CN103382492B - L-氨基酸或核酸的生产方法 - Google Patents

L-氨基酸或核酸的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及L-氨基酸或核酸的生产方法，具体地涉及一种生产L-氨基酸或核酸的方法，包括在具有搅拌叶轮的发酵罐内的液体培养基中培养具有生产L-氨基酸或核酸的能力的微生物，根据需要向培养基中添加晶种，从而在该培养基中生成并蓄积L-氨基酸或核酸的晶体，并且从培养物收集L-氨基酸或核酸的晶体，其中，在晶体析出后或添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度控制在2.4kW/m3以下。

Description

L-氨基酸或核酸的生产方法
本申请是申请日为2008年01月09日，申请号为“200880005616.0”(国际申请号为“PCT/JP2008/050135”)，名称为“L-氨基酸或核酸的生产方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及发酵工业，是一种通过利用微生物的发酵方法在析出L-氨基酸或核酸的同时进行培养的方法。
背景技术
L-氨基酸是使用具有L-氨基酸生产能力的属于棒状杆菌型细菌或肠杆菌科的氨基酸生产菌采用发酵方法工业生产的。作为这些氨基酸生产菌，为了提高生产率，使用了从自然界分离的菌株或该菌株的人工突变株、或者通过基因重组而增强了L-氨基酸生物合成酶的重组体等。
例如，在L-色氨酸发酵中，可以例举增强了邻氨基苯甲酸合成酶活性、磷酸甘油酸脱氢酶活性、色氨酸合酶活性的细菌(专利文献1)，以及扩增了色氨酸操纵子的细菌(专利文献2～4)。
此外，在L-谷氨酸发酵中，可以例举通过增强谷氨酸脱氢酶基因(gdh)、异柠檬酸脱氢酶基因(icdA)、顺乌头酸水化酶基因(acnA,acnB)以及柠檬酸合酶基因(gltA)来增加L-谷氨酸的生产能力的技术(专利文献5)。
此外，在L-苏氨酸发酵中，可以例举强化了天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、由thr操纵子所编码的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)、苏氨酸合酶基因(thrC)的微生物(专利文献6)等。
通过上述微生物的选育、生产方法的改良，L-氨基酸的生产能力得到了相当程度的提高，但为了应对今后更加旺盛的需求，需要开发更廉价且有效率的L-氨基酸生产方法。
另一方面，在使培养液中蓄积的L-氨基酸晶析的同时进行发酵的方法是已知的(专利文献7、8)。此外，对于L-谷氨酸而言，已经公开了使用能够在析出L-谷氨酸的同时蓄积L-谷氨酸的微生物来生产L-谷氨酸的方法(专利文献9)。此外，还已知晶析发酵法，其中将平均粒径1～120μm的氨基酸晶体添加到培养基中(专利文献10)。
然而，与常规的不析出晶体的发酵相比，上述方法的生产率不足，需要进一步加以改良。
专利文献1WO94/08031号
专利文献2特开昭57-71397号
专利文献3特开昭62-244382号
专利文献4美国专利第4,371,614号
专利文献5特开昭63-214189号
专利文献6特开2001-346578号
专利文献7特开昭62-288号
专利文献8欧洲专利公报第1078989号
专利文献9美国专利第6905819号
专利文献10WO06/109830号
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的一个目的是提高使用微生物使L-氨基酸或核酸的晶体在析出的同时蓄积在培养基中的发酵生产中的生产率。
解决问题的方法
通常认为，发酵过程中搅拌叶轮功率密度的降低会给发酵带来不利的影响。然而，本发明人经过深入研究后发现，在使L-氨基酸或核酸析出并蓄积的发酵中，通过在晶体析出后或添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度控制在一定水平以下，可以提高L-氨基酸的生产性。从而完成了本发明。
即，本发明如下述。
(1)一种生产L-氨基酸或核酸的方法，包括在具有搅拌叶轮的发酵罐内的液体培养基中培养具有生产L-氨基酸或核酸的能力的微生物，并根据需要向培养基中添加晶种，从而在该培养基中生成并蓄积L-氨基酸或核酸的晶体，并且从培养物中收集L-氨基酸或核酸的晶体；其特征在于，在晶体析出后或添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度控制在2.4kW/m3以下。
(2)前文所述的方法，其特征在于，所述晶体析出后或添加晶种后的搅拌叶轮的功率密度为0.5kW/m3以上。
(3)前文所述的方法，其特征在于，在进行培养的同时将晶体析出前或添加晶种前的搅拌叶轮的功率密度控制在3.0kW/m3以上。
(4)前文所述的方法，其中，所述微生物是属于肠杆菌科的微生物。
(5)前文所述的方法，其中，所述微生物是棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属细菌。
(6)前文所述的方法，其中，所述L-氨基酸是选自L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸或它们的衍生物中的1种或2种以上的L-氨基酸。
(7)前文所述的方法，其中，所述核酸是选自肌苷、腺苷、鸟苷、黄苷、肌苷酸、腺苷酸、鸟苷酸、黄苷酸或它们的衍生物中的1种或2种以上的核酸。
具体地，本发明涉及如下方面：
1.一种生产L-氨基酸或核酸的方法，包括在具有搅拌叶轮的发酵罐内的液体培养基中培养具有生产L-氨基酸或核酸的能力的微生物，根据需要向培养基中添加晶种，从而在该培养基中生成并蓄积L-氨基酸或核酸的晶体，并且从培养物中收集L-氨基酸或核酸的晶体；其特征在于，在晶体析出后或添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度控制在2.4kW/m3以下。
2.项1所述的方法，其特征在于，所述晶体析出后或添加晶种后的搅拌叶轮的功率密度为0.5kW/m3以上。
3.项1所述的方法，其特征在于，在进行培养的同时将晶体析出前或添加晶种前的搅拌叶轮的功率密度控制在3.0kW/m3以上。
4.项1～3中任一项所述的方法，其中，所述微生物是属于肠杆菌科的微生物。
5.项1～3中任一项所述的方法，其中，所述微生物是棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属细菌。
6.项1～5中任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸是选自L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸或它们的衍生物中的1种或2种以上的L-氨基酸。
7.项1～6中任一项所述的方法，其中，所述核酸是选自肌苷、腺苷、鸟苷、黄苷、肌苷酸、腺苷酸、鸟苷酸、黄苷酸或它们的衍生物中的1种或2种以上的核酸。
附图简要说明
图1发酵装置的概要图。显示了从发酵罐收集目的物质。
图2显示搅拌叶轮的搅拌功率密度与L-色氨酸生产速度的图。
图3显示搅拌叶轮的搅拌功率密度与L-谷氨酸生产速度的图。
图4显示搅拌叶轮的搅拌功率密度与L-苏氨酸生产速度的图。
实施发明的最佳模式
＜1＞本发明的生产方法
本发明的方法是这样的方法：一种L-氨基酸或核酸的生产方法，包括在具有搅拌叶轮的发酵罐内的液体培养基中培养具有生产L-氨基酸或核酸的能力的微生物，并根据需要向培养基中添加晶种，从而在该培养基中生成并蓄积L-氨基酸或核酸的晶体，并且从培养物中收集L-氨基酸或核酸的晶体；其特征在于，在晶体析出后或者添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度(每单位发酵液的功率)控制在2.4kW/m3以下。
在本发明中，对于“L-氨基酸”没有特殊限制，只要其在使用微生物进行的发酵方法中能够析出同时蓄积在培养基中即可，包括例如：L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-瓜氨酸等碱性氨基酸，L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-甘氨酸等脂肪族氨基酸，L-苏氨酸、L-丝氨酸等属于羟基单氨基羧酸的氨基酸，L-脯氨酸等环式氨基酸，L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸，L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸等含硫氨基酸，L-谷氨酸、L-天冬氨酸等酸性氨基酸，以及L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等在侧链上具有酰胺基的氨基酸。
优选地，可以例举疏水性氨基酸、酸性氨基酸以及在侧链上具有酰胺基的氨基酸。特别优选地，作为疏水性氨基酸，可以例举属于脂肪族氨基酸的L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸，属于芳香族氨基酸的L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸；作为酸性氨基酸，可以例举L-谷氨酸、L-天冬氨酸，作为在侧链上具有酰胺基的氨基酸，可以例举L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等。
此外，本发明的L-氨基酸中还包括以上述氨基酸为起始物质而获得的L-氨基酸衍生物，包括例如GABA、对羟基-D-苯基甘氨酸、DOPA、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸等。
通过本发明生产的L-氨基酸或核酸可以是1种，也可以是2种或更多。
在本发明中，对于“核酸”没有特殊限制，只要其在使用微生物进行的发酵方法中能够在析出同时蓄积在培养基中。核酸包括例如嘌呤核苷、嘌呤核苷酸等。嘌呤核苷中包括肌苷、黄苷、鸟苷、腺苷等，嘌呤核苷酸中包括嘌呤核苷的5’-磷酸酯、例如肌苷酸(肌苷-5’-磷酸，以下也称“IMP”)、黄苷酸(黄苷-5’-磷酸，以下也称“XMP”)、鸟苷酸(鸟苷-5’-单磷酸，以下也称“GMP”)、腺苷酸(腺苷-5’-单磷酸。以下也称“AMP”)等。此外，本发明的核酸中还包括以上述核酸为起始物质获得的核酸衍生物，可以例举出Ara-U(尿嘧啶阿拉伯糖苷)、ZVA(Z-伐昔洛韦(Z-valacyclovir))等。而且，在本发明中，有些情况下将上述L-氨基酸、核酸或它们的衍生物表述为“目的物质”。
搅拌叶轮是用来搅拌发酵罐中的液体培养基的，对其形状没有限制。通常，搅拌叶轮由轴和设置在轴上的叶片(blade)构成，叶片或其一部分也可以构成轴。此外，通常搅拌叶轮以轴为中心旋转，但也可以以其它形式工作。作为叶片的形状，可以使用涡轮形、平桨形、螺旋桨形、锚形、带形等，对其没有限制。此外，对于叶片的个数、各个叶片的配置也没有特殊限制。搅拌叶轮是通过发动机等动力机器将动力传至轴而工作的。关于搅拌叶轮，可以参考例如《化学工程便览》，化学工程协会编，修订第四版，1310～1311页，丸善株式会社(化学工学便覧化学工学協会編改訂四版1310～1311ページ丸善株式会社)。
在本发明中，搅拌叶轮的功率密度，是指每单位发酵液的搅拌叶轮的功率。搅拌叶轮的功率是这样计算的：从搅拌发酵液时的动力机器的功率(输出)减去搅拌空发酵罐时的动力机器的功率(输出)。具体而言，例如当动力机器是发动机时，动力可以根据发动机中流动的电流和发动机的效率来计算。此外，也可以通过制作反映发动机中流动的电流与功率之间关系的校准曲线，使用该校准曲线从电流进行换算，来测定功率。而且，可以使用转矩计或转矩传感器等测定转矩的机器来测定与搅拌叶轮相关的转矩，由该值根据下式计算出动力。
功率P[kW]＝T×2×π×n/1000
T：转矩[N·m]
n：搅拌叶轮的转数[/s]
用如上述测定的功率值除以培养基液体量而得到的值就是搅拌叶轮的功率密度。
在本发明中，优选对搅拌叶轮的功率密度加以控制，使晶体析出后或添加晶种后搅拌叶轮的功率密度为2.4kW/m3以下。理想的是，将搅拌叶轮的功率密度控制在更优选为2.0kW/m3以下，特别优选为1.5kW/m3以下，最优选为1.0kW/m3以下。此外，对于搅拌叶轮功率密度的下限没有特殊限制，只要不降低微生物的物质生产或者微生物的生长即可，优选控制在0.4kW/m3以上、优选0.5kW/m3以上、更优选0.6kW/m3以上、最优选0.7kW/m3以上。
在晶体析出后或添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度控制在上述范围，优选对其进行连续控制直至发酵结束。此外，只要将搅拌叶轮的功率密度基本上控制在上述范围内，暂时性地超出上述范围也是可以的。具体地说，如果从晶体析出后或添加晶种后直至发酵结束或目的物质的蓄积达到最高点为止的期间的50%以上、优选70%以上、更优选90%以上的时间内，搅拌叶轮的功率密度满足上述范围，搅拌叶轮的功率密度就基本上得到了控制。
优选的是，晶体析出前或添加晶种前搅拌叶轮的功率密度比上述晶体析出后或添加晶种后的范围高，优选为2.6kW/m3以上，更优选为2.8kW/m3以上，特别优选为3.0kW/m3以上。而且，只要搅拌叶轮的功率密度基本上控制在该范围内，暂时地低于上述范围是也可以的。具体地说，如果从发酵开始或后述的目的物质生产期起直至晶体析出或添加晶种为止的期间的50%以上、优选70%以上、更优选90%以上的时间内，搅拌叶轮的功率密度满足上述范围，搅拌叶轮的功率密度就基本上得到了控制。
在本发明中，如果目的物质的蓄积超过其饱和溶解度，或者超过过饱和状态，则会自然析出目的物质的晶体。因此，当微生物具有在培养基中蓄积超过饱和溶解度的量的目的物质的能力时，不需要进行使目的物质析出的操作，但也可以添加晶体来促进目的物质的析出。晶种是指为了这样的目的而根据需要向培养基中添加的晶体。晶种只要具有促进晶体析出的效果即可，不限于是目的物质，但理想的是目的物质，例如在L-色氨酸发酵中理想的是L-色氨酸。
至于所添加的晶种的浓度，当生产目的物质的微生物具有在发酵步骤中在培养基内析出晶体的能力时，优选是将0.5g/L以上、优选1g/L以上、更优选5g/L以上、更优选10g/L以上的晶种添加到培养基中。
当微生物不具有在培养基中蓄积超过饱和溶解度的量的目的物质的能力时，必须在培养基中添加使得目的物质的浓度达到饱和溶解度以上的量的目的物质。这种情况下，添加的目的物质可以是溶液，也可以是粉末或晶体；但优选至少包含晶体作为晶种。这种情况下，优选晶种的量为10g/L以上、优选20g/L、更优选30g/L、更优选50g/L以上。而且，在本发明中为了促进目的物质析出而添加的物质如无特殊说明也包括在晶种中，即使如前文所述那样在培养基中添加的目的物质为溶液或粉末。
此外，任何情况下，添加晶种的浓度上限没有限制，只要不是显著降低微生物的物质生产或者微生物的生长的浓度即可，适合地为100g/L以下、优选90g/L以下、更优选80g/L以下、特别优选70g/L以下。
添加晶种的时间可以是将具有目的物质生产能力的微生物接种至培养基之前、或者是将微生物接种至培养基后的培养期间中的任何时间，例如，优选是在将微生物接种至培养基后，从培养基中的目的物质浓度达到饱和溶解度时前后到培养基中析出目的物质的晶体之前；更优选培养基中的目的物质浓度处于过饱和状态，且在培养基中析出目的物质晶体之前。若以培养时间表示，则在下述时间添加是理想的：距培养开始或后述的目的物质生产期的起始点5小时后、理想地为10小时后、更理想地为15小时后、更理想地为20小时后、最理想地为25小时后，或者上述时间的附近。此外，当以目的物质的总培养时间或从目的物质生产期到培养结束的时间为1时，优选在经过了总体的0.2、优选0.3、更优选0.4的时间点上或它们的附近添加晶种。
这里，所谓饱和溶解度，是指液体培养基被目的物质饱和时溶解在液体培养基中的目的物质的浓度。即当目的物质的过饱和解除时目的物质所达到的恒定浓度。
各L-氨基酸以及核酸的溶解度如表1、2所示，优选在达到这些浓度时的前后添加晶种。
表1
L-氨基酸 溶解度(20°C)g/L 溶解度(40°C)g/L
L-色氨酸 10.6 14
L-苯丙氨酸 27.4 38
L-酪氨酸 0.38 0.75
L-异亮氨酸 41.2 44
L-亮氨酸 23.8 26
L-缬氨酸 57.5 65
L-谷氨酸 7.2 15
L-苏氨酸 90 122
L-谷氨酰胺 37.3 66
L-组氨酸 38 58
L-天冬氨酸 6.0 8.3
L-半胱氨酸 160
L-胱氨酸 0.09
表2
核苷、核苷酸 溶解度(20°C)g/L 溶解度(40°C)g/L
肌苷 44.4 83.4
鸟苷 0.42 1.05
腺苷 3.0 8.3
肌苷酸 137 241
鸟苷酸 206 260
在本发明中，所谓晶体析出后，是指培养液中超过目的物质的饱和溶解度，目的物质的晶体析出之后。此外，在本发明中，理想的是晶体析出前或添加晶种前搅拌叶轮的功率比晶体析出后或添加晶种后高。而且，晶体析出前或添加晶种前的搅拌叶轮的功率只要在适合微生物生长的范围内即可，理想的是控制在2.4kW/m3以上、优选2.6kW/m3以上、更优选2.8kW/m3以上、更优选3.0kW/m3以上、最优选3.2kW/m3以上。
此外，本发明的方法可以包含使具有目的物质生产能力的微生物增殖的阶段(增殖期)和产生目的物质的阶段(目的物质生产期)。在这种情况下，优选在增殖期使微生物充分生长，而在目的物质生产期最大限度地蓄积目的物质。此外，目的物质析出或添加晶种的时间优选为增殖期的最后阶段或目的物质生产期。晶种的添加可以一次进行，也可以分2次或3次以上来添加，而且还可以连续地进行。
本发明中的“增殖期”，是指碳源主要用于菌体生长的时期，即微生物进行对数增殖的时期；本发明中的“目的物质生产期”，是指从培养开始起10小时以后、优选15小时以后、特别优选20小时以后，碳源主要用于L-氨基酸生产的时期。
对于增殖期中搅拌叶轮的功率没有特殊限制，只要在适于微生物生长的范围即可，具体地说，与前文所述的晶体析出前或添加晶种前的搅拌叶轮的功率的情况相同。
本发明中使用的培养基可以是任何培养基，只要其包含碳源、氮源作为营养源即可。此外，本发明的方法可以采用分批培养(batch culture)、流加培养(Fed-batch culture)、连续培养法(continuous culture)中的任何方法。
这里，在本发明中，上述流加培养是指下述培养方法：将培养基连续地或间歇地添加至培养中的容器中，并且在培养完成之前不从容器中取出培养基。此外，所谓连续培养，是指这样的培养方法：连续地或间歇地将培养基流加至培养中的容器中，同时从容器中取出培养基(通常而言，等于所流加的培养基的量)。“初始培养基”的意思是在流加培养或连续培养中，流加流加培养基之前的分批培养中所用的培养基；“流加培养基”的意思是在进行流加培养或连续培养时，提供至发酵罐的培养基。流加培养基中可以包含微生物生长所必需的全部成分，也可以仅包含这些成分中的一部分。此外，在本发明中，“发酵培养基”是指发酵罐中的培养基，可从该发酵培养基回收目的物质。此外，在本发明中，“发酵罐”是指进行目的物质生产的容器，其形状不限，例如可以使用发酵槽，也可以使用小型发酵罐。此外，其容量只要是能够生成、回收目的物质的容量即可。
作为用于本发明的培养基中包含的碳源，可以使用葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物、糖蜜等糖类，特别是优选葡萄糖、蔗糖。除此之外，醋酸、柠檬酸等有机酸，乙醇、甲醇等醇类也可以单独或与其它碳源组合来加以使用。此外，可以使用的作为碳源的原料包括甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、高级漂白糖蜜(high test molasses)、柑桔糖蜜、转化糖，还可以使用纤维素、淀粉、玉米、谷物、木薯淀粉等天然原料的水解物。此外，培养液中溶解的二氧化碳也可以作为碳源使用。这些碳源可以用于初始培养基，也可以用于流加培养基。培养基中可以仅含这些碳源中的1种，也可以包含2种以上。此外，初始培养基可以与流加培养基使用相同的碳源，也可以将流加培养基的碳源改变为与初始培养基不同。例如，有些情况下，初始培养基的碳源为葡萄糖，而流加培养基的碳源为蔗糖。
作为本发明的培养基中包含的氮源，可以使用氨气、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐等，pH调整中使用的氨气、氨水也可作为氮源利用。此外，还可以利用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆水解物等。培养基中可以只含这些氮源中的1种，也可以含有2种以上。这些氮源可以用于初始培养基，也可以用于流加培养基。此外，初始培养基、流加培养基中可以使用相同的氮源，也可以将流加培养基的氮源改变为与初始培养基不同。
此外，本发明的培养基中，除了碳源、氮源之外，优选还包含磷酸源。作为磷酸源，可以利用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、焦磷酸等磷酸多聚物等。
此外，本发明的培养基除碳源、氮源之外，还可以包含生长促进因子(具有生长促进效果的营养素)。能够使用的生长促进因子包括痕量金属、氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸以及含有前述物质的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白降解产物等。特别是对于芳香族氨基酸、支链氨基酸而言，因为生物合成系统是共有的，所以有些情况下，如后述的那样，微生物的目的氨基酸以外的生物合成被弱化。在这样的情况下，优选在培养基中添加生物合成系统被弱化了的氨基酸。例如，当目的氨基酸是L-色氨酸时，理想的是添加L-苯丙氨酸和/或酪氨酸；当目的氨基酸为L-苯丙氨酸时，理想的是添加L-色氨酸和/或L-酪氨酸(WO2003048374号小册子)。
作为微量金属类，可以例举铁、锰、镁、钙等；作为维生素，可以例举维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酸酰胺、维生素B12、吡哆醇、泛酸等。这些生长促进因子可以包含在初始培养基中，也可以包含在流加培养基中。
此外，在使用其生长需求氨基酸等的营养缺陷型突变株时，优选添补所需求的营养素。特别是，可在本发明中使用的L-氨基酸生产菌大多如后述地强化了L-氨基酸生物合成途径，而弱化了L-氨基酸分解能力，因此，理想的是添加选自L-赖氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1种或2种以上。对于核酸生产菌，同样地优选在培养基中添加必要的物质。
初始培养基和流加培养基的培养基组成可以相同，也可以不同。而且，当流加培养基的流加分多个阶段进行时，各流加培养基的组成可以相同，也可以不同。
对于培养而言，优选在发酵温度20～45℃、特别优选30～42℃下进行通气培养。作为供给至发酵罐的气体，除空气之外，可以将高浓度氧与空气同时供给，提高供给气体中的氧浓度(参照特公平05-048117号公报、特公平5-39594号公报)。
氧供给量可以是使得培养基中的氧浓度为2～4ppm的量，优选以1/10～1.5/1VVM供给包含氧浓度40%～100%的高浓度氧与空气的混合气体。高浓度氧可以使用氧浓缩器制备。这里，氧浓缩器有PSA式、氧富集膜式，可以采用用蒸发器将液态氧气化后供给到发酵罐中、或者将液态氧直接供给到发酵罐中的方法。
此外，将pH控制在5～9来进行通气培养。当培养过程中pH下降时，例如可以加入碳酸钙，或用氨气、氨气水等碱来中和。而且，当目的氨基酸为酸性氨基酸例如L-谷氨酸时，希望在pH3～9、优选3～5的条件下进行。通过在这样的条件下优选培养10小时～120小时左右，培养液中可蓄积显著量的目的物质。蓄积的目的物质的浓度只要是比野生株高，且能够从培养基中收集、回收的浓度即可，对于L-氨基酸而言，优选为50g/L以上、优选75g/L以上、更优选100g/L以上，对于核酸而言，优选为50g/L以上、优选75g/L以上、更优选100g/L以上。
从培养结束后的培养液中收集目的物质的方法可以采用公知的回收方法来进行。例如，析出到培养基中的目的物质可以通过离心分离或过滤等来回收。此外，对于析出到培养基中的目的物质，可以在溶解于培养基中的目的物质晶析后一并加以分离。
在本发明中，为了确保目的物质的蓄积高于一定水平，可以将微生物的培养分为种子培养(seed culture)和主培养(main culture)来进行，例如，种子培养可通过使用培养瓶等的振荡培养或通过分批培养来进行，而主培养可以以流加培养、分批培养或连续培养的方式进行；或者，种子培养和主培养均可以以分批培养的方式进行。此外，在种子培养和主培养之前，可以进行1次、2次或更多的前培养，顺次进行规模放大。
在采用这些培养方法时，可以在达到预定目的物质浓度时，取出一部分目的物质并添加新培养基，反复进行培养。新添加的培养基优选是包含碳源以及具有生长促进效果的营养素(生长促进因子)的培养基。作为碳源，优选葡萄糖、蔗糖、果糖，作为生长促进因子优选氮源、磷酸、氨基酸等。作为氮源，可以使用氨、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐等。此外，作为磷酸源，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，作为氨基酸，在使用营养缺陷型突变株的情况下，优选补加所要求的营养素。
本发明中，当进行流加培养或连续培养时，可间歇地流加流加培养基，使糖或营养源的供给暂时停止。此外，优选的是，停止流加培养基供给的时间为流加进行时间的至多30%，理想的是至多20%，特别理想的是至多10%。当间歇流加流加培养液时，可添加一定时间的流加培养基，并如下控制第二次及以后的添加：在某个添加期前面的添加停止期中发酵培养基内碳源耗尽时pH的上升和溶氧浓度的上升通过计算机被检测到时，即开始添加；并且因此培养罐(culture tank)中的基质浓度可一直自动地保持在低水平(美国专利5,912,113号说明书)。
作为碳源，优选葡萄糖、蔗糖、果糖；作为生长促进因子，优选氮源、磷酸、氨基酸等。作为氮源，可以使用氨、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐等。此外，作为磷酸源，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，作为氨基酸，在使用营养缺陷型突变株时，优选添补所要求的营养素。此外，流加培养基可以是1种，也可以混合2种以上的培养基。在使用2种以上的流加培养基时，这些培养基可以混合起来通过1个进料罐流加，也可以通过多个进料罐流加。
此外，在进行流加培养时，优选这样进行流加，使得作为流加培养液或者发酵培养基总体的碳源量的糖量不超过30g/L，优选控制在20g/L以下、10g/L以下。特别是优选控制糖浓度使得微生物的对数生长结束以后的糖浓度在所述浓度范围内。碳源的流加速度可以采用美国专利5,912,113号说明书记载的方法来控制。此外，优选以这样的浓度流加糖和磷酸，使得糖和磷酸成为菌体生长的限制因子；流加培养液中包含的磷酸的量以P/C比计为2以下、优选1.5以下、更优选1以下(参照美国专利5,763,230号说明书)。
在将连续培养方法用于本发明时，可以同时进行取出和流加；也可以取出一部分后再进行流加。此外，所述方法也可以是对菌体进行再利用的连续培养方法，其中将包含目的物质和细胞的培养液取出，并且仅将细胞返回到发酵罐中(参照法国专利号2669935号说明书)。作为连续或间歇流加营养源的方法，使用与流加培养中所用的相同方法。
这里，在间歇地取出培养液的情况下，可以在达到预定的目的物质浓度时取出一部分目的物质，并且新添加培养基以进行培养。此外，优选进行培养使添加的培养基的量最终与取出之前培养液的量为等量。这里，“等量”的意思是取出之前培养液量的大约93～107%的量。
在将培养液连续取出的情况下，优选在流加营养培养基的同时或之后开始取出。例如，取出开始于流加开始之后的至多5小时后，优选3小时后，更优选至多1小时后。此外，至于培养液的取出量，优选取出的量和流加的量为等量。
所谓再利用菌体的连续培养方法，是如下所述的方法：在达到了预定的目的物质浓度水平时，将发酵培养基间歇或连续地取出，仅取出目的物质，并且将包含菌体的过滤残余物或离心上清液再循环到发酵罐中，这种方法可通过参考例如法国专利号2669935说明书来实施。
此外，可以在培养过程中从发酵罐中取出采用本发明的晶析方法析出的晶体。具体地，可以采用通过下述方法来提高生产性的方法：在发酵罐中采用本发明的方法进行晶析发酵，从发酵液中取出包含目的物质、菌体的发酵液，对目的物质的晶体进行离心处理、浓缩，取出晶体，将发酵液返回到发酵罐中。例如可以采用下述方法：在图1所示的装置中，包含目的物质、菌体的发酵液从管线A开始循环，将目的物质的晶体通过离心处理B加以浓缩并通过管线C取出，将发酵液通过管线D返回发酵罐。此时，可以将菌体返回发酵罐，也可以不返回发酵罐。晶体的离心分离处理适合使用液体旋流器(特开平5-92944)。
而且，在核酸的生产方法中，通过使嘌呤核苷磷酸化酶和磷酸核糖转移酶作用于采用本发明的方法生产的肌苷或鸟苷，可以获得5’-肌苷酸或者5’-鸟苷酸。
此外，还可以使磷酸转移酶作用于使用本发明的微生物生产的嘌呤核苷来对其进行磷酸化，来生产嘌呤核苷酸(核苷-5’-磷酸酯)(特开2000-295996)。例如，可以采用下列方法：使用导入了编码大肠杆菌肌苷鸟苷激酶的基因的埃希氏菌属细菌的嘌呤核苷酸生产方法(WO91/08286号小册子)、使用导入了编码乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)肌苷鸟苷激酶的基因的产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammnoniagenes)的嘌呤核苷酸生产方法(WO96/30501号小册子)。
此外，还可以通过使利用本发明的微生物生产的嘌呤核苷与选自多聚磷酸、苯基磷酸、氨甲酰基磷酸中的磷酸供体、以及具有生成核苷-5’-磷酸酯的能力的微生物或酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)相互作用，来生产嘌呤核苷酸(核苷-5’-磷酸酯)。对于具有生成核苷-5’-磷酸酯能力的微生物没有特殊限制，只要是具有将嘌呤核苷转化为嘌呤核苷酸的能力的微生物即可，例如，可以例举诸如国际公开小册子WO9637603号记载的微生物。
此外，还有诸如特开平07-231793公开的蟑螂埃希氏菌(Escherichiablattae)JCM1650、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)ATCC33105、植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)IFO14939(ATCC33531)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IFO3318(ATCC8724)、土生克雷伯氏菌(Klebsiellaterrigena)IFO14941(ATCC33257)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)IFO3168、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)IFO12010、产气肠杆菌IFO13534(ATCC13048)、河生色杆菌(Chromobacterium fluviatile)IAM13652、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)IFO12614、拉氏西地西菌(Cedecea lapagei)JCM1684、Cedecea davisiae JCM1685、奈氏西地西菌(Cedecea neteri)JCM5909等。
作为酸性磷酸酶，例如可以使用诸如特开2002-000289公开的酸性磷酸酶，更优选可以使用对核苷的亲和性提高的酸性磷酸酶(参照特开平10-201481)或核苷酸酶活性降低的突变型酸性磷酸酶(参照WO9637603)、磷酸酯水解活性降低的突变型酸性磷酸酶(特开2001-245676)等。
还可以通过对利用本发明的微生物生产的嘌呤核苷进行化学磷酸化，来获得嘌呤核苷酸(Bulletin of the Chemical Society of Japan42，3505)。此外，还可以采用下列方法：利用微生物所具有的ATP再生系统，使本发明的具有XMP生产能力的微生物与XMP氨基化酶(アミナーゼ)活性偶联来获得GMP的方法、使其与肌苷激酶偶联来获得IMP的方法(Biosci.Biotech.Biochem.,51,840(1997),特开昭63-230094)。
就上述嘌呤核苷酸的生产中使用的、采用本发明的方法生产的肌苷或鸟苷或嘌呤核苷而言，可以是经过纯化的，也可以是嘌呤核苷的发酵液或含嘌呤核苷的粗纯化品。
<2>能够用于本发明的微生物
对于本发明中使用的微生物没有特殊限制，只要该微生物具有L-氨基酸或核酸生产能力，且在液体培养基中进行培养时能够在培养基中蓄积L-氨基酸或核酸即可。蓄积的L-氨基酸或核酸的量可以是任意的，只要能够蓄积到可从培养基中回收的程度即可，优选具有能够使目的物质从培养基中晶析出来的能力，例如，理想的是能够蓄积所述表1、2中记载的浓度以上的浓度的目的物质。
例如，如果降低含L-谷氨酸的水溶液的pH，则L-谷氨酸在γ-羧基的pKa(4.25)附近溶解度显著减少，在等电点(pH3.2)处的溶解度达到最低。虽然因培养基组成而异，但通常来说，L-谷氨酸在约30℃的条件下，pH3.2时溶解10～20g/L，pH4.0时溶解30～40g/L，pH4.7时溶解50～60g/L。
作为用于本发明的微生物或者用于选育该微生物的亲本株，可以使用以埃希氏菌属(Escherichia)细菌、泛菌属(Pantoea)细菌为代表的属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的微生物，或者使用棒状杆菌型细菌等。此外，也可以使用能够由甲醇生产L-氨基酸的甲醇同化细菌，例如甲基菌属(Methylobacillus)细菌、嗜甲基菌属(Methylophilus)细菌等。其它属于肠杆菌科的微生物的实例包括肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯杆菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)和摩根氏菌属(Morganella)等属于γ-变形细菌(γ-Proteobacteria)的肠杆菌科细菌。此外，作为其它微生物，可以例举：脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)细菌、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌以及属于酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)等的酵母等。
作为埃希氏菌属细菌的实例，可以利用Neidhardt等的著作(Neidhardt，F.C.等，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，American Society forMicrobiology，Washington，D.C.，1028，表1)中所列的，例如大肠杆菌等。作为大肠杆菌的野生株，可以例举K12株或其衍生株、大肠杆菌MG1655株(ATCC47076)、以及大肠杆菌W3110株(ATCC27325)等。这些在例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，地址：P.O.Box1549，Manassas，VA20108，1，United States of America)有分售。即，每个菌株都被给予登录号，可以利用该登录号订购该菌株。与各菌株对应的登录号记载在美国典型培养物保藏中心的产品目录中(参照http：//www.atcc.org/)。
此外，肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等；泛菌属细菌的实例包括Pantoeaananatis。而且，在近几年中，基于16S rRNA核苷酸序列分析，有些成团肠杆菌被重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis和斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等。在本发明中，可以使用归类在肠杆菌科中的任何细菌，无论属于肠杆菌属或泛菌属均可。在利用基因工程手段选育Pantoea ananatis的场合，Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)和它们的衍生物均可使用。这些菌株在当初分离时被鉴定为成团肠杆菌，并进行了保藏。但如上所述，通过使用16S rRNA核苷酸序列的分析，已将它们重分类为Pantoea ananatis。
作为嗜甲基菌属细菌，具体地可以例举：食甲基嗜甲基菌(Methylophilusmethylotrophus)，作为其代表性菌株可以例举出AS1菌株(NCIMB10515)等。食甲基嗜甲基菌AS1菌株可以从国立工业和海洋细菌保藏中心(National Collections of Industrial and Marine Bacteria，地址：NCIMB Lts.，Torry Research Station135，Abbey Road，Aberdeen AB98DG，UnitedKingdom)获得。
作为甲基菌属细菌，具体地可以例举：糖原甲基菌(Methylobacillusglycogenes)、鞭毛甲基菌(Methylobacillus flagellatum)等。作为糖原甲基菌，可以例举T-11菌株(NCIMB11375)、ATCC21276菌株、ATCC21371菌株、ATR80菌株(见Appl.Microbiol.Biotechnol.，(1994)，第42卷，p67-72记载)和A513菌株(见Appl.Microbiol.Biotechnol.，(1994)，第42卷，p67-72记载)等。糖原甲基菌NCIMB11375菌株可以从国立工业和海洋细菌保藏中心(National Collections of Industrial and Marine Bacteria，地址：NCIMB Lts.，Torry Research Station135，Abbey Road，Aberdeen AB98DG，United Kingdom)获得。此外，鞭毛甲基菌包括例如KT菌株(见Arch.Microbiol.，1988，第149卷，pp.441-446记载)等。
作为棒状杆菌型细菌，可以利用下述微生物：它们是在《Bergey’s Manualof Determinative Bacteriology》第8版599页(1974)中定义的一组微生物，被分类为需氧性、革兰氏阳性、非耐酸性、无芽孢形成能力的杆菌。此外，棒状杆菌型细菌包括曾经归类于短杆菌属(Brevibacterium)、但现在已经统一归类于棒杆菌属(Corynebacterium)的那些细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，并且还包括属于与棒杆菌属极其近缘的短杆菌属或微杆菌属(Microbacterium)的细菌。
这样的棒状杆菌型细菌的实例如下。
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)
美棒杆菌(Corynebacterium callunae)
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)
栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)
二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)
Brevibacterium immariophilum
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)
生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)
白色棒杆菌(Brevibacterium album)
蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)
具体而言，可包括例如以下菌株：
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870
醋谷棒杆菌ATCC15806
烷醇棒杆菌ATCC21511
美棒杆菌ATCC15991
谷氨酸棒杆菌ATCC13020、ATCC13032、ATCC13060
百合花棒杆菌ATCC15990
栖糖蜜棒杆菌ATCC17965
嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERM BP-1539)
力士棒杆菌ATCC13868
二歧短杆菌ATCC14020
黄色短杆菌ATCC13826、ATCC14067、AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC14068
乳发酵短杆菌ATCC13869(谷氨酸棒杆菌ATCC13869)
玫瑰色短杆菌ATCC13825
解糖短杆菌ATCC14066
生硫短杆菌ATCC19240
产氨棒杆菌ATCC6871、ATCC6872
白色短杆菌ATCC15111
蜡状短杆菌ATCC15112
嗜氨微杆菌ATCC15354
这些菌株在例如美国典型培养物保藏中心(地址P.O.Box1549，Manassas，VA2010812301Parklawn Drive，Rockville，Maryland20852，UnitedStates of America)有分售。此外，根据布达佩斯条约的规定，将AJ12340菌株于1987年10月27日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)(305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM BP-1539。此外，根据布达佩斯条约的规定，将AJ12418菌株于1989年1月5日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号FERM BP-2205。
在使用芽孢杆菌属细菌时，芽孢杆菌属细菌的例子包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等。
作为枯草芽孢杆菌，可以例举枯草芽孢杆菌168Marburg(ATCC6051)、枯草芽孢杆菌PY79(Plasmid，1984，12，1-9)等；作为解淀粉芽孢杆菌，可以例举解淀粉芽孢杆菌T(ATCC23842)以及解淀粉芽孢杆菌N(ATCC23845)等。此外，作为短小芽孢杆菌，可以例举短小芽孢杆菌Gottheil No.3218(ATCC No.21005)(美国专利第3,616,206号)等。
以下描述将生产L-氨基酸或核酸的能力赋予如上所述的亲本菌株的方法。
为了赋予生产L-氨基酸或核酸的能力，可使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等的选育中常规使用的方法(参见《氨基酸发酵》(株)学会出版中心，1986年5月30日第1版，第77-100页)(アミノ酸発酵、(株)学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77～100頁)，如获得营养缺陷突变体、类似物抗性菌株或代谢调控突变体，或构建将L-氨基酸或核酸的生物合成系统酶的表达增强的重组菌株等。这里，在L-氨基酸生产菌的选育中，营养缺陷突变、类似物抗性、代谢调节突变等性质可以单独赋予一种，也可以赋予两种或三种以上。此外，表达增强的L-氨基酸生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。此外，也可以将营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶活性的增强相结合来进行。
具有生产L-氨基酸或核酸的能力的营养缺陷突变体菌株、L-氨基酸或核酸类似物抗性菌株或代谢调控突变体菌株可以这样获得：对亲本菌株或野生型菌株施以常规的突变处理，即用X-射线或紫外线照射处理，或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等处理；然后，从所得突变株中选择显示营养缺陷、类似物抗性或代谢调控突变、且具有L-氨基酸生产能力的那些菌株。
具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷型突变株、L-氨基酸类似物抗性株或代谢调控突变株可以这样获得：对亲本株或野生株实施常规的突变处理，即用X-射线或紫外线照射处理，或用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯(EMS)等诱变剂处理；然后，从所得突变株中选择显示营养缺陷、类似物抗性或代谢调控突变、且具有L-氨基酸生产能力的那些菌株。
以下，具体示例赋予氨基酸生产能力的方法和氨基酸生产菌。
L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸均为芳族氨基酸，并且共享生物合成系统。编码芳族氨基酸生物合成系统酶的基因的实例包括脱氧阿拉伯-庚酮糖酸磷酸合酶(deoxyarabino-heptulosonate phosphate synthase)(aroG)、3-脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)(aroA)和分支酸合酶(chorismate synthase)(aroC)(欧洲申请公开763127号说明书)。已知这些基因由酪氨酸抑制子(tyrR)调控，所以也可通过缺损tyrR基因来增加芳族氨基酸的生物合成系统酶活性(参考欧洲专利763127的说明书)。此外，酶名称后的括号内为基因名称(后文中亦然)。
此外，当强化各种氨基酸生产能力时，可以弱化目的芳族氨基酸以外的生物合成系统。例如当目的氨基酸为L-色氨酸时，可以减弱L-苯丙氨酸生物合成系统、L-酪氨酸生物合成系统(US4,371,614)。
此外，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroF，aroG)受到芳族氨基酸的反馈抑制，因此可以对其进行修饰，以使其不受反馈抑制。例如，对于aroF，可以将N末端起第147位的L-天冬氨酸或第181位的L-丝氨酸取代为其它氨基酸残基的突变型aroF基因导入宿主，而对于aroG，可以将N末端起第146位的L-天冬氨酸、第147位的L-甲硫氨酸、第150位的L-脯氨酸或第202位的L-丙氨酸中的1个氨基酸残基、或者第157位的L-甲硫氨酸和第219位的L-丙氨酸这两个氨基酸残基取代为其它氨基酸的突变型aroG基因导入宿主，从而获得芳族生产氨基酸生产菌(EP0488424)。
此外，作为与支链氨基酸的合成相关的基因，可以例举ilvGMEDA操纵子。该操纵子受L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的操纵子表达调控(弱化作用)，因此，通过使微生物携带除去或突变了弱化作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子，能够提高它们的L-氨基酸生产率。
芳族氨基酸、支链氨基酸分别共享生物合成系统，因此优选使用除目的L-氨基酸以外的芳族氨基酸、支链氨基酸的固有生物合成系统经过了弱化的菌株。例如，当目的氨基酸为L-色氨酸时，可以通过弱化L-苯丙氨酸、L-酪氨酸的固有生物合成系统；当目的氨基酸为L-苯丙氨酸时，可以通过弱化L-色氨酸、L-酪氨酸的固有生物合成系统；当目的氨基酸为L-缬氨酸时，可以通过减弱L-亮氨酸、L-异亮氨酸的固有生物合成系统；当目的氨基酸为L-异亮氨酸时，可以通过减弱L-缬氨酸、L-亮氨酸的固有生物合成系统；当目的氨基酸为L-亮氨酸时，可以通过减弱L-缬氨酸、L-异亮氨酸的固有生物合成系统，来获得高效生产目的L-氨基酸的菌株。可以通过下述方法实现弱化生物合成系统的目的：分别对编码该生物合成系统的酶的基因导入突变；以及使用含有由希望被弱化的生物合成系统所合成的L-氨基酸的合成培养基来获得在合成培养基中需要该L-氨基酸的菌株。
以下，例示出赋予L-氨基酸生产能力的方法以及能够在本发明中使用的被赋予了L-氨基酸生产能力的微生物。
L-色氨酸生产菌
L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本株的例子包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其色氨酰-tRNA合成酶缺陷，该酶由突变的trpS基因编码(美国专利5,756,345)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码不受丝氨酸反馈抑制性的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因(美国专利6,180,373)；色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRLB-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美国专利4,371,614)；磷酸烯醇丙酮酸的生产能力增加的大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美国专利6,319,696)等等。此外，还可以使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白的活性增强的属于埃希氏菌属的L-色氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本株的例子还包括增加了选自邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)和色氨酸合酶(trpAB)中的1种以上的酶的活性的菌株。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者都受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入使反馈抑制解除的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏型邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164、和通过将质粒pGH5(WO94/08031)导入大肠杆菌SV164而获得的转化菌株，所述质粒pGH5包含编码解除了反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的突变的serA基因。
此外，作为L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的例子，可以例举：增强了3-磷酸丝氨酸磷酸酶(serB)活性的菌株(US4,371,614)、增强了磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pckA)活性的菌株(WO2004/090125)、组成型表达马来酸合酶-异柠檬酸裂合酶-异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶操纵子(ace操纵子)或者增强了该操纵子的表达的菌株(WO2005/103275)。
L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本株的例子还包括导入了包含编码抑制解除型邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌株(特开昭57-71397号，特开昭62-244382号，美国专利第4,371,614)。此外，可以通过增加色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由α和β亚单位组成，这两种亚单位分别由trpA和trpB基因编码。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-马来酸合酶操纵子的表达来改进L-色氨酸生产能力(WO2005/103275)。
作为棒状杆菌型细菌，可以使用下列菌株：磺胺胍(sulfaguanidine)抗性株谷氨酸棒杆菌AJ12118(FERM BP-478，特许01681002号)、导入了色氨酸操纵子的棒状杆菌型细菌(特开S63240794号公报)，导入了编码棒状杆菌型细菌来源的莽草酸激酶的基因的棒状杆菌型细菌(特开01994749号公报)。
L-苯丙氨酸生产菌
L-苯丙氨酸生产菌或用于诱导L-苯丙氨酸生产菌的亲本株的例子包括，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)；保持有突变型pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC55371)(美国专利5,354,672)；大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)；大肠杆菌NRRL B-12141，NRRL B-12145，NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利4,407,952)等。此外，也可以使用大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERMBP-3566)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和命名为AJ12604的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](FERM BP-3579)作为亲本菌株(EP488424B1)。此外，还可使用增加了由yedA基因或yddG基因所编码的蛋白的活性的、属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
作为棒状杆菌型细菌中的苯丙氨酸生产菌，可以使用下列菌株：降低了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶活性的谷氨酸棒杆菌BPS-13株(FERMBP-1777)，K77(FERM BP-2062)和K78(FERM BP-2063)(欧洲专利公开公报331145，JP02303495)，酪氨酸营养缺陷株(JP05049489)等。
此外，对于苯丙氨酸生产菌，通过进行修饰使得将副产物摄入细胞内，例如通过增加L-色氨酸摄取基因tnaB或mtr或者L-酪氨酸摄取基因tyrP的表达量，也可以获得高效地生产L-苯丙氨酸的菌株(EP1484410)。
L-酪氨酸生产菌
作为酪氨酸生产菌的例子，包括具有不受酪氨酸抑制的脱敏型预苯酸脱水酶基因(tyrA)的埃希氏菌属细菌(欧洲专利申请公开1616940号公报)。
L-缬氨酸生产菌
L-缬氨酸生产菌或用于诱导L-缬氨酸生产菌的亲本株的例子包括但不限于经修饰而过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利第5,998,178号)。优选将ilvGMEDA操纵子的衰减所必需的区域移除以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。此外，优选将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。
用于衍生本发明的L-缬氨酸生产菌的亲本株的实例还包括在氨酰t-RNA合成酶中具有突变的突变株(美国专利第5,658,766号)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545Moscow，1st Dorozhny proezd，1)，保藏号为VKPM B-4411。
此外，还可以使用其生长需要硫辛酸(lipoic acid)和/或缺失H+-ATP酶的突变株(WO96/06926)作为亲本株。
作为棒状杆菌型细菌中的L-缬氨酸生产菌，包括例如通过修饰而增强了编码L-缬氨酸生物合成相关酶的基因的表达的菌株。L-缬氨酸生物合成相关酶的实例包括由ilvBNC操纵子编码的酶，即，由ilvBN编码的乙酰羟酸合酶、由ilvC编码的异构还原酶(isomero-reductase)(国际公开小册子WO00/50624号)。此外，由于ilvBNC操纵子受到L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的操纵子表达调控(transcriptional regulation)，所以最好解除弱化作用，以解除由所生成的L-缬氨酸导致的表达抑制。
作为具有L-缬氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，可以通过降低或者缺损至少一种与减少L-缬氨酸产生的物质代谢途径相关的酶的活性来进行。例如，可以考虑降低涉及L-亮氨酸合成的苏氨酸脱水酶的活性，或降低涉及D-泛酸合成的酶的活性(国际公开小册子WO0050624号)。
其它赋予L-缬氨酸生产能力的方法还包括例如赋予对氨基酸类似物等的抗性的方法。
例如，可以使用L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸营养缺陷性的、并对D-核糖、嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的、并且具有L-缬氨酸生产能力的突变菌株(FERM P-1841，FERM P-29，特公昭53-025034)，对聚酮类有抗性的突变菌株(FERM P-1763，FERM P-1764；特公平06-065314)，在以醋酸为唯一碳源的培养基中对L-缬氨酸有抗性、且在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中对丙酮酸类似物(氟丙酮酸(fluoropyruvic acid)等)敏感的突变菌株(FERM BP-3006，BP-3007，特许3006929号)。
L-异亮氨酸生产菌
L-异亮氨酸生产菌或用于诱导L-异亮氨酸生产菌的亲本株的例子包括，但不限于对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变株(特开平5-304969号)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸等具有抗性的突变株，以及对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变株(特开平5-130882号)。此外，还可以使用以编码涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白(如苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶(acetohydroxate synthase)等)的基因转化的重组菌株作为亲本株(特开平2-458号，FR0356739，和美国专利第5,998,178号)。
棒状杆菌型细菌中的L-异亮氨酸生产菌的例子包括：扩增了编码支链氨基酸分泌蛋白的brnE基因的棒状杆菌型细菌(特开2001-169788)、通过与L-赖氨酸生产菌进行原生质体融合而赋予了L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌(特开昭62-74293)、增强了高丝氨酸脱氢酶的棒状杆菌型细菌(特开昭62-91193)、苏氨酸氧肟酸(threonine hydroxamete)抗性菌株(特开昭62-195293)、α-酮丙二酸(α-ketomalonic acid)抗性菌株(特开昭61-15695)和甲基赖氨酸抗性菌株(特开昭61-15696)。
L-亮氨酸生产菌
L-亮氨酸生产菌或用于诱导L-亮氨酸生产菌的亲本株的例子包括，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPM B-7386，美国专利第6,124,121号))或对亮氨酸类似物(包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5,5,5-三氟亮氨酸等)有抗性的大肠杆菌菌株(特公昭62-34397号和特开平8-70879号)；通过WO96/06926中描述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(特开平8-70879号)，等等。
本发明的细菌可以通过增加涉及L-亮氨酸生物合成的一种以上的基因的表达来加以改进。这些基因的实例可优选例举以编码解除了L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶的突变leuA基因(美国专利第6,403,342号)为代表的leuABCD操纵子中的基因。此外，可以通过增加编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的一种以上的基因的表达来改进本发明的细菌。这类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。
棒状杆菌型细菌中的L-亮氨酸-生产菌的例子包括：2-噻唑丙氨酸和β-羟基亮氨酸抗性菌株(特开平8-266295)，缬氨酸类似物抗性菌株(特开昭63-248392)，缬氨酸营养缺陷菌株(特公昭38-4395)，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)抗性菌株(特公昭51-37347)以及苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸营养缺陷菌株(特公昭54-36233)。
L-谷氨酸生产菌
关于适合作为L-谷氨酸生产菌的菌株，可以例举出进行修饰使得编码L-谷氨酸生物合成相关酶的基因的表达增强的方法。作为L-谷氨酸生物合成相关酶，相关基因的实例包括但不限于编码如下酶的基因：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、顺乌头酸水合酶(acnA，acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA，pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)和葡糖磷酸异构酶(pgi)、甲基柠檬酸合酶(prpC)，等等。
经修饰而增强了柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因、丙酮酸脱氢酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达的菌株的实例包括在EP1078989A、EP955368A和EP952221A、EP1033407A中公开的那些菌株。
用于赋予L-谷氨酸生产能力的修饰，还可以通过降低或缺损下述酶的活性来实现，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径中分支而产生其它化合物的反应。这类催化从L-谷氨酸生物合成途径中分支并产生除L-谷氨酸外的化合物的反应的酶的实例包括异柠檬酸裂合酶(aceA)，α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)，乙酰羟酸合酶(acetohydorxy acid synthase)(ilvG)，乙酰乳酸合酶(ilvI)，甲酸乙酰转移酶(pfl)，乳酸脱氢酶(ldh)，谷氨酸脱羧酶(gadAB)，1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(1-pyrroline-5-carboxilate dehydrogenase)(putA)等。
例如，可以通过使用编码α-酮戊二酸脱氢酶的Elo亚基的sucA(odhA)基因来进行修饰，从而降低α-酮戊二酸脱氢酶的活性。α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的菌株包括例如如下菌株：
乳发酵短杆菌ΔS菌株(国际公开95/34672号小册子)
乳发酵短杆菌AJ12821(FERMBP-4172；参照法国专利公报9401748号说明书)
黄色短杆菌AJ12822(FERMBP-4173；参照法国专利公报9401748号说明书)
谷氨酸棒杆菌AJ12823(FERMBP-4174；参照法国专利公报9401748号说明书)
Pantoea ananatis AJ13601(FERM BP-7207)
植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)AJ13410菌株(FERM BP-6617)
Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)。
这里，Pantoea ananatis AJ13356因αKGDH-E1亚基基因(sucA)的破坏而缺损了α-酮戊二酸脱氢酶活性。该菌株在分离当时被鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)，作为成团肠杆菌AJ13356进行了保藏。但是，基于16S rRNA核苷酸序列等，其被重新分类为Pantoea ananatis。尽管AJ13356在上述保藏机构中是作为成团肠杆菌保藏的，在本说明书中仍将其描述为Pantoea ananatis。
而且，可以通过下述方法赋予棒状杆菌型细菌以L-谷氨酸生产能力：扩增yggB基因(NCgl1221；NP_600492.Reports small-conductance.[gi：19552490]；WO2006/070944)的方法，和导入编码区中导入了突变的突变型yggB基因的方法。
本发明的生产方法中使用的微生物可以是经过修饰而增强了D-木糖5-磷酸-磷酸酮醇酶和/或果糖6-磷酸磷酸酮醇酶活性的微生物。
对于D-木糖5-磷酸-磷酸酮醇酶活性以及果糖6-磷酸磷酸酮醇酶活性，可以仅活化其中的一种，也可以两种均加以活化。
其它赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法还包括赋予对有机酸类似物、呼吸链抑制剂等的抗性的方法，和赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。这类方法的实例包括赋予单氟乙酸抗性的方法(特开昭50-113209)、赋予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性的方法(特开昭57-065198)、弱化脲酶的方法(特开昭52-038088)、赋予丙二酸抗性的方法(特开昭52-038088)、赋予针对苯并吡喃酮或萘醌类的抗性的方法(特开昭56-1889)、赋予HOQNO抗性的方法(特开昭56-140895)、赋予α-酮丙二酸抗性的方法(特开昭57-2689)、赋予胍抗性的方法(特开昭56-35981)和赋予青霉素敏感性的方法(特开平4-88994)，等等。
这些抗性菌株的具体实例包括如下菌株：
黄色短杆菌AJ3949(FERM BP-2632；参考特开昭50-113209)
谷氨酸棒杆菌AJ11628(FERM P-5736；参考特开昭57-065198)
黄色短杆菌AJ11355(FERM P-5007；参考特开昭56-1889)
谷氨酸棒杆菌AJ11368(FERM P-5020；参考特开昭56-1889号公报)
黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；参考特开昭57-2689号公报)
谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；参考特开昭57-2689号公报)
黄色短杆菌AJ11564(FERM P-5472；参考特开昭56-140895号公报)
黄色短杆菌AJ11439(FERM P-5136；参考特开昭56-35981号公报)
谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004；参考特开平04-88994号公报)
乳发酵短杆菌AJ11426(FERM P-5123；参考特开平56-048890号公报)
谷氨酸棒杆菌AJ11440(FERM P-5137；参考特开平56-048890号公报)
乳发酵短杆菌AJ11796(FERM P-6402；参考特开平58-158192号公报)
L-苏氨酸生产菌
用于本发明的L-苏氨酸生产菌的优选实例包括增强了L-苏氨酸生物合成系统酶的属于肠杆菌科的细菌。编码L-苏氨酸生物合成系统酶的基因的实例包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、thr操纵子所编码的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)。可以导入这些基因中的两种以上。可将L-苏氨酸生物合成系统基因导入苏氨酸分解受阻抑的属于肠杆菌科的细菌中。苏氨酸分解受阻抑的埃希氏菌属细菌的实例包括例如苏氨酸脱氢酶活性缺损的TDH-6菌株(特开2001-346578号)等等。
L-苏氨酸生物合成系统酶的酶活性受终产物L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建L-苏氨酸生产菌，优选对L-苏氨酸生物合成系统酶进行修饰以使所述酶不受L-苏氨酸的反馈抑制。上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，苏氨酸操纵子形成弱化子(attenuator)结构。苏氨酸操纵子的表达受到培养液中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且表达受到弱化作用的抑制。可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现弱化作用的消除或降低(参照Lynn，S.P.，Burton，W.S.，Donohue，T.J.，Gould，R.M.，Gumport，R.I.，and Gardner，J.F.J.Mol.Biol.194：59-69(1987)；国际公开第02/26993号小册子；国际公开第2005/049808号小册子)。
苏氨酸操纵子上游存在天然启动子，可用非天然(non-native)启动子将其取代(参考WO98/04715号小册子)。或者，可以构建苏氨酸操纵子使得苏氨酸生物合成的相关的基因的表达受到λ噬菌体的阻遏物(repressor)和启动子的调控(参考欧洲专利第0593792号说明书)。而且，为了对埃希氏菌属细菌进行修饰使其不受L-苏氨酸的反馈抑制，可以通过选择对α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性的菌株来获得。
对于如上所述经修饰而不受L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子而言，优选的是其在宿主微生物中拷贝数增加，或者是其连接于强启动子而表达量增加。除了通过使用质粒的扩增来增加拷贝数，还可以通过使用转座子、Mu噬菌体等向基因组上转入苏氨酸操纵子来增加拷贝数。
对于天冬氨酸激酶III基因(lysC)，优选使用经过修饰而不受L-赖氨酸的反馈抑制的基因。这样的经过修饰而不受反馈抑制的lysC基因可使用美国专利5,932,453中描述的方法来获得。
理想的是，除了L-苏氨酸生物合成系统酶之外，还增强糖酵解系统、TCA循环和呼吸链中涉及的基因、调控这些基因表达的基因、和糖摄取基因。这些在L-苏氨酸生产中有效的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB)(欧洲专利733712号说明书)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(pepC)(国际公开95/06114号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(欧洲专利877090号说明书)、棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶基因(国际公开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)。
此外，增强赋予L-苏氨酸抗性的基因和/或赋予L-高丝氨酸抗性的基因的表达，或对宿主赋予L-苏氨酸抗性和/或L-高丝氨酸抗性，也是理想的。赋予抗性的基因的实例包括rhtA基因(Res.Microbiol.154：123-135(2003))、rhtB基因(欧洲专利申请公开第0994190号说明书)、rhtC基因(欧洲专利申请公开第1013765号说明书)和yfiK、yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)。此外，关于对宿主赋予L-苏氨酸抗性的方法，可参考欧洲专利申请公开第0994190号说明书、国际公开第90/04636号小册子记载的方法。
L-苏氨酸生产菌的例子包括大肠杆菌VKPM B-3996菌株(参照美国专利第5,175,107号说明书)。该VKPM B-3996菌株在1987年11月19日以登录号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms(VKPM)，GNII Genetika)(地址：Russia，117545Moscow，1st Dorozhny proezd，1)。此外，该VKPM B-3996菌株保持有质粒pVIC40(国际公开第90/04636号小册子)，所述质粒pVIC40是通过将苏氨酸生物合成系统基因(苏氨酸操纵子：thrABC)插入具有链霉素抗性标记的广谱载体质粒pAYC32(参照Chistorerdov,A.Y.和Tsygankov,Y.D.Plasmid，16，161-167(1986))中而获得的。在该pVIC40中，苏氨酸操纵子中的thrA所编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I解除了L-苏氨酸的反馈抑制。
此外，大肠杆菌VKPM B-5318株(参照欧洲专利第0593792号说明书)也是合适的L-苏氨酸生产菌的实例。VKPM B-5318菌株(分类命名为大肠杆菌TDH7\pPRT614)在1990年5月3日以登录号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms(VKPM)，GNII Genetika)(Russia，117545Moscow，1stDorozhny proezd，1)。该VKPM B-5318菌株是异亮氨酸非营养缺陷型菌株，并且携带如下所述而构建的重组质粒DNA：缺失了天然具有的转录调节区——弱化子区的苏氨酸操纵子(即苏氨酸生物合成相关基因)位于λ噬菌体温度敏感性C1阻遏物、PR启动子和Cro蛋白的N末端部分的下游，并且苏氨酸生物合成相关基因的表达受所述λ噬菌体阻遏物和启动子的调控。
L-谷氨酰胺生产菌
作为通过选育来赋予L-谷氨酰胺生产能力的方法，包括例如进行修饰而使得编码L-谷氨酰胺生物合成相关酶的基因的表达增强的方法。例如，作为L-谷氨酸生物合成相关的酶，可以例举谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶(特开2002-300887)。
用于赋予L-谷氨酰胺生产能力的修饰可以通过降低或缺损下述酶的活性来进行，所述酶催化从L-谷氨酰胺生物合成途径中分支而生成其它化合物的反应。例如，可以考虑降低细胞内的谷氨酰胺酶活性(特开2004-187684)。
为了通过选育来赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力，可以例举赋予对氨基酸类似物等的抗性的方法。实例包括：赋予6-重氮-5-氧-正亮氨酸抗性的方法(特开平3-232497)、赋予嘌呤类似物抗性和/或甲硫氨酸亚砜抗性的方法(特开昭61-202694)、赋予α-酮丙二酸抗性的方法(特开昭56-151495)、赋予对包含谷氨酸的肽的抗性的方法(特开平2-186994)等。
作为具有L-谷氨酰胺生产能力的棒状杆菌型细菌的具体例子，可以例举诸如下述的菌株。
黄色短杆菌AJ11573(FERM P-5492；参照特开昭56-151495公报)
黄色短杆菌AJ12210(FERM P-8123；参照特开昭61-202694公报)
黄色短杆菌AJ12212(FERM P-8123；参照特开昭61-202694公报)
黄色短杆菌AJ12418(FERM BP-2205；参照特开平2-186994公报)
黄色短杆菌DH18(FERM P-11116；参照特开平3-232497公报)
栖糖蜜棒杆菌DH344(FERM P-11117；参照特开平3-232497公报)
谷氨酸棒杆菌AJ11574(FERM P-5493；参照特开昭56-151495公报)
L-半胱氨酸生产菌
作为L-半胱氨酸生产菌的例子，包括但不限于下列属于埃希氏菌属的菌株：用编码反馈抑制抗性的丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15株(美国专利第6,218,168号、俄罗斯专利申请第2003121601号)；过量表达编码适于向细胞分泌毒素物质的蛋白质的基因的大肠杆菌W3110株(美国专利第5,972,663号)；半胱氨酸脱巯基酶活性降低的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)；由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正转录调控因子活性提高的大肠杆菌W3110(WO0127307A1)等。
在本发明中使用的L-氨基酸生产菌中，除编码天然的生物合成系统酶的基因之外，糖摄取、糖代谢(糖酵解系统)和能量代谢中涉及的基因也可以是经过扩增的。
糖代谢中涉及的基因的实例是编码糖酵解途径的酶的基因或糖摄取的基因，包括葡糖-6-磷酸异构酶基因(pgi；国际公开第01/02542号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps；欧洲申请公开877090号说明书)、磷酸葡糖变位酶基因(pgm；国际公开03/04598号小册子)、果糖二磷酸醛缩酶基因(fbp；国际公开03/04664号小册子)、丙酮酸激酶基因(pykF；国际公开03/008609号小册子)、转醛醇酶(transaldolase)基因(talB；国际公开03/008611号小册子)、延胡索酸酶基因(fum；国际公开01/02545号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps；欧洲申请公开877090号小册子)、非-PTS蔗糖摄取基因(csc；欧洲申请公开149911号小册子)和蔗糖同化基因(scrAB操纵子；国际公开90/04636号小册子)。
能量代谢中涉及的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB；美国专利5,830,716号说明书)和细胞色素bo型氧化酶基因(cyoB；欧洲专利申请公开1070376号说明书)。
下面，示例说明赋予微生物核酸生产能力的方法以及核酸生产菌。
具有核酸生产能力的细菌微生物可以这样获得：对于诸如上述的细菌微生物赋予例如嘌呤核苷营养缺陷性、或进一步赋予对嘌呤类似物等药物的抗性(参照特公昭38-23099、特公昭54-17033、特公昭55-45199、特公昭57-14160、特公昭57-41915、特公昭59-42895)。例如，具有营养缺陷性以及药物抗性的芽孢杆菌属细菌，可以这样获得：使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或EMS(甲磺酸乙酯)等常规的突变处理中使用的突变剂进行处理。
作为生产嘌呤核苷的芽孢杆菌属细菌，可以例举如下。
作为属于芽孢杆菌属的肌苷生产株的具体例子，可以使用枯草芽孢杆菌KMBS16株。该菌株是已知的枯草芽孢杆菌trpC2株(168Marburg)的衍生物，其中引入了编码嘌呤操纵子阻遏物的purR基因的缺损(purR::spc)、编码琥珀酰-AMP合酶的purA基因的缺损(purA::erm)、和编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因的缺损(deoD::kan)(特开2004-242610，US2004166575A1)。此外，还可以使用枯草芽孢杆菌菌株AJ3772(FERM P-2555)(特开昭62-014794)等。
作为具有鸟苷生产能力的芽孢杆菌属细菌，可以例举如下：IMP脱氢酶的活性提高了的芽孢杆菌属细菌(特开平3-58787)、将携带嘌呤类似物抗性或德夸菌素(decoyinine)抗性基因的载体导入腺嘌呤营养缺陷性突变株而得到的芽孢杆菌属细菌(特公平4-28357)等。
此外，作为生产嘌呤核苷酸的芽孢杆菌属细菌，可以例举如下。
作为肌苷酸生产菌，已报告有磷酸酶活性减弱的枯草芽孢杆菌肌苷生产菌株(Uchida，K.等，Agr.Biol.Chem.，1961，25，804-805、Fujimoto，M.Uchida，K.，Agr.Biol.Chem.，1965，29，249-259)。作为鸟苷酸生产菌，可以例举具有腺嘌呤营养缺陷性，且具有德夸菌素或甲硫氨酸亚砜抗性，并且具有5’-鸟苷酸(鸟苷-5’-单磷酸，以下也称“GMP”)生产能力的芽孢杆菌属的突变株(特公昭56-12438号公报)。
此外，黄苷酸生产菌可以使用在以产氨棒杆菌(Corynebacteriumammmoniagenes)为中心的棒状杆菌型细菌的选育中采用的方法来构建。例如，可以通过获得PRPP酰胺转移酶(amidotransferase)强化株(特开平8-168383)、脂肪族氨基酸抗性株(特开平4-262790)、脱氢脯氨酸抗性株(韩国专利公开公报2003-56490)来构建黄苷酸生产菌。
此外，作为具有嘌呤类物质生产能力的芽孢杆菌属细菌的选育方法，可以例举提高嘌呤核苷和嘌呤核苷酸共享的嘌呤生物合成的相关酶，即嘌呤生物合成酶的细胞内活性的方法。优选该酶的细胞内活性与芽孢杆菌属细菌的非修饰株例如野生型的芽孢杆菌属细菌相比有所提高。所谓“活性提高”，相当于每个细胞平均的酶分子数增加，或者每个酶分子平均的比活性提高等情形。例如，可以通过提高所述酶的基因的表达量来提高活性。作为所述嘌呤生物合成的相关酶，可以例举磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP synthetase[EC：2.7.6.1])等。
进入戊糖磷酸系统的葡萄糖等糖源经代谢生成的分解代谢物的一部分经由核酮糖-5-磷酸转变为核糖-5-磷酸。由生物合成的核糖-5-磷酸出发，生成嘌呤核苷、组氨酸和色氨酸生物合成中不可或缺的前体物质磷酸核糖焦磷酸(PRPP)。具体地，磷酸核糖焦磷酸合成酶将核糖-5-磷酸转变为PRPP。因此，通过进行使得磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性提高的修饰，可以赋予或增强芽孢杆菌属细菌的嘌呤类物质生产能力。
所谓“磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性提高”，是指磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性相对于野生株或亲本株等非修饰株有所增加。磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性可以采用例如Switzer等的方法(Methods Enzymol.，1978，51，3-11)、Roth等的方法(Methods Enzymol.，1978，51，12-17)来测定。磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性提高了的芽孢杆菌属细菌可以例如这样构建：如特开2004-242610号公报所述的方法那样，通过使用质粒的方法或在染色体上进行重组的方法等，使编码磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因在芽孢杆菌属细菌中高表达。
另一方面，当生成了嘌呤核苷、组氨酸和色氨酸生物合成中不可或缺的前体物质PRPP时，其一部分会通过嘌呤生物合成的相关酶群转变为嘌呤核苷酸、嘌呤核苷。编码这样的酶群的基因包括例如枯草芽孢杆菌的嘌呤操纵子，具体而言有purEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD操纵子的基因(EbboleDJ和Zalkin H，J.Biol.Chem.，1987，262，17，8274-87)(现在也称为purEKBCSQLFMNHD：Bacillus subtilis and Its Closest Relatives，主编：A.L.Sonenshein，ASM Press，Washington D.C.，2002。Genbank登录号.NC_000964)和大肠杆菌的pur调节子的基因(Escherichia and Salmonella，第二版，主编：F.C.Neidhardt，ASM Press，Washington D.C.，1996)。
因此，可以也通过增强这些基因的表达来赋予或增强嘌呤类物质生产能力。此外，可在本发明中使用的嘌呤操纵子基因不限于所述这些，还可以利用其它微生物或动植物来源的基因。
作为增加嘌呤操纵子的表达量的方法，可以例举通过使用质粒的方法或重组到染色体上的方法等来在芽孢杆菌属细菌中高表达嘌呤操纵子基因的方法。
作为增加嘌呤操纵子的表达量的第2种方法，可以例举这样的方法：将嘌呤操纵子的天然启动子更换为更强力的启动子，或者将天然启动子的-35、-10区更换为共有序列。
例如，在枯草芽孢杆菌(B.subtilis168Marburg株；ATCC6051)中，嘌呤操纵子的-35序列为共有序列(TTGACA)，但-10序列为TAAGAT，与共有序列TATAAT不同(Ebbole，D.J.和H.Zalikn，J.Biol.Chem.，1987，262，8274-8287)。因此，通过将-10序列(TAAGAT)改变为共有序列、或者进行修饰使其变为TATAAT、TATGAT或TAAAAT而接近共有序列，可以提高嘌呤操纵子的转录活性。而且，启动子序列的取代可以采用与下述的基因取代相似的方法来进行。
作为增加嘌呤操纵子表达量的第3种方法，可以例举降低嘌呤操纵子的阻遏物的表达量的方法(USP6,284,495号)。“嘌呤操纵子的阻遏物的表达”包括嘌呤操纵子基因的转录、以及转录产物的翻译这两个方面。此外，“降低表达量”包括：表达量比非修饰株例如野生型的芽孢杆菌属细菌中的表达量低，以及表达基本上消失。
为了降低嘌呤操纵子的阻遏物(嘌呤阻遏物)的表达量，例如可以采用下列方法：通过对芽孢杆菌属细菌进行紫外线照射或使用NTG或EMS等通常突变处理中使用的突变剂进行处理，并选择嘌呤阻遏物的表达量降低的突变株。
此外，除突变处理之外，嘌呤阻遏物的表达量降低的芽孢杆菌属细菌还可以这样获得：例如通过采用基因重组法的同源重组法(Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory press(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.，1985，162，1196-1202)将染色体上的编码嘌呤阻遏物的基因(purR；GenBank Accession NC_000964(编码区域为碱基号54439～55293)替换成不能正常发挥功能的基因(以下也称“破坏型基因”)。
而且，也可以通过减弱嘌呤类物质向细胞内的摄入来强化嘌呤类物质生产能力。例如，嘌呤核苷向细胞内的摄入可以通过阻断嘌呤核苷向细胞内的摄入的相关反应来减弱。上述嘌呤核苷细胞内摄入的相关反应包括例如核苷通透酶所催化的反应。
而且，在生产嘌呤核苷时，为了增强嘌呤核苷生产能力，可以降低分解嘌呤类物质的酶的活性。作为这样的酶，可以例举例如嘌呤核苷磷酸化酶。
从PRPP出发通过嘌呤生物合成的相关酶群而生物合成的嘌呤核苷酸经过脱磷酸化转变为嘌呤核苷。为了有效率地蓄积嘌呤核苷，优选降低将嘌呤核苷进一步分解并转变为次黄嘌呤等的嘌呤核苷磷酸化酶的活性。即，理想的是进行修饰，使得以嘌呤核苷(以肌苷为代表)为底物的嘌呤核苷磷酸化酶弱化或者缺损。
嘌呤核苷磷酸化酶活性的降低具体而言可以通过在芽孢杆菌属细菌中破坏编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因和pupG基因来实现。本发明的芽孢杆菌属细菌也可以是经过修饰而使得诸如上述的deoD基因和pupG基因单独或同时被破坏的细菌。deoD基因、pupG基因可以利用例如芽孢杆菌属来源的基因(deoD；Genbank登录号.NC_000964(编码区域为2134672-2135370)，pupG；Genbank登录号.NC_000964(编码区域为2445610-2446422)。
此外，为了增强嘌呤类物质生产能力，可以降低琥珀酰-AMP合酶的活性。作为编码琥珀酰-AMP合酶的基因，可以例举purA基因。作为purA基因，可以例举：以GenBank登录号.NC_000964(编码区域为互补链的碱基号4153460-4155749)登录的碱基序列。
而且，为了增强嘌呤类物质生产能力，可以降低肌苷单磷酸(IMP)脱氢酶的活性。作为编码IMP脱氢酶的基因，可以例举guaB基因。作为guaB基因，可以例举出例如：具有以GenBank登录号.NC_000964(编码区域为15913-17376)登录的碱基序列的基因。
此外，作为增强嘌呤类物质生产能力的方法，可以考虑扩增编码具有嘌呤类物质分泌活性的蛋白质的基因。作为这样的基因得到扩增的细菌，可以例举例如：扩增了rhtA基因的芽孢杆菌属细菌(特开2003-219876)。
在基于基因重组的微生物选育中使用的基因不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，在不损害编码的蛋白质的功能的条件下，还可以使用上述基因的同源物或人工修饰体等具有保守突变的基因。即，还可以是编码具有下述序列的蛋白质的基因：所述序列是在公知蛋白质的氨基酸序列中，在1个或者数个位置上包含1个或者数个氨基酸的取代、缺失、插入或增加等而形成的序列。
这里，所谓“1个或者数个”，虽然因氨基酸残基在蛋白质立体结构中的位置或氨基酸残基的种类而异，但具体而言优选是1～20个、更优选1～10个、更优选1～5个。此外，所谓保守突变，当取代部位为芳族氨基酸时，是指在Phe、Trp、Tyr之间相互取代的突变，当取代部位为疏水性氨基酸时，是指在Leu、Ile、Val之间相互取代的突变，当取代部位为极性氨基酸时，是指在Gln、Asn之间相互取代的突变，当取代部位为碱性氨基酸时，是指在Lys、Arg、His之间相互取代的突变，当取代部位为酸性氨基酸时，是指在Asp、Glu之间相互取代的突变，当取代部位为带有羟基的氨基酸时，是指在Ser、Thr之间进行相互取代的突变。典型的保守突变是保守取代，视为保守取代的取代具体地可以例举：从Ala到Ser或Thr的取代，从Arg到Gln、His或Lys的取代，从Asn到Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代，从Asp到Asn、Glu或Gln的取代，从Cys到Ser或Ala的取代，从Gln到Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代，从Glu到Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代，从Gly到Pro的取代，从His到Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代，从Ile到Leu、Met、Val或Phe的取代，从Leu到Ile、Met、Val或Phe的取代，从Lys到Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代，从Met到Ile、Leu、Val或Phe的取代，从Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代，从Ser到Thr或Ala的取代，从Thr到Ser或Ala的取代，从Trp到Phe或Tyr的取代，从Tyr到His、Phe或Trp的取代，以及从Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于作为基因来源的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。这样的基因例如可以这样获得：采用定点突变法对公知基因的碱基序列进行修饰使得被编码的蛋白质的特定部位处的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或增加。
而且，具有诸如上述的保守突变的基因还可以是编码下述蛋白质的基因：就编码的氨基酸序列全长而言，其与野生型蛋白质具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选97%以上的同源性，且具有与野生型蛋白质等同的功能。
此外，可以将基因序列中各自的密码子取代为易于在基因所导入的宿主中使用的密码子。
具有保守突变的基因可以通过突变剂处理等常规突变处理中使用的方法来获得。
此外，基因还可以是下述DNA，所述DNA与公知基因序列的互补序列或可由所述互补序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有与公知基因产物等同的功能的蛋白质。这里，“严格条件”，是指形成所谓特异性杂交体，但不形成非特异性杂交体的条件。举例说明：在具有高同源性的DNA之间、例如具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选97%以上的同源性的DNA之间发生杂交，而同源性低于上述的DNA之间则不发生杂交的条件；或者在与常规Southern杂交的洗涤条件即60℃、1×SSC、0.1%SDS，优选0.1×SSC、0.1%SDS，更优选68℃、0.1×SSC、0.1%SDS相当的盐浓度、温度下，清洗1次更优选2～3次的条件。
作为探针，也可以使用基因的互补序列的一部分。这种探针可以通过PCR制备，其中PCR以基于公知的基因序列制备的寡核苷酸为引物，以包含这些碱基序列的DNA片段为模板来进行。例如，当使用300bp左右长度的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件可以是例如50℃、2×SSC、0.1%SDS。
实施例
以下例举出实施例对本发明进行具体说明。但本发明不限于以下的实施例。
实施例1L-色氨酸的生产
作为L-色氨酸生产菌使用了大肠杆菌No.202(参照国际公开第2005/103275号小册子)。该菌株是在L-色氨酸生产菌SV164株(国际公开第94/08031号小册子)的染色体上插入包含磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA，来源于质粒pGH5，参照国际公开第94/08031号小册子)以及脱敏型trpE基因(来源于大肠杆菌MTR#2株，参照美国专利第4,371,614号说明书)的trp操纵子(来源于质粒pGX100)而得到的菌株。
将1个接种环量的大肠杆菌No.202的甘油保存液接种到LB-琼脂糖平板培养基(胰蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠0.5%、琼脂糖1.5%)，30℃静置培养24小时。
将10μl的上述培养液接种到置于500ml坂口烧瓶中的50mlLB培养基(胰蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠0.5%)中，30℃振荡下(114转/分钟)进行8小时的前培养。
将上述前培养液0.9ml接种到具有下述组成的300ml种子培养基中。使用总容量1L的小型发酵罐，30℃下培养约14小时，培养中搅拌叶轮的功率密度为4.4kW/m3，同时通入1vvm的经过灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。此外，培养中温度保持在30℃，用氨气将pH保持在6.5。
〔种子培养基组成〕
准备具有下述组成的300ml主培养培养基，其中分别接种种子培养液30ml。使用总容量1L的小型发酵罐，31℃下实施主培养，培养中以4.4kW/m3的条件进行搅拌，同时通入1vvm的经灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。此外，培养期间将温度保持在31℃。用氨气将pH保持在6.7。培养中，通过适当地流加700g/L的葡萄糖溶液，调节小型发酵罐内的糖浓度为5～20g/L。此外，在第23小时添加L-色氨酸晶体10g(33g/L)，在将搅拌叶轮的功率密度改变为2.4kW/m3、5.5kW/m3、15.5kW/m3、19.9kW/m3的4种条件下进行了培养。
〔主培养培养基组成〕
培养46小时后，测定培养基中的L-色氨酸浓度，计算出生产速度，结果如图2所示。在功率密度0的条件下并没有进行培养，但在图2中为了制作近似曲线而亦将其绘出。而且，生产速度是以将搅拌功率密度15.5kW/m3的条件下的生产率作为1时的相对值来描述的。
参考例1：L-谷氨酸生产菌的构建
设计了引物1(SEQ ID NO:1)和引物2(SEQ ID NO:2)，用于扩增质粒RSFCPG (欧洲申请公开1233068号说明书)中除gltA基因的ORF以外的部分；所述质粒具有大肠杆菌来源的gltA基因、ppc基因和gdhA基因。使用该引物，以RSFCPG为模板进行PCR，得到了约14.9kb的片段。另一方面，使用引物3(SEQ ID NO:3)和引物4(SEQ ID NO:4)，以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板进行PCR，得到了包含甲基柠檬酸合酶基因(prpC)的约1.2kb的片段。将两PCR产物分别用BglII、KpnI处理并进行连接后，转化大肠杆菌JM109株。收集全部出现的菌落，提取作为混合物形式的质粒。用该质粒混合物转化柠檬酸合酶(CS)缺损株大肠杆菌ME8330株，将其涂布在含50mg/L尿嘧啶、5mg/L硫胺-HCl的M9极限培养基(葡萄糖5g、硫酸镁2mM、磷酸二氢钾3g、氯化钠0.5g、氯化铵1g、磷酸氢二钠6g溶于纯水1L而得到的培养基)上。从出现的菌株提取质粒，以其作为RSFPPG。在Pantoea ananatis SC17sucA株中导入L-谷氨酸生产质粒RSFPPG，构建了L-谷氨酸生产菌SC17sucA/RSFPPG(本菌株称为“NA1株”)。
上述SC17sucA株是这样得到的：作为能够在低pH条件下含L-谷氨酸和碳源的培养基上增殖的菌株从自然界分离出AJ13355株，从AJ13355株获得粘液质低生产突变株(SC17)，破坏该菌株的sucA基因从而得到SC17sucA株(美国专利第6,596,517号)。SC17sucA株的内部编号为Pantoea ananatis AJ417，其于平成16年(2004年) 2月26日保藏于经济产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现名称：独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)专利生物保藏中心，邮政编码305-8566 茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM BP-08646。
实施例2L-谷氨酸的生产
将1个接种环量的谷氨酸生产菌Pantoea ananatis NA1的甘油保存液接种到LBGM9-琼脂糖平板培养基(胰蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠1.05%、葡萄糖0.5%、七水合硫酸镁0.05%、十二水磷酸氢二钠1.72%、磷酸二氢钾0.3%、氯化铵0.1%、琼脂糖2%、四环素盐酸盐25mg/L)上，34℃静置培养24小时。
将相当于1张平皿的前培养菌体接种到具有下述组成的培养基300ml中。使用总容量1L的小型发酵罐进行了培养，其中搅拌叶轮的功率密度为3.3kW/m3，培养同时通入1vvm的经灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。此外，培养中温度保持在34℃，用氨气将pH保持在4.7。在培养的第20小时，通过适宜地流加700g/L的蔗糖溶液，将小型发酵罐内的糖浓度调节为5～20g/L。此外，在培养的第20小时，添加L-谷氨酸的α晶体20g，在将搅拌的功率密度改变为2.4kW/m3、15.5kW/m3、19.9kW/m3的3种条件下进行了培养。
〔培养基组成〕
培养49小时后，测定培养基中的L-谷氨酸浓度，计算出生产速度，结果如图3所示。生产速度是以将搅拌功率密度为15.5kW/m3的条件下的生产性作为1时的相对值来描述的。
实施例3L-苏氨酸的生产
作为L-苏氨酸生产菌，使用了大肠杆菌VKPM B-5318(欧洲公开第0593792号)。
将1个接种环量的大肠杆菌VKPM B-5318的甘油保存液接种到LB-琼脂糖平板培养基(蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠0.5%、琼脂糖1.5%、链霉素硫酸盐100mg/L)上，37℃静置培养24小时。
将相当于1/10平板量的上述培养液接种到置于500ml坂口烧瓶中的50ml LB培养基(胰蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠0.5%、卡那霉素硫酸盐25mg/L、链霉素硫酸盐20mg/L)中，40℃振荡下(144转/分钟)进行4小时的前培养。
准备具有下述组成的主培养培养基300ml，分别接种种子培养液30ml。使用总容量1L的小型发酵罐，在40℃、5.5kW/m3的搅拌下实施主培养，培养同时通入1vvm的经灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。此外，培养期间温度保持在40℃，用氨气将pH保持在7.0。培养中，通过适宜地流加700g/L的蔗糖溶液，将小型发酵罐内的糖浓度调节为5～20g/L。此外，在第21小时，添加L-苏氨酸的晶体24g(70g/L)，在将搅拌叶轮的功率密度改变为2.4kW/m3、5.5kW/m3、13.5kW/m3的3种条件下进行了培养。
〔主培养培养基组成〕
培养45小时后，测定培养基中的L-苏氨酸浓度，计算出生产速度，结果如图4所示。生产速度是以将搅拌功率密度为5.5kW/m3的条件下的生产性作为1时的相对值来描述的。
实施例4L-苯丙氨酸的生产
作为L-苯丙氨酸生产菌，使用大肠杆菌AJ12741株(特许第3225597号公报，以下也记作”R/GAL株”)。该菌株是在缺失tyrR、tyrA基因的大肠杆菌K-12的W3110株中导入编码反馈抑制解除的3-脱氧-Ｄ-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶的aroG4基因、编码分支酸变位酶-预苯酸脱水酶的pheA基因以及编码莽草酸激酶的aroL基因而得到的菌株。该菌株(分类命名为大肠杆菌AJ12741)于平成4年(1992年)6月11日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Scienceand Technology)，现名为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERMP-13000，平成6年(1994年) 9月14日转为国际保藏，保藏号FERM BP-4796。
将1个接种环量的AJ12741株的甘油保存液接种到LBG-琼脂糖平板培养基(胰蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠1%、琼脂糖1.5%)，35℃静置培养24小时。
将相当于1张平皿量的上述前培养菌体接种到具有下述组成的培养基300ml中。使用总容量1L的小型发酵罐培养约16小时，其中，搅拌叶轮的功率密度为3.3kW/m3，培养的同时通入1vvm的经灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。此外，培养中温度保持在35℃。用氨气将pH保持在6.5。
〔种子培养基组成〕
准备具有下述组成的主培养培养基300ml，在其中接种种子培养液30ml。使用总容量1L的小型发酵罐，在35℃、搅拌叶轮的功率密度为3.3kW/m3的搅拌下实施主培养，培养的同时通入1vvm的经灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。此外，培养期间将温度保持在35℃，用氨气将pH保持在6.5。培养中，通过适宜地流加500g/L的葡萄糖溶液，将小型发酵罐内的糖浓度调节为5～20g/L。此外，第24小时，添加L-苯丙氨酸的晶体20g，在以下4个条件下进行培养：将搅拌叶轮的功率密度改变为5.5kW/m3、15.5kW/m3、19.9kW/m3的条件，或者控制在2.4kW/m3以下。
〔主培养培养基组成〕
实施例5肌苷和/或鸟苷的生产
将1个接种环量的生产肌苷和鸟苷的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)AJ1991株(VKPM B-8994，参照美国专利第3,575,809号)的甘油保存液接种到LBG-琼脂糖平板培养基(胰蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠1%、琼脂糖1.5%)，34℃静置培养24小时。AJ1991株又名解淀粉芽孢杆菌G1136A株，2005年3月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM),GNII Genetika)(Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)，保藏号VKPM B-8994。2006年10月13日转为国际保藏。
将1个铂接种环量的上述前培养菌体接种到装在500ml坂口烧瓶中的下述组成的培养基50ml中，34℃、振荡下(115转/分钟)进行16小时的前培养。
〔种子培养基组成〕
准备具有下述组成的主培养培养基300ml，接种种子培养液15ml。使用总容量1L的小型发酵罐，在34℃、搅拌叶轮功率密度3.3kW/m3的搅拌下实施主培养，培养同时通入1vvm的经灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。此外，培养期间保持温度为34℃，用氨气将pH保持在6.5。培养中，通过适宜地流加500g/L的葡萄糖溶液，将小型发酵罐内的糖浓度调节为5～20g/L。此外，在第24小时，添加鸟苷晶体0.8g，并在下述4个条件下进行培养：将搅拌叶轮的功率密度改变为5.5kW/m3、15.5kW/m3、19.9kW/m3的条件，或者控制在2.4kW/m3以下的条件。
〔主培养培养基组成〕
工业实用性
根据本发明，能够在通过使用具有L-氨基酸或核酸生产能力的微生物的发酵法进行的L-氨基酸或核酸生产方法中提高L-氨基酸或核酸的生产率。L-氨基酸或核酸的生产率包括对糖收率的提高、和/或生产速度的提高。

Claims (3)

1.一种生产L-谷氨酸的方法，包括在具有搅拌叶轮的发酵罐内的液体培养基中培养具有生产L-谷氨酸的能力的Pantoea ananatis，根据需要向培养基中添加晶种，从而在该培养基中生成并蓄积L-谷氨酸的晶体，并且从培养物中收集L-谷氨酸的晶体，
其中，在晶体析出后或添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度控制在2.4kW/m3以下。
2.权利要求1所述的方法，其中所述晶体析出后或添加晶种后的搅拌叶轮的功率密度控制在0.5kW/m3以上。
3.权利要求1所述的方法，其中在进行培养的同时将晶体析出前或添加晶种前的搅拌叶轮的功率密度控制在3.0kW/m3以上。
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