ES2354867T3 - Genes de corynebacterium glutamicum que codifican proteínas del camino metabólico. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado de Corynebacterium glutamicum, estando implicada dicha proteína en el metabolismo de metionina y lisina y comprendiendo la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2.

Description

Genes de Corynebacterium glutamicum que codifican proteínas del camino metabólico.

Antecedentes de la invención

Ciertos productos y subproductos de procesos metabólicos existentes naturalmente en las células tienen utilidad en una serie extensa de industrias, que incluyen las industrias alimentaria, de los piensos, de los cosméticos, y farmacéutica. Estas moléculas, denominadas colectivamente "productos químicos finos", incluyen ácidos orgánicos, aminoácidos tanto proteinógenos como no proteinógenos, nucleótidos y nucleósidos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, así como enzimas. Su producción se realiza muy convenientemente por cultivo en gran escala de bacterias desarrolladas para producir y secretar grandes cantidades de una molécula particular deseada. Un organismo particularmente útil para este propósito es Corynebacterium glutamicum, una bacteria gram-positiva no patógena. Por selección de cepas, se han desarrollado cierto número de cepas mutantes que producen un conjunto de compuestos deseables. Sin embargo, la selección de las cepas implicadas para la producción de una molécula particular es un proceso difícil y que consume mucho tiempo.

Sumario de la invención

La invención proporciona una nueva molécula de ácido nucleico bacteriano que tiene una diversidad de usos. Estos usos incluyen la identificación de microorganismos que pueden utilizarse para producir aminoácidos, tales como lisina y metionina, la modulación de dicha producción en C. glutamicum o bacterias emparentadas, la tipificación o identificación de C. glutamicum o bacterias afines, como puntos de referencia para el mapeado del genoma de C. glutamicum, y como marcadores para transformación. Esta nueva molécula de ácido nucleico codifica una proteína, a la que se hace referencia en esta memoria como proteína del camino metabólico (MP).

C. glutamicum es una bacteria aerobia gram-positiva que se utiliza comúnmente en la industria para la producción en gran escala en una diversidad de productos químicos finos, y también para la degradación de hidrocarburos (por ejemplo en vertidos de petróleo) y para la oxidación de terpenoides. La molécula de ácido nucleico MP de la invención, por consiguiente, puede utilizarse para identificar microorganismos que pueden ser utilizados para producir productos químicos finos, v.g., por procesos de fermentación. La modulación de la expresión del ácido nucleico MP de la invención, o la modificación de la secuencia de la molécula de ácido nucleico MP de la invención, pueden utilizarse para modular la producción de uno o más productos químicos finos a partir de un microorganismo (v.g., para mejorar el rendimiento o la producción de uno o más productos químicos finos a partir de una especie de Corynebacterium o Brevibacterium). En una realización preferida, el gen MP de la invención está combinado con uno o más genes implicados en el mismo camino metabólico o un camino diferente para modular la producción de los aminoácidos mencionados anteriormente, a partir de un microorganismo.

El ácido nucleico MP de la invención puede utilizarse también para identificar un organismo como Corynebacterium glutamicum o como un miembro de la misma familia, o para identificar la presencia de C. glutamicum o un organismo afín del mismo en una población mixta de microorganismos. La invención proporciona la secuencia de ácido nucleico de un gen de C. glutamicum; por sondeo del DNA genómico extraído de un cultivo de una población simple o mixta de microorganismos en condiciones severas con una sonda que abarca una región de un gen de C. glutamicum que es exclusivo de este organismo, puede averiguarse si dicho organismo está presente. Aunque Corynebacterium glutamicum no es patógeno en sí mismo, el mismo es afín a especies patógenas en humanos, tales como Corynebacterium diphtheriae (el agente causal de la difteria); la detección de tales organismos tiene una gran relevancia clínica.

La molécula de ácido nucleico MP de la invención puede servir también como punto de referencia para mapeado del genoma de C. glutamicum, o de genomas de organismos afines. Análogamente, esta molécula, o variantes o porciones de la misma, pueden servir como marcadores para especies de Corynebacterium o Brevibacterium modificadas por ingeniería genética.

La proteína MP codificada por la nueva molécula de ácido nucleico de la invención es capaz de, por ejemplo, realizar un paso enzimático implicado en el metabolismo de los aminoácidos, especialmente lisina y metionina. Dada la disponibilidad de vectores de clonación para uso en Corynebacterium glutamicum, tales como los descritos en Sinskey et al, patente U.S. No. 4.649.119, y técnicas para manipulación genética de C. glutamicum y las especies de Brevibacterium afines (v.g., lactofermentum) (Yoshihama et al, J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata et al., J. Bacteriol. 159: 306-311 (1984); y Santamaria et al., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)); la molécula de ácido nucleico de la invención puede utilizarse en la ingeniería genética de este organismo para hacer de él un productor mejor o más eficiente de dichos aminoácidos.

Esta producción o eficiencia de producción mejorada de dicho producto químico puede ser debida a un efecto directo de la manipulación del gen de la invención, o puede ser debida a un efecto indirecto de dicha manipulación. Específicamente, las alteraciones en los caminos metabólicos de C. glutamicum para los aminoácidos, especialmente lisina y metionina, pueden tener un impacto directo sobre la producción global de uno o más de estos compuestos deseados a partir de este organismo. Por ejemplo, la optimización de la actividad de una proteína del camino biosintético de lisina o metionina o la disminución de la actividad de una proteína del camino de degradación de lisina o metionina puede dar como resultado un aumento en el rendimiento o la eficiencia de producción de lisina o metionina a partir de dicho organismo modificado por ingeniería genética. Las alteraciones en las proteínas implicadas en estos caminos metabólicos pueden tener también un impacto indirecto sobre la producción o la eficiencia de producción de un producto químico fino deseado. Por ejemplo, puede eliminarse una reacción que está en competición por un compuesto intermedio necesario para la producción de una molécula deseada, o puede optimizarse un camino necesario para la producción de un compuesto intermedio particular para un compuesto deseado. Adicionalmente, modulaciones en la biosíntesis o degradación de lisina o metionina pueden aumentar la capacidad global del microorganismo para crecer y dividirse rápidamente, aumentando así el número y/o las capacidades de producción del microorganismo en cultivo e incrementando con ello el rendimiento posible del producto químico fino deseado.

El ácido nucleico y la molécula de proteína de la invención, solos o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico y proteínas del mismo o diferente camino metabólico, pueden utilizarse para mejorar directamente la producción o la eficiencia de producción de dichos productos químicos finos a partir de Corynebacterium glutamicum (v.g., metionina o lisina). Utilizando métodos genéticos recombinantes bien conocidos en la técnica, pueden manipularse una o más de las enzimas biosintéticas o degradantes de la invención para aminoácidos, especialmente lisina y metionina, de tal modo que se module su función. Por ejemplo, una enzima biosintética puede mejorarse en eficiencia, o puede destruirse su región de control alostérica de tal modo que se evite la inhibición por realimentación de la producción del compuesto. Análogamente, una enzima degradante puede delecionarse o modificarse por sustitución, deleción, o adición de tal modo que su actividad degradante para el compuesto deseado se reduzca sin deterioro de la viabilidad de la célula. En cada caso, el rendimiento global o la velocidad de producción del producto químico fino deseado pueden incrementarse.

Es asimismo posible que tales alteraciones en la molécula de proteína y el nucleótido de la invención puedan mejorar la producción de otros productos químicos finos además de los aminoácidos, v.g., lisina y metionina, vitaminas, cofactores, nutrientes farmacéuticos, nucleótidos, nucleósidos, y trehalosa por mecanismos indirectos. El metabolismo de un compuesto cualquiera está interconectado necesariamente con otros caminos biosintéticos y degradantes dentro de la célula, y los cofactores, compuestos intermedios, o sustratos necesarios en un camino son suministrados o están limitados análogamente por otro camino de este tipo. Así pues, por modulación de la actividad de la proteína de la invención, puede verse afectada la producción o eficiencia de actividad de otro camino biosintético o degradante de productos químicos finos. Por ejemplo, los aminoácidos sirven como las unidades estructurales de todas las proteínas, pero pueden estar presentes además intracelularmente en niveles que son limitantes para la síntesis de proteínas; por consiguiente, por aumento de la eficiencia de producción o los rendimientos de uno o más aminoácidos en el interior de la célula, pueden ser sintetizadas más fácilmente proteínas, tales como proteínas biosintéticas o degradantes. Análogamente, una alteración en una enzima de camino metabólico de tal modo que una reacción secundaria particular se vea más o menos favorecida puede dar como resultado la superproducción o infraproducción de uno o más compuestos que se utilizan como productos intermedios o sustratos para la producción de un producto químico fino deseado.

Genes que codifican proteínas de camino metabólico ("MP") de Corynebacterium glutamicum se conocen en la técnica anterior (Peters-Wendisch; Microbiology 143 (4): 1095-1103 (1997)). Además, métodos de modulación del rendimiento de productos químicos finos (concretamente lisina) por una célula, que comprenden la introducción de uno o más genes metabólicos en dicha célula son conocidos por la técnica anterior (Cremer; Appl. Environm. Microbiol. 57 (6): 1746-1752 (1991)).

La presente descripción describe otros ejemplos de proteínas MP y sus ácidos nucleicos correspondientes en la Tabla 1 y SEQ ID NOs 3-122. Entre éstos, las proteínas de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 y sus ácidos nucleicos correspondientes (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, respectivamente) se presentan como potencialmente útiles.

Adicionalmente, la presente invención describe y reivindica protección para una proteína MP adicional, a saber la de SEQ ID NO: 2, y para el ácido nucleico correspondiente (SEQ ID NO: 1). Este nuevo gen ha sido designado metZ.

La proteína de la invención, al igual que otras proteínas MP, es capaz, por ejemplo, de la realización de un paso enzimático implicado en el metabolismo de moléculas importantes para el funcionamiento normal de las células, tales como aminoácidos, v.g., lisina y metionina. Las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína MP se designan en esta memoria como moléculas de ácido nucleico MP. En una realización preferida, la proteína MP de la invención, sola o en combinación con una o más proteínas distintas del mismo o diferente camino metabólico, realiza un paso enzimático relacionado con el metabolismo de uno o más de los siguientes: aminoácidos, v.g., lisina y metionina. Ejemplos de dichas otras proteínas incluyen las codificadas por los genes indicados en la Tabla 1.

De acuerdo con ello, un aspecto de la descripción se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico (v.g., cDNAs, DNAs, o RNAs) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína MP o porciones biológicamente activas de la misma, así como fragmentos de ácido nucleico adecuados como iniciadores o sondas de hibridación para la detección o amplificación de ácidos nucleicos codificantes de MP (v.g., DNA o mRNA). La molécula de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de nucleótidos indicada como SEQ ID NO: 1), o la región codificante o un complemento de la misma de una de estas secuencias de nucleótidos. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida a es al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, ó 60%, con preferencia al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, o 70%, con más preferencia al menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, u 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o 90%, o 91%, 92%, 93%, 94%, y con más preferencia todavía al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o más homóloga a la secuencia de nucleótidos indicada como SEQ ID NO: 1, o una porción de la misma. En otra parte de la invención, la molécula de ácido nucleico aislada codifica las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NO: 2. La proteína MP preferida de la presente invención posee también preferiblemente al menos una de las actividades de MP descritas en esta memoria.

En otra realización de la descripción, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una proteína o porción de la misma en donde la proteína o proteína de la misma incluye una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la invención (SEQ ID NO: 2), v.g., suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos de la invención de tal modo que la proteína o porción de la misma mantiene una actividad de MP. Preferiblemente, la proteína o porción de la misma codificada por la molécula de ácido nucleico mantiene la capacidad de realizar una reacción enzimática en un camino metabólico de aminoácido, v.g. lisina o metionina, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido, o trehalosa. En una realización, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico es al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, ó 60%, con preferencia al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, o 70%, con más preferencia al menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, u 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o 90%, o 91%, 92%, 93%, 94%, y con más preferencia todavía al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o más homóloga a la secuencia de aminoácidos de la invención (v.g. una secuencia entera de aminoácidos SEQ ID NO: 2). En otra realización preferida, la proteína es una proteína de longitud total de C. glutamicum que es sustancialmente homóloga a la secuencia entera de aminoácidos de la invención (codificada por un marco de lectura abierto representado en SEQ ID NO: 1).

En otra realización preferida de la descripción, la molécula de ácido nucleico aislada se deriva de C. glutamicum y codifica una proteína (v.g., una proteína de fusión MP) que incluye un dominio biológicamente activo que es al menos aproximadamente 50% o más homólogo con respecto a una de las secuencias de aminoácidos de la invención (SEQ ID NO: 2) y es capaz de catalizar una reacción en un camino metabólico para un aminoácido, v.g. lisina o metionina, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido, o trehalosa, o una o más de las actividades indicadas en la Tabla 1, y que incluye también secuencias de ácido nucleico heterólogas que codifican un polipéptido heterólogo o regiones reguladoras.

En otra realización de la descripción, la molécula de ácido nucleico aislada tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos y se hibrida en condiciones severas a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención SEQ ID NO: 1). Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada corresponde a una molécula de ácido nucleico existente naturalmente. Más preferiblemente, el ácido nucleico aislado codifica una proteína MP de C. glutamicum existente naturalmente, o una porción biológicamente activa de la misma.

Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, v.g., vectores de expresión recombinantes, que contienen la molécula de ácido nucleico de la invención, sola o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico implicadas en el mismo o diferente camino, y células hospedadoras en las cuales se han introducido tales vectores. En una realización, se utiliza una célula hospedadora de este tipo para producir una proteína MP por cultivo de la célula hospedadora en un medio adecuado. La proteína MP puede aislarse luego del medio o de la célula hospedadora.

Otro aspecto adicional de la invención se refiere a un microorganismo alterado genéticamente en el cual el gen MP de la invención, solo o en combinación con uno o más genes implicados en el mismo o diferente camino metabólico, han sido introducidos o alterados. En una realización, el genoma de un microorganismo ha sido alterado por introducción de la molécula de ácido nucleico de la invención que codifica una o más secuencias MP de tipo salvaje o mutadas como transgenes solos o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico implicadas en el mismo o diferente camino metabólico. En otra realización, se han alterado los genes MP endógenos dentro del genoma del microorganismo, v.g. han sufrido disgregación funcional, por recombinación homóloga con uno o más genes MP alterados. En otra realización, el gen MP endógeno o introducido, solo o en combinación con uno o más genes del mismo o diferente camino metabólico en un microorganismo han sido alterados por una o más mutaciones, deleciones, o inversiones puntuarles, pero codifican todavía proteínas MP funcionales. En otra realización adicional, una o más de las regiones reguladoras (v.g., un promotor, represor o inductor) del gen MP en un microorganismo, solo o en combinación con uno o más genes MP o en combinación con uno o más genes del mismo o diferente camino metabólico, ha sido alterado (v.g., por deleción, truncación, inversión, o mutación puntual) de tal modo que la expresión de uno o más genes MP se ha modulado. En una realización preferida, el microorganismo pertenece al género Corynebacterium o Brevibacterium, siendo particularmente preferido Corynebacterium glutamicum. En una realización preferida, el microorganismo se utiliza también para la producción de un compuesto deseado, tal como un aminoácido, siendo particularmente preferidos lisina y metionina. La invención describe el gen MP metZ (SEQ ID NO: 1), y la descripción contiene el gen metC (SEQ ID NO: 3), o el gen RXA00657 (SEQ ID NO: 5), solo o en combinación con el gen MP de la invención o en combinación con uno o más genes implicados en el metabolismo de metionina y/o lisina.

En otro aspecto, la descripción proporciona un método de identificación de la presencia o actividad de Corynebacterium diphtheriae en un individuo. Este método incluye detección de las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos de la invención (solas o en combinación con otro MP descrito en esta memoria, es decir las secuencias indicadas en la Tabla 1 y en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO: 3 a 122) en un individuo, detectando con ello la presencia o actividad de Corynebacterium diphtheriae en el individuo.

Otro aspecto adicional de la invención se refiere a una proteína o porción MP, v.g., porción biológicamente activa aislada, de la misma. En una realización preferida, la proteína MP aislada, sola o en combinación con una o más proteínas MP de la descripción, o en combinación con una o más proteínas del mismo o diferente camino metabólico, puede catalizar una realización enzimática implicada en uno o más caminos para el metabolismo de un aminoácido, v.g., lisina o metionina, una vitamina, un cofactor, un nutriente farmacéutico, un nucleótido, un nucleósido, o trehalosa. En otra realización de la descripción, la proteína MP aislada o porción de la misma es suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos de la invención SEQ ID NO: 2, de tal modo que la proteína o porción de la misma mantiene la capacidad de catalizar una reacción enzimática implicada en uno o más caminos para el metabolismo de un aminoácido, una vitamina, un cofactor, un nutriente farmacéutico, un nucleótido, un nucleósido, o trehalosa.

La invención proporciona también una preparación aislada de una proteína MP. En realizaciones preferidas, la proteína MP comprende la secuencia de aminoácidos de la invención SEQ ID NO: 2. En otra realización preferida, la descripción se refiere a una proteína aislada de longitud total que es sustancialmente homóloga a una secuencia entera de aminoácidos de la invención SEQ ID NO: 2 (codificada por un marco de lectura abierto indicado en SEQ ID NO: 1). La proteína puede ser al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 5.5%, 56%, 57%, 58%, 59%, o 60%, con preferencia al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, o 70%, con más preferencia al menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, u 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o 90%, o 91%, 92%, 93%, 94%, y con más preferencia todavía al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o más homóloga a una secuencia entera de aminoácidos de la invención SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones de la descripción, la proteína MP aislada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 50% o más homóloga a una de las secuencias de aminoácidos de la invención SEQ ID NO: 2, y es capaz de catalizar una reacción enzimática en un camino metabólico de aminoácido, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido, o trehalosa sea sola o en combinación con una o más proteínas MP de la invención o cualquier proteína del mismo o diferente camino metabólico, o tiene una o más de las actividades indicadas en la Tabla 1.

Alternativamente, la proteína MP aislada de la descripción puede comprender una secuencia de aminoácidos que es codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida, v.g. se hibrida en condiciones severas, o es al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, o 60%, con preferencia al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, o 70%, con más preferencia al menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, u 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o 90%, o 91%, 92%, 93%, 94%, y con más preferencia todavía al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o más homóloga a una secuencia de nucleótidos de una de la invención (sic). Se prefiere también que las formas preferidas de proteínas MP tengan también una o más de las bioactividades MP descritas en esta memoria.

El polipéptido MP, o una porción biológicamente activa del mismo, puede estar enlazado operativamente a un polipéptido no-MP para formar una proteína de fusión. Preferiblemente, esta proteína de fusión tiene una actividad que difiere de la de la proteína MP sola. En otras realizaciones preferidas, esta proteína de fusión, cuando se introduce en un camino de C. glutamicum para el metabolismo de un aminoácido, vitamina, cofactor, o nutriente farmacéutico, da como resultado rendimientos y/o eficiencia de producción incrementados de un producto químico fino deseado a partir de C. glutamicum. Preferiblemente, la integración de esta proteína de fusión en un camino metabólico de aminoácido, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido, o trehalosa de una célula hospedadora modula la producción de un compuesto deseado por la célula.

En otro aspecto, la descripción proporciona métodos para selección de moléculas que modulan la actividad de una proteína MP, sea por interacción con la proteína propiamente dicha o un sustrato o pareja de fijación de la proteína MP, o por modulación de la transcripción o traducción de una molécula de ácido nucleico MP de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir dicho compuesto químico. Este método implica el cultivo de una célula que contiene uno o más vectores que dirigen la expresión de la molécula de ácido nucleico MP reivindicada de la invención, sea sola o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico MP distintas, de tal modo que se produce dicho compuesto químico. En una realización preferida, este método incluye adicionalmente el paso de obtener una célula que contiene un vector de este tipo, en el cual una célula es transfectada con un vector que dirige la expresión de un ácido nucleico MP. En otra realización preferida, este método incluye adicionalmente el paso de recuperar el producto químico del cultivo. En una realización particularmente preferida, la célula pertenece al género Corynebacterium o Brevibacterium, o se selecciona de las cepas indicadas en la Tabla 3. En otra realización preferida, el gen MP se utiliza en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico MP implicadas en el metabolismo de metionina y/o lisina. El producto químico fino es un aminoácido, v.g., L-lisina y L-metionina.

Otro aspecto de la descripción se refiere a métodos para modular la producción de una molécula a partir de un microorganismo. Tales métodos incluyen poner en contacto la célula con un agente que modula la actividad de la proteína MP o la expresión del ácido nucleico MP de tal modo que se altera una actividad asociada de la célula con relación a esta misma actividad en ausencia del agente. En una realización preferida, la célula se modula para uno o más caminos metabólicos de aminoácido, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido o trehalosa de C. glutamicum, de tal modo que se mejoran los rendimientos o la tasa de producción de un producto químico fino deseado por este microorganismo. El agente que modula la actividad de la proteína MP puede ser un agente que estimula la actividad de la proteína MP o la expresión del ácido nucleico MP. Ejemplos de agentes que estimulan la actividad de la proteína MP o la expresión del ácido nucleico MP incluyen moléculas pequeñas, proteínas MP activas, y ácidos nucleicos que codifican proteínas MP que han sido introducidos en la célula. Ejemplos de agentes que inhiben la actividad o expresión de MP incluyen moléculas pequeñas y moléculas de ácido nucleico MP antisentido.

Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para modular los rendimientos de un compuesto deseado a partir de una célula, que implican la introducción de un gen MP de tipo salvaje o mutante en una célula, sea solo o en combinación de una o más moléculas de ácido nucleico MP de la invención o cualquier molécula de ácido nucleico del mismo o diferente camino metabólico, sea mantenido en un plásmido separado o integrado en el genoma de la célula hospedadora. Si está integrado en el genoma, dicha integración puede ser aleatoria, o puede tener lugar por recombinación homóloga de tal modo que el gen nativo es reemplazado por la copia introducida, causando la producción del compuesto deseado por la célula a modular. En una realización preferida, dichos rendimientos se incrementan. En otra realización preferida, dicho producto químico es un producto químico fino. El producto químico fino es un aminoácido. En realizaciones especialmente preferidas, dichos aminoácidos son L-lisina y L-metionina. En otra realización preferida, dicho gen es el gen metZ (SEQ ID NO: 1), solo o en combinación con el gen metC (SEQ ID NO: 3), o el gen RXA00657 (SEQ ID NO: 5), o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico MP de la descripción o con uno o más genes implicados en el metabolismo de metionina y/o lisina.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un ácido nucleico y proteína MP implicados en el metabolismo de aminoácidos en Corynebacterium glutamicum, especialmente lisina y metionina. Las moléculas de la invención pueden utilizarse en la modulación de la producción de dichos productos químicos a partir de microorganismos, tales como C. glutamicum, sea directamente (v.g., donde la modulación de la actividad de una proteína de la biosíntesis de lisina o metionina tiene un impacto directo sobre la producción o eficiencia de producción de lisina o metionina por dicho organismo), o pueden tener un impacto directo que da como resultado sin embargo un aumento del rendimiento o de la eficiencia de producción del compuesto deseado (v.g., donde la modulación de la actividad de una proteína de la biosíntesis de nucleótidos (sic) tiene un impacto sobre la producción de un ácido orgánico o un ácido graso por la bacteria, debido quizás a crecimiento incrementado o a un suministro incrementado de cofactores, compuestos energéticos, o moléculas precursoras necesarios). Las moléculas MP pueden utilizarse solas o en combinación con otras moléculas MP de la descripción, o en combinación con otras moléculas implicadas en el mismo camino o un camino metabólico diferente (v.g. metabolismo de lisina o metionina). En una realización preferida, las moléculas MP son las moléculas de ácido nucleico metZ (SEQ ID NO: 1), sola o en combinación con metC (SEQ ID NO: 3), o RXA00657 (SEQ ID NO: 5) o las proteínas codificadas por estas moléculas de ácido nucleico (SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6, respectivamente). Aspectos de la invención se explican adicionalmente a continuación.

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I. Productos Químicos Finos

El término "producto químico fino" está acreditado en la técnica e incluye moléculas producidas por un organismo que tienen aplicaciones en diversas industrias, tales como, pero sin carácter limitante, las industrias farmacéutica, agrícolas y de los cosméticos. Tales compuestos incluyen ácidos orgánicos, tales como ácido tartárico, ácido itacónico, y ácido diaminopimélico, aminoácidos tanto proteinógenos como no proteinógenos, bases púricas y pirimidínicas, nucleósidos, y nucleótidos (como se describen, v.g., en Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, p. 561-612, en Biotechnology vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, y las referencias contenidas en dichos lugares), lípidos, ácidos grasos tanto saturados como insaturados (v.g., ácido araquidónico), dioles (v.g. propanodiol, y butanodiol), carbohidratos (v.g., ácido hialurónico y trehalosa), compuestos aromáticos (v.g., aminas aromáticas, vanillina, e índigo), vitaminas y cofactores (como se describen en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", p. 443-613 (1996) VCH: Weinheim y las referencias citadas en dicho lugar; and Ong, A.S., Niki, E. & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia, celebrada en fechas 1-3 Sept., 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press, (1995)), enzimas, poliquétidos (Cane et al. (1998) Science 282: 63-68), y todos los restantes productos químicos descritos en Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 y las referencias citadas en dichos lugares. El metabolismo y los usos de algunos de estos productos químicos finos se explican con mayor detalle a continuación.

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A. Metabolismo y Usos de los Aminoácidos

Los aminoácidos constituyen las unidades estructurales básicas de todas las proteínas, y como tales son esenciales para el funcionamiento celular normal en todos los organismos. El término "aminoácido" está acreditado en la técnica. Los aminoácidos proteinógenos, de los cuales existen 20 especies, sirven como unidades estructurales para las proteínas, en las cuales los mismos están enlazados por enlaces peptídicos, mientras que los aminoácidos no proteinógenos (de los cuales se conocen centenares) no se encuentran normalmente en las proteínas (véase Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Los aminoácidos pueden encontrarse en la configuración óptica D o L, aunque los L-aminoácidos son generalmente el único tipo encontrado en las proteínas existentes naturalmente. Los caminos biosintético y degradante de cada uno de los 20 aminoácidos proteinógenos han sido bien caracterizados en células tanto procariotas como eucariotas (véase por ejemplo, Stryer, L. Biochemistry, 3ª edición, páginas 578-590 (1982)). Los aminoácidos "esenciales" (histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, y valina), así denominados porque son generalmente un requisito nutricional debido a la complejidad de sus biosíntesis, se convierten fácilmente por caminos biosintéticos sencillos en los 11 aminoácidos "no esenciales" restantes (alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamato, glutamina, glicina, prolina, serina y tirosina). Los animales superiores conservan de hecho la capacidad de sintetizar algunos de estos aminoácidos, pero los aminoácidos esenciales deben ser suministrados en la dieta a fin de que tenga lugar la síntesis normal de las proteínas.

Aparte de su producción en la biosíntesis de las proteínas, ciertos aminoácidos son productos químicos interesantes por sí mismos, y se ha encontrado que muchos de ellos tienen diversas aplicaciones en las industrias alimentarias, de los piensos, químicas, de los cosméticos, agrícolas, y farmacéuticas. La lisina es un aminoácido importante en la nutrición no sólo de los humanos, sino también de animales monogástricos tales como las aves y los cerdos. El glutamato se utiliza muy habitualmente como aditivo saborizante (glutamato monosódico, MSG) y se utiliza ampliamente en la industria alimentaria en toda su extensión, al igual que aspartato, fenilalanina, glicina y cisteína. Glicina, L-metionina y triptófano se utilizan todos ellos en la industria farmacéutica. Glutamina, valina, leucina, isoleucina, histidina, arginina, prolina, serina y alanina se utilizan tanto en la industria farmacéutica como en la de los cosméticos. Treonina, triptófano, y D/L-metionina son aditivos comunes de piensos. (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, p. 466-502 in Rehm et al. (eds.) Biotechnology vol. 6, capítulo 14a, VCH: Weinheim). Adicionalmente, se ha encontrado que estos aminoácidos son útiles como precursores para la síntesis de aminoácidos y proteínas sintéticos, tales como N-acetilcisteína, S-carboximetil-L-cisteína, (S)-5-hidroxitriptófano, y otros descritos en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97 VCH: Weinheim 1985.

La biosíntesis de estos aminoácidos naturales en organismos capaces de producirlos, tales como bacterias, ha sido bien caracterizada (para revisión de la biosíntesis bacteriana de aminoácidos y regulación de la misma, véase Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606). El glutamato se sintetiza por la aminación reductora de \alpha-cetoglutarato, un compuesto intermedio en el ciclo del ácido cítrico. Glutamina, prolina y arginina se producen cada uno subsiguientemente a partir de glutamato. La biosíntesis de serina es un proceso de tres pasos que comienza con 3-fosfoglicerato (un compuesto intermedio en la glicólisis), y que da como resultado este aminoácido después de pasos de oxidación, transaminación, e hidrólisis. Cisteína y glicina se producen ambos a partir de serina; la primera por la condensación de homocisteína con serina, y la última por la transferencia del átomo de carbono \beta de la cadena lateral a tetrahidrofolato, en una reacción catalizada por serina-transhidroximetilasa. Fenilalanina y tirosina se sintetizan a partir de los precursores de los caminos glicolítico y de pentosa-fosfato, eritrosa-4-fosfato y fosfoenolpiruvato en un camino biosintético de 9 pasos que difiere únicamente en los dos pasos finales después de la síntesis del prefenato. El triptófano se produce también a partir de estas dos moléculas iniciales, pero su síntesis es un camino de 11 pasos. La tirosina puede ser sintetizada también a partir de fenilalanina, en una reacción catalizada por fenilalanina-hidroxilasa. Alanina, valina, y leucina son todos ellos productos biosintéticos del piruvato, el producto final de la glicólisis. El aspartato se forma a partir de oxaloacetato, un compuesto intermedio en el ciclo del ácido cítrico. Asparagina, metionina, treonina, y lisina se producen todos ellos por la conversión de aspartato. La isoleucina se forma a partir de treonina.

Los caminos biosintéticos que conducen a la metionina han sido estudiados en diversos organismos. El primer paso, la acilación de la homoserina, es común a todos los organismos, aun cuando la fuente de los grupos acilo transferidos es diferente. Escherichia coli y las especies afines utilizan succinil-CoA (Michaeli, S. y Ron, E. Z. (1981) Mol. Gen. Genet. 182, 349-354), mientras que Saccharomyces cerevisiae (Langin, T., et al. (1986) Gene 49, 283-293), Brevibacterium flavum (Miyajima, R. y Shiio, I. (1973) J. Biochem. 73, 1061-1068; Ozaki, H. y Shiio, I. (1982) J. Biochem. 91, 1.163-1171), C. glutamicum (Park, S.-D., et al. (1998) Mol. Cells 8, 286-294), y Leptospira meyeri (Belfaiza, J. et al. (1998) 180, 250-255; Bourhy, P., et al. (1997) J. Bacteriol. 179, 4396-4398) utilizan acetil-CoA como el donante de acilo. La formación de homocisteína a partir de acilhomoserina puede tener lugar por dos vías diferentes. E. coli utiliza el camino de transsulfuración que es catalizado por la cistationina-\gamma-sintasa (el producto de metB) y cistationina \beta-liasa (el producto de metC). S. cerevisiae (Cherest, H. y Surdin-Kerjan, Y. (1992) Genetics 130,51-58), B. flavum (Ozaki, H. y Shiio, I. (1982) J. Biochem. 91, 1163-1171), Pseudomonas aeruginosa (Foglino, M., et al. (1995) Microbiology 141, 431-439), y L. meyeri (Belfaiza, J., et al. (1998) J. Bacteriol. 180, 250-255) utilizan el camino de sulfhidrilación directa que es catalizado por acilhomoserina-sulfhidrilasa. Al contrario que B. flavum, estrechamente afín, que utiliza únicamente el camino de la sulfhidrilación directa, han sido detectadas actividades enzimáticas del camino de transsulfuración en los extractos de las células de C. glutamicum y se ha propuesto que el camino es la ruta para la biosíntesis de metionina en el organismo (Hwang, B-J., et al. (1999) Mol. Cells 9, 300-308; Kase, H. y Nakayama, K. (1974) Agr. Biol. Chem. 38, 2021-2030; Park, S.-D., et al. 1998) Mol. Cells 8, 286-294).

Aunque algunos genes implicados en la biosíntesis de metionina en C. glutamicum han sido aislados, la información acerca de la biosíntesis de metionina en C. glutamicum es todavía muy escasa. Ningún gen distinto de metA y metB ha sido aislado del organismo. Para comprender los caminos biosintéticos que conducen a metionina en C. glutamicum, los autores de la presente invención han aislado y caracterizado el gen metC (SEQ ID NO: 3) y el gen metZ (denominado también metY) (SEQ ID NO: 1) de C. glutamicum (véase la Tabla 1).

Los aminoácidos en exceso de las necesidades de síntesis de proteínas de la célula no pueden almacenarse, y en lugar de ello son degradados para proporcionar productos intermedios para los caminos metabólicos principales de la célula (para una revisión véase Stryer, L. Biochemistry 3ª edición, cap. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle", p. 495-516 (1988)). Aunque la célula es capaz de convertir aminoácidos no deseados en compuestos intermedios metabólicos útiles, la producción de aminoácidos es costosa en términos de energía, moléculas precursoras, y las enzimas necesarias para sintetizarlas. Así, no es sorprendente que la biosíntesis de aminoácidos esté regulada por inhibición por realimentación, en la cual la presencia de un aminoácido particular sirve para ralentizar o detener por completo su propia producción (para revisión de los mecanismos de la realimentación en los caminos de la biosíntesis de aminoácidos, véase Stryer, L. Biochemistry 3ª edición, cap. 24: "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", p. 575-600 (1988)). Así pues, la producción de cualquier aminoácido particular está limitada por la cantidad de dicho aminoácido presente en la célula.

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B. Metabolismo y Usos de Vitaminas, Cofactores, y Nutrientes Farmacéuticos

Vitaminas, cofactores, y nutrientes farmacéuticos constituyen otro grupo de moléculas que los animales superiores son incapaces de sintetizar y por consiguiente deben ingerir, aunque los mismos son sintetizados fácilmente por otros organismos, tales como las bacterias. Estas moléculas son o bien sustancias bioactivas por sí mismas, o son precursores de sustancias biológicamente activas que pueden servir como portadores de electrones o compuestos intermedios en una diversidad de caminos metabólicos. Aparte de su valor nutritivo, estos compuestos tienen también valor industrial importante como agentes colorantes, antioxidantes, y catalizadores u otros adyuvantes de procesos. (Para una revisión de la estructura, actividad, y aplicaciones industriales de estos compuestos, véase, por ejemplo, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" vol. A27, p. 443-613 VCH: Weinheim 1986.) El término "vitamina" está acreditado en la técnica e incluye nutrientes que son requeridos por un organismo para su funcionamiento normal, pero que dicho organismo no puede sintetizar por sí mismo. El grupo de vitaminas puede abarcar cofactores y compuestos nutrientes farmacéuticos. La expresión lingüística "cofactor" incluye compuestos no proteínicos requeridos para que tenga lugar una actividad enzimática normal. Tales compuestos pueden ser orgánicos o inorgánicos; las moléculas de cofactores de la invención son preferiblemente orgánicas. El término "nutriente farmacéutico" incluye suplementos dietéticos que tienen beneficios para la salud de plantas y animales, particularmente en los humanos. Ejemplos de tales moléculas son vitaminas, antioxidantes, así como ciertos lípidos (v.g. ácidos grasos poliinsaturados).

La biosíntesis de estas moléculas en los organismos capaces de producirlas, tales como bacterias, ha sido extensamente estudiada (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" vol. A27, p. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, y la Society for Free Radical Research - Asia, celebrada en fecha 1-3 de septiembre de 1994 en Penang, Malaysia, AOCS Press: Champaign, IL X, 374 S).

La tiamina (vitamina B_{1}) es producida por el acoplamiento químico de restos pirimidina y tiazol. La riboflavina (vitamina B_{2}) se sintetiza a partir de guanosina-5'-trifosfato (GTP) y ribosa-5'-fosfato. La riboflavina, a su vez, se utiliza para la síntesis de flavina-mononucleótido (FMN) y flavina-adenina-dinucleótido (FAD). La familia de compuestos denominada colectivamente "vitamina B_{6}" (v.g., piridoxina, piridoxamina, piridoxa-5'-fosfato, y el hidrocloruro de piridoxina utilizado comercialmente) son todos ellos derivados de la unidad estructural común, 5-hidroxi-6-metilpiridina. El pantotenato (ácido pantoténico), (R)-(+)-N-(2,4-dihidroxi-3,3-dimetil-1-oxobutil)-\beta-alanina) puede producirse por síntesis química o por fermentación. Los pasos finales en la biosíntesis del pantotenato consisten en la condensación dirigida por ATP de \beta-alanina y ácido pantoico. Las enzimas responsables de los pasos de biosíntesis para la conversión en ácido pantoico, en \beta-alanina y para la condensación en ácido pantoténico son conocidos. La forma metabólicamente activa del pantotenato es la Coenzima A, cuya biosíntesis pasa por 5 pasos enzimáticos. Pantotenato, piridoxal-5'-fosfato, cisteína y ATP son los precursores de la Coenzima A. Estas enzimas no sólo catalizan la formación de pantotenato, sino también la producción de ácido (R)-pantoico, (R)-pantolactona, (R)-pantenol (provitamina B_{5}), panteteína (y sus derivados) y coenzima A.

La biosíntesis de biotina a partir de la molécula precursora pimeloil-CoA en microorganismos ha sido estudiada en detalle, y han sido identificados varios de los genes implicados. Se ha encontrado que muchas de las proteínas correspondientes están implicadas también en la síntesis de racimos de Fe y son miembros de la clase de proteínas nifS. El ácido lipoico se deriva del ácido octanoico, y sirve como coenzima en el metabolismo energético, donde el mismo llega a formar parte del complejo piruvato-deshidrogenasa y el complejo \alpha-cetoglutarato-deshidrogenasa. Los folatos son un grupo de sustancias, todas las cuales se derivan del ácido fólico, que se deriva a su vez de ácido L-glutámico, ácido p-aminobenzoico y 6-metilpterina. La biosíntesis del ácido fólico y sus derivados, a partir de los compuestos intermedios del metabolismo guanosina-5'-trifosfato (GTP), ácido L-glutámico y ácido p-aminobenzoico ha sido estudiada en detalle en ciertos microorganismos.

Los corrinoides (tales como las cobalaminas y particularmente la vitamina B_{12}) y las porfirinas pertenecen a un grupo de productos químicos caracterizados por un sistema de anillos de tetrapirrol. La biosíntesis de la vitamina B_{12} es tan compleja que no ha sido todavía caracterizada por completo, pero muchas de las enzimas y sustratos implicados se conocen actualmente. El ácido nicotínico (nicotinato), y la nicotinamida son derivados de piridina que se conocen también como "niacina". La niacina es el precursor de las importantes coenzimas NAD (nicotinamida-adenina-dinucleótido) y NADP (nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato) y sus formas reducidas.

La producción en gran escala de estos compuestos se ha basado en gran parte en síntesis químicas exentas de células, aunque algunos de estos productos químicos han sido producidos también por cultivo en gran escala de microorganismos, tales como riboflavina, Vitamina B_{6}, pantotenato, y biotina. Únicamente la Vitamina B_{12} se produce exclusivamente por fermentación, debido a la complejidad de su síntesis. Las metodologías in vitro requieren aportes importantes de materiales y tiempo, a menudo con un coste elevado.

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C. Metabolismo y Usos de Purinas, Pirimidinas, Nucleósidos y Nucleótidos

Los genes del metabolismo de las purinas y pirimidinas, y sus proteínas correspondientes, son dianas importantes para la terapia de enfermedades tumorales e infecciones virales. Las expresiones lingüísticas "purina" o "pirimidina" incluyen las bases nitrogenadas que son constituyentes de ácidos nucleicos, coenzimas, y nucleótidos. El término "nucleótido" incluye las unidades estructurales básicas de las moléculas de ácido nucleico, todas las cuales están constituidas por una base nitrogenada, un azúcar pentosa (en el caso del RNA, el azúcar es ribosa; en el caso del DNA, el azúcar es D-desoxirribosa), y ácido fosfórico. La expresión lingüística "nucleósido" incluye moléculas que sirven como precursores de los nucleótidos, pero que carecen del resto ácido fosfórico que poseen los nucleótidos. Por inhibición de la biosíntesis de estas moléculas, o su movilización para formar moléculas de ácido nucleico, es posible inhibir la síntesis de RNA y DNA; por inhibición de esta actividad de una manera direccionada a las células cancerosas, puede inhibirse la capacidad de las células tumorales para dividirse y replicarse. Adicionalmente, existen nucleótidos que no forman moléculas de ácido nucleico, sino que sirven en su lugar como almacenes de energía (por ejemplo, AMP) o como coenzimas (por ejemplo, FAD y NAD).

Varias publicaciones han descrito el uso de estos productos químicos para estas indicaciones médicas, por influir en el metabolismo de purinas y/o pirimidinas (v.g. Christopherson, R.I. y Lyons S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents." Med. Res. Reviews 10: 505-548). Los estudios de las enzimas implicadas en el metabolismo de purinas y pirimidinas se han enfocado en el desarrollo de nuevos fármacos que pueden ser utilizados, por ejemplo, como inmunosupresores o anti-proliferantes (Smith, J.L., (1995) "Enzimas in nucleotide synthesis." Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 752-757; (1995) Biochem Soc. Transact. 23: 877-902). Sin embargo, las bases púricas y pirimidínicas, los nucleósidos y nucleótidos tienen otras utilidades: como compuestos intermedios en la biosíntesis de varios productos químicos finos (v.g., tiamina, S-adenosil-metionina, folatos, o riboflavina), como vehículos de energía para la célula (v.g., ATP o GTP), y como productos químicos en sí mismos, utilizados comúnmente como mejoradores del sabor (v.g., IMP o GMP) o para varias aplicaciones médicas (véase, por ejemplo, Kuminaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, p. 561-612). Asimismo, las enzimas involucradas en el metabolismo de purinas, pirimidinas, nucleósidos o nucleótidos están siendo utilizadas crecientemente como dianas contra las cuales se desarrollan productos químicos para protección de las cosechas, con inclusión de fungicidas, herbicidas e insecticidas.

El metabolismo de estos compuestos en las bacterias ha sido caracterizado (para revisiones, véase, por ejemplo, Zalkin, H. y Dixon, J.E. (1992) "de novo purina nucleotide biosynthesis", en: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic Press: p. 259-287; y Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleotides", Capítulo 8 en: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: Nueva York).

El metabolismo de las purinas ha sido objeto de investigación intensiva, y es esencial para el funcionamiento normal de la célula. El metabolismo deteriorado de las purinas en los animales superiores puede causar enfermedades graves, tales como la gota. Los nucleótidos de purina se sintetizan a partir de ribosa-5-fostato, en una serie de etapas que pasan por el compuesto intermedio inosina-5'-fosfato (IMP), y que dan como resultado la producción de guanosina-5'-monofosfato (GMP) o adenosina-5'-monofosfato (AMP), a partir de los cuales se producen fácilmente las formas de trifosfato utilizadas como nucleótidos. Estos compuestos se utilizan también como almacenes de energía, con lo que su degradación proporciona energía para muchos procesos bioquímicos diferentes en la célula. La biosíntesis de las pirimidinas procede por la formación de uridina-5'-monofosfato (UMP) a partir de ribosa-5-fosfato. A su vez, UMP se convierte en citidina-5'-trifosfato (CTP). Las formas desoxi de todos estos nucleótidos se producen en una reacción de reducción de un solo paso a partir de la forma ribosa-difosfato del nucleótido a la forma desoxirribosa-difosfato del nucleótido. Después de la fosforilación, estas moléculas son capaces de participar en la síntesis del DNA.

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D. Metabolismo y Usos de la Trehalosa

La trehalosa está constituida por dos moléculas de glucosa, combinadas en enlace \alpha,\alpha-1,1. La misma se utiliza comúnmente en la industria alimentaria como edulcorante, aditivo para alimentos secos o congelados, y en bebidas. Sin embargo, la misma tiene también aplicaciones en las industrias farmacéutica, de los cosméticos y biotecnológica (véase, por ejemplo, Nishimoto et al., (1998) Patente U.S. No. 5.759.610; Singer, M.A. y Lindquist, S. (1998) Trends Biotech. 16: 460-467; Paiva, C.L.A. y Panek, A.D. (1996) Biotech Ann. Rev. 2: 293-314; y Shiosaka, M. (1997) J. Japan 172: 97-102). La trehalosa es producida por enzimas de muchos microorganismos y se libera naturalmente en el medio circundante, del cual puede recogerse utilizando métodos conocidos en la técnica.

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II. Elementos y Métodos de la Invención

Las Tablas 1 y 2 proporcionan listas de ácidos nucleicos y proteínas MP que juegan un papel o intervienen en uno o más caminos del metabolismo celular de C. glutamicum (la lista de la Tabla 2 está integrada por moléculas conocidas en la técnica anterior).

Una molécula MP tiene impacto en la producción de un producto químico deseado, sea solo o en combinación o moléculas implicadas en el mismo o diferentes caminos metabólicos, o en uno o más caminos metabólicos distintos para aminoácidos, vitaminas, cofactores, nutrientes farmacéuticos, nucleótidos, nucleósidos o trehalosa. Una molécula MP puede modularse en actividad, de tal modo que los caminos metabólicos de C. glutamicum en los cuales está implicada la molécula MP se modulen en eficiencia o capacidad de producción, lo cual modula directa o indirectamente la producción o eficiencia de producción de un producto químico fino deseado por C. glutamicum.

Las moléculas MP que catalizan una reacción enzimática que implica uno o más aminoácidos, son útiles para la producción de un producto químico fino. Entre ellas son particularmente útiles metZ, metC y RXA00657. La presente invención concierne a metZ, que juega un papel en la producción de lisina o metionina.

La expresión lingüística "proteína MP" o "polipéptido MP" incluye proteínas que juegan un papel, v.g., catalizan una reacción enzimática, en uno o más caminos metabólicos de aminoácidos, vitaminas, cofactores, nutrientes farmacéuticos, nucleótidos, nucleósidos o trehalosa. Ejemplos de proteínas MP incluyen las codificadas por los genes MP indicados en la Tabla 1 y por las SEQ ID NOs de número impar. Los términos "gen MP" o "secuencia de ácido nucleico MP" incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína MP, que están constituidas por una región codificante y regiones de secuencias 5' y 3' no traducidas correspondientes. Ejemplos de genes MP incluyen los indicados en la Tabla 1. Los términos "producción" o "productividad" están acreditados en la técnica e incluyen la concentración del producto de fermentación (por ejemplo, el producto químico fino deseado) formado en un tiempo dado y un volumen de fermentación dado (v.g., kg de producto por hora y por litro). El término "eficiencia de producción" incluye el tiempo requerido para que se alcance un nivel particular de producción (por ejemplo, el tiempo necesario para que la célula alcance una tasa de producción particular de un producto químico fino). El término "rendimiento" o "rendimiento producto/carbono" está acreditado en la técnica e incluye la eficiencia de la conversión de la fuente de carbono en el producto (es decir, el producto químico fino). Esto se escribe generalmente, por ejemplo, como kg de producto por kg de fuente de carbono. Al aumentar el rendimiento o la producción del compuesto, se incrementa la cantidad de moléculas recuperadas, o de moléculas útiles recuperadas de dicho compuesto en una cantidad dada de cultivo a lo largo de un periodo de tiempo dada. Los términos "biosíntesis" o un "camino biosintético" están acreditados en la técnica e incluyen la síntesis de un compuesto, preferiblemente un compuesto orgánico, por una célula a partir de compuestos intermedios, pudiendo tratarse de un proceso multietápico y altamente regulado. Los términos "degradación" o un "camino de degradación" están acreditados en la técnica e incluyen la descomposición de un compuesto, preferiblemente un compuesto orgánico, por una célula en productos de degradación (hablando en términos generales, moléculas más pequeñas o menos complejas) en lo que puede ser un proceso multietápico o altamente regulado. La expresión lingüística "metabolismo" está acreditada en la técnica e incluye la totalidad de las reacciones bioquímicas que tienen lugar en un organismo. Por tanto, El metabolismo de un compuesto particular, (v.g. metabolismo de un aminoácido tal como glicina) comprende los caminos globales de biosíntesis, modificación, y degradación en la célula relacionados con este compuesto.

La molécula MP de la presente invención puede combinarse con una o más moléculas MP adicionales de la descripción o una o más moléculas del mismo o diferente camino metabólico para aumentar el rendimiento de un aminoácido deseado, especialmente, lisina o metionina. Alternativa o adicionalmente, un subproducto que no se desea puede reducirse por combinación o disgregación de moléculas MP u otras moléculas metabólicas (v.g. moléculas implicadas en el metabolismo de lisina o metionina). Las moléculas MP combinadas con otras moléculas del mismo o diferente camino metabólico pueden alterarse en su secuencia de nucleótidos y en la secuencia de aminoácidos correspondiente a fin de alterar su actividad en condiciones fisiológicas, lo que conduce a un aumento en la productividad y/o rendimiento del producto químico deseado. En una realización adicional, una molécula MP en su forma original o en su forma alterada arriba descrita puede combinarse con otras moléculas del mismo o diferente camino metabólico que están alteradas en su secuencia nucleotídica de tal modo que su actividad se vea alterada en condiciones fisiológicas, lo que conduce a un aumento en la productividad y/o rendimiento de metionina o lisina.

En otra realización, la molécula MP de la invención, sola o en combinación con una o más moléculas del mismo o diferente camino metabólico, son capaces de modular la producción de una molécula deseada, tal como un producto químico fino, en un microorganismo tal como C. glutamicum. Utilizando técnicas genéticas recombinantes, una o más de las enzimas biosintéticas o degradantes de la invención para aminoácidos, v.g. lisina o metionina, vitaminas, cofactores, nutrientes farmacéuticos, nucleótidos, nucleósidos o trehalosa pueden manipularse de tal modo que se module su función. Por ejemplo, una enzima biosintética puede mejorarse en eficiencia, o puede destruirse su región de control alostérico de tal modo que se impida la inhibición por realimentación de la producción del compuesto. Análogamente, una enzima degradante puede delecionarse o modificarse por sustitución, deleción, o adición de tal modo que su actividad degradante para el compuesto deseado se reduzca sin deteriorar la viabilidad de la célula. En cada caso, el elemento o tasa de producción global de uno de estos compuestos químicos finos deseados puede incrementarse.

Es asimismo posible que tales alteraciones en la molécula de proteína y nucleótido de la invención puedan mejorar la producción de otros productos químicos finos además de los aminoácidos. El metabolismo de cualquier compuesto está interconectado necesariamente con otros caminos biosintéticos y degradantes en el interior de la célula, y los cofactores, compuestos intermedios, o sustratos necesarios en un camino están suministrados o limitados probablemente por otro camino de esta clase. Así pues, por modulación de la actividad de la proteína de la invención, puede verse afectada la producción o eficiencia de actividad de un camino biosintético o degradante de otro producto químico fino. Por ejemplo, los aminoácidos sirven como unidades estructurales de todas las proteínas, pero pueden estar presentes intracelularmente en niveles que son limitantes para la síntesis de proteínas; por consiguiente, al aumentar la eficiencia de producción o los rendimientos de uno o más aminoácidos dentro de la célula, pueden ser sintetizadas más fácilmente proteínas tales como proteínas biosintéticas o degradantes. Análogamente, una alteración en una enzima del camino metabólico de tal modo que pueda verse más o menos favorecida una reacción secundaria particular puede dar como resultado la super- o infraproducción de uno o más compuestos que se utilizan como compuestos intermedios o sustratos para la producción de un producto químico fino deseado.

La secuencia de ácido nucleico aislada de la invención está contenida en el genoma de una cepa de Corynebacterium glutamicum disponible de la American Type Culture Collection, a la que se ha asignado la designación ATCC13032. La secuencia de nucleótidos de los DNAs MP aislados de C. glutamicum y las secuencias predichas de aminoácidos de las proteínas MP de C. glutamicum se muestran en el Listado de Secuencias como SEQ ID NOs de número impar y SEQ ID NOs de número par, respectivamente. Se han realizado análisis por computadora que clasifican y/o identifican estas secuencias de nucleótidos como secuencias que codifican proteínas del camino metabólico, v.g., proteínas implicadas en los caminos metabólicos de metionina o lisina.

La presente descripción se refiere también a proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos de la invención (v.g., la secuencia de una SEQ ID NO de número par del Listado de Secuencias). Como se utiliza en esta memoria, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos seleccionada es al menos aproximadamente 50% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada, v.g., la secuencia de aminoácidos seleccionada completa. Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos seleccionada puede ser también al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, o 60%, con preferencia al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, o 70%, con más preferencia al menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, u 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o 90%, o 91%, 92%, 93%, 94%, y con más preferencia todavía al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o más homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada.

La proteína MP de la invención, sola o en combinación con una o más proteínas del mismo o diferente camino metabólico, puede catalizar una reacción enzimática en uno o más caminos metabólicos de aminoácidos, vitaminas, cofactores, nutrientes farmacéuticos, nucleótidos, nucleósidos, o trehalosa, o tener una o más de las actividades indicadas en la Tabla 1 (especialmente metabolismo de la biosíntesis de metionina o lisina).

Diversos aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las subsecciones que siguen:

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A. Moléculas de Ácido Nucleico Aisladas

Un aspecto de la descripción se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos MP o porciones biológicamente activas de los mismos, así como fragmentos de ácido nucleico suficientes para uso como sondas o iniciadores de hibridación para la identificación o amplificación de ácido nucleico codificante de MP (v.g., DNA MP). Como se utiliza en esta memoria, el término "molécula de ácido nucleico" tiene por objeto incluir moléculas de DNA (v.g., cDNA o DNA genómico) y moléculas de RNA (v.g., mRNA) y análogos del DNA o RNA generados utilizando análogos nucleotídicos. Este término abarca también secuencias no traducidas localizadas en ambos extremos 3' y 5' de la región codificante del gen: al menos aproximadamente 100 nucleótidos de secuencia aguas arriba del extremo 5' de la región codificante y al menos aproximadamente 20 nucleótidos de secuencia aguas abajo del extremo 3' de la región codificante del gen. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es DNA bicatenario. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está exento de secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el DNA genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico MP aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el DNA genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico (v.g., una célula de C. glutamicum). Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de DNA, puede estar sustancialmente exenta de otro material celular, o medio de cultivo, cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico MP descrita en esta memoria, v.g., una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de una SEQ ID NO de número impar del Listado de Secuencias, o una porción de la misma, puede aislarse utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencias que se proporciona en esta memoria. Por ejemplo, puede aislarse un DNA MP de C. glutamicum a partir de una biblioteca de C. glutamicum utilizando la totalidad o una porción de una de las secuencias SEQ ID NO de número impar del Listado de Secuencias como sonda de hibridación y técnicas de hibridación estándar (v.g., como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Además, una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de la secuencia de ácido nucleico de la invención (v.g., una SEQ ID NO: 1 de número impar) puede aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores oligonucleotídicos diseñados sobre la base de esta secuencia (v.g., una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de la secuencia de ácido nucleico de la invención (v.g., una SEQ ID NO: 1 de número impar) puede aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores oligonucleotídicos diseñados sobre la base de esta misma secuencia). Por ejemplo, puede aislarse mRNA a partir de células endoteliales normales (v.g., por el procedimiento de extracción con tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) y puede prepararse DNA utilizando transcriptasa inversa (v.g., transcriptasa inversa de MLV de Moloney, disponible de Gibco/DRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa AMV, disponible de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, Florida). Los iniciadores oligonucleotídicos sintéticos para la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa pueden diseñarse sobre la base de una de las secuencias de nucleótidos que se muestran en el Listado de Secuencias. El ácido nucleico de la invención puede amplificarse utilizando cDNA o, alternativamente, DNA genómico, como molde e iniciadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas estándar de amplificación PCR. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de la secuencia de DNA. Adicionalmente, pueden prepararse oligonucleótidos correspondientes a una secuencia oligonucleotídica de MP por técnicas de síntesis estándar, v.g. utilizando un sintetizador automático de DNA.

Una molécula de ácido nucleico asilada de la descripción comprende preferiblemente una de las secuencias de nucleótidos que se muestran en el Listado de Secuencias. Los DNAs comprenden secuencias que codifican proteínas MP (es decir, la "región codificante", indicada en cada secuencia SEQ ID NO: de número impar en el Listado de Secuencias), así como secuencias 5' no traducidas y secuencias 3' no traducidas, indicadas también en cada SEQ ID NO: de número impar en el Listado de Secuencias. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede comprender únicamente la región codificante de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico del Listado de
Secuencias.

Para los propósitos de esta solicitud, se comprenderá que algunas de las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos MP indicadas en el Listado de Secuencias tenga un número de identificación RXA, RXN, RXS, o RXC que tienen la designación "RXA", "RXN", "RXS" o "RXC" seguida por 5 dígitos (es decir, RXA, RXN, RXS, o RXC). Cada una de las secuencias de ácido nucleico comprende hasta 3 partes: una región 5' de aguas arriba, una región codificante, y una región de aguas abajo. Cada una de estas 3 regiones se identifica por la misma designación RXA, RXN, RXS, o RXC a fin de eliminar confusión. Así pues, la cita "una de las secuencias de número impar del Listado de Secuencias", , se refiere a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico en el Listado de Secuencias, que pueden distinguirse también por sus diferentes designaciones RXA, RXN, RXS, o RXC. La región codificante de cada una de estas secuencias se traduce en una secuencia de aminoácidos correspondiente, lo cual se indica también en el Listado de Secuencias, como una SEQ ID NO: de número par que sigue inmediatamente a la secuencia de ácido nucleico correspondiente. Por ejemplo, la región codificante para RXA00115 se indica en SEQ ID NO: 69, mientras que la secuencia de aminoácidos codificada por ella se indica como SEQ ID NO: 70. Las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la invención se identifican por las mismas designaciones RXA, RXN, RXS, o RXC que las moléculas de aminoácidos codificados por ellas, de tal modo que pueden correlacionarse fácilmente. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos designadas RXA00115, RXN00403, y RXS03158 son traducciones de las regiones codificantes de las secuencias de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico RXA00115, RXN00403, y RXS03158, respectivamente. La correspondencia entre las secuencias de nucleótidos y aminoácidos RXA, RXN, RXS, y RXC de la invención y sus SEQ ID NOs asignados se muestra en la Tabla 1.

Varios de los genes de la descripción son "genes de designación F". Un gen de designación F incluye aquellos genes indicados en la Tabla 1 que tienen una "F" delante de la designación RXA, RXN, RXS, o RXC. Por ejemplo, SEQ ID NO: 77, designado, como se indica en la Tabla 1, como "F RXA00254", es un gen de designación F.

Se enumeran también en la Tabla 1 los genes metZ (o metY) y metC (designados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos correspondiente codificadas por los genes metZ y metC se designan como SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Se describe también una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de una de las secuencias nucleotídicas de la invención (v.g., una secuencia de una SEQ ID NO: de número impar del Listado de Secuencias), o una porción de la misma. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una de las secuencias de nucleótidos de la invención es una que es suficientemente complementaria a una de las secuencias de nucleótidos representadas en el Listado de Secuencias (v.g., la secuencia de una SEQ ID NO: de número impar) de tal modo que la misma puede hibridarse a una de las secuencias de nucleótidos de la invención, formando con ello un dúplex estable.

En otra realización preferida adicional de la descripción, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, o 60%, con preferencia al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, o 70%, con más preferencia al menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, u 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o 90%, o 91%, 92%, 93%, 94%, y con más preferencia todavía al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o más homóloga a una SEQ ID NO: de número impar del Listado de Secuencias, o una porción de la misma. Se describen también los intervalos y valores de identidad intermedios a los intervalos arriba citados (v.g., 70 a 90% idénticas u 80-95% idénticas). Por ejemplo, deben considerarse incluidos los intervalos de valores de identidad que utilizan una combinación de cualquiera de los valores anteriores citados como límites superior y/o inferior. En una realización preferida adicional, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida, v.g., se hibrida en condiciones severas, a una de las secuencias de nucleótidos de la invención, o una porción de la misma.

Además, la molécula de ácido nucleico de la descripción puede comprender solamente una porción de la región codificante de la secuencia de una de las SEQ ID NOs de número impar del Listado de Secuencias, por ejemplo un fragmento que puede utilizarse como sonda o iniciador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de una proteína MP. Las secuencias de nucleótidos determinadas por la clonación de los genes MP de C. glutamicum permite la generación de sondas e iniciadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de homólogos MP en otros tipos de células y organismos, así como homólogos MP de otras especies de Corynebacteria o especies afines. La sonda/iniciador comprende por regla general un oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido comprende típicamente una región de secuencia nucleotídica que se hibrida en condiciones severas a al menos aproximadamente 12, con preferencia aproximadamente 25, de modo más preferible aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena de sentido de una de las secuencias nucleotídicas de la invención (v.g., una secuencia de una de las SEQ ID NOs de número impar del Listado de Secuencias), una secuencia antisentido de una de estas secuencias, o mutantes de la misma existentes naturalmente. Los iniciadores basados en una secuencia de nucleótidos de la invención pueden utilizarse en reacciones PCR para clonar homólogos de MP. Las sondas basadas en las secuencias de nucleótidos MP pueden utilizarse para detectar transcritos o secuencias genómicas codificantes de la misma proteína o proteínas homólogas. Preferiblemente, la sonda comprende además un grupo marcador unido a ella; v.g. el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Dichas sondas pueden utilizarse como parte de un kit de test de diagnóstico para identificar células que expresen erróneamente una proteína MP, por ejemplo por medida de un nivel de un ácido nucleico codificante de MP en una muestra de células de un individuo, v.g., por detección de niveles de mRNA MP o determinación de si un gen MP genómico ha sido mutado o delecionado.

En una realización, la molécula de ácido nucleico de la descripción codifica una proteína o porción de la misma que incluye una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos de la invención (v.g., una secuencia de una SEQ ID NO: de número par del Listado de Secuencias) de tal modo que la proteína o porción de la misma mantiene la capacidad para catalizar una reacción enzimática en un camino metabólico de aminoácido, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido, o trehalosa. Como se utiliza en esta memoria, la expresión "suficientemente homóloga" se refiere a proteínas o porciones de las mismas que tienen secuencias de aminoácidos que incluyen un número mínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes (v.g., un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar a un residuo de aminoácido en una secuencia de una de las SEQ ID NOs de número par del Listado de Secuencias), a una secuencia de aminoácidos de la invención de tal modo que la proteína o porción de la misma es capaz de catalizar una reacción enzimática en un camino metabólico de aminoácido, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido o trehalosa de C. glutamicum. Los miembros proteínicos de tales caminos metabólicos, como se han descrito arriba, funcionan para catalizar la biosíntesis o degradación de uno o más de: aminoácidos, vitaminas, cofactores, nutrientes farmacéuticos, nucleótidos, nucleósidos o trehalosa. Ejemplos de dichas actividades se describen también en esta memoria. Así, "la función de una proteína MP" contribuye al funcionamiento global de uno o más de tales caminos metabólicos y contribuye, directa o indirectamente, al rendimiento, la producción y/o la eficiencia de producción de uno o más productos químicos finos. Ejemplos de actividades de proteínas MP se presentan en la Tabla 1.

En otra realización de la descripción, la proteína es al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, o 60%, con preferencia al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, o 70%, con más preferencia al menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, u 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o 90%, o 91%, 92%, 93%, 94%, y con más preferencia todavía al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o más homóloga a una secuencia entera de aminoácidos de una SEQ ID NO: de número par del Listado de Secuencias.

Porciones de proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico MP de la descripción son con preferencia porciones biológicamente activas de una de las proteínas MP. Como se utiliza en esta memoria, el término "porción biológicamente activa de una proteína MP" tiene por objeto incluir una porción, v.g., un dominio/motivo, de una proteína MP que cataliza una reacción enzimática en uno o más caminos metabólicos de aminoácido, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido, o trehalosa de C. glutamicum, o tiene una actividad como la indicada en la Tabla 1. Para determinar si una proteína MP o una porción biológicamente activa de la misma pueden catalizar una reacción enzimática en un camino metabólico de aminoácido, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido, o trehalosa, puede realizarse un ensayo de actividad enzimática. Tales métodos de ensayo son bien conocidos por quienes poseen una experiencia ordinaria en la técnica, como se detalla en el Ejemplo 8 de la sección de ejemplos.

Fragmentos adicionales de ácido nucleico que codifican las porciones biológicamente activas de una proteína MP puede prepararse por aislamiento de una porción de una de las secuencias de aminoácidos de la descripción (v.g., una secuencia de una SEQ ID NO: de número par del Listado de Secuencias), expresión de la porción codificada de la proteína o péptido MP (v.g., por expresión recombinante in vitro) y evaluación de la actividad de la porción codificada de la proteína o péptido MP.

La descripción abarca adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de una de las secuencia de nucleótidos descritas en esta memoria (v.g., una secuencia de una SEQ ID NO: de número impar del Listado de Secuencias) (y porciones de la misma) debido a la degeneración del código genético y codifican por consiguiente la misma proteína MP que la codificada por las secuencias de nucleótidos de la invención. En otra realización, la molécula de ácido nucleico aislada tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada en el Listado de Secuencias (v.g., una SEQ ID NO: de número par). En otra realización adicional, la molécula de ácido nucleico codifica una proteína de C. glutamicum de longitud total que es sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos codificada por un marco de lectura abierto representado en una SEQ ID NO: de número impar del Listado de Secuencias.

En una realización, la descripción incluye secuencias de nucleótidos y aminoácidos que tienen un porcentaje de identidad con una secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la invención que es mayor que el de una secuencia de la técnica anterior (v.g., una secuencia de Genbank o la proteína codificada por una secuencia de este tipo) incluida en la Tabla 2). Por ejemplo, la descripción incluye una secuencia de nucleótidos que es mayor que y/o idéntica al menos en un 45% a la secuencia de nucleótidos designada RXA00657 SEQ ID NO: 5. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica podría calcular el umbral inferior de porcentaje de identidad para cualquier secuencia dada de la invención por examen de los registros de identidad porcentual calculados por GAP indicados en la Tabla 4 para cada uno de los tres aciertos principales para la secuencia dada, y por sustracción del porcentaje de identidad máximo calculado por GAP de 100%. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará también que están abarcadas asimismo secuencias de ácido nucleico y aminoácidos que tienen identidades porcentuales mayores que el umbral inferior así calculado (v.g. son al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, o 60%, con preferencia al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, o 70%, con más preferencia al menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, u 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o 90%, o 91%, 92%, 93%, 94%, y con más preferencia todavía al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o más idénticas).

Además de las secuencias de nucleótidos MP de C. glutamicum indicadas en el Listado de Secuencias como SEQ ID NOs de número impar, será apreciado por una persona con experiencia ordinaria en la técnica que pueden existir polimorfismos de secuencias de DNA que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas MP dentro de una población (v.g., la población de C. glutamicum). Dicho polimorfismo genético en el gen MP puede existir entre individuos dentro de una población debido a variación natural. Como se utilizan en esta memoria, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica una proteína MP, preferiblemente una proteína MP de C. glutamicum. Dichas variaciones naturales pueden dar típicamente como resultado 1-5% de varianza en la secuencia de nucleótidos del gen MP. Pueden utilizarse cualquiera y la totalidad de tales variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos en MP resultantes que son el resultado de variación natural y que no alteran la actividad funcional de las proteínas MP.

Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes naturales y homólogos distintos de C. glutamicum del DNA MP de C. glutamicum de la descripción pueden aislarse sobre la base de su homología con el ácido nucleico MP de C. glutamicum descrito en esta memoria utilizando DNA de C. glutamicum, o una porción del mismo, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación estándar en condiciones de hibridación severas. De acuerdo con ello, en otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la descripción tiene al menos 15 nucleótidos de longitud y se hibrida en condiciones severas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de una SEQ ID NO: de número impar del Listado de Secuencias. En otras realizaciones, el ácido nucleico tiene al menos una longitud de 30, 50, 100, 250 o más nucleótidos. Como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que el término "se hibrida en condiciones severas" describe condiciones para hibridación y lavado en las cuales secuencias de nucleótidos que son al menos 60% homólogas una a otra se mantienen típicamente hibridadas una a otra. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias de al menos aproximadamente 65%, de modo más preferible al menos aproximadamente 70%, y de modo aún más preferible al menos aproximadamente 75% o más homólogas una a otra se mantienen típicamente hibridadas unas a otras. Dichas condiciones severas son conocidas por una persona con experiencia ordinaria en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo no limitante preferido de condiciones de hibridación severas son hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1% SDS a 50-65ºC. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada descrita en esta memoria que se hibrida en condiciones severas a una secuencia de nucleótidos de la invención corresponde a una molécula de ácido nucleico existente naturalmente. Como se utiliza en esta memoria, una molécula de ácido nucleico "existente naturalmente" se refiere a una molécula de RNA o DNA que tiene una secuencia de nucleótidos que existe en la naturaleza (v.g., codifica una proteína natural). En una realización, el ácido nucleico codifica una proteína MP natural de C. glutamicum.

Además de variantes existentes naturalmente de la secuencia MP que pueden existir en la población, una persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios por mutación en una secuencia de nucleótidos de la invención, conduciendo de este modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína MP codificada, sin alterar la capacidad funcional de la proteína MP. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en una secuencia de nucleótidos de la invención. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado con respecto a la secuencia de tipo salvaje de una de las proteínas MP (v.g. una SEQ ID NO: de número par del Listado de Secuencias) sin alterar la actividad de dicha proteína MP, en tanto que un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad de la proteína MP. Otros residuos de aminoácidos, sin embargo (v.g. aquéllos que no están conservados o están solamente semiconservados en el dominio que tiene actividad MP) pueden no ser esenciales para la actividad y por consiguiente es probable que sean susceptibles de alteración sin alterar la actividad MP.

De acuerdo con ello, otro aspecto de la descripción se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas MP que contienen cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad MP. Tales proteínas MP difieren en secuencia de aminoácidos de una secuencia de una SEQ ID NO: de número par del Listado de Secuencias pero retienen al menos una de las actividades MP descritas en esta memoria. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 50% homóloga a una secuencia de aminoácidos de la invención y es capaz de catalizar una reacción enzimática en un camino metabólico de aminoácido, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido, o trehalosa, o tiene una o más actividades indicadas en la Tabla 1. Preferiblemente, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico es al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, o 60%, con preferencia al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, o 70%, con más preferencia al menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, u 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o 90%, o 91%, 92%, 93%, 94%, y con más preferencia todavía al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o más homóloga a una de las secuencias de aminoácidos descritas en esta memoria.

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos (v.g., una de las secuencias de aminoácidos de la invención y una forma mutante de la misma) o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (v.g. puede introducirse lagunas en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para alineación óptima con la otra proteína o el otro ácido nucleico). Los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes de los aminoácidos o nucleótidos se comparan luego. Cuando una posición en una secuencia (v.g., una de las secuencias de aminoácidos de la invención) está equipada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la otra secuencia (v.g., una forma mutante de la secuencia de aminoácidos), entonces las moléculas son homólogas a dicha posición (es decir, tal como se utiliza en esta memoria, "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por ambas secuencias (es decir, % homología = # de posiciones idénticas/ # total de posiciones x 100).

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína MP homóloga a una secuencia de proteínas de la descripción (v.g., una secuencia de una SEQ ID NO: de número par del Listado de Secuencias) puede crearse por introducción de una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en una secuencia nucleotídica de la invención de tal modo que se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse en una de las secuencias de nucleótidos de la invención por técnicas estándar, tales como mutagénesis orientada y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se realizan en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una "sustitución conservadora de aminoácido" es una en la cual el residuo de aminoácido está reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.g., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (v.g., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (v.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (v.g., alanina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (v.g., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.g., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así pues, un residuo de aminoácido no esencial predicho en una proteína MP se reemplaza preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, pueden introducirse mutaciones aleatorias a lo largo de la totalidad o una parte de una secuencia codificante de MP, por ejemplo por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden clasificarse respecto a una actividad MP descrita en esta memoria a fin de identificar mutantes que retienen la actividad MP. Después de la mutagénesis de la secuencia de nucleótidos de una de las SEQ ID NOs de número impar del Listado de Secuencias, la proteína codificada puede expresarse recombinantemente y se puede determinar la actividad de la proteína utilizando, por ejemplo, ensayos descritos en esta memoria (véase el Ejemplo 8 de la Sección de ejemplos).

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas MP arriba descritas, otro aspecto de la descripción se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido respecto a ellas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, v.g., complementaria a la cadena codificante de una molécula de DNA bicatenario o complementaria a una secuencia de mRNA. De acuerdo con ello, un ácido nucleico antisentido puede estar unido por enlaces hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificante de MP entera, o sólo a una porción de la misma. En una realización, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido respecto a una "región codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína MP. El término "región codificante" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos (v.g., la región codificante entera de SEQ ID NO: 1 (metZ) comprende los nucleótidos 363 a 1673). En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido respecto a una "región no codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica MP. El término "región no codificante" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante, que no se traducen en aminoácidos (es decir, a las que se hace referencia también como regiones no traducidas 5' y 3').

Dadas las secuencias de cadena codificante que codifican MP descritas en esta memoria (v.g., las secuencias indicadas como SEQ ID NOs de número impar en el Listado de Secuencias), pueden diseñarse de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificante entera de mRNA MP, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido sólo con respecto a una porción de la región codificante o no codificante de mRNA MP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción de mRNA MP. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos. Un ácido nucleico antisentido de la invención puede construirse utilizando síntesis química y reacciones enzimáticas de ligación utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (v.g., un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente utilizando nucleótidos existentes naturalmente o nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, pudiendo utilizarse v.g., derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-yodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosil queosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, and 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual un ácido nucleico ha sido subclonado en orientación antisentido (p. ej., el RNA transcrito a partir del ácido nucleico insertado tendrá orientación antisentido respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito con mayor detalle en la subsección siguiente).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la descripción se administran típicamente a una célula o se generan in situ de tal modo que las mismas se hibridan con o se fijan a mRNA celular y/o DNA genómico que codifica una proteína MP para inhibir de este modo la expresión de la proteína, v.g., por inhibición de la transcripción y/o traducción. La hibridación puede hacerse por complementariedad convencional de nucleótidos para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se fija a dúplex de DNA, por interacciones específicas en la hendidura mayor de la doble hélice. La molécula antisentido puede modificarse de tal modo que la misma se fije específicamente a un receptor o un antígeno expresado en la superficie de una célula seleccionada, v.g., por enlace de la molécula de ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo que está fijado a un receptor o antígeno de la superficie celular. La molécula de ácido nucleico antisentido puede suministrarse también a células que utilizan los vectores descritos en esta memoria. Para conseguir concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren constructos de vectores en los cuales la molécula de ácido nucleico antisentido está sometida al control de un promotor fuerte procariota, viral, o eucariota.

En otra realización adicional, la molécula de ácido nucleico antisentido de la descripción es una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con RNA complementario en los cuales, al contrario que las unidades \beta usuales, las cadenas corren paralelas una a otra (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender también un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) o un análogo quimérico RNA-DNA (Inoue et al., (1987) FEBS Lett. 215: 327-330).

En otra realización adicional, un ácido nucleico antisentido de la descripción es una ribozima. Las ribozimas son moléculas catalíticas de RNA con la actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un mRNA, con el cual tienen una región complementaria. Así, las ribozimas (v.g., ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334: 585-591)) pueden utilizarse para escindir catalíticamente transcritos de mRNA MP para inhibir de este modo la traducción del mRNA MP. Una ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico codificante de MP puede diseñarse sobre la base de la secuencia de nucleótidos de un DNA MP descrito en esta memoria (a saber, SEQ ID NO: 1 (metZ). Por ejemplo, puede construirse un derivado de un RNA IVS L-19 de Tetrahymena en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos a escindir en un mRNA codificante de MP. Véase, v.g., Cech et al. Patente U.S. No. 4.987.071 y Cech et al. Patente U.S. No. 5.116.742. Alternativamente, puede utilizarse mRNA MP para seleccionar un RNA catalítico que tenga una actividad específica de ribonucleasa de una agrupación de moléculas de RNA. Véase, v.g., Bartel, D. y Szostak, J.W. (1993) Science 261: 1411-1418.

Alternativamente, la expresión de los genes MP puede inhibirse por direccionamiento de secuencias de nucleótidos complementarios a la región reguladora de una secuencia de nucleótidos MP (v.g., un promotor MP y/o intensificadores) a fin de formar estructuras de triple hélice que impiden la transcripción de un gen MP en las células diana. Véase, en líneas generales, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad Sci. 660: 27-36; y Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12): 807-15.

Otro aspecto de la descripción se refiere a combinaciones de genes implicados en metabolismo de metionina y/o lisina y al uso de combinaciones de genes implicadas en el metabolismo de metionina y/o lisina en los métodos de la invención. Combinaciones preferidas son la combinación de metZ con metC, metB (codificante de cistationina-sintasa), metA (codificante de homoserina-O-acetiltransferasa), metE (codificante de metionina-sintasa), metH (codificante de metionina-sintasa), hom (codificante de homoserina-deshidrogenasa), asd (codificante de aspartatosemialdehído-deshidrogenasa), lysC/ask (codificante de aspartoquinasa) y rxa00657 (designado en esta memoria como SEQ ID NO: 5), dapA (gen codificante de dihidrodipicolinato- -sintasa), dapB (gen codificante de dihidrodipicolinato-reductasa), dapC (gen codificante de 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2-carboxilato-N-succiniltransferasa), dapD/argtD (gen codificante de acetilornitina-transaminasa), dapE (gen codificante de succinildiaminopimelato-desuccinilasa), dapF (gen codificante de diaminopimelato-epimerasa), lysA (gen codificante de diaminopimelato-descarboxilasa), ddh (gen codificante de diaminopimelato-deshidrogenasa), lysE (gene codificante del exportador de lisina), lysG (gen codificante del exportador regulador), hsk (gene codificante de homoserina quinasa) así como genes implicados en la reacción anaplerótica tales como ppc (gen codificante de fosfoenolpiruvato carboxilasa), ppcK (gen codificante de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa), pycA (gen codificante de piruvato carboxilasa), accD, accA, accB, accC (genes codificantes de las subunidades de acetil-CoA-carboxilasa), así como genes del camino pentosa-fosfato, genes gpdh que codifican glucosa-6 fosfato-deshidrogenasa, opcA, pgdh (gen codificante de 6-fosfogluconato-deshidrogenasa), ta (gen codificante de transaldolasa), tk (gen codificante de transcetolasa), pgl (gen codificante de 6-fosfoglucono-lactonasa), rlpe (gen codificante de ribulosa-fosfato-3-epimerasa) rpe (gen codificante de ribosa 5-fosfato epimerasa) o combinaciones de los genes arriba mencionados de los caminos pentosa-fosfato, u otros genes MP descritos en esta memoria.

Los genes pueden alterarse en su secuencia de nucleótidos y en la secuencia de aminoácidos correspondiente dando como resultado derivados de tal modo que su actividad se altera en condiciones fisiológicas, lo cual conduce a un aumento en la productividad y/o rendimiento de un aminoácido deseado tal como metionina o lisina. Una clase de alteraciones o derivados de este tipo es bien conocida para la secuencia de nucleótidos del gen ask que codifica aspartoquinasa. Estas alteraciones conducen a eliminación de la inhibición por realimentación por los aminoácidos lisina y treonina y subsiguientemente a superproducción de lisina. En una realización preferida, el gen metZ se utiliza en una cepa de Corynebacterium en combinación con ask, hom, metA y metH. En otra realización preferida, metZ se utiliza en una cepa de Corynebacterium en combinación con ask, hom, metA y metE. En una realización más preferida, las combinaciones de genes metZ se combinan con ask, hom, metA y metH, o metZ se combina con ask, hom, metA y metH en una cepa de Corynebacterium y fuentes de azufre tales como sulfatos, tiosulfatos, sulfitos y se utilizan asimismo en el medio de crecimiento fuentes de azufre más reducidas tales como H_{2}S y sulfuros y derivados. Pueden utilizarse también fuentes de azufre tales como metil-mercaptano, ácido metanosulfónico, tioglicolatos, tiocianatos, tiourea, aminoácidos que contienen azufre tales como cisteína y otros compuestos que contienen azufre. Otro aspecto de la descripción se refiere al uso de las combinaciones de genes arriba mencionadas en una cepa de Corynebacterium que es, antes o después de la introducción de los genes, mutagenizada por radiación o por productos químicos mutágenos bien conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica y seleccionados respecto a resistencia contra concentraciones elevadas del producto químico fino de interés, v.g., lisina o metionina o análogos del producto químico fino deseado tales como los análogos de metionina, etionina, metil-metionina, u otros. Las combinaciones de genes mencionadas anteriormente pueden expresarse en una cepa de Corynebacterium que tenga disgregaciones de genes particulares. Se prefieren diluciones de genes que codifican proteínas que favorecen el flujo de carbono a metabolitos no deseados. En los casos en que el producto químico fino deseado es metionina, la formación de lisina puede ser desfavorable. En tal caso la combinación de los genes arriba mencionados debería tener lugar en una cepa de Corynebacterium que lleve una disgregación génica del gen lysA (que codifica diaminopimelato-descarboxilasa) o el gen ddh que codifica la meso-diaminopimelato-deshidrogenasa que cataliza la conversión de tetrahidropicolinato en meso-diaminopimelato). En una realización preferida, los genes arriba mencionados están alterados todos ellos de tal manera que sus productos génicos no sufren inhibición por realimentación por los productos finales o metabolitos del camino biosintético que conduce al producto químico deseado. En el caso en que el producto químico fino deseado es metionina, las combinaciones génicas pueden expresarse en una cepa tratada previamente con agentes mutágenos o radiación y seleccionados para la resistencia arriba mencionada. Adicionalmente, la cepa debería dejarse crecer en un medio de cultivo que contenga una o más de las fuentes de azufre arriba mencionadas.

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B. Vectores de Expresión Recombinantes y Células Hospedadoras

Se describen también vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína MP (o una porción de la misma) o combinaciones de genes en las cuales al menos un gen codifica una proteína MP. Como se utiliza en esta memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido" que hace referencia a un bucle circular de DNA bicatenario al cual pueden estar ligados segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el cual segmentos de DNA adicionales pueden estar ligados al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen los mismos (v.g. vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (v.g., vectores de mamífero no episómicos) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora después de introducción en la célula hospedadora, y se replican por tanto en ella junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. A dichos vectores se hace referencia en esta memoria como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de DNA recombinante se encuentran a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente, dado que el plásmido es la forma de vector utilizada más comúnmente. Sin embargo, la invención tiene por objeto incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (v.g., retrovirus deficientes en replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que desempeñan funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes comprenden un ácido nucleico de la descripción en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células hospedadoras a utilizar para la expresión, que está enlazada operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, debe entenderse que "enlazado operativamente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la o las secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica (v.g. en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). El término "secuencia reguladora" debe entenderse que incluye promotores, sitios de fijación de represores, sitios de fijación de activadores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión (v.g., terminadores, señales de poliadenilación, u otros elementos de la estructura secundaria del mRNA). Secuencias reguladoras de este tipo se describen, por ejemplo, en Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Secuencias reguladoras incluyen aquéllas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia nucleotídica en muchos tipos de célula hospedadora y aquéllas que dirigen la expresión de la secuencia nucleotídica únicamente en ciertas células hospedadoras. Secuencias reguladoras preferidas son, por ejemplo, promotores tales como cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^{q}-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SPO2, \lambda-P_{R}- o \lambda P_{L}, que se utilizan preferiblemente en bacterias. Secuencias reguladoras adicionales son, por ejemplo, promotores de levaduras y hongos, tales como ADC1, MF\alpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, promotores de plantas tales como CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o promotores de ubiquitina o faseolina. Es también posible utilizar promotores artificiales. Será apreciado por una persona con experiencia ordinaria en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseado, etc. Los vectores de expresión pueden introducirse en células hospedadoras para producir de este modo proteínas o péptidos, con inclusión de proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describen en esta memoria (v.g., proteínas MP, formas mutantes de proteínas MP, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes pueden diseñarse para expresión de proteínas MP en células procariotas o eucariotas, por ejemplo, en células bacterianas tales como C. glutamicum, "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: más Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; and van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas y células de plantas multicelulares (véase Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.: 583-586) o células de mamífero. Células hospedadoras adecuadas se discuten adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras del promotor T7 y T7-polimerasa.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo en la mayoría de los casos con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o proteínas que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden cierto número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, usualmente al término amino de la proteína recombinante, pero también al término C, o se fusionan en el interior de regiones adecuadas en las proteínas. Tales vectores de fusión desempeñan típicamente tres propósitos: 1) aumentar la expresión de proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) contribuir a la purificación de la proteína recombinante por actuar como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítico en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante a fin de permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión subsiguientemente a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutation-S-transferasa (GST), proteína E de fijación de maltosa, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana. La secuencia codificante de la proteína MP puede clonarse en un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica una proteína de fusión que comprende, desde el término N al término C, GST-sitio de escisión de trombina-proteína X. La proteína de fusión puede purificarse por cromatografía de afinidad utilizando resina glutatión-agarosa. La proteína MP recombinante no fusionada a GST puede recuperarse por escisión de la proteína de fusión con trombina.

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles adecuados que no son de fusión incluyen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B 1, \lambdagt11, pBdCl, y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; y Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nueva York IBSN 0 444 904018). La expresión del gen diana por el vector pTrc está basada en la transcripción de RNA-polimerasa del hospedador a partir de un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión del gen diana por el vector pET 11d está basada en la transcripción de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediada por una RNA-polimerasa viral coexpresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por las cepas hospedadoras BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) de un profago \lambda residente que alberga un gen T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV5. Para transformación de otras variedades de bacterias, pueden seleccionarse vectores apropiados. Por ejemplo, se sabe que los plásmidos pIJ101, pIJ364, pIJ702 y pIJ361 son útiles en la transformación de Streptomyces, mientras que los plásmidos pUB110, pC194, o pBD214 son adecuados para transformación de especies de Bacillus. Varios plásmidos para uso en la transferencia de información genética a Corynebacterium incluyen pHM1519, pBL1, pSA77, o pAJ667 (Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nueva York IBSN 0 444 904018).

Una estrategia para maximizar la expresión de proteínas recombinantes consiste en expresar la proteína en una bacteria hospedadora que tenga una capacidad deteriorada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia consiste en alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión de tal modo que los codones individuales para cada aminoácido sean los utilizados preferentemente en la bacteria seleccionada para expresión, tal como C. glutamicum (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118. Dicha alteración de la secuencia de ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo por técnicas estándar de síntesis de DNA.

En otra realización de la descripción, el vector de expresión de la proteína MP es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embd J. 6: 229-234), , 2 \mu, pAG-1, Yep6, Yep13, pEMBLYe23, pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y métodos para la construcción de vectores apropiados para uso en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen los detallados en: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) ``Genes transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, and Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nueva York (IBSN 0 444 904018).

Alternativamente, las proteínas MP pueden expresarse en células de insecto, utilizando vectores de expresión de baculovirus. Vectores de baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (v.g., células Sf9) incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170: 31-39).

En otra realización de la descripción, las proteínas MP pueden expresarse en células de plantas unicelulares (tales como algas) o en células vegetales procedentes de plantas superiores (v.g., las espermatofitas, tales como plantas de cosecha). Ejemplos de vectores de expresión en plantas incluyen los detallados en: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. y Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721, e incluyen pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, y pDH51 (Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nueva York IBSN 0 444 904018).

En otra realización adicional de la descripción, se expresa un ácido nucleico en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329-840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) Embo J. 6: 187-195). Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión son proporcionadas a menudo por elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores utilizados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y el Virus 40 de los Simios. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como para células eucariotas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,
1989.

El vector de expresión recombinante de mamífero puede ser capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (v.g. se utilizan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Elementos reguladores de tejidos específicos se conocen en la técnica. Ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejidos adecuados incluyen el promotor albúmina (específico de hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos de linfoides (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), promotores específicos de neuronas (v.g., el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230: 912-916), y promotores específicos de la glándula mamaria (v.g., promotor de lactosuero; Patente U.S. No. 4,873,316 y Publicación de Solicitud Europea No. 264,166). Están abarcados también promotores regulados experimentalmente, por ejemplo los promotores hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249: 374-379) y el promotor de \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).

La descripción proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de DNA descrita en esta memoria, clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de DNA está enlazada operativamente a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión (por transcripción de la molécula de DNA) de una molécula de RNA que es antisentido respecto al mRNA MP. Pueden seleccionarse secuencias reguladoras enlazadas operativamente a un ácido nucleico clonado en orientación antisentido, que dirigen la expresión continua de la molécula de RNA antisentido en una diversidad de tipos de células, por ejemplo promotores y/o intensificadores virales, o pueden seleccionarse secuencias reguladoras que dirigen la expresión constitutiva, específica de tejido o específica de tipo de célula del RNA antisentido. El vector de expresión antisentido puede encontrarse en la forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en el cual se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia, cuya actividad puede venir determinada por el tipo de célula en la que se introduce el vector. Para una exposición de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido véase Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis; Reviews-Trends in Genetics, vol. 1 (1) 1986.

Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedadoras en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se utilizan intercambiablemente en esta memoria. Debe entenderse que dichos términos se refieren no sólo a la célula individual particular, sino también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Dado que pueden existir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula progenitora, pero se incluyen todavía dentro del alcance del término tal como se utiliza en esta memoria.

Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una proteína MP puede expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum. Otras células hospedadoras adecuadas son conocidas por quieres poseen una experiencia ordinaria en la técnica. Microorganismos afines a Corynebacterium glutamicum que pueden ser utilizados convenientemente como células hospedadoras para las moléculas de ácido nucleico y proteínas de la descripción se presentan en la Tabla 3.

Puede introducirse DNA vector en células procariotas o eucariotas por técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se utilizan en esta memoria, debe entenderse que los términos "transformación" y "transfección", "conjugación" y "transducción" hacen referencia a una diversidad de métodos acreditados en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (v.g., DNA o RNA lineal (v.g., un vector linealizado o un constructo génico solo sin un vector) o ácido nucleico en la forma de un vector (v.g., un plásmido, fago, fásmido, fagémido, transposón u otro DNA) en una célula hospedadora, con inclusión de co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia mediada por productos químicos, o electroporación. Métodos adecuados para transformación o transfección de células hospedadoras pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de células de mamífero, es sabido que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, únicamente una pequeña fracción de células puede integrar el DNA extraño en su genoma. Con objeto de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (v.g. resistencia a antibióticos) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede introducirse en una célula hospedadora en el mismo vector que el que codifica una proteína MP o puede introducirse en un vector separado. Las células transfectadas establemente con el ácido nucleico introducido pueden identificarse por selección de fármacos (v.g. las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirá, en tanto que las otras células
morirán).

Para crear un microorganismo recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen MP en la cual se ha introducido una deleción, adición o sustitución a fin de alterar con ello, v.g., causar una disgregación funcional en el gen MP. Preferiblemente, este gen MP es un gen MP de Corynebacterium glutamicum, pero puede ser un homólogo de una bacteria afín o incluso de una fuente de mamífero, levadura o insecto. En una realización preferida, el vector está diseñado de tal manera que, después de la recombinación homóloga, el gen MP endógeno queda funcionalmente destruido (es decir, ya no codifica una proteína funcional; a lo que se hace referencia también como un vector "de bloqueo". Alternativamente, el vector puede diseñarse de tal modo que, después de la recombinación homóloga, el gen MP endógeno se muta o altera de cualquier otro modo pero codifica todavía proteína funcional (v.g., la región reguladora de aguas arriba puede alterarse, alterando con ello la expresión de la proteína MP endógena). En el vector de recombinación homólogo, la porción alterada del gen MP está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por ácido nucleico adicional del gen MP a fin de permitir que se produzca recombinación homóloga entre el gen MP exógeno transportado por el vector y un gen MP endógeno en un microorganismo. El ácido nucleico MP flanqueante adicional tiene longitud suficiente para recombinación homóloga exitosa con el gen endógeno. Típicamente, se incluyen en el vector varios kilobases de DNA flanqueante (en ambos extremos 5' y 3') (véase v.g., Thomas, K.R., y Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503 para una descripción de vectores de recombinación homóloga). El vector se introduce en un microorganismo (v.g., por electroporación), y se seleccionan las células en las que se ha recombinado homólogamente el gen MP introducido con el gen MP endógeno, utilizando métodos conocidos en la técnica.

Pueden producirse microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten una expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen MP en un vector que lo pone bajo control del operón lac permite la expresión del gen MP únicamente en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en la técnica.

En otra realización de la descripción, un gen MP endógeno en una célula hospedadora sufre disgregación (v.g., por recombinación homóloga u otros medios genéticos conocidos en la técnica), de tal modo que no tiene lugar la expresión de su productos proteínico. En otra realización, un gen MP endógeno o introducido en una célula hospedadora se ha alterado por una o más mutaciones, deleciones, o inversiones puntuales, pero codifica todavía una proteína MP funcional. Una o más de las regiones reguladoras (v.g., un promotor, represor, o inductor) de un gen MP en un microorganismo pueden alterarse (v.g., por deleción, truncación, inversión, o mutación puntual) de tal modo que se modula la expresión del gen MP. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará que las células hospedadoras que contienen más de uno de los genes MP descritos y modificaciones de las proteínas pueden producirse fácilmente utilizando los métodos descritos en esta memoria.

Una célula hospedadora descrita en esta memoria, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede utilizarse para producir (es decir expresar) una proteína MP. De acuerdo con ello, se proporcionan también métodos para producción de proteínas MP utilizando las células hospedadoras. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la invención (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una proteína MP, o en cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica una proteína MP de tipo salvaje o alterada) en un medio adecuado hasta que se produce la proteína MP. En otra realización, el método comprende adicionalmente el aislamiento de proteínas MP del medio o de la célula hospedadora.

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C. Proteínas MP Aisladas

Otro aspecto de la descripción proporciona proteínas MP aisladas y porciones biológicamente activas de las mismas. Una proteína "aislada" o "purificada" o porción biológicamente activa de la misma está sustancialmente exenta de material celular cuando se produce por técnicas de DNA recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión lingüística "sustancialmente exento de material celular" incluye preparaciones de proteína MP en las cuales la proteína está separada de los componentes celulares de las células en las cuales se produce natural o recombinantemente. En una realización, la expresión lingüística "sustancialmente exento de material celular" incluye preparaciones de proteína MP que tienen menos de aproximadamente 30% (referido a peso seco) de proteína distinta de MP (a la que se hace referencia también en esta memoria como "proteína contaminante"), de modo más preferible menos de aproximadamente 20% de proteína distinta de MP, de modo todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de proteína distinta de MP, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de proteína distinta de MP. Cuando la proteína MP o porción biológicamente activa de la misma se produce recombinantemente, la misma está también con preferencia sustancialmente exenta del medio de cultivo, es decir, que el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10%, y muy preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína. El término "sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de proteína MP en las cuales la proteína está separada de los precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, el término "sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de proteína MP que tiene menos de aproximadamente 30% (referido a peso seco) de precursores químicos o productos químicos distintos de MP, de modo más preferible menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o productos químicos distintos de MP, de modo todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos distintos de MP, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos distintos de MP. En realizaciones preferidas, las proteínas aisladas o porciones biológicamente activas de las mismas carecen de proteínas contaminantes del mismo organismo del que se deriva la proteína MP. Típicamente, tales proteínas se producen por expresión recombinante de, por ejemplo, una proteína MP de C. glutamicum en un microorganismo tal como C. glutamicum.

Una proteína MP aislada o una porción de la misma puede catalizar una reacción enzimática en un camino metabólico de aminoácido, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido, o trehalosa, o tiene una o más de las actividades indicadas en la Tabla 1. En realizaciones preferidas de la descripción, la proteína o porción de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos de una SEQ ID NO: de número par del Listado de Secuencias, de tal modo que la proteína o porción de la misma mantiene la capacidad para catalizar una reacción enzimática en un camino metabólico de aminoácido, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido, o trehalosa. La porción de la proteína es preferiblemente una porción biológicamente activa como se describe en esta memoria. Otras proteínas MP pueden tener una secuencia de aminoácidos indicada como una SEQ ID NO: de número par del Listado de Secuencias, o una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida, v.g., se hibrida en condiciones severas, a una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: de número impar del Listado de Secuencias. Dicha proteína MP puede tener una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, o 60%, con preferencia al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, o 70%, con más preferencia al menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, u 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o 90%, o 91%, 92%, 93%, 94%, y con más preferencia todavía al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o más homóloga a una de las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria, o una porción de la misma. Los intervalos y valores de identidad intermedios a los valores arriba indicados (v.g., 70-90% idénticos u 80-95% idénticos) son también útiles. Por ejemplo, deben considerarse incluidos intervalos de valores de identidad que utilicen una combinación de cualquiera de los valores anteriores citados como límites superior y/o inferior. Las proteínas MP preferidas de la presente invención poseen también preferiblemente al menos una de las actividades MP descritas en esta memoria. Por ejemplo, una proteína MP preferida incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida, v.g., se hibrida en condiciones severas, a una secuencia de nucleótidos de la invención, y que puede catalizar una reacción enzimática en un camino metabólico de aminoácido, vitamina, cofactor, nutriente farmacéutico, nucleótido, nucleósido, o trehalosa, o que tiene una o más de las actividades indicadas en la Tabla 1.

Una proteína MP útil es sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos de una SEQ ID NO: de número par del Listado de Secuencias y retiene la actividad funcional de la proteína de una de las secuencias de aminoácidos, pero difiere en secuencia de aminoácidos debido a variación natural o mutagénesis, como se describe en detalle en la subsección I anterior. Dicha proteína MP es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, o 60%, con preferencia al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, o 70%, con más preferencia al menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, u 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o 90%, o 91%, 92%, 93%, 94%, y con más preferencia todavía al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,7% o más, homóloga a una secuencia entera de aminoácidos y que tiene al menos una de las actividades de MP descritas en esta memoria. Los intervalos y valores de identidad intermedios a los valores citados anteriormente (v.g., 70-90% idénticos u 80-95% idénticos) son también útiles. Por ejemplo, deben considerarse incluidos intervalos de valores de identidad que utilicen una combinación de cualquiera de los valores anteriores citados como límites superior y/o inferior.

Porciones biológicamente activas de una proteína MP incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una proteína MP, v.g., una secuencia de aminoácidos de una SEQ ID NO: de número par del Listado de Secuencias o la secuencia de aminoácidos de una proteína homóloga a una proteína MP, que incluyen menos aminoácidos que una proteína MP de longitud total o la proteína de longitud total que es homóloga a una proteína MP, y exhiben al menos una actividad de una proteína MP. Por regla general, las porciones biológicamente activas (péptidos, v.g. péptidos que tienen, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud) comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de una proteína MP. Además, otras porciones biológicamente activas, en las cuales otras regiones de la proteína están delecionadas, pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse respecto a una o más de las actividades descritas en esta memoria. Preferiblemente, las porciones biológicamente activas de una proteína MP incluyen uno o más dominios/motivos seleccionados o producciones de los mismos que tienen actividad biológica.

Las proteínas MP se producen preferiblemente por técnicas de DNA recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se somete a clonación en un vector de expresión (como se ha descrito arriba), se introduce el vector de expresión en una célula hospedadora (como se ha descrito arriba) y la proteína MP se expresa en la célula hospedadora. La proteína MP puede aislarse luego de las células por un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas. Como alternativa a la proteína recombinante, una proteína, polipéptido o péptido MP puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos. Además, la proteína MP nativa puede aislarse de las células (v.g. células endoteliales), utilizando por ejemplo un anticuerpo anti-MP, que puede producirse por técnicas estándar utilizando una proteína MP de esta descripción o fragmento de la misma.

La descripción proporciona también proteínas MP quiméricas o de fusión. Como se utiliza en esta memoria, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" MP comprende un polipéptido MP enlazado operativamente a un polipéptido distinto de MP. Un "polipéptido MP" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a MP, mientras que un "polipéptido distinto de MP" se refiere a un polipéptido que tiene un secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la proteína MP, v.g., una proteína que es diferente de la proteína MP y que se deriva del mismo organismo o de un organismo diferente. Dentro de la proteína de fusión, el término "enlazado operativamente" tiene por objeto indicar que el polipéptido MP y el polipéptido distinto de MP están fusionados en marco uno a otro. El polipéptido distinto de MP puede estar fusionado al término N o al término C del polipéptido MP. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-MP en la cual las secuencias MP están fusionadas al término C de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de proteínas MP recombinantes. En otra realización, la proteína de fusión es una proteína MP que contiene una secuencia señal heteróloga en su término N. En ciertas células hospedadoras (v.g., células hospedadoras de mamífero), la expresión y/o secreción de una proteína MP puede incrementarse mediante el uso de una secuencia señal heteróloga.

Preferiblemente, una proteína MP quimérica o de fusión de la descripción se produce por técnicas estándar de DNA recombinante. Por ejemplo, fragmentos de DNA que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan unos a otros en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo por empleo de términos de extremos romos o de extremos cohesivos para ligación, digestión con enzimas de restricción a fin de proporcionar términos apropiados, rellenado de extremos cohesivos en caso apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión indeseable, y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automáticos de DNA. Alternativamente, puede llevarse a cabo la amplificación por PCR de fragmentos génicos utilizando iniciadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden reasociarse y reamplificarse subsiguientemente para generar una secuencia de gen quimérica (véase, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", editores Ausubel et al., John Wiley % Sons: 1992). Además, están disponibles comercialmente muchos vectores de expresión que codifican ya un resto de fusión (v.g., un polipéptido GST). Un ácido nucleico codificante de MP puede clonarse en un vector de expresión de este tipo de tal modo que el resto de fusión se enlace en marco a la proteína MP.

Pueden generarse homólogos de la proteína MP por mutagénesis, v.g. mutación puntual discreta o truncación de la proteína MP. Como se utiliza en esta memoria, el término "homólogo" se refiere a una forma variante de la proteína MP que actúa como agonista o antagonista de la actividad de la proteína MP. Un agonista de la proteína MP puede retener sustancialmente la misma, o un subconjunto, de las actividades biológicas de la proteína MP. Un antagonista de la proteína MP puede inhibir una o más de las actividades de la forma existente naturalmente de la proteína MP, por ejemplo, por fijación competitiva a un miembro situado aguas abajo o aguas arriba de la cascada MP que incluye la proteína MP. Por tanto, la proteína MP de C. glutamicum y homólogos de la misma de la presente descripción pueden modular la actividad de uno o más caminos metabólicos en los cuales las proteínas MP juegan un papel en este microorganismo.

En una realización alternativa de la descripción, pueden identificarse homólogos de la proteína MP por selección de bibliotecas combinatorias de mutantes, v.g., mutantes de truncación, de la proteína MP para actividad agonista o antagonista de la proteína MP. Una biblioteca diversificada de variantes MP puede generarse por mutagénesis combinatoria al nivel de los ácidos nucleicos, y está codificada por una biblioteca de genes diversificada. Una biblioteca diversificada de variantes MP puede producirse mediante, por ejemplo, ligación enzimática de una mixtura de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de tal modo que el conjunto degenerado de secuencias MP potenciales puede expresarse como polipéptidos individuales, o alternativamente, como una serie de proteínas de fusión mayores (v.g. para presentación de fago) que contienen la serie de secuencias MP en ellas. Hay una diversidad de métodos que pueden ser utilizados para producir bibliotecas de homólogos potenciales de MP a partir de una secuencia oligonucleotídica degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede realizarse en un sintetizador automático de DNA, y el gen sintético puede ligarse luego a un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite la provisión, en una sola mixtura, de la totalidad de las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias MP potenciales. Métodos para síntesis de oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, v.g. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.

Adicionalmente, pueden utilizarse bibliotecas de fragmentos de la proteína MP de codificación (sic) para generar una población diversificada de fragmentos MP para cribado y selección subsiguiente de homólogos de una proteína MP. Una biblioteca de fragmentos de secuencia codificante puede generarse por tratamiento de un fragmento PCR bicatenario de una secuencia codificante MP con una nucleasa en condiciones en las cuales se produce mella sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalización del DNA bicatenario, renaturalización del DNA para formar DNA bicatenario que puede incluir pares sentido/antisentido de productos mellados diferentes, retirada de porciones monocatenarias de dúplex reformados por tratamiento con nucleasa S1, y ligación de la biblioteca de fragmentos resultante a un vector de expresión. Por este método, puede derivarse una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales, C-terminales e internos de diversos tamaños de la proteína MP.

Se conocen en la técnica varios métodos para seleccionar productos génicos de bibliotecas combinatorias producidas por mutaciones puntuales o truncación, y para seleccionar bibliotecas de cDNA en relación con productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Dichos métodos son adaptables para selección rápida de las bibliotecas génicas generadas por la mutagénesis combinatoria de homólogos de MP. Los métodos utilizados más ampliamente, que son susceptibles de análisis de alta capacidad, para selección de bibliotecas génicas grandes incluyen típicamente clonación de la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, transformación de células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante, y expresión de los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis recurrente de conjunto (REM), una nueva técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede utilizarse en combinación con los ensayos de selección para identificar homólogos de MP (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).

Pueden aprovecharse ensayos basados en células para analizar una biblioteca de MP diversificada, utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

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D. Usos y Métodos de la Invención

Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteínas, proteínas de fusión, iniciadores, vectores, y células hospedadoras descritas en esta memoria pueden utilizarse en uno o más de los métodos siguientes: identificación de C. glutamicum y organismos afines; mapeado de genomas de organismos relacionados con C. glutamicum; identificación y localización de secuencias de interés de C. glutamicum; estudios de evolución; determinación de regiones de proteínas MP requeridas para función; modulación de una actividad de proteína MP; modulación de la actividad de un camino MP; y modulación de la producción celular de un compuesto deseado, tal como un producto químico fino.

La molécula de ácido nucleico MP de la invención tiene una diversidad de usos. En primer lugar, la misma puede utilizarse para identificar un organismo como perteneciente a Corynebacterium glutamicum u otro organismo de la misma familia. Aquéllas pueden utilizarse también para identificar la presencia de C. glutamicum u otro organismo de la misma familia en una población mixta de microorganismos. La invención proporciona la secuencia de ácido nucleico de un gen de C. glutamicum; por sondeo del DNA genómico extraído de un cultivo de una población singular o mixta de microorganismos en condiciones severas con una sonda que abarca una región de un gen de C. glutamicum que es exclusiva de este organismo, puede averiguarse si está presente este organismo. Aunque Corynebacterium glutamicum no es en sí mismo patógeno para los humanos, está emparentado con especies que son patógenos humanos, tales como Corynebacterium diphtheriae. Corynebacterium diphtheriae es el agente causal de la difteria, una infección aguda y febril de desarrollo rápido que implica patología tanto local como sistémica. En esta enfermedad, se desarrolla una lesión local en el tracto respiratorio superior que implica lesión necrótica de las células epiteliales; los bacilos secretan toxina que se disemina por toda la lesión hasta tejidos susceptibles distales del cuerpo. Se producen cambios degradantes por la inhibición de la síntesis de proteínas en estos tejidos, que incluyen corazón, músculo, nervios periféricos, cápsulas suprarrenales, riñones, hígado y bazo, dando como resultado la patología sistémica de la enfermedad. La difteria sigue teniendo alta incidencia en muchas partes del mundo, que incluyen África, Asia, Europa Oriental y los estados independientes de la antigua Unión Soviética. Una epidemia en curso de difteria en las dos últimas regiones ha dado como resultado al menos 5000 muertes desde 1990.

En una realización, la descripción proporciona un método de identificación de la presencia o actividad de Corynebacterium diphtheriae en un individuo. Este método incluye detección de una o más de las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos indicadas como SEQ ID NOs de número impar o de número par, respectivamente, en el Listado de Secuencias en un individuo, detectando de este modo la presencia o actividad de Corynebacterium diphtheriae en el individuo. C. glutamicum y C. diphtheriae son bacterias afines, y muchas de las moléculas de ácido nucleico y proteínas en C. glutamicum son homólogas a proteínas de ácido nucleico y proteínas de C. diphtheriae, por lo que pueden utilizarse para detectar C. diphtheriae en un individuo.

Las moléculas de ácido nucleico y proteína de la invención pueden servir también como marcadores para regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no sólo en el mapeado del genoma, sino también para estudios funcionales de proteínas de C. glutamicum. Por ejemplo, para identificar la región del genoma a la que se fija una proteína de fijación de DNA particular de C. glutamicum, podía digerirse el genoma de C. glutamicum e incubarse los fragmentos con la proteína de fijación de DNA. Aquellos que fijan la proteína pueden sondarse adicionalmente con la molécula de ácido nucleico de la invención, preferiblemente con marcadores fácilmente detectables; la fijación de una molécula de ácido nucleico de este tipo al fragmento del genoma permite la localización del fragmento en el mapa genómico de C. glutamicum, y, cuando se realiza múltiples veces con enzimas diferentes, facilita una determinación rápida de la secuencia de ácido nucleico a la que se fija la proteína. Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser suficientemente homólogas a las secuencias de especies afines de tal modo que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en bacterias afines, tales como Brevibacterium lactofermentum.

La molécula de ácido nucleico MP de la invención es útil también para estudios evolutivos y estructurales de proteínas. Los procesos metabólicos en los cuales participa la molécula de la invención son utilizados por una gran diversidad de células procariotas y eucariotas; por comparación de las secuencias de las moléculas de ácido de la presente invención con aquéllas que codifican enzimas similares de otros organismos, puede evaluarse la interrelación evolutiva de los organismos. Análogamente, una comparación de este tipo permite una evaluación de cuáles son las regiones de la secuencia que se conservan y cuáles no, lo que puede ayudar a la determinación de aquellas regiones de la proteína que son esencialmente para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es valioso para estudios de ingeniería de proteínas y puede proporcionar una indicación de lo que puede tolerar la proteína en términos de mutagénesis sin perder la función.

La manipulación de la molécula de ácido nucleico MP de la invención puede dar como resultado la producción de una proteína MP que tenga diferencias funcionales respecto a las proteínas MP de tipo salvaje. Esta proteína puede mejorarse en eficiencia o actividad, puede estar presente en mayores números en la célula de lo que es usual, o puede verse reducida en eficiencia o actividad.

La descripción proporciona también métodos para la selección de moléculas que modulan la actividad de una proteína MP, sea por interacción con la proteína propiamente dicha o un sustrato o pareja de fijación de la proteína MP, o por modulación de la transcripción o traducción de una molécula de ácido nucleico MP. En tales métodos, un microorganismo que expresa una proteína MP de la invención se pone en contacto con uno o más compuestos de test, y se evalúa el efecto de cada compuesto de test sobre la actividad o el nivel de expresión de la proteína MP.

Cuando el producto químico fino que se desea aislar a partir de un cultivo fermentativo en gran escala de C. glutamicum es un aminoácido, la modulación de la actividad o eficiencia de actividad de una proteína descrita en esta memoria por mecanismos genéticos recombinantes puede impactar directamente en la producción de uno de estos aminoácidos. Por ejemplo, en el caso de una enzima en un camino biosintético para un aminoácido deseado, la mejora en eficiencia o actividad de la enzima (con inclusión de la presencia de copias múltiples del gen), conduciría a una producción o eficiencia de producción incrementada del aminoácido deseado. En el caso de una enzima en un camino biosintético para un aminoácido cuya síntesis se encuentra en competición con la síntesis de un aminoácido deseado, cualquier disminución en la eficiencia o actividad de esta enzima (con inclusión de la deleción del gen) debería dar como resultado un aumento en la producción o eficiencia de producción del aminoácido deseado, debido a la competencia disminuida por compuestos intermedios y/o energía.

En el caso de una enzima en un camino de degradación para un aminoácido deseado, cualquier disminución en eficiencia o actividad de la enzima debería dar como resultado un mayor rendimiento o eficiencia de producción del producto deseado debido a una disminución en su degradación. Finalmente, la mutagénesis de una enzima implicada en la biosíntesis de un aminoácido deseado de tal modo que esta enzima ya no sea capaz de inhibición por retroalimentación debería dar como resultado rendimientos o eficiencia de producción incrementados del aminoácido deseado. Lo mismo sería aplicable a las enzimas biosintéticas y degradantes implicadas en el metabolismo de vitaminas, cofactores, nutrientes farmacéuticos, nucleótidos, nucleósidos y trehalosa.

Análogamente, cuando dicho producto químico deseado no es uno de los compuestos mencionados anteriormente, la modulación de la actividad de una de las proteínas descritas en esta memoria puede impactar todavía en el rendimiento y/o la eficiencia de producción del compuesto a partir de un cultivo en gran escala de C. glutamicum. Los caminos metabólicos de cualquier organismo están estrechamente interconectados; el compuesto intermedio utilizado por un camino es suministrado a menudo por un camino diferente. La expresión y función enzimáticas pueden regularse sobre la base de los niveles celulares de un compuesto a partir de un proceso metabólico diferente, y los niveles celulares de las moléculas necesarias para el crecimiento básico, tales como aminoácidos y nucleótidos, pueden afectar críticamente a la viabilidad del microorganismo en cultivo en menor escala. Así pues, la modulación de una enzima de la biosíntesis de aminoácidos, por ejemplo, de tal modo que ya no sea sensible a la inhibición por retroalimentación o tal que ha mejorado en eficiencia o reposición puede dar como resultado niveles celulares incrementados de uno o más aminoácidos. A su vez, esta agrupación incrementada de aminoácidos proporciona no sólo un suministro incrementado de las moléculas necesarias para la síntesis de las proteínas, sino también de moléculas que se utilizan como compuestos intermedios y precursores en numerosos otros caminos biosintéticos. Si un aminoácido particular ha sido limitante en la célula, su producción incrementada podría aumentar la capacidad de la célula para realizar numerosas otras reacciones metabólicas, y para permitir que la célula produzca más eficientemente proteínas de todas clases, aumentando posiblemente la tasa de rendimiento global o capacidad de supervivencia de la célula en cultivo a gran escala. La viabilidad incrementada mejora el número de células capaces de producir el producto químico fino deseado en un cultivo fermentativo, aumentando con ello el rendimiento de este compuesto. Procesos similares son posibles por la modulación de actividad de un enzima degradante de la invención de tal modo que la enzima ya no cataliza, o cataliza menos eficientemente, la degradación de un compuesto celular que es importante para la biosíntesis de un compuesto deseado, o que permitirá que la célula crezca y se reproduzca más eficientemente en cultivo en gran escala. Debe resaltarse que la optimización de la actividad degradante o la disminución de la actividad biosintética de ciertas moléculas de la invención pueden tener también un efecto beneficioso sobre la producción de ciertos productos químicos finos a partir de C. glutamicum. Por ejemplo, por disminución de la eficiencia de la actividad de una enzima biosintética en un camino que compite con el camino biosintético del compuesto deseado para uno o más compuestos intermedios, podría estar disponible más cantidad de dichos compuestos intermedios para conversión en el producto deseado. Una situación similar puede requerir la mejora de la capacidad degradante o eficiencia de una o más proteínas de la invención.

Esta lista arriba mencionada de estrategias de mutagénesis para que las proteínas MP den como resultado rendimientos incrementados de un compuesto deseado no debe entenderse como limitante; variaciones en estas estrategias de mutagénesis serán fácilmente evidentes para una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Por estos mecanismos, las moléculas de ácido nucleico y proteínas de la descripción pueden utilizarse para generar C. glutamicum o cepas afines de bacterias que expresan moléculas de ácido nucleico y proteínas MP mutadas de tal modo que se mejore el rendimiento, la producción y/o la eficiencia de producción de un compuesto deseado. Este compuesto deseado puede ser cualquier producto natural de C. glutamicum, que incluye los productos finales de caminos de biosíntesis y compuestos intermedios de caminos metabólicos existentes naturalmente, así como moléculas que no existen naturalmente en el metabolismo de C. glutamicum, pero que son producidas por una cepa de C. glutamicum. Compuestos preferidos a producir por cepas de Corynebacterium glutamicum son los aminoácidos L-lisina y L-metionina.

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E) Realizaciones particularmente útiles

Entre las moléculas MP descritas en esta memoria tres de ellas se destacan como particularmente útiles. La primera es un gen que fue identificado a partir del genoma de Corynebacterium glutamicum como un gen codificante de una proteína hipotética reguladora de la transcripción. Este gen se describe como RXA00657. La secuencia de nucleótidos de RXA00657 corresponde a SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos de RXA00657 corresponde a SEQ ID NO: 6. Se encontró que cuando el gen RXA00657, así como secuencias reguladoras situadas aguas arriba y aguas abajo descritas en los ejemplos, se clonaba en un vector capaz de replicación en Corynebacterium glutamicum y se transformaba y expresaba en una cepa productora de lisina tal como ATCC13286, esta cepa producía más lisina comparada con la cepa transformada con el mismo plásmido que carecía del fragmento nucleotídico RXA00657 mencionado anteriormente. Además de la observación de que el título de lisina aumentaba en la cepa mencionada, la selectividad determinada por la cantidad molar de lisina producida en comparación con la cantidad molar de sacarosa consumida aumentaba también (véase el Ejemplo 14). La sobreexpresión de RXA00657 en combinación con la sobreexpresión de otros genes cualesquiera que estaban implicados directamente en el camino específico de la lisina tales como lysC, dapA, dapB, dapC, dapD, dapF, ddh, lysE, lysG, y lysR da como resultado un aumento en la producción de lisina comparada con RXA00657 solo.

La segunda es el gen metC (SEQ ID NO: 3), que codifica la cistationina-b-liasa del camino de biosíntesis de metionina de C. glutamicum. El producto de traducción del gen (SEQ ID NO: 4) no exhibía homología significativa alguna con el del gen metC de otros organismos. La introducción del plásmido que contenía el gen metC en C. glutamicum daba como resultado un aumento de 5 veces en la actividad de cistationina-\beta-liasa. El producto proteínico, designado ahora MetC (correspondiente a SEQ ID NO: 4), que codifica un producto proteínico de 35.574 Daltons y está constituido por 325 aminoácidos, es idéntico al gen aecD previamente consignado (Rossol, I. y Puhler, A. (1992) J. Bacteriology 174, 2968-2977) excepto por la existencia de dos aminoácidos diferentes. Al igual que el gen aecD, cuando está presente en copias múltiples, el gen metC confería resistencia a S-(\beta-aminoetil)-cisteína, que es un análogo de lisina tóxico. Sin embargo, evidencias genéticas y bioquímicas sugieren que la actividad natural del producto del gen metC consiste en mediar la biosíntesis de metionina en C. glutamicum. Se construyeron cepas mutantes de metC y las cepas exhibían prototrofia para metionina. Las cepas mutantes perdían completamente su capacidad para exhibir resistencia a S-(\gamma-aminoetil)-cisteína. Estos resultados demuestran que, además de la transsulfuración, que es otro camino biosintético, el camino de sulfhidrilación directa es funcional en C. glutamicum como una ruta biosintética paralela para metionina.

La tercera es el nuevo gen al que se refiere la invención, metZ (o metY). El aislamiento de este gen (SEQ ID NO: 1), y de su producto (SEQ ID NO: 2) demuestra la presencia de un camino de sulfhidrilación catalizado por O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa. Entre los eucariotas, se han consignado especies de hongos y levaduras que tienen ambos caminos de transsulfuración y sulfhidrilación directa. Hasta ahora, no se ha encontrado ningún organismo procariota que posea ambos caminos. Al contrario que E. coli, que posee únicamente la ruta biosintética para lisina, C. glutamicum posee dos caminos biosintéticos paralelos para el aminoácido. El camino biosintético para metionina en C. glutamicum es análogo al de lisina en dicho aspecto.

El gen metZ está localizado en la región de aguas arriba de metA, que es el gen que codifica la enzima que cataliza el primer paso de la biosíntesis de metionina (Park, S.-D., et al. (1998) Mol. Cells 8, 286-294). Las regiones citadas aguas arriba y aguas debajo de metA se secuenciaron para identificar otros genes met. Parece ser que metZ y metA forman un operón. La expresión de los genes que codifican MetA y MetZ conduce a superproducción de los polipéptidos correspondientes.

Sorprendentemente, los genes metZ pueden complementar las cepas mutantes auxotróficas de metionina de Escherichia coli metB. Esto demuestra que el producto proteínico de metZ cataliza un paso que puede salvar en derivación el paso catalizado por el producto proteínico de metB.

MetZ sufría también disgregación y la cepa mutante exhibía protrotrofia de metionina.

Se construyeron también mutantes dobles de Corynebacterium glutamicum metB y metZ. El mutante doble es auxotrófico para metionina. Así, metZ codifica una proteína que cataliza la reacción de O-acetil-homoserina a homocisteína, que es un paso en el camino de sulfhidrilación de la biosíntesis de metionina. Corynebacterium glutamicum contiene a la vez el camino de transsulfuración y el camino de sulfhidrilación de la biosíntesis de metionina.

La introducción de metZ en C. glutamicum dio como resultado la expresión de una proteína de 47.000 Dalton. La introducción combinada de metZ y metA en C. glutamicum daba como resultado la aparición de proteínas metA y metZ como se demostraba por electroforesis en gel. Sí la cepa de Corynebacterium es un superprotector de lisina, la introducción de un plásmido que contenía metZ y metA daba como resultado un título más bajo de lisina, pero se detectaba acumulación de homocisteína y metionina.

En otra realización, se introdujeron metZ y metA en cepas de Corynebacterium glutamicum junto con el gen hom, que codificaba la homoserina-deshidrogenasa, catalizando la conversión de aspartato-semialdehído en homoserina. Para este experimento se seleccionaron diferentes genes hom procedentes de distintos organismos. El gen hom de Corynebacterium glutamicum puede utilizarse al igual que genes hom de otros procariotas como Escherichia coli o Bacillus subtilis, o el gen hom de eucariotas tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Ashbya gossypii o algas, plantas superiores o animales. Es posible que el gen hom sea insensible contra la inhibición por realimentación mediada por cualesquiera metabolitos que existan en las rutas biosintéticas de los aminoácidos de la familia del aspartato, tales como aspartato, lisina, treonina o metionina. Tales metabolitos son por ejemplo aspartato, lisina, metionina, treonina, aspartil-fosfato, aspartato-semialdehído, homoserina, cistationina, homocisteína o cualquier otro metabolito que exista en estas rutas biosintéticas. Además de los metabolitos, la homoserina-deshidrogenasa puede ser insensible contra la inhibición por los análogos de todos aquellos metabolitos o incluso contra otros compuestos implicados en este metabolismo dado que existen otros aminoácidos como cisteína o cofactores tales como vitamina B12, y la totalidad de sus derivados así como S-adenosilmetionina y sus metabolitos y derivados y análogos. La insensibilidad de la homoserina-deshidrogenasa contra todos éstos, una parte de éstos o sólo uno de estos compuestos puede o bien ser su actitud natural o puede ser resultado de una o más mutaciones que son resultado de mutación clásica y selección utilizando productos químicos o irradiación u otros mutágenos. Las mutaciones podrían introducirse también en el gen hom utilizando tecnología génica, por ejemplo la introducción de mutaciones puntuales específicas del sitio o por cualquier método mencionado anteriormente para las secuencias de DNA codificantes de MP o DNA codificante de MP.

Cuando se combinó un gen hom con los genes metZ y metA y se introdujo en una cepa de Corynebacterium glutamicum que es un superproductor de lisina, la acumulación de lisina se redujo y la acumulación de homocisteína y metionina se incrementó. Puede conseguirse una mejora adicional de las concentraciones de homocisteína y metionina, si se utiliza una cepa de Corynebacterium glutamicum superproductora de lisina y se introdujo una rotura del gen ddh o el gen lysA antes de la transformación con DNA que contenía un gen hom y metZ y metA en combinación. La superproducción de homocisteína y metionina era posible utilizando fuentes de azufre diferentes. Podrían utilizarse sulfatos, tiosulfatos, sulfitos y también fuentes de azufre más reducidas como H_{2}S y sulfuros y derivados. Asimismo, fuentes orgánicas de azufre como metil-mercaptano, tioglicolatos, tiocianatos, tiourea, aminoácidos que contienen azufre tales como cisteína y otros compuestos que contienen azufre pueden utilizarse para conseguir superproducción de homocisteína y metionina.

El gen metC se introdujo en una cepa de Corynebacterium glutamicum utilizando los métodos arriba mencionados. El gen metC puede transformarse en la cepa en combinación con otros genes como metB, metA y metA. Puede añadirse también el gen hom. Cuando se combinaron el gen hom, y los genes metC, metA y metB en un vector y se introdujeron en una cepa de Corynebacterium glutamicum, se consiguió superproducción de homocisteína y metionina. La superproducción de homocisteína y metionina fue posible utilizando fuentes de azufre diferentes. Podrían utilizarse sulfatos, tiosulfatos, sulfitos y también fuentes de azufre más reducidas como H_{2}S y sulfuros y derivados. Asimismo, fuentes orgánicas de azufre como metil-mercaptano, tioglicolatos, tiocianatos, tiourea, aminoácidos que contienen azufre como cisteína y otros compuestos que contienen azufre pueden utilizarse para conseguir superproducción de homocisteína y metionina.

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F. Objeto de la invención

La materia que constituye el objeto de la invención abarca las realizaciones siguientes:

1.

Un polipéptido aislado de Corynebacterium glutamicum, estando implicada dicha proteína en el metabolismo de metionina y lisina y comprendiendo la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2.

2.

Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente secuencias de aminoácidos heterólogas.

3.

Una molécula de ácido nucleico aislada de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína de la reivindicación 1.

4.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 3, en donde dicho ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 1 o un complemento de la misma.

5.

Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.

6.

El vector de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente uno o más ácidos nucleicos que codifican proteínas implicadas en caminos metabólicos.

7.

El vector de la reivindicación 6, en el cual los ácidos nucleicos segundo y ulteriores se seleccionan de las secuencias de número impar enumeradas en la Tabla 1, con inclusión de cualquier molécula de ácido nucleico designada F.

8.

El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, que es un vector de expresión.

9.

Una célula hospedadora transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 8, en donde dicha célula es un microorganismo.

10.

La célula hospedadora de la reivindicación 9, en donde la célula pertenece al género Corynebacterium o Brevibacterium.

11.

La célula de la reivindicación 10, seleccionada del grupo constituido por:

\quad

Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrilophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium heali, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum, y las cepas indicadas en la Tabla 3.

12.

La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 ó 11 en donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico da como resultado la modulación de la producción de metionina y/o lisina.

13.

Un método de producción de un polipéptido de la reivindicación 1 que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 9 en un medio de cultivo apropiado.

14.

Un método de producción de un producto químico fino, que comprende cultivar una célula de la reivindicación 12.

15.

Un método de la reivindicación 14, en donde dicha célula se cultiva en presencia de una fuente de azufre.

16.

El método de la reivindicación 14, en donde dicho método comprende adicionalmente el paso de recuperar el producto químico fino de dicho cultivo.

17.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14, 15 ó 16, en donde el producto químico fino es un aminoácido.

18.

El método de la reivindicación 17, en donde el aminoácido es metionina o lisina.

19.

Un método para producir un producto químico fino, que comprende ultimar una célula cuyo DNA genómico ha sido alterado por la inclusión de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.

20.

El método de la reivindicación 19, en donde el DNA genómico de la célula se ha alterado ulteriormente por la inclusión de un ácido nucleico que codifica una proteína implicada en caminos metabólicos.

21.

El método de la reivindicación 20, en donde dicho ácido nucleico adicional se selecciona de las secuencias número impar enumeradas en la Tabla 1, con exclusión de cualquier molécula de ácido nucleico designada F.

22.

El método de las reivindicaciones 19 ó 20, en el cual la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo constituido por los genes metC, metB, metA, metE, metH, hom, asd, lysC, lysC/ask, rxa00657, dapA, dapB, dapC, dapD/argD, dapE, dapF, LysA, ddh, lysE, lysG, lysR, hsk, ppc, pycA, accD, accA, accB, addD, gpdh o cualquier combinación de los genes arriba mencionados.

La invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos que siguen, que no deben considerarse como limitantes.

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Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de DNA genómico total de Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Un cultivo de Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) se dejó crecer durante una noche a 30ºC con sacudidas enérgicas en medio BHI (Difco). Las células se cosecharon por centrifugación, se desechó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 5 ml de tampón-I (5% del volumen original del cultivo - todos los volúmenes indicados se han calculado para 100 ml de volumen de cultivo). Composición del tampón-I: 140,34 g/l de sacarosa, 2,46 g/l MgSO_{4} x 7H_{2}O, 10 ml/l solución de KH_{2}PO_{4} (100 g/l, ajustada a pH 6,7 con KOH), 50 ml/l concentrado M12 (10 g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l NaCl, 2 g/l MgSO_{4} x 7H_{2}O, 0,2 g/l CaCl_{2}, 0,5 g/l extracto de levadura (Difco), 10 ml/l mezcla de elementos traza (200 mg/l FeSO_{4} x H_{2}O, 10 mg/l ZnSO_{4} x 7 H_{2}O, 3 mg/l MnCl_{2} x 4 H_{2}O, 30 mg/l H_{3}BO_{3}, 20 mg/l CoCl_{2}, x 6 H_{2}O, 1 mg/l NiCl_{2} x 6 H_{2}O, 3 mg/l Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O, 500 mg/l agente complejante (EDTA o ácido cítrico), 100 ml/l mezcla de vitaminas (0,2 mg/l biotina, 0,2 mg/l ácido fólico, 20 mg/l ácido p-aminobenzoico, 20 mg/l riboflavina, 40 mg/l pantotenato de Ca, 140 mg/l ácido nicotínico, 40 mg/l hidrocloruro de piridoxal, 200 mg/l mio-inositol). Se añadió lisozima a la suspensión hasta una concentración final de 2,5 mg/ml. Después de una incubación de aproximadamente 4 horas a 37ºC, se degradó la pared celular y los protoplastos resultantes se cosecharon por centrifugación. El pelet se lavó una vez con 5 ml de tampón-I y una vez con 5 ml de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). El pelet se resuspendió en 4 ml de tampón TE y 0,5 ml de solución SDS (10%) y se añadieron 0,5 ml de solución de NaCl (5M). Después de la adición de proteinasa K a una concentración final de 200 \mug/ml, la suspensión se incubó durante aprox. 18 h a 37ºC. El DNA se purificó por extracción con fenol, fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y cloroformo-alcohol isoamílico, utilizando procedimientos estándar. A continuación, se precipitó el DNA por adición de 1/50 volúmenes de acetato de sodio 3M y 2 volúmenes de etanol, seguido por una incubación durante 30 min a -20ºC y una centrifugación durante 30 min a 12.000 rpm en una centrífuga de alta velocidad utilizando un rotor SS34 (Sorvall). El DNA se disolvió en 1 ml de tampón TE que contenía 20 \mug/ml de RNasaA y se dializó a 4ºC contra 1000 ml de tampón TE durante al menos 3 horas. Durante este tiempo, el tampón se cambió tres veces. A partes alícuotas de 0,4 ml de la solución de DNA dializada, se añaden 0,4 ml de LiCl 2M y 0,8 ml de etanol. Después de una incubación durante 30 min a -20ºC, se recogió el DNA por centrifugación (13.000 rpm, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Alemania). El pelet de DNA se disolvió en tampón TE. El DNA preparado por este procedimiento podía utilizarse para todos los propósitos, con inclusión de transferencia Southern o construcción de bibliotecas genómicas.

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Ejemplo 2 Construcción de bibliotecas genómicas en Escherichia coli o Corynebacterium glutamicum ATCC13022

Utilizando DNA preparado como se describe en el Ejemplo 1, se construyeron bibliotecas de cósmidos y plásmidos de acuerdo con métodos conocidos y bien establecidos (véase v.g., Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning : A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, o Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.).

Podría utilizarse cualquier plásmido o cósmido. De uso particular fueron los plásmidos pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Acad Sci. USA, 75: 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol 134: 1141-1156), plásmidos de la serie pBS (pBSSK+, pBSSK- y otros; Stratagene, LaJolla, USA), o cósmidos como SuperCos1 (Stratagene, LaJolla, USA) o Lorist6 (Gibson, T.J., Rosenthal A. y Waterson, R.H. (1987) Gene 53: 283-286. Una biblioteca específica para uso en C. glutamicum puede construirse utilizando el plásmido pSL109 (Lee, H.-S. A. J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4: 256-263).

Para el aislamiento de clones metC, se transformaron células JE6839 de E. coli con el DNA de la biblioteca y se extendieron en placas sobre medio mínimo M9 que contenía ampicilina y suplementos apropiados. Las placas se incubaron a 37ºC durante 5 días. Se aislaron los clones y se seleccionaron respecto al contenido de plásmido. La secuencia completa de nucleótidos del gen metC aislado se determinó por métodos bien conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica.

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Ejemplo 3 Secuenciación y Análisis Funcional del DNA por Computadora

Se utilizaron bibliotecas genómicas como las descritas en el Ejemplo 2 para secuenciación del DNA de acuerdo con métodos estándar, en particular por el método de terminación de cadenas utilizando máquinas se secuenciación ABI377 (véase, v.g., Fleischman, R.D. et al. (1995)'' Whole-genome Random Sequencing y Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science, 269: 496-512). Se utilizaron iniciadores de secuenciación con las secuencias de nucleótidos siguientes: 5'-GGAAACAGTATGACCATG-3' (SEQ ID NO: 123) o 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'(SEQ ID NO.: 124).

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Ejemplo 4 Mutagénesis in vivo

La mutagénesis in vivo de Corynebacterium glutamicum puede realizarse por paso de un plásmido (u otro vector) de DNA a través de E. coli u otros microorganismos (v.g. especies de Bacillus o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae) que están deteriorados en sus capacidades para mantener la integridad de su información genética. Cepas mutantes típicas tienen mutaciones en el gen para el sistema de reparación de DNA (v.g., mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia, véase Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, en: Escherichia coli y Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Washington). Dichas cepas son bien conocidas por quienes poseen experiencia ordinaria en la técnica. El uso de tales cepas se ilustra, por ejemplo, en Greene, A. y Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34.

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Ejemplo 5 Transferencia de DNA entre Escherichia coli y Corynebacterium glutamicum

Varias especies de Corynebacterium y Brevibacterium contienen plásmidos endógenos (como v.g., pHM1519 o pBL1) que se replican autónomamente (para revisión véase, v.g., Martin. J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5: 137-146). Pueden construirse fácilmente vectores lanzadera para Escherichia coli y Corynebacterium glutamicum utilizando vectores estándar para E. coli (Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons) a los cuales se añade un origen de replicación para y un marcador adecuado de Corynebacterium glutamicum. Tales orígenes de replicación se toman preferiblemente de plásmidos endógenos aislados de especies de Corynebacterium y Brevibacterium. De utilidad particular como marcadores de transformación para estas especies son genes para resistencia a la kanamicina (tales como los derivados de los transposones Tn5 o Tn903) o cloranfenicol (Winnacker, E.L. (1987) ``From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim). Existen numerosos ejemplos en la bibliografía de la construcción de una gran diversidad de vectores lanzadera que se replican tanto en E. coli como en C. glutamicum, y que pueden utilizarse para varios propósitos, con inclusión de la sobreexpresión de genes (para referencia, véase v.g., Yosihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, Martin J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5: 137-146 y Eikmanms, B.J. et al. (1991), Gene, 102: 93-98).

Utilizando métodos estándar, es posible clonar un gen de interés en uno de los vectores lanzadera arriba descritos e introducir tales vectores híbridos en cepas de Corynebacterium glutamicum. La transformación de C. glutamicum puede conseguirse por transformación de protoplastos (Kastsumata, R. et al. (1984) J. Bacteriol. 159306-311), electroporación (Liebl, E. et al. (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53: 399-303) y en los casos en que se utilizan vectores especiales, también por conjugación (como se describe, v.g., en Schäfer, A. et al. (1990), J. Bacteriol. 172: 1663-1666). Es asimismo posible transferir los vectores lanzadera para C. glutamicum a E. coli por preparación de DNA plasmídico de C. glutamicum (utilizando métodos estándar bien conocidos en la técnica) y transformación del mismo en E. coli. Este paso de transformación puede realizarse utilizando métodos estándar, pero es ventajoso utilizar una cepa de E. coli deficiente en Mcr, tal como NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166: 1-19).

Los genes pueden sobreexpresarse en cepas de C. glutamicum utilizando plásmidos que comprenden pCG1 (Patente U.S. No. 4.617.267) o fragmentos del mismo, y opcionalmente el gen para resistencia a la kanamicina de TN903 (Grindley, N.D. y Joyce, C.M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(12): 7176-7180). Adicionalmente, pueden sobreexpresarse genes en cepas de C. glutamicum utilizando el plásmido pSL109 (Lee, H.-S. y A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4: 256-263).

Aparte del uso de plásmidos replicativos, la sobreexpresión génica puede lograrse también por integración en el genoma. La integración genómica en C. glutamicum u otras especies de Corynebacterium o Brevibacterium puede realizarse por métodos bien conocidos, tales como recombinación homóloga con una o más regiones genómicas, integración mediada por endonucleasas de restricción (REMI) (véase, v.g., Patente DE 19.823.834), o por el uso de transposones. Es asimismo posible modular la actividad de un gen de interés por modificación de las regiones reguladoras (v.g. un promotor, un represor, y/o un intensificador) por modificación de secuencia, inserción, o deleción utilizando métodos dirigidos al sitio (tales como recombinación homóloga) o métodos basados en sucesos aleatorios (tales como mutagénesis de transposones o REMI). Pueden insertarse también secuencias de ácido nucleico que funcionan como terminadores de la transcripción en posición 3' respecto a la región codificante de uno o más genes de la invención; dichos terminadores son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Vinnacker, E.L. (1987) (From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology. VCH: Weinheim).

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Ejemplo 6 Evaluación de la Expresión de la Proteína Mutante

Las observaciones de la actividad de una proteína mutada en una célula hospedadora transformada están basadas en el hecho de que la proteína mutante se expresa de una manera similar y en cantidad similar a la de la proteína de tipo salvaje. Un método útil para averiguar el nivel de transcripción del gen mutante (un indicador de la cantidad de mRNA disponible para traducción al producto génico) consiste en realizar una transferencia Northern (para referencia véase, por ejemplo, Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York), en donde un iniciador diseñado para fijarse al gen de interés se marca con un identificador detectable (usualmente radiactivo o quimioluminiscente), de tal modo que cuando se extrae el RNA total de un cultivo del organismo, se corre en gel, se transfiere a una matriz estable y se incuba con esta sonda, la fijación y cantidad de fijación de la sonda indica la presencia y también la cantidad de mRNA para este gen. Esta información es una evidencia del grado de transcripción del gen mutante. Puede prepararse RNA celular total a partir de Corynebacterium glutamicum por varios métodos, todos ellos bien conocidos en la técnica, tales como el descrito en Bormann E.R. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.

Para evaluar la presencia o la cantidad relativa de proteína traducida a partir de este mRNA, se emplearon técnicas estándar, tales como electroforesis en gel de SDS-acrilamida. Por este método se demostró la superproducción de metC y MetZ en combinación con metA en Corynebacterium glutamicum. Puede emplearse también transferencia Western (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York). En este proceso, se extraen las proteínas celulares totales, se separan por electroforesis en gel, se transfieren a una matriz tal como nitrocelulosa, y se incuban con una sonda, tal como un anticuerpo, que se fija específicamente a la proteína deseada. Esta sonda está identificada generalmente con un marcador quimioluminiscente o colorimétrico que puede ser detectado fácilmente. La presencia y cantidad del marcador observadas indican la presencia y cantidad de la proteína mutante deseada presente en la célula.

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Ejemplo 7 Crecimiento de Escherichia coli y Corynebacterium glutamicum Modificado Genéticamente - Medios y Condiciones de Cultivo

Se cultivan rutinariamente cepas de E. coli en caldo MB y LB, respectivamente (Follettie M.T., et al. (1993) J. Bacteriol. 175, 4096-4103). El medio mínimo para E. coli es M9 y MCGC modificado (Yoshihama, M., et al. (1985) J. Bacteriol. 162, 591-507). Se añadió glucosa a una concentración final de 1%. Se añadieron antibióticos en las cantidades siguientes (microgramos por mililitro): ampicilina, 50; kanamicina, 25; ácido nalidíxico, 25. Se añadieron aminoácidos, vitaminas, y otros suplementos en las cantidades siguientes: metionina 9,3 mM; arginina, 9,3 mM; histidina 9,3 mM; tiamina, 0,05 mM. Las células de E. coli se cultivaron rutinariamente a 37ºC, respectivamente.

Se cultivan Corynebacterias modificadas genéticamente en medios de crecimiento sintéticos o naturales. Varios medios de crecimiento diferentes para Corynebacterias son no sólo bien conocidos sino que están disponibles fácilmente (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11: 11-16; Patente DE 4.120.867; Liebl (1992) ``The Genus Corynebacterium, en: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag). Estos medios están constituidos por una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y elementos traza. Fuentes de carbono preferidas son azúcares, tales como mono-, di-, o polisacáridos. Por ejemplo, glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa sirven como fuentes de carbono muy satisfactorias. Es asimismo posible suministrar azúcar al medio mediante compuestos complejos tales como melazas u otros subproductos del refino del azúcar. Puede ser también ventajoso suministrar mezclas de diferentes fuentes de carbono. Otras fuentes de carbono posibles son alcoholes y ácidos orgánicos, tales como metanol, etanol, ácido acético o ácido láctico. Las fuentes de nitrógeno son usualmente compuestos nitrogenados orgánicos o inorgánicos, o materiales que contienen estos compuestos. Fuentes ilustrativas de nitrógeno incluyen amoniaco gaseoso o sales amónicas, tales como NH_{4}Cl o
(NH_{4})_{2}SO_{4}, NH_{4}OH, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes de nitrógeno complejas tales como licor de maceración de maíz, harina de soja, proteína de soja, extracto de levadura, extracto de carne y otras.

La superproducción de aminoácidos que contienen azufre como homocisteína y metionina se hizo posible utilizando fuentes de azufre diferentes. Pueden utilizarse sulfatos, tiosulfatos, sulfitos, así como fuentes de azufre más reducidas tales como H_{2}S y sulfuros y derivados. Asimismo, pueden utilizarse fuentes orgánicas de azufre tales como metil-mercaptano, tioglicolatos, tiocianatos, tiourea, aminoácidos que contienen azufre tales como cisteína y otros compuestos que contienen azufre para conseguir su superproducción de homocisteína y metionina.

Compuestos salinos inorgánicos que pueden incluirse en los medios incluyen las sales cloruro, sales de fósforo o sulfatos de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, cinc, cobre y hierro. Pueden añadirse al medio compuestos formadores de quelatos para mantener en solución los iones metálicos. Agentes quelantes particularmente útiles incluyen dihidroxifenoles, como catecol o protocatechuato, o ácidos orgánicos, tales como ácido cítrico. Es típico que los medios contengan también otros factores de crecimiento, tales como vitaminas o promotores del crecimiento, ejemplos de los cuales incluyen biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales se originan frecuentemente de componentes de medios complejos tales como extracto de levadura, melazas, licor de maceración de maíz y otros. La composición exacta de los compuestos del medio depende fuertemente del experimento inmediato y se decide individualmente para cada caso específico. Información acerca de la optimización de los medios está disponible en el libro de texto ``Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (eds. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Asimismo, es posible seleccionar medios de crecimiento de suministradores comerciales, como estándar 1 (Merck) o BHI (infusión cerebro-corazón, DIFCO) u otros.

Todos los componentes del medio se esterilizan, sea por calentamiento (20 minutos a 1,5 bar y 121ºC) o por filtración estéril. Los componentes pueden esterilizarse juntos o, en caso necesario, por separado. Todos los componentes del medio pueden estar presentes al comienzo del cultivo, o pueden añadirse opcionalmente de manera continua o por lotes.

Las condiciones de cultivo se definen por separado para cada experimento. La temperatura debería estar comprendida en un intervalo entre 15ºC y 45ºC. La temperatura puede mantenerse constante o puede alterarse durante el experimento. El pH del medio debería estar comprendido en el intervalo de 5 a 8,5, con preferencia alrededor de 7,0, y puede mantenerse por adición de tampones al medio. Un tampón ilustrativo para este propósito es un tampón de fosfato de potasio. Alternativa o simultáneamente, pueden utilizarse tampones sintéticos tales como MOPS, HEPES, ACES y otros. Es también posible mantener un pH constante del cultivo por adición de NaOH o NH_{4}OH durante el cultivo. Si se utilizan componentes de medio complejos tales como extracto de levadura, puede reducirse la necesidad de tampones adicionales, debido al hecho de que muchos compuestos complejos tienen capacidades altas de tamponamiento. Si se utiliza un fermentador para cultivar los microorganismos, el pH puede controlarse también utilizando amoniaco gaseoso.

El tiempo de incubación está comprendido usualmente en un intervalo de varias horas a varios días. Este tiempo se selecciona a fin de permitir que se acumule la cantidad máxima de producto en el caldo. Los experimentos de cultivo descritos pueden llevarse a cabo en una diversidad de vasijas, tales como placas de microtitulación, tubos de vidrio, matraces de vidrio o fermentadores de vidrio o metálicos de tamaños diferentes. Para selección de un número grande de clones, los microorganismos deberían cultivarse en placas de microtitulación, tubos de vidrio o matraces de sacudidas, con o sin deflectores. Se utilizan preferiblemente matraces de sacudidas de 100 ml, llenos con 10% (en volumen) del medio de cultivo requerido. Los matraces deben sacudirse en una máquina de sacudidas rotativa (amplitud 25 mm) utilizando un intervalo de velocidades de 100-300 rpm. Las pérdidas por evaporación pueden reducirse por mantenimiento de una atmósfera húmeda; alternativamente, debería realizarse una corrección matemática para tener en cuenta las pérdidas por evaporación.

Si se testan clones modificados genéticamente, debe testarse también un clon de control sin modificar o un clon de control que contenga el plásmido básico sin inserción alguna. El medio se inocula a una DO_{600} de 0,5-1,5 utilizando células que han crecido en placas de agar, tales como placas CM (10 g/l glucosa, 2,5 g/l NaCl, 2 g/l urea, 10 g/l polipeptona, 5 g/l extracto de levadura, 5 g/l extracto de carne, 22 g/l NaCl, 2 g/l urea, 10 g/l polipeptona, 5 g/l extracto de levadura, 5 g/l extracto de carne, 22 g/l agar, pH 6,8 con NaOH 2M) que se había incubado a 30ºC. La inoculación del medio se realiza por introducción de una suspensión en solución salina de células de C. glutamicum procedente de placas CM o adición de un precultivo líquido de esta bacteria.

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Ejemplo 8 Análisis in Vitro de la Función de Proteínas Mutantes

La determinación de actividades y parámetros cinéticos de las enzimas está bien establecida en la técnica. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima alterada dada tienen que adaptarse a la actividad específica de la enzima de tipo salvaje, lo cual está plenamente dentro de la capacidad de una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Revisiones acerca de enzimas en general, así como detalles específicos concernientes a estructura, cinética, principios, métodos, aplicaciones y ejemplos para la determinación de muchas actividades enzimáticas pueden encontrarse, por ejemplo, en las referencias siguientes: Dixon, M., y Webb, E.C., (1979) Enzimas. Longmans: Londres; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: Nueva York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzimas, 3^{rd} ed. Academic Press: Nueva York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2^{nd} ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Graß1, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3^{rd} ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; y Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, "Enzymes". VCH: Weinheim, p. 352-363.

Se prepararon extractos de células de Corynebacterium glutamicum como se ha descrito anteriormente (Park, S.-D., et al. (1998) Mol. Cells 8, 286-294). La cistationina-\beta-liasa se ensayó como sigue. La mixtura de ensayo contenía Tris-HCl 100 mM (pH 8,5), NADH 0,1 mM, L-cistationina 1 mM, 5 unidades de L-lactato-deshidrogenasa, y cantidades apropiadas de extracto bruto. Los cambios ópticos se monitorizaron a 340 nm. El ensayo para resistencia a S.-(\gamma-aminoetil)-cisteína (AEC) se llevó a cabo como ha sido descrito en Rossol, I. y Pühler, A. (1992) J. Bacteriol. 174, 2968-77. Los resultados de los ensayos de cistationin-\beta-liasa a partir de extractos de cepas diferentes de Corynebacterium glutamicum, así como los resultados de los ensayos de resistencia a AEC de la misma cepa se resumen a continuación en la Tabla 5.

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TABLA 5 Expresión de cistationina-\beta-liasa^{a}

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La capacidad de los clones metC para expresar cistationina-\beta-liasa se testó por ensayo enzimático. Se ensayaron extractos brutos preparados a partir de las células ASO19E12 de C. glutamicum que albergaban el plásmido pSL173. Las células que albergaban el plásmido demostraron un aumento de aproximadamente 5 veces en la actividad de cistationina-\beta-liasa comparadas con las que albergaban el vector vacío pMT1 (Tabla 5), debido aparentemente al efecto gen-dosis. El análisis SDS-PAGE de los extractos brutos reveló una banda supuesta de cistationina-\beta-liasa con un M_{r} aproximado de 49.000. La intensidad de cada banda supuesta de cistationina-\beta-liasa estaba de acuerdo con los datos de los ensayos de complementación y enzimáticos (Tabla 5). Como se ha descrito arriba, una región de metC parecía ser prácticamente idéntica al AECD consignado previamente. Dado que el gen AECD se aisló sobre la base de su capacidad para conferir resistencia a S-(\beta-aminoetil)-cisteína (AEC), un análogo tóxico de lisina, los autores de la invención testaron el producto proteínico de metC respecto a la presencia de la actividad. Como se muestra en la Tabla 5, las células que sobreexpresaban cistationina-\beta-liasa exhibían resistencia incrementada a AEC. La cepa que llevaba una mutación en el gen metC (véase más adelante) perdió completamente su capacidad para exhibir un fenotipo resistente a AEC.

El ensayo para O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa se realizó como sigue (Belfaiza, J., et al. (1998) J. Bacteriol. 180, 250-255; Ravanel, S., M. Droux, y R. Douce (1995) Arch. Biochem. Biophys. 316, 572-584; Foglino, M. (1995) (Belfaiza, J., et al. (1998) J. Bacteriol. 180, 250-255; Ravanel, S., M. Droux, y R. Douce (1995) Arch. Biochem. Biophys. 316, 572-584; Foglino, M. (1995) Microbiology 141, 431-439). 141, 431-439). La mezcla de ensayo de 0,1 ml contenía MOPS-NaOH 20 mM (pH 7,5), O-acetilhomoserina 10 mM, Na_{2}S 2 mM en NaOH 50 mM, y una cantidad apropiada de enzima. Inmediatamente después de la adición de Na_{2}S que se añadió finalmente, la mezcla de reacción se cubrió con 50 \mul de aceite mineral. Después de 30 minutos de incubación a 30ºC, se paró la reacción por ebullición de la mixtura durante 3 minutos. La homocisteína producida en la reacción se cuantificó como se ha descrito previamente (Yamagata, S. (1987) Method Enzymol. 143, 478-483). Se tomó la mixtura de reacción de 0,1 ml y se mezcló con 0,1 ml de H_{2}O, 0,6 ml de NaCl saturado, 0,1 ml de Na_{2}CO_{3} 1,5M que contenía KCN 67 mM, y 0,1 ml de nitroprusiato al 2%. Después de 1 minuto de incubación a la temperatura ambiente, se midió la densidad óptica a 520 nm. Las células de Corynebacterium que albergaban copias adicionales del gen metZ, v.g., un plásmido que contenía el gen metZ, exhibían actividades enzimáticas de metZ significativamente mayores que el mismo tipo de células de Corynebacterium sin copias adicionales del gen metZ.

La actividad de las proteínas que se fijan a DNA puede medirse por varios métodos bien establecidos, tales como ensayos de desplazamiento de bandas de DNA (llamados también ensayos de retardo en gel). El efecto de tales proteínas sobre la expresión de otras moléculas puede medirse utilizando ensayos de genes informadores (tales como el descrito en Kolmar H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 y las referencias citadas en dicho lugar). Los sistemas de test de genes informadores son bien conocidos y están bien establecidos para aplicaciones en células tanto pro- como eucariotas, utilizando enzimas tales como beta-galactosidasa, proteína verde fluorescente y varias otras.

La determinación de la actividad de las proteínas de transporte de membrana puede realizarse de acuerdo con técnicas como las descritas en Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels y Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure y Función, Springer: Heidelberg, p. 85-137; 199-234; y 270-322.

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Ejemplo 9 Análisis del Impacto de la Proteína Mutante sobre la Producción del Producto Deseado

El efecto de la modificación genética en C. glutamicum sobre la producción de un compuesto deseado (tal como un aminoácido) puede evaluarse dejando crecer el microorganismo modificado en condiciones adecuadas (tales como las arriba descritas) y analizando el medio y/o el componente celular respecto a producción incrementada del producto deseado (por ejemplo, un aminoácido). Tales métodos de análisis son bien conocidas por una persona con experiencia ordinaria en la técnica, e incluyen espectroscopia, cromatografía en capa delgada, métodos de tinción de diversas clases, métodos enzimáticos y microbiológicos, y cromatografía analítica tal como cromatografía líquida de alta resolución (véase, por ejemplo, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 89-90 y p. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry y Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol. 3, Capítulo III: "Product recovery and purification", página 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley y Sons; Kennedy, J.F. y Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological materials, John Wiley y Sons; Shaeiwitz, J.A. y Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, in: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Capítulo 11, page 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications.).

Además de la determinación del producto final de fermentación, es asimismo posible analizar otros componentes de los caminos metabólicos utilizados para la producción del compuesto deseado, tales como compuestos intermedios y productos secundarios, a fin de determinar la eficiencia global de producción del compuesto. Los métodos de análisis incluyen medidas de niveles de nutrientes en el medio (v.g., azúcares, hidrocarburos, fuentes de nitrógeno, fosfato, y otros iones), medidas de la composición y el crecimiento de la biomasa, análisis de la producción de metabolitos comunes de los caminos de biosíntesis, y medida de los gases producidos durante la fermentación. Métodos estándar para estas medidas se reseñan en Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, P.M. Rhodes y P.F. Stanbury, eds., IRL Press, p. 103-129; 131-163; y 165-192 (ISBN: 0199635773) y las referencias citadas en dicho lugar.

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Ejemplo 10 Purificación del Producto Deseado a partir del Cultivo de C. glutamicum

La recuperación del producto deseado de las células de C. glutamicum o del sobrenadante del cultivo arriba descrito puede realizarse por diversos métodos bien conocidos en la técnica. Si el producto deseado no es secretado por las células, las células pueden cosecharse del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y pueden lisarse las células por técnicas estándar, tales como fuerza mecánica o tratamiento por ultrasonidos. Los residuos celulares se separan por centrifugación, y la fracción sobrenadante que contiene las proteínas solubles se retiene para purificación ulterior del compuesto deseado. Si el producto es secretado por las células de C. glutamicum, entonces las células se retiran del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y se retiene la fracción sobrenadante para purificación ulterior.

La fracción sobrenadante de cualquier método de purificación se somete a cromatografía con una resina adecuada, en la cual la molécula deseada o bien es retenida sobre una resina de cromatografía mientras que muchas de las impurezas contenidas en la muestra no lo son, o las impurezas son retenidas por la resina mientras que la muestra no lo es. Tales pasos de cromatografía pueden repetirse en caso necesario, utilizando la misma o diferentes resinas cromatográficas. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica estaría perfectamente versada en la selección de resinas cromatográficas apropiadas y en su aplicación más eficaz para una molécula particular a purificar. El producto purificado puede concentrarse por filtración o ultrafiltración, y guardarse a una temperatura a la cual se maximice la estabilidad del producto.

Existe una amplia serie de métodos de purificación conocidos en la técnica, y el método de purificación que antecede no debe considerarse como limitante. Técnicas de purificación de este tipo se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: Nueva York (1986).

La identidad y pureza de los compuestos aislados puede evaluarse por métodos estándar en la técnica. Éstos incluyen cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de tinción, cromatografía en capa delgada, NIRS, ensayo enzimático, o microbiológicamente. Dichos métodos de análisis se revisan en: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; y Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, 575-581 y p. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry y Molecular Biology, John Wiley y Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry y Molecular Biology, vol. 17.

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Ejemplo 11 Análisis de las Secuencias Génicas de la Invención

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias son métodos conocidos en la técnica, y pueden realizarse utilizando un algoritmo matemático, tal como el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, modificado según Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77. Dicho algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico MP de la invención. Las búsquedas de proteínas NBLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, registro = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína MP de la invención. Para obtener alineaciones con lagunas para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, una persona con experiencia ordinaria en la técnica conocerá el modo de optimizar los parámetros del programa (v.g., XBLAST y NBLAST) para la secuencia específica que se analiza.

Otro ejemplo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Meyers y Miller ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17). Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparación de secuencias de aminoácidos, puede utilizarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12, y una penalidad por laguna de 4. Algoritmos adicionales para análisis de secuencias se conocen en la técnica, e incluyen ADVANCE y ADAM, descritos en Torelli y Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10: 3-5; y FASTA, descrito en Pearson y Lipman (1988) P.N.A.S. 85: 2444-8.

El porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos puede lograrse también utilizando el programa GAP en el paquete de Software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de laguna de 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso por longitud de 2, 3 o 4. El porcentaje de homología entre dos secuencias de ácido nucleico puede realizarse utilizando el programa GAP en el paquete de software CGC, utilizando parámetros estándar, tales como un peso de laguna de 50 y un peso por longitud de 3.

Un análisis comparativo de las secuencias génicas de la invención con las presentes en Genbank ha sido realizado utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, v.g., Bexevanis y Ouellette, eds. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes y Proteins. John Wiley y Sons: Nueva York). Las secuencias génicas de la invención se compararon con genes presentes en Genbank en un proceso de tres pasos. En un primer paso, se realizó un análisis BLASTN (v.g., un análisis de alineación local) para cada una de las secuencias de la invención contra las secuencias de nucleótidos presentes en Genbank, y se retuvieron para análisis ulterior los 500 aciertos principales. Se realizó sobre estos 500 aciertos una búsqueda FASTA subsiguiente (v.g., un análisis de alineación combinado local y global, en el cual se alinean regiones limitadas de las secuencias). Cada secuencia génica de la invención se alineó a continuación globalmente para cada uno de los tres aciertos FASTA principales, utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG (empleando parámetros estándar). Con objeto de obtener resultados correctos, se ajustó la longitud de las secuencias extraídas de Genbank a la longitud de las secuencias de búsqueda por métodos bien conocidos en la técnica. Los resultados de este análisis se exponen en la Tabla 4. Los datos resultantes son idénticos a lo que podría haberse obtenido en caso de que se hubiera realizado un análisis GAP (global) individualmente sobre cada uno de los genes de la invención en comparación con cada una de las referencias en Genbank, pero requerían un tiempo de computación notablemente reducido en comparación con dicho análisis con amplitud de toda la base de datos GAP (global). Las secuencias de la invención para las cuales no se obtuvo alineación alguna por encima de los valores de punto de corte se indican en la Tabla 4 por la ausencia de información de alineación. Será comprendido adicionalmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica que los porcentajes de homología de alineación GAP expuestos en la Tabla 4 bajo el encabezamiento "% homología (GAP)" están expresados en el formato numérico europeo, donde un "," representa una coma decimal. Por ejemplo, un valor de "40,345" en esta columna representa "40.345%" con el formato de puntuación inglés.

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Ejemplo 12 Construcción y Operación de Microrredes de DNA

Las secuencias de la invención pueden utilizarse adicionalmente en la construcción y aplicación de microrredes de DNA (el diseño, la metodología y los usos de las redes de DNA son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Schena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470; Wodicka, L. et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 1359-1367; DeSaizieu, A. et al. (1998) Nature Biotechnology 16: 45-48; y DeRisi, J.L. et al. (1997) Science 278:
680-686).

Las microrredes de DNA son soportes sólidos o flexibles constituidos por nitrocelulosa, nailon, vidrio, silicona, u otros materiales. Las moléculas de ácido nucleico pueden fijarse a la superficie de una manera ordenada. Después de marcación apropiada, otros ácidos nucleicos o mezclas de ácidos nucleicos pueden hibridarse a las moléculas de ácido nucleico inmovilizadas, y el marcador puede utilizarse para monitorizar y medir las intensidades de señal individuales de las moléculas hibridadas en regiones definidas. Esta metodología permite la cuantificación simultánea de la cantidad relativa o absoluta de todos los ácidos nucleicos o ácidos nucleicos seleccionados en la muestra o mixtura de ácido nucleico aplicada. Las microrredes de DNA, por consiguiente, permiten un análisis de la expresión de ácidos nucleicos múltiples (tantos como 6800 o más) en paralelo (véase, v.g., Schena, M. (1996) BioEssays 18(5): 427-431).

Las secuencias de la invención pueden utilizarse para diseñar iniciadores oligonucleotídicos que son capaces de amplificar regiones definidas de uno o más genes de C. glutamicum por una reacción de amplificación de ácido nucleico tal como la reacción en cadena de la polimerasa. La elección y el diseño de los iniciadores oligonucleotídicos 5' o 3' o de enlazadores apropiados permite la fijación covalente de los productos PCR resultantes a la superficie de un medio de soporte arriba descrito (y descrito también, por ejemplo, en Schena, M. et al. (1995) Science 270:
467-470).

Pueden construirse también microrredes de ácido nucleico por síntesis de oligonucleótidos in situ como ha sido descrito por Wodicka, L. et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 1359-1367. Por métodos fotolitográficos, se exponen a la luz regiones de la matriz definidas con precisión. Los grupos protectores que son fotolábiles se activan de este modo y sufren adición de nucleótidos, en tanto que las regiones que están enmascaradas contra la luz no sufren modificación alguna. Ciclos subsiguientes de protección y activación por la luz permiten la síntesis de oligonucleótidos diferentes en posiciones definidas. Regiones pequeñas definidas de los genes de la invención pueden sintetizarse sobre microrredes por síntesis de oligonucleótidos en fase sólida.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención presentes en una muestra o mixtura de nucleótidos pueden hibridarse a las microrredes. Estas moléculas de ácido nucleico pueden marcarse de acuerdo con métodos estándar. Resumidamente, las moléculas de ácido nucleico (v.g., moléculas de mRNA o moléculas de DNA) se marcan por incorporación de nucleótidos marcados isotópica o fluorescentemente, v.g., durante la transcripción inversa o la síntesis del DNA. La hibridación de ácidos nucleicos marcados a microrredes ha sido descrita (v.g., en Schena, M. et al. (1995) supra; Wodicka, L. et al. (1997), supra; y DeSaizieu A. et al. (1998), supra). La detección y la cuantificación de la molécula hibridada se adaptan al marcador específico incorporado. Los indicadores radiactivos pueden detectarse, por ejemplo, como se describe en Schena M. et al. (1995) arriba) y los marcadores fluorescentes pueden detectarse, por ejemplo, por el método de Shalon et al. (1996) Genome Research 6: 639-645).

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La aplicación de las secuencias de la invención a la tecnología de microrredes de DNA, como se ha descrito arriba, permite análisis comparativos de diferentes cepas de C. glutamicum u otras Corynebacterias. Por ejemplo, estudios de variaciones entre cepas basados en perfiles de transcritos individuales y la identificación de genes que son importantes para propiedades específicas y/o deseadas de las cepas tales como patogenicidad, productividad y tolerancia al estrés son facilitados por las metodologías de redes de ácido nucleico. Asimismo, son posibles comparaciones del perfil de expresión de genes de la invención durante el curso de una reacción de fermentación utilizando la tecnología de redes de ácido nucleico.

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Ejemplo 13 Análisis de la Dinámica de las Poblaciones de Proteínas Celulares (Proteómica)

Los genes, composiciones y métodos de la invención pueden aplicarse para estudiar las interacciones y la dinámica de poblaciones de proteínas, denominada "proteómica". Poblaciones de proteínas de interés incluyen, pero sin carácter limitante, la población total de proteínas de C. glutamicum (v.g., en comparación con las poblaciones de proteínas de otros organismos), aquellas proteínas que son activas en condiciones ambientales o metabólicas específicas (v.g., durante la fermentación, a temperatura alta o baja, o a pH alto o bajo) o aquellas proteínas que son activas durante fases específicas de crecimiento y desarrollo.

Las poblaciones de proteínas pueden analizarse por diversas técnicas bien conocidas, tales como electroforesis en gel. Proteínas celulares pueden obtenerse, por ejemplo, por lisis o extracción, y pueden separarse unas de otras utilizando una diversidad de técnicas electroforéticas. La electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) separa las proteínas principalmente sobre la base de su peso molecular. La electroforesis en gel de poliacrilamida con enfoque isoeléctrico (IEF-PAGE) separa las proteínas por su punto isoeléctrico (que refleja no sólo la secuencia de aminoácidos sino también modificaciones de la proteína posteriores a la traducción). Otro método, más preferido, de análisis de proteínas es la combinación consecutiva de ambas IEF-PAGE y SDS-PAGE, conocida como electroforesis en gel 2-D (descrita, por ejemplo en Hermann et al. (1998) Electrophoresis 19: 3217-3221; Fountoulakis et al. (1998) Electrophoresis 19: 1193-1202; Langen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192; Antelmann et al. (1997) Electrophoresis 18: 1451-1463). Otras técnicas de separación pueden utilizarse también para separación de proteínas, tales como electroforesis capilar en gel; dichos métodos son bien conocidos en la
técnica.

Las proteínas separadas por estas metodologías pueden visualizarse por técnicas estándar, tales como tinción o marcación. Se conocen en la técnica tintes adecuados, e incluyen Azul Brillante Coomassie, tinte de plata, o tintes fluorescentes tales como Sypro-Ruby (Molecular Probes). La inclusión de aminoácidos marcados radiactivamente u otros precursores de proteínas (v.g., ^{35}S-metionina, ^{35}S-cisteína, aminoácidos marcados con ^{14}C, ^{15}N-aminoácidos, o aminoácidos marcados con ^{15}NO_{3}, ^{15}NH_{4}^{+} o ^{13}C) en el medio de C. glutamicum permite la marcación de proteínas de estas células antes de su separación. Análogamente, pueden emplearse marcadores fluorescentes. Estas proteínas marcadas pueden extraerse, aislarse y separarse de acuerdo con las técnicas descritas previamente.

Las proteínas visualizadas por estas técnicas pueden analizarse ulteriormente por medida de la cantidad de tinte o marcador utilizada. La cantidad de una proteína dada puede determinarse cuantitativamente utilizando, por ejemplo, métodos ópticos y puede compararse con la cantidad de otras proteínas en el mismo gel o en otros geles. Las comparaciones de proteínas en geles pueden hacerse, por ejemplo, por comparación óptica, por espectroscopia, por escaneo de imágenes y análisis de geles, o por el uso de películas y filtros fotográficos. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica.

Para determinar la identidad de cualquier proteína dada, puede emplearse secuenciación directa u otras técnicas estándar. Por ejemplo, puede utilizarse secuenciación de aminoácidos N- y/o C-terminales (tal como la degradación de Edman), al igual que espectrometría de masas (en particular las técnicas MALDI o ESI (véase, v.g., Langen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192)). Las secuencias de proteínas proporcionadas en esta memoria pueden utilizarse para la identificación de proteínas de C. glutamicum por estas técnicas.

La información obtenida por estos métodos puede utilizarse para comparar los patrones de presencia, actividad, o modificación de proteínas entre diferentes muestras a partir de diversas condiciones biológicas (v.g., diferentes organismos, tiempos de fermentación, condiciones de medio, o biotopos diferentes, entre otras). Los datos obtenidos de tales experimentos solos, o en combinación con otras técnicas, pueden utilizarse para diversas aplicaciones, tales como comparación del comportamiento de diversos organismos en una situación dada (v.g., metabólica), para aumentar la productividad de las cepas que producen productos químicos finos o para aumentar la eficiencia de la producción de productos químicos finos.

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Ejemplo 14 Clonación de Genes por Aplicación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Los genes pueden amplificarse utilizando oligonucleótidos específicos que comprenden secuencias de nucleótidos homólogas a secuencias de Corynebacterium glutamicum u otras cepas así como sitios de reconocimiento de enzimas de restricción bien conocidos en la técnica (v.g., como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^{nd}. ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Estos oligonucleótidos pueden utilizarse para amplificar fragmentos específicos de DNA que contienen partes del cromosoma de cepas mencionadas utilizando DNA-polimerasas tales como DNA-polimerasa de T. aquaticus, DNA-polimerasa de P. furiosus, o DNA-polimerasa de P. woesei y nucleótidos dNTPs en una solución tampón apropiada como se describe por el fabricante.

Fragmentos de genes tales como secuencias codificantes de RXA00657 con inclusión de regiones apropiadas aguas arriba y aguas abajo no contenidas en la región codificante del gen mencionado pueden amplificarse utilizando las tecnologías mencionadas con anterioridad. Adicionalmente, estos fragmentos pueden purificarse de oligonucleótidos y nucleótidos no incorporados. Pueden utilizarse enzimas de restricción de DNA para producir extremos que sobresalen, que pueden utilizarse para ligar fragmentos de DNA a vectores digeridos con enzimas complementarias o enzimas compatibles que producen extremos que pueden utilizarse para ligar el DNA en los vectores mencionados en Sinskey et al., Patente U.S. No. 4.649.119, y técnicas para manipulación genética de C. glutamicum y las especies de Brevibacterium afines (v.g., lactofermentum) (Yoshihama et al, J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata al., J. Bacteriol. 159: 306-311 (1984); y Santamaria et al., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984). Los oligonucleótidos utilizados como iniciadores para la amplificación de la secuencia de DNA aguas arriba, la secuencia de la región codificante y la región de RXA00657 de aguas abajo eran como sigue:

TCGGGTATCCGCGCTACACTTAGA

(SEQ ID NO: 121);

GGAAACCGGGGCATCGAAACTTA

(SEQ ID NO: 122).

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El DNA cromosómico de Corynebacterium glutamicum con una cantidad de 200 ng se utilizó como molde en un volumen de reacción de 100 \mul que contenía 2,5U Pfu Turbo-Polimerasa^{TM} (Stratagene^{TM}), y 200 \muM de dNTP-nucleótidos. La PCR se realizó en un PCR-Cycler^{TM} (Perkin Elmer 2400^{TM}) utilizando el protocolo temperatura/tiempo siguiente:

1 ciclo: 94ºC: 2 min;

20 ciclos: 94ºC: 1 min;

52ºC: 1 min, 72ºC: 1,5 min,

1 ciclo: 72ºC: 5 min.

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Los iniciadores se separaron del fragmento de DNA amplificado resultante y el fragmento resultante se clonó en el sitio romo EcoRV de pBS KS (Stratagene^{TM}). El fragmento se escindió por digestión con las enzimas de restricción BamHI/XhoI y se ligó a un vector pB digerido con BamHI SalI (SEQ ID NO: 125). El vector resultante se designó pB RXA00657.

Los vectores recombinantes resultantes pueden analizarse utilizando técnicas estándar descritas v.g. en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), y pueden transferirse a C. glutamicum utilizando las técnicas mencionadas anteriormente.

Una cepa de Corynebacterium (ATCC13286) se trató para una transformación como se ha descrito. La transformación de C. glutamicum puede realizarse por transformación de protoplastos (Kastsumata, R. et al. (1984) J. Bacteriol. 159306-311), electroporación (Liebl, E. et al. (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53: 399-303) y en los casos en que se utilizan vectores especiales, también por conjugación (como se describe, v.g., en Schäfer, A. et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666). Es también posible transferir los vectores lanzadera para C. glutamicum a E. coli por preparación de DNA plasmídico de C. glutamicum (utilizando métodos estándar bien conocidos en la técnica) y transformación del mismo en E. coli. Este paso de transformación puede realizarse utilizando métodos estándar, pero resulta ventajoso utilizar una cepa de E. coli deficiente en Mcr, tal como NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166: 1-19).

La transformación de una cepa bacteriana tal como una cepa de Corynebacterium glutamicum (ATCC13286) se realizó con un plásmido pB que contenía las regiones de DNA de RXA00657 mencionadas anteriormente (SEQ ID NO: 6) y en otro caso por el vector pB (SEQ ID NO: ) que no llevaba inserción adicional alguna de ácidos nucleicos.

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Las cepas resultantes se extendieron en placas y se aislaron del medio CM (10 g/l glucosa, 2,5 g/l NaCl, 2,0 g/l urea, 10 g/l Bacto-Peptona (Difco/Becton Dickinson/Sparks USA^{TM}), 5 g/l de extracto de levadura (Difco/Becton Dickinson/Sparks USA^{TM}), 5 g/l de extracto de carne (Difco/Becton Dickinson/Sparks USA^{TM}), 22 g/l de agar (Difco/Becton Dickinson/Sparks USA^{TM}) y 15 \mug/ml de sulfato de kanamicina (Serva, Alemania) con un (sic) ajustado con NaOH a un pH de 6,8.

Las cepas aisladas del medio de agar mencionado anteriormente se inocularon en 10 ml en un matraz de sacudidas de 100 ml que no contenía deflector alguno en medio líquido que contenía 100 g/l de sacarosa, 50 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2,5 g/l de NaCl, 2,0 g/l de urea, 10 g/l de Bacto-Peptona (Difco/Becton Dickinson/Sparks USA), 5 g/l de extracto de levadura (Difco/Becton Dickinson/Sparks USA), 5 g/l de extracto de carne (Difco/Becton Dickinson/Sparks USA) y 2,5 g/l de CaCO_{3} (Riedel de Haen, Alemania). El medio se ajustó con NaOH a un pH de 6,8.

Las cepas se incubaron a 30ºC durante 48 horas. Los sobrenadantes de las incubaciones se prepararon por centrifugación durante 20 minutos a 12.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf^{TM}. Los sobrenadantes líquidos se diluyeron y se sometieron a análisis de aminoácidos (métodos estándar para estas medidas se reseñan en Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, P.M. Rhodes y P.F. Stanbury, eds., IRL Press, p. 103-129; 131-163; y 165-192 (ISBN: 0199635773) y las referencias citadas en dicho lugar.

Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 6.

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Resultados TABLA 6

2

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Equivalentes

Las personas con experiencia ordinaria en la técnica reconocerán, o podrán averiguar utilizando simplemente experimentación de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descritas en esta memoria. Tales equivalentes deben entenderse abarcados por las reivindicaciones que siguen.

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

TABLA 3 Cepas de Corynebacterium y Brevibacterium que pueden utilizarse en la Práctica de la Invención

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

<110> BASF Aktiengesellschaft

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<120> GENES DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM QUE CODIFICAN PROTEÍNAS DEL CAMINO METABÓLICO

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<130> BGI-121CP2PC

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<140>

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<141>

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<150> 09/606740

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<151> 2000-06-23

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<150> 60/187970

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<151> 2000-03-09

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<160> 125

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<170> PatentIn Vers. 2.0

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<210> 1

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<211> 1840

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<212> DNA

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<213> Corynebacterium glutamicum

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<220>

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<221> CDS

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<222> (363)..(1676)

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<400> 1

97

98

99

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<210> 2

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<211> 437

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<212> PRT

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<213> Corynebacterium glutamicum

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<400> 2

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100

101

102

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<210> 3

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<211> 1495

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<212> DNA

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<213> Corynebacterium glutamicum

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<220>

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<221> CDS

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<222> (287)..(1264)

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<400> 3

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103

104

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<210> 4

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<211> 325

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<212> PRT

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<213> Corynebacterium glutamicum

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<400> 4

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106

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<210> 5

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<211> 1033

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<212> DNA

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<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

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<220>

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<221> CDS

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<222> (101)..(1006)

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<400> 5

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108

109

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<210> 6

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<211> 301

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<212> PRT

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<213> Corynebacterium glutamicum

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<400> 6

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110

111

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<210> 7

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<211> 948

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<212> DNA

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<213> Corynebacterium glutamicum

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<220>

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<221> CDS

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<222> (101)..(925)

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<223> RXA02229

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<400> 7

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112

113

\newpage

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<210> 8

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<211> 275

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<212> PRT

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<213> Corynebacterium glutamicum

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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115

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 1491

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<212> DNA

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<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

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<220>

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<221> CDS

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<222> (101)..(1468)

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<223> RXS02970

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

117

118

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 456

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

120

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1330

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1330)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA01009

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

122

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 410

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

124

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 792

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(769)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC02390

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

126

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

128

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 897

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(874)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC01796

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

130

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

132

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 771

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(748)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC01207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

134

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1026

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1003)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC00657

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

137

138

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

140

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1059

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1036)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC00552

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

142

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1386

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1363)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA00534

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

145

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 421

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

148

149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1155

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1132)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA00533

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

150

151

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

153

154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 608

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (69)..(608)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA02843

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

155

156

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1230

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1207)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA02022

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

159

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

161

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1059

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1036)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA00044

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

163

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 867

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(844)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA00863

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

166

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

168

169

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 873

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(850)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA00864

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

170

171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

172

173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 608

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (69)..(608)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA02843

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

174

175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

176

177

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1143

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1120)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXN00355

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

178

179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

180

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 958

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(958)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA00352

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

182

183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

184

185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1400

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1377)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA00972

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

186

187

188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 459

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

189

190

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(2098)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA02653

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

192

193

194

195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 666

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

196

197

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 993

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(970)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA01393

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

199

200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1626

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1603)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA00241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

202

203

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 501

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

205

206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 822

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(799)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA01394

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

208

209

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

210

211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1026

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1003)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA00865

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

212

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

214

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1071

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1098)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXS02021

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

216

217

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 316

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

218

219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1296

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1273)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXS02157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

220

221

222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 391

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

223

224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1008

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(985)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC00733

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

225

227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

228

229

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 426

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(426)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC00861

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

230

231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1066

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1066)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC00866

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

233

234

235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

236

237

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1527

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1504)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC02095

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

238

239

240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 468

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

241

242

243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (34)..(272)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC03185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

244

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

245

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1147)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA00115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

247

248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 349

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

249

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1254

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1231)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXN00403

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

251

252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 377

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

253

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1210)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA00403

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

255

256

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 370

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

258

259

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 687

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(664)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXS03158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

260

261

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

262

263

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 617

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(594)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA00254

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

264

265

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

266

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1147)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA02532

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

267

268

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 349

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

269

270

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 861

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(838)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXS03159

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

271

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

273

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 703

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(703)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA02768

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> En todos los casos, n = cualquier nucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> En todos los casos, Xaa = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

275

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> En todos los casos, Xaa = cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

277

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1090)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA00216

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

279

280

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

281

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 551

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(528)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXA02197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

283

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

284

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2599

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(2599)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXN02198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

285

286

287

288

289

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 833

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

290

291

292

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2578

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(2578)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA02198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

293

294

295

296

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 826

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

297

298

299

300

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 621

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(598)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXN03074

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

301

302

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

303

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 621

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(598)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA02906

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

305

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

1001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1557

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1534)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXN00132

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

307

309

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 478

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

310

311

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(105)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA00132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

312

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

313

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1396

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1396)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA01371

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

314

315

316

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 432

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

317

318

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2358

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(2335)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXN02085

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

319

321

322

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 745

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

324

325

326

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1923

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1900)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA02085

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

327

328

329

330

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 600

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

331

332

333

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 603

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(580)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA02086

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

334

335

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

336

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1326

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1303)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXN02648

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

337

338

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 401

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

339

340

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 548

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(525)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA02648

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

341

342

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

343

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 784

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(784)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FRXA02658

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

344

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

346

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 408

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(385)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC02238

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

347

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

348

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1827

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1804)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RXC00128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

350

351

352

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 568

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

353

354

355

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1344

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (101)..(1321)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> RNA02240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

356

357

358

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 407

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

359

360

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial : iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgggtatcc gcgctccactt aga

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial : iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAACCGGG GCATCGAAAC TTA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial : iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaacagta tgaccatg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial : iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaaaacgac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4334

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Corynebacterium glutamicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

361

363

364

Claims (22)

1. Un polipéptido aislado de Corynebacterium glutamicum, estando implicada dicha proteína en el metabolismo de metionina y lisina y comprendiendo la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.

2. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente secuencias de aminoácidos heterólogas.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína de la reivindicación 1.

4. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 3, en donde dicho ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o un complemento de la misma.

5. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.

6. El vector de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente uno o más ácidos nucleicos que codifican proteínas implicadas en caminos metabólicos.

7. El vector de la reivindicación 6, en donde los ácidos nucleicos segundo y ulteriores se seleccionan de las secuencias de número impar enumeradas en la Tabla 1, con inclusión de cualquier molécula de ácido nucleico designada F.

8. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, que es un vector de expresión.

9. Una célula hospedadora transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 8, en donde dicha célula es un microorganismo.

10. La célula hospedadora de la reivindicación 9, en donde la célula pertenece al género Corynebacterium o Brevibacterium.

11. La célula de la reivindicación 10, seleccionada del grupo constituido por

Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrilophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium heali, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum, y las cepas expuestas en la Tabla 3.

\vskip1.000000\baselineskip

12. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 ó 11, en donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico da como resultado la modulación de la producción de metionina y/o lisina.

13. Un método de producción de un polipéptido de la reivindicación 1, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 9 en un medio de cultivo apropiado.

14. Un método de producción de un producto químico fino, que comprende cultivar una célula de la reivindicación 12.

15. Un método de la reivindicación 14, en donde dicha célula se cultiva en presencia de una fuente de azufre.

16. El método de la reivindicación 14, en donde dicho método comprende adicionalmente el paso de recuperar el producto químico fino de dicho cultivo.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14, 15 ó 16, en donde el producto químico fino es un aminoácido.

18. El método de la reivindicación 17, en donde el aminoácido es metionina o lisina.

19. Un método para producir un producto químico fino que comprende cultivar una célula cuyo DNA genómico ha sido alterado por la inclusión de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.

20. El método de la reivindicación 19, en el cual el DNA genómico de la célula ha sido alterado ulteriormente por la inclusión de un ácido nucleico que codifica una proteína implicada en caminos metabólicos.

\newpage

21. El método de la reivindicación 20, en el cual dicho ácido nucleico adicional se selecciona de las secuencias de número impar enumeradas en la Tabla 1, con la exclusión de cualquier molécula de ácido nucleico designada F.

22. El método de las reivindicaciones 19 ó 20, en el cual la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo constituido por los genes metC, metB, metA, metE, metH, hom, asd, lysC, lysC/ask, rxa00657, dapA, dapB, dapC, dapD/argD, dapE, dapF, LysA, ddh, lysE, lysG, lysR, hsk, ppc, pycA, accD, accA, accB, addD, genes gpdh o cualquier combinación de los genes arriba mencionados.