FR2602794A1 - Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un gene de resistance a la tetracycline, son procede d'obtention et ses applications biochimiques - Google Patents
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Abstract
LE FRAGMENT D'ADN COMPREND AU MOINS UNE PARTIE DU GENE TETM, CE GENE CODANT POUR UNE PROTEINE DE RESISTANCE A LA TETRACYCLINE.
Description
FRAGMENT D'ADN COMPRENANT AU MOINS UNE PARTIE
D'UN GENE DE RESISTANCE A LA TETRACYCLINE,
SON PROCEDE D'OBTENTION ET SES APPLICATIONS BIOCHIMIQUES
L'invention est relative à un fragment d'ADN comprenant au moins une partie d'un gene de résistance à la tétracycline et à son procédé d'obtention.
D'UN GENE DE RESISTANCE A LA TETRACYCLINE,
SON PROCEDE D'OBTENTION ET SES APPLICATIONS BIOCHIMIQUES
L'invention est relative à un fragment d'ADN comprenant au moins une partie d'un gene de résistance à la tétracycline et à son procédé d'obtention.
Elle vise également ses applications biochimiques, en particulier pour la détection de résistance à la tétracycline dans des cultures cellulaires, notamment bactériennes.
Le problème de la détection d'une résistance bactérienne aux antibiotiques est bien connu. I1 se pose de plus en plus en clinique humaine en raison des résistances acquises par les bactéries en nombre de plus en plus important à des antibiotiques déterminés.
I1 s'avère donc nécessaire de subordonrer toute thérapie avec un antibiotique déterminé à un test de détection préalable de l'existence, chez la bactérie infectant le patient à traiter, d'une résistance éventuelle à cet antibiotique. Dans le cas d'une réponse positive dans le test effectué, l'antibiotique concerné doit être écarté de toute prescription clinique.
On sait que la tétracycline ou Tc appartient à une famille d'antibiotiques à large spectre qui provoque l'arrêt de la synthèse des protéines en empêchant la liaison des ARN-t amino-acyle aux ribosomes (1). (Les références bibliographiques sont données à la fin de la description).
La résistance à la tétracycline correspond au déterminant de résistance le plus répandu parmi toutes les espèces de bactéries tant à Gram-négatif qu'à
Gram-positif.
Gram-positif.
Chez les bactéries à Gram-négatif, en particulier E.coli, on a défini par les méthodes d'hybridation ADN-ADN (2) au moins quatre classes génétiquement différentes de déterminants de résistance à la téra- cycline TcR, à savoir : (tetA, tetB, tetC et tetD).
Ces déterminants sont portés par des plasmides ou par des transposons et présentent les propriétés suivantes (i) La résistance à la tétracycline peut être induite par des concentrations sub-inhibitrices de tétracycline (1).
(ii) Le mécanisme de résistance n'entraine pas de modification de l'antibiotique mais son reflux actif à l'extérieur de la cellule (3).
Chez les bactéries à Gram-positif, en particulier dans les streptocoques, trois déterminants distincts ont été identifiés à savoir : (tetL, tetM et tetN (4).
Aucun de ces déterminants ne présente d'homologie avec l'une des classes de déterminants des Gramnégatifs décrits ci-dessus.
En étudiant une souche de Streptococcus, les inventeurs ont isolé un transposon navette conjugatif portant un déterminant de résistance à Tc, localisé puis cloné et séquencé le gène de résistance à Tc.
Les développements de ces travaux ont permis de mettre en évidence qu'en utilisant une partie au moins de cette séquence génique, il est possible de détecter de manière fiable la présence d'un gène de résistance à Tc dans des cultures cellulaires notamment bactériennes.
L'invention a donc pour but de fournir un nouveau fragment d'ADN comportant au moins une partie d'une séquence génique capable de conférer des propriétés de résistance à Tc à un microorganisme, plus spécialement à une bactérie.
Elle vise également à fournir un procédé d'obtention de ce fragment d'ADN par clonage dans une bactérie.
L'invention vise, en outre, les applications biochimiques de ce nouveau fragment 'ADN, en-paxticu- lier pour l'élaboration de sondes pour la détection de bactéries résistant à Tc. L'invention vise également à fournir la protéine correspondant à la séquence nucléotidique du fragment considéré et les anticorps, plus spécialement les anticorps monoclonaux-capables de reconnaitre spécifiquement cette protéine.
Le fragment d'ADN de l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une partie du gène tetM codant pour une protéine capable de conférer une résistance à la tétracycline, le gène tetM étant inclus dans la séquence nucléotidique suivante
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L'expression "au moins une partie du gène tetM" désigne toute séquence nucléotidique dont la structure correspond à une partie de ce gène, présentant une longueur suffisante pour reconnaître spécifiquemént ce gène dans un prélèvement à l'étude, dans des essais d'hybridation mettant en jeu cette séquence en tant que sonde. Cette expression désigne également toute séquence nucléotidique hybridable avec la précédente, telle qu' obtenue par transcription enzymatique inverse de l'ARN correspondant ou encore par synthèse chimique.
Il va de soi que les bases de la séquence nucléoditique considérée peuvent être dans un ordre différent de celui trouvé dans les gènes et/ ou que ces bases peuvent être le cas échéant substituées, dès lors qu'une sonde élaborée à partir d'une telle séquence donne une réponse caractéristique et non équivoque quant à la capacité de reconnaître la présence du gène tetM.
La séquence codante du gène tetM est caractérisée en ce qu'elle est définie par le codon d'initiation ATG en position 131 et le codon de terminaison
TAG en position 2047 dans une phase de lecture ouverte (ou PLO en abrégé) de 1917 paires de base.
TAG en position 2047 dans une phase de lecture ouverte (ou PLO en abrégé) de 1917 paires de base.
Selon un autre aspect, la séquence du gène tetM est caractérisée en ce qu'elle est présente dans le transposon navette conjugatif Tn1545 du plasmide pIP804 présent dans la souche de Streotococcus faecalis BM4127, à laquelle il confère un haut niveau de résistance à Tc.
Cette souche a été déposée le 24 Juillet 1986 sous le n I 582 à la Collection Nationale de
Cultures de Microorganismes (C.N.C.M).
Cultures de Microorganismes (C.N.C.M).
Le gène tetM est également caractérisé en ce qu'il est porté par un fragment d'ADN de restriction HincII - HincII de 4 kb environ tel qu'obtenu par digestion par fiiiiclI d'un mélange de plasmides pIP804 et pAT181, ce dernier étant construit par délétion in vitro des fragments BamHI - AvaI de pAT95 (pBR322 ;t Km).
Ce fragment de 4 kb environ contient des sites uniques HindIII, ClaI, SacI et KDnI.
L'expression de la séquence nucléotidique du déterminant de résistance à Tc selon l'invention, dans des minicellules d'E.coli selon les techniques habituelles conduit à une protéine TETM ayant une masse moléculaire apparente M de l'ordre de 68.000 daltons, telle que déterminée par électrophorèse sur gel de PLOyacrylamide -SDS.
Il apparaît que cette protéine ne présente pas d'homologie structurale avec les determinants de résistance à Tc des Gram-négatifs (tetA, tetB, tetC) ou de Bacillus et de StaPhvlococcus.
L'estimation de 68.000 daltons de M est en accord avec la Mr de 72.500 daltons déduite de la séquence nucléotidique de la PLO de 1917 pb ci-dessus.
La séquence correspondante d'acides aminés est la suivante
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La protéine TETM est caractérisé par une hydropathie d'environ -0,21 ce qui contraste fortement avec les hydropathies calculées pour les autres protéines TET qui sont nettement hydrophobes (valeurs de 0,76 à 0,93).
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La protéine TETM est caractérisé par une hydropathie d'environ -0,21 ce qui contraste fortement avec les hydropathies calculées pour les autres protéines TET qui sont nettement hydrophobes (valeurs de 0,76 à 0,93).
L'invention vise également les ADN recombinants contenant les fragments d'ADN ci-dessus recombinés avec des fragments hétérologues,ainsi que les vecteurs recombinants, notamment les plasmides hybrides comportant au moins une partie du gène tetM.
De tels plasmides comprennent le plasmide pAT183 tel qu'obtenu par introduction d'un fragment de 4 kb environ HincII-HincII dans le site unique HincII de pAT181, clivage par PvuI du plasmide pAT182 résultant, suivi d'une digestion par BAL31.
L'invention vise en outre, en tant qu'intermédiaires, les souches bactériennes modifiées, ou transformants, caractérisées par l'insertion dans leur génome d'au moins une partie d'un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus.
Conformément à l'invention, le séquençage du déterminant de résistance à Tc comprend - l'introduction du fragment de 4kb Hincîl-Hincil dans le site unique HincII de pAT181, ce qui conduit au plasmide recombinant pAT182, - le sous-clonage du gène tetM par clivage par PvuI, suivi d'une digestion par l'exonucléase BAL-31, ce qui conduit au plasmide recombinant DAT183, et - le séquençage d'un fragment de 2094 pb contenu dans l'insertion de 2,9kb environ HincII-BAL-31 capable de conférer la résistance à la tétracycline.
La séquence codante est avantageusement purifiée puis le fragment HincII-HaeIII de 3 kb environ est soumis à une digestion par diverses endonucléases de restriction. On effectue le clonage des fragments obtenus dans des formes réplicatives appropriées deM13mpl0,
M13mp18 et M13mp19. La séquence nucléotidique du déterminant est alors déterminée selon les techniques haBi- tuelles à partir des fragments obtenus.
M13mp18 et M13mp19. La séquence nucléotidique du déterminant est alors déterminée selon les techniques haBi- tuelles à partir des fragments obtenus.
L'invention vise également les applications biochimiques d'au moins une partie de la séquence du gène tetM définie ci-dessus.
Ces applications comprennent l'élaboration de sondes pour la détection de la résistance à Tc dans les bactéries.
Des sondes appropriées pour ce type de détection sont avantageusement marquées par un élément radio-actif ou tout autre groupe permettant sa reconnaissance à l'état hybridé avec la préparation renfermant l'ADN à étudier.
Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique renfermant des bactéries, ou directement avec ces bactéries ou leurs acides nucléiques, dans des conditions autorisant l'hybridation éventuelle de la séquence nucléotidique de la sonde avec une séquence complémentaire, éventuellement contenue dans le produit testé.
La distribution du gène tetM a été étudiée par hybridation sur colonie chez des souches de cocci à
Gram-positif, streptocoques, staphylocoques et chez
Campylobacter.
Gram-positif, streptocoques, staphylocoques et chez
Campylobacter.
Des résultats reproductibles ont été obtenus en utilisant comme sonde intragénique, un fragment d'ADN comportant 850pb nucléotides délimité par les sites de restriction en position iinaIII - ClaI.
Les fragments intragéniques sont avantageusement utilisables comme sondes pour l'étude de la dissémination de la résistance à Tc. Les hybridations avec l'ADN d'autres cocci à Gram-positif permettent d'étudier la variabilité de la résistance.
L'invention vise également les applications immunologiques de la protéine codée, plus spécialement pour l'élaboration -d'antisérum spécifique ainsi que d'anticorps polyclonaux et monoclonaux. Les anticorps polyclonaux sont formés selon les techniques classiques par injection de la protéine à des animaux, récupération des antisérums, puis des anticorps à partir des antisérums par exemple par chromatographie d'affinité.
D'autres avantages et caractéristiques de 1 'invention sont rapportés dans la description qui suit concernant le clonage du gène tetM chez n.coli, la détermination de sa séquence nucléotidique et l'analyse des produits d'expression. Dans cette description, il sera fait référence aux figures 1 à 4, - la figure 1, représentant une carte de restriction simplifiée d'un fragment de 4 kb HincII--HincII portant le gène tetM et la stratégie de séquençage utilisée pour déterminer sa séquence nucléotidique, - la figure 2, la séquence nucléotidique du gène tetM, - la figure 3, les codons de terminaison du fragment d'ADN de 2094 pb contenant le gène tetM pour les trois phases ouverts de lecture sur les deux brins d'ADN, - la figure 4, les résultats de l'analyse des protéines codées par les plasmides recombinants pAT183 et ses dérivés dans la souche d'.coli AR 1062 produisant des minicellules, et - la figure 5, les résultats d'études épidémiologiques effectuées avec différentes sondes.
MATERIELS ET METHODES a/ - Plasmides. souches de bactéries et de bactério Phases
Le transposon conjugatif Tnl545, est préparé à partir de la souche S. faecalis BM4127 qui héberge pIP804 (pIP964 :: Tn1545). Pour les expériences de clonage, on construit pAT181 (Tcs, Kmr, Apr) qui est un dérivé de pBR322 (pAT95 (28) # (BamHI-AyaI).
Le transposon conjugatif Tnl545, est préparé à partir de la souche S. faecalis BM4127 qui héberge pIP804 (pIP964 :: Tn1545). Pour les expériences de clonage, on construit pAT181 (Tcs, Kmr, Apr) qui est un dérivé de pBR322 (pAT95 (28) # (BamHI-AyaI).
La souche d' E.coli JM101 est transfectée avec les fragments d'ADN à séquencer en utilisant les bactériophages soit M13mp18, M13mp19, (9) soit
M13mp10 (10).
M13mp10 (10).
Les plasmides recombinants sont introduits par transformation (11) dans E.coli HB1Ol (12) et dans la souche AR1062 (13) produisant des minicellules. Comme concentration d'antibiotique pour la sélection des cellules, on utilise 100 pg/ml d'ampicilline, 20 pg/ml de kanamycine et 5 pg/ ml de tétracycline.
bl - Préparation de l'ADN nlasmidique
pIP804 est préparé selon (14) et des préparations à grande ou à petite échelle d'ADN plasmidique de E.coli sont effectuées respectivement selon (11) et (15).
pIP804 est préparé selon (14) et des préparations à grande ou à petite échelle d'ADN plasmidique de E.coli sont effectuées respectivement selon (11) et (15).
c/ - Analvse et Purification des fragments d'ADN
On analyse les fragments de restriction par électrophorèse sur plaques (10 x 10 x 0,7 cm) de gel d'agarose à 0,8% en utilisant un tampon Tris-Borate
EDTA. On récupère les fragments d'ADN à partir de gels par électrotransfert sur membrane de dialyse.
On analyse les fragments de restriction par électrophorèse sur plaques (10 x 10 x 0,7 cm) de gel d'agarose à 0,8% en utilisant un tampon Tris-Borate
EDTA. On récupère les fragments d'ADN à partir de gels par électrotransfert sur membrane de dialyse.
d/ - Séauencaae
Les fragments d'ADN clonés dans les bactériophages M13mp10, M13mp18 et M13mp19, sont séquencés selon la technique de terminaison de chaîne (16). On soumet les fragments d'ADN à une électrophorèse sur gel vertical de polyacrylamide à 8% (40 x 30 x-0,05 m), contenant 8M d'urée, puis on effectue des autoradiogrammes.
Les fragments d'ADN clonés dans les bactériophages M13mp10, M13mp18 et M13mp19, sont séquencés selon la technique de terminaison de chaîne (16). On soumet les fragments d'ADN à une électrophorèse sur gel vertical de polyacrylamide à 8% (40 x 30 x-0,05 m), contenant 8M d'urée, puis on effectue des autoradiogrammes.
e/ - Analvse des protéines Plasmidiques avec des minicellules
Les minicellules sont préparées, marquées avec de la 35S-méthionine lysées et les extraits soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS comme décrit dans (17).
Les minicellules sont préparées, marquées avec de la 35S-méthionine lysées et les extraits soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS comme décrit dans (17).
- Expériences d'hybridation
Les sondes sont marquées in vitro avec 32p et hybridées selon (19) à de l'ADN immobilisé sur des filtres de cellulose (11).
Les sondes sont marquées in vitro avec 32p et hybridées selon (19) à de l'ADN immobilisé sur des filtres de cellulose (11).
EXEMPLE 1
LOCALISATION ET CLONAGE DE LA REGION DE RESISTANCE A LA
TETRACYCLINE DE Tn1545.
LOCALISATION ET CLONAGE DE LA REGION DE RESISTANCE A LA
TETRACYCLINE DE Tn1545.
Le gène tetM a été localisé par hybridation avec pJ13 (18) dans un fragment de restriction HincII -HincII de 4 kb introduit dans le site unique HincII de pAT181 (la délétion du fragment BamHI-AvaI ayant éliminé le deuxième site HincII de pBR322).
Le plasmide recombinant résultant pAT182 confère la résistance à la tétracycline et à la
Kanamycine à E.coli.
Kanamycine à E.coli.
On rapporte sur la figure 1 une carte de restriction simplifiée du fragment HincII - HincII de 4 kb. L'examen de cette carte montre que ce fragment contient des sites uniques BindIII, ClaI, SacI et KPnI
Dans la partie supérieure, le plasmide pAT183 qui est un dérivé de pAT182 dont la taille a été réduite à environ 2kb (zone ombrée) par action de BAL31 après clivage au site PvuI. Le plasmide pAT182 a été construit en insérant le fragment de 4 kb HincII dans le site unique HincII du vecteur plasmidique pAT81, Le plasmide pAT181 est un dérivé TCS de pAT95 décrit dans (8).
Dans la partie supérieure, le plasmide pAT183 qui est un dérivé de pAT182 dont la taille a été réduite à environ 2kb (zone ombrée) par action de BAL31 après clivage au site PvuI. Le plasmide pAT182 a été construit en insérant le fragment de 4 kb HincII dans le site unique HincII du vecteur plasmidique pAT81, Le plasmide pAT181 est un dérivé TCS de pAT95 décrit dans (8).
On indique également sur cette figure la localisation et la direction de la transcription des gènes tetM et aDhA-3. Les délétions () effectuées in vitro sont numérotées de 1 à 4. #3 est indiqué par une barre ouverte.
Dans la partie inférieure, le fragment d'ADN Hindi - BAL31 de Tn1545 streptococcal est indiqué par une barre ouverte et le vecteur plasmidique pAT181 par une ligne continue. Le fragment séquencé recouvrant le gène tetM est indiqué par des flèches. Les flèches en pointillés indiquent la direction et l'étendue des régions séquencées.
Le plasmide recombinant ainsi obtenu pAT183 comprend une insertion d'ADN de 2,9 kb que l'on soumet à une étape de séquençage.
EXEMPLE 2
DETERMINATION DE LA SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DU GENE tetM
On soumet le fragment HincII-HaeIII de 3 kb environ de pAT183 à une opération de purification puis de digestion avec différentes endonucléases de restriction. On génère ainsi une banque de fragments d'ADN qui sont clonés dans des formes réplicatives de M13 mi10, M13mp18 et M13mp19, coupées de maniere appropriée.
DETERMINATION DE LA SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DU GENE tetM
On soumet le fragment HincII-HaeIII de 3 kb environ de pAT183 à une opération de purification puis de digestion avec différentes endonucléases de restriction. On génère ainsi une banque de fragments d'ADN qui sont clonés dans des formes réplicatives de M13 mi10, M13mp18 et M13mp19, coupées de maniere appropriée.
On a déterminé la séquence de l'insertion complète, selon la stratégie donnée sur la figure 1, en utilisant la banque des fragments obtenus.
Sur la figure 2, on a représenté la structure primaire obtenue par analyse sur ordinateur d'un fragment de 2094 pb recouvrant le gène tetM::Tn 1545.
La localisation des codons d'initiation (ATG, GTG, TTG) et de terminaison (TAG, TGA, TAA) dans les trois phases de lecture sur chaque brin d'ADN séquencé a révélé l'existence d'une seule phase de lecture ouverte de 1917 pb, s'étendant du codon ATG en position 131 au codon TAG en position 2047 (voir la figure 3).
Le site de fixation au ribosome (SFR) supposé est encadré. Il est situé 8 pb avant le codon d'initiation ATG.(partie entourée).
L'examen de la séquence d'ADN précèdant immédiatement le codon d'initiation, révèle une séquence
Shine- Dalgarno (TGAATGGAGG, résidus 113 - 122). Cette séquence possède une complémentarité pour 8 des 10 bases avec l'extrémité 3'-OH de l'ÂRN-r 16S de Bacillus subtilis et présente les caractéristiques typiques d'un site de liaison au ribosome de Gram-positif.
Shine- Dalgarno (TGAATGGAGG, résidus 113 - 122). Cette séquence possède une complémentarité pour 8 des 10 bases avec l'extrémité 3'-OH de l'ÂRN-r 16S de Bacillus subtilis et présente les caractéristiques typiques d'un site de liaison au ribosome de Gram-positif.
Sur la figure 2, on a souligné les deux séquences répétées de 21 pb, les flèches indiquant le début et la fin du gène tetM. La séquence de pBR322 est encadrée.
Le fragment de 1917 pb code pour la protéine
TETM de masse moléculaire apparente M de 72500 daltons dont la séquence déduite de la séquence nucléotidique est également donnée sur la figure 2 au-dessus des codons respectifs.
TETM de masse moléculaire apparente M de 72500 daltons dont la séquence déduite de la séquence nucléotidique est également donnée sur la figure 2 au-dessus des codons respectifs.
D'après l'étude de l'hydropatie, la protéine
TETM est plutôt hydrophile, ce qui suggère qu'il ne s' agit pas d'une protéine membranaire.
TETM est plutôt hydrophile, ce qui suggère qu'il ne s' agit pas d'une protéine membranaire.
Sur la figure 3, on a représenté les codons de terminaison du fragment d'ADN de 2094 pb contenant le gène tetM pour les trois phases de lecture ouverte sur les deux brins d'ADN.
La numérotation débute à la première paire de base séquencée. Le cadre hachuré correspond au gène tetM dont le sens de transcription est indiqué par la flèche.
La figure 4 représente les résultats de l'analyse des protéines codées par les plasmides recombinants pAT183 et ses dérivés dans la souche & coli AR1062 produisant des minicellules
Les polypeptides marquées par de la [35S]-méthionine, synthétisés dans les minicellules, ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS et visualisés par autoradiographie.
Les polypeptides marquées par de la [35S]-méthionine, synthétisés dans les minicellules, ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS et visualisés par autoradiographie.
La migration des protéines standards et leur masse moléculaire M respective, sont indiquées sur la gauche ainsi que l'échelle de Mr déduite.
La protéine de 29,2 kd, APH (3'), spécifique pour la résistance à la kanamycine, apparaît dans chaque échantillon analysé.
La protéine de résistance à Tc (1 ou TETM) présentant une M apparente de 68 kd n'est que détectable que dans la piste de pAT183. Une série de trois autres polypeptides de 32,5 à 35 kd (numérotés 2,3 et 4) sont également produites par pAT183 et pAT183 @ indIII mais non par pAT181. On obtient une version tronquée de ces quatre polypeptides avec le plasmide pAT183 KPnI.
EXEMPLE 3
INACTIVATION PAR LES ION IN VITRO DU GENE tetM ET ANALYSE
PAR MINICELLULES.
INACTIVATION PAR LES ION IN VITRO DU GENE tetM ET ANALYSE
PAR MINICELLULES.
On a confirmé l'étendue du gène tetM en construisant des dérivés du plasmide pAT183 et en examinant les protéines codées par ceux-ci dans des minicellules. On a construit par digestion, remplissage et ligation les plasmides suivants : pAT183 #(HindIII), pAT183(Sac I), pAT183#(Kpn I) et pAT183A(Sac I - KPn
I).
I).
Ces plasmides ainsi que pAT181 et pAT183 ont été introduits par transformation dans la souche
E.coli AR1062 productrice de minicellules.
E.coli AR1062 productrice de minicellules.
On a sélectionné les clones en fonction de leur résistance à la kanamycine. On a constaté que pAT183 est le seul plasmide recombinant conférant à
E.coli la résistance à la tétracycline.
E.coli la résistance à la tétracycline.
Les protéines marquées produites par les minicellules ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide - SDS (voir figure 4).
Parmi les protéines codées par pAT183 dans les minicellules, on décèle un polypeptide de 68000 daltons.
La suppression du site KPnI conduit à la synthèse d'une protéine tronquée de 65000 daltons.
On constate, en outre, que toutes les autres protéines liées à la présence de l'insertion HincII ~ BAL31, en particulier les protéines de 35000, 34500, et 33000 daltons sont décalées et présentent une masse moléculaire apparente réduite d'environ 2000 daltons.
D'après ces résultats, ces produits proviendraient du même transcript et il existerait des sites secondaires internes d'initiation de la traduction au sein du gène tetM.
On considère que ces sites d'initiation de la traduction sont localisés dans le milieu du gène tetM, à proximité du site ClaI, étant donné que les protéines 2, 3 et 4 ne sont plus synthétisées lorsque le site SacI et le fragment Sacl - SDnI sont délétés.
EXEMPLE 4
Construction-d'une sonde intragénique tetM pour des études épidémiologiques.
Construction-d'une sonde intragénique tetM pour des études épidémiologiques.
Pour analyser le transfert interspécifique du gène tetM on a construit des sondes spécifiques de ce gène constituées par des fragments intragéniques clonés dans le bactériophage M13mp18. A titre de comparaison, on a utilisé d'une part, la première sonde tetM construite, à savoir pJI3, constituée par un fragment
HincII de 5kb isolé du chromosome de S.aaalactiae cloné dans E.coli pACY177 (18), d'autre part le fragment
HincII de 5kb purifié.
HincII de 5kb isolé du chromosome de S.aaalactiae cloné dans E.coli pACY177 (18), d'autre part le fragment
HincII de 5kb purifié.
Des études épidémiologiques préliminaires effectuées avec la sonde de l'invention, ont montré que l'utilisation de pJI3 ou de son insertion, en tant que sonde pour la détection du gène tetM dans des isolats cliniques, donne de fausses hybridations positives.
On a représenté sur la figure 5 les résultats obtenus respectivement avec 1/ - pJ13(pACYC177#5-kb HincII de S.agalactiae
B109, tetM) 2/ - M13mp18# 850-bp HindIII-Clal fragment intragénique
de Tn1545 tetM 3/ - M13mpl8 1L 530-bp HPaII fragment intragénique de pJH1 aDhA-3
Comme le montre l'examen de cette figure, l'ADN de pJI3 marqué au phosphore 32 par translation de cesure, hybride à l'ADN des plasmides pIP1433 (Km, Tc) et pMAK175 (Tc) de Campylobacter coli et c.jejuni.
B109, tetM) 2/ - M13mp18# 850-bp HindIII-Clal fragment intragénique
de Tn1545 tetM 3/ - M13mpl8 1L 530-bp HPaII fragment intragénique de pJH1 aDhA-3
Comme le montre l'examen de cette figure, l'ADN de pJI3 marqué au phosphore 32 par translation de cesure, hybride à l'ADN des plasmides pIP1433 (Km, Tc) et pMAK175 (Tc) de Campylobacter coli et c.jejuni.
Des résultats similaires sont obtenus en utilisant comme sonde le fragment purifié HincII de 5kb contenant le gène tetM.
Cependant, on ne détecte aucune homologie entre le dérivé de M13mp18 portant le fragment intragénique HindII-Clal de 850pb et pIP1433 ou pMAK175.
Ces résultats négatifs sont confirmés avec les sondes M13 contenant d'autres fragments intragéniques spécifiques du gène tetM.
Il apparaît donc vraisemblable que la réponse positive obtenue résulte d'une homologie avec les séquences extragéniques de 3kb qui sont adjacentes au gène tetM dans l'insertion de pJI3.
Dans une expérience de contrôle, une homologie a été détectée entre le dérivé de M13mp18 qui porte un fragment intragénique aphA-3(KmR) et le plasmide pIP804 (Km, Em, Tc) et pIP1433, alors qu'aucune homologie n'est observée avec l'ADN de pMAK175.
Ces expériences. d'hybridation montrent que le déterminant de résistance à Tc dans Campylobacter sp.
diffère de tetM.
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Claims (11)
1. Fragment d'ADN caractérisé en ce qu'il comprend au moins une partie du gène tetM, ce gène codant pour une protéine de résistance à la tétracycline et étant inclus dans la séquence nucléotidique suivante:
CGT CCT C@G TAT ATT CAA @AA TAT CGT AGT CAT TTA GCT TTC TTT ACA AAT GGA CGT AGT @TT TGT TTA ACA AAG TTA AAA GGG TAC CAT GTT ACT ACC 1972 GGT @AT CCT CTT TCC CAG CCC CGT C@T CCA AAT AGT CCG ATA GTT AAA GTA CGT TAT ATG TTC ATA AAA ATA @@T TAG TGTATTTTAT @TTGTTATAT 2070
GAA TAT CTT TCA CGA CCA TAC AAC GAT CCT CCT AAA TAT TGT GCG AAG ATC ATA @@G GCT CAA TTG AAA AAT AAT GAG ATC ATT CTT AGT GAA GAA ATC 1873
TTT CGG ATA CTT GCT CCT ATT GTA TTG GAA CAA GTC TTA AAA AAA CGT GGA ACA GGA TTG TTA @AG CCA TAT CTT AGT TTT AAA ATT TAT GCG CCA CAG 1774
TAT CCC TAT CAA CAA GGA TTG TAT GCT T@@ AGT GTG ACG TAC TGT AAA ATC TAT TTT AAG TAT CGC TTA TGC TAT AGC CCT ATT ACT ACC CCA CCA GAT 1475
CCA C@@ CTT CCA TTA AGG AGC GGA GTA CAG TAT GAG AGC TCG GTT TCT CTT GGA TAC TTA A@T TAG TCG TTT CAA AGT GGA GTT ATG CAG GGG ATA CGC 1574
ACA GTC ATT TAT ATG GAA AGA CCG TTA AAA AAA GCA GAG TAT ACC ATT CAC ATC GAA GTT CCA CCG AAT CCT TTC TGG TCT TCC ATT GGT CTA TCT GTA 1477
CAT GAA ATC ATA CTT TCT TTC TTA GGG AAA GTA CAA ATG GAA GTG ACT TGT GCT CTG CTG CAA GAA AAG TAT CAT GTG GAG ATA GAA ATA AAA GAG CCT 137@
AAT GAG TTT TTG AAG TTA AAT AST GTT CTT GGA GAT ACA AAG CTA TTG CCA CAG AGA GAG AGA ATT GAA AAT CCC CTC CCT CTG CTG CAA ACG ACT GTT 11@0 @AA CCG AGC AAA CCT CAA CAA AGG GAA ATG TTA CTT GAT CCA CTT TTA GAA ATC TCC GAC AAT AAC CCG CTT CTG CAA TAT TAT GTG TAT TCT GCG ACA 1279
GAA AAG GAA AAA ATA AAA ATT ACA GAA ATG TAT ACT TCA ATA AAT GGT GAA TTA TGT AAA ATC AAT AAG GCT TAT TCC TGG GAA ATT @TT ATT TTG CAG 10@@
AAA GTT TTC AAA ATT GAG TAT TCG GAA AAA AGA CAG CTT CTT GCA TAT ATA CTT CTT TAT AGT @GC GTA CTG CAT TTG C@A AAT CC@ @T@ ACA ATA TCT 182
GCA AGT GCA AAA AAC AAT ATA GGG ATT AAT AAC CTT ATA GAA GTG ATT ACG AAT AAA TTT TAT TCA TCA ACA CAT CGA AGT CAG TCT GAA CTT TGC GGA @83
TTG GAG AAA TAT ACG TCT GGG AAA TTA TTG GAA CCA TTA GAA CTC GAA CAA GAG GAA AGC ATA AGA TTT CAT AAT TGT TCC CTG TTC CCT GTT TAT CAC 784
GTA ATC AAA CAG AAG TTA GAA CTG CAT CCT AAT ATG CTT STA ATG AAC TTT ACC GAA TCT GAA CAA TGG GAT ATG GTA A@@ @@@ @@A AAT GAT TAC CTT @85
GGT ATT CCC ACA ATC TTT TTT ATC AAT AAG ATT GAC CAA AAT GGA ATT GAT TTA TCA ACG GTT TAT CAG GAT ATT AAA GAG AAA CTT TCT GCG GAA ATT 58@
CGT TCA TTA TCA TTA TTA GAT GGG GCA ATT CTA CTG ATT TCT GCA AAA GAT GGC GTA CAA GCA CAA ACT CGT ATA TTG TTT CAT GCA CTT AGG AAA ATA 187
ATT ACA ATT CAG ACT GCG ATA ACC TCT TTT CAG TGG AAA AAT ACT AAG GTG AAC ATC ATA GAC ACG CCA GGA CAT ATG GAT TTT TTA GCA GAA GTA TAT 388
GAA AGC TTA TTA TAT AAC AGT GGA GCG ATT ACA GAA TTA GGA AGC GTG GAC AGA GGT ACA ATG AAA ACG GAT AAT ACG CTT TTA GAA CGT CAG AGA GGA 289
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2. Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence codante du gène tetM est définie par un codon d'initiation ATG en position 131 et un codon de terminaison TAG en position 2047 dans une phase de lecture ouverte de 1917 pb.
3. Fragment d'ADN selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est présent dans le transposon navette conjugatif Tn1545 du plasmide pIP804 de
S.faecalis BM 4127.
4. Fragment d'ADN selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est porté par un fragment dlADN de restriction de HincII-HincII de 4 kb environ du plasmide pAT182.
5. Fragment dlADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine de résistance à la tétracycline ayant une masse moléculaire apparente de l'ordre de 68000 daltons.
6. Protéine de résistance à la tétracycline caractérisée en ce qu'elle possède une masse moléculaire apparente de 72500 daltons, correspondant à une séquence du type
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7. Vecteurs recombinants comportant au moins une partie du fragment d'ADNselon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
8. Souches bactériennes modifiées, caractérisées en ce qu'après transformation elles comportent dans leur génome au moins une partie du gène tetM.
9. Procédé d'obtention d'un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend - l'introduction du fragment de 4kb HincII-HincII dans le site unique HincII de pAT181, ce qui conduit au plasmide recombinant pAT182 - le sous-clonage du gène tetM par clivage par PvuI, suivi d'une digestion par l'exonucléase BAL-31, ce qui conduit au plasmide recombinant pAT183, et - le séquençage d'un fragment de 2094pb contenu dans l'insertion de 2,9kb environ HincII-BAL-31 capable de conférer la résistance à la tétracycline.
10. Application d'un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, plus spécialement d'une séquence intragénique du gène tetM pour l'élaboration de sondes de détection de la résistance à la tétracycline dans des cultures cellulaires.
11. Application selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'on utilise comme sonde intragénique un fragment d'ADN de 850pb, délimité par les sites de restriction indIII-ClaI.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8610921A FR2602794A1 (fr) | 1986-07-28 | 1986-07-28 | Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un gene de resistance a la tetracycline, son procede d'obtention et ses applications biochimiques |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8610921A FR2602794A1 (fr) | 1986-07-28 | 1986-07-28 | Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un gene de resistance a la tetracycline, son procede d'obtention et ses applications biochimiques |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2602794A1 true FR2602794A1 (fr) | 1988-02-19 |
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ID=9337799
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8610921A Pending FR2602794A1 (fr) | 1986-07-28 | 1986-07-28 | Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un gene de resistance a la tetracycline, son procede d'obtention et ses applications biochimiques |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2602794A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001000868A1 (fr) * | 1999-06-25 | 2001-01-04 | Imperial College Innovations Limited | Methode de detection de neisseria gonorrhoeae pharmacoresistantes |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP0115936A1 (fr) * | 1983-01-24 | 1984-08-15 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Plasmides chimériques |
-
1986
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0115936A1 (fr) * | 1983-01-24 | 1984-08-15 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Plasmides chimériques |
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| WO2001000868A1 (fr) * | 1999-06-25 | 2001-01-04 | Imperial College Innovations Limited | Methode de detection de neisseria gonorrhoeae pharmacoresistantes |
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