FR2599743A1 - Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un gene de resistance a l'erythromycine, son procede d'obtention et ses applications biochimiques - Google Patents
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Abstract
LE FRAGMENT D'ADN DE L'INVENTION RENFERME AU MOINS UNE PARTIE DU GENE EREB CODANT POUR UNE PROTEINE CAPABLE D'INACTIVER L'ERYTHROMYCINE.
Description
FRAGMENT D'ADN COMPRENANT AU MOINS UNE PARTIE
D'UN GENE DE RESISTANCE A L'ERYTHROMYCINE,
SON PROCEDE D'OBTENTION ET SES APPLICATIONS BIOCHIMIQUES
L'invention est relative à un fragment d'ADN comprenant au moins une partie d'un gène de résistance à l'érythromycine et à son procédé d'obtention.
D'UN GENE DE RESISTANCE A L'ERYTHROMYCINE,
SON PROCEDE D'OBTENTION ET SES APPLICATIONS BIOCHIMIQUES
L'invention est relative à un fragment d'ADN comprenant au moins une partie d'un gène de résistance à l'érythromycine et à son procédé d'obtention.
Elle vise également ses applications biochimiques, notamment pour détecter les bactéries résistant à ltérythromycine.
Divers auteurs ont proposé d'utiliser l'éry tbrortycine, ou Em, en thérapeutique pour moduler la flore à gram-négatif du tractus intestinal (Andremont et Tancréde (1981) Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur) 132 B, 419-427 et Andremont et al (1986) Antimicrob. Agents
Chemother (sous presse).
Chemother (sous presse).
On a cependant observé la présence fréquente dans le tractus intestinal d'entérobactéries hautement résistantes à Em (MIC # 500 g/ml). Cette résistance est habituellement associée à une utilisation antérieure d'érythromycine.
Dans des travaux antérieurs, les inventeurs ont mis en évidence un plasmide pIP1100 de 61kb conférant un niveau de résistance élevé à Em dans la souche
E. coli BM2195 isolée d'une hemoculture (1a).(Les références bibliographiques sont rapportées à la fin de la description).
E. coli BM2195 isolée d'une hemoculture (1a).(Les références bibliographiques sont rapportées à la fin de la description).
Ce plasmide, qui est auto-transférable à d'autres cellules de E. coli, appartient au groupe d'incompatibilité X et code pour une résistance à l'ampicilline, la gentamycine, la streptomycine et l'érythromycine.
Les inventeurs ont alors mis en évidence que la résistance à l'érythromycine résulte de la synthèse d'une estérase d'érythromycine dite de type I, qui hydrolyse le cycle lactone de Eut et de l'oléandomycine (Out), codée par le gène ereA porté par le plasmide pIP1100.
Il a été proposé d'utiliser dans des essais d'hybridation, comme sonde nucléotidique, un fragment intragénique du gène ereA, afin de mettre en évidence la présence éventuelle, de gènes responsables d'une résistance à l'érythromycine chez un agent pathogène.
Le développement des travaux des inventeurs dans ce domaine les a conduits à observer une hétérogé néité des déterminants de résistance à Em et à mettre en évidence deux autres gènes de résistance, dont un nouveau gène capable de conférer une résistance en inactivant Em et Om.
L'invention a donc pour but de fournir un nouveau fragment d'ADN comportant au moins une partie d'une séquence génique responsable de la résistance à Em par inactivation.
Elle vise également à fournir un procédé d'obtention de ce fragment d'ADN par clonage dans une bactérie.
L'invention vise en outre les applications biochimiques de ce nouvéau fragment d'ADN, en particulier pour l'élaboration de sondes pour la détection de bactéries résistant à Em. L'invention vise également à fournir la protéine codée par la. séquence en question et les anticorps, plus spécialement les anticorps monoclonaux capables de reconnaitre spécifiquement cette protéine.
Le fragment d'ADN de l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une partie du gène ereB codant pour une protéine capable d'inactiver l'érythromycine, le gène ereB étant inclus dans la séquence nucléotidique suivante
GATCGTAAAG CGTATTCTAC GGCAATACGG CTACCCACCC GATATGCAAA TGCTGGCCA@ 40
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L'expression "au moins une partie du gène ereB" désigne toute séquence nucléotidique dont la séquence correspond à une partie du gène ereB, ayant une longueur suffisante pour reconnaitre spécifiquement ce gène dans un prélèvement à l'étude, dans des essais d'hybridation mettant en jeu cette séquence en tant que sonde. Cette expression désigne également toute sonde contenant une séquence nucléotidique hybridable avec la précédente, telle qu'obtenue par transcription enzymatique inverse de l'ARN correspondant ou encore par synthèse chimique.
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L'expression "au moins une partie du gène ereB" désigne toute séquence nucléotidique dont la séquence correspond à une partie du gène ereB, ayant une longueur suffisante pour reconnaitre spécifiquement ce gène dans un prélèvement à l'étude, dans des essais d'hybridation mettant en jeu cette séquence en tant que sonde. Cette expression désigne également toute sonde contenant une séquence nucléotidique hybridable avec la précédente, telle qu'obtenue par transcription enzymatique inverse de l'ARN correspondant ou encore par synthèse chimique.
Il va de soi que les bases de la séquence nucléotidique considérée peuvent être dans un ordre différent de celui trouvé dans le gène et/ou que ces bases peuvent etre le cas échéant substituées, dès lors qu'une sonde élaborée à partir d'une telle séquence donne une réponse caractéristique et non équivoque quant à la capacité de reconnaître la présence du gène ereB.
La séquence codante du gène-ereB, définie par les données de clonage et l'analyse de sa séquence nucléotidique rapportées dans les exemples7 comporte une phase ouverte de lecture de 1257 paires de base allant des positions 383 à 1639.
Les travaux des inventeurs ont montré que la séquence du gène ereB est présente dans le plasmide naturel pIP1527 chez E. coli. BM2570, auquel il confère un niveau de résistance élevé à l'érythroutycine (Em) et à (Om) par inactivation. Ce plasmide a été déposé sous le n I-572 le 10 Juin 1986 à la Collection Nationale de
Culture de Microorganismes (C.N.C.M.).
Culture de Microorganismes (C.N.C.M.).
Selon un autre aspect, le gène ereB est caractérisé en ce qu'il est porté par un fragment d'ADN de restriction de 3,8kb environ, tel qu'obtenu par digestion à l'aide de l'endonucléase de restriction BamHI à partir du plasmide naturel pIP1527.
Le gène ereB est également contenu dans l'insertion de 1,9kb obtenue à partir du fragment de restriction de 3,8kb cloné dans le site BamHI du plasmide pBR329, par digestion partielle par Sau3A du plasmide pBR329 avec l'insertion de 3,8kb.
Le gène ereB est également caractérisé en ce qu'il renferme une teneur en guanosine et cytosine, inférieure à celle du génome de E. coli (G + C), contrairement au gène ereA, dont la teneur G + C est de 50,5%.
L'expression de la séquence nucléotidique de l'invention conduit en minicellules d'E. coli à une protéine ayant une masse moléculaire apparente de 51.000 daltons, estimée par électrophorèse en gel de polyacrylamide.
Cette estimation est en accord avec la masse moléculaire de 48118 daltons déduite de la séquence nucléotidique du gène ereB. Cette protéine contient 419 acides aminés dont la séquence est présentée ci-après
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L'étude de l'érythromycine modifiée sous l'action de cette protéine, montre qu'il s'agit d'une estérase d'érythromycine.
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L'étude de l'érythromycine modifiée sous l'action de cette protéine, montre qu'il s'agit d'une estérase d'érythromycine.
La comparaison des séquences d'acides aminés de cette enzyme appelée estérase d'érythromycine de type II et celle codée par le gène ereA ne révèle pas d'homologie statistiquement significative.
L'invention vise également les vecteurs recombinants, notamment les plasmides hybrides comportant au moins une partie du gène ereB codant pour l'estérase d'erythromycine de type 11.
De tels plasmides comprennent :
- le plasmide pAT70 tel qu'obtenu par insertion dans pBR329 du fragment de 3,8kb récupéré lors de la digestion de pIP1527 par BamHI,
- le plasmide pAT72 tel qu'obtenu par insertion dans le site BamHI de pUC8 du fragment de 1,9kb récupéré lors de la digestion partielle de pAT70 par
Sau3A.
- le plasmide pAT70 tel qu'obtenu par insertion dans pBR329 du fragment de 3,8kb récupéré lors de la digestion de pIP1527 par BamHI,
- le plasmide pAT72 tel qu'obtenu par insertion dans le site BamHI de pUC8 du fragment de 1,9kb récupéré lors de la digestion partielle de pAT70 par
Sau3A.
- le plasmide pAT76 tel qu'obtenu par digestion partielle de pAT72 avec EcoRI et PstI, récupération d'un fragment de 838 paires de base, purification et clonage dans pUC8.
L'invention vise en outre en tant qu'intermédiaires, les souches bactériennes modifiées, ou transformants, caractérisées par la présence d'au moins une partie du gène ereB.
Ces transformants sont caractérisés en ce qu'ils expriment la résistance à Em et sont capables de l'inactiver ou contiennent une partie du gène ereB.
Conformément à l'invention, l'obtention de la séquence codant pour une protéine capable d'inactiver l'érythromycine comprend
- le clonage d'un fragment d'ADN de restriction BamHI de 3,8kb du plasmide naturel pIP1527 dans le site BamHI du plasmide pBR329, conduisant à la construction du plasmide pAT70,
- la digestion partielle avec l'endonucléase de restriction Sau3A de l'ADN du plasmide pAT70 et la récupération d'une insertion de 1,9kob.
- le clonage d'un fragment d'ADN de restriction BamHI de 3,8kb du plasmide naturel pIP1527 dans le site BamHI du plasmide pBR329, conduisant à la construction du plasmide pAT70,
- la digestion partielle avec l'endonucléase de restriction Sau3A de l'ADN du plasmide pAT70 et la récupération d'une insertion de 1,9kob.
L'insertion de 1,9kb est purifiée selon les techniques classiques.
L'invention vise en outre les applications biochimiques d'au moins une partie de la séquence du gène ereB définie ci-dessus.
Ces applications comprennent l'élaboration de sondes pour la détection de la résistance à Eut dans les bactéries.
Des sondes appropriées pour ce type de détection sont avantageusement marquées par un élément radioactif ou tout autre groupe permettant sa reconnaissance à l'état hybridé avec la préparation renfermant l'ADN à étudier.
Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique renfermant des bactéries, ou directement avec ces bactéries ou leurs acides nucléiques, dans des conditions autorisant l'hybridation éventuelle de la séquence nucléotidique de la sonde avec une séquence complémentaire, éventuellement contenue dans le produit testé.
La distribution du gène ereB a été étudiée par hybridation sur colonie chez des souches d'entérobactéries.
Des résultats reproductibles ont été obtenus en utilisant comme sonde intragénique, le fragment d'ADN de 838 pb délimité par les sites de restriction EcoRI en position 530 et PstI en position 1368.
Ce fragment intragénique est avantageusement utilisé comme sonde pour l'étude de la dissémination de la résistance à Em.
L'invention vise également les applications immunologiques de la protéine codée, plus spécialement pour l'élaboration d'antisérum spécifique ainsi que d'anticorps spécifiques, en particulier d'anticorps monoclonaux. Ces anticorps sont formés selon les techniques classiques par injection de la protéine à des animaux, récupération des antisérums, puis des anticorps à partir des antisérums par exemple par chromatographie d'affinité.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention sont rapportés dans la description qui suit concernant le clonage du gène ereB chez E. coli, la détermination de sa séquence nucléotidique et l'analyse des produits d'expression. Dans cette description, il sera fait référence aux figures 1 et 2.
- la figure 1 représentant la structure de l'érythromycine modifiée sous l'action de l'estérase de type I codée par le gène ereA ou celle de l'estérase de type II codée par le gène ereB, - les figures 2a, 2b et 2c, respectivement la carte de restriction de pAT70 et pAT72, la détermination de la séquence par la technique de terminaison de chaine et la purification du fragment AccI-SmaI de 1,9 kb par digestion et clonage.
EXEMPLE 1
MATERIELS ET METHODES a/ Souches de bactéries, bactériophages et plasmides
Les fragments d'ADN à séquencer sont transfectés dans E.coli JM101 (1) en utilisant les vecteurs bactériophages M13mp8 ét M13mp9 (2).
MATERIELS ET METHODES a/ Souches de bactéries, bactériophages et plasmides
Les fragments d'ADN à séquencer sont transfectés dans E.coli JM101 (1) en utilisant les vecteurs bactériophages M13mp8 ét M13mp9 (2).
Les plasmides recombinants sont introduits dans la souche E.coli BM694 (3) par transformation.
Les sources et les propriétés des plasmides utilisés sont rapportées dans le tableau 1.
Plasmide Caracteres phénotypiques Origine
ou génotypiques (a) pAT63 (4) Tra Mob ereA Apa pBR322n[pIP1100
partielle
Sau3A(ereA)
1,66kb] pAT70 (5) Tra Mob ereB Ap Cm pBR329# [pIP1527 BHI
(ereB)-3,8kb] pAT72 (5) Tra Mob ereB Ap pUC8#[pAT70
partielle
Sau3A(ereB)
1906 pb] pUC8 (6) Tra Mob Ap construction
in vitro pAT76 Tra Mob Ap pUC8 (pAT72
EcoRI-PstI-838pb) (a) la nomenclature des caractères phénotypiques des plasmides est donnée selon R. Novick et al (7).
ou génotypiques (a) pAT63 (4) Tra Mob ereA Apa pBR322n[pIP1100
partielle
Sau3A(ereA)
1,66kb] pAT70 (5) Tra Mob ereB Ap Cm pBR329# [pIP1527 BHI
(ereB)-3,8kb] pAT72 (5) Tra Mob ereB Ap pUC8#[pAT70
partielle
Sau3A(ereB)
1906 pb] pUC8 (6) Tra Mob Ap construction
in vitro pAT76 Tra Mob Ap pUC8 (pAT72
EcoRI-PstI-838pb) (a) la nomenclature des caractères phénotypiques des plasmides est donnée selon R. Novick et al (7).
b/ Milieux.
On utilise un bouillon d'une infusion coeurcerveau et de l'agar Pasteur Diagnostics. On réalise les tests de sensibilité sur de l'agar Mueller-Hinton.
Toutes les incubations sont effectuées à 37'C.
ci Inactivation de l'érythromycine par des cellules au repos.
On inactive l'érythromycine à l'aide de cellules au repos de E.coli BM694/pAT63 (ereA) ou BM694/ pAT72 dans un tampon phosphate O,1M pH 7,0 (8).
d/ Préparation de l'ADN.
L'isolement à grande echelle d'ADN de pBR329 pUC8 et d'ADN de plasmides dérivés est effectué comme décrit dans (9).
e/ Electrophorèse et purification de fragments de restriction d'ADN.
Les fragments d'ADN de restriction sont séparés par électrophorèse sur plaques de gel horizontales (20 x 15 x 0,7cmj contenant 0,8% d'agarose se gélifiant à basse température du type VII (Sigma).
Les fragments d'ADN sont purifiés comme décrit dans (10).
e/ Séquençage de l'ADN.
Les fragments de restriction d'ADN sont clonés dans les bactériophages Mi3mp8 et M13mp9 et séquencés par la technique de terminaison de chaîne (11). La séquence complète d'ADN est déterminée en utilisant les programmes d'ordinateurs DBCOMP et DBUTIL (12).
EXEMPLE 2 1/ Structure de l'érvthromvcine modifiée.
Les résultats des différentes déterminations physico-chimiques concernant l'érythromycine modifiée par l'estérase de type I ou celle de type II sont en accord avec la structure représentée sur la figure 1.
2/ Séquence nucléotidique de l'insertion dans PAT72.
Le plasmide pAT70 est constitué par un fragment d'ADN BamHI (3,8kb) du plasmide naturel pIP1527 conférant une résistance à l'érythromycine lorsqu'il est cloné dans pBR329. Le gène ereB est sous-cloné au site de restriction BamHI du plasmide pUC8 comme partie d'un fragment de digestion partielle Sau3A de 1,9kb de l'ADN d'insertion dans pAT70. L'hybride résultant pAT72 ne possède pas de site de restriction BamHI comme le montre l'examen de la figure 2a, qui représente une carte de restriction des 2 plasmides pAT70 et pAT72.
Le fragment BamHI de 3,8kb du plasmide pAT70 est purifié, digéré indépendamment avec l'endonucléase de restriction BalII, ClaI, EcoRI, HindIII ou PstI. Les fragments d'ADN résultants sont clonés dans les formes réplicatives de M13mp8 ou M13mp9 et dans pUC8.
Après clonage dans pUCB, il apparaît qu'aucun de ces fragments de restriction n'exprime de résistance à Em. Les données relatives à la séquence nucléotidique sont obtenues par la technique de terminaison de chaîne et sont representées sur la figure 2b.
Afin de compléter la séquence nucléotidique du gène ereB, le fragment AccI-SmaI de i,9kb du plasmide pAT72 est purifié, digéré par les diverses endonucléases énumérées sur la figure 2c et cloné dans les formes réplicatives de M13mp8 ou M13mp9. Dans chaque expérience, les clones spécifiques sont identifiés par la méthode de screening de dideoxy-T et séquencés par la technique de terminaison de chaîne. La séquence nucléotidique entière du fragment de 1906 pb de pAT72 a été représentée cidessus.
3/ Identification du Qène codant Dour l'estérase d'érv- thromvcine.
La localisation des codons d'initiation (ATG,
GTG) et de terminaison (TAG, TGA, TAA) dans les 3 cadres de lecture ouvert a révélé une seule phase de lecture ouverte (PLO) pour l'estérase. Cette PLO de 1257 pb s'étend du codon ATG en position 383 au codon de terminaison TAA en position 1640. Ce premier codon TAA est suivie d'un deuxième codon de terminaison de la traduction TGA en position- 1643. On localise une séquence ressemblant au site de fixation au-ribosome 6 bases en amont (voir séquence nucléotidique donnée cidessus).
GTG) et de terminaison (TAG, TGA, TAA) dans les 3 cadres de lecture ouvert a révélé une seule phase de lecture ouverte (PLO) pour l'estérase. Cette PLO de 1257 pb s'étend du codon ATG en position 383 au codon de terminaison TAA en position 1640. Ce premier codon TAA est suivie d'un deuxième codon de terminaison de la traduction TGA en position- 1643. On localise une séquence ressemblant au site de fixation au-ribosome 6 bases en amont (voir séquence nucléotidique donnée cidessus).
Cette séquence ACAGGAGG possède une complé- mentarité pour 6 des 8 bases (partie soulignée) avec l'extrémité 3'-OH de 1'ARN ribosomalel5S (3'OH
AUUCCUCC5') de E.coli.
AUUCCUCC5') de E.coli.
La séquence nucléotidique qui s'étend du codon
ATG en position 383 au codon TAA en position 1640 est capable de coder pour une protéine de 419 acides aminés avec un M calculé sur la base de la composition en acides aminés de 48.118.
ATG en position 383 au codon TAA en position 1640 est capable de coder pour une protéine de 419 acides aminés avec un M calculé sur la base de la composition en acides aminés de 48.118.
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Antimicrob. Agents Chemother. 29, 515-518.
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9. Davis, R.W., Botstein, D. et Roth, J.R. (1980) in
Advanced Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor
Laboraty, Ed., pp. 116-119, Cold Spring Harbor, New
York.
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10. Maniatis, T., Fritsch, E.F. et Sambrook, J. (1982)
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Spring Harbor laboratory, Ed., p. 170, Cold Spring
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11. Sanger, F., Nicklen, S. et Coulson, A.R. (1977)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.
Claims (10)
1/ Fragment d'ADN caractérisé en ce qu'il comprend au moins une partie du gène ereB, codant pour une protéine capable d'inactiver l'érythromycine, ce gène étant inclus dans la séquence nucléotidique suivante :
GATCGTAAAG CGTATTCTAC GGCAATATGG CTACCCA@@@ SATATGCAAA TGCTGGCCAC 60 G@AAACCGTT CTCAAGCAAG CAGAATTAA@ TGCTGAGGAA TTGACCCATG AGAATTAATC 120
GGAAAACCGC CTACGCACGT CCATGTGCTC TGGCAGAACA GGGGCGAGGT TAAGAAATGA 180
AGACAAAAAC CAAAGAGGCA CTCTGCCCAT CGCACAAG@@ CGGCTATATG GCTACGCTTC 240
CGTCCGCCCA AATTGGCTTC CTTCGGTCGC CAACTTCGGG TACTCGCGCA ACGTTGGGTG @@@
CAATTAGCCC GCGGGGAGCA TTGGCTTTAA GAGCTGCGCA TCGTGCAGCA AAGAAATTGG @@@
CAATAGCCC GCGCCA TTG3CIITAA GAGCTGCGCA TCGTYSCACA ANGAATTSG
TTC AAA CTG AAT CAC CCT GAT GAT AAT TAC GAT GAT TTT AAG CCA TTA AGA AAA ATA ATT 42@
GGA GAT AAC CGA GTT GTA GCA TTA GGT GAA AAT TCT CAT TTC ATA AAA GAA TTC TTT TTG 541
TTA CGA CAT AGT CTT TTG CGT TTT TTT ATC GAA GAT CTA GGT TTT ACT ACG TTT GCT TTT 601
GAA TTT GGT TTT GCT GAG GGT CAA ATC ATC AAT AAC TGG ATA CAT GGA CAA GGA @CT GAC 66@
GAT GAA ATA GGC AGA TTC TTA AAA CAC TTC TAT TAT CCA GAA GAG CTC AAA ACC ACA TTT 721
CTA TGG CTA AGG GAG TAC ACT AAA GCA GCA AAA GAA AAA ATC ACA TTT CTT GGC ATT GAT 781
ATA CCC AGA AAT GGA GGT TCA TAT TTA CCA AAT ATG GAG ATA GTG CAT GAC TTT TTT AGA 841
ACA GCG GAT AAA GAA GCA CTA CAC ATT ATC GAT GAT GCA TTT AAT ATT GCA AAA AAG ATT 90@
GAT TAC TTC TCC ACA TCA CAG GCA GCC TTA AAT TTA CAT GAG CTA ACA GAT TCT GAG AAA 901
TGC CGT TTA ACT AGC CAA TTA GCT CGA GTA AAA GTT CGC CTT GAA GCT ATG GC@ CCA ATT 1021
CAC ATT GAA AAA TAT GGG ATT GAT AAA TAT GAG ACA ATT CTG CAT TAT GCC AAC GGT ATG 1081
ATA TAC TTG GAC TAT AAC ATT CAA GCT ATG TCG GGC TTT ATT TCA GGA GGC GGA ATG CAG 1141
GGC GAT ATG GGT GCA AAA GAC AAA TAC ATG GCA GAT TCT GTG CTG TGG CAT TTA AAA AAC 1201
CCA CAA AGT GAG CAG AAA GTG ATA GTA GTA GCA CAT AAT GCA CAT ATT CAA AAA ACA CCC 1261
ATT CTG TAT GAT GGA TTT CTA AGT TGC CTA CCA ATG GGC CAA AGA CTT AAA AAT GCC ATT 1321
GGT GAT GAT TAT ATG TCT TTA GGT ATT ACT TCT TAT AGT GGG CAT ACT GCA GCC CTC TAT 1@@@
CCG GAA GTT GAT ACA AAA TAT GGT TTT CGA GTT GAT AAC TTC CAA CTG CAG GAA CCA AAT 1441
GAA GGT TCT GTC GAG AAA GCT ATT TCT GGT TGT GGA GTT ACT AAT TCT TTT GTC TTT TTT 1501
AGA AAT ATT CCT GAA GAT TTA CAA TCC ATC CCG AAC ATG ATT CGA TTT GAT T@T ATT TAC 1@51
ATG AAA GCA GAA CTC GAG AAA GCT TTC GAT GGA ATA TTT CAA ATT GAA AAG T@@ TCT GTA 15@@
TCT GAG GTC GTT TAT GAA TAA TGA AATAG CCAGTATAAC @@@@@@AAAG ATCTCCA@@@@ 155@
ATGGCGAGAG AAGCCAATGC GAG@GCGGGC TAACAGACGC GCGTATAGGA AGTTCAAACG 1740
CCCTTTTCGG GCAGTCTGCT GGGTAGGCGG CGGTCGCGCA AGCCCG@TTT TGGGCACGGA 19@0
TCGGACGTCT GTGAGTGGGA TTTCGGCATC GCGGGGCCAC GCAGCGGGGT TGTCAGCAGC 19@@
CATGCTTCGC TGATTCCCGA CAGCGGGCCG AGCGCGCCT@ CGGATC 1@@@ 2/ Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est présent dans le plasmide naturel pIP1527 chez E.coli.
3t Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est porté par un fragment d'ADN de restriction de 3,8kb environ, tel qu'obtenu par digestion à l'aide de l'endonucléase de restriction BamEI à partir du plasmide naturel pIP1527.
4/ Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est contenu dans l'insertion de 1,9kb obtenus à partir du fragment de restriction de 3,8kb cloné dans le site BamHI du plasmide pBR329, par digestion partielle par Sau 3A du pBR329 avec l'insertion de 3,8kb.
5/ Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par le gène ereB et renferme une teneur en guanosine + cytosine inférieure à celle du génome de E. coli.
6/ Fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine ayant une masse moléculaire de 51.000 daltons environ, capable d'hydrolyser le cycie lactone de
Em et de Om.
7/ Fragment d'ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il code pour une estérase diérythro- mycine de masse moléculaire de 48118 daltons, répondant à la séquence
MET ARG PHE GLU GLU TRP VAL LYS ASP LYS HIS ILE PRO
421
PHE LYS ILE ASN HIS PRO ASP ASP ASN TY@ ASP AS@ PHE LYS PRO LEU A@G LYS ILE ILE
451
GLY ASP THR ARG VAL VAL ALA LEU GLY GLU ASN SER HIS PHE ILE LYS GLU PHE PHE LEU
541
LEU ARG HIS THR LEU LEU ARG PHE PHE ILE GLU ASP LEU GLY PHE THR THR PHE ALA PHE
601
GLU PHE GLU PHE ALA GLU GLY GLN ILE ILE ASN ASN TRP ILE HIS GLU GLN GLY TH@ AS@
661 AS@ GLU ILE GLY ARG PHE LEU LYS HIS PHE TYR THR PRO GLU G@@ LEU LYS THR THR PHE
721
LEU TRP LEU ARG GLU TY@ ASN LYS ALA ALA LYS GLU LYS ILE THR PHE LEU GL@ ILE AS@
781
ILE PRO AR@ ASN GLY GLU SER TYR LEU PRO ASN MET GLU ILE VAL HIS ASP PHE PHE ARG 8@@ TH@ ALA ASF LYS GLU ALA LEU HIS ILE ILE ASP ASF ALA PHE ASN ILE ALA LYS LYS ILE @@@ AS@ TYR PHE SER THR SER GLN ALA ALA LEU ASN LEU HIS GLU LEU THR ASP SER GLU LYS
961
CYS ARG LEU THR SER GLN LEU ALA ARG VAL LYS VAL ARG LEU GLU ALA MET ALA PRO ILE
1021
HIS ILE GLU LYS TYR GLU ILE ASP LYS TYR GLU THR ILE LEU HIS TYR ALA ASN GLY MET
1091
ILE TYR L@@ ASP TYR ASN ILE GLN ALA MET SER GLY PHE ILE SER GLY GLY GLY MET GLN
1141
GLY ASP MET GLY ALA LYS ASP LYS TYR MET ALA AS@ SER VAL LEU TR@ HIS LEU LYS ASN 1@01
PRO GLN SEA G@@ GLN LYS VAL ILE VAL VAL ALA HIS ASN ALA HIS ILE GLN LYS THR PRO
1261
ILE LEU TYR ASP GLY PHE LEU SER CYS LEU PRO MET GLY GLN @@@ LEU LYS ASN ALA ILE
1321
GLY ASP ASP TY@ MET SER LEU GLY ILE THR SER TYR SER GLY HIS THR ALA ALA LEU TYR
1791
PRO GLU VAL AS@ THR LYS TYR GLY PHE ARG VAL AS@ ASN PHE GLN LEU GLN GLU PRO ASN
1441
GLY GLY SER VAL GLU LYS ALA ILE SER GLY CYS GLY VAL THR ASN SER PHE VAL PHE PHE
1501
ARG ASN ILE PRO GLU AS@ LEU GLN SES ILE PRO ASN MET ILE ARG PHE AS@ SE@ ILE TYS
1561
MET LYS ALA GLU LEU GLU LYS ALA PHE AS@ GLY ILE PHE GLN ILE G@@ @YS SE@ SE@ VAL 1@21
SER GLU VAL VAL TYR GLU
8/ Vecteurs recombinants comportant au moins une partie du gène ereB codant pour l'estérase d'érythromycine.
9/ Souches bactériennes modifiées, caractérisées en ce qu'après transformation elles comportent dans leur génone au moins une partie du gène ereB.
10/ Procédé d'obtention d'un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend
- le clonage d'un fragment dlADN de restriction BamI de 3,8kb du plasmide naturel pIP1527 dans le site Dam; du plasmide pBR329, conduisant à la construction du plasmide pAT 70,
- la digestion partielle avec l'endonucléase de restriction Sau3A de l'ADN du plasmide pAT70 et la récupération d'une insertion de 1,9kb, suivie de sa purification selon les techniques classiques.
11/ Application d'un -fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, plus spécialement d'une séquence intragénique du gène ereB pour llélabo- ration de sondes de détection de la résistance à lléry- thromycine.
12/ Application selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'on utilise comme sonde intragénique, le fragment d'ADN de 838 pb délimité par les sites de restriction EcoRI en position 530 et PstI en position 1368.
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|---|---|---|---|
| FR8608405A FR2599743B1 (fr) | 1986-06-10 | 1986-06-10 | Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un gene de resistance a l'erythromycine, son procede d'obtention et ses applications biochimiques |
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| FR8608405A FR2599743B1 (fr) | 1986-06-10 | 1986-06-10 | Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un gene de resistance a l'erythromycine, son procede d'obtention et ses applications biochimiques |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2599743A1 true FR2599743A1 (fr) | 1987-12-11 |
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| Country | Link |
|---|---|
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