaná na príslušnú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je tiež uvedená v Sekvenčnom zázname ako párne očíslovaná sekvencia SEQ ID NO: priamo nasledujúca po príslušnej sekvencií nukleovej kyseliny. Napríklad, kódujúca oblasť pre RXA01524 je uvedená v SEQ ID NO:1, zatiaľ čo aminokyselinová sekvencia, ktorú kóduje je uvedená ako SEQ ID NO:2. Sekvencie molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú určené rovnakými RXA, RXN alebo RXS označeniami ako molekuly aminokyselín, ktoré kódujú, takže sa môžu ľahko korelovať. Napríklad, aminokyselinová sekvencia označená RXA01524 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXA01524, aminokyselinová sekvencia označená RXN00034 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXN00034, aminokyselinová sekvencia označená RXS00568 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXS00568; zhoda medzi RXA, RXN a RXC nukleotidovými sekvenciami a aminokyselinovými sekvenciami podľa tohto vynálezu a im pridelené SEQ ID NO čísla sú uvedené v tabuľke 1.
Niektoré z génov podľa tohto vynálezu sú „F-označené gény“. F-označené gény zahŕňajú tie gény uvedené v tabuľke 1, ktoré majú „F“ pred RXA, RXN alebo RXS označením. Napríklad, SEQ ID NO:7 označuje, ako je ukázané v tabuľke 1, taký F-gén, ktorý má označenie „F RXA00498 “,( SEQ ID NO 25 taký F-gén, ktorý má označenie „F-RXA01345 “, SEQ ID NO 33 taký gén, ktorý má označenie „FRXA02543 “ a SEQ ID NO 37 taký gén, ktorý má označenie „F RXA02282).
V jednom uskutočnení, molekuly nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu sa nedajú zahrnúť do tých, ktoré sú zostavené do tabuľky 2., a to v prípade dapD génu, ktorého sekvenciu publikoval Wehrmann, A. a kol. (1998) v J. Bacteriol. 180 (12), 3159-3165. Avšak, sekvencia získaná vynálezcami predloženej prihlášky je významne dlhšia, ako je publikovaná verzia. Predpokladá sa, že publikovaná verzia vychádzala z nesprávneho štartovacieho kodónu, atak predstavuje len fragment skutočnej kódujúcej oblasti.
V inom výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, zahrňuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna s jednou zo sekvencií nukleotidov podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním sekvencie SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), alebo s jej časťou. Molekulou nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna s jednou z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu, je práve tá, ktorá je dostatočne komplementárna s jednou z nukleotidových sekvencií v Sekvenčnom zázname (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO:), takže sa môže hybridizovať s jednou z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu, v dôsledku čoho sa vytvára stabilný duplex.
V ešte inom výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, a výhodnejšie najmenej asi na 71 %,72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % alebo dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológna s nukleotidovou sekvenciou podlá tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) alebo jej časťou. Intervaly alebo identita medziľahlých hodnôt s vyššie uvedenými intervalmi (napr. 70-90 % identické alebo 80-95 % identické) spadajú tiež do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, intervaly hodnôt identity využívajúce kombináciu akýchkoľvek vyššie uvedených hodnôt ako horné a/alebo dolné hranice taktiež spadajú do rozsahu vynálezu. V ďalšom výhodnom uskutočnení obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu nukleotidovú sekvenciu, ktorá sa hybridizuje, napr. sa hybridizuje v stringentných podmienkach, s jednou nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, alebo jej časťou.
Okrem toho, molekula nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu môže obsahovať len časť kódujúcej oblasti sekvencie jednej z nepárne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, napríklad fragment, ktorý sa môže použiť ako sonda alebo primér, alebo fragment kódujúci biologicky aktívnu časť SRT proteínu. Nukleotidové sekvencie určené z klonovania SRT génov z C. glutamicum umožňujú vytváranie sond a primérov určených na použitie pri identifikácii a/alebo klonovaní SRT homológov v iných typoch buniek alebo organizmov, a tiež SRT homológov z iných Corynebacteria alebo príbuzných druhov. Sonda/primér typicky obsahuje podstatne purifikovaný oligonukleotid. Oligonukleotid typicky obsahuje oblasť nukleotidovej sekvencie, ktorá sa hybridizuje v stringentných podmienkach najmenej asi s 12, výhodne asi s 25, výhodnejšie asi so 40, 50, alebo 75 po sebe idúcimi nukleotidmi zmysluplného (sense) vlákna jednej z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. jednej zo sekvencií s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname), nezmyselnú (antisense) sekvenciu jednej z týchto sekvencií, alebo ich prirodzene sa vyskytujúce mutanty. Priméry založené na nukleotidovej sekvencii podľa tohto vynálezu sa môžu použiť pri PCR reakciách na klonovanie SRT homológov. Sondy založené na SRT nukleotidových sekvenciách sa môžu použiť na detekciu transkriptov alebo genómových sekvencií kódujúcich tie isté alebo homológne proteíny. Vo výhodných uskutočneniach, sonda ďalej obsahuje značkovú skupinu pripojenú k nej, napr. značkovou skupinou môže byť rádioizotop, fluorescenčná zlúčenina, enzým alebo enzýmový kofaktor. Takéto sondy môžu byť súčasťou diagnostického testovacieho kitu na identifikáciu buniek, ktoré chybne exprimovali SRT proteín, napríklad meraním hladiny SRT-kódujúcej nukleovej kyseliny vo vzorke buniek, napr. detegovaním SRT mRNA hladín alebo stanovením, čí genómový SRT gén mutoval alebo deletoval.
V jednom uskutočnení molekula nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, kóduje proteín, alebo jeho časť, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr.sekvenciou s párnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť poskytnúť C. glutamicum rezistenciu alebo toleranciu na jeden alebo viac chemických stresov alebo stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia. Ak sa užíva v tomto dokumente spojenie „dostatočne homológny“ odkazuje sa ním na proteíny alebo ich časti, ktoré majú aminokyselinové sekvencie, ktoré obsahujú minimálny počet identických alebo ekvivalentných (napr. aminokyselinový zvyšok, ktorý má podobný bočný reťazec ako aminokyselinový zvyšok v sekvencií jednej z párne očíslovaných SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) aminokyselinových zvyškov k aminokyselinovej sekvencií podlá tohto vynálezu, takže proteín alebo jeho časť je schopný podieľať sa na rezistencii C. glutamicum na jeden alebo viac chemických stresov alebo stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia. Proteínové členy takýchto metabolických dráh, ako sa opisuje v tomto dokumente, majú funkciu zvyšovať rezistenciu alebo toleranciu C. glutamicum na jeden alebo viac chemických stresov alebo stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia. Príklady takýchto aktivít sú tiež opísané v tomto dokumente. Takto, „funkcia SRT proteínu“ prispieva k celkovej rezistencii C. glutamicum na prvky okolitého prostredia, ktoré môžu brániť jej normálnemu rastu alebo fungovaniu a/alebo ovplyvňuje buď priamo alebo nepriamo na výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií. Príklady SRT proteínových aktivít sú uvedené v tabuľke 1.
V inom uskutočnení je proteín najmenej asi na 50-60 %, výhodne najmenej asi na 60-70 % a výhodnejšie najmenej asi na 70-80 %, 80-90 %, 90-95 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). Intervaly alebo identita medziľahlých hodnôt s vyššie uvedenými hodnotami (napr. 75-80 % identické, 85-87% identické alebo 91-92% identické) spadajú tiež do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, intervaly identity hodnôt využívajúce kombináciu akýchkoľvek vyššie uvedených hodnôt ako horné a/alebo dolné hranice taktiež spadajú do rozsahu vynálezu.
Časťami proteínov kódovaných molekulami SRT nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu sú predovšetkým biologicky aktívne časti jedného z SRT proteínov. Ako sa používa v tomto dokumente, slovné spojenie „biologicky aktívna časť SRT proteínu“, mieni sa tým časť, napr.doména/motív SRT proteínu, ktorá môže spôsobovať rezistenciu alebo toleranciu na jeden alebo viac stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia alebo chemických stresov alebo rizík, alebo ktorá má aktivitu uvedenú v tabuľke 1. Aby sa stanovilo, či SRT proteín alebo jeho biologicky aktívna časť môže zvyšovať rezistenciu alebo toleranciu C. glutamicum na jeden alebo viac chemických stresov alebo stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia alebo alebo rizík, treba vykonať skúšku enzýmovej aktivity. Takéto skúšobné metódy sú dobre známe odborníkom, ktorí pracujú v danej oblasti techniky, ako sa podrobne opisuje v príklade 8 v príkladoch uskutočnenia vynálezu^
Ďalšie fragmenty nukleovej kyseliny kódujúce biologicky aktívne časti SRT proteínu sa môžu pripraviť izoláciou časti jednej z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencie s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), expresiou kódovanej časti SRT proteínu alebo peptidu (napr. pomocou rekombinantnej expresie in vitro) a stanovením aktivity kódovanej časti SRT proteínu alebo peptidu.
Vynález ďalej zahrňuje molekuly nukleových kyselín, ktoré sa odlišujú od jednej z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencie s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname) (a jej častí) v dôsledku degenerácie genetického kódu, a tak kódujú rovnaký SRT proteín ako ten, ktorý kódujú nukleotidové sekvencie opísané vo vynáleze. Vínom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, má nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená v Sekvenčnom zázname (napr. s párne očíslovanou SEQ ID NO:). V ešte ďalšom uskutočnení, kóduje molekula nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu celú dĺžku C.
glutamicum proteínu, ktorý je v podstate homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (ktorá je kódovaná otvoreným systémom čítania prislúchajúcou
SEQ ID NO: uvedenou s nepárnym očíslovaním v Sekvenčnom zázname).
Odborník, ktorý je skúsený v danej oblasti, si bude vedomý toho, že v jednom uskutočnení, sekvencie podľa tohto vynálezu nie sú mienené tak, aby zahrňovali sekvencie známe z doterajšieho stavu techniky, t.j. sekvencie z Genbanky uvedené v tabuľke 2 a 4. V jednom uskutočnení vynález zahrňuje nukleotidové a aminokyselinové sekvencie, ktoré majú percento identity s nukleotidovou alebo aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu väčšie, v porovnaní s doteraz známymi sekvenciami v danej oblasti techniky (napr. Genbankové sekvencie (alebo proteín kódovaný týmito sekvenciami) uvedené v tabuľkách 2 alebo 4). Napríklad v jednom uskutočnení vynález zahrňuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je väčšia ako a/alebo najmenej na 39 % identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00084 (SEQ ID NO: 189), nukleotidovú sekvenciu, ktorá je väčšia a/alebo najmenej na 56% identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00605 (SEQ ID NO: 11) a nukleotidovú sekvenciu, ktorá je väčšia a/alebo najmenej na 50%identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00886 (SEQ ID NO: 39). Odborník v danej oblasti techniky by bol schopný vypočítať dolný prah percenta identity pre akúkoľvek danú sekvenciu podľa vynálezu pomocou skúšania GAP-vypočítaného percenta identity skóre uvedeného v tabuľke 4 pre každý z troch najlepších aktívnych záznamov pre danú sekvenciu a to pomocou odpočítania najvyššieho GAPvypočítaného percenta identity od 100 %. Odborník v danej oblasti techniky si bude tiež vedomý, že sekvencie nukleových kyselín a aminokyselín, ktoré majú percento identity väčšie ako takto vypočítaný dolný prah (napr. sú najmenej 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % alebo 90 % alebo 91 %, %, 93 %, 94 % a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, % alebo viac identické) sú tiež zahrnuté do vynálezu
Okrem C. glutamicum SRT nukleotidových sekvencii uvedených v Sekvenčnom zázname s nepárne označenými SEQ ID NO, môžu odborníci skúsení v danej oblasti techniky usúdiť, že DNA sekvenčné polymorfizmy, ktoré vedú k zmenám v aminokyselinových sekvenciách SRT proteínov sa môžu vyskytovať v rámci populácie (napr. C. glutamicum populácie). Takýto genetický polymorfizmus v SRT géne môže existovať medzi jedincami v rámci populácie v dôsledku prirodzenej variácie. Ak sa používajú v tomto dokumente pojmy „gén“ a „rekombinantný gén“, vzťahujú sa tieto na obsiahnuté molekuly nukleovej kyseliny, ktoré otvoreným systémom čítania kódujú SRT proteín, výhodne C. glutamicum SRT proteín. Také prirodzené variácie môžu väčšinou mať za následok 1-5 % variáciu nukleotidovej sekvencie SRT génu. Ktorékoľvek a všetky takéto nukleotidové variácie a následné aminokyselinové polymorfizmy v SRT, ktoré vyplývajú z prirodzenej variácie a také, ktoré nemenia funkčnú aktivitu SRT proteínov, sú zahrnuté do rozsahu tohto vynálezu.
Molekuly nukleovej kyseliny zodpovedajúce prirodzeným variantom ane-C. glutamicum homológom C. glutamicum SRT DNA podľa vynálezu sa môžu izolovať na základe ich homológie s C. glutamicum SRT nukleovou kyselinou opísanou v tomto dokumente použitím C. glutamicum DNA, alebo jej časti, ako hybridizačnej sondy podlá štandardných hybridizačných metodík v stringentných hybridizačných podmienkach. V súlade s uvedeným v dálšom uskutočnení má molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu najmenej 15 nukleotidovú dĺžku a hybridizuje sa v stringentných podmienkach s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu s nepárne označenou SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname. V dálších uskutočneniach, má nukleová kyselina dĺžku najmenej 30, 50, 100, 250 alebo viac nukleotidov. Tak ako sa používa v tomto dokumente pojem „hybridizuje sa v stringentných podmienkach“, opisujú sa tým podmienky na hybridizáciu a premytie, pri ktorých sú nukleotidové sekvencie najmenej na 60% navzájom homológne a charakteristicky zostávajú navzájom hybridizované. Výhodné podmienky sú také, že sekvencie sú najmenej asi na 65 %, výhodnejšie najmenej asi na 70 % a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 75 % alebo viac navzájom homológne a charakteristicky zostávajú navzájom hybridizované. Takéto stringentné podmienky sú známe skúseným odborníkom v danej oblasti techniky a dajú sa zistiť v Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Výhodným, nelimitujúcim príkladom stringentných hybridizačných podmienok sú hybridizácie v 6X chloride sodnom/citráte sodnom (SSC) pri približne 45 °C s následným jedným alebo viacerými premytiami v 0,2 X SSC, 0,1 % SDS pri 5065 °C. Výhodne, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, ktorá sa hybridizuje v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu sa zhoduje s prirodzene sa vyskytujúcou molekulou nukleovej kyseliny. Ak sa v tomto dokumente používa pojem „prirodzene sa vyskytujúca“ molekula nukleovej kyseliny, odkazuje sa tým na molekuly RNA alebo DNA, ktoré majú nukleotidovú sekvenciu vyskytujúcu sa v prírode (napr. kódujúcu prirodzene sa vyskytujúci proteín). V jednom uskutočnení, nukleová kyselina kóduje prirodzene sa vyskytujúci C. glutamicum SRT proteín.
Okrem prirodzene sa vyskytujúcich variantných SRT sekvencií, ktoré sa môžu vyskytovať v populácii, si odborník v danej oblasti techniky bude v ďalšom vedomý, že zmeny, ktoré sa môžu zaviesť do nukleotidovej sekvencie podľa tohto vynálezu mutáciou, vedú aj k zmenám v aminokyselinovej sekvencií kódovaného SRT proteínu, bez zmeny funkčnej schopnosti SRT proteínu. Napríklad, nukleotidové substitúcie, ktoré vedú k aminokyselinovým substitúciám na „neesenciálnych“ aminokyselinových zvyškoch, sa môžu uskutočniť v nukleotidovej sekvencií podľa tohto vynálezu. „Neesenciálny“ aminokyselinový zvyšok je zvyšok, ktorý môže byť zmenený z „divého“-typu (wild-type) sekvencie jedného z SRT proteínov (napr. s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) bez zmenenia aktivity spomínaného SRT proteínu, kým „esenciálny“ aminokyselinový zvyšok sa vyžaduje na aktivitu SRT proteínu. Ďalšie aminokyselinové zvyšky, však (napr. tie, ktoré nie sú zachované alebo len polozachované v doméne s SRT aktivitou) nemôžu byť esenciálne pre aktivitu, a teda pravdepodobne podliehajú zmene bez zmenenia SRT aktivity.
Podľa toho sa vynález ďalej týka molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich SRT proteíny, ktoré obsahujú zmeny v aminokyselinových zvyškoch, ktoré nie sú esenciálne pre SRT aktivitu. Takéto SRT proteíny sa líšia aminokyselinovou sekvenciou od sekvencie s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname, pričom si udržali najmenej jednu z SRT aktivít opísaných v tomto dokumente. V jednom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu najmenej asi na 50 % homológnu s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu a je schopný zvyšovať rezistenciu alebo toleranciu C. glutamicum na jeden alebo viac stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia alebo chemických stresov, alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1. Výhodne, proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny je najmenej asi na 50-60 % homológny s aminokyselinovou sekvenciou jednej z nepárne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, výhodnejšie najmenej asi na 60-70 % homológny s jednou z týchto sekvencií, dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 70-80%, 80-90%, 9095 % homológny s jednou z týchto sekvencií a najvýhodnejšie najmenej asi na 96 %, 97 %, 98 %, alebo 99 % homológny s jednou z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu.
Aby sa stanovilo percento homológie dvoch aminokyselinových sekvencií (napr. jednej z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu a jej mutantnej formy) alebo dvoch nukleových kyselín, sekvencie sa zoradili za účelom optimálnych porovnaní (napr. medzery (gaps) sa môžu zavádzať do sekvencie jedného proteínu alebo nukleovej kyseliny na optimálne zoradenie s ďalším proteínom alebo nukleovou kyselinou). Aminokyselinové zvyšky alebo nukleotidy v prislúchajúcich aminokyselinových pozíciách alebo nukleotidových pozíciách sa potom porovnajú. Keď je pozícia v jednej sekvencií (napr. jednej aminokyselinovej sekvencií podľa tohto vynálezu) obsadená tým istým aminokyselinovým zvyškom alebo nukleotidom ako prislúchajúca pozícia v inej sekvencií (napr. mutantnou formou aminokyselinovej sekvencie), tak molekuly sú homológne na túto pozíciu (t.j. ak sa v tomto dokumente používa spojenie aminokyselinové alebo nukleovokyselinová „homológia“, je to ekvivalentné aminokyselinovej alebo nukleovokyselinovej „identite“). Percento homológie medzi dvoma sekvenciami závisí od počtu identických pozícií spoločných podľa sekvencií (t.j. % homológie = # identických pozícií / celkových # pozícií x 100).
Molekula izolovanej nukleovej kyseliny kódujúca SRT proteín homológny k proteínovej sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencia s párne očíslovanou SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) sa môže vytvárať zavedením jednej alebo viacerých nukleotidových substitúcií, adícií alebo delécii do nukleotidovej sekvencie podľa tohto vynálezu tak, že jedna alebo viac aminokyselinových substitúcií, adícií alebo delécii sa zavedú do kódovaného proteínu. Mutácie sa môžu zaviesť do jednej z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu pomocou takých štandardných metód ako polohou usmernených mutagenéz a PCR sprostredkovaných mutagenéz. Výhodne, konzervatívne aminokyselinové substitúcie sa uskutočnili na jednom alebo viacerých predikovaných neesenciálnych aminokyselinových zvyškoch. „Konzervatívna aminokyselinová substitúcia“ je taká, pri ktorej sa aminokyselinový zvyšok nahradí s aminokyselinovým zvyškom, ktorý má podobný bočný reťazec. Rodiny aminokyselinových zvyškov, ktoré majú podobné bočné reťazce sú definované v danej oblasti techniky. Tieto rodiny obsahujú aminokyseliny so zásaditými bočnými reťazcami (napr. lyzín, arginín, histidín), s kyslými bočnými reťazcami (kyselina asparágová, kyselina glutámová), polárnymi bočnými reťazcami bez náboja (napr. glycín, asparagín, glutamín, serín, treonín, tyrozín, cysteín), nepolárnymi bočnými reťazcami (napr. alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metionín, tryptofán), beta-rozvetvenými bočnými reťazcami (napr. treonín, valín, izoleucín) a aromatickými bočnými reťazcami (napr. tyrozín, fenylalanín, tryptofán, histidín). Takto predikovaný neesenciálny aminokyselinový zvyšok v SRT proteíne je výhodne nahradený s iným aminokyselinovým zvyškom z tej istej rodiny bočných reťazcov. Alternatívne, v inom uskutočnení, sa mutácie môžu zavádzať náhodne, pozdĺž celej alebo pozdĺž časti SRT kódujúcej sekvencie, napríklad saturačnou mutagenézou a vytvorené mutanty sa môžu podrobiť kontrole na SRT aktivitu opísanú v tomto dokumente, aby sa identifikovali mutanty, ktoré si udržali SRT aktivitu. Následnou mutagenézou jednej z nepárne očíslovaných nukleotidových sekvencii SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname sa môže rekombinantne exprimovať kódovaný proteín a aktivita proteínu sa môže stanoviť, napríklad pomocou skúšok uvedených v tomto dokumente (pozri príklad 8 v príkladoch uskutočnenia vynálezu).
Okrem molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich SRT proteíny, ktoré sa opísali vyššie, sa vynález ďalej týka molekúl izolovanej nukleovej kyseliny, ktoré sú navyše nezmyselné (antisense). „Nezmyselná“ nukleová kyselina obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je komplementárna k „zmysluplnej “(sense) nukleovej kyseline kódujúcej proteín, napr. komplementárna ku kódujúcemu vláknu dvojvláknovej DNA molekuly alebo komplementárna kmRNA sekvencii. Podľa toho sa nezmyselná nukleová kyselina môže viazať vodíkovou väzbou so zmysluplnou nukleovou kyselinou. Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže byť komplementárna k celému SRT kódujúcemu vláknu, alebo len k jeho časti. V jednom uskutočnení je nezmyselná molekula nukleovej kyseliny nezmyselná ku „kódujúcej oblasti“ na kódujúcom vlákne nukleotidovej sekvencie kódujúcej SRT proteín. Pojem „kódujúca oblasť“ sa vzťahuje na oblasť nukleotidovej sekvencie obsahujúcej kodóny, ktoré sa translatujú na aminokyselinové zvyšky (napr. celá kódujúca oblasť SEQ ID NO.120 (RXN00600) obsahuje nukleotidy 1 až 1098). V inom uskutočnení, nezmyselná molekula nukleovej kyseliny je nezmyselná ku „nekódujúcej oblasti“ na kódovacom vlákne nukleotidovej sekvencie kódujúcej SRT. Pojem „nekódujúca oblasť “ sa vzťahuje na 5'- a 3'-sekvencie, ktoré lemujú kódujúcu oblasť, takže nie sú translatované na aminokyseliny (t.j. označované tiež ako 5'- a 3'- netranslatované oblasti).
Z uvedených sekvencií kódujúceho vlákna, ktoré kódujú SRT, opísaných v tomto dokumente (napr. sekvencie uvedené s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname), sa môžu navrhnúť nezmyselné nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu podľa pravidiel Watsonovho a Crickovho párovania báz. Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže byť komplementárna k celej kódujúcej oblasti SRT mRNA, ale výhodnejšie je to oligonukleotid, ktorý je nezmyselný len k časti kódujúcej alebo nekódujúcej oblasti SRT mRNA. Napríklad, nezmyselný oligonukleotid môže byť komplementárny k oblasti obklopujúcej miesto štartu translácie SRT mRNA. Nezmyselný oligonukleotid môže mať napríklad dĺžku 5,10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 alebo 50 nukleotidov. Nezmyselná nukleová kyselina podľa tohto vynálezu sa môže vytvoriť chemickou syntézou a enzýmovými ligačnými reakciami, pričom sa používajú postupy, ktoré sú známe v danej oblasti techniky. Napríklad, nezmyselná nukleová kyselina (napr. nezmyselný oligonukleotid) sa môže chemicky syntetizovať použitím prirodzene sa vyskytujúcich nukleotidov alebo rôzne modifikovaných nukleotidov určených na zvýšenie biologickej stability molekúl alebo na zvýšenie fyzikálnej stability duplexu vytvoreného medzi nezmyselnými a zmysluplnými nukleovými kyselinami, napr. sa môžu použiť fosforotionátové deriváty a akridínom substituované nukleotidy. Príklady modifikovaných nukleotidov, ktoré sa môžu použiť na vytváranie nezmyselných nukleových kyselín zahŕňajú 5-fluóruracil, 5-brómuracil, 5-chlóruracil, 5-jóduracil, hypoxantín, xantín, 4-acetylcytozín, 5- (karboxyhydroxymetyl)uracil, 5-karboxymetylaminometyl-2-tiouridín, 5-karboxymetylamino-metyluracil, dihydrouracil, beta-D-galaktozylcheozín, inozín, N6-izopentenyladenín, 1metylguanín, 1-metylinozín, 2,2-dimetylguanín, 2-metyladenín, 2-metylguanín, 3metylcytozín, 5-metylcytozín, N6-adenín, 7-metylguanín, 5-metylaminometyluracil, 5metoxyaminometyl-2-tiouracil, beta-D-manozylcheozín, 5'-metoxy karboxy mety Iuracil, 5-metoxyuracil, 2-metyltio-N6-izopentenyladenín, kyselina uracil-5-oxyoctová (v), wybutoxozín, pseudouracil, cheozín, 2-tiocytozín, 5-metyl-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metyluracil, metylester kyseliny uracil-5-oxyoctovej, uracil-5-oxyacetic acid (v), 5-metyl-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboxypropyl)uracil, (acp3 )w a 2,6diaminopurín. Alternatívne sa nezmyselná nukleová kyselina môže vytvoriť biologicky použitím expresného vektora, do ktorého sa nukleová kyselina subklonovala v nezmyselnej orientácii (t.j. RNA transkribovaná z vloženej nukleovej kyseliny bude mať nezmyselnú orientáciu k danej cieľovej nukleovej kyseline, podrobnejšie opísanej v nasledujúcom odstavci).
Molekuly nezmyselnej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu sú typicky aplikované do bunky alebo sa vytvárajú in situ tak, že sa hybridizujú s alebo viažu na bunkovú mRNA a/alebo genómovú DNA kódujúcu SRT proteín, aby týmto spôsobom inhibovali expresiu proteínu, napr. inhibovaním transkripcie a/alebo translácie. Hybridizáciou sa môže bežnou nukleotidovou komplementaritou vytvoriť stabilný duplex, alebo napríklad v prípade nezmyselnej molekuly nukleovej kyseliny, ktorá sa viaže na DNA duplexy prostredníctvom špecifických interakcií v hlavnej ryhe dvojitej skrutkovnice. Nezmyselná molekula sa môže modifikovať tak, že sa špecificky viaže na receptor alebo antigén exprimovaný na zvolenom povrchu bunky, napr. pripájaním nezmyselnej molekuly nukleovej kyseliny k peptidu alebo protilátke, ktorá sa viaže na bunkový povrchový receptor alebo antigén. Molekula nezmyselnej nukleovej kyseliny sa môže tiež doručiť k bunkám použitím vektorov opísaných v tomto dokumente. Aby sa dosiahli postačujúce intracelulárne koncentrácie nezmyselných molekúl, uprednostňujú sa také konštrukty vektora, v ktorých molekula nezmyselnej nukleovej kyseliny je regulovaná silným prokaryotickým, vírusovým alebo eukaryotickým promótorom.
V ešte inom uskutočnení, molekulou nezmyselnej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu je α-anomérna molekula nukleovej kyseliny. α-Anomérna molekula nukleovej kyseliny vytvára špecifické dvojvláknové hybridy s komplementárnou RNA, v ktorých na rozdiel od obvyklých β-jednotiek, sú vlákna navzájom paralelné (Gaultier a kol.(1987) Nucleic Acids. fíes.15, 6625-6641). Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže tiež obsahovať 2'-o-metylribonukleotid (Inoue a kol. (1987) Nucleic Acid Res. 15, 6131-6148) alebo chimérový RNA-DNA analóg (Inoue a kol. (1987) FEBS Lett. 215.:327-330).
V ešte ďalšom uskutočnení, nezmyselnou nukleovou kyselinou podľa tohto vynálezu je ribozým. Ribozýmy sú katalytické molekuly RNA s ribonukleázovou aktivitou, ktoré sú schopné štiepiť jednovláknovú nukleovú kyselinu ako mRNA, ku ktorej majú komplementárnu oblasť. Takto ribozým (napr. „kladivkovité“ ribozýmy (hammerhead) (opísané v Haselhoff aGerlach (1988) Náture 334. 585-591)) sa môžu použiť na katalytické štiepenie SRT mRNA transkriptov, v dôsledku čoho sa inhibuje translácia SRT mRNA. Ribozým, ktorý má špecificitu pre SRT-kódujúcu nukleovú kyselinu sa môžu navrhnúť na základe nukleotidovej sekvencie SRT DNA molekuly uvedenej v tomto dokumente (t.j. SEQ ID NO:119 (RXN00600)). Napríklad, derivát Tetrahymena L-19 IVS RNA sa môže skonštruovať tak, že má nukleotidovú sekvenciu aktívneho miesta komplementárnu s nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa má rozštiepiť v SRT-kódujúcej mRNA. Pozri, napr. Cech a kol., americký patentový spis U S č. 4,987,071 a Cech a kol., americký patentový spis U S č. 5,116,742. Alternatívne sa SRT mRNA môže použiť na selekciu katalytickej RNA, ktorá má špecifickú ribonukleázovú aktivitu zo zásoby (pool) RNA molekúl. Pozri, napr. Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261.1411-1418.
Alternatívne sa expresia SRT génu môže inhibovať cieľovou nukleotidovou sekvenciou komplementárnou k regulačnej oblasti SRT nukleotidovej sekvencie (napr. SRT promótora a/alebo zosilňovačov), aby sa vytvorili trojité skrutkovnicové štruktúry, ktoré zamedzujú transkripciu SRT génu v cieľových bunkách. Pozri všeobecne, Helene C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6), 569-84; Helene, C. a kol. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660. 27-36; a Maher, L. J. (1992) Bioassays 14 (12). 807-15
B. Rekombinantné expresné vektory a hostiteľské bunky
Vynález sa ďalej týka vektorov, výhodne expresných vektorov, ktoré obsahujú nukleovú kyselinu kódujúcu SRT proteín (alebo jeho časť). Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojem „vektor“ označuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá je schopná transportovať inú nukleovú kyselinu, s ktorou sa spojí. Jedným typom vektorov je „plazmid“, ktorý označuje kruhovú dvojvláknovú DNA slučku, do ktorej sa ďalšie segmenty DNA môžu ligovať. Iným typom vektora je vírusový vektor, ktorým sa ďalšie DNA segmenty môžu ligovať do vírusového genómu. Určité vektory sú schopné autonómnej replikácie v hostiteľskej bunke, do ktorej sú zavedené (napr. bakteriálne vektory, ktoré majú bakteriálny pôvod replikácie a epizomálne vektory cicavcov). Ďalšie vektory (napr. ne-epizomálne vektory cicavcov) sú integrované do genómu hostiteľskej bunky tak, že sa zavedú do hostiteľskej bunky a týmto spôsobom sa replikujú súčasne s hostiteľským genómom. Okrem toho, určité vektory sú schopné riadiť expresiu génov, ku ktorým boli funkčne pripojené. Tieto vektory sa v tomto dokumente označujú ako „expresné vektory“. Vo všeobecnosti, expresné vektory využívané v rekombinantných DNA metódach sú často vo forme plazmidov. V uvedenej prihláške pojmy „plazmid“ alebo „vektor“ sa môžu zameniteľné používať, aj keď plazmid je najbežnejšie používaným tvarom vektora. Ale vo vynáleze je snaha zahrnúť také tvary expresných vektorov, ako vírusové vektory (napr. replikačné detektívne retrovírusy aadenovírusy a adenoasociované vírusy), ktoré majú ekvivalentné funkcie.
Rekombinantné expresné vektory podľa tohto vynálezu obsahujú nukleovú kyselinu podľa tohto vynálezu v tvare vhodnom na expresiu nukleovej kyseliny v hostiteľskej bunke, čo znamená, že rekombinantné expresné vektory obsahujú jednu alebo viac regulačných sekvencií, zvolených podľa hostiteľských buniek, ktoré sa použijú na expresiu, ktoré sú funkčne pripojené k sekvencií nukleovej kyseliny, ktorá sa má exprimovať. V rámci rekombinantného expresného vektora, „funkčne pripojiť“ znamená, že daná nukleotidová sekvencia sa pripojí k regulačnej sekvencii(iám) takým spôsobom, ktorý umožní expresiu nukleotidovej sekvencie (napr. v in vitro transkripčnom /translačnom systéme alebo i v hostiteľskej bunke, ak je vektor zavedený do hostiteľskej bunky). Pojem „regulačná sekvencia“ zahrňuje promótory, zosilňovače a iné expresné riadiace prvky (napr. polyadenylačné signály). Tieto regulačné sekvencie sú opísané, napríklad v Goeddel; Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulačné sekvencie zahŕňajú tie, ktoré riadia konštitutívnu expresiu nukleotidovej sekvencie v mnohých typoch hostiteľských buniek a tie, ktoré riadia expresiu nukleotidovej sekvencie len v určitých hostiteľských bunkách. Výhodné regulačné sekvencie sú, napríklad také promótory, ako cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet, Ipp-, lac-, Ιρρ-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SPO2, ä-Pr alebo λ-Ρι_, ktoré sa používajú predovšetkým v baktériách. Ďalšie regulačné sekvencie sú, napríklad, promótory z kvasiniek a húb ako ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, promótory z rastlín ako CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos alebo ubikvitínové alebo fazeolínové promótory. Tiež je možné použiť syntetické promótory.
Odborník skúsený v danej oblasti techniky budú vedieť odhadnúť, že či konštrukcia expresného vektora môže závisieť na takých faktoroch akými je výber hostiteľskej bunky, ktorá sa má transformovať, úrovni expresie požadovaného proteínu, a pod. Expresné vektory podľa tohto vynálezu sa môžu zavádzať do hostiteľských buniek, v dôsledku čoho sa produkujú proteíny alebo peptidy, vrátane fúznych proteínov alebo peptidov kódovaných nukleovými kyselinami, ako sa opisuje v tomto dokumente (napr. SRT proteíny, mutantné formy SRT proteínov, fúzne proteíny a pod.).
Rekombinantné expresné vektory podľa tohto vynálezu sa môžu skonštruovať na expresiu SRT proteínov v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách. Napríklad, SRT gény sa môžu exprimovať v bakteriálnych bunkách, takých ako C. glutamicum, bunkách hmyzu (použitím baculovírusových expresných vektorov), kvasinkových a iných bunkách húb (pozri Romanos, a kol., (1992) „Foreign gene expression in yeast: a review“, Yeast 8, 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. a kol. (1991) „Heterologous gene expression in filamentous fungi“ v: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds.,str. 396-428: Academic Press: San Diego; a van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi“, v: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. a kol., eds., str. 1-28, Cambridge University Press, Cambridge), v riasach a v bunkách mnohobunkových rastlín (pozri Schmidt, R and Willmitzer, L. (1988) „High efficiency Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants“ Plánt Celí Rep, 583-586) alebo v bunkách cicavcov. O vhodných hostiteľských bunkách sa diskutuje ďalej vGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185. Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternatívne, rekomblnantný expresný vektor sa môže transkribovať a translatovať in vitro, napríklad použitím T7 promótorových regulačných sekvencií a T7 polymerázy.
Expresia proteínov v prokaryotoch sa najčastejšie uskutočňuje s vektormi obsahujúcimi konštitutívne alebo indukovateľné promótory, ktoré riadia expresiu buď fúznych alebo ne-fúznych proteínov. Fúzne vektory pridávajú mnoho aminokyselín ku kódovanému proteínu, obvykle k amino-koncu rekombinantného proteínu.Takéto fúzne vektory majú typicky tri funkcie: 1) zvyšujú expresiu rekombinantného proteínu; 2) zvyšujú rozpustnosť rekombinantného proteínu; a 3) pomáhajú purifikovať rekombinantný proteín tým, že majú funkciu ligandov pri afinitnej purifikácii. Často sa fúznymi expresnými vektormi zavádza proteolytické štiepne miesto na spojenie fúznej časti a rekombinantného proteínu, aby sa umožnila separácia rekombinantného proteínu z fúznej časti s následnou purifikáciou fúzneho proteínu. Takéto enzýmy, a ich príbuzné rozpoznávacie sekvencie obsahujú Faktor Xa, trombín a enterokinázu.
Charakteristické fúzne expresné vektory obsahujú pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Jihnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), ktoré fúzujú glutatión- Stransferázu (GST), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), ktoré fúzujú maltózu E-viažuci proteín a pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), ktoré fúzujú proteín A k cieľovému rekombinantnému proteínu. V jednom uskutočnení, sekvencia kódujúca SRT proteín je klonovaná do pGEX expresného vektora, aby sa vytvoril vektor kódujúci fúzny proteín začlenením z N-konca k C-koncu GST-trombínového štiepneho miesta-X proteínu. Fúzny proteín sa môže purifikovať pomocou afinitnej chromatografie za použitia glutatiónagarózovej živice. Rekombinantný SRT proteín. ktorý nebol fúziou pripojený na GST sa môže získať štiepením fúzneho proteínu s trombínom.
Príkladmi vhodných induktívnych ne-fúznych E. coli expresných vektorov sú: pTrc (Amann a kol., (1988) Gene 69, 301-315) pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN III113-B1, λ gt11, pBdC1 a pET 11d (Studier a kol., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; a Pouwels a kol., (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018). Cieľová génová expresia zpTrc vektora sa zakladá na RNA polymerázovej transkripcii z hybridného trp-lac fúzneho promótora. Cieľová génová expresia zpET Hd vektora sa zakladá na transkripcii zT7 gn 10-lac fúzneho promótora sprostredkovanej pomocou koexpresie s vírusovou RNA polymerázou (T7 gn 1). Táto vírusová polymeráza je poskytovaná hostiteľskými kmeňmi BL21 (DE3) alebo HMS174(DE3) z rezidentného λ profágu prechovávajúceho T7 gn1 gén pod transkripčnou reguláciou lacUV 5 promótora. Na transformáciu ďalších druhov baktérií sa môžu vybrať vhodné vektory. Napríklad plazmidy plJ101, plJ364, plL702 a plJ361 sa úspešne používajú na transformovanie Streptomyces, zatiaľ čo plazmidy pUB110, pC194 alebo pBD214 sú vhodné na transformáciu Bacillus druhov. Niekoľko plazmidov sa používa pri prenose genetickej informácie do Corynebacterium, a to pHM1519, pBL1, pSL1, pSA77 alebo pAJ667 (Pouwels a kol., eds. (1985) Cloning
Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018).
Jednou stratégiou na maximalizáciu rekombinantnej proteínovej expresie je expresia proteínu v hostiteľskej baktériovej bunke s oslabenou schopnosťou proteolytického štiepenia rekombinantného proteínu (Gotteman.S., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Ďalšou stratégiou je meniť nukleovokyselinovú sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá sa má vložiť do expresného vektora, takže individuálne kodóny pre každú aminokyselinu sú tie, ktoré sa prednostne využívajú v baktérii vybratej na expresiu, napríklad ako C. glutamicum (Wada a kol. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 2111-2118). Takáto zmena nukleovokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu sa môže uskutočniť pomocou štandardných metód syntézy DNA.
V ďalšom uskutočnení, SRT proteínovým expresným vektorom je kvasinkový expresný vektor. Príkladmi vektorov na expresiu v kvasinkách S. cerevisiae sú: pYepSed (Baldari a kol., (1987) Embo J. 6, 229-234), 2 μ, pAG-1, Yep6, Yep13, pEMBLYYe23, pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Celí 30, 933-943), pJRY88 (Schultz a kol., (1987) Gene 54, 113-123) apYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektory a metódy na konštrukciu vektorov vhodných na použitie v ďalších hubách, takých ako vláknitých hubách, sú detailne zhrnuté vo: van den Hondel, C.A.M.J.J & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi“, v: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy a kol., eds., str. 1-28, Cambridge University Press, Cambridge, a Pouwels a kol., eds.(1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York (IBSN 0 444 904018).
Alternatívne sa SRT proteíny podľa tohto vynálezu môžu exprimovať v bunkách hmyzu použitím baculovírusových expresných vektorov. Baculovírusové vektory dostupné na expresiu proteínov pri kultivovácii buniek hmyzu (napr. buniek Sf9) zahrňujú pAc série (Smith a kol., (1983) Mol. Celí Biol. 3, 2156-2165) a pVL série (Lucklow and Summers (1989) Virologv 170. 31-39).
V inom uskutočnení sa SRT proteíny podľa tohto vynálezu môžu exprimovať v bunkách jednobunkových rastlín (napríklad v riasach) alebo v rastlinných bunkách vyšších rastlín (napr. spermatofytoch ako napríklad poľnohospodárskych plodín). Príklady rastlinných expresných vektorov sú detailne zhrnuté v: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) „New plánt binary vectors with selectable markers located proximal to the left border Plánt Mol. Biol. 20,1195-1197; a Bevan,
M.W. (1984) „B\nary Agrobacterium vectorsfor plánt transformation“, Nucl. Acid. Res.
12, 8711-8721 a zahŕňajú pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 apDH51 (Pouwels a kol., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018).
V ešte inom uskutočnení, sa nukleové kyseliny podlá tohto vynálezu exprimujú v bunkách cicavcov použitím expresného vektora cicavcov. Príkladmi expresných vektorov cicavcov sú pCDM8 (Seed, B.(1987) Náture 329-840) apMT2PC (Kaufman a kol. (1987) EMBO J. 6, 187-195). Ak sa použijú bunky cicavcov, tak regulačné funkcie expresných vektorov často plnia vírusové regulačné elementy. Napríklad, bežne používané promótory sa často odvodzujú od polyoma, Adenovirusu 2, cytomegalovirusu aSimian Vírusu 40. Ďalšie vhodné expresné systémy, tak pre prokaryotické ako aj eukaryotické bunky, sa uvádzajú v kapitole 16 a 17 v Sambrook, J., Fritsh. E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
V dálšom uskutočnení rekombinantný expresný vektor cicavcov je schopný riadiť expresiu nukleovej kyseliny prednostne vo zvláštnom type bunky (napr. na expresiu nukleovej kyseliny sa používajú tkanivovo-špecifické regulačné elementy). Tkanivovo-špecifické regulačné elementy sú známe v danej oblasti techniky. Neohraničenými príkladmi vhodných tkanivovo-špecifických promótorov sú: albumínový promótor (pečeňovo-špecifický; Pinkert a kol., (1987) Genes Dev. 1, 268277), lymfoid-špecifické promótory (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43, 235275), predovšetkým promótory v receptoroch T buniek (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8, 729-733) a immunoglobulíny (Banerji a kol., (1983) Celí 33, 729-740; Queen and Baltimore (1983) Celí 33, 741-748), neurón-špecifické promótory (napr. neurofilament-promótor; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86, 5473-5477), pankreasšpecifické promótory; (Edlund a kol. Science 230, 912-916) a špecifické promótory mliečnej žľazy cicavcov (napr. promótor mliečnej srvátky; americký patentový spis č. U S 4,873,316 a publikovaná európska prihláška č. 264 166). Vývojovo-regulované promótory sú tiež zahrnuté, napríklad myšacie hox promótory (Kessel aGruss, (1990) Science 249, 374-379) a α-fetoproteínový promótor (Campes aTilghman, (1989) Genes Dev. 3, 537-546).
Vynález v ďalšom poskytuje rekombinantný expresný vektor obsahujúci molekulu DNA podľa tohto vynálezu klonovanú do expresného vektora v nezmyselnej orientácii. Znamená to, že molekula DNA je funkčne pripojená k regulačnej sekvencií takým spôsobom, ktorý umožňuje expresiu (pomocou transkripcie molekuly DNA) molekuly RNA, ktorá je nezmyselná k SRT mRNA. Regulačné sekvencie funkčne spojené s nukleovou kyselinou klonovanou v nezmyselnej orientácii sa môžu vybrať také, aby riadili kontinuálnu expresiu nezmyselnej molekuly RNA v rôznych typoch buniek, napríklad vírusové promótory a/alebo zosilňovače, alebo regulačné sekvencie sa môžu zvoliť tak, aby riadili konštitutívnu, tkanivovo-špecifickú alebo podľa typu bunky špecifickú expresiu nezmyselnej RNA. Nezmyselný expresný vektor môže mať formu rekombinantného plazmidu, fágomidu alebo zoslabeného vírusu, v ktorom sa nezmyselná nukleová kyselina produkuje pod kontrolou vysoko účinnej regulačnej oblasti, aktivita ktorej sa môže stanoviť pomocou typu bunky, do ktorej je vektor zavedený. Podrobnejšie informácie o regulácii génovej expresie použitím nezmyselných génov, pozri Weintraub, H. a kol., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, fíeviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1), (1986).
Vynález sa ďalej týka hostiteľských buniek, do ktorých sa zaviedol rekombinantný expresný vektor podľa tohto vynálezu. Pojem „hostiteľská bunka“ a „rekombinantná hostiteľská bunka“ sa používa navzájom zameniteľné v tomto dokumente. Rozumie sa, že takéto pojmy označujú nielen príslušný subjekt bunky, ale aj progén alebo potenciálny progén takejto bunky. Pretože určité modifikácie sa môžu vyskytnúť v nasledujúcich generáciách v dôsledku buď mutácie alebo vplyvov prostredia, takýto progén nemôže byť v skutočnosti identický s rodičovskou bunkou, ale ešte stále je zahrnutý do rozsahu pojmu ako sa používa v tomto dokumente.
Hostiteľskou bunkou môže byť akákoľvek prokaryotická alebo eukaryotická bunka. Napríklad, SRT proteín sa môže exprimovať v baktériových bunkách, takých ako C. glutamicum, bunkách hmyzu, kvasinkách alebo bunkách cicavcov (takých ako ovariálnych bunkách čínskeho škrečka (CHO) alebo COS bunkách). Ďalšie vhodné hostiteľské bunky sú známe odborníkom v danej oblasti techniky. Mikroorganizmy príbuzné ku Corynebacteríum glutamicum, ktoré sa môžu obyčajne používať ako hostiteľské bunky pre nukleovú kyselinu a molekuly proteínov podľa tohto vynálezu, sú uvedené v tabuľke 3.
Vektor DNA sa môže zaviesť do prokaryotických a eukaryotických buniek prostredníctvom bežných transformačných a transfekčných metodík. Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojmy „transformácia“ a „transfekcia“, sú mienené tak, že odkazujú na rôzne, v danej oblasti techniky známe, metódy na zavádzanie cudzej nukleovej kyseliny (napr. lineárnej DNA alebo RNA (napr. linearizovaný vektor alebo samotný génový konštrukt bez vektora) alebo nukleovej kyseliny vo forme vektora (napr. plazmidu, fágu, „fazmidu, „fagemidu“, transpozónu alebo inej DNA) do hostiteľskej bunky, vrátane koprecipitácie s fosforečnanom vápenatým alebo chloridom vápenatým, DEAE-dextránovo sprostredkovanej transfekcie, lipofekcie, alebo elektroporácie. Vhodné metódy na transformovanie alebo transfekovanie hostiteľských buniek sa dajú nájsť v Sambrook, a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a ďalších laboratórnych príručkách.
Pri stabilnej transfekcii buniek cicavcov, ako je známe, v závislosti na expresnom vektore a použitej transfekčnej metodike, len malá frakcia buniek môže integrovať cudziu DNA do svojho genómu. Za účelom identifikácie a selekcie týchto integrácií sa gén, ktorý kóduje selekčný markér (napr. rezistenciu na antibiotiká) bežne zavádza do hostiteľských buniek spolu s génom, ktorý je predmetom záujmu.. Výhodné markéry selekcie sú tie, ktoré prepožičiavajú rezistenciu na liečivo, také ako G418, hygromycín ametotrexát. Nukleová kyselina kódujúca selekčný markér sa môže zaviesť do hostiteľskej bunky na tom istom vektore, ktorý kóduje SRT proteín alebo sa môže zaviesť na zvláštnom vektore. Bunky stabilne transfekované so zavedenou nukleovou kyselinou sa dajú identifikovať napríklad selekciou liečiva (napr. bunky, ktoré inkorporovali selekčný markérový gén prežijú, kým ostatné bunky odumrú).
Za účelom vytvorenia homológneho rekombinantného mikroorganizmu, sa pripraví vektor, ktorý obsahuje aspoň časť SRT génu, do ktorého sa zaviedla delécia, adícia alebo substitúcia, aby sa týmto spôsobom zmenil, napr. funkčne rozrušil, SRT gén. Výhodne, týmto SRT génom je Corynebacterium glutamicum SRT gén, ale tento môže byť homológny s príbuznou baktériou alebo dokonca so zdrojmi z cicavcov, kvasiniek alebo hmyzu. Vo výhodnom uskutočnení, je vektor skonštruovaný tak, že homológnou rekombináciou je endogénny SRT gén funkčne narušený (t.j. už ďalej nekóduje funkčný proteín; tiež porovnaj s „knock out“ vektorom). Alternatívne, vektor môže byť skonštruovaný tiež tak, že na základe homológnej rekombinácie, endogénny SRT gén zmutuje alebo sa ináč zmení, ale ešte stále kóduje funkčný proteín (napr. protismerná) regulačná obasť sa môže zmeniť tak, že sa zmení expresia endogénneho SRT proteínu). Vhomológnom rekombinantnom vektore, zmenená časť SRT génu lemuje jeho 5'- a 3'- konce pomocou dodatkovej nukleovej kyseliny SRT génu, čo umožní homológnu rekombináciu medzi exogénnym SRT génom prenášaným prostredníctvom vektora a endogénnym SRT génom v mikroorganizme. Dodatková lemujúca SRT nukleová kyselina má dostatočnú dĺžku na úspešnú homológnu rekombináciu s endogénnym génom. Charakteristicky, niekoľko kilobáz lemujúcej DNA (na oboch 5'- a 3'-koncoch) je zahrnutých do vektora (pozri opis homológnych rekombinantných vektorov napr. Thomas, K. R., and Capecchi, M.R. (1987) Celí 51, 503 ). Vektor sa zavádza do mikroorganizmu (napr. pomocou elektroporácie) a bunky, v ktorých sa zavedený SRT gén homológne rekombinoval s endogénnym SRT génom sa rozdeľujú pomocou metód známych v danej oblasti techniky.
V ďalšom uskutočnení sa môžu produkovať rekombinantné mikroorganizmy, ktoré obsahujú zvolené systémy, ktoré poskytujú regulovanú expresiu zavedeného génu. Napríklad, inklúzia SRT génu na vektor, umiestnený tak, že je regulovaný lac operónom, umožňuje expresiu SRT génu len v prítomnosti IPTG. Takéto regulačné systémy sú dobre známe v danej oblasti techniky.
V ďalšom uskutočnení je endogénny SRT gén v hostiteľskej bunke narušený (napr. homológnou rekombináciou alebo ďalšími genetickými spôsobmi známymi v danej oblasti techniky) tak, že expresia jeho proteínového produktu nenastane. V ďalšom uskutočnení sa endogénny alebo zavedený SRT gén v hostiteľskej bunke zmenil jednou alebo viacerými bodovými mutáciami, deléciami alebo inverziami, ale stále ešte kóduje funkčný SRT proteín. V ešte ďalšom uskutočnení, jedna alebo viac regulačných oblastí (napr. promótor, represor alebo induktor) SRT génu v mikroorganizme sa zmenili (napr. deléciou, trunkáciou, inverziou alebo bodovou mutáciou) tak, že expresia SRT génu je modulovaná. Odborník v danej oblasti techniky si bude vedomý, že hostiteľské bunky, obsahujúce viac ako jednu z opísaných SRT génových a proteínových modifikácií sa dajú ľahko produkovať s použitím spôsobov podľa tohto vynálezu a sú zahrnuté do rozsahu predloženého vynálezu.
Hostiteľská bunka podľa tohto vynálezu, taká ako prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka, sa môže použiť na kultiváciu, aby sa produkoval (t.j. exprimoval) SRT proteín. V súlade s uvedeným, vynález v ďalšom poskytuje spôsoby produkcie SRT proteínov s použitím hostiteľských buniek podľa tohto vynálezu. V jednom uskutočnení, metóda pozostáva z pestovania hostiteľskej bunky podľa tohto vynálezu, (do ktorej sa zaviedol rekombinantný expresný vektor kódujúci SRT proteín, alebo do genómu ktorej sa zaviedol gén, kódujúci „divý“-typ alebo zmenený SRT proteín) vo vhodnom médiu, až kým sa produkuje SRT proteín. V .ďalšom uskutočnení sa spôsob ďalej týka izolácie SRT proteínov z média alebo z hostiteľskej bunky.
C. Izolované SRT proteíny
Vynález sa ďalej týka izolovaných SRT proteínov a ich biologicky aktívnych častí. „Izolovaný“ alebo „purifikovaný“ proteín, alebo jeho biologicky aktívna časť, je v podstate bez celulárneho materiálu vtedy, ak bol produkovaný rekombinantnými DNA metódami, alebo bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok vtedy, ak bol syntetizovaný chemicky. Pojem „v podstate bez bunkového materiálu“ označuje preparáty SRT proteínu, v ktorých sa proteín oddelil od celulárnych zložiek buniek, z ktorých sa prirodzene alebo pomocou rekombinácie produkuje. V jednom uskutočnení, pojem „v podstate bez celulárneho materiálu“ označuje preparáty SRT proteínu, ktoré majú menej ako asi 30% (v sušine) ne-SRT proteínu (tiež označené v tomto dokumente ako „kontaminujúci proteín“), výhodnejšie menej ako asi 20% ne-SRT proteínu, ešte výhodnejšie menej ako asi 10 % ne-SRT proteínu a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % neproteínu. Ak SRT proteín alebo jeho biologicky aktívna časť sa produkuje rekombinantne, tiež je výhodne v podstate bez kultivačného média, t.j. kultivačné médium predstavuje menej ako asi 20 %, výhodnejšie menej ako asi 10 % a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % objemu proteínového preparátu. Slovné spojenie, „v podstate bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok“ označuje preparáty SRT proteínu, v ktorých je proteín oddelený od chemických prekurzorov alebo iných chemických látok, ktoré sú zapojené do syntézy proteínu. V jednom uskutočnení, slovné spojenie „v podstate bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok označuje preparáty SRT proteínu, ktoré majú menej ako asi 30 % (v sušine) chemických prekurzorov alebo ne-SRT chemických látok, výhodnejšie menej ako asi 20 % chemických prekurzorov alebo ne-SRT chemických látok, ešte výhodnejšie menej ako asi 10% chemických prekurzorov alebo ne-SRT chemických látok a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % chemických prekurzorov alebo ne-SRT chemických látok. Vo výhodných uskutočneniach, izolované proteíny alebo ich biologicky aktívne časti neobsahujú kontaminujúce proteíny z toho istého organizmu, z ktorého bol SRT proteín odvodený. Charakteristicky, sa takéto proteíny produkujú rekombinantnou expresiou, napríklad C. glutamicum SRT proteín v takom mikroorganizme, ako je C. glutamicum.
Izolovaný SRT proteín alebo jeho časť, podľa tohto vynálezu môže prispievať k rezistencii alebo tolerancii C. glutamicum na jeden alebo viac chemických stresov alebo stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia alebo na jedno alebo viacero rizík, alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1. Vo výhodných uskutočneniach, proteín alebo jeho časť obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť sprostredkovať rezistenciu alebo toleranciu C. glutamicum.na jeden alebo viac chemických stresov alebo stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia alebo rizík. Časť proteínu je výhodne biologicky aktívna časť, ako sa to uvádza v tomto dokumente. V ďalšom výhodnom uskutočnení má SRT proteín podľa tohto vynálezu aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená s párnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname. V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení má SRT proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárne očíslovanou SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname). V ešte inom výhodnom uskutočnení, má SRT proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi na 71 %, 72%, 73%,74%,75%, 76%, 77%, 78%, 79% alebo 80%, 81 %, 82%, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s nukleotidovými sekvenciami podľa tohto vynálezu, alebo s ich časťou. Rozsahy a medziľahlé hodnoty identity k vyššie uvedeným hodnotám (napr. na 70 až 90 % identické alebo na 80 až 95 % identitické) taktiež spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, rozsahy hodnôt identity využívajúce kombináciu z ktorýchkoľvek vyššie vymenovaných hodnôt ako horné a/alebo dolné medze sú taktiež zahrnuté. Výhodné SRT proteíny podlá predloženého vynálezu majú tiež výhodne najmenej jednu z SRT aktivít, ktoré sa opisujú v tomto dokumente. Napríklad, výhodný SRT proteín podľa predloženého vynálezu obsahuje aminokyselinovú sekvenciu kódovanú nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvencoiu podľa tohto vynálezu, a ktorá môže zvyšovať rezistenciu alebo toleranciu C. glutamicum na jeden alebo viac stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia alebo chemických stresov alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1.
V iných uskutočneniach, SRT proteín je v podstate homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) a uchováva si funkčnú aktivitu proteínu jednej z aminokyselinových sekvencii podľa tohto vynálezu, ale odlišuje sa od aminokyselinovej sekvencie, v dôsledku prirodzenej variácie alebo mutagenézy, ako sa to opisuje detailne v I. odseku vyššie. Podľa toho, v inom uskutočnení, SRT proteínom je proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi na 71 %,72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, a ktorá má najmenej jednu z SRT aktivít opísaných v tomto dokumente. Rozsahy a medziľahlé hodnoty identity k vyššie uvedeným hodnotám (napr. na 70-90 % identitické alebo na 80-95 % identitické) taktiež spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, rozsahy hodnôt identity využívajúce kombináciu z ktorýchkoľvek vyššie vymenovaných hodnôt ako horné a/alebo dolné medze spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. Vdálšom uskutočnení sa vynález sa týka celej dĺžky proteínu C. glutamicum, ktorý je v podstate homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu.
Biologicky aktívne časti SRT proteínu obsahujú peptidy, ktoré majú aminokyselinové sekvencie odvodené z aminokyselinovej sekvencie SRT proteínu, napr. aminokyselinovej sekvencie s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname alebo aminokyselinovej sekvencie proteínu homológneho s SRT proteínom, ktorý obsahuje menej aminokyselín, než je celá dĺžka SRT proteínu, alebo celú dĺžku proteínu, ktorý je homológny s SRT proteínom a vykazuje najmenej jednu aktivitu SRT proteínu. Typicky, biologicky aktívne časti (peptidy, napr. peptidy, ktoré sú napríklad 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 alebo viac aminokyselín dlhé) obsahujú doménu alebo motív s najmenej jednou aktivitou SRT proteínu. Okrem toho, ďalšie biologicky aktívne časti, v ktorých sú ďalšie oblasti proteínu deletované, sa môžu pripraviť pomocou rekombinantných metód a ohodnotiť na jednu alebo viac aktivít opísaných v tomto dokumente. Výhodne, biologicky aktívne časti SRT proteínu obsahujú jednu alebo viac vybraných domén/motívov alebo ich častí, ktoré majú biologickú aktivitu.
SRT proteíny sú výhodne produkované pomocou DNA rekombinantných metodík. Napríklad, molekula nukleovej kyseliny kódujúca proteín sa klonuje do expresného vektora (ako je opísané vyššie), expresný vektor sa zavedie do hostiteľskej bunky (ako je opísané vyššie) a SRT proteín sa exprimuje v hostiteľskej bunke. SRT proteín sa môže potom izolovať z buniek pomocou vhodných purifikačných postupov, a to použitím štandardných metód na purifikáciu proteínov. Alternatívne na rekombinantnú expresiu sa SRT proteín, polypeptid, alebo peptid môžu syntetizovať chemicky použitím štandardných metód na syntézu peptidov. Okrem toho, natívny SRT proteín sa môže izolovať z buniek (napr. endotelových buniek), napríklad použitím anti-SRT protilátky, ktorá sa môže produkovať pomocou štandardných metód využívajúcich SRT proteín alebo jeho fragment, podľa tohto vynálezu.
Vynález tiež poskytuje SRT chimérové alebo fúzne proteíny. Tak ako sa používa v tomto dokumente, SRT „chimérový proteín“ alebo „fúzny proteín“. zahrňuje SRT polypeptid, ktorý je účinne spojený s ne-SRT polypeptidom. „SRT polypeptid“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia sa zhoduje s SRT proteínom, zatiaľ čo „ne-SRT polypeptid“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zodpovedá proteínu, ktorý nie je v podstate homológny s SRT proteínom, napr. proteínom, ktorý sa odlišuje od SRT proteínu, a ktorý je odvodený z toho istého organizmu alebo odlišného organizmu. V rámci fúzneho proteínu sa chce pojmom „účinne spojený“ vyjadriť, že SRT polypeptid a ne-SRT polypeptid sa vzájomne fúziou „in frame“ spoja. Ne-SRT-polypeptid sa môže spojiť fúziou s N-koncom a C-koncom SRT polypeptidu. Napríklad v jednom uskutočnení fúznym proteínom je GST-SRT fúzny proteín, v ktorom SRT sekvencie sa fúziou spojili s C-koncovými GST sekvenciami. Takéto fúzne proteíny môžu uľahčiť purifikáciu rekombinantných SRT proteínov. V ďalšom uskutočnení, fúznym proteínom je SRT proteín obsahujúci heterológnu signálnu sekvenciu na svojom Nkonci. V určitých hostiteľských bunkách (napr. hostiteľských bunkách cicavcov), expresia a/alebo sekrécia SRT proteínu sa môže zvýšiť prostredníctvom použitia heterológnej signálnej sekvencie.
Výhodne sa SRT chimérový alebo fúzny proteín podľa tohto vynálezu produkuje pomocou štandardných DNA rekombinačných metód. Napríklad, fragmenty DNA kódujúce rôzne polypeptidové sekvencie sa spolu ligujú „in frame“ podľa bežných metód, napríklad sa používa tupý (zarovnaný) (blunt-ended) alebo posunutý (neprekrývajúci sa) (stagger-ended) koniec na ligáciu, digescia s reštrikčným enzýmom na poskytnutie vhodného konca, doplnenie kohéznych koncov na prijateľné konce, spracovanie alkalickou fosfatázou na zamedzenie neželateľného pripojenia, a enzýmová ligácia. V inom uskutočnení sa fúzny gén môže syntetizovať pomocou bežných metód, vrátane automatických DNA syntetizátorov. Alternatívne sa PCR amplifikácia génových fragmentov môže uskutočniť použitím zakotvených primérov, ktoré spôsobujú komplementárne prečnievania medzi dvoma za sebou nasledujúcimi génovými fragmentárni, ktoré môžu byť potom tepelne hybridizované (annealed) a reamplifikované, aby sa generovala chimérová génová sekvencia (pozri, napríklad Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel a kol., John Wiley & Sons, 1992). Okrem toho, mnohé expresné vektory, ktoré kódujú fúzny podiel sú komerčne dostupné (napr. GST polypeptid). SRT-kódujúca nukleová kyselina sa môže klonovať do takéhoto expresného vektora, takže fúzny podiel je „in-frame“ spojený spolu s SRT proteínom.
Homológy SRT proteínu sa môžu vytvárať mutagenézou, napr. diskrétnou bodovou mutáciou alebo trunkáciou SRT proteínu. Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojem „homológ označuje rôzne formy SRT proteínu, ktoré pôsobia agonisticky alebo antagonistický na aktivity SRT proteínu. Agonista SRT proteínu môže udržiavať v podstate rovnaké, alebo podprahové biologické aktivity SRT proteínu. Antagonista SRT proteínu môže inhibovať jednu alebo viac aktivít prirodzene sa vyskytujúcej formy SRT proteínu, napríklad prostredníctvom, kompetetívneho viazania so smerovým alebo protismerovým členom SRT systému, ktorý obsahuje SRT proteín. Takto môže C. glutamicum SRT proteín a jeho homológy podľa predloženého vynálezu zvýšiť toleranciu alebo rezistenciu C. glutamicum na jeden alebo viac chemických stresov alebo stresov pochádzajúcich z okolitého prostredia.
V alternatívnom uskutočnení sa homológy SRT proteínu môžu identifikovať skríningom kombinatorických knižníc mutantov, napr. trunkačných mutantov, SRT proteínu na SRT proteínovú agonistickú alebo antagonistickú aktivitu. V jednom uskutočnení, variegátna knižnica (variegated library) SRT variantov sa vytvára pomocou kombinatorickej mutagenézy na úrovni nukleovej kyseliny a je kódovaná variegátnou génovou knižnicou. Variegátna knižnica SRT variantov sa môže získať pomocou napríklad enzýmovej ligácie zmesi syntetických oligonukleotidov do génových sekvencií tak, že degenerovaný súbor potenciálnych SRT sekvencií je exprimovateľný ako individuálne polypeptidy, alebo alternatívne, ako súbor väčších fúznych proteínov (napr. na fágový displej) obsahujúcich súbor SRT sekvencií tam uvedených. Existujú rôzne metódy, ktoré sa môžu použiť na vytváranie knižníc potenciálnych homológov SRT z degenerovanej oligonukleotidovej sekvencie. Chemická syntéza degenerovanej génovej sekvencie sa môže uskutočniť v automatickom DNA syntetizátore, a syntetický gén sa potom liguje do vhodného expresného vektora. Použitie degenerovaného súboru génov umožňuje zabezpečiť v jednej zmesi všetky sekvencie kódujúce požadovaný súbor potenciálnych SRT sekvencií. Metódy na syntetizovanie degenerovaných oligonukleotidov sú známe v danej oblasti techniky (pozri napr. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39,3; Itakura a kol., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53,323; Itakura a kol., (1984) Science 198,1056: Ike a kol., (1983) NudeicAcid Res. H, 477).
Okrem toho, knižnice fragmentov kódujúcich SRT proteín sa môžu použiť na vytváranie variegátnej populácie SRT fragmentov na skríning a následnú selekciu homológov SRT proteínu. V jednom uskutočnení sa knižnica kódujúcich sekvenčných fragmentov môže vytvárať pomocou spracovania dvojvláknového PCR fragmentu SRT kódujúcej sekvencie s nukleázou v podmienkach, v ktorých medzera (nick) sa vyskytuje len raz na molekulu, denaturáciou dvojvláknovej DNA, renaturáciou DNA na vytvorenie dvojvláknovej DNA, ktorá môže obsahovať zmysluplné/nezmyselné páry produktov s rôznym počtom medzier, odstránením jednovláknových častí z novovytvorených duplexov pomocou spracovania s S1 nukleázou a ligovaním knižnice výsledného fragmentu do expresného vektora. Pomocou tejto metódy sa môže odvodiť taká expresná knižnica, ktorá kóduje N-koncové, C-koncové a vnútorné fragmenty rôznych veľkostí SRT proteínu.
Viacero metodík je známych v danej oblasti techniky na skíning génových produktov kombinatorických knižníc vytvorených bodovými mutáciami alebo trunkáciou a na skríning cDNA knižníc na génové produkty, ktoré majú zvolené vlastnosti. Takéto metódy sú prispôsobiteľné na rýchly skríning génových knižníc vytvorených kombinatoriálnou mutagenézou SRT homológov. Najviac používané metódy, ktoré sú vhodné na vysokoúčinnú „through-puť analýzu na skríning veľkých génových knižníc, typicky zahrňujú klonovanie génovej knižnice do replikovateľných expresných vektorov, transformovanie vhodných buniek s výslednou knižnicou vektorov a exprimovanie kombinatorických génov v podmienkach, v ktorých detekcia požadovanej aktivity uľahčuje izoláciu vektora kódujúceho gén, ktorého produkt sa detegoval. Rekurzívna množina mutagenézy (REM), nová metóda, ktorá zlepšuje frekvenciu funkčných mutantov v knižniciach, sa môže použiť v kombinácii so skríningovými skúškami na identifikáciu SRT homológov (Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89,7811-7815; Delgrave a kol., (1993) Protein Engineering 6(3), 327-331).
Vínom uskutočnení sa skúšky na báze bunky môžu využiť na analýzu variegátnej SRT knižnice, ak sa použijú metódy, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky.
D. Použitie a spôsoby vynálezu
Molekuly nukleovej kyseliny, proteíny, proteínové homológy, fúzne proteíny, priméry, vektory a hostiteľské bunky opísané v tomto dokumente sa môžu použiť v jednom alebo vo viacerých nasledovných spôsoboch: identifikácia C. glutamicum a príbuzných organizmov; mapovanie genómov organizmov príbuzných C. glutamicum·, identifikácia a lokalizácia C. glutamicum sekvencii, ktoré sú predmetom záujmu; evolučné výskumy; stanovenie oblastí SRT proteínu potrebných na funkčnosť; modulácia SRT proteínovej aktivity; modulácia aktivity SRT dráhy; a modulácia celulárnej produkcie požadovanej zlúčeniny, takej ako špeciálna chemikália.
Molekuly SRT nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, majú rozmanité použitia. Po prvé, môžu sa použiť na identifikáciu organizmu, akým je Corynebacterium glutamicum alebo príbuzných organizmov. Taktiež sa môžu použiť na identifikáciu prítomnosti C. glutamicum alebo príbuzných organizmov v zmiešanej populácii mikroorganizmov. Vynález poskytuje sekvencie nukleových kyselín mnohých C. glutamicum génov; pomocou sondovania extrahovanej genómovej DNA kultúry jednotnej alebo zmiešanej populácie mikroorganizmov v stringentných podmienkach so sondou prekleňujúcou oblasť C. glutamicum génu, ktorá je osobitá pre tento organizmus, možno určiť, či je tento organizmus prítomný.
I keď Corynebacterium glutamicum samotná je nepatogénna, je príbuzná s patogénnymi druhmi, takými ako Corynebacterium diphtheriae. Corynebacterium diphtheriae je kauzatívny agens diftérie, rýchle sa vyvíjajúcej, akútnej horúčkovitej infekcie s následkami tak lokálnej ako aj systémovej patológie. Pri tejto chorobe, sa vyvíja lokálne poškodenie horného respiračného traktu s nekrotickým poškodením epitelových buniek; bacily vylučujú toxín, ktorý sa rozšíri cez toto poškodenie do distálnych vnímavých telesných tkanív. Degeneratívne zmeny spôsobené inhibíciou proteosyntézy v takých tkanivách, ako v srdci, svale, periférnych nervoch, nadobličkách, obličkách, pečeni a slezine, majú za následok systémovú patológiu choroby. Diftéria pretrváva s vysokým výskytom v mnohých častiach sveta, vrátane Afriky, Ázie, východnej Európy a v nezávislých štátoch bývalého Sovietskeho zväzu. Pokračujúca epidémia diftérie vo východnej Európe a nezávislých štátoch bývalého Sovietskeho zväzu si vyžiadala najmenej 5000 úmrtí od roku 1990.
V jednom uskutočnení vynález poskytuje spôsob na identifikáciu prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphtheriae v subjekte. Týmto spôsobom sa deteguje jedna alebo viacej nukleovokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencií uvedených s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), alebo aminokyselinových sekvencií (napr. sekvencie uvedené s párnym očíslovaním SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname) v subjekte, čím sa deteguje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphtheriae v subjekte. C. glutamicum a C. diphtheriae sú príbuzné baktérie a mnoho molekúl nukleových kyselín a proteínových molekúl v C. glutamicum je homológnych s C. diphtheriae molekulami nukleovej kyseliny a proteínovými molekulami, a preto sa môžu použiť na detekciu C. diphtheriae v subjekte.
Molekuly nukleových kyselín a proteínov podľa tohto vynálezu môžu byť tiež markérmi špecifických oblastí genómu. Je to využiteľné nielen pri mapovaní genómu, ale tiež pri funkčných výskumoch proteínov C. glutamicum. Napríklad, na to, aby sa identifikovala oblasť genómu, ku ktorej sa viaže určitý C. glutamicum DNA-väzbový proteín, by sa mal genóm C. glutamicum podrobiť digescii a fragmenty inkubovať s DNA-väzbovým proteínom. Tie, ktoré viažu proteín môžu byť dodatočne sondované s molekulami nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, výhodne s ľahko detegovateľnými značkami; viazanie takejto molekuly nukleovej kyseliny s genómovým fragmentom umožňuje lokalizáciu fragmentu na genómovej mape C. glutamicum, a keď sa to uskutoční viacnásobne s rôznymi enzýmami, uľahčí to rýchle stanovenie sekvencie nukleovej kyseliny, ku ktorej sa viaže proteín. Ďalej, molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu môžu byť dostatočne homológne so sekvenciami príbuzných druhov, takže molekuly nukleových kyselín môžu fungovať ako markéry pri konštrukcii genómovej mapy v príbuzných baktériách, takých ako Brevibacterium lactofermentum.
Molekuly SRT nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú tiež využiteľné pri evolučných výskumoch a výskumoch proteínovej štruktúry. Procesy vzniku rezistencie, na ktorých sa molekuly podľa tohto vynálezu podieľajú, využíva veľa rozmanitých druhov buniek, porovnaním sekvencií molekúl nukleových kyselín podľa predloženého vynálezu s tými, ktoré kódujú podobné enzýmy u iných organizmov sa môže určiť evolučná príbuznosť organizmov. Podobne, také porovnanie umožňuje určiť, ktoré oblasti sekvencie sú zachované, a ktoré nie, čo môže pomôcť pri stanovení takých oblastí proteínu, ktoré sú esenciálne pre fungovanie enzýmu. Tento druh stanovenia je hodnotný pre výskumy proteínového manipulovania a môže byť indikáciou, čo proteín môže tolerovať pri mutagenéze bez straty funkcie.
Gény podlá tohto vynálezu, napr. gény kódujúce LMRB (SEQ ID NO: 1) alebo iné gény podľa tohto vynálezu kódujúce proteíny zodpovedné za rezistenciu na chemikálie alebo reistenciu na vplyv okolitého prostredia alebo tolerančné proteíny (napr. zodpovedné za rezistenciu na jedno alebo viac antibiotík), sa môžu použiť ako genetické markéry na genetickú transformáciu (napr.na transfer dálších génov do skôr existujúcich génov alebo rozrušenie skôr existujúcich génov) organizmov ako sú C. glutamicum alebo iné druhy baktérií. Použitie takýchto nukleovokyselinových molekúl umožňuje účinnú selekciu organizmov, ktoré inkorporovali danú trasgénnu „kazetu (napr. plazmid, fág, „fazmid“, „fagemid, transpozón alebo iný element nukleovej kyseliny), na báze takého charakteristického znaku, ktorý umožňuje prežitie organizmu v ináč nepriaznivom alebo toxickom prostredí (napr. v prítomnosti antimikrobiálnej zlúčeniny). Ak sa použije jeden alebo viacero génov podľa tohto vynálezu ako genetické markéry, tak rýchlosť a ľahkosť, s ktorou sa organizmy majúce požadované charakteristické znaky (napr. sú modulované na produkciu špeciálnej chemikálie) geneticky manipulujú a izolujú, sa zlepší. Pokiaľ je výhodné, aby sa použili gény podľa tohto vynálezu na selekciu transformovanej C. glutamicum a príbuzných baktérií je možné, ako sa opisuje v tomto dokumente, použiť homológy (napr. homológy z iných organizmov), alelické varianty alebo fragmenty génu zachovávajúceho požadovanú aktivitu. Okrem toho, 5'a 3'regulačné elementy génov podľa tohto vynálezu sa môžu modifikovať, tak ako sa to opisuje v tomto dokumente, (napr. pomocou nukleotidovej substitúcie, inzercie, delécie alebo náhradou s viac požadovaným genetickým elementom), aby sa modulovala transkripcia génu. Napríklad sa môže použiť LMRB variant, v ktorom sa zmenila 5'-nukleotidová sekvencia na štartovacom kodóne v oblasti od 1 až do 200 tak, že sa modulovala (výhodne zvýšila) transkripcia a/alebo translácia LMRB, tak ako sa môžu použiť konštrukty, v ktorých sa gén podľa tohto vynálezu (napr. LMRB gén (SEQ ID NO: 1)) funkčne spojil s jedným alebo viacerými regulačnými signálmi (napr. induktor alebo represor viažuce sekvencie), ktoré sa používajú na modulovanie génovej expresie. Podobne sa môže použiť viac ako jedna kópia génu (funkčného alebo inaktivovaného)
Gény, podľa tohto vynálezu, (napr. gény kódujúce LMRB (SEQ ID NO: 1) alebo iné gény rezistencie na liečivo alebo gény rezistencie na antibiotikum) sa ďalej uplatnili pri objave nových antibiotík, ktoré sú účinné proti Corynebacteria a/alebo iným baktériám. Napríklad, gén podľa tohto vynálezu sa môže exprimovať (alebo nadmerne exprimovať) vo vhodnom hostiteľovi, aby sa vytvoril organizmus so zvýšenou rezistenciou na jedno alebo viac liečiv alebo antibiotík (v prípade LMRB, predovšetkým linkozamidy, zvlášť linkomycín). Tento druh rezistentného hostiteľa sa môže potom použiť na skríning chemických látok s bakteriostatickou a/alebo bakteriocídnou aktivitou, takou akú majú nové antibiotické zlúčeniny. Predovšetkým, je možné použiť gény podľa tohto vynálezu (napr. LMRB gén) na identifikáciu nových antibiotík, ktoré sú účinné proti tým mikroorganizmom, ktoré sú už rezistentné na štandardné antibiotické zlúčeniny.
Vynález poskytuje spôsoby na skríning molekúl, ktoré modulujú aktivitu SRT proteínu, buď interakciou so samotným proteínom alebo substrátom alebo väzobným partnerom SRT proteínu, alebo modulovaním transkripcie alebo translácie molekuly SRT nukleovej kyseliny podlá tohto vynálezu. Pri týchto spôsoboch sa mikroorganizmus, ktorý exprimuje jeden alebo viac SRT proteínov, podľa tohto vynálezu, kontaktuje s jednou alebo viacerými testovanými zlúčeninami, a takto sa dá stanoviť vplyv každej testovanej zlúčeniny na aktivitu alebo úroveň expresie SRT proteínu.
Manipulácia molekúl SRT nukleovej kyseliny môže mať za následok to, že sa produkujú SRT proteíny, ktoré sú funkčne odlišné od „divého“ typu SRT proteínov. Tieto proteíny môžu mať zvýšenú účinnosť alebo aktivitu, môžu sa nachádzať vo väčších počtoch v bunkách než obvykle, alebo môžu mať zníženú účinnosť alebo aktivitu. Cieľom takýchto manipulácií je zvýšiť životaschopnosť a aktivitu bunky, keď je bunka vystavená stresom pochádzajúcim z okolitého prostredia a chemickým stresom a rizikám, ktoré často sprevádzajú fermentačnú kultiváciu vo veľkom rozsahu. Takto, pomocou zvyšovania aktivity alebo počtu kópií proteázy regulovanej teplotným šokom, môže odborník zvýšiť schopnosť bunky rozložiť nesprávne poskladané proteíny, ktoré by ináč mohli interferovať s normálnymi bunkovými funkciami (napríklad, pokračovaním vo viazaní substrátov alebo kofaktorov, i keď proteín nemá takú aktivitu, aby vhodne pôsobil na tieto molekuly). To isté platí pre nadmernú expresiu alebo optimalizáciu aktivity jednej alebo viacerých šaperónových molekúl indukovaných teplotným alebo chladovým šokom. Tieto proteíny pomáhajú tomu, aby sa nascentné polypeptidové reťazce správne poskladali, a takto ich zvýšená aktivita alebo prítomnosť by mala zvýšiť percento správne poskladaných proteínov v bunke, čo by malo zase zvýšiť celkovú metabolickú účinnosť alebo životaschopnosť buniek v kultúre. Nadmerná expresia alebo optimalizácia transportných molekúl aktivovaná osmotickým šokom by mala mať za následok zvýšenú schopnosť bunky podieľať sa na udržaní intracelulárnej homeostázy a týmto spôsobom zvyšovať životaschopnosť týchto buniek v kultúre. Podobne, nadmerná produkcia alebo zvýšenie aktivity pomocou mutagenézy proteínov zapojených do vzniku bunkovej rezistencie na chemické stresy rôznych druhov (buď transportom prekážajúcej chemikálie von z bunky alebo modifikovaním chemikálie na menej rizikovú substanciu) by malo zvýšiť prispôsobivosť organizmu na okolité prostredie obsahujúce rizikovú látku (napr. fermentačná kultivácia vo veľkom rozsahu), čo môže umožniť relatívne väčšiemu počtu buniek, aby prežili v takejto kultúre. Celkovým účinkom všetkých týchto stratégií mutagenézy je to, aby sa zvýšila kvantita produkovania špeciálnych chemikálií zložkami v kultúre, a tým sa zvýšil výťažok, produkcia, a/alebo účinnosť produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z kultúry.
Vyššie spomenuté stratégie mutagenézy SRT proteínov, ktoré majú za následok zvýšené výťažky požadovanej zlúčeniny z C. glutamicum, nie sú mienené ako limitujúce; variácie týchto stratégií mutagenézy sú očividne ľahké pre odborníkov, ktorí sú skúsení v danej oblasti techniky. Pomocou takýchto mechanizmov sa molekuly molekuly nukleovej kyseliny a proteínové molekuly podľa tohto vynálezu môžu využiť na vytváranie C. glutamicum alebo príbuzných kmeňov baktérií, v ktorých expresia mutovaných SRT molekúl nukleovej kyseliny a proteínových molekúl je taká, že výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie požadovanej zlúčeniny sa zvýši. Požadovanou zlúčeninou môže byť akýkoľvek prirodzený produkt produkovaný C. glutamicum, vrátane konečných produktov biosyntetických dráh a medziproduktov prirodzene sa vyskytujúcich metabolických dráh, ako aj molekúl, ktoré sa prirodzene nevyskytujú v metabolizme C. glutamicum, ale ktoré sú produkované kmeňom C. glutamicum podľa tohto vynálezu.
Tento vynález je v ďalšom ilustrovaný pomocou nasledovných príkladov, ktoré by sa nemali chápať ako limitujúce. Obsahy všetkých literárnych odkazov, patentových prihlášok, patentov, publikovaných patentových prihlášok, tabuliek a sekvenčných záznamov, ktoré sú uvedené v tejto prihláške, sú týmto zahrnuté ako odkaz.
σ\ V)
X2 ra I-
£ 75 > E o -X c
rt c
UJ O
Z UJ z z ω 'ζ z S O O N x x ψ UJ UJ “· x x z<<
*C/3 *C/5 0 Q *
O ο CO
rt ô je c
Q1 o 55
Q rt <0 H zl
z
LU < O
IU LU <B
to to
CM S 9 LO 9 m CM ŕ“\ o CO CM CM CO CM CM /—s CO 00 CO CO (O m 00 CO O
CM CM CM o o CO
O O O 5 o o O
Z X Z x cn Z
X X x x x X X X
X x x x x x x x
B
b.
CO Ό
£
UJ UJ ω ω á 55 _l —I UJ UJ CC x
UJ UJ
CL O
D D X X OO »ω»ω
Ul
Q O h ιχ Q. UJ UJ £L X
to o x c
LL
cxj r<
o c X q φ X o
z Q Φ ová z Q ♦rf w ová ID N
σ o Φ x O 7- CO in b- 0) τ- N Φ ω x σ
UJ m b* os r- CO Ul b* o 7- m n D UJ LOS 0) t— co m b* 0) O O o o Ο 7- ff 3 UJ
CO CO CD CD N b* b*. b- CD CO LL Z CO CO CO CO 0) 0) 0) 0) 0) 7- 7— T“ T- T- LA Z CO
03 b.
m o CD T“ CO 10 CM CM CO CM 03 CD to •e cm b- b* O CO o (D h* in O CO ω cm CD O O
CD CO CO r- LD LO CM CO CM CO (D CD CM CO 00 o 03 CO b* CM σ> T- T b. CO o 0) 0) 03 CO o t- CM «2
<B 03 CD CO o CD CO O co CM O T— Q o 00 00 co 0) bZ O 10 m b* b* CM CO o CD O CM co
S CO r- -<3· LO 10 LO cm CM CM IO LO CO CO v- co a 0) •m- ’t m· CM CO C0 CM CM V- co CO CD CM CO 03 CO CM 03
τ- b·. CO 10 CO CD CO O coiocDT-CMb-b-cDio inCpCMCOCDy-T-NO (D’ffOr-CM’-’-r-S
CO
CO 10 O CD M· 1“ CO CM ® CD i- CO CO <0 O CO IO 0) CO O ^•t-LO^CO^CMCO
CO CO
CO CD M· h* r▼- o) oj s ιο o cn o b* o S· S b* co o t“ ’M· G) -r- co h. to co b·
O S CO co OJ 05 •r-COCMCOCOajr^CUCO-rT-coocnojcosojo^· OJ’-OJOJCOCOCO^-ffl®
CO O
00 CO CO LO CD
03 in LD q> m 03 0) CM
CM o LO co o CO CD
CO CM CO CO CM
LO IO CO LO CO tJ- O O CM CD m LO 00 CO CO CO $2 CO X CO to CD
co Q CM CM CO 03 V“ r— o LO CM LO to 0) X (0 CM CM CO CO CD r CM 0) 03 0) CD
O O CM co CM CM CM o CM M Tf CM 10 CD CM 10 to o CM CO CO o (D CM CD o CM CM CM CM o
O o o O O O O O O O o o O O o CM O O O O O o O O O O
o o o o O O O O O rt“ O rr O rr* O o HT o nr O O ŕf- o n- O O ŕF« o O O O ΛΤ* o fT* o ΖΊΤ o rr O rr- O rr* O rt Q nr· O
O CM CD X o CM CD CD O CM CO x o CM M* CD CO O CM CD CD O
b- b- b- b- b- co CO x CQ X 03 03 σ> 03 03 o O O O o t“ CM
t“ r- T“ 1“ 1- y— v— T— T- T“ I- CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
Ol «Λ z
03 CO LO b- 03 CO in b. 0) r- CO IO b- 0) y— CO LO b- 03 y— CO 10 03
CO b. b* b* b* b* CO CO x CD CO 03 03 03 03 03 O O O O O T—
▼— r“ t- T“ I“ y— i- T— Ύ“ r“ CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
in o O co CO
m ro CO M* r- Q O CD o o ro CM CM r- ro o CO Tí· 00 CM o co
CO CM CM CO CO O in O CD CO CO CD 8 |X CM m t— CD CO 00 M* O v- CO
φ· ΙΏ CM CO M* CO t- CM CO ro rx o CO in co OO o 00 CD CD CD CO
CD 10 Γ“ i- ro tí· CM in rx CM T CM m CO m m- IO i- Tt CO ro IO M- CM
(O CO
O ° £ S *
v- 10 Jf co £? h- T- O O o O o o ΣΞ o m o o
CO CD
O o s o o o
CM
CO CD 2 co O o 2 O rx o £čé>ičččä> OO>O0OOO>
T- CD in TT- o O o
O Γ- _ CC CC CC > 0(DO>
CM gS °
CM CO
CO o o CC CC (D O
CO CO CO o o ro ro
CM čó CO CM CM Ô CO ID ro CD CM CO OO CM ro ro r* CM rx CD ro ľx
CO CO M- CD CD CM O CO rx b- O CD m CO CD in CM O co CM CO in
O o O O O O Y- r- S o O co CM V- o CO r“ T“ CO CM o
oooooooooooooooo o
o
L J -» _ - ‘ ‘ - - - ' - - -
SI
Od
CD CO O CM CO CO O CM CD CO O CM ’t CO CO o CM CD 00 O CM M“ CD 00 O CM CD CO Q CM CD
CM CM CO CO CO CO CO Tt m m LO m m CD CD CD CD CD rx rx b- b- rx CO CO CO CO CO ro ro ro ro
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
Q
O CO
ro Γ- CO m IX ro CO IO b- ro CO m IX ro T“ CO m b* ro CO m |x ro CO m rx ro T“ CO m rx ro
CM ΟΟ CO CO CO CO TJ- M* Tf“ in in in m m CD CD CD CD CD IX b- b- IX rx 00 00 CO 00 00 ro ro ro ro ro
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
> c 'φ o>
'Φ C φ o >.
>
CM
CO Iä jľ Ό O >· C w '<0
N cn φί σ tn
Ό CQ
CQ
o O)
CQ
CM CO
CO o o CD <
CM M-
O) T- CO LO rr- co co co co
LD LO LO LD tn
LO LO LO m LO
O“ CD
Tabuľka 2 (pokračovanie)
QQ
LLI rhco
F CO
o >
z >
ro >
m <
Φ Φ
o o
(Q (0
N
CO CO ro ro
xf m O
CM CM CO
CM CM CM
CD CD CO
Z) Σ3 ZJ
CO CO o
(D CM
σ> CM N
co M-
m © ©
x x x
< 3 Ό < I Q
Φ O G
o m LO Γχ X
0)
O) rx
T— CO
t— T“
00 00
x x
m r-
Tabuľka 2 (pokračovanie) Ruimy, R. et al. Phylogeny of the genus Corynebacterium deduced from analyses of small-subunit ribosomal DNA sequences, Int. J. Syst. Bacterial., 45(4):740-746(1995) Serebrijski, I. et al. “Multicopy suppression by asd gene and osmotic stressdependent complementation by heterologous proA in proA mutants, J. Bacterial., 177(24):7255-7260(1995) Serebrijski, I. et al. Multicopy suppression by asd gene and osmotic stressdependent complementation by heterologous proA in proA mutants,1' J. Bacterial., 177(24):7255-7260(1995) Pascual, C. et al. Phylogenetic analysis of the genus Corynebacterium based on 16S rRNA gene sequences,“ Int. J. Syst. Bacterial., 45(4):724-728 (1995) Wehrmann et al. “Functional analysis of sequences adjacent to dapE of C. glutamicum proline reveals the presence of aroP, which encodes the aromatic amino acid transportér, J. Bacterial., 177(20):599 1-5993 (1995) Sakanyan, V. et al. Genes and enzymes of the acetyl cycle of arginine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum: enzýme evolution in the early steps of the arginine pathway, Microbiology, 142:99-108 (1996) Reinscheid, D.J. et al. Cloning, sequence analysis, expression and inactivation of the Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encoding phosphotransacetylase and acetate kinase,“ Microbiology, 145:503-513 (1999) Le Marrec, C. et al. Genetic characterization of site-specific integration functions of phi AAU2 infecting Arthrobacter aureus C70, J. Bacterial., 178(7): 1996-2004 (1996) Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996) Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996) Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996) Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)
16S ribozómová RNA Aspartátsemialdehyddehydrogenáza; ? Gama-g lutamylfosfátreduktáza 16S ribozómová RNA Permeáza aromatickej aminokyseliny, ? Acetylglutamátkináza; N-acetyl-gamaglutamylfosfátreduktáza; acetyl: ornitín-aminotransferáza; ornitin : karbamoyl-transferáza; glutamát-Nacetyl-transferáza Fosfátacetyltransferáza; acetátkináza Miesto pripojenia Promótorový fragment FI Promótorový fragment F2 Promótorový fragment F10 Promótorovýr fragment F13
< z Q ώ co asd; lysC < o Q. 16SrDNA aroP; dapE argB; argC; argD; argF; argj pta; ack A CO c (Q
X8206I X82928 X82929 X84257 X85965 X86157 X89084 X89850 X90356 X90357 X90358 X90359
Μ b
Tabuľka 2 (pokračovanie) Patek, M. etal. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif/1 Microbiology, 142:1297-1309(1996) Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996) Patek, M. et al. “Promoters from C. glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142: 1297-1309 (1996) Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996) Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996) Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996) Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996) Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996) Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996) Siewe, R.M. et al. “Functional and genetic characterization of the (methyl) ammonium uptake carrier of Corynebacterium glutamicum,“ J. Biol. Chem., 271 (10):5398-5403(1996) Peter, H. et al. “Isolation, characterization, and expression of the Corynebacterium glutamicum betP gene, encoding the transport systém for the compatible solute glycine betaine,“ J. Bacteriol., 178(17):5229-5234 (1996) Patek, M. et al. “Identification and transcriptional analysis of the dapB-ORF2dapA-ORF4 operon of Corynebacterium glutamicum, encoding two enzymes involved in L-lysine synthesis,“ Biotechnol. Lett., 19:1 1 13-1 1 17 (1997) Vrljic, M. et al. “A new type of transportér with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebacterium glutamicum, Mol. Microbiol., 22(5):8 1 5-826 (1 996)
Promótorový fragment F22 Promótorový fragment F34 Promótorový fragment F37 Promótorový fragment F45 Promótorový fragment F64 Promótorový fragment F75 Promótorový fragment PF101 Promótorový fragment PF104 Promótorový fragment PF109 Amónium-transportný systém Glycín-betaínový transportný systém Proteín pre export lyzínu; Regulačný proteín pre export lyzínu
E (0 o. 4-4 Φ -Q t: o lysE; lysG
X90360 X9036I X90362 X90363 X90364 X90365 X90366 X90367 X90368 X93513 X935I4 X95649 X96471
LD h*
o 04 σ>
oo CO co
ΙΌ G) 04
CO CO G)
a> σ> 0
x x X
co CO
M* CO
xr ď) CD
o o CO
o o O
> >- >
163 CO CO
54 bm
O) CD G)
o O O
> > >
CM σ>
T“ in
CM CO o
CM CO CO
CO
> > >
Tabuľka 3 Kmene Corynebacterium a Brevibacterium, ktoré sa môžu uplatniť pri využití tohto vynálezu v praxi
DruK^v-i-í/Xž-r? FERM nrrl CECT NCIMB CBS; NCTC DSMZ
Brevibacterium ammoniagenes 21054
Brevibacterium ammoniagenes 19350
Brevibacterium ammoniagenes 19351
Brevibacterium ammoniagenes 19352
Brevibacterium ammoniagenes 19353
Brevibacterium ammoniagenes 19354
Brevibacterium ammoniagenes 19355
Brevibacterium ammoniagenes 19356
Brevibacterium ammoniagenes 21055
Brevibacterium ammoniagenes 21077
Brevibacterium ammoniagenes 21553
Brevibacterium ammoniagenes 21580
Brevibacterium ammoniagenes 39101
Brevibacterium butanicum 21196
Brevibacterium divaricatum 21792 P928
Brevibacterium flavum 21474
Brevibacterium flavum 21129
Brevibacterium flavum 21518
Brevibacterium flavum BI 1474
Brevibacterium flavum BI 1472
Brevibacterium flavum 21127
Brevibacterium flavum 21128
Brevibacterium flavum 21427
Brevibacterium flavum 21475
Brevibacterium flavum 21517
Brevibacterium flavum 21528
Brevibacterium flavum 21529
Brevibacterium flavum BI 1477
Brevibacterium flavum BI 1478
Brevibacterium flavum 21127
Brevibacterium flavum B11474
Brevibacterium healii 15527
Brevibacterium ketoglutamicum 21004
Brevibacterium ketoglutamicum 21089
Brevibacterium ketosoreductum 21914
Brevibacterium lactofermentum 70
Brevibacterium actofermentum 74
Brevibacterium lactofermentum 77
Brevibacterium lactofermentum 21798
Brevibacterium lactofermentum 21799
Brevibacterium lactofermentum 21800
Brevibacterium lactofermentum 21801
Brevibacterium lactofermentum BI 1470
Ŕpd druh í, ATCCh •FERM ČECT NCIMB CBS nctc DSMZ
Brevibacterium lactofermentum 21086
Brevibacterium lactofermentum 21420
Brevibacterium lactofermentum 21086
Brevibacterium lactofermentum 31269
Brevibacterium linens 9174
Brevibacterium linens 19391
Brevibacterium linens 8377
Brevibacterium paraffinolyticum 11160
Brevibacterium spec. 717.73
Brevibacterium spec. 717.73
Brevibacterium spec. 14604
Brevibacterium spec. 21860
Brevibacterium spec. 21864
Brevibacterium spec. 21865
Brevibacterium spec. 21866
Brevibacterium spec. 19240
Corynebacterium acetoacidophilum 21476
Corynebacterium acetoacidophilum 13870
Corynebacterium acetoglutamicum BI1473
Corynebacterium acetoglutamicum B11475
Corynebacterium acetoglutamicum 15806
Corynebacterium acetoglutamicum 21491
Corynebacterium acetoglutamicum 31270
Corynebacterium acetophilum B3671
Corynebacterium ammoniagenes 6872 2399
Corynebacterium ammoniagenes 15511
Corynebacterium fujiokense 21496
Corynebacterium glutamicum 14067
Corynebacterium glutamicum 39137
Corynebacterium glutamicum 21254
Corynebacterium glutamicum 21255
Corynebacterium glutamicum 31830
Corynebacterium glutamicum 13032
Corynebacterium glutamicum 14305
Corynebacterium glutamicum 15455
Corynebacterium glutamicum 13058
Corynebacterium glutamicum 13059
Corynebacterium glutamicum 13060
Corynebacterium glutamicum 21492
Corynebacterium glutamicum 21513
Corynebacterium glutamicum 21526
Corynebacterium glutamicum 21543
Corynebacterium glutamicum 13287
Corynebacterium glutamicum 21851
Corynebacterium glutamicum 21253
Corynebacterium glutamicum 21514
Corynebacterium glutamicum 21516
Corynebacterium glutamicum 21299
Drali, A!ÄTCC-\ FERM NRRĽ CECT NCIMB CBS; NCTG DSMZ
Corynebacterium glutamicum 21300
Corynebacterium glutamicum 39684
Corynebacterium glutamicum 21488
Corynebacterium glutamicum 21649
Corynebacterium glutamicum 21650
Corynebacterium glutamicum 19223
Corynebacterium glutamicum 13869
Corynebacterium glutamicum 21157
Corynebacterium glutamicum 21158
Corynebacterium glutamicum 21159
Corynebacterium glutamicum 21355
Corynebacterium glutamicum 31808
Corynebacterium glutamicum 21674
Corynebacterium glutamicum 21562
Corynebacterium glutamicum 21563
Corynebacterium glutamicum 21564
Corynebacterium glutamicum 21565
Corynebacterium glutamicum 21566
Corynebacterium glutamicum 21567
Corynebacterium glutamicum 21568
Corynebacterium glutamicum 21569
Corynebacterium glutamicum 21570
Corynebacterium glutamicum 21571
Corynebacterium glutamicum 21572
Corynebacterium glutamicum 21573
Corynebacterium glutamicum 21579
Corynebacterium glutamicum 19049
Corynebacterium glutamicum 19050
Corynebacterium glutamicum 19051
Corynebacterium glutamicum 19052
Corynebacterium glutamicum 19053
Corynebacterium glutamicum 19054
Corynebacterium glutamicum 19055
Corynebacterium glutamicum 19056
Corynebacterium glutamicum 19057
Corynebacterium glutamicum 19058
Corynebacterium glutamicum 19059
Corynebacterium glutamicum 19060
Corynebacterium glutamicum 19185
Corynebacterium glutamicum 13286
Corynebacterium glutamicum 21515
Corynebacterium glutamicum 21527
Corynebacterium glutamicum 21544
Corynebacterium glutamicum 21492
Corynebacterium glutamicum B8183
Corynebacterium glutamicum B8182
Corynebacterium glutamicum B12416
Corynebacterium glutamicum B12417
FERM NRRL CECT NCIMB obs :
Corynebacterium glutamicum B12418
Corynebacterium glutamicum BI1476
Corynebacterium glutamicum 21608
Corynebacterium lilium P973
Corynebacterium nitrilophilus 21419 11594
Corynebacterium spec. P4445
Corynebacterium spec. P4446
Corynebacterium spec. 31088
Corynebacterium spec. 31089
Corynebacterium spec. 31090
Corynebacterium spec. 31090
Corynebacterium spec. 31090
Corynebacterium spec. 15954 20145
Corynebacterium spec. 21857
Corynebacterium spec. 21862
Corynebacterium spec. 21863
ATCC: Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, USA
FERM: Fermentation Research Inštitúte, Chiba, Japan
NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA
CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain
NCIMB: National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, UK
CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL
NCTC: National Collection of Type Cultures, London, UK
DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany
Na porovnanie pozri Sugawara, H. et al. (1993) World directory of collections of cultures of microorganisms: Bacteria, fungi and yeasts (4* edn), World federation for culture collections world data center on microorganisms Saimata, Japan
0) σ> b· 05 r* r* co 05 CD 05 CD CD σι 0) CD 05 CD CD 05 03 CO 0) 00 03 00 05 00 05 b- 00 03 05 0) CD
CD CM CM CM Ó Ó ó X ’t có CO CO CO CO T“ 7— b-
O O r- r- o O O O O O O 0 1-0
LO 00 (O CO CO CO CO CM CM CM 0) Ó Ó l< LO CM CO
O O T t- O CM CO CO T“ T“ T
o 00 ’t LO b- CD co cm m co
o OJ b- CD o
0) 03 CD CO m
CO CO CO CO ’t
O o O r— CD CO LO
CM CM CM b. in LD ’T
’T ’t ’T CM CM CM CM
O O o Ό ’t ’t co“
’T M* ’t CO LO m CO
U3 (0 OT
Φ c c c
Φ Φ Φ
čo q. ’o. ‘q.
E cu CO CO
o ω ω co
Ό o o o
□ Φ <0 E E E
o o o
Q. x x x
o O <
O b. o
CM _ CM CO CM CO i- S t- CD 0) T- 0) co
CO LO
CO CM oo
v— CO
LO 05 o
CO Τ-
o Ο
—1 -J LL
< < <
o CM CM
CD CO o
CO m co
T 00 o
CO CO CM
in k. co m
r* v ’t CO 00 τ- CO
CO 00 00 CO CD Ο CO
T~ o o CO LD O CD
o b. b. CO CM o O
CO CO CO 00 00 LU —t
z 0 0 N Σ) < <
CM
0) ’T CO b-
LO o CO
’T ’t oo co o ’t
00 CO CO r* CO CM LO
CO CO CO CO 1— i— CO
E
CB
C
> c K> 2 <
’t ’T
b. CO ’t ’t bQ CM CM š_ S 10 CD (Λ JP T“ <
co 00 o CO
o o o ®5 o ’t
CO r-· b. O ŽJ o U-
z CO CO H O UJ o
(0 0 0 Σ Hl < CO
1— co ώ A ▼— ôj -ŕ—
ω 1— h- < < < <
LU I ωι wi CD I m m m
1 CD m CD 1 ta 1 1 1 CD CO CO
0 0 0 0 0 0 0
o
CO ’T CM ’T o ’t o
CD b’t o
CD CD 00 00 CM CD b- CD 00 CD b- OO oo G) CD CD CD G) 00
CD q CD CD G) q G> 0) CD G) q q q G) G) G) CD G) G)
F ^-1 CO M in co CD CM V- r- F CO od od F
O O O O O q q O τη Y“ Y- O o O O O O
CO CO F CD cd ó F ló od Ó CÓ LD CD Y“ F F F cd
CM CM y— T- CM CM CM CM Y~ y- CM CM CM Y— CM CM CM CM CM
CM
CO bin K co
λ x:
Q.
O ω o u. Q tn bM*
CD CO to C Φ ‘o.
o
E o T
o CD b- b. CM b. CO b- co co (O o b- b. CD CO
LO co m m ID ID 00 T” in cd CD CO CM CM CM
CM Tľ co CD O CO T CM m co CO m CO CO T- q
O rf CM cm N CM’ co (Ó ID ID (D (O co’ LD
M* CO CD co m- LD CO CO LO U*) co CO <0 CO CO
E □ ’>
CQ
E E E to to ω E E
3 c c c 3
Έ to C Έ to Φ Φ o. Φ 'u to ’Z to
© ‘to Φ © to Q. ‘o. Φ T ’ot Φ *(Ä T· Ä
o o O O o CQ CQ CQ O o O o
(0 □ CQ CQ □ to to ω CO 3 CO 3
-9 o o *O φ X3 O O 9 o O O Φ O E o E o E X2 O Q O Φ -9 θ O Q Φ
>. o α o
s 2 S 52 r T x 3 T* 5 2
h. E
o 2
co 3 ω □ o o c φ
3 3 Φ 3 O to Φ
«O-g > ° Ô o o to c to c to c
= c > C > to C
Λ O β O (Q Φ o >» Φ Φ Q_ Φ o
□ 5 O s e Q_ Q. u
E φ g CQ CQ (0 ‘w
ω t o 2 « O o >. W to o -g O o T Q. Φ to o E to O E to o E Φ Q. O Q
co c S C 5 o o o >,
m ω O φ O ω T X r -J
O CD tn o 00 CM CO b· r— in co T* S ° G) LO r* co CO o CD G) b. CM T- CM CO O CM m CM CM CD O o o
T“ _1 G b* h. o o X co σ O y- O £ O CO o o
< < N < X < <0 N <
in
CM 00 co T“
CD O b- T 00 CO
CO tn 00 b· 00 CD M- CD o
o o CO T- CD CO M- CO tn CM
in CO CO CM •o- t- M- CO ^r
co X co o
Ξ) LO O ω O M* (D 00 > _ O ? W So G> rr k. Tt bG) CD o b- CM t- Yf CM CO O CM •M* > CO CM CM >
z < O δ o < O Y- O 0
o ω F E H Q tn F CD
CM X S <s < 0
ω ód F CM *“ m ČM GÓ Ii
ω X < < < m X F < <
°ι X CD I m co 1 1 °l x ω I I CD | CD I
CD 1 CD 1 CQ mm m 1 1 m m CD 1 CD
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
T”
O o CM
CM CM
M- iD
CD O
G) G) O
m CO
o o o
o o o
CO (0 CQ
2 2 S
O OO CD 0> CD
K T* T“
b. o CO M- Y“ Y“ o
y- G> N in o o O u CO Φ OO N
y- co co CM
CD P CM o T- T CO
G) X 00 _j _J —1 CD
N < X < < < < < D
O y-
CM 'M' o O O
Yfr (D LO Q ’T co
co M- s CD CD G) CD o
y- r* 00 CO co CD O o
CM CM T“ <n (O CO
í O o t F CO O CD O CO O b« O o oo M* bCM
m ® “š in M- ’ď* CD CO
< 0 b. r> OO CD
O CN ω ω ω Z)
ω £ > O m x x x ČO CO <
m < O Y~ Ii Ii X
CM I 0 0 0 F ČM
< < < < (- F F ω <
m cd I I CD I m I I, X 1 X, ω I ωι
1 1 00 CD CQ 1 m 1 CD CD CO CQ CD
0 0 0 0 0 0 0 G 0
CO CO G)
o CO CO
CD tn CM
t- T—
LO 00
O M- CD
CO CO b-
o o O
o o O
CQ CQ (0
í č 2
CO CO 0) 0) 00 G) CD CO G) co CD CD G5 CO 00 05 CO CO oo
q G5 G) G) G5 G5 q 05 G5 G) G) G5 G) q G) 0) q q b* O) b· 05 q
co ó CD CO CO CD G) in CM CO CO CD τ- cd CM T— 7~ G) G) 7~
q T“ q q O O T“ O q ▼“ O O O Ο q O x^ CO 00
cd CO xt r< l< Xf N in CO T“ CM X” X“ CM
CM CM CM CM T“ CM o O CM CM X” T“ X” o o K“ CM CM D T“
K CM CM CM in
n b- b- T“
χί T“ xt xt CD.
T“ xŕ r** b·*
xr co co co CO
U) cn E
C c
Φ ‘o. Φ Q. ” ω ω ω
CQ CO o o
cn tn 2 3
o o •S o O A-
E E Q Φ
o o >7-Q
I T S 3
o o
> >
LU LU
CM 4? m co m b.
to o O G5 x- 00
co a> 0) CO o o> in tn
b. O b· b> CO CO CO x- G5
CM o 2 o CM O CD Xt
m t- o o in O O O o
G) U. O Q G> -1 O _J -1
Z3 < < < N < z> < <
CM CM G)
CO CM CM O (0 x- CO tn
00 xt b* in T- Tt- O o
n b· O O o G5 ΙΌ G5
o b. o O co CD CM x- o
oo CM x- co CO CM xt
82 tn o o CO CO
b. CM G) b- ó ’í f** tn > <
CO S ° o tn w 2 F N
05 o tn 2 0 LL
ZD o Q * O O LD tn
< UJ ** < P -j O Q o
D. O w CM s 5 ω ω ω
CM o 0 y— T—
< ™ H H- < < < < <
CD X m CO CD CD CD
ca1 cd en CD CD en tn en m
o 0 0 0 0 0 0 0 0
CO CO
in Ό· CO
CO CM xf
CO CM
CO O 05
o CM
CD 00 00
O o O
O o O
CO CQ CO
s s č
O CO CM xt G) xt co Xt G) xt
o K O O σ> in xt CO m t—
OK CO 00 T— xt b- m q r^ q
o b.* G5* xt b-“ G5* G)’ 00* b.* oo*
xf CQ CO CO CO co xt xr co co co
O O ‘ o
Q o o
CO CO CQ
íc íc J=
g g g
Φ Φ Φ
x: x:
o o U
tn ω W)
UJ UJ UJ
CO CO
Φ b. E
O o O o
E Q. Q. c
‘5 * Ž· Φ 05
«□ *□ o
C C O
*5* Ό E E C Ό
Ό C
Q.
C b·* b.’ O
Ό w CO CO O
Φ Ό Ό o
Q. O O xt
O ώ ’cn B Ό o
(0 c ω CO n en CO 3 N OO oo
•σ o o CM
S CO c Q. CO c xo CO c *co CQ O Jť
< >c <D E >» C MD O) E O o E E o en o E CD cn m m <0
CC Q. o A 2 (D
o CO £ x: o .e o 2
o u CO CM CM CM
in 00 CM CO tn h* |ϊ >.9 U s. * m (0 £ £
CM CO ω tn tn S
X
G) O o w tn o CO
tn tn tn tn T“ G)
co CM CM co CO
co b- b* o CD tn
b- h* —1 G5 Xf
-j N N < Z H
CO co CO
xt tn
<3> G> b- CD
CO m n o CO
CO CO tn xt
o M- Xt o CO
OC O o G5
CC 0> G) CO xr
Q > > tn CD m tn
5 t— O H O h“ o o UJ Z
q S s 0 čo Τ- čo
t— t— Ι— H“
< < < < tn ω
m 1 m 1 en I CD I UJ LU I
1 tn 1 CD 1 m CD 1 CD CD
0 Φ 0 0 0 0
00 00
(O CO
xt n
CO co
tn
00 CD
o O
o O
CQ CO
x A 2
CO G)
CD CD o b. b. CO
O 10 o G5 G) O
O xt r^ G) G) o
xt b. CD CO 00 o
CD b* LU
O X -J 3 =) <
CD O O
O O o CD
7— CD o o
CM i- xt o o m
C0 (D (D T“ o
x- tn xt 7“
r b. b- CO G) CO
< Z CD S CD 5
tn Z Q Ώ Ξ) o
O O 5 O O o
> o r~ o Q UJ
en tn ω UJ UJ <
ČM ôj ČN
< < < <
tn tn | I CD | tn I m I CD I
1 1 CD CD CD 1 CD 1 CQ 1 m
00 0 0 0 0
G)
CD tn
CM b-
x- G)
CD o
00 o
00 G)
O O
O O
CO CO
s č
0) 05 0) 0) 0) cn 05 CO 00 N 0) ΓΧ rx co CO 0) 05 0) rx rx
0) 0) q o cn 0) q 0) 0) 0) 0) 0) 0> 0> 0) 0) 05 0) 0> 0)
σ> 0) ó 0) Ó CO tT 0) r- CM CÓ ó l< CM 0) iri cm’ l< có oo
q O q r- o O q 0^0 q T* q q O O q
CM CM r·.’ oo xr CO ľx co u5 aó ó CM 05 CM y—· 0) CM CM
CM CM o CM O CM T- t- O t- CM T“ r- Ύ— CM O o o
b. rx 00 CO O TJ- rx UJ Tí· CO 0) U) 0) b- co τ- Y—
in in •m- CO o CO CM O) r* co 00 cm 0) Ιί)
°°. 00 m co CM CO 0) co o co ω CO co CO CO o
^• ΙΛ rx‘ K γ— cm b· r- 0) co 00 b. co
CO CO CO CO CO ’M* CO C0 CO Tfr Tt co in co CO
T“ 05 CO 0) CO r* rx cm Tt o TT Tf CM b. r* CO CO TJ- LO 1co in
Tf
co CM
05 co r- rx CO
CM o o co 05 00 CO
O co o 00 CO CO
CO T- o T O T-
Φ (A 1 r“ ω S
*3 X 0)
0) 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0J <t 00 0) 0) 00 CO S 0) G) CO 0) 0) 0) N
q q 0) O) q G) O 0) 05 0) 0) G) G5 q q q q q q G5 q
C\| CM CM CM CM CM Ó Ó CO CO CO cô oo τ- G> 0) 0) CO O) 0) t—
q O T- 1- O O O O ο o o O O O O O O I-
Ó co CO 00 00 Q 05 G5 ’t M- CO cô ó cô CO
o o o o O O O t- CM t- T“ r- r- < Q CM CM CO O O o CM
m oo
ro CO ro ro ro ro co b- b- 10T-CO
o CO b- CM CM CM 05 CM 0) t- G5 cd 0) η: S
q q tT q co q N q q Ο <0 t- q \
0) CM CO CM CO* <o* ro“ o“ b* ro“ b-’ b* co“ co“ co’
co CO CO *4· CO co co M· co CO t- co co co
c Φ 4—· O O o O £ T“ co x: O S CO -C H o t- O CM -X ' Φ
Ä Q. O > O > 3 o u. T— Φ * C0 ω -F- O CM r-
S 2 o —' lll Z lll z Q. ->* C m « Q. c Q- O CO '?* Q- £
< < -Q CO (0 co «
>O .9ro n > o > o O Ό O E Ό .s Em
1Z X> z z Q. CM O R
Ä « O o m > UJ > C Z Q. CM <2 í6 w CM □
O.3 '—o ž ω 2: lll E O 2 Ý g O m * =
Ό ω ω Φ SP ·» CO >
ro £ -X Q. Ň ro í CO* cd*
z Z
3 G ' ro ro
SD t—
ro 1___ 0) C OsS? i T“·
CO <0 <fí C0 <0 <0 (0
r C c C C c C
φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ
Q. Q. Q. Q. Q. Q. O.
(0 CO (0 CO (0 (0 CO
W C0 (0 (0 (0 <0 (0
O o O O O o o
F b b E E E b
O o o O O O o
I x x x x x x
Q. Q. o-í Q. Q. Q. ô.®
CO CO <0 _ CO « (0 « Έ
CO <0 « =5 <0 CO <0
o o o O O o O O o
E E E> E E E E g
o o o->- o o o o 2
ro (O ro co CO ro CO ro CO CO « 00 _ b- ro CO τ-
N ro ro ro CO CO w Ο CO
o O o CM 05 0) CO CO 2 σ>
CO Τ- T- T- ’t co o
CD Ο o ro o o o o o O i-
CM Q O M* _] —1 U. U. £ IL -J
Q < < Q < < < < s < <
CO CO CM CM
CO CO O O T ·φ (D
CO Tj CO CO CO CO TT CM T-
<0 CO CM o O r- r- o n ro
CO CO b* b* 05 05 CO m- O
05 T— CM CM CO T- CO
<
ro co ro co CL .J 0 Z s z 04 Z CM CM X CL CO
0 LL < X N O τ- f o τ- CM O CM O <<t co co u CO 5
Ο Q < Ο O < Q_ Z x “5 ω x -3 ω x LL LL S _i _ι ω UJIUD cô o H LL 0L
O cd 0 CO 0 IX CM 0 cm’ 0 0 0 5 WMQ 1 1 1 < t- ČM 0
> H H ľj F F < H
O I I I Ο- Ι X I I ffl X I 1
1 £0 CQ1 1 CD 1 m CD f CD I 1 1 CO CD £0 co cn
0 0 0 0 0 0 000 0 0
o
CO CM CO N
CM h-
ro CO F
co xr N o
ro ro CM
o o CM CO
τ- τ-
o Ο Ο o
CO CQ m
S c s č
ro Tí- O T- T- 00 ro o o
CM CM O co co ro CO 0) CD
co cm cm ro co co o co 00 CD 00
05 ro ro τ- O o Tt CM b* b*
Q ο o τ- T- T- o ro o o T“
ο o o o o o T“ o o G)
ľj Q O O 00 0 LL 0 Q 0)
< < < < < < < < < < N
f f τ- CO CO CO O
CD οο oo ro CO CO o ro ro
CO CO 00 CO CO o ro CM CM
ro co co o CM CM ’t CO CO
o co co o O O CO CM CM T“
co T- T- CO b* b* CO CM τ- CM
<
D_ o t— T- Ο o
VJ Tj O C0 CO OD ro 0) CD ro
_] CM CM 2 2 co CO 00
CM CM O O o co b- b* o
ro ro ľľ T- T- CM o o o
s o o θ O O o ro o o CD
LL o o O O Q o 0 0 D
Q. 0 0 < < < Q < < ω
<< « éó « < < « CD
0 ω co 0 0 0 ω 0 0
F X X H 1-bXXF F <
X 1 XXX 1 1 1 X X X X X 1 1 1 1 1 x I m I
1 cn 1 1 CD CD CD 1 1 1 1 1 CD CD (S 0 CD m CD
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
ro CO
N τ- Tj CO
ro Ο CM ro
CO »-
ro b* CO
*^· o o CM
co ro
o o o o
CO (0 co CO
í x x h. č
(D G) CD CD b- O) 00 00 b- G) (D CD CD O G) CD O) CO O)
CD G) CD G) CD CD CD 0) q CD G) CD (D G) G) CD G) CD O)
CO b- b- G) G) CM 00 CO to b* Ó to oo (D ’Φ OO
O O O O O O T-r- o O O O O T- O o O O O
CM CM ”t <0 6 có CD CO CO t—* CÓ CM CM OO to CM
O O t- -r- CM »- CM CM O CM CM O i- o CM CM O CM O
CM O CO
CO
CM O CO có
CO
CO O O CO b* CO CO t—
b- CM CO CM CO O CO r—
00 CM CD CO CM G) T
b· O CM* N N00 CD CO
CO CO CO CO G) CO
CO CO b- G) b* CO Tin co σ> co“ co“ CO CO CO
CO in co
CO CD o>m o o COco co -e t-co to to inm· co co coco
Λ « w ω ω w O
o c c c c C o
S co φ (D Φ .2 CO
S cl cl Q. ‘a. ο-Έ
° CO <0 Φ co CO O ω =
<0 <0 U) UJ ω
2 o o O o o ®
□ E E E E E Q
CO o o o o O UJ
Q T X x X X UJ
w E (0
$ o S
£i .c
C o c
O > o -X Φ ω o íx
mapa 96B-96C kmeň y; cn bw sp, *** SEKVENOVANIE VO VÝVOJI neusporiadaných úsekov.
o o b· — CO CO O> < O o
N b* to ° T“ in co to to
7— T- C\| 00 c\| X to CM CM t“ |s» CM
7“ f- (0 CD CO ® co G) CD NO’- 0) o
T- -T— b* oo co X to O O (O τ- o o
t- i” CO o w S co O O ο co o o o
II 11 r- x co — O O m cm Q O o
< o < N < D < < < Q < < <
CO CO to to CM S N b.
00 00 CM co co CO CO
o o o oo to T“ b. b. G) b- CO CO
00 00 o to co CO to
b- gj t- r* to T- oo co to CM CM
T- T- CO CM CM CM CM t- CM Ί- T“ t-
00
o CO CO 0 5 O O
O O tM N- r- £0 7“ 7- b· r— t“ CO ín oo a> S S CM to co to co •M“ CM G) O O T CM CD O O to m· G) O o to G) O Q
X X UJ oo o — i UJ to r: Q CM C\J · H Z3 □ O < Q < 5 S Q o < U <
< < < M· M· 4- O < X to i: t- 0
O 0 0 0
X X < < 5 ω < 1— H _l X H H 1—
X X CD CO é UJ 1 1 1 CO t x, X t xxx 1 1 1 X I X |
1 1 1 m m m 1 1 1 m tn m 1 cn CO 1 CO 1 1 i co co m 1 CO CD
CD O 0 0 0 CD 0 0 0 000 0 0
0 CD
O to o N CD to
o o 7— to b-
in CO to O co CM
7“ T“ 7“ T“
00 to to CO CM
to b- N CM
to to to to CO G)
7“ 7“
o o O o O O
(0 CO (0 (0 (0 CO
s x k_ c e 2 í
0) 0) 0) 00 10 ’Τ (£> 00 0) 0) 0>
q 0) 05 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0) 0)
αό ό Ó τ~ Ó b Ν 0) C0 00 00
ο 7— 7— ο Ο Ο Ο Ο Ο
cm ώ co CD 10 ’t Κ cd
ο CM 7- ο τ— CM CM CM Ο
0) σ> αο ο 0) 00 σ>
0) σ> 0) q q 05 0)
00 οό Γ< τ- C0 N
Ο ο q q Ο q q
C0 10 10
ο ο ο ο Ο CM CM
Γ00
10
CO CO CO
q 10 10
CO 00
CO CO CO
k.
φ Φ Φ
4-^
ω en cn
CO co co
cn en CD
o o O
c c c
CO CQ (0
Φ Φ Φ
E E E
m m (0
£ -C x:
cx ex ex
o o o
cn en en
o o o
k.
Q Q Q
0) 0) CM 0) M* O CD CM CM CD CO 0) o T '’t
n CO CD CM 0) CM CO CD CD s r- co 10 b-
q q q 0) r- 00 CO CD N CD o 0)
CD ιο CM 10* in (D~ cd M- o CO
CO •M· co •M* CO co CO CO CO CO 0) 00 T“ CO CO
CO Φ CQ O en □ E Q. M ω o. <0 Q. Q. (0 UJ O O UJ o 3 2 o ex CQ en o ex φ en o V L· CO 3 -Q Q 2 i \J k. CO 3 O c É kJ l— CQ 3 -Q O 2 E
-C •w ω P X) XJ p E E MS & CQ
o S S o o o O = O 3 o 3
Φ S r < < x X X O σι Q CD O CD
0) CO N 0> b· 10 10 * co s io Tt ^- 2 2 2
CM b10 10 b· 0) 2 t- y 2 o o O—l—l
N L < < <
to co
T tOT
10 ONO
LO LO b. OJ 4 OJ
CM co CO O OJ
CM CO CM T- CO
δ ® CO < ω O t Φ CO < fe O t Φ
en o o .g
x: o
'5K -X '>7
g ® « ® «
E Ό -0.5
k> o 8 o 8 δ
ex cn c °C UJ G °c en
O 3 O 3
φ c €2 £2
s ss éS
ω
en N b sz N
10 CD CO O CO O CM LJ: to ® m N S® £to
K O o to Q t 10 to CD v 2
O r* to oj r- 10 g O to g S££!8
O O < O O O O o co O T“ b· 0)
< < o ω u 5 ω h μ <
CM Ťŕ < x co N < < < CO
0 0 0 H 2 - <N P oc _i ί-
1- H 1— x x < ω
X X, X 1 X.Q-, m 1 LLI I α. o. □. x
1 m m CD co m 1 CD CQ 1 1 1 1 CD CQ CD CD
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
cn
0) CO CD O O Q O N CO o o Q b. 0) CD 0) o CD LO 7“ cn o CO CO M* T“ M* O CO t to 2 ω ® cm £ oj S2 N <
< < íl LL LL en ”
n < < < “ω
0 0 ČM cm CM t- h“
1— 1— < < < < CO
x, x I x t CO i m I m LLI I 1
1 CO 1 CD 1 CD i CD CD CD CD
0 0 0 0 0 CD 0
10 o CO
0) O b. CO
CO CM CO
»“ •’t *“
CD r* co
cn CO co CO
0) 0) o o
T“ CM CM
O o o o
CQ CQ CQ CQ
S x k. £ e
σ> G) G) G) Φ m LO G) G) co co co G) in 0) co G) CD 00 in
G) G) G) G) G) G) G) G) G) CD G) G) 0) G) 0) G> G) G) G) G)
CO K CO CO CM CD r< t^ xŕ CM x“ CÔ xŕ tn CM
Q t— o Q O O t- O Q t- -r- O O Q O O i— o t—
Ó CO cd <D G) co in 00 t- y- cd ó cd b· c\i cd G) cd
CM CM CM CM CM CM O CM CM t- t- CM t- τ- CM O CM CM CM
xt 00 CO OO b* CM 00 00 CO o o CO o oo O CO CO CO G) b*
s CO CO CO tn b- xr CO Y— o CM 00 O <D tn tn CO
b. CD G) CM tn CO co tn CO CO b- xr T“ O o Xt xt CO xr
CO co“ iri tn co“ co“ r-“ CO* tn o“ o“ b.“ co“ CM CM* G) G) CD G) tn
CO CO CO co CO co xf M· CO xt xr CO CO xt xr CO CO CO xt co
ω w ω ω ω £ « ω
c 2 c c s D c
(D 2 2 Φ Φ 2 3 Φ
’q. Q O Q. Q. Q.
m ω W CQ CQ CQ
(0 2 2 (/) ω •h 2 (0
o E E O O g E o
E OT E E Φ <2 E
o 2 2 o o CO □ o
x Σ S X X O Σ x
00 T~ T— b- 0 0 o tn in CD
CM CO CO tn r* ra ra Ϊς 00 co CD
CO Y“ G) G) 00 o> S 2 cm r- w ra CD CD CM
CO 00 xf xt xt o co ra ra m r-~ m ra w in in E CM
o o G) G) tn oo co o o cn cd g m cm CO co CO
Y o o CD CO y- o b> o o co o S o ra o o O E
O O xt > O O Q « ra & _i cn _j u. CM
< < < X X D < < <<2QJ<I < < < Z
o o h- f'·· 00 00
CM xt xt G) co co ra Y-
O Xt xt rara-i-ocoT CO co
tn 00 00 tn in T- <0 in SS N M-ON S in in in o
o tn tn CO CO b- CO Xt CM CM ra t- O O O in tn G) CM
tn T- ^t CO CM in τ— T- TJ -T— Tf Tf r— ▼“ co CO
xt CO
CD <0 T- Y- T· m
CD 00 tn CD o M0 M < CD E O O O CD T“ 00 o o o CD xt CD CO Y“ G) xr G) CO T* cn *,± co * 5
x*, ŕ* CO tn x < CM < CM X xŕ x Ϋ UJ cn O cn
« 0 0 π- 1— A i-
ω tE H h- ω tn 5 ω
UJ 0-, x 1 X I UJ I UJ I ? Ul 1 1
co1 CO m t m 1 CQ m 1 1 m m
0 0 0 0 0 0 0
h* G) CD < Y Y
m tn < CO Ύ~ T- CO m
co CD G) m CC ľď CO Φ CM
CD CD bσ m tn o o o o □ O m Ξ) 1- Λ LL < Q. tn x < Σ tn CM m O in CM tn co 0 rtn 0 A tn E CO o CM E CM
< in < < CM CM U. CC m =) s 2 T S X xt x x LL < Z tn
ω G 0 π- 0 0
ω 1- F— O m < ω h- 1- < Φ
°ι XX z |“| CC I n., CO I 1 Ul I t X 1 X, m I UJ I
cn mm m i 1 m m m CQ CO l m 1 m 1 m
0 0 O 0 0 0 0 0 0 0 0 0
co
CO CO CM
CM oo CO
X xr b-
o Τ- CM
O Ο O
CM CM CM
CM CM CM
O O O
CQ CQ CQ
2 í í
CM
O m G) 00
O G) in
G> CO tn
tn cn CD
o o CO 5
CM co xt
CM CM CM CM
O O O O
CQ CQ CQ CQ
2 2 2 2
m CO G) σ> b< C O)
o q 0) 0) G) ej 2 9
CN Y“ tri 6 to 2 3
T“ o o o Y“ —- .ž o
N ó Φ >>o
CN o CN o X > co
CO h- CN C CN Φ G) 00 0) G) q G) G) G) G) S G) OO G) O O o
G) G3 G> G) G) q o
Ó Ó m O N T” Ó 6 (< CÓ CÓ CN CN
Y“ 2: A o o T“ Y- q o o o o O
N od φ >»co N ó N CD 03 b- N N
o ÚC > CN CO Y“ f— CN O CM CN O O
CN m G) 00 o b- G) C0
b. LO CO o CD O O
Y“ O N o O Ν- CO
b·’ CM CN LO G3 b- αι b-
co N in N G3 CO co G)
0) c Φ (0 D O S. o Φ 4·^ o h· Q. (/) □ f \ o O E □ φ o E CO co E □ φ 4*4 O E
Q. w Q 0 'u <B =J *+— CO
(Q V) o O O o Φ b o Φ O -Q O “I o o V) © o X3 Φ c ω E
E c ’c C ŕ™ CO co ž· co 4-4
o CO CO O Zj 3 Ί5 o
I Q Q Q cn cd LL O 03
N 00 00 CO co OO O CM co o CN
O CN tn CO CO Ν’ CO O CO CN CO
N O_ q CO CO q 00 N q
co“ CN b.“ b-‘ CD ΙΩ K b.“ co’ ID
b- b- co CO CO CO CO CO CO CO CO
k.
(0 Φ Φ Φ
E o ω CO ω CO ω CO Φ CO Φ CO
•2 □ w E 03 0) O)
O c O c o c §« w Q. Φ
e -q E CO Φ CO Φ Φ Φ «J p O Q E cn'o) .2 φ Φ E <o (0
.5 2 Φ í= ti □ ‘C CO E E E D C ‘E φ Φ n 4-* U. c Φ Q.
Φ w © _co « Φ Ž £ <V r*\
Q O 2 3 •2 o o Φ >>Δ Έ Q. O CO o L. E Q_ O (0 O k_ Έ Q. O CO O u 9 2 (Q c c .Q ω ω O □ p o tí £ >> co CQ Q CO © CO og co (0 o E o
S cn S -2 Q Q Q S CC oc S X z
> • >
o N O
-X Q-
Φ (0 χ s
o C 'D
£ 2 x:
Q □c u
'>» c CO o 'c w «
Ό
.s
‘C o δ δ
Q. i S-
CO
D o □
Φ i= <0
C
o «2
CN CN Y tn CN z CO tn co CO G) D CD G) O 00 tn CD < CN N CN G> m G) < CN CO 00 o LU
S CD
o CO CO tn m
CM CN N N CO
CD CO tn
CO CN
00 G) N
CN CM tn O CN
co co 00 tn 03 tn CN CO
tn CN 03 D (D < G) < 00 o
z tn Q. Q ó CO b.’ CO uj
H ôj Η H H
ω < cd ω <
LU m I LU 1 Ul 1 Q_ [
1 CO 1 cn 1 CO 1 CQ s
0 0 0 0 LU
00
o b-
CO N
CN
Ν’ N
in m
CN CM
o o
CO (0
č x
r* CD N
o co CO CN
o S oo N CO
CN o o G> tn
00 Y- tn G)
N -1 IU X N
G)
<0 G)
CD v- to o
G) oo co T— tn
CO to Τ- CN CO
Ο
x
b- x O o
b* UJ CO
O CN X m CL CD
CO UJ 00 I
N b 2 Q_ ŕ
Ν’ CN o^ S s
F“ l- Y“
CD s < < <
LU I θΛι m I m 1
1 CO m S 1 m 1 m
ω O LU CD CD
b-
b-
G)
CO
Ν’
m
CN
o
co
S
CN bN CD O O O < O CN O O O O < O CN O O o Q < 0) r«. co co ® ? co rto o G) LL N < o co co OO G) CO CO o CO r- CO G)
O o < CN b- 33
< <
CN CN
CD N N OO CO
CO tn tn G) CD r* Y' N
CD CD CD N T- N G) N
tn O o CN CO CD 00
N CO CN CO *“
Ν’
o o
CN CN O 00 S
CN O O CN 03 CO N CN
b- o O CN bi CO in CD
Ν’ CD CO CN CO
CD o o —1 NT o ÍD “3
O Q o O o Q CD
O < < -J o ”3 X
Q <£ Ťŕ Ϋ Z nr s CN
CD CD T“ · u. 0
CN 1- 1— < o o < H
1 X 1 x | m x x m I
CD CO 1 CD 1 m m m m co
0 CD CD CD CD CD CD CD
tT
CO T“ Y—
G) CN CO
CO CN CO
CD b- b.
CO 00
in m CN
CN CN CO
O o o
(0 (0 ω
S S S
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava celkovej genómovej DNA Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Kultúra Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) sa pestovala cez noc pri 30 °C za intenzívneho pretrepávania v BHI médiu (Difco). Bunky sa zbierali centrifugáciou, supernatant sa odhodil a bunky sa resuspendovali v 5 ml tlmivého roztoku-l (5 % pôvodného objemu kultúry - všetky vyznačené objemy boli kalkulované, na 100 ml objem kultúry). Zloženie tlmivého roztoku-l: 140,34 g/l sacharózy, 2,46 g/l MgSO4 x 7 H2O, 10 ml/l KH2PO4 roztoku (100 g/l, pH upravené s KOH na 6,7), 50 ml/l M12 koncentrátu (10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l NaCl, 2 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0,2 g/l CaCI2, 0,5 g/l kvasinkového extraktu (Difco), 10 ml/l zmesistopových prvkov (200 mg/l FeSO4 x H2O, 10 mg/l ZnSO4x 7 H2O, 3 mg/l MnCI2 x H2O, 30 mg/ H3BO3, 20 mg/ CoCI2 x 6 H20,1 mg/l NiCI2 x 6 H2O, 3 mg/l Na2MoO4x 2 H2O, 500 mg/l komplexotvorného činidla (EDTA alebo kyseliny citrónovej), 100 ml/l zmesi vitamínov (0,2 mg/l biotínu, 0,2 mg/l kyseliny listovej, 20 mg/l kyseliny p -aminobenzoovej, 20 mg/l riboflavínu, 40 mg/l Ca-pantotenátu, 140 mg/l kyseliny nikotínovej, 40 mg/l pyridoxín hydrochloridu, 200 mg/l myoinozitolu). Lyzozým sa pridal k suspenzii na konečnú koncentráciu 2,5 mg/ml. Po asi 4 h inkubácii pri 37 °C, sa rozložila bunková stena a výsledné protoplasty sa zbierali centrifugáciou. Sediment sa raz premyl s 5 ml tlmivého roztoku-l a raz s 5 ml TEtlmivého roztoku (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8). Sediment sa resuspendoval v 4 ml TE-tlmivého roztoku a pridalo sa 0,5 ml roztoku SDS (10 %) a 0,5 ml roztoku NaCl (5 M) Po pridaní proteinázy K na konečnú koncentráciu 20 pg/ml sa suspenzia inkubovala cca 18 hodín pri 37 °C. DNA sa purifikovala extrakciou s fenolom, fenolom-chloroformom-izoamylakoholom a chloroformom-izoamylalkoholom podľa štandardných metód. Potom sa DNA vyzrážala pridaním 1/50 objemu 3 M octanu sodného a 2 objemov etanolu s následnou 30 minútovou inkubáciou pri -20 °C a 30 minútovou centrifugáciou pri 12 000 otáčkach za minútu (rpm) vo vysokorýchlostnej centrifúge s použitím SS34 rotora (Sorvall). DNA sa rozpustila v 1 ml TE-tlmivého roztoku obsahujúceho 20 pg/ml RNázy A a dialyzovala pri 4 °C proti 1000 ml TE-tlmivého roztoku najmenej 3 hodiny. Počas tohto času sa tlmivý roztok trikrát vymenil. K 0,4 ml alikvotným podielom dialyzovaného roztoku DNA sa pridalo 0,4 ml 2 M LiCI a 0,8 ml etanolu. Po 30 minútovej inkubácii pri -20 °C cenrifugácie (13 000 otáčok za minútu (rpm), Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Nemecko). DNA sediment sa rozpustil vTEtlmivom roztoku. DNA pripravená týmto postupom sa môže použiť na všetky účely, vrátane metódy južných odtlačkov (southern blotting) alebo konštrukcie genómových knižníc.
Príklad 2
Konštrukcia genómových knižníc Corynebacterium glutamicum ATCC13032 v Escherichia coli
DNA pripravená podľa opisu v príklade 1 sa použila na konštruovanie kozmidových a plazmidových knižníc podľa známych a dobre zavedených metód (pozri napr. Sambrook, J. a kol. (1989) „Molecular Cloning: A Laboratory Manuaľ, Cold Spring Harbor Laboratory Press, alebo Ausubel, F. M. a kol. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons.).
Použiť sa môže akýkoľvek plazmid alebo kozmid. Predovšetkým sa použili plazmidy pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Sci. USA, 75, 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134, 1141-1156), plazmidy sérií pBS (pBSSK +, pBSSK - a ďalšie; Stratagene, LaJolla, USA), alebo kozmidy ako SuperCos 1 (Stratagene, LaJolla, USA) alebo Lorist6 (Gibson, T.J., Rosenthal, A. and Waterson, R.H. (1987) Gene 53, 283-286. Génové knižnice špecifické na použitie v C. glutamicum môžu byť konštruované použitím plazmidu pSL 109 (Lee, H.S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4, 256-263).
Príklad 3
Sekvenovanie DNA a komputerová funkčná analýza
Na sekvenovanie DNA podľa štandardných metód sa použili genómové knižnice, opísané v príklade 2, predovšetkým sa použila metóda reťazovej terminácie použitím ABI377 sekvenčných prístrojov (pozri napr. Fleischman, R.D. a kol. (1995) „Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.“, Science, 269, 496-512). Použili sa sekvenčné priméry s nasledovnými nukleotidovými sekvenciami: 5-GGAAACAGTATGACCATG-3', SEQ ID NO:305 alebo 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3', SEQ ID NQ:306.
Príklad 4
In vivo mutagenéza
In vivo mutagenéza Corynebacterium glutamicum sa môže uskutočniť pasážovaním plazmidu (alebo iného vektora) DNA do E. coli alebo iných mikroorganizmov (napr. do druhov Bacillus alebo kvasiniek ako Saccharomyces cerevisiae), čím sa zhorší ich schopnosť udržať si integritu genetickej informácie. Typické mutátorové kmene mali mutácie v génoch reparačného systému DNA (napr. mutHLS, mutD, mutT, atď.; na porovnanie pozri Rupp, W.D.(1996) DNA repair mechanisms, vEscherichia coli and Salmonella, str. 2277-2294, ASM, Washington.) Takéto kmene sú dobre známe odborníkom, ktorí sú skúsení v danej oblasti techniky. Použitie takýchto kmeňov je uvedené napríklad v Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7, 32-34.
Príklad 5
Transfer DNA medzi Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum
Niekoľko Corynebacterium a Brevibacterium druhov obsahuje endogénne plazmidy (ako napr. pHM1519 alebo pBL1), ktoré sa autonómne replikujú (pozri prehľad, napr. Martin, J.F. a kol. (1987) Biotechnology, 5, 137-146). „Shuttle“ vektory pre Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum sa môžu ľahko konštruovať použitím štandardných vektorov pre E. coli (Sambrook, J. a kol. (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manuaľ, Cold Spring Harbor Laboratory Press alebo Ausubel, F.M. a kol., (1994) „ Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons), ku ktorým sa pridal pôvodný alebo na tento účel replikovaný a vhodný markér z Corynebacterium glutamicum . Takáto replikácia je výhodná pri použití endogénnych plazmidov izolovaných z Corynebacterium alebo Brevibacterium druhov. Predovšetkým výhodné pre tieto druhy je použitie génov zodpovedných za rezistenciu na kanamycín (takých, ktoré sú odvodené z Tn5 alebo Tn903 transpozónov) alebo na chloramfenikol (Winnacker, E.L. (1987) „From Genes to Clones - Introduction to Gene technology, VCH, Weinheim) ako transformačných markérov. V literatúre existuje mnoho príkladov na konštrukciu „divého typu „shuttle“ vektorov, ktoré sa replikujú aj v E. coli aj v C. glutamicum, a ktoré sa môžu použiť na niekoľko účelov, vrátane nadmernej expresie génu (na porovnanie pozri napr. Yoshihama, M. a kol. (1985) J. Bacteriol. 162, 591-597,
Martin J.F. a kol. (1987) Biotechnology, 5, 137-146 aEikmanns, B.J. a kol. (1991)
Gene, 102, 93-98).
Použitím štandardných metód je možné klonovať gén, ktorý je predmetom záujmu, do jedného zo„shuttle“ vektorov opísaných vyššie a zaviesť takéto hybridné vektory do kmeňov Corynebacterium glutamicum . Transformácia C. glutamicum sa môže dosiahnuť pomocou protoplastovej transformácie (Kastsumata, R. a kol.(1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), elektroporácie (Liebl, E. a kol. (1989) FEMS Microbioi. Letters, 53, 399-311) a v prípadoch, keď sa použijú špeciálne vektory, tiež pomocou konjugácie (ako sa to opisuje napr. v Schäfer, A. a kol. (1990) J. Bacteriol. 172, 1663-1666). Tak isto je možný transfer „shuttle“ vektorov pre C. glutamicum do E. coli pomocou preparácie plazmidovej DNA z C glutamicum (použitím štandardných metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky) a jej transformovaním do E. coli. Takýto transformačný krok sa môže uskutočniť použitím štandardných metód, ale výhodné je použiť Mcr-deficitný kmeň E. coli, ako napríklad NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166, 119).
Gény sa môžu nadmerne exprimovať v kmeňoch C. glutamicum použitím plazmidov, ktoré obsahujú pCG1 (americký patentový spis č. US 4,617,267) alebo ich fragmentov a voliteľne gén rezistencie na kanamycín z TN903 (Grindley, N.D. a Joyce, C.M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(12), 7176-7180). Okrem toho sa gény môžu nadmerne exprimovať v kmeňoch C. glutamicum použitím plazmidu pSL 109 (Lee, H.-S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbioi. Biotechnol. 4, 256-263).
Okrem použitia replikačných plazmidov sa nadmerné exprimovanie génu môže tiež dosiahnuť pomocou integrácie do genómu. Genómová integrácia v C. glutamicum alebo iných Corynebacterium alebo Brevibacteríum druhoch sa môže uskutočniť pomocou takých metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky ako je homológna rekombinácia s genómovou(ými) oblasťou (am i), integrácia usmernená reštrikčnou endonukleázou (REMI) (pozri napr. nemecký patentový spis DE 19823834), alebo prostredníctvom použitia transpozónov. Tak isto je možné modulovať aktivitu génu, ktorý je predmetom záujmu, pomocou modifikovania regulačných oblastí (napr. promótora, represora a/alebo zosilňovača) pomocou sekvenčnej modifikácie, inzercie alebo delécie, využijúc miestne cielené metódy (ako je homológna rekombinácia) alebo metódy založené na náhodných prípadoch (ako transpozónová mutagenéza alebo REMI). Sekvencie nukleových kyselín, ktoré majú funkciu transkripčných terminátorov, sa tiež môžu vložiť 3' ku kódovacej oblasti jedného alebo viacerých génov podľa tohto vynálezu; takéto terminátory sú dobre známe v danej oblasti techniky a sú opísané napríklad voWinnacker, E.L. (1987) From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology. VCH, Weinheim.
Príklad 6
Stanovenie expresie mutantných proteínov.
Pozorovania aktivity mutovaných proteínov v transformovanej hostiteľskej bunke sa opierajú o fakt, že mutantný proteín je exprimovaný rovnakým spôsobom a v rovnakom množstve ako „divý“-typ proteínu. Na určenie úrovne transkripcie mutantného génu existuje užitočná metóda (indikovanie množstva mRNA dostupnej na transláciu na génový produkt), a to metóda severných odtlačkov (Northern blot) (na porovnanie pozri napríklad Ausubel a kol.(1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York), pri ktorej sa primér určený na naviazanie ku génu, ktorý je predmetom záujmu, označí s detegovateľnou značkou, (obyčajne rádioaktívnou alebo chemoluminiscenčnou) tak, že keď sa celková RNA kultúry organizmu vyextrahuje, spracuje na géli, transferuje sa na stabilnú matricu a inkubuje s touto sondou, naviazanie a kvantita naviazania sondy indikuje prítomnosť a tiež množstvo mRNA pre tento gén. Táto informácia je dôkazom stupňa transkripcie mutantného génu. Celková bunková RNA sa môže pripraviť z Corynebacterium. glutamicum pomocou niekoľkých metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky, ako ich opisujú v Bormann, E.R. a kol. (1992) Mol. Microbiol. 6, 317-326.
Na stanovenie prítomnosti alebo relatívneho množstva proteínu translatovaného z tejto mRNA sa môžu použiť štandardné metódy, také ako metóda západných odtlačkov (Western blot), (pozri napríklad Ausubel, a kol. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York). Pri tomto procese sa celkový bunkový proteín extrahuje, gélovou elektroforézou sa separuje, prenesie sa na nitrocelulózovú matricu, a inkubuje sa so sondou, ako napríklad protilátkou, ktorá sa špecificky viaže na požadovaný proteín. Táto sonda je obvykle označená s chemoluniniscenčnou alebo kolorimetrickou značkou, ktorá sa dá ľahko detegovať. Prítomnosť a kvantita pozorovanej značky poukazuje na prítomnosť a množstvo požadovaného mutantného proteínu prítomného v bunke.
Príklad 7
Rast geneticky modifikovanej Corynebacterium. glutamicum - médiá a podmienky kultivácie
Geneticky modifikovaná Corynebacterium. glutamicum sa pestuje na syntetickom alebo prírodnom rastovom médiu. Celý rad rôznych rastových médií pre Corynebacteria sú aj dobre známe, aj ľahko dostupné (Lieb, a kol., (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 205-210; von der Osteň, a kol., (1998) Biotechnology Letters, H, 11-16; nemecký patentový spis DE 4,120,867; Liebl (1992) „The Genus Corynebacterium, v The Procaryotes, Volume II, Balows, A. a kol., eds. SpringerVerlag). Tieto médiá sa skladajú z jedného alebo viacerých zdrojov uhlíka, zdrojov dusíka, anorganických solí, vitamínov a stopových prvkov. Výhodnými zdrojmi uhlíka sú sacharidy ako mono-, di-, alebo polysacharidy. Napríklad, glukóza, fruktóza, manóza, galaktóza, ribóza, sorbóza, ribulóza, laktóza, maltóza, sacharóza, rafinóza, škrob alebo celulóza sú veľmi dobrými zdrojmi uhlíka. Tak isto je možné dodávať sacharid do média prostredníctvom komplexných zlúčenín, takých ako melasy alebo vedľajších produktov pri rafinácii cukru. Tak isto sa môžu výhodne dodávať zmesi rôznych zdrojov uhlíka. Ďalšími možnými zdrojmi uhlíka sú alkoholy a organické kyseliny ako metanol, etanol, kyselina octová alebo kyselina mliečna. Zdrojmi dusíka sú obyčajne organické a anorganické zlúčeniny dusíka, alebo materiály, ktoré obsahujú tieto zlúčeniny. Príkladnými zdrojmi dusíka sú plynný amoniak alebo amónne soli ako NH4CI alebo (NH4)2SO4, NH4OH, dusičnany, močovina, aminokyseliny alebo komplexné dusíkové zdroje ako macerovaný kukuričný mok, sójová múčka, sójový proteín, kvasinkový extrakt, mäsový extrakt a iné.
Zlúčeniny anorganických solí, ktoré sa môžu zahrnúť do médií sú soli vápnika, horčíka, sodíka, kobaltu, molybdénu, draslíka, mangánu, zinku, medi a železa vo forme chloridov, fosforečnanov alebo síranov. Aby sa udržali ióny kovov v roztoku, môžu sa pridať do média chelátotvorné zlúčeniny. Predovšetkým užitočnými chelátotvornými zlúčeninami sú dihydoxyfenoly, ako katechol alebo protokatechinát alebo organické kyseliny, také ako kyselina citrónová. Médiá zvyčajne obsahujú aj ďalšie rastové faktory ako vitamíny alebo rastové promótory, napríklad také ako biotín, riboflavín, tiamín, kyselinu listovú, kyselinu nikotínovú, pantotenát a pyridoxín. Rastové faktory a soli často pochádzajú z komplexných zložiek média ako kvasinkového extraktu, melasy, macerovaného kukuričného moku a ďalších. Presné zloženie média veľmi závisí od bezprostredného pokusu a rieši sa individuálne pre každý špecifický prípad. Informácie o optimalizácii médií sú dostupné v príručke .Applied Microbioi. Physiology, A practical Approach (eds.
P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) str. 53-73, ISBN 019 963577 3). Tiež je možné, aby sa zvolilo rastové médium od komerčných dodávateľov, ako štandard 1 (Merck) alebo BHI („grain heart infusion“, DIFCO) alebo ďalšie.
Všetky zložky média sa sterilizujú, buď tepelne (20 minút pri 1,5 bar a 121 °C) alebo sterilnou filtráciou. Zložky sa môžu sterilizovať spolu, alebo ak je to nutné, tak oddelene. Všetky zložky médií môžu byť prítomné na začiatku rastu, alebo sa môžu voliteľne pridávať kontinuálne alebo po dávkach.
Podmienky kultivácie sú určené pre každý pokus osobitne. Teplota by mala byť v rozsahu od 15 °C do 45 °C. Teplota sa môže udržiavať konštantná, alebo sa môže v priebehu pokusu meniť. Hodnota pH média by mala byť v rozpätí od 5 do 8,5, výhodne okolo 7,0 a dá sa udržiavať pomocou prídavku tlmivých roztokov k médiu. Príkladným tlmivým roztokom na tento účel je tlmivý roztok fosforečnanu draselného. Alternatívne alebo súbežne sa môžu používať syntetické tlmivé roztoky ako MOPS, HEPES, ACES a iné. Konštantné pH sa pri kultivácii môže tiež udržať pridaním NaOH alebo NH4OH počas rastu. Ak sa použijú komplexné zložky do média ako kvasinkový extrakt, nutnosť používať dodatočné tlmivé roztoky sa môže znížiť, v dôsledku toho, že mnohé komplexné zlúčeniny majú vysokú tlmivú kapacitu. Ak sa na kultiváciu mikroorganizmov používa fermentor, tak pH sa dá tiež regulovať použitím plynného amoniaku.
Inkubačný čas je obvykle v rozpätí od niekoľkých hodín až do niekoľkých dní. Tento čas sa zvolí tak, aby sa umožnilo maximálne nazhromaždenie produktu v živnom kvapalnom médiu. Opísané rastové pokusy sa môžu uskutočňovať v rôznych nádobách, napríklad mikrotitračných platniach, sklenených skúmavkách alebo sklenených bankách alebo sklenených alebo kovových fermentoroch rôznych veľkostí. Na skríning veľkého množstva klonov by sa mal mikroorganizmus pestovať v mikrotitračných platniach, sklenených skúmavkách alebo trepacích bankách, buď s alebo bez miešacích zarážok. Výhodne sa používajú 100 ml trepacie banky naplnené na 10% (objemových) s požadovaným rastovým médiom. Banky by sa mali trepať na rotačnej trepačke (rozkmit 25 mm) pri rýchlostnom rozsahu 100 300 otáčok za minútu. Straty odparovaním sa môžu znížiť pomocou udržiavania vlhkého ovzdušia; alternatívne by sa mala uskutočniť matematická korekcia strát odparovaním.
Ak sa testujú geneticky modifikované klony, mal by sa tiež testovať nemodif i kovaný kontrolný kloň alebo kontrolný kloň obsahujúci základný plazmid bez akejkoľvek inzercie. Médium sa inokuluje na 0,5 - 1,5 OD6oo použitím buniek kultivovaných na agarových platniach ako napríklad CM platniach (10 g/l glukóza, 2,5 g/l NaCI, 2 g/l močovina, 10 g/l polypeptón, 5 g/l kvasinkový extrakt, 5 g/l mäsový extrakt, 22 g/l agar, pH 6,8 s 2 M NaOH), potom sa inkubuje pri 30 °C . Inokulácia média sa dosiahne buď tým, že sa zavedie suspenzia buniek C. glutamicum z CM platní vo fyziologickom roztoku alebo prídavkom kvapalnej predkultivovanej baktérie.
Príklad 8
In vitro analýza funkcie mutantných proteínov
Stanovenie aktivít a kinetických parametrov enzýmov je v danej oblasti techniky zavedené. Pokusy stanoviť aktivitu akéhokoľvek zmeneného enzýmu sa musia prispôsobiť špecifickej aktivite „divého“-typu enzýmu, čo je v schopnostiach odborníka skúseného v odbore. Všeobecný prehľad o enzýmoch, ako aj špecifické detaily týkajúce sa štruktúry, kinetík, princípov, metód, aplikácií a príklady na stanovenie mnohých enzýmových aktivít sa dajú nájsť napríklad v nasledovných odkazoch: Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes, Longmans, London; Fersht, (1985) Enzýme Structure and Mechanism. Freeman, New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press, Oxford; Boyer, STR. D., ed. (1983) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press, New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2rd ed. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., ΘΓββΙ, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed., vol. I -XII, Verlag Chemie, Weinheim; a Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, „Enzymes“. VCH, Weinheim, str. 352-363.
Aktivita proteínov, ktoré sa viažu na DNA sa môže merať pomocou niekoľkých dobre zavedených metód, ako DNA skúškou pásového posunu (bandshift) (tiež nazývanou gélová retardačná skúška). Vplyv takýchto proteínov na expresiu ďalších molekúl sa môže merať pomocou skúšok s reportérovým génom (tak ako to opisuje Kolmar, H. a kol. (1995) EMBO J. 14, 3895-3904 a odkazy tam citované). Testovacie systémy reportérového génu sú dobre známe a zavedené na aplikovanie tak v prokaryotických, ako aj eukaryotických bunkách, použitím takých enzýmov ako beta-galaktozidázy, zeleného fluorescenčného proteínu a niekoľkých ďalších.
Stanovenie aktivity membránovo-transportných proteínov možno uskutočniť podľa takých metodík, aké sa opisujú v Gennis, R.B. (1989) „ Pores, Channels and Transporters“, v Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer, Heidelberg, str. 85-137 a 270-322.
Príklad 9
Analýza vplyvu mutantného proteínu na produkciu požadovaného produktu
Vplyv genetickej modifikácie v C. glutamicum na produkciu požadovanej zlúčeniny (takej ako aminokyseliny) sa môže stanoviť modifikovaním mikroorganizmu vo vhodných podmienkach (ako sú vyššie opísané) a analyzovaním média a/alebo bunkovej zložky na zvýšenú produkciu požadovaného produktu (t.j. aminokyseliny). Takéto analytické metódy sú dobre známe odborníkom, ktorí pracujú v danej oblasti techniky a zahŕňajú spektroskopiu, tenkovrstvovú chromatografiu, vyfarbovacie metódy rôzneho druhu, enzýmové a mikrobiologické metódy a analytickú chromatografiu, ako napríklad vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (pozri napríklad: Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str. 89-90 a str. 443-613, VCH, Weinheim (1985); Fallon, A. a kol.,(1987) „Applications of HPLC in Biochemistry“ v Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm a kol., (1993) Biotechnology, vol. 3, Chapter III: „Product recovery and purification“, str. 469-714, VCH, Weinheim; Belter, P.A. a kol. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery process for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, v Ulmann 's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, str. 1-27, VCH, Weinheim; and Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Okrem merania konečného produktu fermentácie, je tiež možné analyzovať ďalšie zložky metabolických dráh, ktoré sa využívajú na produkciu požadovanej zlúčeniny, také ako medziprodukty a vedľajšie produkty, aby sa stanovil celkový výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie zlúčeniny. Metódy analýz zahrňujú merania hladiny živín v médiu (napr. sacharidov, uhľovodíkov, zdrojov dusíka, fosfátu a ďalších iónov), merania zloženia a rastu biomasy, analýzu produkcie bežných metabolitov biosyntetických dráh a meranie plynov produkovaných počas fermentácie. Štandardné metódy pre tieto merania sú načrtnuté v Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, eds., IRL Press, str. 103-129; 131-163; and 165-192 (ISBN 0199635773) a odkazoch tam citovaných.
Príklad 10
Purifikácia požadovaného produktu z kultúry C. glutamicum
Získanie požadovaného produktu z buniek C. glutamicum alebo supernatantu vyššie opísanej kultúry sa môže uskutočniť rôznymi metódami, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Ak požadovaný produkt nie je vylučovaný z buniek, bunky sa môžu zbierať z kultivácie pomocou centrifugácie pri nízkych otáčkach, potom sa bunky lyžujú štandardnými metódami, ako napríklad mechanickým zásahom alebo sonifikáciou. Bunkový debris sa odstráni centrifugáciou a supernatantná frakcia obsahujúca rozpustné proteíny sa nechá na ďalšiu purifikáciu požadovanej zlúčeniny. Ak je produkt vylučovaný z C. glutamicum buniek, tak bunky sa odstránia z kultúry pomocou centrifugácie pri nízkych otáčkach a supernatantná frakcia sa nechá na ďalšiu purifikáciu.
Supernatantná frakcia z oboch purifikačných metód sa podrobí chromatografii s vhodnou živicou, pri ktorej je požadovaná molekula buď zadržaná na chromatografickej živici, zatiaľ čo mnohé nečistoty nie; alebo pomocou živice sa zadržia nečistoty a nie vzorka. Takéto chromatografické kroky sa môžu opakovať, ak je potrebné, použitím rovnakej alebo rôznych chromatografických živíc. Odborník v danej oblasti techniky by mal byť veľmi skúsený vo výbere vhodných chromatografických živíc, v ich najúčinnejšej aplikácii na príslušnú molekulu, ktorá
100 sa má purifikovať. Purifikovaný produkt sa môže zahustiť pomocou filtrácie alebo ultrafiltrácie a uchovávať pri teplote, pri ktorej stabilita produktu je maximálna.
V danej oblasti techniky je známych veľa purifikačných metód a predchádzajúca metóda purifikácie nie je limitujúcou. Takéto purifikačné metódy sú opísané napr. vBailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-HilI, New York (1986).
Identita a čistota izolovaných zlúčenín sa môže stanoviť štandardnými metódami v danej oblasti techniky. Tieto zahŕňajú vysokúčinnú kvapalinovú chromatografiu (HPLC), spektroskopické metódy, vyfarbovacie metódy, tenkovrstvovú chromatografiu, NIRS, enzýmovú .alebo mikrobiologickú skúšku. Takéto metódy analýzy sú zhrnuté v: Patek, a kol. (1994) Appl. Environ. Microbioi. 60,133-140; Malakhova a kol. (1996) Biotekhnologiya H, 27-32; a v Schmidt a kol., (1998) Bioprocess Engineer. 19, 67-70. Ulmannš Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH, Weinheim, str. 89-90, str. 521-540, str. 540-547, str. 559-566, 575-581 and str. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways, An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. a kol., (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in Biochemistry in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol.17.
Príklad 11
Použitie reportérového génu na klonovanie génu Corynebacterium glutamicum zodpovedného za rezistenciu na linkomycín
A. Identifikácia génu kódujúceho LMRB proteín
Plazmid pSL130 sa skonštruoval pomocou ligácie aceB promótorovej oblasti (paceB) C. glutamicum (Kim, H.J. a kol., (1997) J. Microbioi. Biotechnol. 7: 287292) do polyspojovníka (polylinkera) lac operónového fúzneho vektora pRS415, ktorý nemá promótor (Šimon, R.W. a kol., (1987) Gene 53: 85-96). Plazmid pSL145 sa skonštruoval pomocou ligácie výslednej paceB-Iac oblasti do the E. coli klonovacieho vektora pACYC184. E. coli DH5aF’ sa transformoval s pSL145 a výsledný kmeň sa použil ako hostiteľský kmeň na skríning genómovej knižnice C. glutamicum (v pSL109).
Skríning transformantov sa uskutočnil sledovaním rastu na agarovom médiu, ktoré obsahovalo 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-beta-D-glalaktopyranozid (X-Gal). Biela
101 kolónia, obsahujúca DNA ovplyvňujúcu lacZ expresiu sa vyčlenila na ďalšiu analýzu. Zistilo sa, že tento kloň obsahuje 4 kB fragment z génovej knižnice. Subklony sa skonštruovali v pSL109 a subklon, ktorý si zachováva biely fenotyp na X-Gal platniach sa identifikoval. Zistilo sa, že tento subklon obsahuje 2,6 kB BamHI-Xhol fragment (plazmid pSL149-5). Fragment sa sekvenoval a zistilo sa, že ide o gén kódujúci membránový proteín (LMRB gén).
1442 nukleotidov kódujúcej sekvencie LMRB génu kóduje polypeptid skladajúci sa zo 481 aminokyselinových zvyškov s vysokým obsahom hydrofóbnych aminokyselín. Pri Genbankovom prehľadávaní sa stanovilo, že LMRB proteín je na 40 % identický s proteínovým produktom ImrB génu z Bacillus subtilis (Genbanková Akcesia AL009126, TREMBL Akcesia P94422), čo sa stanovilo použitím CLUSTAL W analýzou (pri použití štandardných parametrov).
LMRN proteín obsahuje sekvenčný profil: 158-A-P-A-L-G-P-T-L-S-G-167 (SEQ ID NO:301), ktorý sa podobá známemu proteínu zodpovednému za multiliekovú rezistenciu, ktorý je zhodný s motívom G-X-X-X-G-P-X-X-G-G (SEQ ID NO:302) (Paulsen, I.T., and Skurray, R.A. (1993) Gene 124: 1-11). Preto sa LMRB proteín klasifikoval ako proteín zodpovedný za liekovú rezistenciu.
B. In vivo analýza funkcie ImrB
ImrB gén sa nadmerne exprimoval v C. glutamicum ASO19E12 (Kim, H.J. a kol., (1997) J. Microbiol. Biotechnol. 7: 287-292) použitím plazmidu pSL149-5, ktorý je opísaný vyššie.
Rozrušenie LMRB génu sa dosiahlo pomocou vektora pSL18-lmrB. Tento vektor sa skonštruoval takto: interný fragment LMRB génu sa amplifikoval pomocou PCR v štandardných podmienkach použitím primérov 5’CTCCAGGATTGCTCCGAAGG-3’ (SEQ ID NO:303) a 5’CACAGTGGTTGACCACTGGC-3’ (SEQ ID NO:304). Výsledný PCR produkt sa opracoval s T7 DNA polymerázou a T7 polynukleotidkinázou a klonoval sa do Smal miesta plazmidu pSL18 (Kim, Y.H. and H.-S. Lee (1996) J. Microbiol. Biotechnol. 6, 315-320). Rozrušenie LMRB génu v C. glutamicum ASO19E12 sa vykonalo pomocou konjugácie, ako to predtým opísal (Schwarzer and Puhler (1991) Bio/Technology 9:84-87).
102
Bunky C. glutamicum transformované s pSL149-5 vykazujú podobné rezistencie na erytromycín, penicilín G, tetracyklín, chloramfenikol, spektinomycín, kyselinu nalidixovú, gentamycín, streptomycín, etídiumbromid, karbonylkyanid- mchlórfenylhydrazón (CCCP), a dodecylsulfát sodný, ako netransformované bunky. Avšak, pokiaľ ide o rezistenciu na linkomycín, pozorovali sa signifikantné rozdiely pri transformovaných a netransformovaných bunkách.
Zistilo sa, že bunky C. glutamicum nadmerne exprimujúce LMRB sú schopné rásť v prítomnosti 20 pg/ml linkomycínu. Naproti tomu bunky, ktoré neexprimujú LMRB (alebo bunky, ktoré prenášajú LMRB rozrušenie), neboli schopné rásť na agarovom médiu, ktoré obsahovalo 5 pg/ml linkomycínu. Tento efekt je jasne viditeľný v kvapalnej kultúre. Nadmerná expresia LMRB vedie k 9-násobnému zvýšeniu rezistencie (v porovnaní s „divým“ typom) na linkomycín a rozrušenie LMRB spôsobuje zníženie rezistencie (28 % „divého“ typu) na toto antibiotikum. Príklad 12
Analýza génových sekvencií podľa vynálezu
Porovnanie sekvencií a určenie percenta homológie medzi dvoma sekvenciami sú v danej oblasti techniky známe metódy a môžu sa uskutočniť použitím matematického algoritmu ako algoritmu podľa Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-68, modifikovaného podľa Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 90, 5873-77. Takýto algoritmus je inkorporovaný do NBLAST a XBLAST programov (VERSION 2.0), Altschul, a kol. J. Mol. Biol. 215. 403-10. BLAST nukleotidové vyhľadávanie sa môže uskutočňovať s NBLAST programom, „score = 100“, „wordlenght = 12“, aby sa získali nukleotidové sekvencie homológne s SRT molekulami nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu. BLAST proteínové vyhľadávanie sa môže uskutočniť s XBLAST programom, „score = 50“, „wordlength = 3“, aby sa získali aminokyselinové sekvencie homológne s SRT proteínovými molekulami podľa tohto vynálezu. Aby sa kvôli porovnaniam získali zoradenia s medzerami, môže sa využiť Gapped BLAST, ako to opisuje v Altschul a kol., (1997> Nucleic Acids Res. 25(17), 3389-3402. Keď sa používajú programy BLAST a Gapped BLAST, odborník skúsený v danej oblasti techniky bude vedieť, ako treba optimalizovať parametre programu (napr. XBLAST a NBLAST) na to, aby sa mohla analyzovať špecifická sekvencia
103
Ďalším príkladom matematického algoritmu využívaného sa porovnanie sekvencií je algoritmus podľa: Meyers and Miller ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4, 11-17). Takýto algoritmus je inkorporovaný do ALIGN programu (verzia 2,0), ktorý je súčasťou GCG sekvenčného zoraďovacieho súboru programov. Ak sa používa na porovnávanie aminokyselinových sekvencií ALIGN program, môže sa použiť PAM120 „weight residue table“, „gap length penalty 12“ a „gap penalty 4“. Dodatkové algoritmy pre sekvenčnú analýzu sú známe v danej oblasti techniky, a zahŕňajú ADVANCE a ADAM opísané vTorelIi a Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10, 3-5; a FASTA opísané v Pearson and Lipman (1988) P.N.A.S. 85, 24448.
Percento homológie medzi dvoma aminokyselinovými sekvenciami sa môže tiež stanoviť použitím GAP programu v GCG súbore programov (dostupných na http//www.gcg.com.), použitím buď Blosum 62 matice alebo PAM 250 matice a „gap weight“ 12, 10, 8, 6 alebo 4 a „length weight“ 2, 3 alebo 4. Percento homológie medzi dvoma nukleotidovými sekvenciami sa môže stanoviť použitím GAP programu v GCG súbore programov, pri použití štandardných parametrov - „gap weight“ 50 a „lenght weight“ 3.
Porovnávacia analýza génových sekvencií podľa tohto vynálezu s tými, ktoré sú uvedené v Genbank sa uskutočnila pomocou metód, ktoré sú známe v danej oblasti techniky (pozri napr. Bexevanis and Ouellete, eds. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. John Wiley and Sons, New York). Génové sekvencie podľa tohto vynálezu sa porovnali s génmi uvedenými v Genbanke trojkrokovým postupom. V prvom kroku sa uskutočnila BLASTIN analýza (napr. lokálna zoraďovacia analýza) pre každú sekvenciu podľa tohto vynálezu voči nukleotidovým sekvenciám uvedeným v Genbanke a najlepších 500 nálezov sa odložilo na ďalšie analýzy. Ďalšie FASTA vyhľadávanie (napr. kombinovaná lokálna a globálna analýza zoradenia, v ktorej limitované oblasti sekvencií sú zoradené), sa uskutočnilo na týchto 500 nálezoch. Každá génová sekvencia podľa tohto vynálezu bola ďalej globálne priradená ku každému z najlepších troch FASTA nálezov, použitím GAP programu v GCG súbore programov (použitím štandardných parametrov). Za účelom získania správnych výsledkov, sa dĺžka sekvencie, vyňatá z Genbanky, upravila na dĺžku vyhľadávaných sekvencií pomocou metód dobre známych v danej oblasti techniky.
104
Výsledky tejto analýzy sú uvedené v tabuľke 4. Výsledné údaje vyžadovali signifikantne kratšie komputerové časy v porovnaní s takouto širokou databázovou GAP (globálnou) analýzou, avšak sú identické stými, ktoré by sa boli získali samostatne vykonanou GAP (globálnou) analýzou na každom géne podľa tohto vynálezu v porovnaní so všetkými odkazmi v Genbanke. Sekvencie podľa tohto vynálezu, pre ktoré sa nezískali žiadne zoradenia mimo „cutoff“ hodnôt sú uvedené v tabuľke 4 tak, že tam chýbajú informácie o zoradení. Odborník skúsený v odbore si bude ďalej vedomý toho, že GAP percento homológie zoradenia, ktoré sa uvádza v tabuľke 4 pod hlavičkou „% homológie (GAP) je uvedené v európskom numerickom tvare, v ktorom ·, predstavuje desatinnú čiarku. Napríklad hodnota „40,345“ v tejto kolónke predstavuje „40,345 %“.
Príklad 13
Konštrukcia a funkcia DNA mikromatríc
Sekvencie podlá tohto vynálezu sa môžu okrem toho použiť na konštrukciu a aplikáciu DNA mikromatríc (zostavenie, metodológia a použitia DNA mikromatríc sú dobre známe v danej oblasti techniky a sú opísané napríklad v Schena, M, a kol., (1995) Science 270, 467-470; Wodicka, L. a kol. (1997) Náture Biotechnology 15, 1359-1367; DeSaizieu, A. a kol., (1998) Náture Biotechnology 16, 45-48; a DeRisi, J.L. a kol. (1997) Science 278, 680-686).
DNA mikromatrice sú pevné alebo flexibilné podklady skladajúce sa z nitrocelulózy, nylonu, skla, silikónu alebo iných materiálov, k povrchu ktorých sa molekuly nukleovej kyseliny môžu pripojiť v určitom usporiadaní. Po vhodnom označkovaní sa môžu dálšie nukleové kyseliny alebo zmesi nukleových kyselín hybridizovať s imobilizovanými molekulami nukleovej kyseliny a značka sa môže použiť na monitorovanie a meranie individuálnych signálnych intenzít hybridizovaných molekúl v určených oblastiach. Táto metodológia umožňuje súčasne kvantifikovať relatívne alebo absolútne množstvo všetkých alebo zvolených nukleových kyselín v použitej vzorke nukleovej kyseliny alebo zmesi. DNA mikromatrice preto umožňujú analýzu expresie veľkého počtu (až 6800 alebo viac) nukleových kyselín paralelne (pozri napr. Schena, M. (1996) BioEssays 18(5), 427-431).
105
Sekvencie podľa tohto vynálezu sa môžu tiež použiť na konštrukciu oligonukleotidových primérov, ktoré sú schopné amplifikovať definované oblasti jedného alebo viacerých C glutamicum génov pomocou takej nukleovokyselinovej amplifikačnej reakcie akou je polymerázová reťazová reakcia. Výber a konštrukcia 5 - alebo 3'-oligonukleotidových primérov alebo vhodných spojovníkov umožňuje kovalentné pripojenie výsledných PCR produktov k povrchu podporného média, opísaného vyššie (a tiež opísaného napríklad vSchena, M. a kol. (1995) Science 270. 467-470).
Nukleovokyselinové mikromatrice sa môžu tiež konštruovať pomocou oligonukleotidovej syntézy in situ podľa Wodicka, L. a kol. (1997) Náture Biotechnology 15, 1359-1367. Pomocou fotolitografických metód sa presne určené oblasti matrice exponujú na svetle. Ochranné skupiny, ktoré sú fotolabilné, sa týmto spôsobom aktivujú a podliehajú nukleotidovej adícii, zatiaľ čo oblasti, ktoré sú maskované pred svetlom nepodliehajú žiadnej modifikácii. Nasledujúce cykly ochrany a aktivácie svetlom umožňujú syntézu rôznych oligonukleotidov v definovaných pozíciách. Malé, definované oblasti génov podľa tohto vynálezu sa môžu syntetizovať na mikromatriciach pomocou syntézy oligonuleotidov v pevnej fáze.
Molekuly nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu prítomné vo vzorke alebo zmes nukleotidov sa môžu hybridizovať s DNA mikromatricami. Tieto molekuly nukleovej kyseliny sa môžu značkovať podľa štandardných metód. Stručne, molekuly nukleovej kyseliny (napr. mRNA molekuly alebo DNA molekuly) sa značia pomocou inkorporácie izotopicky alebo fluorescečne značených nukleotidov, napr. počas reverznej transkripcie alebo syntézy DNA. Hybridizácia značených nukleových kyselín s DNA mikromatricami je opísaná (napr. v Schena, M. a kol., (1995); Wodicka, L. a kol., (1997), citované vyššie; aDeSaizieu A. a kol. (1998), citované vyššie). Detekcia a kvantifikácia hybridizovanej molekuly je prispôsobená špecificky inkorporovanému značeniu. Rádioaktívne značenia sa môžu detegovať (napríklad podľa Schena, M. a kol., (1995) citované vyššie;) a fluorescenčné značenia sa môžu detegovať napríklad podľa metódy Shalon a kol. (1996) Genome Research 6, 639-645).
Použitie sekvencii podľa tohto vynálezu na DNA mikromatricovú technológiu, ako sa opisuje vyššie, umožňuje porovnávacie analýzy rôznych
106 kmeňov C. glutamicum alebo iných Corynebacteria. Napríklad, výskumy interkmeňových variácií založených na individuálnych transkripčných profiloch a identifikácia génov, ktoré sú dôležité pre špecifické a/alebo požadované vlastnosti kmeňa, také ako patogenita, produktivita a odolnosť voči stresu sú uľahčené použitím nukleovokyselinových matricových metodík. Nukleovokyselinové matricové technológie je možné použiť tiež na porovnania profilu expresie génov podlá tohto vynálezu v priebehu fermentačnej reakcie.
Príklad 14
Analýza dynamiky bunkových proteínových populácií (proteómov)
Gény, kompozície a spôsoby podľa tohto vynálezu sa môžu aplikovať na výskum interakcií a dynamiky populácií proteínov, nazývaných „proteómy“. Proteínové populácie, ktoré sú predmetom záujmu, obsahujú, ale nie sú obmedzené na, celkovú proteínovú populáciu C. glutamicum (napr. v porovnaní s proteínovými populáciami iných organizmov) a tie proteíny, ktoré sú aktívne v špecifických podmienkach prostredia alebov špecifických metabolických podmienkach (napr. počas fermentácie, pri vysokej alebo nízkej teplote, alebo pri vysokom alebo nízkom pH) alebo tie proteíny, ktoré sú aktívne počas špecifických fáz rastu a vývoja.
Proteínové populácie sa môžu analyzovať pomocou rôznych dobre známych metód, napríklad ako gólovou elektroforézou. Bunkové proteíny sa môžu získať, napríklad, lýzou alebo extrakciou a môžu sa navzájom separovať použitím rôznych elektroforetických metód. Polyakrylamidová gélová elektroforéza s dodecylsulfátom sodným (SDS-PAGE) separuje proteíny prevažne na základe ich molekulovej hmotnosti. Izoelektricko-fokusačná polyakrylamidová gélová elektroforéza (IEFPAGE) separuje proteíny pomocou ich izoelektrického bodu (ktorý odráža nielen aminokyselinovú sekvenciu, ale tiež potranslačné modifikácie proteínu). Ďalšou, výhodnejšou metódou proteínovej analýzy je následná kombinácia oboch IEFPAGE a SDS-PAGE metód, známych ako 2-D-gélová elektroforéza (opísaná napríklad vHermann a kol. (1998) Electrophoresis, 19, 3217-3221; Fountoulakis, a kol. (1998) Electrophoresis, 19, 1193-1202; Langen, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1184-1192; Antelmann, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1451-1463). Na proteínovú separáciu sa môžu tiež použiť dálšie separačné metódy ako napríklad
107 kapilárna gólová elektroforéza; tieto metódy sú dobre známe v danej oblasti techniky.
Proteíny, ktoré sa separovali pomocou týchto metodík, sa môžu vizualizovať štandardnými metódami, takými ako vyfarbovanie alebo značkovanie. Vhodné vyfarbovacie činidlá sú známe v danej oblasti techniky a zahŕňajú Coomassie Brilliant Blue, striebro alebo fluorescenčné farbivá, také ako Sypro Ruby (Molekulové sondy). Zahrnutie rádioaktívne značených aminokyselín alebo ďalších proteínových prekurzorov (napr. 35S-metionínu, 35S-cysteínu, 14C-značených aminokyselín, 15N-aminokyselín, 15NO3 alebo 15NH4+ alebo 13C-značených aminokyselín) do média C.glutamicum umožňuje označiť proteín z týchto buniek pred ich separáciou. Podobne sa môžu použiť fluorescenčné značky. Tieto značené proteíny sa môžu extrahovať, izolovať a separovať podľa doteraz opísaných metodík.
Proteíny vizualizované týmito metodikami sa môžu v ďalšom analyzovať meraním množstva použitého farbiva alebo značky. Množstvo určitého proteínu sa môže v ďalšom stanoviť kvantitatívne použitím, napríklad, optických metód a môže sa porovnať s množstvom iných proteínov v tom istom géli alebo v iných géloch. Porovnania proteínov na géloch sa môžu urobiť napríklad optickým porovnaním, spektroskopicky, zobrazovacím snímaním a analýzou gélov, alebo použitím fotografických filmov a zobrazení. Takéto metódy sú dobre známe v danej oblasti techniky.
Aby sa stanovila identita ktoréhokoľvek daného proteínu, môže sa použiť priame sekvenovenie alebo iné štandardné metódy. Napríklad sa môže použiť Na/alebo C-koncové aminokyselinové sekvenovanie (ako Edmanova degradácia) , ako aj hmotnostná spektrometria (výhodne MALDI alebo ESI metódy (pozri napr. Langen, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1184-1192)). Tu poskytnuté proteínové sekvencie sa môže použiť na identifikáciu C. glutamicum proteínov pomocou týchto metodík.
Informácie získané týmito metódami sa môžu použiť na porovnanie podôb proteínovej prítomnosti, aktivity alebo modifikácie medzi rôznymi vzorkami z rozličných biologických podmienok (okrem iného napr. rôzne organizmy, časové podmienky fermentácie, stav média alebo rôzne biotopy). Údaje získané z takýchto
108 pokusov samotných, alebo v kombinácii s ďalšími technológiami, sa môžu použiť na také rôzne aplikácie, ako na porovnanie správania sa rôznych organizmov v určitej (napr. metabolickej) situácii, na zvýšenie produktivity kmeňov, ktoré produkujú špeciálne chemikálie alebo na zvýšenie účinnosti produkcie špeciálnych chemikálií.
Ekvivalenty
Odborníci skúsení v danej oblasti techniky zistia alebo budú schopní len pomocou bežnej rutinnej praxe zistiť mnohé ekvivalenty ku špecifickým uskutočneniam podľa vynálezu, opísaným v tomto dokumente. Také ekvivalenty uskutočnení spadajú do rozsahu nasledujúcich patentových nárokov.

Claims (38)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny z Corynebacteríum glutamicum kódujúca stresový, rezistenčný alebo tolerančný gén, alebo jeho časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiadne F-označené gény uvedené v tabuľke 1.
  2. 2. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa nároku 1, kde uvedený stresový, rezistenčný alebo tolerančný gén je zvolený zo skupiny pozostávajúcej z molekúl nukleových kyselín podieľajúcich sa na odpovedi na stres, tolerancii alebo rezistencii na teplotné stresy, pH stresy, kyslíkové stresy, osmotické stresy, toxické chemické látky, kyslíkové radikály, antibiotiká alebo na linkomycín.
  3. 3. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny z Corynebacteríum glutamicum zvolená zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname alebo jej časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden F-označený gén uvedený v tabuľke 1.
  4. 4. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptidovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
  5. 5. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá kóduje prirodzene sa vyskytujúci alelický variant polypeptidu zvolený zo skupiny aminokyselinových sekvencií zahrňujúcich sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
  6. 6. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50% homológna s nukleotidovou sekvenciou zvolenou zo skupiny sekvencií zahrňujúcich sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jej časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
  7. 7. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca najmenej 15 nukleotidový fragment nukleovej kyseliny obsahujúci nukleotidovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
    110
  8. 8. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá sa hybridizuje s molekulou nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 v stringentných podmienkach.
  9. 9. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, vyznačujúca sa tým, že obsahuje molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 alebo jej časť a nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu heterológny polypeptid.
  10. 10. Vektor, obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
  11. 11. Vektor podľa nároku 10, ktorý je expresným vektorom.
  12. 12. Hostiteľská bunka transfekovaná s expresným vektorom podľa nároku 11.
  13. 13. Hostiteľská bunka podľa nároku 12, kde uvedenou bunkou je mikroorganizmus.
  14. 14. Hostiteľská bunka podľa nároku 13, kde uvedená bunka patrí do rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium.
  15. 15. Hostiteľská bunka podľa nároku 12, kde expresiou uvedenej molekuly nukleovej kyseliny sa moduluje produkcia špeciálnej chemikálie z uvedenej bunky.
  16. 16. Hostiteľská bunka podľa nároku 15, kde uvedená špeciálna chemikália je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z organických kyselín, aminokyselín proteínového a neproteínového pôvodu, purínových a pyrimidínových báz, nukleozidov, nukleotidov, lipidov, nasýtených a nenasýtených mastných kyselín, diolov, sacharidov, aromatických zlúčenín, vitamínov, kofaktorov, polyketidov a enzýmov.
  17. 17. Spôsob produkcie polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 12, vo vhodnom kultivačnom médiu, pričom sa produkuje polypeptid.
  18. 18. Izolovaný stresový, rezistenčný alebo tolerančný polypeptid z Corynebacterium glutamicum, alebo jeho časť.
  19. 19. Proteín podľa nároku 18, kde stresový, rezistenčný alebo tolerančný polypeptid je zvolený zo skupiny pozostávajúcej z proteínov podieľajúcich sa na stresovej odozve, tolerancii alebo rezistencii na teplotné stresy, stresy na pH, stresy na
    111 kyslík, osmotické stresy, stresy na toxické chemické látky, kyslíkové radikály, antibiotiká alebo na linkomycín.
  20. 20. Izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
  21. 21. Izolovaný polypetid obsahujúci prirodzene sa vyskytujúci alelický variant polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jeho časť, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
  22. 22. Izolovaný polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 21, ktorý ďalej obsahuje heterológne aminokyselinové sekvencie.
  23. 23. Izolovaný polypeptid, ktorý je kódovaný molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna s nukleovou kyselinou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiadne F-označené molekuly nukleovej kyseliny uvedené v tabuľke 1
  24. 24. Izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50% homológna s aminokyselinovou sekvenciou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
  25. 25. Spôsob produkcie špeciálnej chemikálie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu bunky obsahujúcej vektor podlá nároku 12, tak že sa produkuje špeciálna chemikália.
  26. 26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob dálej zahrňuje krok získania špeciálnej chemikálie z uvedenej kultúry.
    112
  27. 27. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob ďalej zahrňuje krok transfekcie uvedenej bunky s vektorom podľa nároku 11, čím sa získa bunka obsahujúca uvedený vektor.
  28. 28. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená bunka patrí do rodov Corynebacterium alebo Brevibacteríum.
  29. 29. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená bunka je zvolená zo skupiny zahrňujúcej Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrilophilus, Brevibacteríum ammoniagenes, Brevibacteríum butanicum, Brevibacteriumdivaricatum, Brevibacteríum flavum, Brevibacteríum healii, Brevibacteríum ketoglutamicum, Brevibacteríum ketosoreductum, Brevibacteríum lactofermentum, Brevibacteríum linens, Brevibacteríum paraffinolyticum a tých kmeňov, ktoré sú uvedené v tabuľke 3.
  30. 30. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že expresiou molekuly nukleovej kyseliny z uvedeného vektora sa moduluje produkcia uvedenej špeciálnej chemikálie.
  31. 31. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená špeciálna chemikália je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z organických kyselín, aminokyselín proteínového a neproteínového pôvodu, purínových a pyrimidínových báz, nukleozidov, nukleotidov, lipidov, nasýtených a nenasýtených mastných kyselín, diolov, sacharidov, aromatických zlúčenín, vitamínov, kofaktorov, polyketidov a enzýmov.
  32. 32. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedenou špeciálnou chemikáliou je aminokyselina.
  33. 33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedená aminokyselina je zvolená zo skupiny zahrňujúcej lyzín, glutamát, glutamín, alanín, aspartát, glycín, serín, treonín, metionín, cysteín, valín, leucín, izoleucín, arginín, prolín, histidín, tyrozín, fenylalanín a tryptofán.
    113
  34. 34. Spôsob produkcie špeciálnej chemikálie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu bunky, ktorej genómová DNA sa zmenila inklúziou molekuly nukleovej kyseliny, podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
  35. 35. Spôsob diagnostikovania prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphtheriae v subjekte, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje detekciu prítomnosti jednej alebo viacerých z 1 až 304 sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname v subjekte, pričom sekvencie nie sú alebo nie sú kódované žiadnou z F-označených sekvencií uvedených v tabuľke 1, čím sa diagnostikuje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphtheriae v subjekte.
  36. 36. Hostiteľská bunka, obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny zahrňujúcej molekuly nukleových kyselín uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, kde molekula nukleovej kyseliny je porušená.
  37. 37. Hostiteľská bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny zahrňujúcej molekuly nukleových kyselín uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, kde molekula nukleovej kyseliny obsahuje jednu alebo viac nukleovokyselinových modifikácií sekvencií, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname.
  38. 38. Hostiteľská bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny zahrňujúcej molekuly nukleových kyselín uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, kde regulačná oblasť molekuly nukleovej kyseliny je modifikovaná v porovnaní s regulačnou oblasťou „divého“-typu molekuly.
SK1888-2001A 1999-06-25 2000-06-23 Gény Corynebacterium glutamicum kódujúce stresové, rezistenčné a tolerančné proteíny SK18882001A3 (sk)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14103199P 1999-06-25 1999-06-25
US14269299P 1999-07-01 1999-07-01
DE19930429 1999-07-01
DE19931413 1999-07-08
DE19931541 1999-07-08
DE19931457 1999-07-08
DE19932230 1999-07-09
DE19932209 1999-07-09
DE19932914 1999-07-14
US15121499P 1999-08-27 1999-08-27
DE19940764 1999-08-27
DE19941382 1999-08-31
PCT/IB2000/000922 WO2001000804A2 (en) 1999-06-25 2000-06-23 Corynebacterium glutamicum genes encoding stress, resistance and tolerance proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK18882001A3 true SK18882001A3 (sk) 2002-09-10

Family

ID=27582954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1888-2001A SK18882001A3 (sk) 1999-06-25 2000-06-23 Gény Corynebacterium glutamicum kódujúce stresové, rezistenčné a tolerančné proteíny

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP1290178A2 (sk)
JP (3) JP2003525593A (sk)
KR (4) KR20070087095A (sk)
AU (1) AU783703B2 (sk)
CA (1) CA2380870A1 (sk)
ES (1) ES2184658T1 (sk)
HU (1) HUP0203340A2 (sk)
MX (1) MXPA01012844A (sk)
PL (1) PL359863A1 (sk)
SK (1) SK18882001A3 (sk)
TR (1) TR200103709T2 (sk)
WO (1) WO2001000804A2 (sk)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU781091B2 (en) 1999-07-02 2005-05-05 Ajinomoto Co., Inc. DNA encoding sucrose PTS enzyme II
US6569650B1 (en) 1999-08-13 2003-05-27 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of metabolic products and for the nucleotide sequences encoding for the sod gene
EP1156115A1 (en) 2000-05-12 2001-11-21 Degussa AG Corynebacterium glutamicum strain with enhanced secretion activity
DE10032350A1 (de) 2000-07-04 2002-01-24 Degussa Neue für das mdhA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
ES2223900T3 (es) * 2000-08-10 2005-03-01 Degussa Ag Secuencias de nucleotidos que codifican el gen iysr2.
DE10042051A1 (de) * 2000-08-26 2002-03-07 Degussa Neue für das cstA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
EP1320543A2 (en) 2000-09-02 2003-06-25 Degussa AG Nucleotide sequence coding for the sigc gene of corynebacterium glutamicum
WO2002020792A1 (en) * 2000-09-09 2002-03-14 Degussa Ag Efflux protein dep33 of corynebacterium glutamicum
US6759224B2 (en) 2000-09-09 2004-07-06 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the sahH gene
WO2002022843A2 (en) * 2000-09-09 2002-03-21 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the dep34 gene
DE10154180A1 (de) 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag gene die für genetische Stabilitäts-, genexpressions-und Faltungsproteine codieren
DE10154181A1 (de) * 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag Gene die für Stressresistenz-und Toleranz-Proteine codieren
WO2005014828A2 (en) * 2003-08-01 2005-02-17 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of fine chemicals in plants
US8008545B2 (en) 2003-04-15 2011-08-30 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of fine chemicals
US7468262B2 (en) 2003-05-16 2008-12-23 Ajinomoto Co., Inc. Polynucleotides encoding useful polypeptides in corynebacterium glutamicum ssp. lactofermentum
US8728795B2 (en) 2003-12-18 2014-05-20 Basf Se Pgro expression units
DE10359660A1 (de) 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag Psod-Expressionseinheiten
DE10359594A1 (de) 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag PEF-TU-Expressionseinheiten
DE102004035065A1 (de) 2004-07-20 2006-02-16 Basf Ag P-ET-TS-Expressionseinheiten
JP5537818B2 (ja) * 2008-03-04 2014-07-02 国立大学法人信州大学 有用物質の製造方法
WO2010095642A1 (ja) * 2009-02-18 2010-08-26 国立大学法人信州大学 有用物質の製造方法
KR101694850B1 (ko) * 2014-10-08 2017-01-10 씨제이제일제당 주식회사 L-글루타민을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-글루타민 생산방법
KR101941745B1 (ko) * 2016-07-20 2019-01-24 씨제이제일제당 (주) 아실전이효소의 활성을 갖는 미생물 및 이의 용도
EP3456833A1 (en) 2017-09-18 2019-03-20 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
EP3467099A1 (en) 2017-10-05 2019-04-10 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
RU2019128538A (ru) 2018-09-26 2021-03-11 Эвоник Оперейшенс ГмбХ Способ ферментативного получения l-лизина
CN111088202B (zh) * 2019-12-25 2022-01-04 南京工业大学 一种通过生物成膜连续化发酵生产赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法
CN111909912B (zh) * 2020-09-11 2022-03-08 四川农业大学 一种提升水稻穗期高温耐受性的map3k-19基因及其编码得到的蛋白和应用
WO2023165952A1 (en) * 2022-03-01 2023-09-07 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of collagen proteins and bacterial collagen-like proteins by recombinant microorganisms

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2607827A2 (fr) * 1985-09-27 1988-06-10 Pasteur Institut Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un gene de resistance aux lincosamides et applications biochimiques et biologiques
IT1196453B (it) * 1986-07-04 1988-11-16 Sclavo Spa Elemento di dna di corynebacterium diphtheriae con proprieta' tipiche di un elemento di inserzione is
WO1988009819A2 (en) * 1987-06-12 1988-12-15 Massachusetts Institute Of Technology C. glutamicum threonine biosynthetic pathway
MY113040A (en) * 1994-02-24 2001-11-30 Ajinomoto Kk Novel gene derived from coryneform bacteria and use thereof
EP1002866B1 (en) * 1997-07-09 2005-10-12 Ajinomoto Co., Inc. TEMPERATURE SENSITIVE dtsR GENES

Also Published As

Publication number Publication date
KR20060118631A (ko) 2006-11-23
HUP0203340A2 (hu) 2003-01-28
CA2380870A1 (en) 2001-01-04
WO2001000804A2 (en) 2001-01-04
JP2007244391A (ja) 2007-09-27
KR100878335B1 (ko) 2009-01-14
KR20030000013A (ko) 2003-01-03
TR200103709T2 (tr) 2002-08-21
ES2184658T1 (es) 2003-04-16
MXPA01012844A (es) 2002-07-09
KR100834986B1 (ko) 2008-06-03
PL359863A1 (en) 2004-09-06
WO2001000804A3 (en) 2001-08-02
JP2007244392A (ja) 2007-09-27
JP2003525593A (ja) 2003-09-02
AU783703B2 (en) 2005-11-24
AU5836900A (en) 2001-01-31
KR20070087095A (ko) 2007-08-27
KR20070087094A (ko) 2007-08-27
EP1290178A2 (en) 2003-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1257649B1 (en) Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins
KR100834986B1 (ko) 스트레스 저항성 및 내성 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자
US7273721B2 (en) Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport
KR100878333B1 (ko) 항상성 및 적응과 관련된 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자
EP2290062A1 (en) Corynebacterium glutamicum gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase
SK18912001A3 (sk) Gény corynebacterium glutamicum kódujúce proteíny zapojené do membránovej syntézy a membránového transportu
KR101012231B1 (ko) 대사 경로 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자
JP2007267744A (ja) ホスホエノールピルビン酸:糖ホスホトランスフェラーゼ系タンパク質をコードするコリネバクテリウム−グルタミカム遺伝子
WO2002051231A1 (en) Genes of corynebacterium
RU2321634C2 (ru) Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
RU2304616C2 (ru) Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в гомеостазе и адаптации
RU2312145C2 (ru) Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
RU2303635C2 (ru) Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам
AU2007202317A1 (en) Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins
EP1661987A1 (en) Corynebacterium glutamicum gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase

Legal Events

Date Code Title Description
FC9A Refused patent application