KR101452202B1

KR101452202B1 - Ｌ-아미노산 또는 핵산의 제조방법

Info

Publication number: KR101452202B1
Application number: KR1020097019277A
Authority: KR
Inventors: 마사유키 아라키; 유스케 다카하시; 아키히로 와타나베; 후미토 오니시; 다카히로 아사노; 가즈야 곤도; 와타루 히비노; 신타로 이와타니; 사토시 오쿠타니
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2007-02-20
Filing date: 2008-01-09
Publication date: 2014-10-21
Also published as: US20100062493A1; JP2010110216A; KR20090114456A; US8178322B2; WO2008102572A1; BRPI0807598A2; CN103382492B; CN103382492A; HUE026366T2; BRPI0807598B1; EP2130924B1; CN101617054B; EP2130924A1; CN101617054A; EP2130924A4

Abstract

L-아미노산 또는 핵산의 생산능을 갖는 미생물을 교반 날개를 구비한 발효조 중의 액체 배지에서 배양하고, 필요에 따라 종결정을 배지에 첨가하여 당해 배지 중에 L-아미노산 또는 핵산의 결정을 생성, 축적시키고, 배양물로부터 L-아미노산 또는 핵산의 결정을 채취하는 L-아미노산 또는 핵산의 제조법에 있어서, 교반 날개의 동력 밀도를 결정 석출후 또는 종결정 첨가후에 2.4kW/㎥ 이하로 제어한다.

L-아미노산 생산균, 핵산 생산균, 교반 날개, 동력 밀도, L-아미노산 결정, 핵산 결정

Description

Ｌ-아미노산 또는 핵산의 제조방법{Method for production of L-amino acid or nucleic acid}

본 발명은 발효 공업에 관한 것이며, 미생물을 이용한 발효법에 의해 L-아미노산 또는 핵산을 석출시키면서 배양하는 방법이다.

L-아미노산은, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형(coryneform) 세균 또는 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하는 아미노산 생산균을 사용하여 발효법에 의해 공업 생산되고 있다. 이들 아미노산 생산균으로서는, 생산성을 향상시키기 위해 자연계로부터 분리된 균주 또는 당해 균주의 인공 변이주, 또는 유전자 재조합에 의해 L-아미노산 생합성 효소가 증강된 재조합체 등이 사용되고 있다.

예를 들면, L-트립토판 발효에 있어서는, 안트라닐산 합성 효소 활성, 포스포글리세린산 데하이드로게나제 활성, 트립토판 신타제 활성이 증강된 세균[참조: 특허문헌 1], 및 트립토판 오페론이 증폭된 세균을 들 수 있다[참조: 특허문헌 2 내지 4].

또한 L-글루탐산 발효에 있어서는, 글루탐산 데하이드로게나제 유전자(gdh), 이소시트르산 데하이드로게나제 유전자(icdA), 아코니트산 하이드라타제 유전자(acnA, acnB), 및 시트르산 신타제 유전자(gltA)를 증강시킴으로써, L-글루탐산의 생산능을 증강시키는 기술을 들 수 있다[참조: 특허문헌 5].

또한 L-트레오닌 발효에 있어서는, 아스파르토키나제 III 유전자(lysC), 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd), thr 오페론으로 암호화되는 아스파르토키나제 유전자(thrA), 호모세린키나제 유전자(thrB), 트레오닌 신타제 유전자(thrC)를 증강시킨 미생물[참조: 특허문헌 6] 등을 들 수 있다.

상기와 같은 미생물의 육종이나 제조법의 개량에 의해, L-아미노산의 생산능이 상당히 높아졌지만, 금후의 수요의 한층 증대에 대응하기 위해서는, 더욱 염가이고 효율적인 L-아미노산의 제조법의 개발이 요구되고 있다.

한편, 배양액 중에 축적되는 L-아미노산을 결정 석출시키면서 발효를 실시하는 방법이 알려져 있다[참조: 특허문헌 7, 8]. 또한 L-글루탐산에 관해서는, L-글루탐산을 석출시키면서 축적시킬 수 있는 미생물을 사용하여 L-글루탐산을 제조하는 방법이 개시되어 있다[참조: 특허문헌 9]. 또한, 평균 입자 직경이 1 내지 120㎛인 아미노산의 결정을 배지에 첨가하는 결정 석출 발효법도 알려져 있다[참조: 특허문헌 10].

그러나, 상기 방법에서는 통상의 결정을 석출시키지 않는 발효와 비교하여 생산성이 충분하지 않아 더욱 개량이 요구되고 있었다.

특허문헌 1: WO94/08031호

특허문헌 2: 일본 공개특허공보 제(소)57-71397호

특허문헌 3: 일본 공개특허공보 제(소)62-244382호

특허문헌 4: 미국특허 제4,371,614호

특허문헌 5: 일본 공개특허공보 제(소)63-214189호

특허문헌 6: 일본 공개특허공보 2001-346578호

특허문헌 7: 일본 공개특허공보 제(소)62-288호

특허문헌 8: 유럽특허공보 제1078989호

특허문헌 9: 미국특허 제6905819호

특허문헌 10: WO06/109830호

발명의 개시

해결하고자 하는 과제

본 발명은 미생물을 사용하여 L-아미노산 또는 핵산의 결정을 석출시키면서 배지에 축적시키는 발효 생산에 있어서의 생산성의 향상을 목적으로 한다.

과제 해결 수단

통상적으로 발효 과정에 있어서의 교반 날개의 동력 밀도의 저하는, 발효에 악영향을 주는 것이 상정된다. 그러나, 본 발명자는 예의 연구의 결과, L-아미노산 또는 핵산을 석출시키면서 축적시키는 발효에 있어서, 교반 날개의 동력 밀도를, 결정 석출후, 또는 종결정(seed crystal) 첨가후에 일정 이하로 제어함으로써, L-아미노산의 생산성이 향상되는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) L-아미노산 또는 핵산의 생산성을 갖는 미생물을 교반 날개를 구비한 발효조 중의 액체 배지에서 배양하고, 필요에 따라 종결정을 배지에 첨가하여 당해 배지 중에 L-아미노산 또는 핵산의 결정을 생성, 축적시키고, 배양물로부터 L-아미노산 또는 핵산의 결정을 채취하는 L-아미노산 또는 핵산의 제조법에 있어서, 교반 날개의 동력 밀도를 결정 석출후 또는 종결정 첨가후에 2.4kW/㎥ 이하로 제어하는 것을 특징으로 하는 방법.

(2) 상기 결정 석출후 또는 종결정 첨가후의 교반 날개의 동력 밀도가 0.5kW/㎥ 이상인 것을 특징으로 하는 방법.

(3) 결정 석출전 또는 종결정 첨가전의 교반 날개의 동력 밀도를 3.0kW/㎥ 이상으로 제어하면서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 방법.

(4) 상기 미생물이 장내세균과에 속하는 미생물인, 상기 방법.

(5) 상기 미생물이 코리네형 세균, 또는 바실러스속 세균인, 상기 방법.

(6) 상기 L-아미노산이, L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-글루탐산, L-글루타민, L-트레오닌, L-시스테인, L-시스틴 또는 이의 유도체로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 L-아미노산인 상기 방법.

(7) 상기 핵산이 이노신, 아데노신, 구아노신, 크산토신, 이노신산, 아데닐산, 구아닐산, 크산틸산 또는 이들의 유도체로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 핵산인 상기 방법.

도 1은 발효 장치의 개요를 도시하는 도면. 발효조로부터의 목적 물질의 채취를 나타낸다.

도 2는 교반 날개의 교반 동력 밀도와 L-트립토판의 생산 속도를 도시하는 도면.

도 3은 교반 날개의 교반 동력 밀도와 L-글루탐산의 생산 속도를 도시하는 도면.

도 4는 교반 날개의 교반 동력 밀도와 L-트레오닌의 생산 속도를 도시하는 도면.

<1> 본 발명의 제조법

본 발명의 방법은 L-아미노산 또는 핵산의 생산능을 갖는 미생물을 교반 날개를 구비한 발효조 중의 액체 배지에서 배양하고, 필요에 따라 종결정을 배지에 첨가하여 당해 배지 중에 L-아미노산 또는 핵산의 결정을 생성, 축적시키고, 배양물로부터 L-아미노산 또는 핵산의 결정을 채취하는 L-아미노산 또는 핵산의 제조법에 있어서, 교반 날개의 동력 밀도(단위 발효액당의 동력)를 결정 석출후 또는 종결정 첨가후에 2.4kW/㎥ 이하로 제어하는 것을 특징으로 하는 방법이다.

본 발명에 있어서, 「L-아미노산」은, 미생물을 사용한 발효법에 있어서 배지 중에 석출시키면서 축적시킬 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, L-리신, L-오르니틴, L-아르기닌, L-히스티딘, L-시톨린과 같은 염기성 아미노산, L-이소류신, L-알라닌, L-발린, L-류신, L-글리신과 같은 지방족 아미노산, L-트레오닌, L-세린과 같은 하이드록시모노아미노카복실산인 아미노산, L-프롤린과 같은 환식 아미노산, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판과 같은 방향족 아미노산, L-시스테인, L-시스틴, L-메티오닌과 같은 황 함유 아미노산, L-글루탐산, L-아스파라긴산 등과 같은 산성 아미노산 및 L-글루타민, L-아스파라긴 등과 같은 측쇄에 아미드기를 갖는 아미노산을 들 수 있다.

바람직하게는 소수성 아미노산, 산성 아미노산 및 측쇄에 아미드기를 갖는 아미노산을 들 수 있다. 특히 바람직하게는 소수성 아미노산으로서는, 지방족 아미노산인 L-발린, L-류신, L-이소류신, 방향족 아미노산인 L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신을 들 수 있고, 산성 아미노산으로서는 L-글루탐산, L-아스파라긴산을 들 수 있고, 측쇄에 아미드기를 갖는 아미노산으로서는 L-글루타민, L-아스파라긴 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 L-아미노산에는 상기 아미노산을 출발 물질로 하여 수득되는 L-아미노산 유도체도 포함되고, GABA, p-하이드록시-D-페닐글리신, DOPA, 석신산, 말산, 피루브산을 들 수 있다.

본 발명에 의해 제조되는 L-아미노산 또는 핵산은, 1종이라도 양호하며, 2종 또는 그 이상이라도 양호하다.

본 발명에 있어서, 「핵산」은, 미생물을 사용한 발효법에 있어서 배지중에 석출하면서 축적시킬 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 핵산으로서는, 퓨린뉴클레오사이드, 퓨린뉴클레오타이드 등을 들 수 있다. 퓨린뉴클레오사이드에는, 이노신, 크산토신, 구아노신, 아데노신 등이 포함되고, 퓨린뉴클레오타이드에는, 퓨린뉴클레오사이드의 5'-인산에스테르, 예를 들면 이노신산(이노신-5'-인산. 이하「IMP」라고도 한다), 크산틸산(크산토신-5'-인산. 이하「XMP」라고도 한다), 구아닐산(구아노신-5'-모노인산. 이하「GMP」라고도 한다), 아데닐산(아데노신-5'-모노인산. 이하「AMP」라고도 한다) 등이 포함된다. 또한 본 발명의 핵산에는, 상기 핵산을 출발 물질로 하여 수득되는 핵산 유도체도 포함되고, Ara-U(우라실아라비노시드), ZVA(Z-발라시클로비르) 등을 들 수 있다. 또한 본 발명에 있어서 상기의 L-아미노산, 핵산 또는 이들의 유도체를「목적 물질」이라고 표현하는 경우가 있다.

교반 날개란, 발효조 중의 액체 배지를 교반하기 위한 것이며, 형상은 특별히 상관없다. 통상적으로는 교반 날개는 축과, 축에 마련된 날개(블레이드)로 이루어지지만, 날개 또는 그 일부가 축을 구성하는 것이라도 양호하다. 또한 통상적으로 교반 날개는 축을 중심으로 하여 회전하지만, 다른 형식으로 작동하는 것이라도 양호하다. 날개의 형상으로서는, 터빈형, 패들형, 프로펠러형, 앵커형, 리본형 등을 사용할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 또한 날개의 장수, 각각의 날개의 배치도 특별히 제한되지 않는다. 교반 날개는 모터 등의 동력기로부터 축으로 동력이 전달되어 작동한다. 교반 날개에 관해서는, 예를 들면, 화학공학편람(화학공학협회편 개정4판 1310~1311 페이지 마루젠 가부시키가이샤)를 참조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 교반 날개의 동력 밀도란, 단위 발효액당 교반 날개의 동력이다. 교반 날개의 동력은, 발효액을 교반했을 때의 동력기의 동력(출력)으로부터, 발효조가 빈 상태에서 교반했을 때의 동력기의 동력(출력)을 뺌으로써 산출된다. 동력은, 구체적으로는 예를 들면, 동력기가 모터이면, 모터에 흐르는 전류와 모터의 효율로부터 산출할 수 있다. 또한, 모터에 흐르는 전류와, 동력과의 관계를 나타내는 검량선을 작성해 두고, 그 검량선을 사용하여 전류로부터 환산함으로써도, 동력을 측정할 수 있다. 또한 토크 미터 또는 토크 센서 등의 토크를 측정하는 기기를 사용하여 교반 날개에 가해지는 토크를 측정하여 그 값으로부터 이하의 식에 의해 동력을 산출할 수 있다.

동력 P[kW]=T×2×π×n/1000

T: 토크[N·m]

n: 교반 날개의 회전수[/s]

상기와 같이 하여 측정되는 동력값을 배지액량으로 나눈 값이 교반 날개의 동력 밀도이다.

본 발명에 있어서, 교반 날개의 동력 밀도는, 결정 석출후 또는 종결정 첨가후에 2.4kW/㎥ 이하가 되도록 제어하는 것이 바람직하다. 교반 날개의 동력 밀도는, 보다 바람직하게는 2.0kW/㎥ 이하, 특히 바람직하게는 1.5kW/㎥ 이하, 가장 바람직하게는 1.0kW/㎥ 이하로 제어하는 것이 바람직하다. 한편, 교반 날개의 동력 밀도의 하한은, 미생물의 물질 생산, 또는 미생물의 생육을 저하시키지 않는 한 특별히 제한되지 않지만, 0.4kW/㎥ 이상, 바람직하게는 0.5kW/㎥ 이상, 더욱 바람직하게는 0.6kW/㎥ 이상, 가장 바람직하게는 0.7kW/㎥ 이상으로 제어하는 것이 바람직하다.

결정 석출후 또는 종결정 첨가후에, 교반 날개의 동력 밀도는 상기 범위가 되도록 제어되지만, 발효 종료까지 연속적으로 제어되는 것이 바람직하다. 또한, 교반 날개의 동력 밀도가 실질적으로 상기 범위로 제어되어 있으면, 일시적으로 상기 범위를 초과하는 경우가 있어도 양호하다. 구체적으로는, 결정 석출후 또는 종결정 첨가후, 발효 종료 또는 목적 물질의 축적이 한계가 될 때까지의 기간의 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상으로, 교반 날개의 동력 밀도가 상기 범위를 만족시키고 있으면, 교반 날개의 동력 밀도는 실질적으로 제어되고 있다.

결정 석출전 또는 종결정 첨가전에는, 교반 날개의 동력 밀도는 결정 석출후 또는 종결정 첨가후 상기 범위보다도 높은 것이 바람직하고, 바람직하게는 2.6kW/㎥ 이상, 보다 바람직하게는 2.8kW/㎥ 이상, 특히 바람직하게는 3.0kW/㎥ 이상이다. 한편, 교반 날개의 동력 밀도가 실질적으로 이 범위로 제한되어 있으면, 일시적으로 상기 범위를 하회하는 경우가 있어도 양호하다. 구체적으로는, 발효 개시, 또는 후술하는 목적 물질 생산기로부터 결정 석출 또는 종결정 첨가까지의 기간의 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상으로, 교반 날개의 동력 밀도가 상기 범위를 만족시키고 있으면, 교반 날개의 동력 밀도는 실질적으로 제어되고 있다.

본 발명에 있어서, 목적 물질의 결정은, 목적 물질의 축적이 그 포화 용해도를 초과하면, 또는 과포화 상태를 초과하면, 자연스럽게 석출된다. 따라서, 미생물이 배지 중에 포화 용해도를 초과하는 양의 목적 물질을 축적하는 능력이 있는 경우에는, 목적 물질을 석출시키기 위한 조작은 불필요하지만, 목적 물질의 석출을 촉진시키기 위해, 결정을 첨가해도 양호하다. 종결정이란, 이러한 목적으로, 필요에 따라 배지 중에 첨가하는 결정을 의미한다. 종결정은 결정의 석출을 촉진시키는 효과가 있으면, 목적 물질에 한정되지 않지만, 바람직하게는 목적 물질, 예를 들면 L-트립토판 발효이면 L-트립토판이 바람직하다.

첨가하는 종결정의 농도는, 목적 물질을 생산하는 미생물이, 발효 공정에서 배지내에 결정을 석출하는 능력을 갖는 경우에는 0.5g/L 이상, 바람직하게는 1g/L 이상, 보다 바람직하게는 5g/L 이상, 더욱 바람직하게는 10g/L 이상의 종결정을 배지 중에 첨가하는 것이 바람직하다.

미생물이 배지 중에 포화 용해도를 초과하는 양의 목적 물질을 축적할 능력이 없는 경우, 목적 물질의 농도가 포화 용해도 이상이 되는 양의 목적 물질을 배지에 첨가할 필요가 있다. 그 경우에 첨가하는 목적 물질은, 용액이라도, 분체 또는 결정이라도 양호하지만, 적어도 종결정으로서 결정을 함유하는 것이 바람직하다. 그 경우, 종결정의 양은 10g/L 이상, 바람직하게는 20g/L, 보다 바람직하게는 30g/L, 더욱 바람직하게는 50g/L 이상인 것이 바람직하다. 또한 본 발명에 있어서는, 목적 물질의 석출을 촉진시키기 위해 첨가되는 물질은 상기와 같이 배지에 첨가하는 목적 물질이 용액 또는 분체라도, 특기하지 않는 한 종결정에 포함된다.

또한, 어느 경우에도 종결정을 첨가하는 농도의 상한은, 미생물의 물질 생산, 또는 미생물의 생육을 현저하게 저하시키는 농도가 아니면 어느 것이라도 양호하지만, 100g/L 이하, 바람직하게는 90g/L 이하, 보다 바람직하게는 80g/L 이하, 특히 바람직하게는 70g/L 이하인 것이 적합하다.

종결정을 첨가하는 시기는, 목적 물질을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배지에 접종하기 전, 또는 미생물을 배지에 접종한 후의 배양 기간 중 어느 시기라도 양호하지만, 바람직하게는 미생물을 배지에 접종한 후에, 배지 중의 목적 물질 농도가 포화 용해도에 도달하기 전후부터 배지 중에 목적 물질의 결정이 석출되기 전, 보다 바람직하게는 배지 중의 목적 물질 농도가 과포화로 있을 때로서, 배지 중에 목적 물질의 결정이 석출되기 전을 들 수 있다. 배양 시간으로 나타내면 배양 개시 또는 후술하는 목적 물질 생산기의 개시점으로부터 5시간후, 바람직하게는 10시간후, 보다 바람직하게는 15시간후, 더욱 바람직하게는 20시간후, 가장 바람직하게는 25시간후, 또는 이들 근방에서 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 목적 물질의 전체 배양 시간, 또는 목적 물질 생산기로부터 배양 종료까지의 시간을 1로 했을 때, 전체의 0.2, 바람직하게는 0.3, 더욱 바람직하게는 0.4 경과한 시점 또는 이들 근방에서 종결정을 첨가하는 것이 바람직하다.

여기에서 포화 용해도란, 액체 배지가 목적 물질로 포화되어 있을 때의 액체 배지에 용해되어 있는 목적 물질의 농도를 의미한다. 즉 목적 물질의 과포화도가 해소되었을 때에 정상이 되는 목적 물질의 농도를 의미한다.

각 L-아미노산 및 핵산의 용해도는 표 1, 2와 같으며, 이들 농도에 도달하기 전후에, 종결정을 첨가하는 것이 바람직하다.

L-아미노산	용해도(20℃) g/L	용해도(40℃) g/L
L-트립토판	10.6	14
L-페닐알라닌	27.4	38
L-티로신	0.38	0.75
L-이소류신	41.2	44
L-류신	23.8	26
L-발린	57.5	65
L-글루탐산	7.2	15
L-트레오닌	90	122
L-글루타민	37.3	66
L-히스티딘	38	58
L-아스파라긴산	6.0	8.3
L-시스테인	160
L-시스틴	0.09

뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드	용해도(20℃) g/L	용해도(40℃) g/L
이노신	44.4	83.4
구아노신	0.42	1.05
아데노신	3.0	8.3
이노신산	137	241
구아닐산	206	260

본 발명에 있어서, 결정 석출후란, 배양액 중에 목적 물질의 포화 용해도를 초과하고, 목적 물질의 결정이 석출된 후를 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서는, 결정 석출전, 또는 종결정 첨가전에는, 교반 날개의 동력은 결정 석출후, 또는 종결정 첨가후보다도 높은 것이 바람직하다. 또한 결정 석출전, 또는 종결정 첨가전의 교반 날개의 동력은, 미생물의 생육에 적합한 범위이면 어느 것이라도 양호하지만, 2.4kW/㎥ 이상, 바람직하게는 2.6kW/㎥ 이상, 보다 바람직하게는 2.8kW/㎥ 이상, 더욱 바람직하게는 3.0kW/㎥ 이상, 가장 바람직하게는 3.2kW/㎥ 이상으로 제어하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 방법은, 목적 물질 생산능을 갖는 미생물을 증식시키는 단계(증식기)와, 목적 물질을 생산시키는 단계(목적 물질 생산기)를 포함하고 있어도 양호하다. 그 경우, 증식기에 미생물을 충분히 생육시켜 목적 물질 생산기에 목적 물질을 최대한 축적시키는 것이 바람직하다. 또한, 목적 물질의 석출, 또는 종결정의 첨가 시기는, 증식기의 최종 단계, 또는 목적 물질 생산기인 것이 바람직하다. 종결정의 첨가는, 한번에 실시해도 양호하고, 2회 또는 3회 이상으로 나누어 첨가해도 양호하며, 또는 연속적으로 실시해도 양호하다.

본 발명에 있어서의「증식기」란, 탄소원이 주로 균체 생육에 사용되고 있는 시기, 즉 미생물이 대수적으로 증식되고 있는 시기를 의미하고, 본 발명에 있어서의「목적 물질 생산기」란, 배양 개시로부터 10시간 이후, 바람직하게는 15시간 이후, 특히 바람직하게는 20시간 이후 탄소원이 주로 L-아미노산 생산에 사용되고 있는 시기를 의미한다.

증식기의 교반 날개의 동력은, 미생물의 생육에 적합한 범위이면 특별히 제한되지 않으며, 구체적으로는, 상기한 결정 석출전, 또는 종결정 첨가전의 교반 날개의 동력과 동일하다.

본 발명에서 사용되는 배지는, 영양원으로서 탄소원, 질소원을 함유하고 있으면 어느 것이라도 양호하다. 또한, 본 발명의 방법은, 회분 배양(batch culture), 유가 배양(Fed-batch culture), 연속 배양법(continuous culture) 중 어느 것이라도 사용할 수 있다.

여기에서 본 발명에 있어서, 상기 유가 배양이란, 배양 중의 용기에 배지를 연속적 또는 간헐적으로 유가하고, 배양 종료시까지 그 배지를 용기로부터 빼내지 않는 배양 방법을 말한다. 또한, 연속 배양이란, 배양 중의 용기에 배지를 연속적 또는 간헐적으로 유가하는 동시에, 용기로부터 배지(통상적으로 유가하는 배지와 당량)를 빼내는 방법을 말한다. 또한,「초발 배지」란, 유가 배양 또는 연속 배양에 있어서 유가 배지를 유가시키기 전의 회분 배양(batch 배양)에 사용하는 배지를 의미하고, 「유가 배지」란, 유가 배양 또는 연속 배양을 실시할 때에 발효조에 공급하는 배지를 의미한다. 유가 배지는, 미생물의 생육에 필요한 성분 전부를 함유하고 있어도 양호하지만, 일부만을 함유하는 것이라도 양호하다. 또한, 본 발명에 있어서 「발효 배지」란, 발효조 중의 배지를 의미하고, 당해 발효 배지로부터 목적 물질이 회수된다. 또한, 본 발명에 있어서,「발효조」란, 목적 물질 생산을 실시하는 용기를 의미하며, 그 형상은 상관없으며, 예를 들면 발효 탱크를 사용해도 자 퍼멘터(jar fermenter)를 사용해도 양호하다. 또한 그 용량은 목적 물질을 생성·회수할 수 있는 용량이면 어느 것이라도 양호하다.

본 발명에 사용되는 배지에 함유되는 탄소원으로서는, 글루코스, 글리세롤, 프럭토스, 수크로스, 말토스, 만노스, 갈락토스, 전분가수분해물, 당밀 등의 당류를 사용할 수 있고, 특히 글루코스, 수크로스가 바람직하다. 기타, 아세트산, 시트르산 등의 유기산, 에탄올, 메탄올 등의 알콜류도 단독 또는 다른 탄소원과 병용하여 사용할 수 있다. 또한 탄소원이 되는 원료로서는, 케인 당밀, 비트 당밀, 하이테스트 당밀, 시트러스 당밀, 전화당을 사용해도 양호하며, 셀룰로스, 전분, 옥수수, 시리얼, 타피오카 등의 천연 원료의 가수분해물을 사용해도 양호하다. 또한 배양액 중에 용존된 이산화탄소도 탄소원으로서 사용할 수 있다. 이들 탄소원을 초발 배지에도 유가 배지에도 사용할 수 있다. 배지 중에 이들 탄소원을 1종만 함유하고 있어도 양호하며, 2종 이상 함유하고 있어도 양호하다. 또한, 초발 배지, 유가 배지 모두 동일한 탄소원을 사용해도 양호하며, 유가 배지의 탄소원을 초발 배지와 변경해도 양호하다. 예를 들면, 초발 배지의 탄소원을 글루코스로 하고, 유가 배지의 탄소원을 수크로스로 하는 경우이다.

본 발명의 배지 중에 함유되는 질소원으로서는, 암모니아, 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 아세트산암모늄, 우레아 등의 암모늄염 또는 질산염 등을 사용할 수 있고, pH 조정에 사용되는 암모니아 가스, 암모니아수도 질소원으로서 이용할 수 있다. 또한 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수침지여액, 대두가수분해물 등도 이용할 수 있다. 배지 중에 이들 질소원을 1종만 함유하고 있어도 양호하고, 2종 이상 함유하고 있어도 양호하다. 이들 질소원은 초발 배지에도 유가 배지에도 사용할 수 있다. 또한 초발 배지, 유가 배지 모두 동일한 질소원을 사용해도 양호하고, 유가 배지의 질소원을 초발 배지와 변경해도 양호하다.

또한, 본 발명의 배지에는, 탄소원, 질소원 외에 인산원을 함유하고 있는 것이 바람직하다. 인산원으로서는, 인산2수소칼륨, 인산수소2칼륨, 피롤린산 등의 인산 중합체 등을 이용할 수 있다.

또한 본 발명의 배지에는, 탄소원, 질소원 외에, 증식 촉진 인자(증식 촉진 효과를 갖는 영양소)를 함유하고 있어도 양호하다. 증식 촉진 인자란, 미량 금속류, 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 또한 이러한 것을 함유하는 펩톤, 카사미노산, 효모 추출물, 대두단백분해물 등을 사용할 수 있다. 특히 방향족 아미노산, 측쇄 아미노산의 경우, 생합성계가 공통되고 있기 때문에, 미생물이 후술과 같이, 목적 아미노산 이외의 생합성이 약화되고 있는 경우가 있다. 이러한 경우, 생합성계가 약화된 아미노산을 배지 중에 첨가하는 것이 바람직하다. 예를 들면 목적 아미노산이 L-트립토판인 경우, L-페닐알라닌 및/또는 티로신, 목적 아미노산이 L-페닐알라닌인 경우, L-트립토판 및/또는 L-티로신을 첨가하는 것이 바람직하다[참조: WO2003048374호 팜플렛].

미량 금속류로서는, 철, 망간, 마그네슘, 칼슘 등을 들 수 있고, 비타민으로서는, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 니코틴산, 니코틴산아미드, 비타민 B12, 피리독신, 판토텐산 등을 들 수 있다. 이들 증식 촉진 인자는 초발 배지에 함유되어 있어도 양호하고, 유가 배지에 함유되어 있어도 양호하다.

또한 본 발명의 배지에는, 생육에 아미노산 등을 요구하는 영양 요구성 변이주를 사용하는 경우에는 요구되는 영양소를 보첨하는 것이 바람직하다. 특히 본 발명에 사용할 수 있는 L-아미노산 생산균은, 후술과 같이 L-아미노산 생합성 경로가 강화되어 있고, L-아미노산 분해능이 약화되어 있는 것이 많기 때문에, L-리신, L-호모세린, L-이소류신, L-메티오닌으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 첨가하는 것이 바람직하다. 핵산 생산균에 관해서도 동일하게, 필요한 물질을 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.

초발 배지와 유가 배지는, 배지 조성이 동일해도 양호하며, 상이해도 양호하다. 또는, 유가 배지의 유가가 다단계로 이루어지는 경우, 각각의 유가 배지의 조성은 동일해도 양호하고, 상이해도 양호하다.

배양은, 발효 온도 20 내지 45℃, 특히 바람직하게는 30 내지 42℃에서 통기 배양을 실시하는 것이 바람직하다. 발효조에 공급하는 기체로서는, 공기 외에 고농도 산소를 공기와 동시에 공급하여 공급 기체 중의 산소 농도를 높일 수도 있다[참조: 일본 특허공보 제(평)05-048117호, 일본 특허공보 제(평)5-39594호].

산소 공급량은 배지 중의 산소 농도가 2 내지 4ppm이 되는 양이면 양호하며, 산소 농도 40 내지 100%의 고농도 산소와, 공기와의 혼합 가스를 1/10 내지 1.5/1VVM 공급하는 것이 바람직하다. 고농도 산소는, 산소 농축기를 사용하여 조제할 수 있다. 여기에서, 산소 농축기로서는, PSA식, 산소부화막식이 있고, 액체 산소를 증발기로 기화시키거나, 또는 직접 발효조에 공급하는 방법을 사용할 수 있다.

또한, pH를 5 내지 9로 제어하고, 통기 배양을 실시한다. 배양 중에 pH가 저하되는 경우에는, 예를 들면, 탄산칼슘을 가하거나, 암모니아 가스, 암모니아수 등의 알칼리로 중화한다. 또한 목적 아미노산이 산성 아미노산, 예를 들면 L-글루탐산인 경우에는, pH는 3 내지 9, 바람직하게는 3 내지 5로 실시하는 것이 바람직하다. 이러한 조건하에서 바람직하게는 10 내지 120시간 정도 배양함으로써, 배양액 중에 현저한 양의 목적 물질이 축적된다. 축적되는 목적 물질의 농도는 야생주보다 높으며, 배지 중에서 채취·회수할 수 있는 농도이면 어느 것이라도 양호하지만, L-아미노산의 경우에는, 50g/L 이상, 바람직하게는 75g/L 이상, 더욱 바람직하게는 100g/L 이상, 핵산의 경우에는 50g/L 이상, 바람직하게는 75g/L 이상, 더욱 바람직하게는 100g/L 이상인 것이 바람직하다.

배양 종료후의 배양액으로부터 목적 물질을 채취하는 방법은, 공지의 회수방법에 따라서 실시하면 양호하다. 예를 들면, 배지 중에 석출된 목적 물질은, 원심분리 또는 여과 등에 의해 회수할 수 있다. 또한 배지 중에 석출된 목적 물질은, 배지 중에 용해되어 있는 목적 물질을 결정 석출한 후에 함께 분리해도 양호하다.

본 발명에 있어서는, 목적 물질 축적을 일정 이상 유지하기 위해, 미생물의 배양을 종배양과 본배양으로 나누어 실시해도 양호하며, 예를 들면 종배양을 플라스크 등을 사용한 진탕 배양, 또는 회분 배양으로 실시하고, 본배양을 유가 배양, 회분 배양 또는 연속 배양으로 실시해도 양호하며, 종배양, 본배양 모두 회분 배양으로 실시해도 양호하다. 또한 종배양 및 본배양에 앞서 1회, 2회 또는 그 이상의 전배양을 실시하여 순차 스케일업해도 양호하다.

이들 배양법의 경우, 예정한 목적 물질 농도에 도달했을 때에 목적 물질을 일부 뽑아 내고 새롭게 배지를 첨가하여 반복해서 배양을 실시해도 양호하다. 새롭게 첨가하는 배지란, 탄소원 및 증식 촉진 효과를 갖는 영양소(증식 촉진 인자)를 함유하는 배지가 바람직하다. 탄소원으로서는, 글루코스, 수크로스, 프럭토스, 증식 촉진 인자로서는, 질소원, 인산, 아미노산 등이 바람직하다. 질소원으로서는, 암모니아, 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 아세트산암모늄, 우레아 등의 암모늄염 또는 질산염 등을 사용할 수 있다. 또한 인산원으로서는, 인산2수소칼륨, 인산수소2칼륨을 사용할 수 있고, 아미노산으로서는, 영양 요구성 변이주를 사용하는 경우에는 요구되는 영양소를 보첨하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 유가 배양 또는 연속 배양을 실시할 때에는, 일시적으로 당이나 영양원의 공급이 정지되도록 간헐적으로 유가 배지를 유가해도 양호하다. 또한, 유가를 실시하는 시간의 최대로 30% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하에서 유가 배지의 공급을 정지하는 것이 바람직하다. 유가 배양액을 간헐적으로 유가시키는 경우에는, 유가 배지를 일정 시간 첨가하고, 2회 이후의 첨가는 어느 첨가기에 선행하는 첨가 정지기에 있어서 발효 배지 중의 탄소원이 고갈될 때의 pH 상승 또는 용존 산소 농도의 상승이 컴퓨터로 검출될 때에 개시하도록 제어를 실시하여 배양조 내의 기질 농도를 항상 자동적으로 낮은 레벨로 유지해도 양호하다[참조: 미국특허 5,912,113호 명세서].

탄소원으로서는, 글루코스, 수크로스, 프럭토스, 증식 촉진 인자로서는, 질소원, 인산, 아미노산 등이 바람직하다. 질소원으로서는, 암모니아, 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 아세트산암모늄, 우레아 등의 암모늄염 또는 질산염 등을 사용할 수 있다. 또한 인산원으로서는, 인산2수소칼륨, 인산수소2칼륨을 사용할 수 있고, 아미노산으로서는, 영양 요구성 변이주를 사용하는 경우에는 요구되는 영양소를 보첨하는 것이 바람직하다. 또한 유가 배지는 1종이라도 양호하며, 2종 이상의 배지를 혼합해도 양호하다. 2종 이상의 유가 배지를 사용하는 경우, 이들 배지는 혼합하여 하나의 공급캔에 의해 유가시켜도 양호하며, 복수의 공급캔으로 유가시켜도 양호하다.

또한 유가 배양을 실시할 때에, 당의 양이, 유가 배양액 또는 발효 배지 전체의 탄소원량으로서, 30g/L을 초과하지 않을 정도로 유가시키는 것이 바람직하고, 20g/L 이하, 10g/L 이하로 제어하는 것이 바람직하다. 특히, 미생물의 대수 증식 종료시 이후에, 당 농도가 상기 농도 범위가 되도록 제어하는 것이 바람직하다. 탄소원의 유가 속도는, 미국특허 5,912,113호 명세서 기재의 방법을 사용하여 제어할 수 있다. 또한, 당과 인산이 균체 생육의 제한 인자가 되는 농도로 당과 인산을 유가하는 것이 바람직하고, 유가 배양액에 함유되는 인산의 양으로서는, P/C ratio로 2 이하, 바람직하게는 1.5 이하, 더욱 바람직하게는 1 이하이다[참조: 미국특허 5,763,230호 명세서].

본 발명에서 연속 배양법을 사용하는 경우에는, 인발(引拔)은 유가와 동시에 실시해도 양호하며, 일부 인발한 후에 유가를 실시해도 양호하다. 또한 배양액을 목적 물질과 세포를 함유한 채로 인발하여 세포만 발효조로 되돌리는 균체를 재이용하는 연속 배양법이라도 양호하다[참조: 프랑스특허 2669935호 명세서]. 연속적 또는 간헐적으로 영양원을 유가하는 방법은 유가 배양과 동일한 방법이 사용된다.

여기에서, 배양액을 간헐적으로 인발하는 경우에는, 예정한 목적 물질 농도에 도달했을 때에, 목적 물질을 일부 인발하여 새롭게 배지를 유가하여 배양을 실시한다. 또한, 첨가하는 배지의 양은, 최종적으로 인발하기 전의 배양액량과 동량이 되도록 배양하는 것이 바람직하다. 여기에서 동량이란, 인발하기 전의 배양액량과 93 내지 107% 정도의 양을 의미한다.

배양액을 연속적으로 인발하는 경우에는, 영양 배지를 유가시키는 동시에, 또는 유가시킨 후에 개시하는 것이 바람직하며, 예를 들면 개시 시간으로서는 최대로 유가를 시작한 5시간후, 바람직하게는 3시간후, 더욱 바람직하게는 최대로 1시간후이다. 또한 인발하는 배양액량으로서는, 유기시키는 양과 동량으로 인발하는 것이 바람직하다.

균체를 재이용하는 연속 배양법이란, 예정된 목적 물질 농도에 도달했을 때에, 발효 배지를 간헐적으로 또는 연속하여 인발하여 목적 물질만을 취출하여 균체를 함유하는 여과 잔류물 또는 원심 상청액을 발효조 중에 재순환시키는 방법이고,예를 들면 프랑스특허 2669935호 명세서를 참조하여 실시할 수 있다.

또한 본 발명의 결정 석출 방법으로 석출한 결정은, 배양 도중에 발효조로부터 인발해도 양호하다. 구체적으로는, 발효조에서 본 발명의 방법을 사용하여, 결정 석출 발효를 실시하여 목적 물질, 균체를 함유하는 발효액을 발효액으로부터 인발하고, 목적 물질의 결정을 원심 처리·농축하여 결정을 취출하고, 발효액을 발효조로 되돌리는 방법에 의해, 생산성을 높이는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 도 1에 기재된 장치로, 목적 물질, 균체를 함유하는 발효액을 라인 A로부터 순환시켜 목적 물질의 결정을 원심 처리 B로 농축하여 라인 C로부터 인발하고, 발효액을 라인 D로부터 발효조로 되돌리는 방법을 사용할 수 있다. 이 때, 균체는 발효조로 되돌려도, 되돌리지 않아도 양호하다. 결정의 원심분리처리에는 액체 사이클론[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-92944호]을 사용하면 적합하다.

또한, 핵산의 제조법에 있어서는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 이노신 또는 구아노신에, 퓨린뉴클레오사이드포스포릴라제 및 포스포리보실트랜스퍼라제를 작용시킴으로써 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산이 수득된다.

또한, 본 발명의 미생물을 사용하여 생산된 퓨린뉴클레오사이드에, 포스포트랜스퍼라제를 작용시킴으로써 인산화하고, 퓨린뉴클레오타이드(뉴클레오사이드-5'-인산에스테르)를 생산하는 것도 가능하다[참조: 일본 공개특허공보 2000-295996호]. 예를 들면, 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)의 이노신구아노신키나제를 암호화하는 유전자를 도입한 에세리키아속 세균을 사용하는 퓨린뉴클레오타이드의 제조법[참조: WO91/08286호 팜플렛], 엑시구오박테리움 아세틸리쿰(Exiguobacterium acetylicum)의 이노신구아노신키나제를 암호화하는 유전자를 도입한 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)를 사용한 퓨린뉴클레오타이드의 제조법[참조: WO96/30501호 팜플렛]을 채용할 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물을 사용하여 생산된 퓨린뉴클레오사이드에, 폴리인산, 페닐인산, 카르바밀인산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 인산 공여체와, 뉴클레오사이드-5'-인산에스테르를 생성하는 능력을 갖는 미생물이나, 산성 포스파타제(EC 3.1.3.2)를 작용시킴으로써, 퓨린뉴클레오타이드(뉴클레오사이드-5'-인산에스테르)를 생산하는 것도 가능하다. 뉴클레오사이드-5'-인산에스테르를 생성하는 능력을 갖는 미생물은, 퓨린뉴클레오사이드를 퓨린뉴클레오타이드로 변환하는 능력을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 국제공개팜플렛 WO9637603호에 기재된 바와 같은 미생물을 들 수 있다.

또한, 일본 공개특허공보 제(평)07-231793호에 개시되어 있는 바와 같은 에세리키아 블랏타에(Escherichia blattae)JCM 1650, 세라티아 피카리아(Serratia ficaria)ATCC 33105, 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola)IFO 14939(ATCC 33531), 클레브시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae)IFO 3318(ATCC 8724), 클레브시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena)IFO 14941(ATCC 33257), 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii)IFO 3168, 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes)IFO 12010, 엔테로박터 아에로게네스 IFO 13534(ATCC 13048), 크로모박테리움 플루비아틸레(Chromobacterium fluviatile)IAM 13652, 크로모박테리움 비오라세움(Chromobacterium violaceum)IFO 12614, 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei)JCM 1684, 세데세아 다비시에(Cedecea davisiae)JCM 1685, 세데세아 네테리(Cedecea neteri)JCM 5909 등을 사용할 수도 있다.

산성 포스파타제로서는, 예를 들면, 일본 공개특허공보 2002-000289호에 개시되어 있는 바와 같은 것을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 상승된 산성 포스파타제[참조: 일본 공개특허공보 제(평)10-201481호]나 뉴클레오티다제 활성이 저하된 변이형 산성 포스파타제[참조: WO9637603], 인산에스테르 가수분해활성이 저하된 변이형 산성 포스타파제[참조: 일본 공개특허공보 2001-245676호] 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 미생물을 사용하여 생산된 퓨린뉴클레오사이드를 화학적으로 인산화함으로써, 퓨린뉴클레오타이드를 수득하는 것도 가능하다[참조: Bulletin of the Chemical Society of Japan 42, 3505]. 또한 미생물이 가지고 있는 ATP 재생계를 이용하여 본 발명의 XMP 생산능을 갖는 미생물과 XMP 아미나제 활성을 공액시킴으로써 GMP를 수득하는 방법, 이노신키나제를 공액시킴으로써 IMP를 수득하는 방법도 채용할 수 있다[참조: Biosci. Biotech. Biochem., 51, 840(1997), 일본 공개특허공보 제(소)63-230094호].

상기 퓨린뉴클레오타이드의 제조에 사용하는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 이노신 또는 구아노신, 또는 퓨린뉴클레오사이드는, 정제된 것이라도 양호하지만, 퓨린뉴클레오사이드의 발효액 또는 퓨린뉴클레오사이드를 함유하는 조정제물이라도 양호하다.

<2> 본 발명에 사용할 수 있는 미생물

본 발명에 사용하는 미생물은, L-아미노산 또는 핵산 생산능을 가지며, 액체 배지에서 배양했을 때에 배지에 L-아미노산 또는 핵산을 축적시킬 수 있는 미생물이면, 특별히 제한되지 않는다. 축적하는 L-아미노산 또는 핵산의 양은, 배지로부터 회수할 수 있을 정도로 축적할 수 있으면 어느 것이라도 양호하지만, 목적 물질을 배지 중에 결정 석출할 수 있는 능력을 갖는 것이 바람직하고, 예를 들면 상기 표 1, 2에 기재된 것 이상의 농도의 목적 물질을 축적할 수 있는 것이 바람직하다.

예를 들면, L-글루탐산을 함유하는 수용액의 pH를 저하시키면, L-글루탐산은 γ-카르복실기의 pKa(4.25) 부근에서 용해도는 현저하게 감소되고, 등전점(pH 3.2)에서 용해도는 가장 낮아진다. 배지 조성에 따라서도 상이하지만, 통상적으로는 L-글루탐산은 약 30℃에 있어서는, pH 3.2에서 10 내지 20g/L, pH 4.0에서는 30 내지 40g/L, pH 4.7에서는 50 내지 60g/L 용해된다.

본 발명에 사용하는 미생물 또는 이를 육종하기 위한 친주로서는, 에세리키아속 세균, 판토에아속 세균을 대표로 하는 장내세균과에 속하는 미생물이나, 코리네형 세균 등을 사용할 수 있다. 또한 메탄올로부터 L-아미노산을 생산할 수 있는, 메틸로필러스속 세균, 메틸로바실러스속 세균 등의 메탄올 자화성 세균을 사용해도 양호하다. 그밖의 장내세균과에 속하는 미생물로서는, 엔테로박터(Enterobacter)속, 클레브시엘라(Klebsiella)속, 세라티아(Serratia)속, 에르위니아(Erwinia)속, 살모넬라(Salmonella)속, 모르가넬라(Morganella)속 등의 γ-프로테오박테리아에 속하는 장내세균을 들 수 있고, 또한 그밖의 미생물로서는, 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus)속 세균, 바실러스(Bacillus)속 세균, 사카로마이세스속이나 캔디다속 등에 속하는 효모 등을 들 수 있다.

에세리키아속 세균으로서는, 나이트하르트 외의 저서[참조: Neidhardt, F. C. et. al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, table 1]에 열거한 것, 예를 들면 에세리키아 콜라이 등을 이용할 수 있다. 에세리키아 콜라이의 야생주로서는, 예를 들면 K12주 또는 이의 유도체, 에세리키아 콜라이 MG1655주(ATCC No.47076), 및 W3110주(ATCC No.27325) 등을 들 수 있다. 이들을 입수하기 위해서는, 예를 들면 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 분양을 받을 수 있다(주소: ATCC, Address: P.0.Box 1549, Manassa, VA 20108, 1, United States of America). 즉, 균주별로 대응하는 등록번호가 부여되어 있고, 이 등록번호를 이용하여 분양을 받을 수 있다. 각 균주에 대응하는 등록번호는 아메리칸 타입 컬처 콜렉션의 카탈로그에 기재되어 있다[참조: http://www.atcc.org/].

또한 엔테로박터속 세균으로서는, 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 등, 판토에아속 세균으로서는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)를 들 수 있다. 또한, 최근 엔테로박터 아글로메란스는, 16S rRNA의 염기 서열 해석 등에 의해, 판토에아 아글로메란스(Pantoea Agglomerans) 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis), 판토에아 스튜알티(Pantoea stewartii) 등으로 재분류되어 있는 것이 있다. 본 발명에 있어서는, 장내세균과로 분류되는 것이면, 엔테로박터속 또는 판토에아속 중 어느 것에 속하는 것이라도 양호하다. 판토에아 아나나티스를 유전자 공학적 수법을 사용하여 육종하는 경우에는, 판토에아 아나나티스AJ13355주(FERM BP-6614), AJ13356주(FERM BP-6615), AJ13601주(FERM BP-7207) 및 이들 유도체를 사용할 수 있다. 이들 주는 분류된 당시에는 엔테로박터 아글로메란스라고 동정되어 엔테로박터 아글로메란스로서 기탁되었지만, 상기와 같이 16S rRNA의 염기 서열 해석 등에 의해, 판토에아 아나나티스로 재분류되어 있다.

메틸로필러스속 세균으로서 구체적으로는, 메틸로필러스 메틸로트로파스를 들 수 있고, 대표적인 주로서는 AS1주(NCIMB10515) 등을 들 수 있다. 메틸로필러스 메틸로트로파스 AS1주는 내셔널 콜렉션 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아[참조: National Collections of Industrial and Marine Bacteria, 주소 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom]으로부터 입수 가능하다.

메틸로바실러스속 세균으로서 구체적으로는, 메틸로바실러스 글리코게네스(Methylobacillus glycogenes), 메틸로바실러스 플라겔라텀(Methylobacillus flagellatum) 등을 들 수 있다. 메틸로바실러스 글리코게네스로서는, T-11주(NCIMB 11375), ATCC 21276주, ATCC 21371주, ATR80주[참조: Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994), 42권, p67-72에 기재], A513주[참조: Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994), 42권, p.67-72에 기재] 등을 들 수 있다. 메틸로바실러스 글리코게네스 NCIMB 11375주는, 내셔널 콜렉션 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아(National Collections of Industrial and Marine Bacteria, 주소 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom]으로부터 입수 가능하다. 또한, 메틸로바실러스 플라겔라텀으로서는 KT주[참조: Arch. Microbiol., (1988), 149권, p441-446에 기재] 등을 들 수 있다.

코리네형 세균으로서는, 버지즈 매뉴얼 오브 디터미네이티브 박테리올로지(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology), 제8판 599페이지(1974)에 정의되어 있는 일군의 미생물이며, 호기성, 그람 양성, 비항산성, 포자 형성능을 갖지 않는 간균으로 분류되는 미생물을 이용할 수 있다. 또한 코리네형 세균은 종래 브레비박테리움속으로 분류되어 있었지만 현재는 코리네박테리움속 세균으로서 통합된 세균[참조: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)] 및 코리네박테리움속과 매우 근연한 브레비박테리움속 세균 및 마이크로박테리움속 세균을 포함한다.

이러한 코리네형 세균의 예로서 이하의 것을 들 수 있다.

코리네박테리움 아세토아시도필룸

코리네박테리움 아세토글루타미쿰

코리네박테리움 알카놀리티쿰

코리네박테리움 칼루나에

코리네박테리움 글루타미쿰

코리네박테리움 릴리움

코리네박테리움 멜라세콜라

코리네박테리움 서모아미노게네스(코리네박테리움 에피시엔스)

코리네박테리움 허쿨리스

브레비박테리움 디바리카툼

브레비박테리움 플라붐

브레비박테리움 임마리오필룸

브레비박테리움 락토퍼멘텀

브레비박테리움 로제움

브레비박테리움 사카롤리티쿰

브레비박테리움 티오게니탈리스

코리네박테리움 암모니아게네스

브레비박테리움 알붐

브레비박테리움 세리늄

마이크로박테리움 암모니아필룸

구체적으로는, 하기와 같은 균주를 예시할 수 있다.

코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC13870

코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806

코리네박테리움 알카놀리티쿰 ATCC21511

코리네박테리움 칼루나에 ATCC15991

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060

코리네박테리움 릴리움 ATCC15990

코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965

코리네박테리움 에피시엔스 AJ12340(FERM BP-1539)

코리네박테리움 허쿨리스 ATCC13868

브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020

브레비박테리움 플라붐 ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)

브레비박테리움 임마리오필룸 ATCC14068

브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC13869(코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869)

브레비박테리움 로제움 ATCC13825

브레비박테리움 사카롤리티쿰 ATCC14066

브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCC19240

코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6871, ATCC6872

브레비박테리움 알붐 ATCC15111

브레비박테리움 세리늄 ATCC15112

마이크로박테리움 암모니아필룸 ATCC15354

이들을 입수하기 위해서는, 예를 들면 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(주소: P.0.Box 1549, Manassas, VA 2010812301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America)로부터 분양을 받을 수 있다. 또한, AJ12340주는 1987년 10월 27일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터)(우305-8566 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 다이6)에 FERM BP-1539의 수탁번호로 부다페스트조약에 기초하여 기탁되어 있다. 또한 AJ12418주는, 1989년 1월 5일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 FERM BP-2205의 수탁번호로 부다페스트 조약에 기초하여 기탁되어 있다.

바실러스속 세균을 사용할 때에는, 바실러스속 세균으로서는, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀롤리케파시엔스, 바실러스 푸밀러스 등을 들 수 있다.

바실러스 서브틸리스로서는, 바실러스 서브틸리스168 Marburg(ATCC6051), 바실러스 서브틸리스PY79(참조: Plasmid, 1984, 12, 1-9) 등을, 바실러스 아밀롤리케파시엔스로서는, 바실러스 아밀롤리케파시엔스T(ATCC23842), 및 바실러스 아밀롤리케파시엔스N(ATCC23845) 등을 들 수 있다. 또한, 바실러스 푸밀러스로서는, 바실러스 푸밀러스 Gottheil No.3218(ATCC No.21005)[참조: 미국특허 제3,616,206호] 등을 들 수 있다.

이하, 상기와 같은 친주에 L-아미노산 또는 핵산 생산능을 부여하는 방법에 관해서 서술한다.

L-아미노산 또는 핵산 생산능을 부여하기 위해서는, 영양 요구성 변이주, 유사체 내성주 또는 대사 제어 변이주의 취득이나, L-아미노산 또는 핵산의 생합성계 효소의 발현이 증강된 재조합주의 창제 등, 종래 코리네형 세균 또는 에세리키아속 세균 등의 육종에 채용되어 온 방법을 적용할 수 있다[참조: 아미노산 발효, (주) 학회출판센터, 1986년 5월 20일 초판 발행, 제77 내지 100페이지]. 여기에서, L-아미노산 생산균의 육종에 있어서, 부여되는 영양 요구성, 유사체 내성, 대사 제어 변이 등의 성질은, 단독이라도 양호하며, 2종 또는 3종 이상이라도 양호하다. 또한 발현이 증강되는 L-아미노산 생합성계 효소도, 단독이라도, 2종 또는 3종 이상이라도 양호하다. 또한, 영양 요구성, 유사체 내성, 대사 제어 변이 등의 성질의 부여와, 생합성계 효소의 증강이 조합되어도 양호하다.

L-아미노산 또는 핵산 생산능을 갖는 영양 요구성 변이주, L-아미노산 또는 핵산의 유사체 내성주, 또는 대상 제어 변이주를 취득하기 위해서는, 친주 또는 야생주를 통상의 변이 처리, 즉 X선이나 자외선의 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 변이제 처리 등에 의해 처리하여 수득된 변이주 중에서 영양 요구성, 유사체 내성 또는 대사 제어 변이를 나타내고, L-아미노산 생산능을 갖는 것을 선택함으로써 수득할 수 있다.

L-아미노산 생산능을 갖는 영양 요구성 변이주, L-아미노산의 유사체 내성주, 또는 대사 제어 변이주는 친주 또는 야생주를 통상의 변이 처리, 즉, X선이나 자외선의 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG), 에틸메탄설포네이트(EMS) 등의 변이제 처리 등에 의해 처리하고, 수득된 변이주 중에서 영양 요구성, 유사체 내성, 또는 대사 제어 변이를 나타내고, L-아미노산 생산능을 갖는 것을 선택함으로써 수득할 수 있다.

이하, 구체적으로 L-아미노산 생산능을 부여하는 방법과 아미노산 생산균에 관해서 예시한다.

L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신은 모두 방향족 아미노산으로 생합성계가 공통하고 있고, 방향족 아미노산의 생합성계 효소를 암호화하는 유전자로서는, 데옥시아라비노-헵툴론산인산 신타제(aroG), 3-데하이드로퀴네이트 신타제(aroB), 시킴산 데하이드로게나제(aroE), 시킴산 키나제(aroL), 5-에놀산피루빈시킴산3-인산 신타제(aroA), 코리슴산 신타제(aroC)를 들 수 있다[참조: 유럽 출원공개 763127호 명세서]. 또한 이들 유전자는 티로신 리프레서(tyrR)에 의해 제어되는 것이 알려져 있고, tyrR 유전자를 결손시킴으로써, 방향족 아미노산의 생합성계 효소 활성을 상승시켜도 양호하다[참조: 유럽특허 763127호 명세서]. 한편, 효소명 뒤의 괄호안은, 유전자명이다(이하의 기재에 있어서도 동일).

또한, 각각의 아미노산 생산능을 강화시키는 경우, 목적으로 하는 방향족 아미노산 이외의 생합성계를 약화시켜도 양호하다. 예를 들면, 목적 아미노산이 L-트립토판인 경우, L-페닐알라닌 생합성계, L-티로신 생합성계를 약화시켜도 양호하다[참조: US4,371,614].

또한, 3-데옥시-D-아라비노헵툴론산-7-인산 신타제(aroF, aroG)는, 방향족 아미노산에 의한 피드백 저해를 받기 때문에, 피드백 저해를 받지 않도록 개변해도 양호하다. 예를 들면, aroF의 경우, N 말단으로부터 147위치의 L-아스파라긴산 또는 181위치의 L-세린이 다른 아미노산 잔기에, aroG의 경우, N 말단으로부터 146위치의 L-아스파라긴산, 147위치의 L-메티오닌, 150위치의 L-프롤린 또는 202위치의 L-알라닌의 1아미노산 잔기, 또는 157위치의 L-메티오닌 및 219위치의 L-알라닌의 2아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환한 변이형 aroF, aroG 유전자를 숙주에 도입함으로써, 방향족 생산 아미노산 생산균을 수득할 수 있다[참조: EP0488424].

또한 측쇄 아미노산의 합성에 관여하는 유전자로서, ilvGMEDA 오페론을 들 수 있지만, 동 오페론은, L-발린 및/또는 L-이소류신 및/또는 L-류신에 의한 오페론의 발현 조절(어테뉴에이션)을 받기 때문에, 어테뉴에이션에 필요한 영역이 제거 또는 변이된 ilvGMEDA 오페론을 미생물로 유지시킴으로써, 이들의 L-아미노산의 생산성을 향상시킬 수 있다.

방향족 아미노산, 측쇄 아미노산은 각각의 생합성계가 공통하고 있고, 목적으로 하는 L-아미노산 이외의 방향족 아미노산, 측쇄 아미노산에 고유의 생합성계를 약화시킨 주를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 목적 아미노산이 L-트립토판인 경우, L-페닐알라닌, L-티로신 고유의 생합성계를 약화시키는 것, 목적 아미노산이 L-페닐알라닌인 경우, L-트립토판, L-티로신 고유의 생합성계를 약화시키는 것, 목적 아미노산이 L-발린인 경우, L-류신, L-이소류신 고유의 생합성계를 약화시키는 것, 목적 아미노산이 L-이소류신인 경우, L-발린, L-류신 고유의 생합성계를 약화시키는 것, 목적 아미노산이 L-류신인 경우, L-발린, L-이소류신 고유의 생합성계를 약화시킴으로써, 목적 L-아미노산을 효율적으로 생산하는 균주를 수득할 수 있다. 생합성계를 약화시키는 것은, 각각의 그 생합성계의 효소를 암호화하는 유전자에 변이를 도입하는 것, 또한 합성 배지 중에서 약화시키고 싶은 생합성계에 의해 합성되는 L-아미노산을 요구하는 주를, 동 L-아미노산을 함유하는 합성 배지를 사용하여 취득하는 것에 의해 달성할 수 있다.

이하에, L-아미노산 생산능을 부여하는 방법 및 본 발명에서 사용할 수 있는 L-아미노산 생산능이 부여된 미생물을 예시한다.

L-트립토판 생산균

L-트립토판 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 변이 trpS 유전자에 의해 암호화되는 트립토파닐-tRNA 신테타제가 결손된 E.coli JP4735/pMU3028(DSM10122) 및 JP6015/pMU91(DSM10123)[참조: 미국특허 제5,756,345호], 세린에 의한 피드백 저해를 받지 않는 포스포글리세릴레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 serA 대립유전자 및 트립토판에 의한 피드백 저해를 받지 않는 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 trpE 대립유전자를 갖는 E.coli SV164(pGH5)[참조: 미국특허 제6,180,373호], 트립토파나제가 결손된 E. coli AGX17(pGX44)(NRRL B-12263) 및 AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)[참조: 미국특허 제4,371,614호], 포스포에놀피루브산 생산능이 증대된 E. coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps[참조: WO9708333, 미국특허 제6,319,696호] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. yedA 유전자 또는 yddG 유전자로 암호화되는 단백질의 활성이 증대된 에세리키아속에 속하는 L-트립토판 생산균도 사용할 수 있다[참조: 미국특허출원공개 2003/0148473 A1 및 2003/0157667 A1].

L-트립토판 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 안트라닐레이트 신타제(trpE), 포스포글리세레이트 데하이드로게나제(serA) 및 트립토판 신타제(trpAB)로부터 선택되는 효소의 활성의 1종 이상이 증대된 주도 들 수 있다. 안트라닐레이트 신타제 및 포스포글리세레이트 데하이드로게나제는 모두 L-트립토판 및 L-세린에 의한 피드백 저해를 받기 때문에, 피드백 저해를 해제하는 변이를 이들 효소에 도입해도 양호하다. 이러한 변이를 갖는 주의 구체예로서는, 탈감작형 안트라닐레이트 신타제를 유지하는 E. coli SV164 및 피드백 저해가 해제된 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 변이 serA 유전자를 함유하는 플라스미드 pGH5[참조: WO94/08031]를 E. coli SV164에 도입함으로써 수득된 형질전환주를 들 수 있다.

또한, L-트립토판 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서, 3-포스포글리세린포스파타제(serB) 활성을 증대시킨 주[참조: US4,371,614], 포스포에놀피루브산카르복시키나제(pckA)를 증대시킨 주[참조: WO2004/090125], 말레에이트신타제 이소시트레이트 리아제 이소시트레이트 데하이드로게나제 키나제/포스파타제 오페론(ace 오페론)이 구성적으로 발현되거나, 또는 동 오페론의 발현이 강화된 주[참조: WO2005/103275]를 들 수 있다.

L-트립토판 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 저해 해제형 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 트립토판 오페론이 도입된 주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-71397호, 일본 공개특허공보 제(소)62-244382호, 미국특허 제4,371,614호]도 들 수 있다. 또한 트립토판 오페론(trpBA) 중의 트립토판 신타제를 암호화하는 유전자의 발현을 증대시킴으로써 L-트립토판 생산능을 부여해도 양호하다. 트립토판 신타제는 각각 trpA 및 trpB 유전자에 의해 암호화되는 α및 β 서브유니트로 이루어진다. 또한, 이소시트레이트 리아제-말레에이트 신타제 오페론의 발현을 증대시킴으로써 L-트립토판 생산능을 개량해도 양호하다[참조: WO2005/103275].

코리네형 세균으로서는 설파구아니딘에 내성주인 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) AJ12118(FERM BP-478 특허 01681002호), 트립토판 오페론이 유도된 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 S63240794호], 코리네형 세균 유래의 시킴산 키나제를 암호화하는 유전자를 도입한 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 01994749호]을 사용할 수 있다.

L-페닐알라닌 생산균

L-페닐알라닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, E.coli AJ12739(tyrA::Tn10, tyrR)(VKPM B-8197), 변이형 pheA34 유전자를 유지하는 E.coli HW1089(ATCC 55371)[참조: 미국특허 제5,354,672], E.coli MWEC101-b[참조: KR8903681], E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 및 NRRL B-12147[참조: 미국특허 제4,407,952호] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 친주로서, E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566), E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659), E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662) 및 AJ 12604라고 명명된 E.coli K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB](FERM BP-3579)도 사용할 수 있다[참조: EP 488424 B1]. 또한 yedA 유전자 또는 yddG 유전자로 암호화되는 단백질의 활성이 증대된 에세리키아속에 속하는 L-페닐알라닌 생산균도 사용할 수 있다[참조: 미국특허출원공개 2003/0148473 A1 및 2003/0157667 A1].

코리네형 세균의 페닐알라닌 생산균으로서는, 포스포에놀피루브산카르복실라제 또는 피루브산키나제 활성이 저하된 코리네박테리움 글루타미쿰 BPS-13주(FERM BP-1777, K77(FERM BP-2062) 및 K78(FERM BP-2063)[참조: 유럽공개특허공보 331145호, JP 02303495], 티로신 요구성주[참조: JP 05049489] 등을 사용할 수 있다.

또한 페닐알라닌 생산균으로서는, 부생물을 세포내에 도입하도록 개변하는 것, 예를 들면, L-트립토판의 도입 유전자 tnaB, mtr이나 L-티로신의 도입 유전자인 tyrP의 발현량을 향상시킴으로써도, 효율적으로 L-페닐알라닌을 생산하는 균주를 취득할 수 있다[참조: EP1484410].

L-티로신 생산균

티로신 생산균으로서는, 티로신에 의한 저해를 받지 않는 탈감작형 프레펜산 데하이드라타제 유전자(tyrA)를 갖는 에세리키아속 세균[참조: 유럽특허출원공개1616940호]을 들 수 있다.

L-발린 생산균

L-발린 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, ilvGMEDA 오페론을 과잉 발현하도록 개변된 주[참조: 미국특허 제5,998,178호]를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. ilvGMEDA 오페론의 어테뉴에이션에 필요한 영역을 제거하고, 생산되는 L-발린에 의해 오페론의 발현이 감쇠하지 않도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 오페론의 ilvA 유전자가 파괴되어 트레오닌 데아미나제 활성이 감소되는 것이 바람직하다.

본 발명의 L-발린 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 아미노아실t-RNA 신테타제에 변이를 갖는 변이주[참조: 미국특허 제5,658,766호]도 들 수 있다. 예를 들면, 이소류신tRNA 신테타제를 암호화하는 ileS 유전자에 변이를 갖는 E.coli VL1970을 사용할 수 있다. E.coli VL1970은 1988년 6월 24일, 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(VKPM)(Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)에 수탁번호 VKPM B-4411로 기탁되어 있다.

또한 생육에 리포산을 요구하는, 및/또는 H⁺-ATPase를 결실하고 있는 변이주[참조: WO96/06926]를 친주로서 사용할 수 있다.

코리네형 세균의 L-발린 생산균으로서는, 예를 들면, L-발린산 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증강되도록 개변한 균주를 들 수 있다. L-발린산 생합성에 관여하는 효소로서는, 예를 들면 ilvBNC 오페론에 의해 암호화되는 효소, 즉 ilvBN에 의해 암호화되는 아세토하이드록시산 신타제나 ivlC에 의해 암호화되는 이소메로리덕타제[참조: 국제공개팜플렛 WO00/50624호]를 들 수 있다. 또한, ilvBNC 오페론은 L-발린 및/또는 L-이소류신 및/또는 L-류신에 의한 오페론의 발현 조절을 받기 때문에, 생성되는 L-발린에 의한 발현 억제를 해제하기 위해 어테뉴에이션을 해제하는 것이 바람직하다.

L-발린 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는, L-발린 생산을 감소시키는 물질 대사 경로에 관여하는, 적어도 1종의 효소의 활성을 저하 또는 결손시킴으로써 실시해도 양호하다. 예를 들면, L-류신 합성에 관여하는 트레오닌 데하이드라타제나 D-판토테네이트 합성에 관여하는 효소의 활성을 저하시키는 것이 고려된다[참조: 국제공개팜플렛 WO0050624호].

L-발린 생산능을 부여하는 다른 방법으로서, 아미노산 유사체 등에 대한 내성을 부여하는 방법도 들 수 있다.

예를 들면, L-이소류신 및 L-메티오닌 요구성 및 D-리보스, 퓨린리보뉴클레오사이드 또는 피리미딘리보뉴클레오사이드에 내성을 가지며, L-발린 생산능을 갖는 변이주(FERM P-1841, FERM P-29, 일본 특허공보 제(소)53-025034호)나 폴리케타이드류에 내성을 갖는 변이주(FERM P-1763, FERM P-1764, 일본 특허공보 제(평)06-065314호), 또는 아세트산을 유일한 탄소원으로 하는 배지에서 L-발린 내성을 나타내며, 글루코스를 유일한 탄소원으로 하는 배지에서 피루브산 유사체(-플루오로피루브산 등)에 감수성을 갖는 변이주(FERM BP-3006, FERM BP-3007, 일본 특허공보 3006929호)를 들 수 있다.

L-이소류신 생산균

L-이소류신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 6-디메틸아미노퓨린에 내성을 갖는 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-304969호], 티아이소류신, 이소류신하이드록사메이트 등의 이소류신유사체에 내성을 갖는 변이주, 또한 DL-에티오닌 및/또는 아르기닌하이드록사메이트에 내성을 갖는 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-130882호]를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 트레오닌데아미나제, 아세토하이드록시산 신타제 등의 L-이소류신 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합주도 또한 친주로서 사용할 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-458호, FR 0356739 및 미국특허 제5,998,178호].

코리네형 세균의 L-이소류신 생산균으로서는, 측쇄 아미노산 배출 단백질을 암호화하는 brnE 유전자를 증폭시킨 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 2001-169788호], L-리신 생산균과의 프로토플라스트 융합에 의해 L-이소류신 생산능을 부여한 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-74293호], 호모세린데하이드로게나제를 강화시킨 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-91193호], 트레오닌하이드록사메이트 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-195293호], α-케토말론 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)61-15695호], 메틸리딘 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)61-15969호]를 들 수 있다.

L-류신 생산균

L-류신 생산균 또는 이것을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 류신 내성의 E.coli주(예를 들면, 57주(VKPM B-7386, 미국특허 제6,124,121호)) 또는 β-2-티에닐알라닌, 3-하이드록시류신, 4-아자류신, 5,5,5-트리플루오로류신 등의 류신 유사체 내성의 E.coli주[참조: 일본 특허공보 제(소)62-34397호 및 일본 공개특허공보 제(평)8-70879호], WO96/06926에 기재된 유전자 공학적 방법으로 수득된 E.coli주, E. coli H-9068[참조: 일본 공개특허공보 제(평)8-70879호] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 세균은 L-류신 생합성에 관여하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량되어 있어도 양호하다. 이러한 유전자의 예로서는, 바람직하게는 L-류신에 의한 피드백 저해가 해제된 이소프로필말레에이트 신타제를 암호화하는 변이 leuA 유전자[참조: 미국특허 제6,403,342호]로 대표되는, leuABCD 오페론의 유전자를 들 수 있다. 또한 본 발명의 세균은, 세균의 세포로부터 L-아미노산을 배출하는 단백질을 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량되어 있어도 양호하다. 이러한 유전자의 예로서는, b2682 유전자 및 b2683 유전자(ygaZH 유전자)[참조: EP 1239041 A2]를 들 수 있다.

코리네형 세균의 L-류신 생산균으로서는, 2-티아졸알라닌, β-하이드록시류신 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)8-266295호], 발린 유사체 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)63-248392호], 발린 요구성주[참조: 일본 특허공보 제(소)38-4395호], S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC) 내성주[참조: 일본 특허공보 제(소)51-37347호], 페닐알라닌, 발린, 이소류신 요구성주[참조: 일본 특허공보 제(소)54-36233호]를 들 수 있다.

L-글루탐산 생산균

L-글루탐산 생산균으로서 적합한 균주는, 예를 들면, L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증강되도록 개변하는 방법을 들 수 있다. L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소로서는, 이러한 유전자의 예로서는, 글루타메이트데하이드로게나제(gdhA), 글루타민 신테타제(glnA), 글루타메이트 신테타제(gltAB), 이소시트레이트 데하이드로게나제(icdA), 아코니테이트하이드라타제(acnA, acnB), 시트레이트 신타제(gltA), 포스포에놀피루베이트카르복실라제(ppc), 피루베이트 데하이드로게나제(aceEF, lpdA), 피루베이트 키나제(pykA, pykF), 포스포에놀피루베이트 신타제(ppsA), 에놀라제(eno), 포스포글리세로 뮤타제(pgmA, pgmI), 포스포글리세레이트 키나제(pgk), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(gapA), 트리오스포스페이트 이소머라제(tpiA), 프럭토스비스포스페이트 알돌라제(fbp), 포스포프럭토키나제(pfkA, pfkB), 글루코스포스페이트 이소머라제(pgi), 메틸시트르산 신타제(prpC) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

시트레이트 신테타제 유전자, 포스포에놀피루베이트카르복실라제 유전자, 이소시트르산 데하이드로게나제, 피루베이트 데하이드로게나제 및/또는 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자의 발현이 증대하도록 개변된 주의 예로서는, EP1078989A, EP955368A 및 EP952221A, EP1033407A에 개시된 것을 들 수 있다.

L-글루탐산 생산능을 부여하기 위한 개변은, L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기하여 다른 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 저하 또는 결손시킴으로써 실시해도 양호하다. L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기하여 L-글루탐산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로서는, 이소시트르산 리아제(aceA), α-케토글루타르산 데하이드로게나제(sucA), 아세토하이드록시산 신타제(ilvG), 아세토락트산 신타제(ilvI), 포름산아세틸 트랜스퍼라제(pfl), 락트산 데하이드로게나제(ldh), 글루탐산 데카르복실라제(gadAB), 1-피롤린5-카르복실레이트 데하이드로게나제(putA) 등을 들 수 있다.

예를 들면 α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 저하시키기 위해서는 당해 효소의 Elo 서브유니트를 암호화하는 sucA(odhA) 유전자를 사용하여 개변하면 양호하다. α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성이 저하된 주로서, 예를 들면, 이하의 주를 들 수 있다.

브레비박테리움 락토퍼멘텀 ΔS주[참조: 국제공개95/34672호 팜플렛],

브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ12821(FERM BP-4172; 프랑스 특허공보 9401748호 명세서 참조)

브레비박테리움 플라붐 AJ12822(FERM BP-4173; 프랑스 특허공보 9401748호 명세서 참조)

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ12823(FERM BP-4174; 프랑스 특허공보 9401748호 명세서 참조)

판토에아 아나나티스 AJ13601(FERM BP-7207)

클레브시엘라 플란티콜라 AJ13410주(FERM BP-6617)

판토에아 아나나티스 AJ13355(FERM BP-6614)

여기에서, 판토에아 아나나티스AJ13356은, αKGDH-E1 서브유니트 유전자(sucA)의 파괴에 의해 α-케토글루탈레이트 데하이드로게나제 활성이 결손되고 있다. 당해 주는, 분리되었을 때에는, 엔테로박터 아글로메란스로 동정되어 엔테로박터 아글로메란스AJ13356으로서 기탁되었다. 그러나, 16S rRNA의 염기 서열 등에 기초하여, 판토에아 아나나티스로 재분류되었다. AJ13356은 상기 기탁 기관에 엔테로박터 아글로메란스로서 기탁되어 있지만, 본 명세서에서는, 판토에아 아나나티스로서 기재한다.

또한 코리네형 세균에 L-글루탐산 생산능을 부여하는 방법으로서, yggB 유전자(NCgl 1221; NP_600492. Reports small-conductance.[gi:19552490]; W02006/070944)를 증폭시키는 방법, 암호화 영역내에 변이를 도입한 변이형 yggB 유전자를 도입하는 방법을 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 제조법에 사용하는 미생물은, D-크실로스5-인산-포스포케톨라제 및/또는 프럭토스6-인산 포스포케톨라제 활성을 증강시키도록 개변된 미생물이라도 양호하다.

D-크실로스5-인산-포스포케톨라제 활성 및 프럭토스6-인산 포스포케톨라제 활성은 어느 한쪽을 활성화해도 양호하고, 양자를 활성화해도 양호하다.

L-글루탐산 생산능을 부여 또는 증강시키는 다른 방법으로서, 유기산 유사체나 호흡 저해제 등에 대한 내성을 부여하는 방법이나 세포벽 합성 저해제에 대한 감수성을 부여하는 방법도 들 수 있다. 예를 들면 모노플루오로아세트산 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)50-113209호], 아데닌 내성 또는 티민 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-065198호], 우레아제를 약화시키는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)52-038088호], 말론산 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)52-038088호], 벤조피론 또는 나프토퀴논류에 대한 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-1889호], HOQNO 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-140895호], α-케토말론산 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-2689호], 구아니딘 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-35981호], 페니실린에 대한 감수성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)4-88994호] 등을 들 수 있다.

이러한 내성균의 구체예로서는, 하기와 같은 균주를 들 수 있다.

브레비박테리움 플라붐AJ3949(FERM BP-2632; 일본 공개특허공보 제(소)50-113209호 참조)

코리네박테리움 글루타미쿰AJ11628(FERM P-5736; 일본 공개특허공보 제(소)57-065198호 참조)

브레비박테리움 플라붐AJ11355(FERM P-5007; 일본 공개특허공보 제(소)56-1889호 참조)

코리네박테리움 글루타미쿰AJ11368(FERM P-5020; 일본 공개특허공보 제(소)56-1889호 참조)

브레비박테리움 플라붐AJ11217(FERM P-4318; 일본 공개특허공보 제(소)57-2689호 참조)

코리네박테리움 글루타미쿰AJ11218(FERM P-4319; 일본 공개특허공보 제(소)57-2689호 참조)

브레비박테리움 플라붐AJ11564(FERM P-5472; 일본 공개특허공보 제(소)56-140895호 참조)

브레비박테리움 플라붐AJ11439(FERM P-5136; 일본 공개특허공보 제(소)56-35981호 참조)

코리네박테리움 글루타미쿰H7684(FERM BP-3004; 일본 공개특허공보 제(평)04-88994호 참조)

브레비박테리움 락토퍼멘텀AJ11426(FERM P-5123; 일본 공개특허공보 제(평)56-048890호 참조)

코리네박테리움 글루타미쿰AJ11440(FERM P-5137; 일본 공개특허공보 제(평)56-048890호 참조)

브레비박테리움 락토퍼멘텀AJ11796(FERM P-6402; 일본 공개특허공보 제(평)58-158192호 참조)

L-트레오닌 생산균

본 발명에 사용되는 L-트레오닌 생산균으로서 바람직한 것으로서는, L-트레오닌 생합성계 효소를 강화시킨 장내세균과에 속하는 세균을 들 수 있다. L-트레오닌 생합성계 효소를 암호화하는 유전자로서는, 아스파르토키나제III 유전자(lysC), 아스파라긴산세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd), thr 오페론으로 암호화되는 아스파르토키나제I 유전자(thrA), 호모세린키나제 유전자(thrB), 트레오닌 신타제 유전자(thrC)를 들 수 있다. 이러한 유전자는 2종류 이상 도입해도 양호하다. L-트레오닌 생합성계 유전자는, 트레오닌 분해가 억제된 장내세균과에 속하는 세균에 도입해도 양호하다. 트레오닌 분해가 억제된 에세리키아속 세균으로서는, 예를 들면 트레오닌 데하이드로게나제 활성이 결손된 TDH-6주[참조: 일본 공개특허공보 2001-346578호] 등을 들 수 있다.

L-트레오닌 생합성계 효소는, 최종 산물인 L-트레오닌에 의해 효소 활성이 억제된다. 따라서, L-트레오닌 생산균을 구축하기 위해서는, L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 L-트레오닌 생합성계 유전자를 개변하는 것이 바람직하다. 또한 상기 thrA, thrB, thrC 유전자는, 트레오닌 오페론을 구성하고 있지만, 트레오닌 오페론은, 어테뉴에이터 구조를 형성하고 있으며, 트레오닌 오페론의 발현은, 배양액 중의 이소류신, 트레오닌에 의해 저해를 받고, 또한 어테뉴에이션에 의해 발현이 억제된다. 이러한 어테뉴에이션의 해제 또는 저감은, 어테뉴에이션 영역의 리더 서열 또는 어테뉴에이터를 제거함으로써 달성할 수 있다[참조: Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69(1987); 국제공개 제02/26993호 팜플렛;국제공개 제2005/049808호 팜플렛].

트레오닌 오페론의 상류에는, 고유의 프로모터가 존재하지만, 비고유(non-native)의 프로모터로 치환해도 양호하고[참조: WO98/04715호 팜플렛], 트레오닌 생합성 관여 유전자의 발현이 람다파지의 리프레서 및 프로모터에 의해 지배되는 트레오닌 오페론을 구축해도 양호하다[참조: 유럽 특허 제0593792호 명세서]. 또한 L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 에세리키아속 세균을 개변하기 위해서, α-아미노-β-하이드록시발레르산(AHV)에 내성인 균주를 선발함으로써도 수득된다.

이와 같이 L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 개변된 트레오닌 오페론은, 숙주내에서 카피수가 상승하고 있거나, 또는 강력한 프로모터에 연결하여 발현량이 증대하고 있는 것이 바람직하다. 카피수의 상승은 플라스미드에 의한 증폭 외에, 트랜스포존, Mu-파지 등으로 게놈 위로 트레오닌 오페론을 전이시킴으로써도 달성할 수 있다.

또한, 아스파르토키나제III 유전자(lysC)는, L-리신에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 개변한 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 피드백 저해를 받지 않도록 개변한 lysC 유전자는, 미국 특허 5,932,453호 명세서에 기재된 방법에 의해 취득할 수 있다.

L-트레오닌 생합성계 효소 이외에도, 해당계, TCA 회로, 호흡쇄에 관한 유전자나 유전자의 발현을 제어하는 유전자, 당의 도입 유전자를 강화시키는 것도 적합하다. 이러한 L-트레오닌 생산에 효과가 있는 유전자로서는, 트랜스하이드로게나제 유전자(pntAB)[참조: 유럽 특허 733712호 명세서], 포스포에놀피루브산 카르복실라제 유전자(pepC)[참조: 국제공개 95/06114호 팜플렛], 포스포에놀피루브산 신타제 유전자(pps)[참조: 유럽 특허 877090호 명세서], 코리네형 세균 또는 바실러스속 세균의 피루브산카르복실라제 유전자[참조: 국제공개 99/18228호 팜플렛, 유럽 출원공개 1092776호 명세서]를 들 수 있다.

또한, L-트레오닌에 내성을 부여하는 유전자 및/또는 L-호모세린에 내성을 부여하는 유전자의 발현을 강화시키는 것이나, 숙주에 L-트레오닌 내성 및/또는 L-호모세린 내성을 부여하는 것도 적합하다. 내성을 부여하는 유전자로서는, rhtA 유전자[참조: Res. Microbiol. 154: 123-135(2003)] , rhtB 유전자[참조: 유럽 특허출원공개 제0994190호 명세서], rhtC 유전자[참조: 유럽 특허출원공개 제1013765호 명세서], yfiK, yeaS 유전자[참조: 유럽 특허출원공개 제1016710호 명세서]를 들 수 있다. 또한 숙주에 L-트레오닌 내성을 부여하는 방법은, 유럽 특허출원공개 제0994190호 명세서나, 국제공개 제90/04636호 팜플렛에 기재된 방법을 참조할 수 있다.

L -트레오닌 생산균으로서, 에세리키아 콜라이 VKPM B-3996주[참조: 미국 특허 제5,175,107호 명세서]를 예시할 수 있다. 당해 VKPM B-3996주는, 1987년 11월 19일에 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika)(주소: Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd,1)에 등록번호 VKPM B-3996하에 기탁되어 있다. 또한 이러한 VKPM B-3996주는, 스트렙토마이신 내성 마커를 갖는 광역 벡터 플라스미드 pAYC32[참조: Chistorerdov, A. Y., and Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16, 161-167(1986)]에 트레오닌 생합성계 유전자(트레오닌 오페론: thrABC)을 삽입하여 수득된 플라스미드 pVIC40[참조: 국제공개 제90/04636호 팜플렛]을 유지하고 있다. 이러한 pVIC40에 있어서는, 트레오닌 오페론 중의 thrA가 암호화하는 아스파르토키나제I-호모세린 데하이드로게나제I의, L-트레오닌에 의한 피드백 저해가 해제되어 있다.

또한 에세리키아 콜라이 VKPM B-5318주[참조: 유럽 특허 제0593792호 명세서]도 적합한 L-트레오닌 생산균으로서 예시할 수 있다. VKPM B-5318주는, 1990년 5월 3일에 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika)(Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)에 등록번호 VKPM B-5318하에 기탁되어 있다. 또한 당해 VKPM B-5318주는, 이소류신 비요구성 균주이며, 람다파지의 온도 감수성 C1 리프레서, PR 프로모터 및 Cro 단백질의 N 말단 부분의 하류에, 본래 갖는 전사 조절 영역인 어테뉴에이터 영역을 결실한 트레오닌 오페론 즉 트레오닌 생합성 관여 유전자가 위치하고, 트레오닌 생합성 관여 유전자의 발현이 람다파지의 리프레서 및 프로모터에 의해 지배되도록 구축된 재조합 플라스미드 DNA를 유지하고 있다.

L-글루타민 생산균

육종에 의해 L-글루타민 생산능을 부여하기 위한 방법으로서는, 예를 들면 L-글루타민 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증강하도록 개변하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면 L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소로서는, 글루타민 신테타제, 글루탐산 데하이드로게나제를 들 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 2002-300887호].

L-글루타민 생산능을 부여하기 위한 개변은, L-글루타민의 생합성 경로로부터 분기하여 다른 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 저하 또는 결손시킴으로써 실시해도 양호하다. 예를 들면 세포내의 글루타미나제 활성을 저하시키는 것을 생각할 수 있다[참조: 일본 공개특허공보2004-187684호].

육종에 의해 L-글루타민 생산능을 부여 또는 증강시키기 위해서는, 아미노산 유사체 등에 대한 내성을 부여하는 방법도 들 수 있다. 6-디아조-5-옥소-노르류신 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)3-232497호], 퓨린 유사체 내성 및/또는 메티오닌설폭사이드 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)61-202694호], α-케토말론산 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-151495호], 글루탐산을 함유하는 펩타이드에 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-186994호] 등을 들 수 있다.

L-글루타민 생산능을 갖는 코리네형 세균의 구체예로서는, 하기와 같은 균주를 들 수 있다.

브레비박테리움 플라붐AJ11573(FERM P-5492; 일본 공개특허공보 제(소)56-151495호 참조)

브레비박테리움 플라붐AJ12210(FERM P-8123; 일본 공개특허공보 제(소)61-202694호 참조)

브레비박테리움 플라붐AJ12212(FERM P-8123; 일본 공개특허공보 제(소)61-202694호 참조)

브레비박테리움 플라붐AJ12418(FERM BP-2205; 일본 공개특허공보 제(평)2-186994호 참조)

브레비박테리움 플라붐DH18(FERM P-11116; 일본 공개특허공보 제(평)3-232497호 참조)

코리네박테리움 멜라세콜라DH344(FERM P-11117; 일본 공개특허공보 제(평)3-232497호 참조)

코리네박테리움 글루타미쿰AJ11574(FERM P-5493; 일본 공개특허공보 제(소)56-151495호 참조)

L-시스테인 생산균

L-시스테인 생산균의 예로서는, 피드백 저해 내성의 세린아세틸 트랜스퍼라제를 암호화하는 상이한 cysE 대립유전자로 형질전환된 E.coli JM15[참조: 미국 특허 제6,218,168호, 러시아 특허출원 제2003121601호], 세포에 독성의 물질을 배출하기에 적합한 단백질을 암호화하는 과잉 발현 유전자를 갖는 E.coli W3110[참조: 미국 특허 제5,972,663호], 시스테인데설포하이드라제 활성이 저하된 E.coli주[참조: JP11155571A2], cysB 유전자에 의해 암호화되는 양의 시스테인 레귤론의 전사 제어 인자의 활성이 상승된 E.coli W3110[참조: WO0127307A1] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또한 본 발명에 사용하는 L-아미노산 생산균은, 고유의 생합성계 효소를 암호화하는 유전자 이외에, 당의 도입, 당 대사(해당계), 에너지 대사에 관여하는 유전자가 증폭되어 있어도 양호하다.

당 대사에 관여하는 유전자로서는, 해당계 효소를 암호화하는 유전자나 당의 도입 유전자를 들 수 있고, 글루코스6-인산 이소머라제 유전자(pgi; 국제공개 제01/02542호 팜플렛), 포스포에놀피루브산 신타제 유전자(pps; 유럽 출원공개 877090호 명세서), 포스포글루코 뮤타제 유전자(pgm; 국제공개 03/04598호 팜플렛), 프럭토스2인산 알돌라제 유전자(fbp; 국제공개 03/04664호 팜플렛), 피루브산 키나제 유전자(pykF; 국제공개 03/008609호 팜플렛), 트랜스알돌라제 유전자(talB; 국제공개 03/008611호 팜플렛), 푸마라제 유전자(fum; 국제공개 01/02545호 팜플렛), 포스포에놀피루브산 신타제 유전자(pps; 유럽 출원공개 877090호 팜플렛), non-PTS 수크로스 도입 유전자(csc; 유럽 출원공개 149911호 팜플렛), 수크로스 자화성 유전자(scrAB 오페론; 국제공개 제90/04636호 팜플렛)을 들 수 있다.

에너지 대사에 관여하는 유전자로서는, 트랜스하이드로게나제 유전자(pntAB;미국 특허 5,830,716호 명세서), 시토크롬 bo형 옥시다제(cytochrome bo type oxidase) 유전자(cyoB; 유럽 특허출원공개 1070376호 명세서)를 들 수 있다.

다음에 미생물에 핵산 생산능을 부여하는 방법과 핵산 생산균에 관해서 예시한다.

핵산 생산능을 갖는 세균 미생물은, 상기와 같은 세균 미생물에, 예를 들면, 퓨린뉴클레오사이드 요구성, 또는 퓨린 유사체 등의 약제에 대한 내성을 부여함으로써, 취득할 수 있다[참조: 일본 특허공보 제(소)38-23099호, 일본 특허공보 제(소)54-17033호, 일본 특허공보 제(소)55-45199호, 일본 특허공보 제(소)57-14160호, 일본 특허공보 제(소)57-41915호, 일본 특허공보 제(소)59-42895호]. 예를 들면 영양 요구성 및 약제 내성을 갖는 바실러스속 세균은, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG), 또는 EMS(에탄메탄설포네이트) 등의 통상의 변이 처리에 사용되고 있는 변이제에 의한 처리에 의해 취득할 수 있다.

퓨린뉴클레오사이드를 생산하는 바실러스속 세균으로서는, 이하의 것을 들 수 있다.

바실러스속에 속하는 이노신 생산주의 구체예로서, 바실러스 서브틸리스KMBS16주를 사용할 수 있다. 동 균주는, 퓨린 오페론 리프레서를 암호화하는 purR유전자의 결손(purR::spc), 석시닐-AMP 신타제를 암호화하는 purA 유전자의 결손(purA::erm), 및 퓨린뉴클레오사이드포스포릴라제를 암호화하는 deoD 유전자의 결손(deoD::kan)이 도입된, 기지의 바실러스 서브틸리스 trpC2주(168 Marburg)의 유도체이다[참조: 일본 공개특허공보 2004-242610호, US2004166575 A1]. 또한 바실러스 서브틸리스 균주 AJ3772(FERM P-2555)[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-014794호] 등을 사용할 수도 있다.

구아노신 생산능을 갖는 바실러스속 세균으로서는, IMP 탈수소 효소의 활성이 상승된 바실러스속 세균[참조: 일본 공개특허공보 제(평)3-58787호], 퓨린유사체 내성 또는 데코이닌 내성 유전자가 편입되어 있는 벡터를 아데닌 요구성 변이주에 도입한 바실러스속 세균[참조: 일본 특허공보 제(평)4-28357호] 등을 들 수 있다.

또한 퓨린뉴클레오타이드를 생산하는 바실러스속 세균으로서는, 이하의 것을 들 수 있다.

이노신산 생산균으로서는, 바실러스 서브틸리스의 포스파타제 활성이 약화된 이노신 생산주가 보고되어 있다[참조: Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805, Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259]. 구아닐산 생산균으로서는, 아데닌 요구성을 가지며 또한 데코이닌 또는 메티오닌 설폭사이드에 내성을 가지며, 5'-구아닐산(구아노신-5'-모노인산, 이하 「GMP」라고도 한다) 생산능을 갖는 바실러스속의 변이주를 들 수 있다[참조: 일본 특허공보 제(소)56-12438호].

또한 크산틸산 생산균은, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammmoniagenes)를 중심으로 하는 코리네형 세균의 육종에 사용되는 방법을 사용하여 구축할 수 있다. 예를 들면 PRPP 아미도트랜스퍼라제를 강화주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)8-168383호], 지방족 아미노산 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)4-262790호], 데하이드로프롤린 내성주[참조: 한국 특허공개공보 2003-56490호]를 취득함으로써, 크산틸산 생산균을 구축할 수 있다.

또한, 퓨린계 물질 생산능을 갖는 바실러스속 세균을 육종하는 방법으로서, 이하의 방법을 들 수 있다. 퓨린뉴클레오사이드 및 퓨린뉴클레오타이드에 공통된 퓨린 생합성에 관여하는 효소, 즉 퓨린 생합성 효소의 세포내에서의 활성을 상승시키는 방법을 들 수 있다. 상기 효소의 세포내에서의 활성은, 바실러스속 세균의 비개변주, 예를 들면 야생형의 바실러스속 세균보다도 상승시키는 것이 바람직하다. 「활성이 상승된다」란, 예를 들면 세포당 효소 분자의 수가 증가한 경우나, 효소 분자당 비(比)활성이 상승한 경우 등이 해당된다. 예를 들면 상기 효소의 유전자의 발현량을 상승시킴으로써 활성을 상승시킬 수 있다. 상기 퓨린 생합성에 관여하는 효소로서는, 예를 들면 포스포리보실피롤린산 아미도트랜스퍼라제, 포스포리보실피롤린산 신테타제(PRPP synthetase [EC:2.7.6.1]) 등을 들 수 있다.

펜토스인산계에 도입된 글루코스 등의 당원이 대사에 의해 생성된 대사산물의 일부는, 리불로스-5-인산을 경유하여, 리보스-5-인산이 된다. 생합성된 리보스-5-인산으로부터, 퓨린뉴클레오사이드, 히스티딘, 및 트립토판 생합성의 불가결한 전구 물질인 포스포리보실피롤린산(PRPP)이 생성된다. 구체적으로는, 리보스-5-인산은, 포스포리보실피롤린산 신테타제에 의해 PRPP로 전환된다. 따라서, 포스포리보실피롤린산 신테타제의 활성이 상승하도록 개변함으로써, 바실러스속 세균에 퓨린계 물질 생산능을 부여 또는 증강시킬 수 있다.

「포스포리보실피롤린산 신테타제의 활성이 상승한다」란, 포스포리보실피롤린산 신테타제의 활성이 야생주 또는 친주 등의 비개변주에 대하여 증가하고 있는 것을 말한다. 포스포리보실피롤린산 신테타제의 활성은 예를 들면 Switzer 등의 방법[참조: Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11], Roth 등의 방법[참조: Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17)에 의해, 측정할 수 있다. 포스포리보실피롤린산 신테타제의 활성이 상승된 바실러스속 세균은, 예를 들면 일본 공개특허공보 2004-242610호에 기재된 방법과 동일하게 하여, 플라스미드를 사용하는 방법이나 염색체 위에 편입하는 방법 등에 의해, 포스포리보실피롤린산 신테타제를 암호화하는 유전자를 바실러스속 세균에서 고발현시킴으로써 제작할 수 있다.

한편, 퓨린뉴클레오사이드, 히스티딘, 및 트립토판 생합성에 불가결한 전구 물질인 PRPP가 생성되면, 그 일부는 퓨린 생합성에 관여하는 효소군에 의해 퓨린뉴클레오타이드, 퓨린뉴클레오사이드로 변환된다. 이러한 효소군을 암호화하는 유전자로서는, 바실러스 서브틸리스의 퓨린 오페론, 구체적으로는 purEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD 오페론의 유전자[참조: Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87](현재는, purEKBCSQLFMNHD라고도 불린다: Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A. L. Sonenshein, ASM Press, Washington D. C., 2002. Genbank Accession No.NC_000964), 및 에세리키아 콜라이의 pur 레귤론의 유전자[참조: Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996]가 예시된다.

따라서, 이러한 유전자의 발현을 증강시킴으로써, 퓨린계 물질 생산능을 부여 또는 증강시킬 수도 있다. 또한, 본 발명에 사용할 수 있는 퓨린 오페론 유전자는 이러한 것에는 한정되지 않으며, 다른 미생물이나 동식물 유래의 유전자도 이용할 수도 있다.

퓨린 오페론의 발현량을 증대시키는 방법으로서는, 플라스미드를 사용하는 방법이나 염색체 위에 편입하는 방법 등에 의해, 퓨린 오페론 유전자를 바실러스속 세균에서 고발현시키는 방법을 들 수 있다.

퓨린 오페론의 발현량을 증대시키는 제2의 방법으로서, 퓨린 오페론 고유의 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 치환하는 것이나, 고유의 프로모터의 -35, -10영역을 컨센서스 서열로 치환하는 것을 들 수 있다.

예를 들면 바실러스 서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg주; ATCC6051)에서는, 퓨린 오페론의 -35 서열은 컨센서스 서열(TTGACA)이지만, -10 서열은 TAAGAT이며, 컨센서스 서열 TATAAT와는 상이하다[참조: Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287]. 따라서, -10 서열(TAAGAT)을 컨센서스 서열로 하는 것, 또는 컨센서스 서열에 근접하여 TATAAT 또는 TATGAT, 또는 TAAAAT가 되도록 개변함으로써, 퓨린 오페론의 전사 활성을 상승시킬 수 있다. 또한, 프로모터 서열의 치환은, 하기의 유전자 치환과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

퓨린 오페론의 발현량을 증대시키는 제3의 방법으로서, 퓨린 오페론의 리프레서의 발현량을 저하시키는 방법도 들 수 있다[참조: USP6,284,495호]. 「퓨린 오페론의 리프레서의 발현」이란, 퓨린 오페론 유전자의 전사, 및 전사 산물의 번역의 양자를 포함한다. 또한 「발현량을 저하시킨다」란, 발현량이, 비개변주, 예를 들면 야생형의 바실러스속 세균에 있어서의 발현량보다도 낮은 것, 및, 발현이 실질적으로 소실되어 있는 것을 포함한다.

퓨린 오페론의 리프레서(퓨린 리프레서)의 발현량을 저하시키기 위해서는, 예를 들면, 바실러스속 세균을 자외선 조사 또는 NTG 또는 EMS 등의 통상 변이 처리에 사용되고 있는 변이제에 의해 처리하여, 퓨린 리프레서의 발현량이 저하된 변이주를 선택하는 방법을 채용할 수 있다.

또한 퓨린 리프레서의 발현량이 저하된 바실러스속 세균은, 변이 처리 이외에, 예를 들면 유전자 재조합법을 사용한 상동 재조합법[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press(1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202]에 의해, 염색체 위의 퓨린 리프레서를 암호화하는 유전자(purR; GenBank Accession NC_000964(암호화 영역은 염기 번호 54439 내지 55293)를, 정상적으로 기능하지 않는 유전자(이하, 「파괴형 유전자」라고 하는 경우가 있다)로 치환함으로써 수득할 수 있다.

또한, 퓨린계 물질의 세포내로의 도입을 약화시킴으로써도, 퓨린계 물질 생산능을 강화시킬 수 있다. 예를 들면 퓨린뉴클레오사이드의 세포로의 도입은, 퓨린뉴클레오사이드의 세포내로의 도입에 관여하는 반응을 차단함으로써 약화시킬 수 있다. 상기 퓨린뉴클레오사이드의 세포내로의 도입에 관여하는 반응은, 예를 들면 뉴클레오사이드 퍼미아제로 촉매되는 반응이다.

또한, 퓨린뉴클레오사이드를 제조하는 경우에는, 퓨린뉴클레오사이드 생산능을 증강시키기 위해서 퓨린계 물질을 분해하는 효소의 활성을 저하시켜도 양호하다. 이러한 효소로서, 예를 들면 퓨린뉴클레오사이드 포스포릴라제를 들 수 있다.

PRPP로부터, 퓨린 생합성에 관여하는 효소군에 의해 생합성된 퓨린뉴클레오타이드는, 탈인산화되어서 퓨린뉴클레오사이드로 변환된다. 퓨린뉴클레오사이드를 효율적으로 축적시키기 위해서는, 퓨린뉴클레오사이드를 더욱 분해하여 히포크산틴 등으로 하는 퓨린뉴클레오사이드포스포릴라제의 활성을 저하시키는 것이 바람직하다. 즉, 이노신을 비롯한 퓨린뉴클레오사이드를 기질로 하는 퓨린뉴클레오사이드포스포릴라제를 약화, 또는 결손시키도록 개변하는 것이 바람직하다.

퓨린뉴클레오사이드포스포릴라제 활성의 저하는, 구체적으로는, 바실러스속 세균으로 퓨린뉴클레오사이드포스포릴라제를 암호화하는 deoD 유전자와 pupG 유전자를 파괴함으로써 달성할 수 있다. 본 발명의 바실러스속 세균은, 상기와 같은 deoD 유전자와 pupG 유전자를 단독, 또는 동시에 파괴하도록 개변된 것이라도 양호하다. deoD 유전자, pupG 유전자는, 예를 들면 바실러스속 유래의 유전자(deoD; Genbank Accession No.NC_000964(암호화 영역은 2134672-2135370), pupG;Genbank Accession No.NC_000964(암호화 영역은 2445610-2446422)를 이용할 수 있다.

또한 퓨린계 물질 생산능을 증강시키기 위해서, 석시닐-AMP 신타제의 활성을 저하시켜도 양호하다. 석시닐-AMP 신타제를 암호화하는 유전자로서는, purA 유전자를 들 수 있다. purA 유전자로서는, 예를 들면 GenBank Accession No.NC_000964(암호화 영역은 상보쇄의 염기 번호 4153460-4155749)로 등록되어 있는 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다.

또한, 퓨린계 물질 생산능을 증강시키기 위해, 이노신모노인산(IMP) 탈수소 효소의 활성을 저하시켜도 양호하다. IMP 탈수소 효소를 암호화하는 유전자로서는, guaB 유전자를 들 수 있다. guaB 유전자로서는, 예를 들면 GenBank Accession No.NC_000964(암호화 영역은 15913-17376)로 등록되어 있는 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다.

또한 퓨린계 물질 생산능을 증강시키는 방법으로서, 퓨린계 물질을 배출하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 증폭시키는 것을 생각할 수 있다. 이러한 유전자가 증폭된 세균으로서는, 예를 들면 rhtA 유전자를 증폭시킨 바실러스속 세균을 들 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 2003-219876호].

유전자 재조합에 의한 미생물에 육종에 있어서 사용하는 유전자는, 상기한 유전자 정보를 갖는 유전자나, 공지의 서열을 갖는 유전자에 한정되지 않고, 암호화되는 단백질의 기능이 손상되지 않는 한, 그 유전자의 동족체나 인위적인 개변체 등, 보존적 변이를 갖는 유전자도 사용할 수 있다. 즉, 공지의 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 위치에서의 1 또는 몇 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 등을 포함하는 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자라도 양호하다.

여기에서, 「1 또는 몇 개」란, 아미노산 잔기의 단백질의 입체 구조에 있어서의 위치나 아미노산 잔기의 종류에 따라서도 다르지만, 구체적으로는 바람직하게는 1 내지 20개, 더 바람직하게는 1 내지 10개, 더 바람직하게는 1 내지 5개를 의미한다. 또한 보존적 변이란, 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에는, Phe, Trp, Tyr간에, 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는, Leu, Ile, Val간에, 극성 아미노산인 경우에는, Gln, Asn간에, 염기성 아미노산인 경우에는, Lys, Arg, His간에, 산성 아미노산인 경우에는, Asp, Glu간에, 히드록실기를 갖는 아미노산인 경우에는, Ser, Thr간에 서로 치환하는 변이이다. 보존적 변이의 대표적인 것은, 보존적 치환이며, 보존적 치환이라고 간주되는 치환으로서는, 구체적으로는, Ala로부터 Ser 또는 Thr로의 치환, Arg으로부터 Gln, His 또는 Lys로의 치환, Asn으로부터 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp으로부터 Asn, Glu 또는 Gln로의 치환, Cys로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Gln으로부터 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환, Glu로부터 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly로부터 Pro로의 치환, His로부터 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환, Ile으로부터 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Let로부터 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Lys로부터 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환, Met로부터 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환, Phe로부터 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환, Ser로부터 Thr 또는 Ala로의 치환, Thr로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Trp로부터 Phe 또는 Tyr로의 치환, Tyr로부터 His, Phe 또는 Trp로의 치환, 및, Val로부터 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 들 수 있다. 또한 상기와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위 등에는, 유전자가 유래하는 미생물의 개체차, 종의 차이에 기초하는 경우 등의 천연적으로 발생하는 변이(돌연변이 또는 변이)에 의해 생성되는 것도 포함된다. 이러한 유전자는, 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해, 암호화되는 단백질의 특정한 부위의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하도록 공지의 유전자의 염기 서열을 개변함으로써 취득할 수 있다.

또한, 상기와 같은 보존적 변이를 갖는 유전자는, 암호화되는 아미노산 서열 전체에 대하여, 야생형 단백질과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 소유하고, 야생형 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자라도 양호하다.

또한, 유전자의 서열에 있어서의 각각의 코돈은, 유전자가 도입되는 숙주에서 사용하기 쉬운 코돈으로 치환한 것이라도 양호하다.

보존적 변이를 갖는 유전자는, 변이제 처리 등, 통상 변이 처리에 사용되는 방법에 의해 취득된 것이라도 양호하다.

또한 유전자는, 공지의 유전자 서열의 상보 서열 또는 그 상보 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 공지의 유전자 산물과 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA라도 양호하다. 여기에서, 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 일례를 나타내면, 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들면 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리가 하이브리드화하고, 이것보다 상동성이 낮은 DNA끼리가 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 서던 하이브리드화의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 더욱 바람직하게는, 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도, 온도에서, 1회, 보다 바람직하게는 2 내지 3회 세정하는 조건을 들 수 있다.

프로브로서는, 유전자의 상보 서열의 일부를 사용할 수도 있다. 이러한 프로브는, 공지의 유전자 서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 이들의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면 프로브로서, 300bp 정도 길이의 DNA 단편을 사용하는 경우에는, 하이브리드화의 세정 조건은, 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS를 들 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되지 않는다.

〔실시예 1〕L-트립토판의 제조

L-트립토판 생산균으로서, E.coli No.202[참조: 국제공개 제2005/103275호 팜플렛]을 사용하였다. 동 균주는, L-트립토판 생산균 SV164주[참조: 국제공개 제94/08031호 팜플렛]의 염색체 위에, 포스포글리세레이트 데하이드로게나제 유전자(serA. 플라스미드 pGH5에 유래한다. 국제공개 제94/08031호 팜플렛 참조), 및, 탈감작형 trpE 유전자(E.coli MTR #2주 유래. 미국 특허 제4,371,614호 명세서 참조)를 포함하는 trp 오페론(플라스미드 pGX100 유래)을 삽입하여 수득된 균주이다.

E.coli No.202의 글리세롤 스톡을, LB-아가로스 플레이트 배지(트립톤 1%, 효모 추출액 0.5%, 염화나트륨 0.5%, 아가로스 1.5%)에 1백금이 식균하고, 30℃에서 24시간 동안 정지(靜地) 배양하였다.

상기의 배양액을 500ml 판구 플라스크에 넣은 50ml의 LB 배지(트립톤 1%, 효모 추출액 0.5%, 염화나트륨 0.5%)에 10㎕ 접종하고, 30℃에서 8시간, 진탕하(114회전/분)에서 전배양하였다.

상기 전배양액 0.9ml을, 하기 조성을 갖는 30Oml의 종배지에 접종하였다. 전체 용적 1L의 소형 발효조를 사용하여, 30℃에서 약 14시간, 교반 날개의 동력 밀도를 4.4kW/㎥으로, 멸균 필터에 의해 멸균한 압축 공기를 1vvm 통기하면서 배양하였다. 또한 배양중 온도는 30℃로 유지하고, pH는 암모니아 가스로 6.5로 유지하였다.

〔종배지 조성〕

글루코스	10g/L
KH₂PO₄	1g/L
(NH₄)₂SO₄	2.5g/L
MgSO₄·7H₂O	0.5g/L
FeSO₄·7H₂O	10mg/L
MnSO₄·4H₂O	10mg/L
대두가수분해물	0.4g/L
L-메티오닌	50mg/L
L-페닐알라닌	125mg/L
L-티로신	125mg/L
비타민 B1	5mg/L
피리독신	30mg/L

하기 조성을 갖는 300ml의 주 배양 배지를 준비하고, 각각에 종배양액 30ml을 접종하였다. 전체 용적 1L의 소형 발효조를 사용하여, 31℃, 4.4kW/㎥의 교반하에서, 멸균 필터에 의해 멸균한 압축 공기를 1vvm 통기하면서 주 배양을 실시하였다. 또한, 배양 기간중 온도는 31℃로 유지하고, pH는 암모니아 가스로 6.7로 유지하였다. 배양중, 700g/L의 글루코스 용액을 적절하게 유가함으로써, 소형 발효조 내의 당 농도를 5 내지 20g/L로 조절하였다. 또한 23시간째에, L-트립토판의 결정을 10g(33g/L) 첨가하고, 교반 날개의 동력 밀도를 2.4kW/㎥, 5.5kW/㎥, 15.5kW/㎥, 19.9kW/㎥로 바꾼 4조건으로 배양을 실시하였다.

〔주 배양 배지 조성〕

글루코스	15g/L
KH₂PO₄	1g/L
(NH₄)₂SO₄	1g/L
대두가수분해물	0.75g/L
NaCl	0.5g/L
MgSO₄·7H₂O	0.3g/L
CaCl₂·2H₂O	14.7mg/L
FeSO₄·7H₂O	10mg/L
MnSO₄·4H₂O	7.5mg/L
L-메티오닌	0.3g/L
L-페닐알라닌	1g/L
비타민 B1	5mg/L
피리독신	36.5mg/L
NH₄Cl	3.13g/L
KOH	1g/L

배양 46시간후에, 배지 중의 L-트립토판 농도를 측정하여, 생산 속도를 산출한 결과를 도 2에 도시한다. 동력 밀도 0에 있어서는 배양을 실시하고 있지 않지만, 도 2에 있어서 근사 곡선을 작성하기 위해서 플롯하였다. 또한, 생산 속도는, 교반 동력 밀도 15.5kW/㎥에서의 생산성을 1이라고 했을 때의 상대값으로 기재하였다.

〔참고예 1〕L-글루탐산 생산균의 구축

에세리키아 콜라이 유래의 gltA 유전자, ppc 유전자 및 gdhA 유전자를 갖는 플라스미드(RSFCPG(참조: 유럽 출원공개 1233068호 명세서)의 gltA 유전자의 ORF 이외의 부분을 증폭시키는 프라이머 1(서열번호 1)과 프라이머 2(서열번호 2)를 설계하였다. 당해 프라이머를 사용하여 RSFCPG를 주형으로 PCR을 실시하여 약 14.9kb의 단편을 취득하였다. 한편, 프라이머 3(서열번호 3)과 프라이머 4(서열번호 4)를 사용하여, E.coli W3110주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하고, 메틸시트르산 신타제 유전자(prpC)를 포함하는 약 1.2kb의 단편을 취득하였다. 양 PCR 산물을 각각 BglII, KpnI로 처리하고, 라이게이션후, E.coli JM109주를 형질전환하였다. 출현한 콜로니를 모두 집균하고, 혼합물로서 플라스미드를 추출하였다. 당해 플라스미드 혼합물로 시트르산 신타제(CS) 결손주인 E.coli ME8330주를 형질전환하고, 50mg/L 우라실, 5mg/L 티아민-HCl을 함유하는 M9 최소 배지(글루코스 5g, 황산마그네슘 2mM, 인산1칼륨 3g, 염화나트륨 0.5g, 염화암모늄 1g, 인산2나트륨 6g을 순수 1L에 포함하는 배지)에 도포하였다. 출현한 주로부터 플라스미드를 추출하고, 이것을 RSFPPG라고 하였다. 판토에아 아나나티스 SC17sucA주에 L-글루탐산 생산 플라스미드 RSFPPG를 도입하고, L-글루탐산 생산균 SC17sucA/RSFPPG(본 균주를 「NA1주」라고 부른다)를 구축하였다.

상기 SC17sucA주는, 저pH로 L-글루탐산 및 탄소원을 포함하는 배지에서 증식할 수 있는 주로서 자연계로부터 분리된 AJ13355주로부터, 점액질 저생산 변이주(SC17)를 취득하고, 동 주의 sucA 유전자를 파괴함으로써 수득된 주이다[참조: 미국 특허 제6,596,517호]. SC17sucA주는, 개별번호 AJ417이 부여되어, 평성 16년 2월 26일에 경제산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현명칭, 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 우편번호 305-8566 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 다이 6)에 수탁번호 FERM BP-08646으로서 기탁되어 있다.

〔실시예 2〕L-글루탐산의 생산

글루탐산 생산균 판토에아 아나나티스 NA1의 글리세롤 스톡을, LBGM9-아가로 스 플레이트 배지(트립톤 1%, 효모 추출액 0.5%, 염화나트륨 1.05%, 글루코스0.5%, 황산마그네슘 7수화물 0.05%, 인산수소2나트륨 12수화물 1.72%, 인산2수소 칼륨 0.3%, 염화암모늄 0.1%, 아가로스 2%, 테트라사이클린염산염 25mg/L)에 1백금이 식균하고, 34℃에서 24시간 동안 정지 배양하였다.

상기의 전배양균 샬레 1장분을, 하기 조성을 갖는 300ml의 배지에 접종하였다. 전체 용적 1L의 소형 발효조를 사용하여 교반 날개의 동력 밀도 3.3kW/㎥로, 멸균 필터에 의해 멸균한 압축 공기를 1vvm 통기하면서 배양하였다. 또한 배양중 온도는 34℃로 유지하고, pH는 암모니아 가스로 4.7로 유지한다. 배양 20시간째에, 700g/L의 수크로스 용액을 적절하게 유가함으로써, 소형 발효조 내의 당 농도를 5 내지 20g/L로 조절하였다. 또한, 배양 20시간째에, L-글루탐산의 α정(晶)을 20g 첨가하고, 교반의 동력 밀도를 2.4kW/㎥, 15.5kW/㎥, 19.9kW/㎥로 바꾼 3조건으로 배양을 실시하였다.

〔배지 조성〕

수크로스	100g/L
MgSO₄·7H₂O	0.4g/L
(NH₄)₂SO₄	5g/L
KH₂PO₄	6g/L
효모 추출물	6g/L
NaCl	1.5g/L
FeSO₄·7H₂O	20mg/L
MnSO₄·4H₂O	20mg/L
L-리신염산염	0.6g/L
DL-메티오닌	0.6g/L
디아미노피멜산	0.6g/L
CaCl₂·2H₂O	2.64mg/L
ZnSO₄·7H₂O	0.72mg/L
CuSO₄·5H₂O	0.64mg/L
CoCl₂·6H₂O	0.72mg/L
H₃BO₃	0.4mg/L
Na₂MoO₄·2H₂O	1.2mg/L
테트라사이클린염산염	25mg/L

배양 49시간 후에, 배지중의 L-글루탐산 농도를 측정하여, 생산 속도를 산출한 결과를 도 3에 도시한다. 또한, 생산 속도는 교반 동력 밀도 15.5kW/㎥에서의 생산성을 1이라고 했을 때 상대값으로 기재하였다.

〔실시예 3〕L-트레오닌의 제조

L-트레오닌 생산균으로서, E.coli VKPM B-5318[참조: 유럽 공개 제0593792호]을 사용하였다.

E.coli VKPM B-5318의 글리세롤 스톡을, LB-아가로스 플레이트 배지(펩톤 1%, 효모 추출액 0.5%, 염화나트륨 0.5%, 아가로스 1.5%, 스트렙토마이신 황산염100mg/L)에 1백금이 식균하고, 37℃에 24시간 동안 정지 배양하였다.

상기의 배양액을 500ml 판구 플라스크에 넣은 50ml의 LB 배지(트립톤 1%, 효모 추출액 0.5%, 염화나트륨 0.5%, 카나마이신 황산염 25mg/L, 스트렙토마이신 황 산염 20mg/L)에 플레이트 1/10량을 접종하고, 40℃에서 4시간, 진탕하(144회전/분)에서 전배양하였다.

하기 조성을 갖는 300ml의 주 배양 배지를 준비하고, 각각에 종배양액 30ml을 접종하였다. 전체 용적 1L의 소형 발효조를 사용하여, 40℃에서, 5.5kW/㎥의 교반하에서, 멸균 필터에 의해 멸균한 압축 공기를 1vvm 통기하면서 주 배양을 실시하였다. 또한 배양 기간중 온도는 40℃로 유지하고, pH는 암모니아 가스로 7.0으로 유지하였다. 배양중, 700g/L의 수크로스 용액을 적절하게 유가함으로써, 소형 발효조 내의 당 농도를 5 내지 20g/L로 조절하였다. 또한, 21시간째에, L-트레오닌의 결정을 24g(70g/L) 첨가하고, 교반 날개의 동력 밀도를 2.4kW/㎥, 5.5kW/㎥, 13.5kW/㎥로 바꾼 3조건으로 배양을 실시하였다.

〔주 배양 배지 조성〕

수크로스	40g/L
MgSO₄·7H₂O	0.36g/L
(NH₄)₂SO₄	4.5g/L
FeSO₄·7H₂O	18mg/L
MnSO₄·4H₂O	18mg/L
K₂HPO₄	1.5g/L
NaCl	0.6g/L
효모 추출물	1.8g/L
카나마이신 황산염	25mg/L
스트렙토마이신 황산염	25mg/L

배양 45시간후에, 배지중의 L-트레오닌 농도를 측정하고, 생산 속도를 산출한 결과를 도 4에 도시한다. 또한, 생산 속도는, 교반 동력 밀도 5.5kW/㎥에서의 생산성을 1이라고 했을 때의 상대값으로 기재하였다.

〔실시예 4〕L-페닐알라닌의 생산

L-페닐알라닌 생산균으로서, E.coli AJ12741주(특허 제3225597호, 이하, 「R/GAL주」라고 기재하는 경우가 있다.)를 사용한다. 동 주는, tyrR, tyrA 유전자를 결실한 에세리키아 콜라이 K-12의 W3110주에, 피드백 저해가 해제된 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-인산 신타제를 암호화하는 aroG4 유전자, 코리슴산 뮤타제-프레펜산 데하이드라타제를 암호화하는 pheA 유전자, 및 시킴산 키나제를 암호화하는 aroL 유전자를 도입한 주이다. 동 주는, 평성 4년 6월 11일에, 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(주소 우편 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 다이 6)에 수탁번호 FERM P-13000으로 기탁되어, 평성 6년 9월 14일에 국제기탁으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-4796이 부여되어 있다.

AJ12741주의 글리세롤 스톡을, LBG-아가로스 플레이트 배지(트립톤 1%, 효모 추출액 0.5%, 염화나트륨 1%, 아가로스 1.5%)에 1백금이 식균하고, 35℃에서 24시간 동안 정지 배양한다.

상기의 전배양균을 샬레 1장분, 하기의 조성을 갖는 300ml의 배지에 종접종하였다. 전체 용적 1L의 소형 발효조를 사용하여, 약 16시간, 교반 날개의 동력 밀도 3.3kW/㎥, 멸균 필터에 의해 멸균한 압축 공기를 1vvm 통기하면서 배양한다. 또한, 배양중 온도는 35℃로 유지하고, pH는 암모니아 가스로 6.5로 유지한다.

〔종배지 조성〕

글루코스	40g/L
MgSO₄	1g/L
(NH₄)₂SO₄	16g/L
KH₂PO₄	1g/L
효모 추출물	2g/L
FeSO₄·7H₂O	10mg/L
MnSO₄·4H₂O	8mg/L
L-티로신	1g/L
암피실린나트륨	100mg/L

하기 조성을 갖는 300ml의 주 배양 배지를 준비하고, 종배양액 30ml을 접종한다. 전체 용적 1L의 소형 발효조를 사용하여, 35℃에서, 교반 날개의 동력 밀도 3.3kW/㎥의 교반하에서, 멸균 필터에 의해 멸균한 압축 공기를 1vvm 통기하면서 주 배양을 실시한다. 또한, 배양 기간중 온도는 35℃로 유지하고, pH는 암모니아 가스로 6.5로 유지하였다. 배양중, 500g/L의 글루코스 용액을 적절하게 유가함으로써, 소형 발효조내의 당 농도를 5 내지 20g/L로 조절한다. 또한 24시간째에, L-페닐알라닌의 결정을 20g 첨가하고, 교반 날개의 동력 밀도를 5.5kW/㎥, 15.5kW/㎥, 19.9kW/㎥로 바꾼 조건과, 2.4kW/㎥ 이하로 제어한 4조건으로 배양을 실시한다.

〔주 배양 배지 조성〕

글루코스	40g/L
MgS0₄	1g/L
(NH₄)₂SO₄	16g/L
KH₂PO₄	2g/L
효모 추출물	8g/L
FeSO₄·7H₂O	10mg/L
MnSO₄·4H₂O	8mg/L
L-티로신	1.4g/L
암피실린나트륨	100mg/L

〔실시예 5〕이노신 및/또는 구아노신의 생산

이노신 및 구아노신을 생산하는 바실러스 아밀롤리케파시엔스(B. amyloliquefaciens)에 AJ1991주(VKPM B-8994. 미국 특허 제3,575,809호 참조)의 글리세롤 스톡을, LBG-아가로스 플레이트 배지(트립톤 1%, 효모 추출액 0.5%, 염화나트륨 1%, 아가로스 1.5%)에 1백금이 식균하고, 34℃에서 24시간 동안 정지 배양한다. AJ1991주는 G1136A주라고도 명명되어, 2005년 3월 10일에, 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika)(Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)에, 수탁번호 VKPM B-8994로 기탁되어, 2006년 10월 13일에 국제기탁으로 이관되어 있다.

상기의 전배양균을, 500ml 판구 플라스크에 넣은 하기 조성의 배지 50ml에 1백금이 접종하고 34℃에서 16시간 동안 진탕하(115회전/분)에서 전배양한다.

〔종배지 조성〕

글루코스	30g/L
NH₄Cl	3g/L
KH₂PO₄	0.5g/L
MgSO₄·7H₂O	0.4g/L
FeSO₄·7H₂O	10mg/L
MnSO₄·4H₂O	10mg/L
대두가수분해물	1.2g/L
효모 추출물	0.5g/L
리보핵산	5g/L

하기 조성을 갖는 300ml의 주 배양 배지를 준비하고, 종배양액 15ml을 접종 하였다. 전체 용적 1L의 소형 발효조를 사용하여, 34℃에서 교반 날개의 동력 밀도 3.3kW/㎥의 교반하에서, 멸균 필터에 의해 멸균한 압축 공기를 1vvm 통기하면서 주 배양을 실시하였다. 또한 배양 기간중 온도는 34℃로 유지하고, pH는 암모니아 가스로 6.5로 유지하였다. 배양중, 500g/L의 글루코스 용액을 적절하게 유가함으로써, 소형 발효조 내의 당 농도를 5 내지 20g/L로 조절하였다. 또한, 24시간째에, 구아노신 결정을 0.8g 첨가하고, 교반 날개의 동력 밀도를 5.5kW/㎥, 15.5kW/㎥, 19.9kW/㎥로 바꾼 조건과, 2.4kW/㎥ 이하로 제어한 4조건으로 배양을 실시한다.

〔주 배양 배지 조성〕

글루코스	20Og/L
NH₄Cl	2.5g/L
KH₂PO₄	1.3g/L
MgSO₄·7H₂O	1.5g/L
FeSO₄·7H₂O	10mg/L
MnSO₄·4H₂O	10mg/L
대두가수분해물	1.3g/L
리보핵산	1.24g/L
KCl	15g/L
DL-메티오닌	50mg/L

본 발명에 의하면, L-아미노산 또는 핵산 생산능을 갖는 미생물을 사용한 발효법에 의한 L-아미노산 또는 핵산의 생산법에 있어서, L-아미노산 또는 핵산의 생산성을 향상시키는 것이 가능해진다. L-아미노산 또는 핵산의 생산성에는, 대당수 율의 향상, 및/또는 생산 속도의 향상이 포함된다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Method for production of L-amino acid or nucleic acid <130> C877-C7307 <150> JP 2007-039843 <151> 2007-02-20 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 1 <400> 1 ggaagatcta tttgccttcg cacatcaacc tgg 33 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 2 <400> 2 cggggtacct tgtaaatatt ttaacccgcc 30 <210> 3 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 3 <400> 3 ggaagatcta aggagacctt aaatgagcga cacaacgatc ctgcaaaaca gtaccc 56 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 4 <400> 4 cggggtacct cgtagaggtt tactggcgct tatccagcg 39

Claims

L-아미노산 또는 핵산의 생산능을 갖는 미생물을 교반 날개를 구비한 발효조 중의 액체 배지에서 배양하여 당해 배지 중에 L-아미노산 또는 핵산의 결정을 생성, 축적시키고, 배양물로부터 L-아미노산 또는 핵산의 결정을 채취하는 L-아미노산 또는 핵산의 제조 방법으로서,

(A) 교반 날개의 동력 밀도를 결정 석출후 2.4kW/㎥ 이하로 제어하는 것, 또는

(B) 종결정(seed crystal)을 배지에 첨가하는 단계를 포함하고, 교반 날개의 동력 밀도를 결정 석출후 또는 종결정 첨가후에 2.4kW/㎥ 이하로 제어하는 것

을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

(C) 결정 석출후의 교반 날개의 동력 밀도가 0.5kW/㎥ 이상인 것, 또는

(D) 종결정을 배지에 첨가하는 단계를 포함하고, 결정 석출후 또는 종결정 첨가후의 교반 날개의 동력 밀도가 0.5kW/㎥ 이상인 것

을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

(E) 결정 석출전의 교반 날개의 동력 밀도를 3.0kW/㎥ 이상으로 제어하면서 배양하는 것, 또는

(F) 종결정을 배지에 첨가하는 단계를 포함하고, 결정 석출전 또는 종결정 첨가전의 교반 날개의 동력 밀도를 3.0kW/㎥ 이상으로 제어하면서 배양하는 것

을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 코리네형(coryneform) 세균 또는 바실러스(Bacillus)속 세균인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 L-아미노산이, L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-글루탐산, L-글루타민, L-트레오닌, L-시스테인, L-시스틴 및 이의 유도체로부터 선택되는 1종 이상의 L-아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이, 이노신, 아데노신, 구아노신, 크산토신, 이노신산, 아데닐산, 구아닐산, 크산틸산 및 이들의 유도체로부터 선택되는 1종 이상의 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 미생물이 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli) 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 또는 바실러스 아밀롤리케파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 종결정을 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.