FR2607827A2 - Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un gene de resistance aux lincosamides et applications biochimiques et biologiques - Google Patents

Abstract

LE FRAGMENT DE NUCLEOTIDE DE L'INVENTION COMPREND AU MOINS UNE PARTIE DU GENE LINA, CE GENE CODANT POUR UN POLYPEPTIDE CAPABLE D'INACTIVER LES LINCOSAMIDES ET DE CONFERER DES PROPRIETES DE RESISTANCE A LA LINCOMYCINE, ET ETANT INCLUS DANS LA SEQUENCE REPRESENTEE SUR LA FIGURE 2.

Description

FRAGMENT D'ADN COMPRENANT AU MOINS UNE PARTIE D'UN GENE
DE ESISTANCE AUX LINCOSAMIDES ET APPLICATIONS BIOCHI
MIQUES T BIOLOGIQUES
L'invention est relative à un fragment d'ADN comprenant au moins une partie d'un gène de résistance aux lincosaides et à ses applications biologiques et biochimiques.

Elle correspond à un développement de a demande de brevet principal n 85/14397 du 27 Septembre 1986, qui concerne notamment un fragment d'ADN interne au gène linA utilisable comme sonde de détection de résistance aux lincosamides dans des cultures cellulaires, notamment bactériennes.

Des expériences d'hybridation ADN-ADN à l'aide d'une sonde constituée d'un fragment Sau3A interne au gène linA ont permis d'étudier la distribution de ce gène chez des souches de staphylocoques pathogènes résistant aux lincosamides par inactivation. Les inventeurs ont pu ainsi établir que la souche de StaPhvlococcus aureus
BM4611, qui n'hybride pas avec la sonde linA, contient un gène différent codant également pour l'inactivation de la lincomycine et de la clindamycine.

L'invention a donc pour but de fournir un nouveau fragment d'ADN comportant au moins une partie de la séquence d'un gène conférant des propriétés de résistance aux lincosamides à une bactérie.

Elle vise également à fournir un procédé d'obtention de ce fragment d'ADN par clonage dans une bactérie.

L'invention vise, en outre, les applications biologiques et biochimiques de ce nouveau fragment d'ADN, en particulier pour l'élaboration de sondes pour la détection de bactéries résistant aux lincosamides et pour la construction de vecteurs de clonage pour l'étude
d'autres systèmes biologiques.

L'invention vise également à fournir la pro
téine correspondant à la séquence nucléotidique du
fragment considéré et les anticorps, plus spécialement
les anticorps monoclonaux, capables de reconnaitre spéci
fiquement cette protéine.

Le fragment d'ADN de l'invention est caracté
risé en ce qu'il comprend au moins une partie du gène
linA' codant pour une protéine capable d'inactiver les
lincosamides, et étant inclus dans la séquence nucléoti
dique suivante
ATG AAA ATT GAT AAT GTA 662 aCA GAA AAG GAT TTA TTT TAT ATT TTA SAC TTA TTT GAA AAA ATG GAA GTA ACT CAT TGG 722
TTA GAT GGA SGC TGG SGC GTA GAT GTA TTA ACT GGA AAA CAA CAA AGA GAA CAC AGA GAT 782
ATA GAT ATA SAT TTT GAC GCT CAA CAC ACT CAA AAA STT ATA AAA AAA TTA GAA GAT ATA 942
GGA TAC AAA ATA SAA GTT GAT TGG ATG CCT TCA CGT ATG GAA CTT AAA CAT AAA GAA TAT 902
GGA TAT TTA Gal ATT CAT CCT ATA AAT TTA AAT GAT SAT GGT TCC ATT ACT CAA OCA AAC
CCA GAA GGT GGC AAT TAC ATC TTT CAA AAT GAA TGG TTT TCA GAA ACT AAT TAT AAA GGT 1022
CGA AAA ATA CCA TGC ATT TCC AAA GAA GCT CAA CTT CTT TTT CAT TCC GGT TAT GAA TTA 1082
ACA OAA AAA SAC CAT TTT GAT ATA AAA AAT TTA AAA TCA ATA ACT
La séquence nécessaire pour l'expression de ce
gène linA' correspond à la séquence suivante :
AAGCTTTAGA CATATSCTTT AAGGTCTCTT GTAAATGTTC @@
ACCGTCTATT GCATTTCTAG TCGACAAAGT TAGGAATAAC CAACGAGAAG TAGGTTTTTC TTTAACCACT 110
TCTTCAATCA CTTTTTGAGC TTGATAACTA TTTTTCATAG CACGCCTCCA ATTACAGACC GGACATAATT 160
TAGATTTACA AAACCATGTC TTATGTAACT TCAAATATCC TTCATCAGTC GGCTTGAACT CTAAGACGTT 250
TCCACATTGT TTTACGTTAT AAGCCTTTTT TATTTTTAGT ATTTCAAGTA TATCTGCATA SCCTACATTA 320
TCTATTTTCT TTCTCTCCAT GGGCGTGTTC CCACTTTTGT CATATCTTTA ATGTTTCGTT ATCTTGATTT 390
TCGTCTATAT ATTTTGTATG ATTGTCTTGC ATATAAAAAG ACCTGCCAGT ATTAAGTTGA TGAGTAGATG 4@0
TTTCAATCTT GATTACTGGA CTTTTTTATG TCAAATTTTC CTTTCACGCA TAAAAATACA TAAAAACACT @30
AG@@ATATCA CGTTAATATG ATGTTTAATA TCTTTGAGTT ATTTCTATAT AGTATCAAGA CAAGAAGAAA 600
RBS
CTCGTTTTCA ACTCGTTTCA AATTCCTAAA TTAGGAGGGG TAAA ATG AAA ATT SAT AAT GTA 662
ACA GAA AAG GAT TTA TTT TAT ATT TTT GAC TTA TTT GAA AAA ATG GAA GTA ACT CAT TGG 722
TTA GAT GGA GGC TGG GGC GTA GAT GTA TTA ACT GGA AAA GAA CAA AGA GAA CAC AGA GAT 782
ATA GAT ATA GAT TTT GAC GCT CAA CAC ACT CAA AAA GTT ATA AAA AAA TTA GAA GAT ATA 842
GGA TAC AAA ATA GAA GTT GAT TGG ATG CCT TCA CGT ATG GAA CTT AAA CAT AAA GAA TAT 902
GGA TAT TTA GAT ATT CAT CCT ATA AAT TTA AAT GAT GAT GGT TCC ATT ACT CAA GCA AAC 9@2
CCA GAA GGT GGC AAT TAC ATC TTT CAA AAT GAA TGG TTT TCA GAA GCT AAT TAT AAA GGT 1@@2
CGA AAA ATA CCA TGC ATT TCC AAA GAA GCT GAA CTT CTT TTT CAT TCC GGT TAT GAA TTA 1@@@
ACA GAA AAA GAC CAT TTT GAT ATA AAA AAT TTA AAA TCA ATA ACT TAA TT TCTTTATTCC 1142
AATTGCTTTA TTCCAATTGC TTTATTCCAA TTGGTT@AT@ GACGTTGAGC CTCCGAACCC TTAACGATCC 1212
CAAAACTTGC CGAATGGTCG GCTTAATAGC TCACGC@ATG CCGACATTCG TCTGCAAGTT TAGTTAAGGG 1282
TTCGTGTCAA CGCACAATAA TTTCTCGCAT AAATGCGTGT TCTATTTTTT ATTTTTACTC CTCTTGATAG 1@52
CAAAAAACGC CATTCCAATA CAAAACCACA TACCTATAAT CSAT 14@8
L'expressiot "au moins une partie du gène linA'" désigne toute séquence nucléotidique correspondant à une partie de ce gène et présentant une longueur et une homologie suffisantes pour reconnaitre spécifiquement ce gène dans un prélèvement à l'étude, dans des essais, d'hybridation mettant en jeu cette séquence en tant que sonde.Cette expression désigne également toute séquence nucléotidique hybridable avec la précédente, telle qu'obtenue par transcription enzymatique inverse de l'ARN correspondant ou encore par synthèse chimique.

Il va de soi que les bases de la séquence nucléotidique considérée peuvent être dans un ordre différent de celui trouvé dans les gènes et/ ou que ces bases peuvent être, le cas échéant, substituées, dès lors qu'une sonde élaborée à partir d'une telle séquence donne une réponse caractéristique et non équivoque quant à la capacité de reconnaitre la présence du gène linA'.

La séquence codante du gène linA' est carac térisée en ce qu'elle est définie par le codon dtinitia- tion ATG en position 645 et le codon de terminaison TAA en position 1127 dans une phase de lecture ouverte (ou
PLO) de 483 paires de base.

La séquence du gène linA' présente une homologie de 449 sur 483 pb, soit 93% avec le gène linA.

Les travaux des inventeurs ont montré que la séquence du gène linA' est présente dans le plasmide naturel pIP856 de StaPhvlococcus aureus BM4611, de 2,6 kilobases, auquel il confère un niveau de résistance élevé à la lincomycine. Ce plasmide contient un site unique HindIII.

La sonde de S.aureus BM4611 a été déposée le 3
Décembre 1986 sous le n I 634 à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (C.N.C.M.).

Le gène linA' est également caractérisé en ce qu'il est porté par un fragment d'ADN HindIII-ClaI de 1,4
kb tel qu'obtenu par digestion de l'ADN plasmidique de
PIP856, par les enzymes de restriction ClaI et HindIII et
clonage des fragments obtenus dans le plasmide pUC8 de
2,7kb digéré par les enzymes AccI et HindIII.

L'expression de la séquence nucléotidique du
déterminant de résistance aux lincosamides selon l'in
vention dans des minicellules d'E.coli conduit à la
production d'une protéine ayant une masse moléculaire
apparente r de l'ordre de 19000 à 21000 daltons, telle
que déterminée par électrophorèse sur gel de polyacry
lamide -SDS.

Cette estimation est en accord avec la Mr de
19020 daltons déduite de la séquence nucléotidique de la
phase ouverte de lecture de 483 pb ci-dessus.

La séquence correspondante de 161 acides aminés
est la suivante
Met Lys Ile Asp Asn Val 662
Thr Slu Lys As@ Lsi Phe Tyr Ile Leu Aso Lei Phe Glu Lys Met Glu Val Th@ His Trp 722
Leu Asp Gly Gly Trp Gly Val Asp Val Leu Th@ Gly Lys Gln Gln Arg Glu His Arg Asp 782
Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ala Gln His Thr Gln Ly@ Val Ile Lys Lys Leu Glu Asp Ile 842
Gly Tyr Lys Ile Glu Val Asp Trp Met Pro Ser Arg Met Glu Leu Lys His Lys Glu Tyr @02
Gly Tyr Leu Asp Ile His Pro Ile Asn Leu Asn As@ Asp Gly Seroole Th@ Gln Al@ Asn 962
Pro Glu Gly Gly Asn Tyr Ile Phe Gln Asn Glu Trp Phe Ser Glu Thr Asn Tyr Lys Gly 1@22
Arg Lys Ile Pro Cys Ile Ser Lys Glu Ala Gl@ Leu Leu @he H@@ Ser Gly Tyr Glu Leu 1@82
Thr Glu Lys Asp His Phe Asp Ile Lys Asn Leu Lys Ser Ile Thr ***
L'invention vise également les plasmides et les phages recombinants contenant au moins une partie des fragments d'ADN ci-dessus recombinés avec des fragments hétérologues ainsi que les vecteurs recombinants, notamment les plasmides hybrides comportant au mcins une partie du gène linA'. L'utilisation du fragment d'ADN permettant l'expression du gène linA' comme marqueur de résistance permet d'utiliser de tels vecteurs comme outils de clonage pour d'autres systèmes biologiques.

De nouveaux plasmides comprennent le plasmide pAT24 construit en clonant dans le plasmide pUC8 de 2,7kb digéré par les enzymes AccI et HindIII, les fragments obtenus par digestion par des enzymes de restriction appropriés de 2,6 kb du plasmide pAT23, ce plasmide recombinant résultant lui-même de la linéarisation du plasmide piu856 par Hindîli et de son clonage dans le site HindIII de pBR329.

L'invention vise, en outre, en tant qu'inter médiaire les soucies bactériennes modifiées, ou transformants, caractérisées par l'insertion dans leur génome d'au moins une partie d'un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus.

Conformément à l'invention, l'obtention de la séquence du gène linA' codant pour une protéine capable d'inactiver les lincosamides comprend - le clonage du déterminant de résistance aux lincosamides, - la purification du fragment de 1,4kb, par digestion avec les enzymes de restriction appropriées d'un plasmide renfermant la séquence du gène linA', tel que pIP856, pAT23 ou pAT24, - le sous-clonage de fragments de restriction dérivés de ce fragment de 1,4kb dans les formes réplicatives des phages M13mplO, mp18 et mp19.

Grâce à la détermination de la séquence du gène linA', les inventeurs ont disposé de moyens permettant d'étudier les possibilités de construction de sondes intragéniques dans le but, en particulier, d'effectuer une étude épidémiologique de la dissémination du gène linA' parmi un ou plusieurs genres bactériens.

L'invention vise donc des sondes pour la détection de la résistance aux lincosamides dans les bactéries élaborées à partir d'un fragment intragénique du gène linA' décrit ci-dessus.

Des sondes appropriées pour ce type de détection sont avantageusement marquées par un élément radioactif ou tout autre groupe permettant sa reconnais sanve à l'état hybridé avec la préparation refermant l'ADN à étudier.

Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique renfermant des bactéries, ou directement avec ces bactéries ou leurs acides nucléiques, dans des conditions autorisant l'hybridation éventuelle de la séquence nucélotidique de la sonde avec une séquence complémentaire, éventuellement contenue dans le produit testé.

La distribution du gène linA' a été étudiée par hybridation (ADN-ADN) chez des souches de staphylocoques.

Des résultats reproductibles ont été obtenus en utilisant comme sondes intragéniques, des fragments d'ADN internes au gène linA', tels qu'obtenus par action de l'exonucléase BAL31 sur le fragment HindIII-ClaI de 1,4kb purifié, défini ci-dessus.

Une sonde spécifique du gène linA' renferme une séquence de nucléotides allant des positions 645 à 735.

Une sonde hybride avec le gène linA et le gène linA' renferme une séquence de nucléotides allant des positions 789 à 966.

Ces fragments intragéniques SGBt avantageusement utilisés comme sonde > pour l'étude de la dissémination de la résistance aux lincosamides.

L'invention vise également les applications immunologiques de la protéine codée, plus spécialement pour l'élaboration d'antisérum spécifique ainsi que d'anticorps monoclonaux. Ces anticorps polyclonaux sont formés selon les techniques classiques par injection de la protéine à des animaux, récupération des antisérums, puis des anticorps à partir des antisérums par exemple par chromatographie d'affinité.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention sont rapportés dans la description qui suit concernant le clonage du gène linA' chez E.coli, la détermination de sa séquence nucléotidique et l'analyse des produits d'expression. Dans cette description, il sera fait référence aux figures 1 et 2.

- a figure 1 représentant la construction des plasmides pAT23 et pAT24, et - la figure 2, la séquence nucléotidique exprimant le gène linA'.

Les références bibliographiques mentionnees dans ce qui suit sont données en fin de description.

Matériel et méthodes
I Souches bactériennes.

Les origines et les prcpriétés des souches bactériennes utilisées sont résumées dans le tableau 1 suivant (E.coli étant naturellement résistant aux macrolides, lincosamides et streptogramines, on utilise la souche d'E.coli DB10 qui est un mutant de perméation à ces antibiotiques (1).

TABLEAU 1 BACTERIE SOUCHE CARACTERES (a)
Staphylococcus aureus BM4611 LnPnKm
Escherichia coli DB10 Dérivé de PR7(F
thi leu rus PUP nal-r ) sensible
aux MLS
K-12 JM101 (lac-Pro),thr,
supE, F'traD 36,
proAB +,lacIq
K-12 AR1062 thr, leu, lac, qal,
xvl,mal,mtl,
hsdS (a) Les symboles génétiques sont d'après Bachmann et coll. (2) et Novick et coll.(3).

2. MILIEUX DE CULTURE
Les souches d'E.coli et de S.aureus sont cultivées en milieu coeur-cerveau (Difco) bouillon ou agar. On réalise les antibiogrammes sur milieu de Mueller-Hinton (Diagnostic Pasteur) agar avec des disques imprégnés d'antibiotiques (Diagnostics Pasteur). Toutes les incubations sont effectuées à 37-C.

3.TESTS DE GOTS(4)
Principe : si l'on cultive une souche productrice d'une enzyme inactivant l'antibiotique sur une gélose ensemencée avec une souche indicatrice et contenant une quantité d'antibiotique juste suffisante pour inhiber cette dernière, la production d'enzyme provoquera une dégradation de l'antibiotique dans le milieu de culture et se traduira par une croissance de kla souche indicatrice autour de la souche productrice.

Les tests ont été réalisés sur milieu coeur-cerveau contenant la couche indicatrice Sarcina lutea ATCC 9341 et de la clindamycine (0,5 mg/l). Les incubations ont été faites à 30-C pendant 48 h.

4. PLASMIDES
Les plasmides utilisés dans ces travaux sont énumérées dans le tableau 2.

Tableau 2.

Plasmide Caractères phénotypiques(a) Origine pUC8 Tra-, Mob-, Ap pIP856 Tra,Cl,Ln plasmide
naturel pAT23 Tra ,Mob tAp Cl Ln Tc pBR329#pIP856
EcoRI
PAT 24 Tra-, Mob-, Ap CI Ln pUC8#pIP856 HindIII-ClaI
1,4kb (a) La nomenclature des caractéres phénotypiques des plasmides est donnée d'après Novick et coll.(3).

5. PREPARATION DE L'ADN PLASMIDIQUE , Préparation raPide : On effectue la caractérisation des plasmides recombinants obtenus après transformation après extraction de l'ADN plasmidique selon la technique de Birnboim et Doly (5) par digestion par endonucléases de restriction.

, Obtention d'ADN purifié : On extrait l'ADN plasmidique par la technique de lyse alcaline (6) puis on purifie par centrifugation à l'équilibre en gradient de chlorure de cesium-bromure d'éthidium.

6. METHODES D'ANALYSE DES ADN.

a- Coupure Par endonucléases de restriction
L'arrêt de la réaction enzymatique est effectué par dénaturation thermique ou par extraction au phénol selon les enzymes.

b- Electrophorèse analytiqu ou préparative
Les électrophorèses analytiques et préparatives sont réalisées en gels d'agarose à 0,8% immergés dans du tampon Tris-borate-EDTA (Tris base 45mM,acide borique 45mM,EDTA 1,25mM) en présence de bromure d'éthidium (0,5mg/l).

Les fragments d'ADN sont purifiés par électrotransfert :sur une membrane de dialyse.

7. EXPRESSION DANSE DES MINICELLULES D'E.COLI
La souche d'E.coli AR1062 (7) est transformée avec l'ADN des plasmides à etudier et cultivee une nuit sur milieu coeur-cerveau. Les minicellules sont purifiées par centrifugation en gradient de sucrose . Les protéines synthétisées dans les minicellules sont marquées radioactivement par incorporation de (35 5)-méthionine.

Leur masse moléculaire est déterminée par électrophorèse en gel de polyacrylamide à 12,5% en présence de dodécyl-sulfate de sodium (SDS).

8. SEOUENCAGE DE L'ADN
Les fragments d'ADN à séquencer sont clonés dans les formes réplicatives des bactériophages M13mp18,M13mp19 ou M13mpiO et introduits par transformation dans la souche d'E. coli JM101. Les bactériophages recombinants sont isolés sur gélose molle coeur-cerveau en présence d'isopropyl-ss-D-thiogalactopyranoside (80 mg/l) et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-D-galactopyranoside (40mg/l). Les formes simple brin sont purifiées suivant le protocole décrit par Amersham.

La séquence est déterminée par la technique de terminaison de channe (8).Les fragments sont marqués 32 radioactivement par incorporation d'(a32P)-déoxy ATP.

Les échantillons sont déposés sur des gels de polyacrylamide à 6 ou 8% de 0,35 mm d'épaisseur en tampon Tris-borate-EDTA (Tris base 90mM,acide borique 90mM,EDTA 2,5mM).

9. ENZYMFS ET REACTIFS
Les enzymes utilisées et l'(α32P)-dATP proviennent d'Amersham,les phages M13mp18, mp19 et mpiO de
PL-Biochemicals, les antibiotiques des Laboratoires suivants : ampicilline (Bristol),tétracycline (Pfizer), lincomycine et clindamycine (Upjohn).

EXEMPLE 1. CLONAGE DU GENE DE RESISTANCE AUX LINCOSAMIDES CHEZ
E.COLI
a - ConstructiPn des plasmides pAT23 et pAT24
La construction de ces plasmides est illustrée sur la figure 1.

Les tailles des différents fragments. sont indiquées en kilobases. Les flèches en pointillés symbolisent les gènes de résistance inactivés par le clonage.

Dans les plasmides, Ap désigne la résistance à l'ampicilline, Cm au chloramphénicol, Tc à la tétracycline et ORI l'origine de réplication.

On procède comme suit
A/ Construction du plasmide pAT22
On soumet les plasmides pBR329 de 4, et pIP8S5 de 2,5kb à une étape de digestion par EccRI puis de ligation.

On obtient le plasmide pAT22.

B/ Construction du plasmide pAT23
On soumet les plasmides pBR329 de 1kb 4,1kb et pIP856 de 2,6kb à une étape de digestion par HinalII, puis de ligation. On obtient le plasmide pAT23.

C/ Construction du plasmide pAT24
L'insertion HindIII de 2,6kb du plasmide pAT23 a été purifiée, digérée par l'enzyme de restriction ClaI et les fragments obtenus ont été clonés dans le plasmide pUC8 (2,7kb) digéré par les enzymes AccI et HindIII. Le plasmide recombinant pAT24 obtenu contient un fragment
ClaI-HindIII de 1,4kb (fig. 1) conférant la résistance aux lincosamides, par inactivation.

Le fragment de 1,4kb est purifié pour séquençage à partir de pAT24. A cet effet, on soumet pAT24 à une digestion par les enzymes EcoRI et HindIII.

Les clonages sont effectués dans E.coli DB10 en sélectionnant pour la résistance à l'ampicilline (100g/l) et la clindamycine (Ig/l) et en vérifiant le phénotype
Gots positif des transformants obtenus. Les constructions plasmidiques sont vérifiées par digestion par les endonucléases de restriction appropriées.

2. SEOUENCE NUCLEOTIDIOUE DU FRAGMENT DE 1,4KB
a - Sous-clonage dans le bactériophage M13.

Stratégie de séquence.

Le fragment HindIII-EcoRI de 1,4kb purifié est digéré par les endonucléases de restriction, Alul, RsaI,
Sau3A, DraI et TaqI ainsi que par l'exonucléase Baf31, et les fragments obtenus sont clonés dans les formes réplicatives de bactériophages M13mp18, mp19 et mp10. Les bactériophages recombinants ainsi obtenus permettent d'obtenir la totalité de la séquence du fragment de 1,4kb.

La séquence nucléotidique complète du fragment d'ADN Hîndîli-Clal de 1420pb de pIP856 contenant le gène de résistance aux .'incosamides est présentée sur la figure 2.

La numérotation commence au site HindIII. La séquence d'amino-acides de la protéine et le site de fixation du ribosome sont indiqués.

Les références bibliographiques dont question ci-dessus sont les suivantes 1- DATTA,N.,W. HEDGES, D.BECKER, and J.DAVIES.1974.

Plasmid-determined fusidic acid resistance in the
Enterobacteriaceae. J.Gen.Microbiol. 83:191-196.

2- BACHMANN,B.J. 1983.Linkage map of Escherichia coli K12.Edition 7.Microbiol.Rev. 47:180-230.

3- NOVICK,R.P.,R.C. CLOWES,S.N. COHEN,R.CURTISS,N.DATTA, and S.FALKOW.1976. Univorm nomenclature for bacterial plasmids : a proposal.Bacterial.Rev. 40:168-189.

4- GOTS, J.S. 1945. The detection of penicillinase-producing properties of microorganisms.

Science 102:309.

5. BIRNBOIM,H.C. and J.DOLY 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid
DNA. Nucl. Acids Res. 7:1513-1523.

6. MANIATIS, T.,E.F. FRITSCH and J.SAMBROOK.1982. In
Molecular Cloniong, a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Inc.,New York.

7. RAMBACH, A. and D.S. HOGNESS. 1977.Translation of Drosophila Selanoqaster sequences in Escherichia coli Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5041-5045.

8.SANGER,F.S. NICKLEN, and A.R.COULSON. 1977.

DNAsequencing with chain-terminating inhibitors.Proc.Natl.'Acad.Sci., USA 74:5463-5467.

9. MORAN,CP., N.LANG,SG J. LEGRICE,G.LEE,M.STEPHENS,AL
SONENSHEIN, J.PERO and R. LOSIK.1982 Nucleotide sequences that signal the initiation of transcription and translation in Bacillus subtilis. Mol.

Gen.Genet. 186:339-346.

10. STORMO,D.G.., T.G; SCHNEIDER. and L.M. GOLD. 1982
Characterization of translational initiation sites in
E.coli Nucal. Acids Res.10:2971-2996..

11. LECLERCQ, R.,C. CARLIER, J.DUVAL and P.COURVALIN 1985. Plasmidmediated -resistance to lincomycin by inactivation in Staphvlococcus.Antimicrob.Agents
Chemother.

12. ROSENBERG, M. and D. COURT. 1979. Regulatory sequences involved in the promotion and termination of
RNA transcription. Annu. Rev. Genet. 13:319-353.

13. HU and MESSING - Elservier Biomedical press. gene 17 (1982) : 271-272.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1. Sonde de détection d'une résistance aux

lincosamides selon la revendication 7 de la demande de

brevet principal 85/14397 du 27/9/1985, caractérisée en

ce qu'elle renferme un fragment d'ADN du gène linA'dont

la séquence est la suivante

ATG AAA ATT GAT AAT GTA @@2

ACA GAA AAG GAT TTA TTT TAT ATT TTA GAC TTA TTT GAA AAA ATG GAA GTA ACT CAT TGG 722

TTA GAT GGA GGC TGG GGC GTA GAT GTA TTA ACT GGA AAA CAA GAA AGA GAA CAC AGA GAT 782

ATA GAT ATA SAT TTT GAC GCT CAA CAC ACT CAA AAA GTT ATA AAA AAA TTA GAA GAT ATA 842

GGA TAC AAA ATA GAA GTT GAT TGG ATG CCT TCA CGT ATG GAA CTT AAA CAT AAA GAA TAT 902

GGA TAT TTA GA@ ATT CAT CCT ATA AAT TTA AAT GAT GAT GGT TCC ATT ACT CAA GCA AAC 9@2

CCA GAA GGT GGC AAT TAC ATC TTT CAA AAT GAA TGG TTT TGA GAA @CT AAT TAT AAA GGT 1@@2

CGA AAA ATA CCA TGC ATT TCC AAA GAA GCT CAA CTT CTT TTT CAT TCC GGT TAT GAA TTA 1@@@

ACA GAA AAA SAC CAT TTT GAT ATA AAA AAT TTA AAA TCA ATA ACT

2. Fragment d'ADN, caractérisé en ce qu'il

comprend la séquence nucléotidique suivante nécessaire

pour l'expression du gène linA'::

AAGCTTTAGA CATATGCTTT AAG@TCTCTT @TAAATGTTC 40

ACCGTCTATT GCATTTCTAG TCGACAAAGT TAGGAATAAC CAACGAGAAG TAGGTTTTTC TTTAAC@ACT 110

TCTTCAATCA CTTTTTGAGC TTGATAACTA TTTTTCATAG CACGCCTCCA ATTACAGACC GGACATAATT 180

TAGATTTACA AAACCATGTC TTATGTAACT TCAAATATCC TTCATCAGTC GGCTTGAACT CTAAGA@GTT 250

TCCACATTGT TTTACGTTAT AAGCCTTTTT TATTTTTAGT ATTTCAAGTA TAT@TGCATA GCCTACATTA 320

TCTATTTTCT TTCTCTCCAT GGGCGTGTTC C@ACTTTTGT CATATCTTTA ATGTTTGGTT ATCTTGATTT 390

TCGTCTATAT ATTTTGTATG ATTGTCTTGC ATATAAAAAG ACCTGCCAGT ATTAAGTTGA TGAGTAGATG 4@0

TTTCAATCTT GATTACTGGA CTTTTTTATG TCAAATTTTC CTTT@ACGC@ TAAAAATACA @AAAAACACT 530

AGTCATATCA CGTTAATATG ATGTTTAATA TCTTTGAGTT ATTTCTATAT AGTATCAAGA CAAGAAGAAA 600

RBS

CTCGTTTTCA ACTCGTTTCA AATTCCTAAA TTAGGAGGGG TAAA ATG AAA ATT GAT AAT GTA @@2

ACA OAA AAG 3AT TTA TTT TAT ATT TTA SAC TTA TTT OAA AAA ATG GAA GTA ACT CAT TGG 722

TTA GAT GGA GGC TGG GGC GTA GAT GTA TTA ACT GGA AAA CAA CAA AGA GAA CAC AGA GAT 782

ATA GAT ATA GAT TTT GAC GCT CAA CAC ACT CAA AAA GTT ATA AAA AAA TTA GAA GAT ATA 842

GGA TAC AAA ATA GAA GTT GAT TGG ATG CCT TCA CGT ATG GAA CTT AAA CAT AAA GAA TAT 902

GGA TAT TTA GAT ATT CAT CCT ATA AAT TTA AAT GAT SAT G6T TCC ATT ACT C4A GCA AAC 9@2

CCA GAA GGT GGC AAT TAC ATC TTT CAA AAT GAA TGG TTT TCA GAA ACT AAT TAT AAA GG@ 1022

GCA AAA ATA CCA TGC ATT TCC AAA GAA GCT CAA CTT CTT TTT CAT TCC GGT TAT GAA TTA 10@2

ACA GAA AAA GAC CAT TTT GAT ATA AAA AAT TTA AAA TCA ATA ACT TAA TT TCTTTATTCC 1142

AATTGCTTTA TTCCAATTGC TTTATTCCAA TTGCTTTATT GACGTTGAGC CTCCGAACCC TTAA@GATCC 1@12

CAAAACTTGC CGAATGGTCG GCTTAATAGC TCACGCTATG CCGACATTCG TCTGCAAGTT TAGTTAAGGG 1292

TTCGTCTCAA CGCACAATAA TTTCTCGCAT AAATGCGTGT TCTATTTTTT ATTTTTACTC CTCTTGATAG 1@52

CAAAAAACGC CATTCCAATA CAAAACCACA TACCTATAAT CGAT 1418

3.Fragment d'ADN selon la revendication 2,

caractérisé en ce qu'il comprend au moins une partie du

gène linA', ce gène codant pour une protéine capable

d'inactiver les lincosamides et étant inclus dans la

séquence nucléotidique suivante

ATG AAA ATT GAT AAT GTA 662

ACA GAA AAG GAT TTA TTT TAT ATT TTA GAC TTA TTT GAA AAA ATG GAA GTR ACT CAT TGG 722

TTA GAT GGA GGC TGG GGC GTA GAT GTA TTA ACT GGA AAA CAA CAA AGA GAA CAC AGA GAT 782

ATA GAT ATA GAT TTT GAC GCT CAA CAC ACT CAA AAA GTT ATA AAA AAA TTA GAA GAT ATA 842

GGA TAC AAA ATA GAA GTT GAT TGG ATG CCT TCA CGT ATG GAA CTT AAA CAT AAA GAA TAT 901

GGA TAT TTA GA@ ATT CAT CCT ATA AAT TTA AAT GAT GAT GGT TCC ATT ACT CAA G@A AAC 962

CCA GAA GGT GGC AAT TAC ATC TTT CAA AAT GAA TGG TTT TCA GAA @CT AAT TAT AAA GGT 1022

CGA AAA ATA CCA TGG ATT TCC AAA GAA SCT CAA CT@ CTT TTT CAT TCC GGT TAT GAA TTA 1082

ACA GAA AAA SAC CAT TTT GAT ATA MA AAT TTA AAA TCA ATA ACT

4. Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence codante du gène linA' est définie par un codon d'initiation ATG en position 645 et un codon de terminaison TAA en position 1127 dans une phase ouverte de lecture de 483 pb et qu'elle présente une homologie de 449 sur 483 pb soit 93% avec le gène linA.

5. Fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 2 à 4 caractérisé en ce qu'il est présent dans le plasmide naturel pI856 de 2,6 kilobases, chez StaPhvlococcus aureus BM4611, ce plasmide codant pour la résistance à la lincomycine et contenant un site unique

HindIII.

6. Fragment d'ADN, selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'il est porté par un fragment d'ADN de restriction de 1,4kb tel qu'obtenu par digestion de l'ADN plasmidique de pIP856 par les enzymes de restriction ClaI et HindlII, clonage des fragments obtenus dans le plasmide pUC8 de 2,7kb digéré par les enzymes AccI et HindIII.

7. Fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine de résistance aux lincosamides ayant une masse moléculaire apparente de l'ordre de 19000 daltons.

8. Vecteur recombinant comportant au moins une partie à un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 2 à 7.

9. Plasmide pAT24 construit en clonant dans le plasmide pUC8 de 2,7kb digéré par les enzymes AccI et

HindIII, les fragments obtenus par digestion par des enzymes de restriction appropriés de 2 ,6kb,du plasmide pAT23, ce plasmide recombinant résultant lui-même de la linéarisation du plasmide pIP856 par HindIII et de son clonage dans le site Hindîli de pBR329.

10. Procédé d'obtention de la séquence

nucléotidique du gène linA', caractérisé en ce qu'il

comprend

- le clonage . du déterminant de résistance aux

lincosamides,

- la purification du fragment de 1,4kb, par digestion

avec les enzymes de restriction appropriés d'un plasmide

renfermant la séquence du gène linA', tel que pIP856,

pAT23 ou pAT24,

- le sous-clonage de fragments de restriction dérivés de

ce fragment de 1,4kb dans les formes réplicatives des

phages M13mp10, mp18 et mp19.

11. Polypeptide de 19000 à 21000 daltons

environ, capable d'inactiver les lincosamides et de

conférer des propriétés de résistance à la lincomycine,

caractérisé en ce qu'il répond à la séquence suivante

d'acides aminés.

12. Utilisation du fragment d'ADN selon la revendication 2 comme marqueur de résistance de vecteurs de clonage.

Thr Glu Lys Asp His Phe Asp Ile Lys Asn Leu Lys Ser Ile Thr ***

Arg Lys Ile Pro Cys Ile Ser Lys Glu Ala Gl@ Leu Leu Fhe His Ser Gly Tyr Glu Leu 1082

Pro Glu Gly Gly Asn Tyr lic Phe Gln Asn Glu Trp Ph. Ser Glu Thr Asn Tyr Lys Gly

Gly Tyr Leu Asp Ile @is Pro Ile Asp Leu Asn Asp Asp Gly Seroole Thr Gln Ala Asn 962

Gly Tyr Lys Ile Glu Val Asp Trp Met Pro Ser Arg Met Glu Leu Lys His Lys Glu Tyr 902

Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ala Gln His Thr Gln Lys Val Ile Lys Lys Leu Glu Asp Ile 842

Leu Asp Gly Gly Trp Gly Val Asp Val Leu Thr Gly Lys Gln Gln Arg Glu His Arg Asp 782

Met Lys Ile Asp Asn Val 662 Thr Glu Lys Asp Leu Phe Ty@ Ile Leu Asp L@u Phe Glu Lys Met Glu Val Thr His Trp 722