CN101255431B

CN101255431B - 编码代谢途径蛋白的谷氨酸棒杆菌基因

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Publication number: CN101255431B
Application number: CN2008100909127A
Authority: CN
Inventors: M·波姆佩朱斯; B·克雷格尔; H·施雷德尔; O·策尔德; G·哈伯豪尔; J·-W·金; H·-S·李; B·-J·王
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Priority date: 2000-03-09
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: EP1261718B1; ZA200208060B; DK1261718T3; CN1452659A; KR20020086616A; WO2001066573A2; DE60045191D1; BR0017148A; CA2402186C; CN101255431A; CA2402186A1; MXPA02008710A; WO2001066573A3; AU2390301A; ATE486941T1; JP4786107B2; AU2001223903B2; ES2354867T3; BRPI0017148B1; KR101012231B1

Abstract

描述了分离的编码新的谷氨酸棒杆菌MP蛋白的核酸分子，该分子被称为MP核酸分子。本发明也提供了反义核酸分子，含有MP核酸分子的重组表达载体，以及已导入表达载体的宿主细胞。本发明也进一步提供了分离的MP蛋白，MP突变蛋白，融合蛋白质，抗原肽，以及基于谷氨酸棒杆菌MP基因遗传工程提高由该生物体进行的所需化合物生产的方法。

Description

编码代谢途径蛋白的谷氨酸棒杆菌基因

本申请是申请日为2000年12月22日，申请号为00819506.4的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。

相关申请

本申请是2000年6月23日提交的美国专利申请09/606,740的部分继续申请。本申请也是2000年6月23日提交的美国专利申请09/603,124的部分继续申请。本申请要求以下申请的优先权：1999年6月25日提交的美国临时专利申请60/141031，1999年6月2日提交的美国临时专利申请60/142101，1999年8月12日提交的美国临时专利申请60/148613，2000年3月9日提交的美国临时专利申请60/187970，以及1999年7月8日提交的德国专利申请19931420.9。上述申请的全部内容本文引为参考。

发明背景

细胞中天然存在的代谢过程中的特定产物和副产物，在包括食品、饲料、化妆品和制药产业在内的很多行业中有用。这些分子总称为“精细化学物质”，包括有机酸、蛋白源的和非蛋白源的氨基酸、核苷酸和核苷、脂质和脂肪酸、二醇、糖类、芳香族化合物、维生素和辅因子以及酶。可以通过大规模培养产生并分泌大量特定所需分子的细菌，最方便的制备这些产品。用于这一目的的一种特别有用的生物体就是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，一种革兰氏阳性非病原菌。通过菌株筛选，出现了许多产生大批所需化合物的突变株。然而，为改进特殊分子生产而进行的菌株筛选，是一个耗时并且困难的过程。

发明概述

本发明提供了新的细菌核酸分子，这些分子具有多种用途。这些用途包括鉴定可以产生精细化学物质(如赖氨酸和甲硫氨酸等氨基酸)的微生物、调节谷氨酸棒杆菌或者亲缘细菌中的精细化学物质的产生、谷氨酸棒杆菌或者亲缘细菌的分型和鉴定、作为绘制谷氨酸棒杆菌基因组图谱的参照点。这些新的核酸分子编码蛋白质，此处称为代谢途径(MP)蛋白质。

谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性需氧细菌，通常用于工大规模生产各种精细化学物质，也用于降解烃类(例如在石油泄漏中)和氧化萜品醇。因此，本发明的MP核酸分子，可用来鉴定能用于生产精细化学物质的微生物，例如通过发酵方法。调节本发明MP核酸分子的表达，或者修饰本发明MP核酸分子的序列，可以用于调节微生物中一种或者多种精细化学物质的生产(例如，提高棒杆菌或者短杆菌中一种或者多种精细化学物质的产生)。在一个优选实施方案中，本发明的MP基因与参与相同和不同代谢途径的一个或多个基因组合，以调节微生物生产一种或多种精细化学物质。

本发明MP核酸分子可用于鉴定一种微生物是否是谷氨酸棒杆菌或者其亲缘菌株，或者鉴定微生物混合群体中谷氨酸棒杆菌或者其亲缘菌株的存在。本发明提供了许多谷氨酸棒杆菌基因的核酸序列；在严格条件下，用探针探查从单一微生物或者混合微生物群体培养物中提取的基因组DNA，该探针覆盖了谷氨酸棒杆菌基因特有的一段区域，可以确定是否有该微生物存在。尽管谷氨酸棒杆菌本身是非病原性的，但是它与人体中的病原菌种有关，例如白喉棒状菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉致病原)；探测这种微生物具有重大的临床实用性。

本发明MP核酸分子也可以用作绘制谷氨酸棒杆菌基因组图谱的参照点，或者绘制其亲缘菌株基因组图谱的参照点。相似的，这些分子，或者其变体或其部分，可以用作遗传工程棒杆菌或者短杆菌的遗传标记。

例如，本发明新核酸分子编码的MP蛋白可以进行某些精细化学物质代谢中的酶促步骤，所述精细化学物质包括氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、营养因子(nutraceutical)、核苷酸、核苷和海藻糖。考虑到可在谷氨酸棒杆菌中使用的克隆载体的实用性，例如在Sinskey etal.，美国专利号No.4,649,119中公开的，并且考虑到谷氨酸棒杆菌和亲缘短杆菌菌种(例如乳发酵短杆菌)的遗传操作技术(Yashihama et al，J.Bacteriol.162：591-597(1985)；Katsumata et al.，J.Bacteriol.159：306-311(1984)；以及Santamaria et al.，J.Gen.Microbiol.130：2237-2246(1984))，本发明的核酸分子可用于该生物体的遗传工程，使之成为一种或者多种精细化学物质更好的或者更有效的生产者。

精细化学物质的提高或有效生产可以是本发明基因操作的直接作用或这种基因操作的间接作用。具体而言，谷氨酸棒杆菌氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、核苷酸和海藻糖代谢途径的改变对这种生物生产一种或多种这些所需化合物具有直接的效应。例如，优化赖氨酸或甲硫氨酸生物合成途径蛋白活性或降低赖氨酸或甲硫氨酸分解途径蛋白活性可以导致由这种工程改造的生物生产赖氨酸或甲硫氨酸的产量或效率提高。这些代谢途径蛋白的改变也会对所需精细化学物质生产或效率有间接影响。例如，与生产所需分子必须的中间体竞争的反应可以被消除，或者生产所需化合物特定中间体必须的途径可以被优化。此外，氨基酸如赖氨酸或甲硫氨酸、维生素或核苷酸生物合成或降解的调控可以增加生产和分裂的能力，从而增加培养物中微生物的数量和/或生产能力，并增加所需精细化学物质的可能产量。

本发明的核酸和蛋白分子单独或与一种或多种相同或不同代谢途径的核酸和蛋白分子组合，可以用来直接提高谷氨酸棒杆菌中一种或多种所需精细化学物质(如甲硫氨酸或赖氨酸)的生产或生产效率。使用本领域已知的重组技术，一种或多种本发明的氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖的生物合成或降解酶可以被改变，从而调节其功能。例如，可以提高生物合成酶的效率，或破坏其别构控制区从而防止化合物生产的反馈抑制。类似地，降解酶可以通过置换、缺失或增加被缺失或修饰，从而其对所需化合物的降解活性降低，而不影响细胞的活力。在各种情况下，所需精细化学物质的总产量或产率均被提高。

本发明的蛋白质和核苷酸分子的改变也可能通过间接机制提高除氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖以外的其它精细化学物质的生产。任一种化合物的代谢必然与细胞内其它生物合成和降解途径关联，一种途径中的必需辅因子、中间体或底物可能由其它同类途径供给或受其限制。因此，通过调整一种或多种本发明蛋白的活性，另一种精细化学物质生物合成或降解途径活性的生产或效率可能会受到影响。例如，氨基酸可以作为所有蛋白质的结构单元，但其在细胞内的存在的水平可能会限制蛋白合成；因此，通过增加细胞内一种或多种氨基酸的生产效率或产率，诸如生物合成或降解蛋白的蛋白可以更容易合成。同样，代谢途径酶的改变使得特定副反应更有利或不利时，会导致一种或多种用作生产所需精细化学物质的中间体或底物的化合物过量生产或生产不足。

本发明提供了新的编码蛋白质的核酸分子，这种蛋白质在此处称作代谢途径(MP)蛋白质，它们能够完成对细胞正常功能重要的分子例如氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、核苷酸和核苷酸或海藻糖代谢过程中的酶促步骤。编码MP蛋白的核酸分子此处称为MP核酸分子。在优选实施方案中，MP蛋白单独或与相同或不同代谢途径的一种或多种蛋白组合，执行与以下一种或多种物质的代谢相关的酶促步骤：氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷和海藻糖。这些蛋白质的实例，包括那些在表1中列出的基因所编码的蛋白质。

因此，本发明的一个方面涉及，分离含有一段编码一种MP蛋白或者其生物活性部分的核酸序列的核酸分子(例如，cDNA，DNA，或者RNA)，以及分离适合作为探测或扩增MP编码核酸(例如DNA或者RNA)的引物或者杂交探针的核酸片段。在特别优选的实施方案中，分离的核酸分子包含一段列在序列表中的序列号为奇数的核酸序列(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5)或者一条这种核苷酸序列的编码区域或者其互补序列。在其他特别优选的实施方案中，分离的本发明核酸分子包含与序列表中的序列号为奇数的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5)或者其部分有至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％同源性，优选有至少大约61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％的同源性，更优选有至少大约71％，72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％或91％、92％、93％、94％的同源性，甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％、99.7％或者更高的同源性。在其他优选的实施方案中，已分离的核酸分子编码列在序列表中的偶数序列号氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6)。本发明优选的MP蛋白也优选具有至少一种此处描述的MP活性。

在另一个实施方案中，已分离的核酸分子编码一种蛋白质或者其部分，其中的蛋白质或者其部分包含一段氨基酸序列，该序列与本发明的氨基酸序列(例如，在序列表中偶数序列号的序列，如SEQ ID NO：2，SEQID NO：4，SEQ ID NO：6)有充分的同源性，例如，与本发明的氨基酸序列有充分的同源性而使得该蛋白质或者其部分具有MP活性。优选，核酸分子编码的蛋白质或者其部分，保持进行氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、核苷酸和核苷酸或海藻糖代谢途径中的酶促反应的能力。在一个实施方案中，核酸分子编码的蛋白质与本发明的氨基酸序列(例如，从序列表中的偶数序列号序列如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6中选出的完整氨基酸序列)有至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％同源性，优选有至少大约61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％的同源性，更优选有至少大约71％，72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％或91％、92％、93％、94％的同源性，甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％、99.7％或者更高的同源性。在另一个优选的实施方案中，蛋白质是全长的谷氨酸棒杆菌蛋白质，该蛋白质与本发明的全长氨基酸序列(由显示在相应序列表中的奇数序列号核酸序列(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5)开放阅读框架编码的)基本同源。

在另一个优选的实施方案中，分离的核酸分子来自谷氨酸棒杆菌，并编码一种蛋白质(例如一种MP融合蛋白)，该蛋白质包含一段生物活性区域，该区域与本发明的一种氨基酸序列(例如，序列表偶数序列号序列如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6中的一个序列)有至少大约50％或者更高的同源性，并且该蛋白质能够催化氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、核苷酸和核苷酸或海藻糖代谢途径中的反应，或者拥有一种或者多种列在表1中的活性，并且该蛋白质还包含有一段编码异源多肽或者调节区域的异源核酸序列。

在另一个实施方案中，分离的核酸分子至少有15个核苷酸的长度，并且在严格条件下与含有本发明核苷酸序列(例如，在序列表中奇数序列号序列如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5)的核酸分子杂交。优选，分离的核酸分子与天然存在的核酸分子一致。更加优选，分离的核酸分子编码天然存在的谷氨酸棒杆菌MP蛋白，或者其生物活性部分。

本发明的另一个方面涉及载体，例如含有本发明核酸分子或者含有本发明核酸分子与相同或不同途径的一种或多种核酸分子组合的重组表达载体，和被引入这种载体的宿主细胞。在一个实施方案中，通过在合适的培养基中进行培养，这种宿主细胞被用于生产MP蛋白。然后可以从培养基或者宿主细胞中分离该MP蛋白。

另外，本发明的另一个方面涉及一种经过遗传改变的微生物，一种或多种MP基因已经被单独或与一种或多种相同或不同代谢途径的基因组合引入其中或者已经被改变。在一个实施方案中，通过单独引入作为转基因的编码一种或多种野生型或者突变型MP序列的本发明核酸分子或与一种或多种相同或不同代谢途径的核酸分子，改变了该微生物的基因组。在另一个实施方案中，改变了该微生物基因组中的一种或多种内源MP基因，例如，通过使用一种或多种已改变的MP基因进行同源重组而进行功能性破坏。在另一个实施方案中，该微生物中一种或多种内源的或者引入的MP基因(单独或与一种或多种相同或不同代谢途径的基因组合)通过一个或者多个点突变、缺失或者倒位而被改变，但是仍然能编码功能MP蛋白。在另一个实施方案中，改变一种或多种微生物MP基因(单独或与一种或多种相同或不同代谢途径的基因组合)的一个或者多个调节区域(例如，启动子、阻抑物或者诱导物)，从而调节一种或多种MP基因的表达。在优选的实施方案中，微生物属于棒杆菌种或者短杆菌种，特别优选是谷氨酸棒杆菌。在优选的实施方案中，也使用微生物生产所需的化合物，例如氨基酸，特别优选是赖氨酸和甲硫氨酸。在特别优选的实施方案中，MP基因是metZ基因(SEQ ID NO：1)、metC基因(SEQ ID NO：3)或RXA00657基因(SEQ ID NO：5)，单独或与一种或多种本发明的MP基因或与参与甲硫氨酸和/或赖氨酸代谢的一种或多种基因组合。

另一方面，本发明提供了一种鉴定受试者中白喉棒杆菌存在或者活性的方法。该方法包括对受试者中本发明的一种或者多种核酸或者氨基酸序列(例如，列在序列表中SEQ ID NO 1至122的序列)的检测，从而可以检测受试者中谷氨酸棒杆菌的存在或者活性。

另外，本发明的另一个方面涉及已分离出MP蛋白或者其部分，例如其生物活性部分。在一个优选的实施方案中，分离的MP蛋白或者其部分，单独或与一种或多种本发明的MP蛋白或与相同或不同代谢途径的一种或多种蛋白组合，可以催化氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢的一种或多种途径中的酶促反应。在另一个优选的实施方案中，已分离的MP蛋白或者其部分与本发明的一种氨基酸序列(例如，序列表偶数序列号序列如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6中的一个序列)有足够高的同源性，使得该蛋白质或者其部分保持催化氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢的一种或多种途径中的酶促反应的能力。

本发明也提供了MP蛋白的分离制品。在优选的实施方案中，MP蛋白包含本发明的氨基酸序列(例如，序列表偶数序列号序列如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6中的一个序列)。在另一个优选的实施方案中，本发明与分离的全长蛋白质有关，该蛋白质与本发明的完全氨基酸序列(序列表偶数序列号序列如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：6中的一个序列)(由显示在相应序列表中的序列号为奇数如SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的开放阅读框架编码)有相当高的同源性。此外，在另一个实施方案中，蛋白质与本发明的完全氨基酸序列(例如，序列表中偶数序列号序列如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6)有至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％同源性，优选有至少大约61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％的同源性，更优选有至少大约71％，72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％或91％、92％、93％、94％的同源性，甚至更优选有至少大约95％，96％，97％，98％，99％、99.7％或者更高的同源性。在另一个实施方案中，分离的MP蛋白包含的氨基酸序列与本发明的一条氨基酸序列(例如，序列表中的偶数序列号序列如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6中的一个序列)有至少大约50％或者更高的同源性，并且单独或者与一种或多种本发明的MP蛋白或相同或不同代谢途径的任何蛋白组合，能够催化氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应，或者具有表1中列出的一种或者多种活性。

另外，分离的MP蛋白可以含有由核酸序列编码的氨基酸序列，该核酸序列与列在序列表中的偶数序列号的一个核苷酸序列杂交，例如在严格条件下杂交，或者与该核苷酸序列有至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％同源性，优选有至少大约61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％的同源性，更优选有至少大约71％，72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％或91％、92％、93％、94％的同源性，甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％、99.7％或者更高的同源性。也优选MP蛋白的优选形式同样具有一种或者多种此处描述的生物活性。

MP多肽或者其生物活性部分，可以有效的连接到非MP多肽上而形成融合蛋白质。在优选的实施方案中，该融合蛋白质具有不同于单独MP蛋白本身的活性。在另外优选的实施方案中，该融合蛋白质被引入谷氨酸棒杆菌氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、营养因子代谢途径时，引起谷氨酸棒杆菌中所需精细化学物质产量、生产和/或生产效率的增加。在特别优选的实施方案中，把该融合蛋白整合进宿主细胞的氨基酸、微生物、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径，可以调节细胞中所需化合物的生产。

另一方面，本发明提供了筛选可调节MP蛋白活性的分子的方法。该分子通过与蛋白质分子本身或者底物相互作用，或者与MP蛋白的配偶体结合，或者通过调节本发明MP核酸分子的转录或者翻译来调节MP蛋白活性。

本发明的另一个方面涉及生产精细化学物质的方法。该方法涉及培养含有一种或多种载体的细胞，该载体指导本发明MP核酸分子单独表达，或与一种或多种本发明的MP核酸核酸分子或相同或不同代谢途径的任何核酸分子组合表达，从而产生精细化学物质。在一个优选的实施方案中，该方法还包含获得含有该载体细胞的步骤，在该步骤中，使用可以指导MP核酸分子表达的载体转染细胞。在另一个优选的实施方案中，该方法还包含从培养基中回收精细化学物质的步骤。在一个特别优选的实施方案中，细胞是棒杆菌种或者短杆菌种，或者选自列在表3中的那些菌株。在另一个优选实施方案中，MP基因是metZ基因(SEQ IDNO：1)、metC基因(SEQ ID NO：3)或RXA00657基因(SEQ ID NO：5)，单独或与一种或多种本发明的MP基因或与参与甲硫氨酸和/或赖氨酸代谢的一种或多种基因组合。在另一个优选实施方案中，精细化学物质是氨基酸如L-赖氨酸和L-甲硫氨酸。

本发明的另一方面涉及调节微生物中一种分子产生的方法。这种方法包括使用调节MP蛋白活性或者MP核酸表达的药剂接触细胞，使得细胞的相关活性相对于缺少这种药剂时的活性发生了改变。在一个优选的实施方案中，调节谷氨酸棒杆菌细胞的一种或多种氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径，使得这种微生物所需精细化学物质的产量或者产生效率得到提高。调节MP蛋白活性的药剂，可以是刺激MP蛋白活性或者MP核酸表达的药剂。刺激MP蛋白活性或者MP核酸表达的药剂的实例，包括小分子、活性MP蛋白、以及编码已导入细胞的MP蛋白的核酸。抑制MP蛋白活性或者表达的药剂的实例包括小分子和反义MP核酸分子。

本发明的另一个方面，涉及调节细胞中所需化合物产量的方法，包括把野生型或者突变型MP基因导入细胞，单独或与一种获得多种本发明的MP核酸分子或相同或不同代谢途径的任何核酸分子组合，该基因或者保留在单独的质粒上，或者整合到宿主细胞基因组中。如果整合到宿主细胞基因组中，这种整合可以是任意的，或者是通过同源重组发生的，从而使得引入的拷贝取代天然基因，导致细胞中所需化合物的产生得到调节。在一个优选的实施方案中，该产量得到增加。在另一个优选的实施方案中，所说的精细化学物质是氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，所说的氨基酸是L-赖氨酸和L-甲硫氨酸。在另一个优选实施方案中，所述基因是metZ基因(SEQ ID NO：1)、metC基因(SEQ IDNO：3)或RXA00657基因(SEQ ID NO：5)，单独或与一种或多种本发明的MP核酸分子或与参与甲硫氨酸和/或赖氨酸代谢的一种或多种基因组合。

发明详述

本发明提供了MP核酸和蛋白质分子，它们参与谷氨酸棒杆菌中某些精细化学物质包括氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷和海藻糖的代谢。本发明的分子可用于调节微生物如谷氨酸棒杆菌中精细化学物质的生产，这种调节，可以是直接的(例如在赖氨酸和甲硫氨酸生物合成蛋白的调节对该生物体的赖氨酸和甲硫氨酸生产或生产效率具有直接影响时)，或者具有间接影响，但会导致所需化合物产量或生产效率的增加(例如当核苷酸生物合成蛋白活性的调节对细菌的有机酸或脂肪酸生产有影响，可能是由于生长改进或必需的辅因子、能量化合物或前体分子的供应增加)。MP分子可以单独使用，或与本发明的其他MP分子分子组合使用，或与相同或不同代谢途径(如赖氨酸或甲硫氨酸代谢)中的其他分子组合使用。在一个优选实施方案中，MP分子是metZ(SEQ ID NO：1)、metC(SEQ ID NO：3)或RXA00657(SEQ ID NO：5)核酸分子和由这些核酸分子编码的蛋白(分别是SEQID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6。本发明的各个方面进一步详细说明如下。

I.精细化学物质

“精细化学物质”这个词是本领域熟知的，包括生物体产生的在各种产业中使用的分子，例如但不仅仅局限于，制药、农业和化妆品产业。这种化合物包括有机酸，例如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸，蛋白质源和非蛋白质源氨基酸，嘌呤碱基和嘧啶碱基，核苷，以及核苷酸(例如像是描述在Kuninaka，A.(1996)Nucleotides and related compounds，p.561-612，in Biotechnology vol.6，Rehm et al.，eds.VCH：Weinheim及其所含参考文献中的)，脂质，饱和和不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸)，二醇(例如，丙烷二醇和丁烷二醇)，芳香族化合物(例如，芳香胺、香草醛和靛)，维生素和辅因子(参见Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry，vol.A27，“Vitamins”，p.443-613(1996)VCH：Weinheim and referencestherein；and Ong，A.S.，Niki，E.& Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health，andDisease”Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and TechnologicalAssociations in Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia，held Sept.1-3，1994 at Penang，Malaysia，AOCS Press，(1995))，酶，聚酮化合物(ployketides)(Cane et al.，(1998)Science 282：63-68)，以及所有在Gutcho(1983)Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN：0818805086及其参考文献中描述的化学物质。某些这些精细化学物质的代谢和用途进一步详细说明如下。

A.氨基酸的代谢和用途

氨基酸包括所有蛋白质的基本结构单元，同样也是所有生物体正常细胞生物功能所必需的。“氨基酸”这个词是本领域熟知的。蛋白质源的氨基酸有20种，是蛋白质的结构单元，相互之间由肽键相连接，而非蛋白质源氨基酸(已知的有几百种)通常情况下不会出现在蛋白质中(参见Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，vol.A2，p.57-97 VCH：Weinheim(1985))。虽然L-氨基酸通常是天然存在蛋白质中的唯一类型，但是氨基酸可以是D-或者L-光学构型。20种蛋白质源氨基酸中每一种的生物合成或者降解途径，都在原核细胞或者真核细胞中有各自的特点(例如参见Stryer，L.Biochemistry，3^rd edition，pages 578-590(1988))。“必需”氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)之所以这样命名，是因为这些氨基酸生物合成复杂通常是必需的营养条件，它们可以通过简单的生物合成途径转化为其余的11种“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸)。虽然高等生物确实具有合成一些这种氨基酸的能力，但是为了正常的蛋白质合成必须从饮食中补充必需氨基酸。

它们除了在蛋白质合成中的功能，这些氨基酸就其自身来说是有趣的化学物质，并且它们中的很多在食品、饲料、化学、化妆品、农业和制药产业中具有各种应用。赖氨酸在营养方面不仅对于人类是一种重要的氨基酸，而且对于像是家禽和猪这样单胃动物也是重要的。谷氨酸是最常用的风味添加剂(谷氨酸单钠，MSG)，并且广泛应用于整个食品产业，如同天冬氨酸、甘氨酸、半胱氨酸一样。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸全部用于制药产业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸都应用在制药产业和化妆品产业中。苏氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是常用的饲料添加剂(Leuchtenberger，W.(1996)Amino aids-technical production and use，p.466-502 in Rehm et al.(eds.)Biocemistry vol.6，chapter 14a，VCH：Weinheim)。另外，这些氨基酸作为合成氨基酸和蛋白质合成的前体也是很有用的，例如N-乙酰半胱氨酸，S-羧甲基-L-半胱氨酸，(S)-5-羟色氨酸，以及其他在Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，vol.A2，p.57-97 VCH：Weinheim，1985中描述的分子。

在能够产生天然氨基酸的生物体中，例如细菌，这些天然氨基酸的生物合成已经了解得很充分(细菌氨基酸的生物合成及其调节，参见Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47：533-606)。天冬氨酸由α-酮戊二酸还原型氨化合成，后者是柠檬酸循环的中间体。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸都是由谷氨酸依次产生的。丝氨酸的生物合成是一个三步的过程，开始于3-磷酸甘油酸(糖酵解的中间体)，经过氧化作用、转氨作用、水解作用各步骤之后，终止于该氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸都由丝氨酸产生；前者由高半胱氨酸与丝氨酸缩合而成，后者是把侧链β-碳原子转移到四氢叶酸得到的，该反应是由丝氨酸羟甲基转移酶催化的。苯丙氨酸和酪氨酸，由4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇丙酮酸在一条9步的生物合成途径中合成，它们是糖酵解途径和戊糖磷酸途径的前体，这两条途径只是在合成预苯酸之后不同。色氨酸也可以由这两种初始分子产生，但是其合成是一个11步的途径。酪氨酸也可以由苯丙氨酸合成，其反应是由苯丙氨酸羟化酶催化的。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸都是糖酵解终产物丙酮酸的生物合成产物。天冬氨酸由草酰乙酸合成，后者是柠檬酸循环的中间体。天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸都由天冬氨酸转化而成。异亮氨酸由苏氨酸形成。

甲硫氨酸生物合成途径已经在不同生物体中进行了研究。第一步即高丝氨酸的酰化在所有生物体中是相同的，即便转移酰基的来源不同。大肠杆菌和相关物种使用琥珀酰辅酶A(Michaeli，S.And Ron，E.Z.(19810 Mol.Gen.Genet.182，349-354)，而酿酒酵母(Langin，T.，et al.(1986)Gene 49，283-293)、黄色短杆菌(Miyajima，R.And Shiio，I.(1973)J.Biochem.73，1061-1068；Ozaki，H and Shiio，I.(1982)J.Biochem.91，1163-1171)、谷氨酸棒杆菌(Park，S.D.et al.(1998)Mol.Cells 8，286-294)和迈氏钩端螺旋体(Belfaiza，J.et al.(1998)180，250-255；Bourhy，P.，et al.(1997)J.Bacteriol.179，4396-4398)使用乙酰辅酶A作为酰基供体。由酰基高丝氨酸形成高半胱氨酸有两种不同途径。大肠杆菌使用转硫途径，通过胱硫醚γ合酶(metB的产物)和胱硫醚β裂合酶(metC的产物)催化。酿酒酵母(Cherest，H.andSurdin-Kerjan，Y.(1992)Genetics 130，51-58)，黄色短杆菌(Ozaki，H.andShiio，I.(1982)J.Biochem.91，1163-1171)，铜绿假单胞菌(Foglino，M.，et al.(1995)Microbiology 141，431-439)，和迈氏钩端螺旋体(Belfaiza，J.，et al.(1998)J.Bacteriol.180，250-255)利用直接硫化氢解途径，由酰基高丝氨酸硫化氢解酶催化。不像密切相关的黄色短杆菌仅利用直接硫化氢解途径，在谷氨酸棒杆菌的抽提物中检测到了转硫途径的酶活性，在该生物中该途径被认为是甲硫氨酸生物合成的路径(Hwang，B-J.，et al.(1999)Mol.Cells 9，300-308；Kase，H.and Nakayama，K.(1974)Agr.Biol.Chem.38，2021-2030；Park，S.-D.，et al.1998)Mol.Cells 8，286-294)。

尽管已经分离到参与谷氨酸棒杆菌甲硫氨酸生物合成的某些酶，关于谷氨酸棒杆菌中甲硫氨酸生物合成的信息仍非常有限。从该生物中只分离出了metA和metB基因。为了理解谷氨酸棒杆菌中甲硫氨酸的生物合成途径，我们分离和鉴定了谷氨酸棒杆菌的metC基因(SEQ ID NO：3)和metZ(也称为metY)基因(SEQ ID NO：1)(见表1)。

超出细胞蛋白质合成所需的氨基酸是不能储存的，而是被降解后为细胞主要代谢途径提供中间体(评论参见Stryer，L.Biochemistry 3^rd ed.Ch.21“Amino Acid Degradation and the Urea Cycle”p.495-516(1988))。尽管细胞能转化多余的氨基酸为有用的代谢中间体，但是产生氨基酸要消耗很多的能量、前体分子和合成所需的酶。因此用反馈抑制来调节氨基酸的生物合成是不令人吃惊的，特殊氨基酸的存在可以减慢或者完全停止其自身的产生(对于氨基酸生物合成途径反馈机制的评论，参见Stryer，L.Biochemistry 3^rd ed.Ch.24“Biosynthesis of Amino Acid and Heme”p.575-600(1988))。因此，任何特定氨基酸的产量都被细胞内存在的氨基酸数量所限制。

B.维生素、辅因子和营养因子的代谢和用途

维生素、辅因子和营养因子包括另一组分子，虽然其他生物，例如细菌，可以合成这些分子，但是高等动物失去了合成它们的能力而只能摄取。这些分子或者其本身是生物活性物质，或者是生物活性物质的前体，该生物活性物质可以是电子载体或者各种代谢途径的中间体。除了其营养价值，这些化合物作为色素、抗氧化剂和催化剂或者其他加工助剂也有重大的工业价值。(对于这些化合物结构、活性和工业应用的评述，参见例如，Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”vol.A27，p.443-613VCH：Weinheim 1996.)“维生素”这个词是本领域熟知的，包含了生物体正常功能所需但是又不能自身合成的营养素。维生素可以包括辅因子和营养因子化合物。术语“辅因子”包含了进行正常酶活性所需的非蛋白质化合物。这些化合物可以是无机的或者有机的；本发明的辅因子分子优选是有机的。“营养因子”这个词包含了对植物和动物，特别是人体有益的饮食增补剂。这些分子的实例是维生素、抗氧化剂和某些脂质(例如多饱和脂肪酸)。

在能够产生这些分子的生物体，例如细菌中这些分子的生物合成，大部分已经被鉴定(Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”vol.A27，p.443-613，VCH：Weinheim，1996；Michal，G.(1999)Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley & Sons；Ong，A.S.，Niki，E.& Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings of the UNESCO/Confederation ofScientific and Technological Associations in Malaysia，and the Society forFree Radical Research-Asia，held Sept.1-3，1994 at Penang，Malaysia，AOCS Press：Champaign，IL X，374S)

硫胺素(维生素B1)是由嘧啶和噻唑经化学连接产生的。核黄素(维生素B2)由5’-三磷酸鸟嘌呤核苷和5’-磷酸核糖合成。核黄素依次用于合成黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。合称为“维生素B6”的一组化合物(例如，吡哆醇、吡哆胺，5’-磷酸吡哆醛，以及商品化的盐酸吡哆醛)都是共同结构单元5-羟基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸盐(泛酸，(R)-(+)-N-(2，4-二羟基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可由化学合成或者发酵得到。泛酸盐生物合成的最后一步包括ATP驱动的β-丙氨酸和泛解酸的缩合。负责转化成泛解酸和β-丙氨酸酶，以及缩合成泛酸盐的酶都是已知的。泛酸盐的代谢活性形式是辅酶A，其生物合成过程是5个酶促步骤。泛酸盐、5’-磷酸吡哆醛、半胱氨酸和ATP是辅酶A的前体。这些酶不仅催化泛酸盐的形成，也催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton，(R)-泛醇(维生素原B5)泛酰巯基乙胺(及其衍生物)的产生。

在微生物中由前体分子庚二酰辅酶A到生物素的生物合成研究得很详细，并且所涉及的几个基因已被鉴定。很多相应的蛋白质也被发现参与了铁簇(Fe-cluster)的合成，并且是nifS家族蛋白质成员。硫辛酸来自辛酸，在能量代谢中用作辅酶，可以成为丙酮酸脱氢酶复合物和α-酮戊二酸脱氢酶复合物的一部分。叶酸盐是一组叶酸的衍生物，依次来自L-谷氨酸、对氨基苯甲酸和6-甲基蝶呤。起始于代谢中间体5’-三磷酸鸟嘌呤(GTP)、L-谷氨酸和对氨基苯甲酸的叶酸及其衍生物的生物合成，在某些微生物中有详细的研究。

类咕啉(例如钴胺素，以及特别是维生素B12)和卟啉都属于以四吡咯环体系为特征的化学物质。维生素B12的生物合成是这样的复杂，以至于还没有彻底了解其特征，但是许多涉及的酶和底物现在已知。烟酸(烟酸盐)和烟碱是吡啶底衍生物，也被称作“尼亚新”。尼亚新是重要辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)及其还原形式的前体。

尽管有些这样的化合物也可以用大规模微生物培养生产，例如核黄素、维生素B6、泛酸和生物素，但是大规模生产这些化合物很大程度还依赖于非细胞化学体系。只有维生素B12，由于其合成的复杂性，只能用发酵生产。体外方法需要相当多的物质和时间投入，经常花费很大。

C.嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代谢和用途

嘌呤和嘧啶代谢基因及其相应的蛋白质，是肿瘤疾病治疗和病毒感染治疗重要的目标物。术语“嘌呤”和“嘧啶”，包含了作为核酸、辅酶和核苷酸组成的含氮碱基。术语“核苷酸”包含核酸分子基本结构单元，核酸分子由含氮碱基、戊糖(对于RNA，该戊糖是核糖；对于DNA，该戊糖是脱氧核糖)和磷酸组成。术语“核苷”包含了作为核苷酸前体的分子，但是缺少核苷酸所具有的磷酸部分。通过抑制这些分子的生物合成，或者抑制为合成核酸分子而进行的移动，可能会抑制RNA和DNA的合成；通过定向肿瘤细胞的方式来抑制该活性，肿瘤细胞分裂和复制的能量可能会得到抑制。另外，有的核苷酸不用于形成核酸，而是用作能量储存(例如AMP)或者辅酶(例如FAD和NAD)。

有些出版物描述了通过影响嘌呤和/或嘧啶的代谢，这些化学物质作为这些医学指征的使用(例如，Christopherson，R.I.and Lyons，S.D.(1990)“Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis aschemotherapeutic agents.”Med.Res.Reviews 10：505-548)。涉及嘌呤和嘧啶代谢酶类的研究，集中在可以使用的新药开发上面，例如，作为免疫抑制剂或者抗增生剂(Smith，J.L.，(1995)“Enzyme in nucleotidesynthesis.”Curr.Opin.Struct.Biol.5：752-757；(1995)Biochem Soc.Transact.23：877-902)。然而，嘌呤和嘧啶碱基，核苷和核苷酸还具有另外的作用：作为许多精细化学物质生物合成的中间体(例如，硫胺素、S-腺苷甲硫氨酸、叶酸、或者核黄素)，作为细胞能量载体(例如ATP或者GTP)，而作为化学物质本身，通常用作风味增强剂(例如IMP或者GMP)或者几种医学应用(参见，例如，Kuninaka，A.(1996)Nucleotidesand Related Compounds in Biotechnology vol.6，Rehm et al.，eds.VCH：Weinheim，，p.561-612)。同样，涉及嘌呤、嘧啶、核苷或者核苷酸代谢的酶，日渐成为开发出的用作保护农作物的化学物质的作用目标，这些化学物质包括杀真菌剂、除草剂和杀虫剂。

细菌中这些化合物的代谢具有特征(评论参见，例如Zalkin，H.andDixon，J.E.(1992)“de novo purine nucleotide biosynthesis”，in：Progress in NucleicAcid Research and Molecular Biology，vol.42，Academic Press：，p.259-287；andMichal，G.(1999)“Nucleotides and Nucleosides”，Chapter 8 in：BiochemicalPathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，Wiley：New York)。嘌呤代谢一直是重点研究课题，而且它是细胞正常功能所必需的。高等动物中受损的嘌呤代谢能够造成严重的疾病，例如痛风。嘌呤核苷酸由5’-磷酸核糖合成，通过一系列步骤，经过中间体5’-磷酸次黄嘌呤核苷(IMP)，最终产生5’-单磷酸鸟嘌呤(GMP)和5’-单磷酸腺嘌呤(AMP)，并由它们形成用作核苷酸的三磷酸形式。这些化合物也用作能量储存，其降解为细胞中各种不同的生化过程提供能量。嘧啶的生物合成，是通过由5’-磷酸核糖形成5’-磷酸尿嘧啶核苷(UMP)。UMP接下来转变成5’-三磷酸胞嘧啶(CTP)。所有这些核苷酸的脱氧形式都是经过一步还原反应产生的，由核苷酸的二磷酸核糖形式到核苷酸的二磷酸脱氧核糖形式。一经磷酸化，这些分子就可以参与DNA的合成了。

D.海藻糖的代谢和用途

海藻糖包括两个葡萄糖分子，通过α，α-1，1连接。通常在食品产业中用作增甜剂、干燥食品或者冷冻食品添加剂，以及饮料当中。而且，它也应用在制药、化妆品和生物技术产业(参见，例如Nishimoto et al.，(1998)U.S.Patent No.5,759,610；Singer，M.A.and Lindquist，S.(1998)Trends Biotech.16：460-467；Paiva，C.L.A.and Panek，A.D.(1996)Biotech.Ann.Rev.2：293-314；and Shiosaka，M.(1997)J.Japan 172：97-102)。很多微生物中的酶可以产生海藻糖，并将其天然释放到周围培养基中，可以使用技术上熟知的方法从中进行收集。

II.本发明的元件和方法

本发明至少部分是建立在发现新分子的基础上的，此处将其称作MP核酸和蛋白质分子(见表1)，它们在一种或多种细胞代谢途径中起作用或发挥功能。在一个实施方案中，MP分子催化一种或多种氨基酸如赖氨酸或甲硫氨酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应。在优选实施方案中，本发明的一种或多种谷氨酸棒杆菌氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的MP分子活性，单独或与相同或不同代谢途径(如甲硫氨酸或赖氨酸代谢)的分子组合，对用该微生物生产所需精细化学物质有影响。在一个特别优选的实施方案中，本发明MP分子的活性被调节，使得本发明的MP蛋白参与的代谢途径效率或产量被调节，这会直接或间接影响谷氨酸棒杆菌中一种或者多种精细化学物质的生产和生产效率。在优选实施方案中，精细化学物质是氨基酸如赖氨酸或甲硫氨酸。在另一个优选实施方案中，MP分子是metZ、metY和/或RXA00657(见表1)。

术语“MP蛋白”或者“MP多肽”包含了在一种或多种氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中起作用如催化其中的酶促反应的蛋白质。MP蛋白的实例包括那些由列在序列表中序列号为奇数的MP基因编码的蛋白质。术语“MP基因”或者“MP核酸序列”包含了编码MP蛋白的核酸序列，后者包含编码区域以及相应的非翻译的5’和3’序列区域。MP基因的实例包括那些列在表1中的基因。术语“生产”或者“生产力”是本领域熟知的，包含了在给定时间和给定发酵体积内，发酵产物(例如，所需精细化学物质)的浓度(例如，每小时每升千克产物)。术语“生产效率”包含了，要达到特定的生产水平所需的时间(例如，需要多长时间才能使细胞达到特定的精细化学物质)。术语“收益”“产物/碳收益”是本领域熟知的，包含了把碳源转化成产物(例如精细化学物质)的效率。例如，经常写作千克产物每千克碳源。通过提高化合物的收益或者生产，可增加回收分子的数量，或者增加在给定时间内给定数量的培养物中该化合物有用回收分子的数量。术语“生物合成”或者“生物合成途径”是本领域熟知的，包含了在细胞中，从中间化合物经过可能是多步并且是高度调控的过程，合成化合物，特别是有机化合物。术语“降解”或者一条“降解途径”是本领域熟知的，包含了在细胞中，经过可能是多步并且是高度调控的过程，把化合物，优选是有机化合物，分解为降解产物(一般而言，是更小或者复杂性更小的分子)。术语“代谢”是本领域熟知的，包含了生物体中所发生的生化反应的全部。因而，特殊化合物的代谢(例如，像是甘氨酸这样的氨基酸代谢)包括细胞中与该化合物相关的全部生物合成、修饰和降解途径。

本发明的MP分子可以与一种或多种本发明的MP分子或一种或多种相同或不同代谢途径的分子组合，以增加所需精细化学物质的产量。在优选实施方案中，精细化学物质是氨基酸如赖氨酸和甲硫氨酸。或者，此外，不需要的负产物通过MP分子或其他代谢分子(如参与赖氨酸或甲硫氨酸代谢的分子)的组合或破坏而得以减少。与相同或不同代谢途径的其他分子组合的MP分子可以改变器核苷酸序列和相应氨基酸序列，以改变其生理条件下的活性，从而增加所需精细化学物质的产量和/或产率。在再一个实施方案中，原始形式或如上所述改变形式的MP分子可以与相同或不同代谢途径的其他分子组合，这些分子的核苷酸序列发生了改变，导致所需精细化学物质如甲硫氨酸或赖氨酸等氨基酸的产量和/或产率增加。

在另一个实施方案中，本发明的MP分子单独或与相同或不同代谢添加中的一种或多种分子组合，能够调节微生物中，例如谷氨酸棒杆菌中，所需化合物例如精细化学物质的产生。使用重组遗传技术可以操作本发明的一种或者多种氨基酸如赖氨酸或甲硫氨酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖生物合成或降解酶，从而调节其活性。例如，可以提高生物合成酶的效率，或破坏其别构控制区从而防止化合物生产的反馈抑制。类似地，降解酶可以通过置换、缺失或增加被缺失或修饰，从而其对所需化合物的降解活性降低，而不影响细胞的活力。在各种情况下，所需精细化学物质的总产量或产率均被提高。

本发明的蛋白质和核苷酸分子的改变也可能提高除氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖以外的其它精细化学物质的生产。任一种化合物的代谢必然与细胞内其它生物合成和降解途径关联，一种途径中的必需辅因子、中间体或底物可能由其它同类途径供给或受其限制。因此，通过调整一种或多种本发明蛋白的活性，另一种精细化学物质生物合成或降解途径活性的生产或效率可能会受到影响。例如，氨基酸可以作为所有蛋白质的结构单元，但其在细胞内的存在的水平可能会限制蛋白合成；因此，通过增加细胞内一种或多种氨基酸的生产效率或产率，诸如生物合成或降解蛋白的蛋白可以更容易合成。同样，代谢途径酶的改变使得特定副反应更有利或不利时，会导致一种或多种用作生产所需精细化学物质的中间体或底物的化合物过量生产或生产不足。

本发明的分离核酸序列，包含在谷氨酸棒杆菌菌株的基因组中，该菌株可由美国典型培养物保藏中心获得，保藏号ATCC 13032。分离的谷氨酸棒杆菌MP DNA核酸序列，以及预测的谷氨酸棒杆菌MP蛋白氨基酸序列，在序列表中分别以奇数序列号和偶数序列号列出。进行了计算机分析，并将这些核酸序列分类和/或鉴定为编码代谢途径蛋白质的序列，如参与甲硫氨酸或赖氨酸代谢途径的蛋白。

本发明也与这样的蛋白质有关，该蛋白质的氨基酸序列与本发明的氨基酸序列有充分的同源性(例如，序列表中偶数序列号的序列)。如此处所用的那样，具有与挑选出的氨基酸序列有充分同源性的氨基酸序列的蛋白质，与挑选出的氨基酸序列，例如挑选出的氨基酸全序列，有至少大约50％同源性。具有与挑选出的氨基酸序列有很大同源性的氨基酸序列的蛋白质，也可以与挑选出的氨基酸序列有至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％同源性，优选有至少大约61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％的同源性，更优选有至少大约71％，72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％或91％、92％、93％、94％的同源性，甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％、99.7％或者更高的同源性。

本发明的MP蛋白或者其生物活性部分或其片段，单独或与一种或多种相同或不同代谢途径的蛋白组合，能够催化一种或多种氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应，或者具有表1中列出的一种或者多种活性(如甲硫氨酸或赖氨酸生物合成代谢)。

以下各部分更加详细地描述了本发明的各个方面：

A.分离的核酸分子

本发明的一个方面涉及分离的编码MP多肽或者其生物活性部分的核酸分子，以及足够用作杂交探针或者引物的核酸分子片段，这些片段用于鉴定或者扩增编码MP的核酸(例如MP DNA)。如此处所用的那样，术语“核酸分子”的意思是包含DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)，以及由核苷酸类似物产生的DNA或者RNA类似物。该术语也包括位于基因编码区域3’和5’末端的非翻译序列：编码区域5’末端上游序列的至少100个核苷酸，和基因编码区域3’末端下游序列的至少20个核苷酸。核酸分子可以是单链的或者双链的，但是优选是双链DNA。“分离的”核酸分子，是指那些与存在于核酸天然来源中的其他核酸分子相互分离的核酸分子。优选，“分离的”核酸不含有天然位于生物体基因组DNA中核酸两侧的序列(例如，位于核酸5’和3’末端的序列)，核酸就是从该生物体中获得的。例如，在各种实施方案中，分离的MP核酸分子可以含有少于大约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或者0.1kb的核苷酸序列，该序列天然位于细胞基因组DNA核酸分子的两侧，核酸就是从这些细胞(例如，谷氨酸棒杆菌细胞)中获得的。另外，“分离的”核酸分子，例如DNA分子，当用重组技术生产时可以基本上不含有其他细胞物质或者培养基，当化学合成时可以不含化学前体或者其他化学物质。

本发明核酸分子，例如序列表中奇数序列号的核苷酸序列，或者其部分，可以通过标准分子生物学技术和此处提供的序列信息分离得到。例如，谷氨酸棒杆菌MP DNA可以从谷氨酸棒杆菌文库中，使用序列表中奇数序列号序列中一个序列的全部或者其部分作为杂交探针，以及标准杂交技术(例如，像是描述在Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2^nd，ed.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中的)分离得到。另外，包含一条本发明核酸序列(例如，序列表中奇数序列号的核苷酸序列)全部或者一部分的核酸分子，可以通过聚合酶链式反应，使用基于该序列设计的寡聚核苷酸引物，分离得到(例如，包含一条本发明核酸序列(例如，序列表中奇数序列号的核苷酸序列)全部或者一部分的核酸分子，可以通过聚合酶链式反应，使用基于该相同序列设计的寡聚核苷酸引物，分离得到)。例如，mRNA可以从正常内皮细胞分离得到(例如，使用Chirgwin et al.(1979)Biochemistry 18：5294-5299中的硫氰酸胍提取方法)，DNA可以通过逆转录酶(例如，Gibco/BRL，Bethesda，MD提供的Moloney MLV逆转录酶；或者SeikagakuAmerica，Inc.，St.Peterburg，FL提供的AMV逆转录酶)制备。为聚合酶链式反应合成的寡聚核苷酸引物，可以基于序列表中列出的一条核苷酸序列设计。本发明的核酸，可以使用cDNA或者作为另一种选择的基因组DNA作模板，合适的寡聚核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术来扩增。这样扩增出的核酸，可以克隆到合适的载体中，并用DNA序列分析辨别其特征。另外，与MP核苷酸序列相对应的寡聚核苷酸，可以用标准合成技术准备，例如使用自动DNA合成仪。

在一个优选的实施方案中，分离的本发明核酸分子包含序列表中列出的一条核苷酸序列。本发明的核酸序列，正如在序列表中列出的那些，与本发明的谷氨酸棒杆菌MP DNA是一致的。这些DNA包含编码MP蛋白的序列(即“编码区域”，显示在每条序列表中奇数序列号序列中)，以及5’非编码序列和3’非编码序列，也显示在每条序列表中奇数序列号序列中。作为另一种选择，核酸分子可以只包含序列表中核酸序列的编码区域。

为了该申请的目的，可以理解序列表中列出的一些MP核酸和氨基酸序列，都有一个用于识别的RXA，RXN，RXS或者RXC编号，“RXA”，“RXN”，“RXS”，或者“RXC”后面有5个数字(即，RXA，RXN，RXS，或者RXC)。每条核酸序列最多包含三部分：5’上游区域，编码区域，下游区域。三个区域的每个部分，都用相同的RXA，RXN，RXS，或者RXC名称确定以消除混淆。于是叙述“序列表中的一条奇数编码的序列”，是指序列表中的任何核酸序列，这些序列也可以用它们不同的RXA，RXN，RXS，或者RXC名称相互区分。每条这种序列的编码区域都被翻译成相应的氨基酸序列，这些序列也列在序列表中，为紧随相应核酸序列之后偶数序列号。例如，RXA00115的编码区域列在SEQ ID NO：69，而它编码的氨基酸序列列在SEQ ID NO：70。本发明的核酸分子序列，与其编码的氨基酸分子，用相同的RXA，RXN，RXS，或者RXC名称表示，使得它们容易相互联系。例如，称为RXA00115，RXN00403和RXS03158的氨基酸序列，分别是RXA00115，RXN00403和RXS03158核酸分子核苷酸序列编码区域的翻译。本发明RXA，RXN，RXS和RXC核苷酸和氨基酸序列之间的对应，以及它们被指定的序列号列在表1中。

本发明的几个基因是“F-标明的基因”。F-标明的基因包括那些列在表1中并在RXA，RXN，RXS，或者RXC标明前有“F”的基因。例如，SEQ ID NO：77，像在表1中表示的那样，被指定为“F RXA00254”，就是一个F-标明的基因。

表1中列出的还有metZ(或metY)和metC基因(分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3)。metZ和metC基因编码的相应氨基酸序列分别称为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5。

在一个实施方案中，本发明的核酸分子不包含汇编在表2中的那些谷氨酸棒杆菌分子。

在另一个优选的实施方案中，分离的本发明的核酸分子，包含那些是本发明核苷酸序列(例如，序列表中奇数序列号序列)或者其部分的互补分子的核酸分子。与本发明一条核苷酸序列充分互补的核酸分子，是指该分子与序列表中列出的一条核苷酸序列(例如，奇数序列号序列)充分互补，因此它可以与本发明的一条核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双螺旋。

同样在另一个优选的实施方案中，分离的本发明的核酸分子，包含这样的核苷酸序列，该序列与本发明的核苷酸序列(例如，序列表中奇数序列号序列)或者其部分，有至少大约50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％的同源性，优选的有至少大约61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％的同源性，更优选的有至少大约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％，99.7％或者更高的同源性。以上引用范围(例如，70-90％一致性或者80-95％一致性)中间的范围和一致性值，也包含在本发明中。例如，包含了这样的一致性值范围，这些范围是上面引用的上限和/或下限值的组合。在另一种优选的实施方案中，本发明分离的核酸分子包括这样的核苷酸序列，该序列可以与本发明的一条核苷酸序列或者其部分进行杂交，例如，在严格条件下杂交。

另外，本发明核酸分子可能只包含序列表中奇数序列号序列编码区域的一部分，例如，可以用作探针或者引物的片段，或者编码MP蛋白生物活性部分的片段。由谷氨酸棒杆菌MP基因克隆出的核苷酸序列，容许产生探针和引物，这些探针和引物的设计是用于鉴定和/或克隆其他细胞类型或者其他生物体中的MP同系物，以及其他棒杆菌或者亲缘物种中的MP同系物。探针/引物典型的包括相当纯化的寡聚核苷酸。寡聚核苷酸典型的包括这样一段核苷酸序列的区域，该区域在严格杂交条件下，与本发明核苷酸序列(例如，序列表中奇数序列号序列)的有义链，这些序列的反义序列，或者其天然存在的突变体的至少大约12个，优选的大约25个，更优选的大约40，50，或者75个连续核苷酸杂交。基于本发明核苷酸序列的引物，可以用于克隆MP同系物的PCR反应。基于MP核苷酸序列的探针，可以用于探测相同的或者同源蛋白的转录或者基因组序列。在一个优选的实施方案中，探针更是包括另外的附着标记基团，例如标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或者酶的辅因子。这种探针可以用作诊断检测试剂盒的一部分，该试剂盒用于鉴定错误表达MP蛋白的细胞，像是通过测定样本细胞中MP编码核酸的水平，例如，检测MP mRNA的水平，或者测定基因组MP基因是否发生了突变或者缺失。

在一个实施方案中，本发明核酸分子编码一种蛋白质或者其部分，该蛋白质或者其部分的氨基酸序列与本发明的氨基酸序列(例如，序列表中偶数序列号序列)有充分的同源性，从而使得该蛋白质或者其部分可以催化氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应。如此处所用的那样，术语“充分的同源性”是指蛋白质或者其部分的氨基酸序列，含有最小数目的与本发明氨基酸序列一致的或者等价的(例如，具有与序列表偶数序列号序列中的氨基酸残基相似侧链的氨基酸残基)氨基酸残基，从而使得该蛋白质或者其部分，能够催化谷氨酸棒杆菌中氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应。这种代谢途径蛋白质成员，像这里描述的那样，其功能是催化一种或多种氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖的生物合成或降解。这里也描述了这种活性的实例。因而，“MP蛋白的功能”对于一种或多种这种代谢途径有作用，和/或直接或者间接影响一种或者多种精细化学物质的产量、生产和/或生产效率。MP蛋白活性的实例在表1中列出。

在另一个实施方案中，蛋白质与本发明的全部氨基酸序列(例如，序列表中偶数序列号序列)有至少大约50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％的同源性，优选的有至少大约61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％的同源性，更优选的有至少大约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％，99.7％或者更高的同源性。

本发明MP核酸分子编码蛋白质的部分，优选是MP蛋白的生物活性部分。如此处所用的那样，术语“MP蛋白的生物活性部分”的意思是包含MP蛋白这样的部分，例如结构域/基元，该部分能够催化谷氨酸棒杆菌中一种或多种氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应或具有表1中所列活性。可以进行一种酶活性分析，以确定MP蛋白或者其生物活性部分是否可以催化氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应。这种分析方法对于本领域技术人员来说是熟知的，在范例的实例8中有详细的描述。

编码MP蛋白生物活性部分的额外的核酸片段，可以通过以下方法制备，分离本发明氨基酸序列(例如，序列表中偶数序列号序列)的一部分，表达MP蛋白或者多肽的编码部分(例如，通过体外重组表达)，并且估算MP蛋白或者多肽编码部分的活性。

因为遗传密码子的简并性，以及由此可以编码得到和本发明核苷酸序列编码蛋白质相同的MP蛋白，所以本发明进一步包含不同于本发明核苷酸序列(例如，序列表中奇数序列号序列)(和其部分)的核酸分子。在另一个实施方案中，分离的本发明的核酸分子具有这样的核苷酸序列，该序列编码具有序列表中列出的氨基酸序列(例如，偶数序列号)的蛋白质。同样在另一个实施方案中，本发明核酸分子编码全长的谷氨酸棒杆菌蛋白质，该蛋白质与本发明的氨基酸序列(由序列表中奇数序列号开放阅读框架编码)有充分的同源性。

在一个实施方案中，本发明的序列并不意味着包括以前技术上已知的序列，例如那些列在表2中的在本发明以前就可获得的Genbank序列，这对于本领域技术人员来说是可以理解的。在一个实施方案中，本发明包含这样的核苷酸序列和氨基酸序列，该序列与本发明的核苷酸序列和氨基酸序列有一定百分比的一致性，该百分比大于技术上已知的序列(例如，表2列出的Genbank序列(或者该序列编码的蛋白质))与本发明的核苷酸序列和氨基酸序列一致性的百分比。例如，本发明包含与标明为RXA00657(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列有大于和/或至少45％一致性的核苷酸序列。本领域技术人员，通过检查表4中列出的对于每个特定序列给出的3个最高符合的GPA-计算百分比一致性，以及经过从百分之一百中减去最高的GPA-计算百分比一致性，可以计算任何本发明特定序列百分比一致性的低端域值。本领域技术人员也可以意识到，其百分比一致性大于如此计算出的低端域值(例如，至少约50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％，优选的至少大约61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％，更优选的至少大约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更优选的至少大约95％，96％，97％，98％，99％或者更高的一致性)的核酸和氨基酸序列，也是包含在本发明中的。

本领域技术人员可以意识到，除了在序列表中以奇数序列号列出的谷氨酸棒杆菌MP核苷酸序列之外，导致MP蛋白氨基酸序列改变的DNA多态性可以在一定群体(例如谷氨酸棒杆菌群体)中存在。这种MP基因的遗传多态性，可以由于自然条件的变异而在一个群体的不同个体中存在。如此处所用的那样，术语“基因”和“重组基因”是指含有编码MP蛋白的开放阅读框架的核酸分子，优选的MP蛋白是谷氨酸棒杆菌MP蛋白。这种自然条件的变异典型的可以造成MP基因核苷酸序列1-5％的变化。任何以及全部由于自然条件的变异造成的，并且不改变MP蛋白功能活性的，这种核苷酸的变化，以及引起的MP氨基酸的多态性，都属于本发明范围之内。

相应天然变体的核酸分子，和本发明谷氨酸棒杆菌MP DNA的非谷氨酸棒杆菌同源物，可以基于此处公开的它们与谷氨酸棒杆菌MP核酸分子的同源性，使用谷氨酸棒杆菌DNA或者其部分作为杂交探针，在严格杂交条件下根据标准杂交技术分离得到。因此，在另一个实施方案中，分离的本发明核酸分子的长度至少有15个核苷酸，在严格条件下与含有序列表奇数序列号核苷酸序列的核酸分子杂交。在其他实施方案中，核酸分子的长度至少有30，50，100，250或者更多个核苷酸。如此处所用的那样，术语“在严格条件下杂交”的意思是描述这样的杂交和清洗的条件，在该条件下彼此之间有至少60％同源性的核苷酸序列相互之间保持典型的杂交。优选，这种条件是序列之间有至少大约65％，更优选的有至少大约70％，以及甚至更优选的有至少大约75或者更高的同源性，相互之间保持典型的杂交。这种严格条件对于本领域技术人员是已知的，可以在Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。一种优选的但不是限制的严格杂交条件是，在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中大约45℃进行杂交，然后用0.2X SSC，0.1％SDS在50-65℃清洗一次或者多次。优选，分离的本发明的核酸分子，在严格杂交条件下与本发明的核苷酸序列杂交，相当于得到天然存在的核酸分子。如此处所用的那样，“天然存在的”核酸分子是指具有自然中存在的核苷酸序列(例如，编码天然蛋白质)的RNA或者DNA分子。在一个实施方案中，核酸编码天然谷氨酸棒杆菌MP蛋白。

本领域技术人员可以进一步意识到，除了群体中存在的天然存在的MP序列变体以外，可以通过突变把改变引入本发明核苷酸序列中，从而导致被编码MP蛋白的氨基酸序列的改变，而不改变MP蛋白的功能。例如，可以在本发明核苷酸序列中，进行可以导致“非必需”氨基酸残基的氨基酸取代的核苷酸取代。“非必需”氨基酸残基是指这样的残基，该残基可以在MP蛋白的野生型序列(例如，序列表中偶数序列号序列)中发生改变，而不改变MP蛋白的活性，而“必需”氨基酸残基是MP蛋白活性所必需的。然而，其他氨基酸残基(例如，那些在MP活性结构域中非保守的或者只是半保守的氨基酸残基)可能对于活性不是必需的，因此也可以在不改变MP活性的情况下被改变。

因此，本发明的另一个方面涉及编码这样的MP蛋白的核酸分子，该MP蛋白含有对MP活性非必需的氨基酸残基的变化。这些蛋白质的氨基酸序列不同于序列表中偶数序列号序列，但仍然保持至少一种此处描述的MP活性。在一个实施方案中，分离的核酸分子包含一段编码蛋白质的核苷酸序列，其中该蛋白质的氨基酸序列与本发明的氨基酸序列有至少大约50％的同源性，并且能够催化氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应，或者具有表1中列出的一种或者多种活性。优选，核酸分子编码的蛋白质与本发明的氨基酸序列，有至少大约50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％的同源性，优选的有至少大约61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％的同源性，更优选的有至少大约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％，99.7％或者更高的同源性。。

为了确定两种氨基酸序列(例如，本发明的一种氨基酸序列与其突变体形式)或者两种核酸序列的同源性百分比，出于最适宜比较的目的，对序列进行序列对比(例如，为了与其他蛋白质或者核酸进行最适宜的序列对比，可以在一种蛋白质或者核酸的序列中引入间隙)。然后比较相应氨基酸位置的氨基酸残基或者核酸位置的核苷酸。当一条序列(例如，本发明的一条氨基酸序列)中的一个位置被与其他序列(例如，氨基酸序列的突变体形式)相应位置相同的氨基酸残基或者核苷酸占据时，该分子在这个位置是同源的(即，如此处所用的氨基酸或者核酸“同源性”与氨基酸或者核酸的“一致性”是相同的)。两条序列之间的百分比同源性，是一个相同位置数目被序列均分的函数(即，％一致性＝相同位置的#/全部位置的#x 100)。

分离的与本发明蛋白质序列(例如，序列表中偶数序列号序列)同源的编码MP蛋白质的核酸分子，可以通过向本发明核苷酸序列中引入一个或者多个核苷酸取代、插入、缺失而产生，从而在编码蛋白质中引入一个或者多个氨基酸取代、插入、缺失。可以使用标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，在本发明核苷酸序列中引入突变。优选，保守的氨基酸取代是在一个或者多个预期的非必需氨基酸残基进行的。“保守的氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族，在技术上有规定。这些家族包括，具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有无电荷极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香组侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，预期的MP蛋白中的非必需氨基酸残基，优选的被同一侧链家族中的其他氨基酸取代。另外，在另一个实施方案中，可以在MP编码序列全长或者部分，随机的引入突变，例如通过饱和诱变，根据此处描述的鉴定具有MP活性突变体的MP活性，筛选出得到的突变体。在一条序列表中奇数序列号核苷酸序列诱变之后，被编码蛋白质可以重组表达，蛋白质活性也可以，例如使用此处描述的分析(参见范例的实例8)，得到确定。

除了以上描述的编码MP蛋白质的核酸分子以外，本发明的另一方面还与分离的反义核酸分子有关。“反义”核酸包括与编码蛋白质的“有义”核酸互补的核苷酸序列，例如与双链DNA分子编码链互补，或者与mRNA序列互补。因此，反义核酸可以通过氢键与有义核酸连接。反义核酸可以与全部MP编码链互补，也可以仅与其部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子，与编码MP蛋白的核苷酸序列编码链的“编码区域”反义。术语“编码区域”是指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域(例如，SEQ ID NO.1(metZ)的全部编码区域包括363至1673核苷酸)。在另一个实施方案中，反义核酸分子，与编码MP的核苷酸序列编码链的反义。术语“非编码区域”是指编码区域两侧不翻译成氨基酸的5’和3’序列(即5’和3’非翻译区域)。

考虑到此处公布的编码MP的编码链序列(例如，序列表中列出的奇数序列号序列)，本发明反义核酸可以根据Watson和Crick的碱基配对规则进行设计。反义核酸分子可以与MP mRNA的全部编码区域互补，但是更优选是这样的寡聚核苷酸，该寡聚核苷酸仅与MP mRNA的编码区域或者非编码区域的部分是反义的。例如，反义寡聚核苷酸可以与MP mRNA翻译起始位置附近的区域互补。例如，反义寡聚核苷酸的长度可以是5，10，15，20，25，30，35，40，45或者50个核苷酸。本发明的反义核酸分子，可以使用技术上已知的程序，通过化学合成或者酶促连接反应构建。可以使用天然存在的核苷酸或者各种经过修饰的核苷酸，化学合成反义核酸(例如反义寡聚核苷酸)，那些经过修饰的核苷酸，是为了增加分子的生物稳定性，或者为了增加反义核酸与有义核酸之间形成双螺旋的物理稳定性而设计的，例如可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的经修饰的核苷酸的实例包括，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，beta-D-半乳糖基肌苷，N6-异戊基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基尿嘧啶-2-硫代尿嘧啶，beta-D-甘露糖基queosine，5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-异戊基腺嘌呤，尿嘧啶-5-含氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-含氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-含氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w，以及2，6-二氨基嘌呤。另外，反义核酸可以使用表达载体生物合成，其中核酸被反义方向亚克隆到表达载体中(即，由插入核酸转录的RNA，相对于插入的目的核酸是反义方向的，以下部分有进一步叙述)。

本发明的反义核酸分子，被典型的施用于细胞或者在原位产生，从而它们可以与编码MP蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或者结合，进而抑制蛋白质的表达，例如，抑制转录和/或翻译。杂交可以通过常规核苷酸互补性而形成稳定的双螺旋，或者，例如，当反义核酸分子结合DNA双螺旋时，它与双螺旋的大沟发生特殊相互作用。反义分子可以被修饰，从而使得该分子可以与受体或者与特定细胞表面表达的抗原特异性结合，例如，反义核酸分子与多肽或者抗体的结合，该抗体与细胞表面受体或者抗原结合。反义核酸分子也可以使用此处描述的载体递送至细胞。为了得到细胞内足够浓度的反义分子，这样的载体是优选，即在该载体中，反义核酸分子被置于原核、病毒或者真核启动子的控制之下。

而在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是一种α-异头物核酸分子。α-异头物核酸分子与互补的RNA形成特异的双链杂交体，杂交体中两股链走向彼此平行，这与通常的β-单元相反(Gaultier et al.(1987)Nucleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子也可以包含2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.(1987)Nucleic Acids.Res.15：6131-3148)或者化学RNA-DNA类似物(Inoue et al.(1987)FEBS Lett.215：327-330)。

而在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是核酶。核酶是催化型RNA分子，具有核糖核酸酶活性，能够切割单链核酸，例如mRNA，它具有与单链核酸互补的区域。因此，核酶(例如，锤头核酶(描述于Haselhoff and Gerlach(1988)Nature 334：585-591))可以用于催化切割MP mRNA转录物，从而抑制MP mRNA的翻译。对于MP编码核酸分子有特异性的核酶，可以基于此处公布的MP DNA核苷酸序列(即SEQ IDNO：1(metZ))来设计。例如，可以构建四膜虫属L-19IVS RNA的衍生物，其活性位点的核苷酸序列与被切割的MP-编码mRNA的核苷酸序列是互补的。参见，例如，Cech et al.U.S.Patent No.4,987,071和Cech et al.U.S.Patent No.5,116,742。另外，MP mRNA可以用于RNA分子库中筛选具有特异核酶活性的催化型RNA。参见，例如，Bartel，D.and Szostak，J.W.(1993)Science 261：1411-1418。

另外，通过把与MP核苷酸序列调节区域(例如，MP启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列作为目标，形成三螺旋结构，可以抑制MP基因的表达，该三螺旋结构可以阻止MP基因在目的细胞中的转录。一般参见，Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，C.etal.(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；and Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)：807-15。

本发明另一方面涉及参与甲硫氨酸和/或赖氨酸代谢的基因组合和该基因组合在本发明方法中的用途。优选的组合是metZ和metC、metB(编码胱硫醚合酶)、metA(编码高丝氨酸O乙酰转移酶)、metE(编码甲硫氨酸合酶)、metH(编码甲硫氨酸合酶)、hom(编码高丝氨酸脱氢酶)、asd(编码天冬氨酸半醛脱氢酶)、lysC/ask(编码天冬氨酸激酶)和rxa00657(此处称为SEQ ID NO：5)、dapA(编码二氢吡啶二羧酸合成酶)、dpaB(编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因)、dapC(编码2，3，4，5-四氢吡啶-2-羧化物N-琥珀酰转移酶的基因)，dapD/argD(编码乙酰鸟氨酸转氨酶的基因)，dapE(编码琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶的基因)，dapF(编码二氨基庚二酸差向异构酶的基因)，lysA(编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因)，ddh(编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因)，lysE(赖氨酸外泌蛋白的基因)，lysG(编码外泌调节物的基因)，hsk(编码高丝氨酸激酶的基因)以及参与添补反应的基因如ppc(编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因)，ppcK(编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因)，pycA(编码丙酮酸羧化酶的基因)，accD，accA，accB，accC(编码乙酰辅酶A羧化酶的基因)，以及戊糖磷酸途径的基因，编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的gpdh基因，opcA，pgdh(编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因)，ta(编码转醛醇酶的基因)，tk(编码转酮醇酶的基因)，pgl(编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶的基因)，rlpe(编码核酮糖磷酸3-差向异构酶的基因)、rpe(编码核酮糖磷酸5-差向异构酶的基因)的组合或上述戊糖磷酸途径基因或其他本发明MP基因的组合。

所述基因可以改变其核苷酸序列和相应氨基酸序列，产生在生理条件下活性发生改变的衍生物，从而增加所需精细化学物质如甲硫氨酸和赖氨酸等氨基酸的产量和/或产率。编码天冬氨酸激酶的ask基因的核苷酸序列的改变或衍生物是熟知的。这些改变导致赖氨酸和苏氨酸的反馈抑制消除，从而消除了对赖氨酸过量产生的抑制。在优选的实施方案中，metZ基因或metZ基因的改变形式与ask、hom、metA和metH或这些基因的衍生物组合用于棒杆菌中。在另一个优选实施方案中，metZ基因或metZ基因的改变形式的组合与ask、hom、metA和metE或这些基因的衍生物组合，或者metZ与ask、hom、metA和metE或这些基因的衍生物组合用于棒杆菌中，并且硫源如硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐和更加还原的硫源如硫化氢和硫醚和衍生物用于培养基中。硫源如甲基硫醇、甲烷磺酸、硫代羟乙酸、硫代氰酸盐、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸和其他含硫化合物也可使用。本发明另一方面涉及上述基因组合在棒杆菌中的用途，所述菌株在导入所述基因之前或之后，通过辐射或本领域技术人员熟知的诱变剂进行诱变，并对高浓度目标精细化学物质如赖氨酸或甲硫氨酸或所需精细化学物质的类似物如甲硫氨酸类似物乙硫氨酸、甲基甲硫氨酸等进行选择。在另一个实施方案中，上述基因组合可以在具有特定基因破坏的棒杆菌菌株中表达。优选的基因破坏是是编码促使碳向不需要的代谢物流动的蛋白质。在甲硫氨酸是所需精细化学物质时，形成赖氨酸就是不利的。在这种情况下，上述基因的组合应当在lysA基因(编码二氨基庚二酸脱羧酶)或ddh基因(编码催化四氢吡啶二羧酸向内消旋二氨基庚二酸转变的内消旋二氨基庚二酸脱氢酶)被破坏的棒杆菌菌株中进行。在优选的实施方案中，上述基因的有利组合被改变使得其基因产物不受终产物或形成所需精细化学物质的生物合成途径的代谢物反馈抑制。在所需精细化学物质是甲硫氨酸时，该基因组合可以在已经用诱变剂或辐射处理的菌株中表达，并对上述抗性选择。此外，该菌株应当生长在含有一种或多种上述硫源的培养基中。

在另一个优选实施方案中，从谷氨酸棒杆菌基因组中鉴定到一个推定的转录调控蛋白。该基因被称为RXA00657。RXA00657的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。RXA00657的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。当RXA00657以及实施例中所述的上游和下游调控区被克隆到能够在谷氨酸棒杆菌中复制的载体中并转化从而在产赖氨酸菌株如ATCC13286中表达时，该菌株相对于用缺少上述RXA00657核苷酸片段的相同质粒转化的菌株产生更多的赖氨酸。除了观察到上述菌株中赖氨酸效价增加外，由产生的赖氨酸的摩尔数与消耗的蔗糖摩尔数比较确定的选择性也增加了(见实施例14)。RXA00657的过量表达与其他直接参与赖氨酸特异性途径的基因如lysC，dapA，dapB，dapC，dapD，dapF，ddh，LysE，LysG和lysR的过量表达组合产生的赖氨酸较仅有RXA00657时增加了。

B.重组表达载体和宿主细胞

本发明的另一方面涉及载体，优选是含有编码MP蛋白(或者其部分)的核酸或有至少一个编码MP蛋白的基因的基因组合的表达载体。如此处所用的那样，术语“载体”是指能够连接其他核酸，并对其进行运输的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，质粒是指环形双链DNA环，其中连接有额外的DNA片段。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体可以在它们被引入的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体，以及附加型哺乳动物载体)。其他的载体(例如，非附加型哺乳动物载体)一经引入宿主细胞就会整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一同复制。另外，某些载体能够指导与之相连接的基因的表达。这些载体此处称作“表达载体”。总之，重组DNA技术使用的表达载体经常是质粒形式。在本说明中，“质粒”和“载体”可以交换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明有意包括这些表达载体的其他形式，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，它们具有相同的功能。

本发明重组表达载体包括本发明的核酸，该核酸在宿主细胞中以适合核酸表达的形式存在，这就意味着重组表达载体含有一条或者多条调节序列，这些序列是基于用作表达的宿主细胞选出的，它们被可行的连接到要表达的核酸序列上。在重组表达载体中，“可行的连接”的意思是指，感兴趣核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式进行连接(例如，在体外转录/翻译系统中，或者在载体被引入的宿主细胞中)。术语“调节序列”的意思是包括启动子、增强子和其他表达控制元素(例如，聚腺苷酸化信号)。这种调节序列在，例如，Goeddel；GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中有描述。调节序列包括，那些在很多类型宿主细胞中，指导核苷酸序列组成型表达的序列，以及那些在某些宿主细胞中，指导核苷酸序列表达的序列。优选的调节序列是，例如，像是cos-，tac-，trp-，tet-，trp-tet-，lpp-，lac-，lpp-lac-，lacI^q-，T7-，T5-，T3-，gal-，trc-，ara-，SP6-，arny-，SPO2-，λ-P_R-或者λP_L这样的启动子，这些启动子优选的使用在细菌中。另外的调节序列是，例如，酵母和真菌的启动子，例如ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH，植物的启动子，例如，CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，nos或者ubiquitin-或phaseolin-启动子。也可以使用人造启动子。这些对于本领域技术人员是可以意识到的，即表达载体的设计依赖于这些因素：用于转化的宿主细胞的选择，所需蛋白质的表达水平等。本发明的表达载体可以引入宿主细胞，从而产生此处描述的核酸所编码的蛋白质或者多肽，包括融合蛋白质或者多肽(例如，MP蛋白、MP蛋白的突变形式、融合蛋白质等)。

可以设计本发明的重组表达载体，用于在原核或者真核细胞中表达MP蛋白。例如，MP基因可以在以下细胞中表达，像是谷氨酸棒杆菌这样的细菌细胞，昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)，酵母和其他真菌细胞(参见Romanos，M.A.et al.(1992)“Foreign gene expression in yeast：areview”，Yeast 8：423-488；van den Hondel，C.A.M.J.J.et al.(1991)“Heterologous gene expression in filamentous fungi”in：More GeneManipulations in Fungi，J.W.Bennet & L.L.Lasure，eds.，p.396-428：Academic Press：San Diego；and van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)“Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi，in：Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F.et al.，eds.，p.1-28，Cambridge University Press：Cambridge)藻类或者多细胞植物细胞(参见Schmidt，R.and Willmitzer，L.(1998)High efficiency Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf andcotyledon explants”Plant Cell Rep.：583-586)，或者哺乳动物细胞。适当的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有进一步论述。另外，重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。

原核细胞中的蛋白质表达，经常是由含有组成型或者诱导型启动子的载体进行的，这些启动子指导融合蛋白质或者非融合蛋白质的表达。融合载体在编码蛋白质上添加一定数目的氨基酸，通常是在重组蛋白质的氨基末端，但也可以在C末端，或与蛋白中的合适区域融合。这种融合载体具有3个典型用途：1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的溶解性；和3)用作亲和纯化的配基，帮助融合蛋白纯化。在融合表达载体中，蛋白质切割位点经常是被引入到融合部分与重组蛋白质的结合处，使得在纯化出融合蛋白质之后，能够把重组蛋白质与融合部分分离开。这种酶，以及它们的同源识别序列，包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。

典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.and Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们分别与目标重组蛋白融合了谷光甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖E结合蛋白，或者蛋白质A。在一个实施方案中，MP蛋白编码序列被克隆到pGEX表达载体中，产生一个编码融合蛋白的载体，该载体从N-末端到C-末端包括，GST-凝血酶切割位点-X蛋白质。融合蛋白可以使用谷光甘肽-琼脂糖树脂，通过亲和层析纯化。与GST分离开的重组MP蛋白，可以通过用凝血酶切割融合蛋白质得到。

合适的大肠杆菌诱导型非融合表达载体的实例包括，pTrc(Amann etal.，(1988)Gene 69：301-315)，pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19，pKC30，pRep4，pSH1，pSH2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III 113-B1，λgt11，pBdC1，和pET 11d(Studier et al.，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；and Pouwels et al.，eds.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。pTrc载体的目标基因表达，依赖于杂交trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶的转录。pET 11d载体的目标基因表达，依赖于共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的T7gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或者HMS 174(DE3)中驻留的λ噬菌体提供，该噬菌体含有在lacUV 5启动子转录控制下的T7gn1基因。对于其他种类细菌的转化，可以选择合适的载体。例如，已知质粒pIJ101，pIJ364，pIJ702和pIJ361转化链霉菌是有效的，而质粒pUB110，pC194，或者pBD214适合转化杆状菌种。有助于把遗传信息转入棒状杆菌的几种质粒包括pHM1519，pBL1，pSA77或者pAJ667(Pouwels et al.，eds.(1985)Cloning Vectors，Elsevier：NewYork IBSN 0 444 904018)。

一种最大限度增大重组蛋白表达的方案是，在宿主细胞中表达这样的蛋白质，该蛋白质具有不会减弱的蛋白酶剪切重组蛋白质的能力(Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一种方案是改变插入表达载体中核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的密码子都是所选用于表达的细菌优先使用的，例如谷氨酸棒杆菌(Wada et al.(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本发明核酸序列的这种改变，是可以通过标准DNA合成技术进行的。

在另一个实施方案中，MP蛋白表达载体是酵母表达载体。酵母S.cerivisae用于表达的载体的实例包括，pYepSec1(Baldari，et al.，(1987)Embo J.6：229-234)，2μ，pAG-1，Yep6，Yep13，pEMBK Ye23，pMFa(Kurjan and Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz et al.，(1987)Gene 54：113-123)，和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。用于构建适合在其他真菌中，例如丝状真菌中，使用的载体的载体和方法，包括那些详述于下列文献中的：van den Hondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)“Gene transfer systems and vector development forfilamentous fungi，in：Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy，etal.，eds.，p.1-28，Cambridge University Press：Cambridge，and Pouwels et al.，eds.(1985)Cloning Vectors，Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。

另外，本发明MP蛋白可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中，用于表达蛋白质的杆状病毒载体包括，pAC系列(Smith et al.(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow and Summer(1989)Virology 170：31-39)。

在另一个实施方案中，本发明MP蛋白可以在单细胞植物细胞(例如藻类)中表达，或者在高等植物(例如种子植物，像是作物植物)的植物细胞中表达。植物表达载体的实例包括那些详述于下列文献中的：Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.and Masterson，R.(1992)″New plantbinary vectors with selectable markers located proximal to the left border″，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，M.W.(1984)″BinaryAgrobacterium vectors for plant transformation”，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721，包括pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004和pDH51(Pouwels et al.，eds.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。

也是在另一个实施方案中，本发明核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman et al.(1987)EMBO J.6：187-195)。表达载体的控制功能，当时用在哺乳动物中时，经常是由病毒调节元素提供的。例如，通常使用的启动子来自多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。其他对于原核细胞和真核细胞都合适的表达体系，参见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual.2nd，ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989的16章和17章。

在另一个实施方案中，重组的哺乳动物表达载体，能够指导特定细胞类型中优选核酸的表达(例如，组织特异性调节元素被用于表达核酸)。组织特异性调节元素在技术上是已知的。合适的组织特异性启动子的实例包括但不局限于，白蛋白启动子(肝脏特异；Pinkert et al.(1987)Gene Dev.1：268-277)，淋巴特异启动子(Calame and Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)，T-细胞受体的特殊启动子(Winoto and Baltimore(1989)EMBO J.8：729-933)和免疫球蛋白的特殊启动子(Banerji et al.(1983)Cell 33：729-740；Queen and Baltimore(1983)Cell 33：741-748)，神经元特异的启动子(例如神经丝启动子；Byrne and Ruddle(1989)PANS86：5473-5477)，胰腺特异的启动子(Edlund et al.(1985)Science 230：912-916)，以及乳腺特异的启动子(例如乳汁乳清启动子；U.S.Patent No.4,873,316和European Application Publication No.264,166)。也包括发育调节的启动子，例如鼠类hox启动子(Kessel and Gruss(1990)Science249：374-379)和α-胎蛋白启动子(Campes and Tilghman(1989)Genes Dev.3：537-546)。

本发明此外还提供了含有本发明DNA分子的重组表达载体，该DNA分子以反义方向克隆在表达载体中。也就是说，DNA分子可以可操作性的按以下方式连接到调节序列上，即允许与MP mRNA反义的RNA分子表达(通过DNA分子的转录)的方式。可以选择那些在各种细胞类型中指导反义RNA分子连续表达的调节序列，，例如病毒启动子和/或增强子，或者可以选择指导连续的、组织特异的或者细胞类型特异的反义RNA表达的调节序列，作为调节序列。反义表达载体可以以重组质粒、噬菌粒或者减毒病毒的形式存在，在其中反义核酸在高效调节区域的控制下产生，其活性可以通过引入载体的细胞类型来确定。关于使用反义基因调节基因表达，可以参见Weintraub，H.et al.，Antisense RNA as amolecular tool for genetics analysis，Review-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986。

本发明的另一方面，涉及被引入本发明重组表达载体的宿主细胞的。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此处可以交替使用。该术语应该理解为，不仅指被挑选的特定细胞，而且也指这些细胞的后代或者可能的后代。因为突变或者环境影响会使得某些修饰发生在成功的传代中，这些后代细胞实际上不可能与母细胞完全相同，但是也包含在此处使用的术语范围之内。

宿主细胞可以是任何原核或者真核细胞。例如，MP蛋白可以在像是谷氨酸棒杆菌这样的细菌细胞中、昆虫细胞中、酵母细胞中或者哺乳动物细胞(例如中国大鼠卵巢细胞(CHO)或者COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞，对于本领域技术人员来说是熟知的。可以用作本发明核酸和蛋白质分子宿主细胞的谷氨酸棒杆菌亲缘微生物，在表3中列出。

载体DNA可以通过常规转化或者转染技术，引入原核或者真核细胞。如此处所用的那样，术语“转化”和“转染”的意思是指各种本领域熟知的，把外源核酸(例如，线性DNA或者RNA(例如，线性载体或者没有载体的单独基因结构))或者以载体形式存在的核酸(例如，质粒、噬菌体、噬菌粒、噬菌粒、转座子或者其他DNA)转入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或者氯化钙共沉淀，DEAE-右旋糖苷介导的转染，脂质转染，或者电传孔。转化或者转染宿主细胞的合适方法，可以在Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed..，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)，以及其他实验室手册上找到。

已知，为了稳定的转染哺乳动物细胞，依靠使用的表达载体和转染技术，只有一小部分可以把外源DNA整合到其自身基因组中。为了鉴定和筛选这些整合体，编码筛选标记(例如，对抗生素的抗性)的基因通常与感兴趣的基因被一同引入宿主细胞。优选的筛选标记包括那些能赋予药物抗性的标记，例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。编码筛选标记的核酸，可以与MP蛋白在同一个载体上被引入宿主细胞，或者在单独的载体上引入宿主细胞。经被引入核酸稳定转染的细胞，可以使用药物筛选鉴定(例如，与筛选标记基因合并的细胞可以存活，而其他细胞则死掉)。

为了创造同源重组微生物，制备含有至少部分MP基因的载体，该基因具有缺失、添加或者取代，从而改变，例如功能性破坏，MP基因。优选的该是谷氨酸棒杆菌MP基因，但是它也可以是来自亲缘细菌的同源物，甚至是来自哺乳动物、酵母或者昆虫。在一个优选的实施方案中，设计载体，使得根据同源重组，内源MP基因被功能性破坏(即，不在编码功能蛋白质；也称作“敲除”载体)。另外，可以设计载体，使得根据同源重组，内源MP基因被发生突变或者改变，但是仍编码功能蛋白质(例如，改变上游调节区域，从而改变内源MP基因的表达)。在同源重组载体中，被改变的MP基因部分，在其5’和3’末端侧面连接有多余的MP核酸，使得同源重组可以发生在载体携带的外源MP基因和微生物的内源MP基因之间。多余的侧面连接的MP核酸具有足够的长度，可以与内源基因成功的发生同源重组。典型的，载体中含有几千个碱基的侧链DNA(5’和3’末端)(参见，例如，Thomas，K.R.，and Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503 for a description of homologous recombinationvectors)。引入微生物(例如电传孔)和细胞的载体，选择那些其中引入的MP基因与内源MP基因，使用技术上已知的技术可以同源重组的。

在另一个实施方案中，可以产生含有所选择系统的重组微生物，该系统允许调节引入基因的表达。例如，包含的MP基因在载体中处于lac操纵子的控制之下，使得MP基因只能在IPTG存在时表达。这种调节系统在技术上是熟知的。

在另一个实施方案中，宿主细胞中的内源MP基因被破坏(例如，通过同源重组或者其他技术上已知的遗传方法)，使得其蛋白质产物的表达不能发生。在另一个实施方案中，宿主细胞中的内源的或者引入的MP基因，经一个或者多个点突变、缺失或者倒置而改变，但是仍旧编码功能MP蛋白。而在另一个实施方案中，微生物MP基因的一个或者多个调节区域(例如，启动子、阻抑物或者诱导子)被改变(例如，通过缺失、剪切、倒置或者点突变)，使得MP基因的表达得到调节。本领域技术人员可以意识到，含有不止一个所述MP基因和蛋白质修饰的宿主细胞，使用本发明的方法可以很容易的产生，这些细胞也包含在本发明中。

本发明宿主细胞，例如培养的原核或者真核宿主细胞，可以用于产生(例如表达)MP蛋白。因此，本发明进一步提供了，使用本发明宿主细胞产生MP蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中引入了编码MP蛋白的重组表达载体，或者其基因组中引入了编码野生型或者改变的MP蛋白的基因)，直到产生MP蛋白。在另一个实施方案中，该方法进一步包括从培养基或者宿主细胞中分离MP蛋白。

C.分离的MP蛋白

本发明的另一方面涉及分离的MP蛋白及其生物活性部分的。“分离的”或者“纯化的”蛋白，或者其生物活性部分，当使用重组DNA技术生产时基本上没有细胞物质，当化学合成时基本上没有化学前体或者其他化学物质。术语“基本上不含细胞物质”包括这样的MP蛋白制备，其中蛋白质被从天然或者重组产生该蛋白质的细胞的细胞组分中分离出。在一个实施方案中，术语“基本上不含细胞物质”包括制备含有至少大约30％(干重)非MP蛋白(此处也称作“污染蛋白质”)的MP蛋白，更优选的含有少于大约20％的非MP蛋白，甚至更优选的含有少于大约10％的非MP蛋白，最优选的含有少于大约5％的非MP蛋白。当MP蛋白或者其生物活性部分经重组产生时，优选是基本上不含培养基，即培养基少于制备蛋白质体积的大约20％，优选的少于10％，最优选的少于大约5％。术语“基本上不含化学前体或者其他化学物质”包括这样的MP蛋白制备，其中蛋白质被从参与蛋白质合成的化学前体或者其他化学物质中分离出。在一个实施方案中，术语“基本上不含化学前体或者其他化学物质”包括制备含有至少大约30％(干重)化学前体或者非MP化学物质的MP蛋白，更优选的含有少于大约20％的化学前体或者非MP化学物质，甚至更优选的含有少于大约10％的化学前体或者非MP化学物质，最优选的含有少于大约5％的化学前体或者非MP化学物质。在一个优选的实施方案中，分离的蛋白质或者其生物活性部分，不含有来自获得MP蛋白的同一生物体的污染蛋白质。这种蛋白质典型的是由重组表达产生，例如像谷氨酸棒杆菌这样微生物中的谷氨酸棒杆菌MP蛋白的重组表达。

分离的本发明的MP蛋白或者其生物活性部分，能够催化氨基酸、维生素、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应或者具有一种或者多种列在表1中的活性。在一个优选的实施方案中，蛋白质或者其部分含有这样的氨基酸序列，该序列与本发明的氨基酸序列(例如，序列表偶数序列号序列中的一个序列)有充分的同源性，使得该蛋白质或者其生物活性部分，能够催化氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应。蛋白质的部分，优选是指此处描述的生物活性部分。在另一个优选的实施方案中，本发明的MP蛋白具有在序列表中以偶数序列号列出的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，MP蛋白具有由核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列与本发明的核苷酸序列(例如，序列表奇数序列号序列中的一个序列)杂交，例如在严格条件下杂交。在另一个优选的实施方案中，MP蛋白具有由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列与本发明的一条核酸序列或者其部分，有至少大约50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％的同源性，优选的有至少大约61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％的同源性，更优选的有至少大约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。介于上面引述的值之间的范围或者一致性值(例如，70-90％的一致性或者80-95％的一致性)，也有意的包含在本发明中。例如，有意的包含了这样的一致性值范围，这些范围是上面引用的上限和/或下限值的组合。本发明优选的MP蛋白也优选的具有至少一种此处描述的MP活性。例如，一种本发明优选的MP蛋白包含这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列与本发明的核苷酸序列杂交，例如在严格条件下杂交，并且该序列能够催化氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应，或者具有一种或者多种列在表1中的活性。

在其他实施方案中，MP蛋白与本发明的氨基酸序列(例如，序列表偶数序列号序列中的一个序列)有充分的同源性，并且具有本发明氨基酸序列蛋白质的功能活性，正如以上I部分详细描述的那样，其氨基酸序列由于天然改变或者突变而有所不同。因此，在另一个实施方案中，MP蛋白是这样的蛋白质，它具有的氨基酸序列与本发明的完全氨基酸序列，有至少大约50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％的同源性，优选的有至少大约61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％的同源性，更优选的有至少大约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性，并且具有至少一种此处描述的MP活性。介于上面引述的值之间的范围或者一致性值(例如，70-90％的一致性或者80-95％的一致性)，也有意的包含在本发明中。例如，有意的包含了这样的一致性值范围，这些范围是上面引用的上限和/或下限值的组合。在另一个实施方案中，本发明与这样的全长谷氨酸棒杆菌蛋白质有关，该蛋白质与本发明的氨基酸序列有充分的同源性。

MP蛋白的生物活性部分包含这样的多肽，该多肽含有来自MP蛋白氨基酸序列的氨基酸序列，例如，序列表偶数序列号的氨基酸序列或者与MP蛋白同源蛋白质的氨基酸序列，该部分含有比全长MP蛋白或者全长MP蛋白同源蛋白质更少的氨基酸，并且表现出至少一种MP蛋白活性。典型的生物活性部分(肽，例如，氨基酸长度为像是5，10，15，20，30，35，36，37，38，39，40，50，100或者更多的肽)包括一个具有至少一种MP蛋白活性的结构域或者基元。另外，其他生物活性部分，其中蛋白质的其他部分已被删除，可以通过重组技术制备，并鉴定其此处描述的一种或者多种活性。优选的MP蛋白的生物活性部分，含有一个或者多个挑选的具有生物活性的结构域/基元或者其部分。

MP蛋白优选的通过重组DNA技术生产。例如，把编码蛋白质的核酸分子克隆到表达载体中(如上所述)，将表达载体引入宿主细胞(如上所述)并在宿主细胞中表达MP蛋白。然后按照合适的纯化方案，使用标准蛋白质纯化技术，从细胞中分离MP蛋白。除了重组表达，可以使用标准肽合成技术化学合成MP蛋白、多肽或者肽。另外，天然MP蛋白可以从细胞(例如内皮细胞)中分离，例如使用抗-MP抗体，该抗体可以使用本发明的MP蛋白或者其部分通过标准技术产生。

本发明也提供了MP嵌合蛋白或者融合蛋白。如此处所用的，MP“嵌合蛋白”或者“融合蛋白”含有可操作性连接到非MP多肽上的MP多肽。“MP多肽”是指含有MP相关氨基酸序列的多肽，而“非MP蛋白”是指含有这样的蛋白质相关氨基酸序列的多肽，该蛋白质与MP蛋白没有基本的同源性，例如，来自相同或者不同生物体的与MP蛋白不同的蛋白质。在融合蛋白质中，术语“可操作性连接”的意思是指，MP蛋白与非MP蛋白相互之间是符合读框的融合。非MP多肽可以融合到MP多肽的N-末端或者C-末端。例如，在一个实施方案中，融合蛋白质是DST-MP融合蛋白，其中MP序列融合到GST序列的C-末端。该融合蛋白质有助于重组MP蛋白的纯化。在另一个实施方案中，融合蛋白质是在其N-末端有异源信号序列的MP蛋白。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源信号序列可以增加MP蛋白的表达和/或分泌。

优选，本发明的嵌合蛋白或者融合蛋白通过标准重组DNA技术产生。例如，依照常规技术编码不同多肽序列的DNA片段被符合读框的连接在一起，例如，使用平头末端或者交错末端的末端连接，使用限制性酶进行消化以提供合适的末端，使用粘性末端补平作为合适的末端，使用碱性磷酸酶处理以避免不合需要的连接，以及使用酶促连接。在另一个实施方案中，可以使用常规技术包括自动DNA合成仪合成融合基因。另外，可以使用锚引物进行基因片段的PCR扩增，锚引物可以增加两条连续基因片段之间的互补的突出端，连续基因可以随后进行退火和再扩增而产生嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols in MolecularBiology，eds.Ausubel et al.John Wiley & Sons：1992)。另外，很多已经编码融合部分(例如GST多肽)的表达载体是商业提供的。MP-编码核酸可以被克隆到这种表达载体中，使得融合部分符合读框的连接到MP蛋白上。

MP蛋白的同源物可以通过突变产生，例如MP蛋白的不连续点突变或者剪切。如此处所用的，术语“同源物”是指MP蛋白的变体形式，它们可以用作MP蛋白活性的激动剂或者拮抗物。MP蛋白的激动剂可以基本上具有MP蛋白相同的或者部分的生物活性。MP蛋白的拮抗物可以抑制MP蛋白天然存在形式的一种或者多种活性，例如，通过与包含MP蛋白的MP系统的下游或者上游成员竞争性结合。因此，本发明的谷氨酸棒杆菌MP蛋白及其同源物，可以调节一条或者多条糖类转运途径的活性，或者调节MP蛋白在该微生物中发挥作用的细胞内信号传导途径的活性。

在另外的实施方案中，MP蛋白的同源物可以通过筛选MP蛋白突变体的组合文库，例如剪切突变体，来鉴定MP蛋白激动剂或者拮抗剂活性。在一个实施方案中，MP变体的多样性文库通过在核酸水平上组合性突变而产生，并由多样性基因文库编码。MP变体的多样性文库可以通过，例如，把合成的寡聚核苷酸混合物酶促连接到基因序列中，使得潜在MP序列的简并集合作为单个多肽，或者其中含有MP序列集合的更大的融合蛋白质(例如为了噬菌体展示)的集合，是可以表达的。有各种方法可以用于从简并寡聚核苷酸序列，产生潜在MP同源物文库。可以用自动DNA合成仪进行简并基因序列的化学合成，然后合成基因被连接到合适的表达载体中。基因简并集合的使用，允许混合的提供编码所需潜在MP序列集合的全部序列。合成简并寡聚核苷酸的方法在技术上是已知的(参见，例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura et al.(1984)Science 198：1056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。

另外，编码MP蛋白片段的文库，可用于产生MP片段的多样性群体，该群体用于筛选并挑选MP蛋白的同源物。在一个实施方案中，编码序列片段的文库可以这样产生，即在大约每分子只产生一个切口的条件下，用核酸酶处理MP编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，复性DNA以形成双链DNA，该双链DNA可以包含从不同有切口的产物形成的有义/反义对，在重新形成的双螺旋中通过S1核酸酶处理除去单链部分，以及把最后得到的片段文库连接到表达载体中。通过该方法，可以得到编码N-末端、C-末端和不同大小MP蛋白中间片段的表达文库。

筛选由点突变或者剪切得到的组合文库中的基因产物的许多技术，以及筛选cDNA文库中具有所挑选特性基因产物的技术，在技术上都是已知的。这些技术都适用于由MP同源物组合突变得到的基因文库的快速筛选。筛选大型基因库的应用最广泛的技术，能够用于高产量分析，包括把基因组文库克隆到可复制表达载体中，用得到的载体文库转化载体文库，以及在一定条件下表达组合基因，在该条件下所需活性的检测有助于编码被检测产物基因的载体的分离。回归系综突变(REM)，一种增加文库中功能突变体频率的新技术，可以与筛选分析一起用于鉴定MP同源物(Arkin and Yourvan(1992)PANS 89：7811-7815；Delgrave et al.(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。

在另一个实施方案中，使用技术上已知的方法，基于细胞的分析可以用于分析多样性MP文库。

D.本发明的应用和方法

此处描述的核酸分子、蛋白质、蛋白质同源物、融合蛋白质、引物、载体和宿主细胞，可以应用于下述一种或者多种方法中：鉴定谷氨酸棒杆菌和亲缘微生物；绘制谷氨酸棒杆菌亲缘生物体的基因组图谱；鉴定和定位谷氨酸棒杆菌的感兴趣序列；进化研究；确定MP蛋白的功能必需区域；MP蛋白活性调节；MP途径活性调节；所需化合物，例如精细化学物质的细胞生产的调节。

本发明MP核酸分子具有各种用途。首先，它们可以用于鉴定一种生物体是否是谷氨酸棒杆菌或者其近亲生物体。它们也可以用于鉴定混合微生物群体中谷氨酸棒杆菌或者其亲缘生物体的存在。本发明提供了许多谷氨酸棒杆菌基因的核酸序列；在严格条件下，使用跨越对谷氨酸棒杆菌特异基因的探针，探测从单一或者混合微生物培养物中提取的基因组DNA，可以确定该生物体是否存在。尽管谷氨酸棒杆菌本身是非致病性的，但是它与致病种类相关，例如白喉棒杆菌。白喉棒杆菌是白喉的致病源，白喉是一种发展迅速、急性、发烧的感染，它涉及局部病状和系统病状。得这种疾病时，上呼吸道发生局部病变，并且包括上皮细胞坏死性损伤；细菌分泌毒素，毒素从病变处散布到身体易受感染的末梢组织。这些组织包括心脏、肌肉、外周神经、肾上腺、肾脏、肝脏和脾脏，在其中由于蛋白质合成被抑制而造成的变质性改变，会导致该疾病的系统病状。白喉在世界许多地区保持高发病率，这些地区包括非洲、亚洲、东欧和前苏联的独立国家。从1990年起，在后两个地区白喉的持续流行，导致了至少5,000人死亡。

在一个实施方案中，本发明与鉴定受试者中白喉棒杆菌存在或者活性的方法有关。该方法包括鉴定受试者中本发明的一条或者多条核酸或者氨基酸序列(例如，分别列在序列表中的奇数或者偶数序列号序列)，从而检测受试者中白喉棒杆菌的存在或者活性。谷氨酸棒杆菌和白喉棒杆菌是有亲缘关系的细菌，谷氨酸棒杆菌中的许多核酸和蛋白质分子是白喉棒杆菌中核酸和蛋白质分子的同源物，因此也可以用于检测受试者中的白喉棒杆菌。

本发明的核酸和蛋白质分子也可以用作基因组特定区域的标记。这不仅在绘制基因组图谱时有用，而且可以用于谷氨酸棒杆菌蛋白质功能研究。例如，为了鉴定特定谷氨酸棒杆菌DNA结合蛋白与之结合的基因组区域，可以消化谷氨酸棒杆菌基因组，将片段与DNA结合蛋白孵育。与蛋白质结合的片段可以进一步用本发明的核酸分子探测，优选使用易检测标记；这些核酸分子与基因组片段的结合，可以定位片段在谷氨酸棒杆菌基因组图谱上的位置，而且，当使用不同的酶进行多次操作时，有助于快速确定蛋白质与之结合的核酸序列。另外，本发明核酸分子可以与亲缘种类有充分的同源性，使得这些核酸分子可以作为构建亲缘细菌基因组图谱的标记，例如乳发酵短杆菌。

本发明的MP核酸分子又可以用于进化和蛋白质结构研究。本发明分子参与的糖类摄取系统，被各种各样的细菌所使用；通过比较本发明核酸分子序列和那些在其他生物体中编码相似酶的核酸分子序列，可以估算生物体的进化相关性。类似的，这种比较允许估算保守序列区域和非保守序列区域，这可以有助于确定蛋白质中对于酶功能必需的区域。这种类型的确定对于蛋白质工程研究是有价值的，并且可以指示那些蛋白质可以忍受突变而不失去功能。

本发明MP核酸分子的操作可以导致具有与野生型MP蛋白不同功能的MP蛋白的产生。可以提高这些蛋白质的效率或者活性，可以使之以比通常更多的数目出现在细胞中，或者降低其效率或者活性。

本发明也提供了筛选可调节MP蛋白活性的分子的方法，这些分子或者通过与蛋白质本身或者底物相互作用，或者与MP蛋白的配偶体结合，或者通过调节本发明MP核酸分子的转录或者翻译来调节MP蛋白活性。在该方法中，表达一种或者多种MP蛋白的微生物，与一种或者多种试验化合物接触，并且评估每种测试化合物对于MP蛋白活性或者表达水平的作用。

当需要从谷氨酸棒杆菌的大规模发酵培养物中分离的所需精细化学物质是氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖时，通过重组遗传机制调节一种或多种本发明蛋白的活性效率或活性可以直接影响这些精细化学物质中的一种。例如，对所需氨基酸生物合成途径中的酶而言，该酶活性或效率的提高(包括存在多个拷贝的基因)应当导致所需氨基酸的生产或生产效率增加。对于其合成与所需氨基酸的生物合成竞争的氨基酸生物合成途径中的酶，该酶活性或效率的降低(包括基因缺失)会导致所需氨基酸生产或生产效率的增加，是由于对中间体化合物和/或能量的竞争减少。对于所需氨基酸降解途径的酶，该酶活性或效率的降低会导致所需产物的产量或生产效率更高，这是由于其降解减少了。最后，对所需氨基酸生物合成相关酶进行诱变使得该酶不再被反馈抑制，这会导致所需氨基酸的产量或生产效率提高。对本发明的维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷和海藻糖代谢相关的生物合成和降解酶来说，同样如此。

类似地，当所需精细化学物质不是上述化合物之一时，本发明的一种蛋白活性的调节仍有可能影响谷氨酸棒杆菌大规模培养生产该化合物的效率和/或产量。任何生物体的代谢途径都是密切关联的，一种途径使用的中间体经常由不同的途径供给。酶表达和功能可以根据不同代谢过程化合物的细胞水平来调节，基础生产必需的分子如氨基酸和核苷酸的细胞水平对大规模培养中的微生物活力具有重大影响。因此，调节一种氨基酸生物合成酶使得其对反馈抑制不再有反应或其效率或转变提高，会导致一种或多种氨基酸细胞水平增加。结果，该增加的氨基酸供给不但增加对蛋白质合成必需分子的供应，也会增加用作多种其它生物合成途径中的中间体和前体的分子的供应。如果细胞内特定氨基酸有限，增加其生产也会增加细胞进行多种其它代谢反应的能力，并使细胞更有效地生产各种蛋白，可能会增加大规模培养中的细胞总生产速率或存活能力。活力增加提高了发酵培养物中能够产生所需精细化学物质的细胞的数量，从而增加该化合物的产量。通过调节本发明降解酶活性，使得该酶不再催化对所需化合物生物合成重要，或使大规模培养物中的细胞生长和增殖更有效的细胞化合物的降解或催化效率降低，也会存在类似情况。应当强调的是，优化本发明某些分子的降解活性或降低生物合成活性也会对谷氨酸棒杆菌生产某些精细化学物质有正面作用。例如，通过降低与所需化合物生物合成途径竞争一种或多种中间体的途径中生物合成酶的活性效率，更多的中间体可以用于所需物质的转化。类似情形下需要提高一种或多种本发明蛋白的降解能力或效率。

前面提到的导致所需化合物产量增加的MP蛋白诱变方案的列表，并不意味着仅局限于此；这些诱变方案的变化对于本领域普通技术人员来说是很明白的。经过这些机制，本发明的核酸和蛋白质分子可以用于产生表达突变MP核酸和蛋白质分子的谷氨酸棒杆菌或者其亲缘菌株，从而增加所需化合物的产量、生产和/或生产效率。该所需化合物可以是谷氨酸棒杆菌的任何天然产物，这包括生物合成途径的最终产物和天然存在代谢途径的中间体，以及不是在谷氨酸棒杆菌代谢中天然存在但是由本发明谷氨酸棒杆菌菌株产生的分子。在谷氨酸棒杆菌中生产的优选化合物是L-赖氨酸和L-甲硫氨酸。

在一个实施方案中，由谷氨酸棒杆菌中分离出编码甲硫氨酸生物合成途径的第三个酶胱硫醚β裂合酶的metC基因。该基因的翻译产物与来自其他生物的metC基因没有明显的同源性。导入含有metC基因的质粒到谷氨酸棒杆菌中导致胱硫醚β裂合酶活性增加5倍。现被称为MetC的该蛋白产物编码35574道尔顿的蛋白产物，由325个氨基酸组成，与以前报导的aec基因(Rossol，I and Puhler，A.(1992)J.Bacteriology 174，2968-2977)只有两个氨基酸不同。象aecD基因一样，以多拷贝存在时，metC基因赋予对赖氨酸的毒性类似物S-(β-氨基乙基)-半胱氨酸的抗性。但是，遗传和生化证据揭示，metC基因的天然活性是介导谷氨酸棒杆菌中的甲硫氨酸生物合成。构建了metC突变菌株，该菌株显示甲硫氨酸原养型。突变菌株完全失去了对S-(β-氨基乙基)-半胱氨酸的抗性。这些结果显示，除了另一个生物合成途径转硫作用外，直接硫化氢解途径在谷氨酸棒杆菌中作为平行的甲硫氨酸生物合成途径起作用。

在另一个实施方案中，附加的硫化氢解途径显示是由O乙酰高丝氨酸硫化氢解酶催化。分离到了相应的metZ(或metY)基因和酶(分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)证实了该途径的存在。在真核生物中，真菌和酵母已经报导同时具有转硫作用和直接硫化氢解途径。迄今为止，还未发现具有两种途径的原核生物。与大肠杆菌仅具有一个赖氨酸生物合成途径不同，谷氨酸棒杆菌具有该氨基酸的两个平行的生物合成途径。在这方面，甲硫氨酸生物合成途径类似于赖氨酸。

metZ基因位于metA的上游，后者编码催化甲硫氨酸生物合成第一步的酶(Park，S.-D.，et al(1998)Mol.Cells 8，286-294)。对metA的上游核下游进行了测序以鉴定其他met基因。似乎metZ和metA形成一个操纵子。编码MetA和MetZ的基因的表达导致相应多肽的过量产生。

令人吃惊的是，metZ克隆可以补充大肠杆菌metB突变株营养缺陷型。这显示metZ蛋白产物催化的步骤可以跨过metB蛋白产物催化的步骤。MetZ也被破坏，突变菌株显示甲硫氨酸原养型。也构建了谷氨酸棒杆菌metB和metZ双重突变体。该双重突变体是甲硫氨酸营养缺陷型。因此，metZ编码的蛋白催化O-乙酰-高丝氨酸到高半胱氨酸的反应，这是甲硫氨酸生物合成的硫化氢解途径的一个步骤。谷氨酸棒杆菌同时具有甲硫氨酸生物合成的转硫作用和硫化氢解途径

导入metZ至谷氨酸棒杆菌表达47000道尔顿的蛋白。同时导入metZ和metA至谷氨酸棒杆菌在凝胶电泳中显示有metA和metZ蛋白。如果棒杆菌菌株是赖氨酸的过量生产者，导入含有metA和metZ的质粒导致较低的赖氨酸效价，但检测到高半胱氨酸和甲硫氨酸积累。

在另一个实施方案中，metA和metZ与hom基因一起被导入到谷氨酸棒杆菌中，hom基因编码高丝氨酸脱氢酶，催化天冬氨酸半醛向高丝氨酸的转变。选择了不同生物的不同hom基因用于该实验。可以使用谷氨酸棒杆菌的hom基因，也可以使用来自其他原核生物如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的hom基因，或者真核生物如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、棉桃阿舒氏囊霉菌或海藻、高等植物或动物的hom基因。Hom基因可以对任何天冬氨酸家族的氨基酸如天冬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸的生物合成途径中任何代谢物的反馈抑制不敏感。这些代谢物如天冬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、天冬氨酸磷酸、天冬氨酸半醛、高丝氨酸、胱硫醚、高半胱氨酸或任何该生物合成途径中的其他代谢物。除了这些代谢物外，高丝氨酸脱氢酶可能对所有这些的类似物的抑制不敏感，甚至对参与该代谢的其他化合物的抑制也不敏感，因为还有其他氨基酸如半胱氨酸或辅因子如维生素B12和其所有衍生物和S腺苷甲硫氨酸和其代谢物和衍生物和类似物。高丝氨酸脱氢酶对所有这些不敏感，这些化合物的一部分或一种可以是其天然趋向，或者可以是使用化学试剂或辐射或其他诱变剂的一种或多种经典突变和选择的结果。突变可以使用基因技术例如导入位点特异点突变或者任何上述MP或MP编码DNA序列适用的方法导入到hom基因中。

当hom基因与metZ和metA基因组合并导入到过量产生赖氨酸的谷氨酸棒杆菌中时，赖氨酸积累减少了，高半胱氨酸和甲硫氨酸积累增加了。如果使用过量产生谷氨酸棒杆菌的菌株并且在用含有hom基因和metZ和metA基因组合的DNA转化之前，破坏其中ddh基因或lysA基因，则高半胱氨酸和甲硫氨酸积累还可增加。使用不同的硫源均可实现高半胱氨酸和甲硫氨酸的过量产生。硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐和更加还原的硫源如硫化氢和硫醚和其衍生物也可以使用。有机硫源如甲基硫醇、硫代羟乙酸、硫代氰酸盐、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸和其他含硫化合物也可用来实现高半胱氨酸和甲硫氨酸过量生产。

在另一个实施方案中，metC基因使用前述方法被导入到谷氨酸棒杆菌中。metC基因可以与其他基因如metB、metA和metA一起转化到菌株中。也可加入hom基因。当hom基因、metC、metB和metA基因被组合到一个载体上时并导入到谷氨酸棒杆菌中时，就实现了高半胱氨酸和甲硫氨酸的过量生产。硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐和更加还原的硫源如硫化氢和硫醚和其衍生物也可以使用。有机硫源如甲基硫醇、硫代羟乙酸、硫代氰酸盐、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸和其他含硫化合物也可用来实现高半胱氨酸和甲硫氨酸过量生产。

本发明进一步由以下实例阐明，这些实例不应该被解释为仅局限于此。本申请中所引用的所有参考文献、专利申请、专利、发表的专利申请、表和序列列表中的内容，全部引入作为参考。

实施例

实施例1：谷氨酸棒杆菌ATCC 13032全部基因组DNA的制备

谷氨酸棒杆菌(ATCC 13032)培养物在BHI培养基(Difco)中，30℃剧烈振荡培养过夜。离心收集细胞，弃上清，细胞重新悬浮在5ml缓冲液I(培养物原体积的5％-所有指出的体积都是对于100ml培养物体积计算的)中。缓冲液I的组成：140.34g/l蔗糖，2.46g/l MgSO₄×7H₂O，10ml/l KH₂PO₄溶液(100g/l，KOH调节至PH6.7)，50g/l M12浓缩物(10g/l(NH₄)₂SO₄，1g/l NaCl，2g/l MgSO₄×7H₂O，0.2g/l CaCl₂，0.5g/l酵母提取物(Difco))，10ml/l微量元素混合物(200mg/l FeSO₄×H₂O，10mg/l ZnSO₄×7H₂O，3mg/l MnCl₂×4H₂O，30mg/l H₃BO₃，20mg/lCoCl₂×6H₂O，1mg/l NiCl₂×6H₂O，3mg/l Na₂MoO₄×2H₂O)，500mg/l络合剂(EDTA或者柠檬酸)，100ml/l维生素混合物(0.2mg/l生物素，0.2mg/l叶酸，20mg/l p-氨基安息香酸，20mg/l核黄素，40mg/lpanthothenate，140mg/l烟酸，40mg/l盐酸吡多醛，200mg/l肌醇)。悬浮液中加入溶菌酶至终浓度2.5mg/ml。37℃孵育大约4小时之后，细胞壁被降解，得到的原生质体用离心收集。沉淀用5ml缓冲液I洗一次，用5ml TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1ml EDTA，pH8)洗一次。沉淀用4ml TE缓冲液重悬，并加入0.5ml SDS溶液(10％)和0.5ml NaCl溶液(5M)。加入蛋白酶K至终浓度200μg/ml，悬浮液在37℃孵育约18小时。DNA用苯酚、苯酚-氯仿-异戊醇、氯仿-异戊醇按照标准程序提取纯化。然后，加入1/50体积的3M乙酸钠和2倍体积的乙醇，在-20℃孵育30分钟，用使用SS34转头(Sorvall)的高速离心机12,000rpm离心30分钟，沉淀DNA。把DNA溶解在含有20μg/ml RNaseA的1ml TE缓冲液中，在1000ml TE缓冲液中4℃透析至少3小时。这段时间中，更换缓冲液3次。每0.4ml透析的DNA溶液中，加入0.4ml 2M LiCl和0.8ml乙醇。在-20℃孵育30分钟后，离心(13,000rpm，Biofuge Fresco，Heraeus，Hanau，Germany)收集DNA。DNA沉淀融解在TE缓冲液中。按该程序制备的DNA可以用于所有目的，包括southern杂交和基因组文库的构建。

实施例2：在大肠杆菌中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组文库的构建

使用如在实施例1中所描述制备的DNA，按照已知的和充分建立的方法(参见，例如Sambrook，J.et al.(1989)“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，或者Ausubel，F.M.et al.(1994)“Current Protocols inMolecular Bilogy”，John Wiley & Sons.)，可以构建粘粒文库和质粒文库。

可以使用任何质粒和粘粒。质粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：3737-3741)；pACY177(Change & Cohen(1978)J.Bacteriol 134：1141-1156)，pBS系列质粒(pBSSK+，pBSSK-和其他质粒；Stratagene，LaJolla，USA)，粘粒SuperCos1(Stratagene，LaJolla，USA)或者Lorist6(Gibson，T.J.，Rosenthal A.and Waterson，R.H.(1987)Gene53：283-286)可以用于特殊用途。专门在谷氨酸棒杆菌中使用的基因文库可以用质粒pSL109(Lee，H.-S.and A.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4：256-263)构建。

为了分离metC克隆，大肠杆菌JE6839细胞用文库DNA转化并在含有氨苄青霉素和合适添加物的M9基本培养基上铺平板。平板在37℃温育5天。分离集落并筛选质粒内含物。分离的metC基因的完整核苷酸序列通过本领域普通技术人员熟知的方法确定。

实施例3：DNA测序和计算机功能分析

按照标准方法，使用如在实施例2中所描述基因组文库，可以进行DNA测序，特别是用使用ABI377测序仪的链终止方法(参见，例如Fleischman，R.D.et al.(1995)“Whole-genome Random Sequencing andAssembly of Haemophilus Influenzae Rd.，Science，269：496-512)。使用具有以下核苷酸序列的测序引物：5’-GGAAACAGTATGACCATG-3’(SEQID NO：123)或者5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO：124)。

实施例4：体内诱变

可以通过大肠杆菌或者其他微生物(例如，芽孢杆菌某些菌或者像是酿酒酵母的酵母)的质粒(或者其他载体)DNA的传代，进行谷氨酸棒杆菌的体内诱变，其中这些微生物保持其遗传信息整体性的能力已被损伤。典型的突变株，在DNA修复系统的基因中有突变(例如，mutHLS，mutD，mutT等；参考文献参见Rupp，W.D.(1996)DNA repair mechanisms，in：Escherichia coli and Salmonella，p.2277-2294，ASM：Washington.)。这些菌株对于技术熟练的人来说是熟知的。这些菌株的使用阐述在，例如Greener，A.and Callahan，M.(1994)Strategies 7：32-34中。

实施例5：在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间传递的DNA

棒杆菌和短杆菌菌种含有能自发复制的内源质粒(像是例如，pHM1519或者pBL1)(评论参见，例如，Martin，J.F.et al.(1987)Biotechnology，5：137-146)。大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的穿梭载体，可以使用大肠杆菌的标准载体容易的构建(Sambrook，J.et al.(1989)“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press或者Ausubel，F.M.et al.(1994)“Current Protocols in Molecular Bilogy”，John Wiley & Sons.)，即在其中加入谷氨酸棒杆菌的复制叉起始点和合适的标记。这种复制起始点，优选是从棒杆菌和短杆菌菌种中分离的内源质粒获得的。用作这些菌种转化标记这一特殊用途的是卡那霉素抗性基因(例如来自Tn5或者Tn903转座子的那些卡那霉素抗性基因)或者氯霉素抗性基因(Winnacker，E.L.(1987)“From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology，VCH，Weinheim)。在构建各种野生型穿梭载体的文献中有许多实例，这些穿梭载体可以在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中复制，并且可以用于各种目的，其中包括基因过量表达(参考文献参见，例如，Yoshihama，M.et al.(1985)J.Bacteriol.162：591-597，Martin J.F.et al.(1987)Biotechnology，5：137-146和Eikmanns，B.J.et a；.(1991)Gene，102：93-98)。

使用标准方法可以把感兴趣的基因克隆到上述穿梭载体中，并且可以把该杂交载引入谷氨酸棒杆菌菌株中。谷氨酸棒杆菌的转化可以通过原生质体转化(Kastsumata，R.et al.(1984)J.Bacteriol.159306-311)，电传孔(Liebl，E.et al.(1989)FEMS Microbiol.Letters，53：399-303)实现，当使用特殊的载体时，也可以通过结合作用(例如在

A et al.(1990)J.Bacteriol.172：1663-1666)实现。也可以通过从谷氨酸棒杆菌制备质粒DNA(使用技术上已知的标准方法)并将其转化到大肠杆菌中，而把穿梭载体从谷氨酸棒杆菌转移到大肠杆菌。这一转化步骤可以使用标准方法进行，但是使用Mcr缺陷型大肠杆菌菌株，例如NM522(Gough &Murray(1983)J.Mol.Biol.166：1-19)是有利的。

使用含有pCG1(U.S.Patent No.4,617,267)或者其片段的质粒，并且可以选择来自TN903的卡那霉素抗性基因(Grindley，N.D.and Joyce，C.M.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(12)：7176-7180)，就可以在谷氨酸棒杆菌中过量表达基因。另外，使用质粒pSL109(Lee，H.-S.and A.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4：256-263)也可以在谷氨酸棒杆菌中过量表达基因。

除了使用可复制质粒以外，也可以通过基因组整合而实现基因的过量表达。谷氨酸棒杆菌或者其他棒杆菌或者短杆菌菌种的基因组整合，可以通过熟知的方法实现，例如基因组区域的同源重组，限制性核酸内切酶介导的整合(REMI)(参见例如，DE Patent 19823834)，或者通过使用转座子。也可以通过修饰调节区域(例如，启动子、阻抑物和/或增强子)，通过使用定向位点方法(例如同源重组)或者基于随机事件方法(例如转座子诱变或者REMI)的序列修饰、插入或者缺失，来调节感兴趣基因的活性。用作转录终止子的核酸序列，也可以被插入到本发明一个或者多个基因编码区域的3’；这样的终止子在技术上是熟知的，并且描述在例如Winnacker，E.L.(1987)From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology.VCH：Weinheim中。

实施例6：突变蛋白质表达的估算

被转化宿主细胞中突变蛋白质活性的观测，依赖于这一事实，即突变蛋白质以与野生型蛋白质相似的方式和相似的数量表达。确定突变基因转录水平(用于基因产物翻译的mRNA的数量指标)的一种有用的方法是进行Northern杂交(参考文献参见，例如，Ausubel et al.(1988)CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley：New York)，其中设计的用于结合感兴趣基因的引物标记有可探测的标记(通常是放射性的或者化学发光的)，从而，当生物体培养物的全部RNA被提取出，跑凝胶电泳，转移到稳定介质上并与该探针孵育，结合探针的结合和数量便指示了该基因mRNA的存在和数量。该信息是突变基因转录程度的证据。可以使用几种方法从谷氨酸棒杆菌中制备全部细胞RNA，这在技术上是熟知的，例如描述在Bormann，E.R.et al.(1992)Mol.Microbiol.6：317-326中的。

为了估算由该mRNA翻译的蛋白质的存在和相对数量，可以使用标准技术例如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。在谷氨酸棒杆菌中metC和metZ与metA组合的过量生产通过该方法得到证实。Western印迹也可使用(参见，例如，Ausubel et al.(1988)Current Protocols in Molecular Biology，Wiley：New York)。在该方法中，提取全部细胞蛋白质，通过凝胶电泳分离，转移到像是硝酸纤维素这样的介质上，和与所需蛋白质特异结合的探针共孵育，例如抗体。该探针通常标记有易于检测的化学发光的或者比色的标记。观测到的标记的存在和数量，指示了出现在细胞中的所需突变蛋白质的存在和数量。

实施例7：大肠杆菌和遗传修饰的谷氨酸棒杆菌的生长-培养基和培养条件

大肠杆菌菌株按常规分别在MB和LB培养液中培养(Follettie，M.T.，et al.(1993)J.Bacteriol.175，4096-4103)。大肠杆菌基本培养基是M9和改进的MCGC(Yoshihama，M.，et al.(1985)J.Bacteriol.162，591-507)。加入葡萄糖至终浓度1％。按以下量加入抗体(每毫升微克数)：氨苄青霉素50；卡那霉素25；萘啶酮酸，25。氨基酸、维生素和其他添加物按以下量加入：甲硫氨酸9.3mM；精氨酸9.3mM；组氨酸9.3mM；硫胺素0.05mM。大肠杆菌细胞按常规在37℃下培养。

遗传修饰的谷氨酸棒杆菌可以培养在合成或者天然生长培养基中。用于谷氨酸棒杆菌的各种不同的生长培养基是已知的并且是易于得到的(Lieb，et al.(1989)Appl.Microbiol.Biotechno.，32：205-210；von der Ostenet al.(1998)Biotechnology Letters，11：11-16；Patent DE 4,120,867；Liebl(1992)“The Genus Corynebacterium，in：Procaryotes，Volume II，Balows，A.et al.，eds.Springer-Verlag)。这些培养基含有一种或者多种碳源、氮源、无机盐、维生素和微量元素。优选的碳源是糖类，例如单糖、二糖或者多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖，棉子糖，淀粉或者纤维素，都可用作很好的碳源。也可以通过复杂化合物向培养基提供糖类，例如糖蜜或者其他糖类精炼的副产物。提高不同碳源的混合物也是有利的。其他可用的碳源有酒精和有机酸，例如甲醇、乙醇、乙酸或者乳酸。氮源通常是有机或者无机的氮化合物，或者含有这些化合物的物质。代表性的氮源包括氨气或者铵盐，例如NH₄Cl或者(NH₄)₂SO₄、NH₄OH、硝酸盐、尿素、氨基酸或者复杂的氮源，例如玉米浸泡液、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉类提取物或者其他。

含硫氨基酸如高半胱氨酸和甲硫氨酸的过量生产可以使用不同的硫源实现。硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐和更加还原的硫源如硫化氢和硫醚和其衍生物均可使用。有机硫源如甲基硫醇、硫代羟乙酸、硫代氰酸盐、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸和其他含硫化合物也可用来实现高半胱氨酸和甲硫氨酸过量生产。

可以包含在培养基中的无机盐化合物，包括盐酸盐、磷酸盐或者硫酸盐的钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜或者铁。螯合剂可以加到培养基中，以维持溶液中的金属离子。特别有用的螯合剂包括二羟基苯酚，像是儿茶酚和原儿茶酸，或者有机酸，像是柠檬酸。培养基典型的也含有生长因子，例如维生素和生长促进剂，它们的实例包括生物素、核黄素、硫胺、叶酸、烟酸、泛酸盐和吡多醇。生长因子和盐经常来自复杂的培养基成分，例如酵母提取物、糖蜜、玉米浸泡液和其他成分。培养基化合物的确切组成强烈的依赖于直接实验，而且对于每一个具体情况具体决定。关于培养基最优化的信息通过在教科书“AppliedMicrobiol.Physiology，A Practical Approach”(eds.P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)pp.53-73，ISBN 0 19 963577 3)”中。也可以从商业供应商那里选择生长培养基，像是standard 1(Merck)或者BHI(grain heart infusion，DIFCO)或者其他的。

所有培养基组分都要通过加热(1.5bar，120℃，20分钟)或者无菌过滤灭菌。组分可以一起灭菌，或者如果必要的话分开单独灭菌。所有的培养基组分可以在生长的开始就加入，或者可以选择连续性或者分批加入。

培养条件对每个实验分别确定。温度应该在15℃到45℃范围内。温度可以保持恒定，或者在实验中改变。培养基的pH在5到8.5范围内，优选的在大约7.0，并且可以通过培养基中缓冲液的添加来维持。针对这一目的有代表性的缓冲液是磷酸钾缓冲液。合成缓冲液，例如MOPS、HEPES、ACES以及其他的，也可以代替使用或者同时使用。也可以在生长过程中通过添加NaOH或者NH₄OH，以维持稳定的培养pH。如果使用像是酵母提取物这样的复杂培养基组分，可以减少添加缓冲液的必要性，这是因为许多复杂化合物具有很强的缓冲能力这一事实。如果使用发酵罐培养微生物，也可以使用氨气控制pH。

孵育时间通常在几小时到几天范围内。这一时间的选取是为了允许在液体培养基中积累最大量的产物。公布的生长实验可是在各种容器中进行，例如微量滴定板、玻璃试管、玻璃摇瓶或者不同大小的玻璃或者金属的发酵罐。为了筛选大量的克隆，微生物应该培养在有挡板或者没有挡板的微量滴定板、玻璃试管或者摇瓶中。优选的使用100ml摇瓶，加入10％(体积)的所需培养基。摇瓶应该放在摇床上摇动(振幅25毫米)，速度范围100-300rpm。可以通过保持湿润的空气减少蒸发损失；或者，对蒸发损失进行数学修正。

如果要检测遗传修饰的克隆，那么也应该检测未经修饰的对照克隆或者含有基本质粒但没有任何插入的对照克隆。使用生长在琼脂板上30℃孵育的细胞，例如CM平板(10g/l葡萄糖，2.5g/l NaCl，2g/l尿素，10g/l多胨，5g/l酵母提取物，5g/l肉汁提取物，22g/l琼脂，2M NaOH调至pH 6.8)，接种培养基至OD₆₀₀值为0.5-1.5。培养基的接种可以通过引入来自CM平板的谷氨酸棒杆菌细胞的盐悬浮液，或者通过加入该细菌的液体预培养物实现。

实施例8：突变蛋白质功能的体外分析

酶的活性和动力学参数的测定在技术上是已经很好建立了的。任何对给定的经过改变的酶的活性测定实验，必须适合野生型酶的特殊活性，这完全在技术熟练者的能力之内。关于酶的概括评论，以及关于结构、动力学、原理、方法、应用和确定许多酶活性实例的明确细节，可以在例如以下参考文献中找到：Dixon，M.，and Webb，E.C.，(1979)Enzymes.Longmans：London；Fersht，(1985)Enzyme Structure and Mechanism.Freeman：NewYork；Walsh，(1979)Enzymatic Reaction Mechanisms.Freeman：San Francisco；Price，N.C.，Stevens，L.(1982)Fundamentals of Enzymology.Oxford Univ.Press：Oxford；Boyer，P.D.，ed.(1983)The Enzymes，3^rd ed.Academic Press：New York；Bisswanger，H.，(1994)Enzymkinetik，2^nd ed.VCH：Weinheim(ISBN 3527300325)；Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，Graβl，M.，eds.(1983-1986)Methods of EnzymaticAnalysis，3^rd ed.，vol.I-XII，Verlag Chemie：Weinheim；and Ullmann’s Encyclopediaof Industrial Chemistry(1987)vol.A9，“Enzymes”.VCH：Weinheim，p.352-363。

谷氨酸棒杆菌细胞提取物按照以前所述制备(Park，S.-D.，et al.(1998)Mol.Cells 8，286-294)。胱硫醚β裂合酶按照以下分析。分析混合物含有100mM Tris-HCl(pH8.5)，0.1mM NADH，1mM L-胱硫醚，5单位L-乳酸脱氢酶和适量的粗提取物。在340纳米监测光度变化。S-(□-氨基乙基)-半胱氨酸(AEC)抗性分析按照Rossol，I.and Pühler，A.(1992)J.Bacteriol.174，2968-77所述进行。不同谷氨酸棒杆菌菌株提取物的胱硫醚β裂合酶分析和同一菌株的AEC抗性分析见以下表5。

表5.胱硫醚β裂合酶的表达^a

谷氨酸棒杆菌HL459 metC突变体^d23 + -

大肠杆菌JE6839 metC突变体21 - ND^e

^a酶通过在含有1％葡萄糖的基本培养基中生长至稳定期诱导。收获细胞、破碎并如材料和方法部分分析活性。

^b使用MCGC基本培养基。在平板上监测生长。

^c细胞在含有40mM S-(□-氨基乙基)-半胱氨酸(AEC)的平板上生长5天。

^d本研究中制备的突变体。

^e未测定。

metC克隆表达胱硫醚β裂合酶的能力通过酶促实验测定。分析由携带质粒pSL173的谷氨酸棒杆菌ASO19E12细胞制备的粗提取物。携带该质粒的细胞与携带空载体pMT1的细胞相比，胱硫醚β裂合酶活性增加5倍(表5)，显然具有基因剂量效应。粗提取物的SDS-PAGE分析显示了M_r约为41,000的推定的胱硫醚β裂合酶带。各个推定的胱硫醚β裂合酶带的强度与互补和酶实验数据(表5)一致。如上所述，metC的一个区域似乎与原来报导的aceD基因几乎一致。因为aecD基因是根据其赋予对赖氨酸毒性类似物S-(□-氨基乙基)-半胱氨酸(AEC)的抗性分离的，我们测定了metC蛋白产物的该活性存在。如表5所示，过量表达胱硫醚β裂合酶的细胞对AEC的抗性增加。携带有突变metC基因(见后文)的菌株完全失去了对AEC的抗性表型。

对O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的分析如下进行(Belfaiza，J.，et al.(1998)J.Bacteriol.180，250-255；Ravanel，S.，M.Droux，and R.Douce(1995)Arch.Biochem.Biophys.316，572-584；Foglino，M.(1995)Microbiology 141，431-439)。0.1毫升分析混合物含有20mM MOPS-NaOH(pH7.5)，10mM O-乙酰高丝氨酸，50mM NaOH中的2mM Na₂S，和适量的酶。最后加入Na₂S后，用50微升矿物油覆盖混合物。30℃温育30分钟，煮沸混合物3分钟终止反应。反应中产生的高半胱氨酸如前所述进行定量(Yamagata，S.(1987)Method Enzymol.143，478-483.)。取出0j.1毫升反应混合物，与0.1ml H₂O，0.6ml饱和NaCl，0.1ml含有67mMKCN的1.5M Na₂CO₃和0.1ml 2％硝普盐。室温温育1分钟后，520纳米测定光密度。携带多余拷贝的metZ基因如含有metZ基因的质粒的棒杆菌较没有多余metZ基因的棒杆菌细胞，metZ酶活性明显要高。

结合DNA的蛋白质的活性可以通过几种技术上已知的方法测定，例如DNA条带移位分析(也称作凝胶阻滞分析)。这些蛋白质对其他分子表达的作用，可以用报告基因分析测定(例如描述在Kolmar，H.et al.(1995)EMBO J.14：3895-3904中的，及其引用的参考文献)。报告基因测试系统是已知的，并且在原核和真核细胞中的应用都已建立，使用像是beta-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白和几种其他蛋白质这样的酶。

膜转运蛋白质活性的测定可以根据例如描述在Gennis，R.B.(1989)“Pores，Channels and Transporters”，in Biomembrane，Molecular Structureand Function，Springer：Heidelberg，p.85-137；199-234；and 270-322中的那些技术进行。

实施例9：突变蛋白质对于所需产物生产的效果的分析

谷氨酸棒杆菌遗传修饰对于所需化合物(例如氨基酸)生产的作用，可以这样估计，即通过合适条件下(例如以上描述的那些)生长已修饰的微生物，并且分析增加所需产物(例如，氨基酸)生产的培养基和/或细胞组分。这些分析技术对于熟练常规技术者来说是熟知的，包括光谱分析、薄层层析、各种染色方法、酶促方法和微生物方法，以及像是高效液相色谱(Ullman，Encyclopedia of Industrial Chemistry，vol.A2，p.89-90 and p.443-613，VCH：Weinheim(1985)；Fallon，A.et al.，(1987)“Applications of HPLC in Biochemistry”in：Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，vol.17；Rehm et al.(1993)Biotechnology，vol.3，Chapter III：“Product recovery and purification”，page 469-714，VCH：Weinheim；Belter，P.A.et al.(1988)Bioseparations：downstream processing for biotechnology，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.and Cabral，J.M.S.(1992)Recovery processes for biological materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.and Henry，J.D.(1988)Biochemicalseparations，in：Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，vol.B3，Chapter 11，page 1-27，VCH：Weinheim；and Dechow，F.J.(1989)Separationand purification techniques in biotechnology，Noyes Publications)这样的分析层析。

除了对最终发酵产物的测定，也可以对用于所需化合物生产的代谢途径的其他组分进行分析，例如中间体和副产物，以确定化合物的总生产效率。分析方法包括培养基中营养物水平(例如，糖类、烃、氮源、磷酸以及其他离子)的测定，生物量组成和生长的测定，生物合成途径常见代谢产物的生产的分析，以及对发酵中产生气体的测定。这些测定的标准方法略述在Applied Microbial Physiology，A Practical Approach，P.M.Rhodes and P.F.Stanbury，eds.，IRL Press，p.103-163；and 165-192(ISBN：0199635773)及其引用的参考文献中。

实施例10：谷氨酸棒杆菌培养物中所需产物的纯化

从谷氨酸棒杆菌细胞中或者上述培养基的上清中回收所需产物，可以通过技术上已知的各种方法进行。如果所需产物不是细胞分泌的，那么可以通过低速离心从培养基中收集细胞，用标准技术裂解细胞，例如机械力或者超声波。离心除去细胞碎片，保留含有可溶蛋白的上清部分用于进一步纯化所需化合物。如果产物是从谷氨酸棒杆菌细胞分泌的，那么用低速离心从培养基中除去细胞，保留上清部分用于进一步纯化。

任何一种纯化方法得到的上清部分，用合适的树脂进行层析，所需分子被层析树脂保留，而样品中的很多杂质不被保留，或者杂质被树脂保留，而样品不被保留。使用相同或者不同的层析树脂，可以根据需要重复这一层析步骤。本领域技术人员可以非常熟练的选择合适的层析树脂，并且熟知这些树脂对于待纯化特定分子最有效的应用。纯化的产物可以用过滤或者超滤浓缩，并且贮存在产物稳定性最大的温度下。

技术上已知的纯化方法非常多，前述的纯化方法并不意味着仅仅局限于此。这些纯化方法描述在，例如Bailey，J.E.& Ollis，D.F.BiochmicalEngineering Fundamentals，McGraw-Hill：New York(1986)中。

分离化合物的特性和纯度，可以技术上的标准技术估计。这包括高效液相色谱(HPLC)、分光方法、染色方法、薄层层析、NIRS、酶促方法或者微生物方法。这些分析方法在以下文献中有评论：Patek et al.(1994)Appl.Environ.Microbiol.60：133-140；Malakhova et al.(1996)Biotekhnologiya 11：27-32；and Schmidt et al.(1998)Bioprocess Engineer.19：67-70.Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，(1996)vol.A27，VCH：Weinheim，p.89-90，p.521-540，p.540-547，p.559-566，575-581 andp.581-587；Michal，G.(1999)Biochemical Pathways：An Atlas ofBiochemistry and Molecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.et al.(1987)Applications of HPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，vol.17。

实施例11：本发明基因序列的分析

序列比较和两条序列之间同源性百分比的测定，是技术上已知的技术，可以使用数学运算法则完成，例如Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68中的运算法则，该运算法则在Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中有修改。该运算法则被整合在Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST核苷酸搜寻可以用NBLAST程序进行，score＝100，wordlength＝12，可以得到与本发明MP核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜寻可以用XBLAST程序进行，score＝50，wordlength＝3，可以得到与本发明MP蛋白质分子同源的氨基酸序列。出于比较的目的，为了获得有间隙的序列对比，可以使用描述在Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中的GappedBLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，本领域技术人员知道对于特定的待分析序列如何优化程序(例如，XBLAST和NBLAST)的参数。

用于序列比较的另一个数学运算法则实例是，Meyers和Miller运算法则((1998)Comput.Appl.Biosci.4：11-17)。该运算法则被整合在ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列序列对比软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120重量残基表、间隙长度处罚12、间隙处罚4。其他的序列分析运算法则在技术上也是已知的，包括ADVANCE和ADAM，叙述在Torelli and Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.10：3-5中；和FASTA，叙述在Pearson and Lipman(1998)P.N.A.S.85：2444-8中。

两条氨基酸序列之间的百分比同源性也可以使用GCG软件包(http://www.gcg.com有提供)中的GAP程序实现，使用Blosum 62矩阵或者PAM 250矩阵，间隙分量12、10、8、6或者4，长度分量2、3或者4。两条核酸序列之间的百分比同源性可以使用GCG软件包中的GAP程序实现，使用标准参数，例如间隙分量50和长度分量3。

本发明基因序列与Genbank中序列之间的比较分析，可以使用技术上已知的技术进行(参见，例如，Bexevanis and Ouellette，eds.(1998)Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins.John Wiley and Sons：New York)。本发明基因序列，通过三个步骤的方法与Genbank中的序列进行比较。在第一步中，对本发明的每一条序列相对Genbank中的核苷酸序列进行BLASTN分析(例如，本地序列对比分析)，保留最高的500个匹配作进一步分析。然后对这500个匹配作FASTA搜寻(例如，本地与全世界的组合序列对比分析，在其中对限定的序列区域进行序列对比)。接下来，对本发明的每条基因序列与FASTA的三个最高匹配，使用GCG软件包中的GAP程序(使用标准参数)进行全世界序列对比。为了得到正确结果，从Genbank选出的序列长度，使用技术上熟知的方法调节为查询序列的长度。该分析的结果列在表4中。虽然这样得到的结果，与对本发明每条基因相对于Genbank每条对照所进行的单独GAP(全世界)分析得到的结果，是一致的，但是相对于大数据库的GAP(全世界)分析来说，所需的计算时间大大减少。没有得到截止值以上序列对比的本发明序列，在表4中表明，缺少序列对比信息。本领域技术人员能够深一层的理解，在表4中列出的标题“％homology(GPA)”下的GAP序列对比同源性百分比，是以欧洲数字格式列出的，其中‘，’代表十进制点。例如，该列中的值“40,345”代表“40.345％”。

实施例12：DNA微阵列的构建和操作

本发明的序列还可以用于DNA微阵列(DNA阵列的设计、方法和应用技术上是熟知的，描述在，例如，Schena，M.te al.(1995)Science 270：467-470；Wodicka，L.et al.(1997)Nature Biotechnology 15：1359-1367；DeSaizieu，A.et al.(1998)Nature Biotechnology 16：45-48；and DeRisi，J.L.et al.(1997)Science 278：680-686)的构建和应用。

DNA微阵列使用固体或者可弯曲的支持物，包括硝酸纤维素、尼龙、玻璃、硅或者其他材料。核酸分子可以以有序的方式连接在表面。合适标记之后，其他核酸或者核酸混合物可以与固定的核酸分子杂交，标记可以用于监控和测量确定区域杂交分子的单独的信号强度。本方法允许同时定量适用的核酸样品或者混合物中的全部或者所选择核酸的相对或者绝对数量。因此，DNA微阵列允许多种(多至6800或者更多)类似核酸表达的分析(参见例如，Schena，M.(1996)BioEssays 18(5)：427-431)。

本发明序列可以用于设计寡聚核苷酸引物，这些引物可以通过像聚合酶链式反应这样的核酸扩增反应扩增一条或者多条谷氨酸棒杆菌基因的确定区域。5’或者3’寡聚核苷酸引物或者合适连接体的选择和设计，允许得到的PCR产物共价连接到上述支持介质的表面(也描述在，例如，Schena，M.et al.(1995)Science 270：467-470)。

核酸微阵列也可以通过如在Wodicka，L.et al.(1997)NatureBiotechnology 15：1359-1367中描述的原位寡聚核苷酸合成构建。通过照相平板方法，可将矩阵中精确确定的区域暴露在光线中。保护基团是光不稳定的，从而被激活并经受核苷酸添加，但是被掩饰而见不到光的区域不进行任何修饰。接下来的保护和光激活循环，允许在确定位置不同寡聚核苷酸的合成。本发明确定的小区域可以在微阵列上通过固相寡聚核苷酸合成而合成。

出现在样品或者核苷酸混合物中的本发明核酸分子，可以与微阵列杂交。可以根据标准方法标记这些核酸分子。简单的说，核酸分子(例如，mRNA分子或者DNA分子)可以通过与同位素或者荧光标记的核苷酸结合而被标记，例如，在逆转录或者DNA合成中。标记核酸与微阵列的杂交有描述(例如在Schena，M.et al.(1995)supra；Wodicka，L.et al.(1997)，supra；and DeSaizieu A.et al.(1998)，supra中)。杂交分子的检测和定量要适合特定的结合标记。放射性标记可被探测，例如，在Schena，M.et al.(1995)supra中描述的，荧光标记也可以探测，例如使用Shalon etal.(1996)Gemone Research 6：639-645的方法。

如上所述，本发明序列在DNA微阵列中的应用，允许不同的谷氨酸棒杆菌菌株或者其他棒杆菌的比较分析。例如，通过核酸阵列方法，可以促进基于个别转录分部图的菌株内改变的研究，以及促进对特定和/或所需的像是致病性、生产能力和压力承受能力这样的菌株性质重要的基因的鉴定。同样，使用核酸阵列技术，也可以比较发酵反应过程中本发明基因表达的分部图。

实施例13：细胞蛋白质群体动力学的分析(蛋白质组学)

本发明的基因、组成和方法，可以用于研究蛋白质群体的相互作用和动力学，称作“蛋白质组学”。感兴趣的蛋白质群体包括，但是不局限于，谷氨酸棒杆菌的全部蛋白质群体(例如，和其他生物体的蛋白质群体比较起来)，在特殊环境或者代谢条件下(例如，发酵中、高温或者低温、或者高pH或低pH)有活性的那些蛋白质，或者在特定生长或者发育阶段有活性的那些蛋白质。

可以用各种熟知的技术分析蛋白质群体，例如凝胶电泳。细胞蛋白质可以通过例如裂解或者提取获得，也可以使用各种电泳技术彼此分离。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，很大程度上基于它们的分子重量。等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-PAGE)通过等点点(这不仅反映了氨基酸序列，而且放映了蛋白质的翻译后修饰)分离蛋白质。另一种更加优选的蛋白质分析方法是，IEF-PAGE和SDS-PAGE的连续结合，称为2-D-凝胶电泳(在例如Hermann et al.(1998)Electrophoresis 19：3217-3221；Fountoulakis et al.(1998)Electrophoresis 19：1193-1202；Langen et al.(1997)Electrophoresis 18：1184-1192；Antelmann et al.(1997)Electrophoresis18：1451-1463中有描述)。

用这些方法分离的蛋白质可以通过标准技术显现，例如通过染色或者标记。合适的染色在技术上是已知的，包括考马斯亮蓝、银染或者荧光染料，例如Sypro Ruby(Molecular Probes)。谷氨酸棒杆菌培养基中包含有放射性标记的氨基酸或者其他蛋白质前体(例如，³⁵S-甲硫氨酸，³⁵S-半胱氨酸，¹⁴C-标记氨基酸，¹⁵N-氨基酸，¹⁵NO₃或者¹⁵NH₄ ⁺或者¹³C-标记氨基酸)，可以使得这些细胞在其蛋白质分离之前就标记蛋白质。类似的，也可以使用荧光标记。根据前述技术可以提取、隔离和分离这些标记蛋白质。

用这些技术显现的蛋白质，可以通过测量所用的染料或者标记作进一步分析。特定蛋白质的数量可以使用例如光学方法，进行定量确定，并且可以与在同一块凝胶上或者其他凝胶上的其他蛋白质的数量进行比较。可以通过例如光学比较、分光分析、凝胶图象分析和扫描，或者通过使用照相胶片或者显示器，对凝胶上的蛋白质进行比较。这些技术在技术上是熟知的。

为了确定特定蛋白质的特性，可以使用直接序列测定或者其他标准技术。例如，可以使用N-和/或C-末端氨基酸测序(例如Edman降解)，以及质谱分析(特别是MALDI或者ESI技术(参见例如，Langen et al.(1997)Electrophoresis 18：1184-1192))。此处提供的蛋白质序列，可以用作通过这些技术进行的谷氨酸棒杆菌蛋白质鉴定。

通过这些技术得到的信息，可以用于比较蛋白质存在、活性、不同生物条件下(例如，在其他条件中的不同生物体、发酵时间点、培养基条件、或者生物环境)不同样品间修饰的各种模式。这些试验得到的数据，可以单独的，或者与其他技术相结合的用于各种应用，例如比较特定情况下(例如代谢情况)各种生物体的行为，增加生产精细化学物质的菌株的生产能力，或者增加精细化学物质生产的效率。

实施例14：利用聚合酶反应(PCR)克隆基因

可以使用含有与谷氨酸棒杆菌或其他菌株序列同源的核苷酸序列或本领域熟知的限制酶识别位点的特异性寡核苷酸扩增基因(例如可参见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。这些可以用来扩增含有上述菌株部分基因组的特异性DNA片段，使用以下DNA聚合酶如水生栖热菌DNA聚合酶、P.furiosus DNA聚合酶或P.woesei DNA聚合酶，在适量的缓冲溶液中含有dNTP，按照厂商说明进行操作。

基因片段如包括基因编码区中不存在的合适上游和下游区域的RXA00657编码序列可以使用上述技术扩增。而且，这些片段可以由未整合的寡核苷酸和核苷酸中纯化。DNA限制酶可以用来产生突出末端，用来连接DNA片段至用互补性酶或匹配的酶消化的载体上，所述酶产生可以用来连接DNA至Sinskey等美国专利4649119中所述的载体中的末端，使用谷氨酸棒杆菌和相关的短杆菌(如乳发酵短杆菌)遗传操作技术见以下文献(Yoshihama et al，J.Bacteriol.162：591-597(1985)；Katsumata et al.，J.Bacteriol.159：306-311(1984)；and Santamaria et al.，J.Gen.Microbiol.130：2237-2246(1984)。用于扩增RXA00657上游DNA序列、编码区序列和下游区域的引物如下：

TCGGGTATCCGCGCTACACTTAGA(SEQ ID NO：121)；

GGAAACCGGGGCATCGAAACTTA(SEQ ID NO：122)

200ng谷氨酸棒杆菌染色体DNA用作模板，反应体积100μl，含有2,5UPfu Turbo-Polymerase^TM(Stratagene^TM)，和200μM dNTP-核苷酸。在PCR-Cycler^TM(Perkin Elmer 2400^TM)上进行PCR，使用以下温度/时间循环：

1个循环：94℃：2min.；

20个循环：94℃：1min.；

52℃：1min，72℃：1.5min.，

1个循环：72℃：5min.

从获得的扩增DNA片段中除去引物，所得的片段克隆进pBS KS(Stratagene^TM)平端EcoRV位点。用限制酶BamHI/XhoI消化切下片段，并连接到BamHI SalI消化的载体pB(SEQ ID NO.：125)中。所得载体称为pBRXA00657。

所得重组载体使用标准技术分析，具体可参见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)，也可以使用上述技术转移进谷氨酸棒杆菌中。

棒杆菌菌株(ATCC 13286)如上所述转化处理。棒杆菌菌株转化可以通过原生质体转化(Kastsumata，R.et al.(1984)J.Bacteriol.159306-311)，电穿孔(Liebl，E.et al.(1989)FEMS Microbiol.Letters，53：399-303)实现，在使用特殊载体时，也可以通过辍合(conjugation)实现(见例如A.et al.(1990)J.Bacteriol.172：1663-1666)。也可以将穿梭载体由谷氨酸棒杆菌转化到大肠杆菌中，由谷氨酸棒杆菌中制备质粒DNA(使用本领域熟知的标准方法)并转化进大肠杆菌中。该转化步骤可以通过标准方法实现，使用Mcr-缺陷大肠杆菌菌株如NM522(Gough & Murray(1983)J.Mol.Biol.166：1-19)更为有利。

细菌菌株如谷氨酸棒杆菌菌株(ATCC 13286)的转化使用含有前述RXA00657 DNA区域的(SEQ ID NO.：6)质粒pB或不含插入核酸的载体pB(SEQ ID NO.：)进行。

所得菌株铺平板并由CM培养基中分离，培养基含有10g/l葡萄糖，2,5g/l NaCl，2,0g/l尿素，10g/l细菌用蛋白胨(Difco/Becton Dicinson/SparksUSA^TM)，5g/l酵母提取物(Difco/Becton Dicinson/Sparks USA^TM)，5g/l肉提取物(Difco/Becton Dicinson/Sparks USA^TM)，22g/l琼脂(Difco/BectonDickinson/Sparks USA^TM)和15μg/ml硫酸卡那霉素(Serva，Germany)，用NaOH调pH至6.8。

由上述琼脂培养基中分离的菌株以10毫升接种于没有覆盖(baffles)的100ml烧瓶中的液体培养基中，培养基中含有100g/l蔗糖，50g/l(NH4)₂SO₄，2,5g/l NaCl，2,0g/l尿素，10g/l细菌用蛋白胨(Difco/BectonDickinson/Sparks USA)，5g/l酵母提取物(Difco/Becton Dickinson/SparksUSA)，5g/l肉提取物(Difco/Becton Dickinson/Sparks USA)，和25g/l CaCO3(Riedel de Haen，Germany)。用NaOH调pH至6.8。

菌株30℃温育48h。Eppendorf^TM离心机中12,000rpm离心20′制备上清。稀释液体上清并进行氨基酸分析(这些测定的标准方法见AppliedMicrobial Physiology，A Practical Approach，P.M.Rhodes and P.F.Stanbury，eds.，IRL Press，p.103-129；131-163；and 165-192(ISBN：0199635773)及其中引用的文献)。

结果见以下表6。

表6

菌株ATCC13286	含有的质粒	pB	pB RXA00657

产生的赖氨酸(g/l)		13.5	14.93
				选择性(mol赖氨酸/mol消耗的糖)	0.235	0.25

等同声明

本领域技术人员可以认识到，或者能够确定仅仅使用常规实验，此处描述的本发明的特定实施方案有很多等价物。下面的权利要求意图包含这些等价物。

表3：可用于本发明实施的棒杆菌和短杆菌菌株

属

种

ATCC

FERM

NRRL

DECT

NCIMB

CBS

NCTC

DSMZ

短杆菌

产氨短杆菌

21054

短杆菌

产氨短杆菌

19350

短杆菌

产氨短杆菌

19351

短杆菌

产氨短杆菌

19352

短杆菌

产氨短杆菌

19353

短杆菌

产氨短杆菌

19354

短杆菌

产氨短杆菌

19355

短杆菌

产氨短杆菌

19356

短杆菌

产氨短杆菌

21055

短杆菌

产氨短杆菌

21077

短杆菌

产氨短杆菌

21553

短杆菌

产氨短杆菌

21580

短杆菌

产氨短杆菌

39101

短杆菌

butanicum

21196

短杆菌

分歧短杆菌

21792

P928

短杆菌

黄色短杆菌

21474

短杆菌

黄色短杆菌

21129

短杆菌

黄色短杆菌

21518

短杆菌

黄色短杆菌

B11474

短杆菌

黄色短杆菌

B11472

短杆菌

黄色短杆菌

21127

短杆菌

黄色短杆菌

21128

短杆菌

黄色短杆菌

21427

短杆菌

黄色短杆菌

21475

短杆菌

黄色短杆菌

21517

短杆菌

黄色短杆菌

21528

短杆菌

黄色短杆菌

21529

短杆菌

黄色短杆菌

B11477

短杆菌

黄色短杆菌

B11478

短杆菌

黄色短杆菌

21127

短杆菌

黄色短杆菌

B11474

短杆菌

希氏短杆菌

15527

短杆菌

酮戊二酸短杆菌

21004

短杆菌

酮戊二酸短杆菌

21089

短杆菌

ketosoreductum

21914

短杆菌

乳发酵短杆菌

70

短杆菌

乳发酵短杆菌

74

短杆菌

乳发酵短杆菌

77

短杆菌

乳发酵短杆菌

21798

短杆菌

乳发酵短杆菌

21799

短杆菌

乳发酵短杆菌

21800

短杆菌

乳发酵短杆菌

21801

短杆菌

乳发酵短杆菌

B11470

短杆菌

乳发酵短杆菌

B11471

属

种

ATCC

FERM

NRRL

CECT

NCIMB

CBS

NCTC

DSMZ

短杆菌

乳发酵短杆菌

21086

短杆菌

乳发酵短杆菌

21420

短杆菌

乳发酵短杆菌

21086

短杆菌

乳发酵短杆菌

31269

短杆菌

扩展短杆菌

9174

短杆菌

扩展短杆菌

19391

短杆菌

扩展短杆菌

8377

短杆菌

paraffinolyticum

11160

短杆菌

短杆菌属种.

717.73

短杆菌

短杆菌属种.

717.73

短杆菌

短杆菌属种.

14604

短杆菌

短杆菌属种.

21860

短杆菌

短杆菌属种.

21864

短杆菌

短杆菌属种.

21865

短杆菌

短杆菌属种.

21866

短杆菌

短杆菌属种.

19240

棒杆菌

嗜乙酰乙酸棒杆菌

21476

棒杆菌

嗜乙酰乙酸棒杆菌

13870

棒杆菌

乙酰谷氨酸棒杆菌

B11473

棒杆菌

乙酰谷氨酸棒杆菌

B11475

棒杆菌

乙酰谷氨酸棒杆菌

15806

棒杆菌

乙酰谷氨酸棒杆菌

21491

棒杆菌

乙酰谷氨酸棒杆菌

31270

棒杆菌

嗜乙酰棒杆菌

B3671

棒杆菌

产氨棒杆菌

6872

2399

棒杆菌

产氨棒杆菌

15511

棒杆菌

fujiokense

21496

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

14067

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

39137

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21254

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21255

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

31830

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

13032

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

14305

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

15455

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

13058

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

13059

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

13060

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21492

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21513

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21526

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21543

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

13287

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21851

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21253

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21514

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21516

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21299

属

种

ATCC

FERM

NRRL

CECT

NCMB

CBS

NCTC

DSMZ

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21300

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

39684

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21488

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21649

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21650

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19223

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

13869

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21157

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21158

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21159

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21355

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

31808

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21674

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21562

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21563

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21564

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21565

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21566

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21567

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21568

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21569

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21570

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21571

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21572

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21573

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21579

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19049

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19050

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19051

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19052

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19053

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19054

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19055

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19056

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19057

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19058

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19059

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19060

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

19185

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

13286

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21515

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21527

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21544

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21492

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

B8183

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

B8182

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

B12416

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

B12417

属

种

ATCC

FERM

NRRL

CECT

NCIMB

CBS

NCTC

DSMZ

Otherorigin

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

B12418

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

B11476

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

21608

棒杆菌

百合花棒杆菌

P973

棒杆菌

nitrilophilus

21419

11594

棒杆菌

棒杆菌属种

P4445

棒杆菌

棒杆菌属种

P4446

棒杆菌

棒杆菌属种

31088

棒杆菌

棒杆菌属种

31089

棒杆菌

棒杆菌属种

31090

棒杆菌

棒杆菌属种

31090

棒杆菌

棒杆菌属种

31090

棒杆菌

棒杆菌属种

15954

20145

棒杆菌

棒杆菌属种

21857

棒杆菌

棒杆菌属种

21862

棒杆菌

棒杆菌属种

21863

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌^*

ASO19

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌^**

ASO19E12

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌^***

HL457

棒杆菌

谷氨酸棒杆菌^****

HL459

ATCC：美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，USA

FERM：发酵研究所，Chiba，Japan

NRRL：ARS培养物保藏中心，北方区域研究实验室，Peoria，IL，USA

CECT：西班牙典型培养物保藏中心，Valencia，Spain

NCIMB：国立工业和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen，UK

CBS：真菌菌种保藏中心，Baarn，NL

NCTC：国立典型培养物保藏中心，London，UK

DSMZ：德意志微生物保藏中心，Braunschweig，Germany

具体可参见Sugawara，H.et al.(1993)World directory ofcollections ofcultures of microorganisms：Bacteria，fungi and yeasts(4^th edn)，World federation for culture collections world data center on microorganisms，Saimata，Japen.

^*谷氨酸棒杆菌ATCC13059^d的自发利福平抗性突变体Yoshihama et al.，1985

^**ASO19的限制缺陷变体Follettie et al.，1993

^***ASO19E12mnetC-破坏突变体本研究

^****ASO19E12metC-破坏突变体本研究

序列表

Claims

1.经分离的核酸分子，所述的核酸分子由SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其全长互补序列组成。

2.编码由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成的多肽的分离的核酸分子或该经分离的核酸分子的全长互补序列。

3.分离的核酸分子，该核酸分子由权利要求1所述的核酸分子和编码异源多肽的核苷酸序列组成。

4.包含权利要求1或2的核酸分子的载体。

5.权利要求4的载体，其为表达载体。

6.以权利要求4或5的载体转染的宿主细胞。

7.权利要求6的宿主细胞，其中所述细胞是微生物。

8.权利要求6的宿主细胞，其中该细胞属于棒杆菌属(Corynebacterium)或者短杆菌属(Brevibacterium)。

9.权利要求6-8中任一项的宿主细胞，其中，所述核酸分子的表达导致来自所述细胞的氨基酸产量的提高，其中所述氨基酸是L-甲硫氨酸。

10.生产L-甲硫氨酸的方法，包括在合适的培养基中培养权利要求9的细胞，从而生产所述的氨基酸。

11.权利要求10的方法，其中所述细胞在硫源存在下培养。

12.权利要求10的方法，其中所述的方法还包括从培养物中回收所述氨基酸的步骤。

13.权利要求10的方法，其中所述的细胞属于棒杆菌属或者短杆菌属。

14.权利要求10的方法，其中所述的细胞来自：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、力士棒杆菌(Corynebacteriumherculis)、百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、嗜乙酰棒杆菌(Corynebacteriumacetophilum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、Corynebacterium fujiokense、Corynebacterium nitrilophilus、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、Brevibacterium butanicum、分歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、希氏短杆菌(Brevibacterium healii)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacteriumketoglutamicum)、Brevibacterium ketosoreductum、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)。