JP5337044B2 - 異種タンパク質製造のための細胞及びそれを用いた製造方法 - Google Patents
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Description
近年、抗体や生理活性タンパク質などの多くのバイオ医薬品が輩出されているが、組換えタンパク質を効率よく動物細胞に生産させる技術は、バイオ医薬品の低コスト化につながり、患者への安定な供給を約束するものである。
従って、より生産効率の高いタンパク質の製造方法が望まれている。
アニオンエクスチェンジャーは、細胞膜内外のアニオンを交換輸送するトランスポーター(膜輸送タンパク質)である。SLC4ファミリーはHCO3 -のトランスポーターのファミリーであるが、それに属するAE1、AE2及びAE3という3つのメンバーは、細胞膜外のCl-を細胞膜内のHCO3 -と交換する機能を有する。
また、腎臓において、AE2には、AE2a、AE2b及びAE2cという3つのアイソフォームがみつかっている。AE2は、細胞シグナル伝達のために細胞内pHホメオスタシスを制御すると考えられている(非特許文献4)が、AE2ノックアウトマウスは離乳期に死亡するが、腎性の表現型異常はみられない(非特許文献5)。
一方、Bicarbonateトランスポーター機能を有するアニオンエクスチェンジャーを強発現させることにより、アニオンエクスチェンジャーを介したアニオンの培養細胞内への取り込みおよび細胞外への排出を人為的に促進することが、培養細胞における所望の組換えタンパク質の産生向上に寄与することについてはまったく知られていない。
(1) Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAを導入した細胞を培養し、所望のポリペプチドを産生させることを含む、ポリペプチドの製造方法。
(2)Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞が、BicarbonateトランスポーターをコードするDNAを導入した細胞である(1)記載の製造方法。
(5)Bicarbonateトランスポーターが、SLC4アニオンエクスチェンジャーである(1)乃至(3)記載の製造方法。
(6)SLC4アニオンエクスチェンジャーが、AE1である(5)記載の製造方法。
(7)細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である(1)〜(6)のいずれかに記載の製造方法。
(8)所望のポリペプチドが抗体である(1)〜(7)のいずれかに記載の製造方法。
(a) 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA
(b) 配列番号2のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は/及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c) 配列番号2のアミノ酸配列と50%以上の相同性を有し、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d) 配列番号1の塩基配列を有するDNA
(e) 配列番号1の塩基配列を有するDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(11)BicarbonateトランスポーターをコードするDNAと所望のポリペプチドをコードするDNAが導入されている細胞。
(12)さらにシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ又はアラニンアミノトランスフェラーゼをコードするDNAが導入されている(11)記載の細胞。
(13)BicarbonateトランスポーターをコードするDNAとシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ又はアラニンアミノトランスフェラーゼをコードするDNAが導入されている細胞。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2007‐276182の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明は、Bicarbonateトランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAを導入した細胞を培養し、所望のポリペプチドを産生させることを含む、ポリペプチドの製造方法を提供する。
本発明の方法において、所望のポリペプチドは特に限定されず、抗体(例えば、抗IL-6レセプター抗体、抗グリピカン-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体、抗VLA4抗体など)や生理活性タンパク質(顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、エリスロポエチン、インターフェロン、IL-1やIL-6等のインターロイキン、t-PA、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固因子、PTHなど)など如何なるポリペプチドでもよいが、特に抗体が好ましい。抗体は、天然抗体、Fab、scFv、sc(Fv)2などの低分子化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの如何なる抗体であってもよい。
Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞を用いることにより、細胞によるポリペプチドの産生量を増加させることができる。
Bicarbonate トランスポーターを強発現する細胞は、天然の細胞と比較してBicarbonateトランスポーターの発現量が増加している細胞であれば特に限定されない。天然の細胞は特に限定されないが、例えばCHO細胞など組換えタンパク質を製造する際に宿主として用いられている細胞を挙げることができる。
(a) 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA
(b) 配列番号2のアミノ酸配列において、1又は複数(例えば、数個)のアミノ酸が置換、欠失、付加又は/及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c) 配列番号2のアミノ酸配列と50%以上の相同性を有し、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d) 配列番号1の塩基配列を有するDNA
(e) 配列番号1の塩基配列を有するDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするDNA
SLC4アニオンエクスチェンジャー活性は、以下のようにして測定することができる。
市販されているこれらのポリペプチドをコードする遺伝子をヒト等のSLC4アニオンエクスチェンジャーをコードする遺伝子と融合させ、これにより調製された融合遺伝子を発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
ストリンジェントな条件としては、当業者であれば適宜選択することができるが、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1%SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1%SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAを得ることができる。上記のハイブリダイズするDNAは好ましくは天然由来のDNA、例えばcDNA又は染色体DNAであってよい。
BicarbonateトランスポーターをコードするDNAはベクターに挿入されるとよい。
Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞は、所望のポリペプチドを製造するために、さらにシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ(CSAD)又はアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)を強発現していることが好ましい。BicarbonateトランスポーターのほかにCSAD又はALTを強発現する細胞に所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入し、該細胞を培地中で培養することにより、より大量に所望のポリペプチドを製造することが可能である。
CSADは、本来、3-スルフィン酸アラニンをハイポタウリンに変換する酵素として知られているが、CHO細胞内で強発現させることにより、β-アラニンを過剰量合成するようになる。
細胞に強発現させるCSADとしては、如何なる生物由来のCSADでもよく特に限定されない。具体的には、ヒト、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、フグ類のトラフグ、ホヤ類のカタユウレイボヤなどの生物由来のCSADが挙げられ、ヒト、げっ歯類或いは宿主細胞と同じ種由来のCSADであることが好ましく、例えば、CSADを強発現させる細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)である場合には、ヒト或いはハムスター由来のCSADであることが好ましい。
(a1) 配列番号4のアミノ酸配列又はUniProt Knowledgebase (Swiss-Prot and TrEMBL)ラットCSAD (Q64611) 、マウスCSAD_(Q9DBE0)若しくはヒトCSAD_(Q9Y600)のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA
(b1) 配列番号4のアミノ酸配列又はUniProt Knowledgebase (Swiss-Prot and TrEMBL)ラットCSAD (Q64611) 、マウスCSAD_(Q9DBE0)若しくはヒトCSAD_(Q9Y600)のアミノ酸配列において、1又は複数(例えば、数個)のアミノ酸が置換、欠失、付加又は/及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつCSAD活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c1) 配列番号4のアミノ酸配列又はUniProt Knowledgebase (Swiss-Prot and TrEMBL)ラットCSAD (Q64611) 、マウスCSAD_(Q9DBE0)若しくはヒトCSAD_(Q9Y600)のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有し、かつCSAD活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d1) 配列番号3の塩基配列又はGenBank ラットCSAD NM_021750、マウスCSAD NM_144942若しくはヒトCSAD NM_015989の塩基配列を有するDNA
(e1) 配列番号3の塩基配列又はGenBank ラットCSAD NM_021750、マウスCSAD NM_144942若しくはヒトCSAD NM_015989の塩基配列を有するDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつCSAD活性を有するポリペプチドをコードするDNA
CSAD活性とは、3-sulfino-L-alanine = hypotaurine + CO2 を触媒し、脱炭酸させる活性を包含する概念である。L-cysteic acidを脱炭酸させる活性でもある(EC-Number 4.1.1.29 )。
Davis K. et.al., J Biomed Sci 2001;8:359-364 で示されているように、L-[1-14C]cysteic acidからCSADの脱炭酸酵素活性によって生成される14CO2を定量する。
本発明において、CSADをコードするDNAとして、配列番号4のアミノ酸配列又はUniProt Knowledgebase (Swiss-Prot and TrEMBL)ラットCSAD (Q64611) 、マウスCSAD_(Q9DBE0)若しくはヒトCSAD_(Q9Y600)のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNAを用いるとよい。その他にも、配列番号4のアミノ酸配列又はUniProt Knowledgebase (Swiss-Prot and TrEMBL)ラットCSAD (Q64611) 、マウスCSAD_(Q9DBE0)若しくはヒトCSAD_(Q9Y600)のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は/及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつCSAD活性を有するポリペプチドをコードするDNAを用いてもよい。
市販されているこれらのポリペプチドをコードする遺伝子をハムスター等のCSADをコードする遺伝子と融合させ、これにより調製された融合遺伝子を発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
また、CSADをコードするDNAにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる(Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74 )。また、CSADをコードするDNAは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン(ATG)及び/又は終止コドン(TAA、TGA、又はTAG)の挿入等が挙げられる。
ストリンジェントな条件としては、当業者であれば適宜選択することができるが、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1%SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1%SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAを得ることができる。上記のハイブリダイズするDNAは好ましくは天然由来のDNA、例えばcDNA又は染色体DNAであってよい。
ALTを強発現する細胞としては、例えば、ALT遺伝子が人為的に導入された細胞を挙げることができる。ALT遺伝子が人為的に導入された細胞は当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、ALT遺伝子をベクターに組込み、該ベクターを細胞に形質転換することにより作製することが可能である。さらに、本明細書では遺伝子活性化技術(例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照)により内因性ALT遺伝子が活性化され、その結果、ALTが強発現した細胞もALT遺伝子が人為的に導入された細胞に包含される。
細胞に導入するALT遺伝子としては、ALTをコードする以下の(a2)〜(e2)のいずれかのDNAを挙げることができる。
(b2) KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140のアミノ酸配列において、1又は複数(例えば、数個)のアミノ酸が置換、欠失、付加又は/及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c2) KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有し、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d2) KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140の塩基配列を有するDNA
(e2) KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 84706、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 76282、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus musculus (mouse): 108682、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus norvegicus (rat): 81670、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis familiaris (dog): 609510、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YLR089C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Saccharomyces cerevisiae: YDR111C、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430、KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120又はKEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140の塩基配列を有するDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするDNA
ALT活性とは、アミノ酸とα-ケト酸との間のアミノ基転移を触媒する酵素活性を包含する概念である。
自動分析用アラニンアミノトランスフェラーゼ測定試薬(ランピア リキッド S-ALT 承認番号20900AMZ00597000)や、Rajamohan F. et.al. Protein Expression and Purification (2006) 48, 81-89 で示された方法を用いてALT活性値を求める。
市販されているこれらのポリペプチドをコードする遺伝子をヒト等のALTをコードする遺伝子と融合させ、これにより調製された融合遺伝子を発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
また、得られたcDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、ALTのアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたcDNAをプローブとしてゲノムDNA ライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することができる。
得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業)等を用いて行うこともできる。また、プライマー等を用いて、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction ; PCR)を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) にしたがい、cDNAの合成および増幅を行うことができる。
また、ALTをコードするDNAにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる(Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74 )。また、ALTをコードするDNAは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン(ATG)及び/又は終止コドン(TAA、TGA、又はTAG)の挿入等が挙げられる。
所望のポリペプチドを製造するには、BicarbonateトランスポーターとCSAD又はALTを強発現する細胞に所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入し、該細胞を培地中で培養することにより製造することが可能である。
Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞(CSAD又はALTを強発現してもよい)の培養には、通常の細胞(好ましくは、動物細胞)培養で使用されている培地を用いることができる。これらには通常、アミノ酸、ビタミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄源、pH緩衝剤を含む。これらの成分の含量は、通常、アミノ酸は0.05−1500mg/L、ビタミン類は0.001−10mg/L、脂質因子は0−200mg/L、エネルギー源は1−20g/L、浸透圧調節剤は0.1−10000mg/L、鉄源は0.1−500mg/L、pH緩衝剤は1−10000mg/L、微量金属元素は0.00001−200mg/L、界面活性剤は0−5000mg/L、増殖補助因子は0.05−10000μg/Lおよびヌクレオシドは0.001−50mg/Lの範囲が適当であるが、これらに限定されず、培養する細胞の種類、所望のポリペプチドの種類などにより適宜決定できる。
具体的には、例えば、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-シスチン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-オルニチン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン等、好ましくはL-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン等のアミノ酸類;i−イノシトール、ビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、p-アミノ安息香酸、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等、好ましくはビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等のビタミン類;塩化コリン、酒石酸コリン、リノール酸、オレイン酸、コレステロール等、好ましくは塩化コリン等の脂質因子;グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース等、好ましくはグルコース等のエネルギー源;塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム等、好ましくは塩化ナトリウム等の浸透圧調節剤;EDTA鉄、クエン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄等、好ましくは塩化第二鉄、EDTA鉄、クエン酸鉄等の鉄源類;炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、HEPES、MOPS等、好ましくは炭酸水素ナトリウム等のpH緩衝剤を含む培地を例示できる。
培地のpHは培養する細胞により異なるが、一般的にはpH6.8〜7.6、多くの場合pH7.0〜7.4が適当である。
Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞(CSAD又はALTを強発現してもよい)がCHO細胞である場合、CHO細胞の培養は当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、通常、気相のCO2濃度が0−40%、好ましくは、2−10%の雰囲気下、30−39℃、好ましくは37℃程度で、培養することが可能である。
Bicarbonateトランスポーターを強発現する細胞(CSAD又はALTを強発現してもよい)を用いて所望のポリペプチドを産生するために適当な培養期間は、通常1日〜3ヶ月であり、好ましくは1日〜2ヶ月、さらに好ましくは1日〜1ヶ月である。
また、動物細胞培養用の各種の培養装置としては、例えば発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等を用いて培養することができる。
本発明の方法により製造されたポリペプチドが医薬として利用可能な生物学的活性を有する場合には、このポリペプチドを医薬的に許容される担体又は添加剤と混合して製剤化することにより、医薬品を製造することができる。
本発明は、BicarbonateトランスポーターをコードするDNAとシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ又はアラニンアミノトランスフェラーゼをコードするDNAが導入されている細胞(どちらのDNAもベクターに組み込まれていてもよい)も提供する。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌(E. coli )、例えば、JM109、DH5α、HB101 等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993 )。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる(Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594 )。
なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当なポリペプチド修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えて部分的にペプチドを除去することもできる。ポリペプチド修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
なお、本発明において、「DNAが導入された細胞」あるいは「DNAを導入した細胞」とは、遺伝子組み換え技術により外来性DNAが組み込まれた細胞の他、遺伝子活性化技術(例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照)により内因性DNAが活性化され、その結果、当該DNAに対応する蛋白質の発現もしくは当該DNAの転写が開始或いは増加した細胞も包含する概念である。
市販のHuman Liver QUICK-Clone cDNA(Clontech社)を鋳型にして、ヒト肝由来Anion Exchanger(AE1)遺伝子をPCR法によって得た。クローニングされた遺伝子は塩基配列を決定し、公開されているヒトAE1との相同性からAE1をコードしていることを確認した。得られたAE1遺伝子は、2733塩基中、8箇所(t263g,t357c,a645t,a672c,c951t,a2078g, t2195c,c2500t)に変異がみられ、コードするアミノ酸は、911個中、4アミノ酸(L88R、E693G, V712A,H834Y)が異なっていた。しかし、13の膜貫通領域をもつトランスポーターと予測されるため(図1)、ヒト肝由来AE1 遺伝子として細胞改変に用いた。
実施例1のPCRクローニングにより取得したヒトAE1(以下AE1)遺伝子にKozak配列を加え、CMVプロモーター発現プラスミドpHyg-AE1(図2)、pPur-AE1(図3)を構築した。pHyg-AE1あるいはAE1遺伝子を含まないpHyg発現プラスミド(Clontech社のpTK5由来のHygromycin耐性遺伝子発現ユニットをpSV2-dhfrプラスミド(ATCC No.37146)に導入したプラスミドを構築後、dhfr発現ユニットを取り除いたものである。)を、親株である抗グリピカン-3抗体産生CHO細胞(国際公開第WO 2006/006693号パンフレットを参照)にエレクトロポレーション法で導入し、Hygromycin(200μg/ml) 存在下、静置培養下で高増殖であった細胞株を拡大したのち、pHyg-AE1細胞株からTotal RNAを調製し、TaqMan法によってヒトAE1を高発現していた5株を選抜した。さらに、振とう培養下で、コントロールであるpHyg導入細胞(4株)と同程度に増殖した4株をヒトAE1導入細胞として、抗体産生量比較をおこなった。初発密度2x105cells/mLの50mlシェーカーフラスコによる流加培養において、シェーカー培養後期12日目のpHyg-AE1導入細胞(4株)の抗グリピカン-3抗体産生量は、pHyg導入細胞(4株)に対して優位であった(t検定 P<0.05, 図4)。
AE1強発現効果は、また、AE1強発現宿主細胞を用いた抗IL-6R抗体産生株構築によって示された。通常の宿主細胞DXB11にpHyg-AE1(図2)をエレクトロポレーション法で導入し、Hygromycin(200μg/ml)存在下、静置培養下で高増殖であった細胞株を選抜、拡大したのち、TaqMan法によってヒトAE1を高発現していた細胞をAE1/DXB11宿主細胞として樹立した。AE1/DXB11宿主細胞に抗IL-6R抗体発現プラスミドを導入し、シングルクローン化されたAE1-S08細胞は抗IL-6R抗体高産生であり、図12に示したように、初発7x105cells/mLの1Lジャー流加培養14日目の産生量は3.0g/Lであった。抗体高産生細胞AE1-S08および宿主細胞AE1/DXB11は共に、継代培養による安定性試験において安定であること、AE1高発現が維持されることは確認済みである。
以上の結果は、AE1遺伝子導入効果が抗体遺伝子導入前後、どちらにおいてもポジティブに作用することを示している。
本発明は、あらゆるポリペプチド(好ましくは抗体)産生細胞へ応用可能である。
CHO DXB11細胞に抗IL-6レセプター抗体遺伝子を導入した抗IL-6レセプター抗体産生細胞(特開平8-99902号公報)からtotal RNA抽出をおこなったのち、ポリAに依存するcDNAを合成した。SalI、XhoI、EcoRIの三種類の制限酵素で断片化したcDNAを鋳型とすることで、Hamster CSAD遺伝子をPCRにより得た。PCRプライマーは 既知であるRatとMouse間で遺伝子配列が保存されている5’,3’を含むものを設計して用いた。クローニングされた遺伝子は塩基配列を決定し、既知の生物種のCSADとの相同性から Hamster CSAD(図9)をコードしていることを確認した。 Hamster CSADはMouse(96% Identity)、Rat(96% Identity)、Human(91% Identity)と既知のアミノ酸配列に対して高い相同性を有しており、同様の活性をもつ酵素であることが予想された。ハムスターのCSADの塩基配列を配列番号3に示す。ハムスターのCSADのアミノ酸配列を配列番号4に示す。
参考例1のクローニングにより取得したHamster CSAD(以下CSAD)遺伝子にKozak配列を加え、CMVプロモーター発現プラスミドpPur/CSAD(図10)を構築した。
市販のHuman Liver QUICK-Clone cDNA(Clontech社)を鋳型にして、ヒト肝由来Alanine aminotransferase(ALT1)遺伝子をPCR法によって得た。クローニングされた遺伝子は塩基配列を決定し、公開されているヒトALT1との相同性からALT1をコードしていることを確認した。得られたALT1遺伝子は、1488塩基中、5箇所(c157a,a215g,c765t,t857c,t995a)に変異がみられ、コードするアミノ酸は、496個中、4アミノ酸(R53S、Q72R, F286S, M332K)が異なっていたが、ヒト肝由来ALT1 PCRクローンとして細胞改変に用いた。
参考例3のクローニングにより取得したヒトALT1(以下ALT1)遺伝子にKozak配列を加え、CMVプロモーター発現プラスミドpPur-ALT1(図11)を構築した。pPur-ALT1あるいはALT1遺伝子を含まないpPur発現プラスミドを、親株である抗グリピカン-3抗体産生CHO細胞(国際公開第WO 2006/006693号パンフレットを参照)にエレクトロポレーション法で導入し、Puromycin(6μg/ml)存在下、静置培養で高増殖であった細胞株(pPur-ALT1:7株, pPur:3株)を選抜した。拡大後、pPur-ALT1細胞株からTotal RNAを調製し、TaqMan法によってヒトALT1を高発現していた6株を選抜し、さらに、振とう培養下で、コントロールであるpPur導入細胞(3株)と同程度に増殖する4株をヒトALT1導入細胞とし、抗体産生量比較をおこなった。初発密度2x105cells/mLの50mlシェーカーフラスコによる流加培養において、シェーカー培養後期17日目のpPur-ALT1導入細胞(4株)の抗グリピカン-3抗体産生量(1236±149 mg/L)は、pPur導入細胞(3株)の抗グリピカン-3抗体産生量(871±119 mg/L)に対して優位であった(t検定 P<0.01)。シェーカー流加培養検討において、それぞれ最も抗体高産生であったpPur-ALT1発現株A72およびPur発現株P41を初発10x105cells/mLで1Lジャー流加培養をおこなうと、A72の抗体産生量は、培養19日目で2.9g/Lであり、P41の抗体産生量(2.2g/L)以上に高産生であった。培養14日目以降にP41の産生量増加がみられないことから、A72の抗体高産生は生存率維持効果によるものと考えられた(培養14日目生存率は、pPur-ALT1発現A72で60%、pPur発現株P41で23%であった)。
CHO DXB11細胞に抗IL-6レセプター抗体遺伝子を導入した抗IL-6レセプター抗体産生細胞(特開平8-99902号公報)からtotal RNA抽出をおこなったのち、ポリAに依存するcDNAを合成した。SalI、XhoI、EcoRIの三種類の制限酵素で断片化したcDNAを鋳型することで、Hamsterタウリントランスポーター(TauT)遺伝子をPCRにより得た。PCRプライマーは 既知であるRat/Mouse TauT間で遺伝子配列が保存されている5’,3’を含むものを設計して用いた。クローニングされた遺伝子は塩基配列を決定し、既知の生物種のTauT との相同性から Hamster TauTをコードしていることを確認した(図13)。Hamster TauTアミノ酸配列はMouse(96% Identity)、Rat(96% Identity)、Human(93% Identity) TauTに対して高い相同性を有しており、12の膜貫通領域をもつトランスポーターであることが予想された(図14)。
参考例5のクローニングにより取得したHamster TauT(以下TauT)遺伝子にKozak配列を加え、CMVプロモーター発現プラスミドpHyg/TauT(図15)を構築した。pHyg/TauTあるいはTauT遺伝子を除いたコントロールプラスミドpHygを、親株である抗グリピカン-3抗体産生CHO細胞(国際公開第WO 2006/006693号パンフレットを参照)にエレクトロポレーション法で導入した。発現プラスミド導入細胞をHygromycin(400μg/ml)存在下で選抜したのち、安定して増殖する細胞株すべてを拡大した(pHyg/TauT:8株, pHyg:7株)。TauT mRNAを調製ののちTaqMan法により、親株に対して優位な発現を確認できる7株をpHyg/TauT導入細胞とした。導入細胞(7株)のmRNA平均発現量はコントロール(7株)の約40倍であった。計14株の細胞は2x105cells/mLの初発密度で50mlシェーカーフラスコによるバッチ(batch)培養および流加(Fed-batch)培養をおこない、培養後期7日目における生細胞密度、乳酸産生量、抗グリピカン-3抗体産生量を比較した。バッチ培養においては細胞増殖にともない培養液中に乳酸などの生育阻害物質が蓄積し、増殖が抑制されるが、pHyg/TauT導入細胞の生細胞密度(9.28±3.27 x 105 cells/ml)および乳酸産生量(1.54±0.20 g/L)はpHyg導入細胞(生細胞密度:5.69±2.09 x 105 cells/ml、乳酸産生量:1.75±0.15 g/L)に対して優位であった(t検定 P<0.05)。抗グリピカン-3抗体産生量に関しては、pHyg/TauT導入細胞の7株中4株(平均抗体産生量:440.6 mg/L)がpHyg導入細胞の最高値(389.6 mg/L)以上であった。さらにpHyg/TauT導入細胞の抗グリピカン-3抗体産生量の優位性(t検定 P<0.01)が流加培養により明らかになったため、上記4株中で最も増殖能が高かったpHyg/TauT導入細胞(T10)と親株の1L ジャーによる流加培養をおこなったところ、T10は培養32日目においても生存率が80%以上に維持されており、乳酸産生が抑制されていた。その結果、抗グリピカン-3抗体産生量は、培養35日目において2.9g/Lを達成した。TauT導入T10細胞が細胞膜上にTauT分子を発現していることはフローサイトメトリー分析で確認した。以上の結果は、Hamster TauTを人為的に発現させることによって抗体産生細胞のポテンシャルが上がり、抗体高産生株が得られることを示唆している。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号1は、ヒトAE1をコードする遺伝子の塩基配列(GenBank M27819)を示す。
<配列番号2>
配列番号2は、ヒトAE1のアミノ酸配列(UniProtKB/Swiss-Prot P02730)を示す。
<配列番号3>
配列番号3は、ハムスターCSADをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
<配列番号4>
配列番号4は、ハムスターCSADのアミノ酸配列を示す。
<配列番号5>
配列番号5は、ヒトALT1をコードする遺伝子の塩基配列(KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875)を示す。
<配列番号6>
配列番号6は、ヒトALT1のアミノ酸配列(KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875)を示す。
<配列番号7>
配列番号7は、ハムスタータウリントランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
<配列番号8>
配列番号8は、ハムスタータウリントランスポーターのアミノ酸配列を示す。
Claims (10)
- BicarbonateトランスポーターをコードするDNA及び所望の抗体をコードするDNAが人為的に導入され、且つ当該Bicarbonateトランスポーターを発現する細胞を培養し、所望の抗体を産生させることを含む、ポリペプチドの製造方法。
- BicarbonateトランスポーターをコードするDNA及び所望の抗体をコードするDNAが人為的に導入され、且つBicarbonateトランスポーターを発現する細胞が、さらにシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ又はアラニンアミノトランスフェラーゼをコードするDNAが人為的に導入され、且つ当該システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ又はアラニンアミノトランスフェラーゼを発現する請求項1記載の製造方法。
- Bicarbonateトランスポーターが、SLC4アニオンエクスチェンジャーまたはSLC26アニオンエクスチェンジャーである請求項1又は2に記載の製造方法。
- Bicarbonateトランスポーターが、SLC4アニオンエクスチェンジャーである請求項1又は2に記載の製造方法。
- SLC4アニオンエクスチェンジャーが、AE1である請求項4記載の製造方法。
- SLC4アニオンエクスチェンジャーをコードするDNAが以下の(a)〜(d)のいずれかである請求項3〜5のいずれかに記載の製造方法。
(a) 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA
(b) 配列番号2のアミノ酸配列において、1個以上10個以下のアミノ酸が置換、欠失又は/及び付加されたアミノ酸配列を有し、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c) 配列番号2のアミノ酸配列と97%以上の同一性を有し、かつSLC4アニオンエクスチェンジャー活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d) 配列番号1の塩基配列を有するDNA - 以下の工程を含む、所望のポリペプチドを含有する医薬品を製造する方法;
(i)請求項1〜6のいずれかに記載の方法で所望のポリペプチドを製造する工程、
(ii)当該ポリペプチドを医薬的に許容される担体又は添加剤と混合する工程。
- BicarbonateトランスポーターをコードするDNAと所望の抗体をコードするDNAが人為的に導入されているCHO細胞。
- さらにシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ又はアラニンアミノトランスフェラーゼをコードするDNAが人為的に導入されている請求項8記載の細胞。
- BicarbonateトランスポーターをコードするDNAとシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ又はアラニンアミノトランスフェラーゼをコードするDNAが人為的に導入されているCHO細胞。
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