JPH10504398A - 有核赤血球の迅速な同時分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 全血サンプル中の有核赤血球及び白血球の同時的及び定量的なフローサイトメトリー分析方法及びデバイスが提供される。方法は、ＲＢＣを除去し且つＮＲＢＣを生体染色用核染料に接触させるため、また、核染料がＷＢＣに透過することを抑制するために、全血サンプルのアリコートからＲＢＣ及びＮＲＢＣ細胞質を溶解させる段階と、染色されたアリコートをフローサイトメトリーによる光測定法で処理する段階と、第一及び第二の範囲の散乱角度の散乱光と蛍光（ＦＬ）とを含むパラメーターに関する少なくとも１つの信号を発生させる段階と、得られた信号を認定するために、認定された信号が第二の散乱信号閾値を上回り同時に第一の散乱信号閾値またはＦＬ閾値を上回る｛〔（第一散乱角信号 ＯＲ ＦＬ信号）ＡＮＤ 第二散乱角信号〕｝信号であることを要求する組合せ論理を用いて処理する段階と、検出された信号から蛍光及び散乱光の認定強度信号の三次元プロットを作成する段階と、作成された三次元プロットからＮＲＢＣとＷＢＣとを識別し、各々の細胞の数を決定する段階とから成る。

Description

【発明の詳細な説明】 有核赤血球の迅速な同時分析方法 発明の背景 本発明は、全血サンプル中の有核赤血球（“ＮＲＢＣ”）を識別し正確にカウ ントする方法に関する。本発明は特に、２つの光散乱パラメーターと蛍光との使 用によって全血サンプル中のＮＲＢＣ及び白血球（“ＷＢＣ”）サブ集団を同時 に識別及びカウントする方法に関する。 貧血の発病に関連する検査項目は注意深く監視する必要がある。血液研究所は 、貧血を診断するための適切な常套処理手順即ち標準処理手順のセットを供給し ている。最も重要な検査項目は、（全自動血球計数器で行う）全血球計算、血液 塗抹標本の形態分析、網状赤血球指数である。従来方法ではＮＲＢＣカウント数 は血液塗抹標本の形態分析によって決定されている。染色した血液塗抹標本を顕 微鏡下に観察し、ＮＲＢＣを手動操作でカウントする。ＮＲＢＣ濃度は一般には 、白血球（“ＷＢＣ”）１００個あたりのＮＲＢＣの数として記録される。通常 は、被験者の血液塗抹標本の同一領域に存在する２００個のＷＢＣとＮＲＢＣの 数とをカウントし、双方を２で除算してＷＢ Ｃ１００個あたりのＮＲＢＣの数としてＮＲＢＣ濃度を表す。手動操作によるこ の種の鏡検方法の主な欠点は、極めて労働集約的なこと、時間が掛かること、主 観的であること、及び、統計が少ないので不正確なことである。従って、正確な 全自動ＮＲＢＣカウント法は、かねてから病理学者及び検査技師らによって要望 されている。 臨床用フローサイトメーターで使用するためにＮＲＢＣカウント法を全自動化 する場合の主要な問題は、ＮＲＢＣは希少なイベントであり、ＲＢＣ集団は極め て多数に存在する成分であるから、細胞の電気抵抗率（インピーダンス測定値） または細胞の光散乱特性（光学測定値）の違いに基づいて赤血球（“ＲＢＣ”） 集団中のＮＲＢＣ集団を検出することが容易ではないことである。ＲＢＣ集団中 でなくＷＢＣ集団中のＮＲＢＣ集団をカウントする実験も数多く試みられたが、 これらの努力は概して成功をみなかった。 ＮＲＢＣはＷＢＣ中で明確なクラスターを形成しないので、フローサイトメー ターで使用される通常の二次元空間識別方法ではＮＲＢＣ集団をＷＢＣ集団から 容易に識別できない。検出された信号を常用の二次元の光散乱（前方対側方）ド ット プロットまたは光の散乱対吸収ドットプロットとして観察するとき、ＮＲＢＣ集 団をリンパ球集団から分離することは通常はできない。大部分のＮＲＢＣ集団の 信号は通常はＲＢＣ間質及び血小板（ＰＬＴ）の信号と混交し、ＮＲＢＣクラス ターの上端は極めてしばしばリンパ球集団の占めるスペース内に伸びている。 Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ Ｈ^*１（登録商標）、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＳＴＫ（登録商 標）、並びに、Ａｂｂｏｔｔ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）３０００及び３５ ００のような全自動的な臨床用血液分析装置は、サンプルのドットプロットがリ ンパ球クラスターの下方に増加したノイズ信号を示すならばサンプル中にＮＲＢ Ｃが存在する可能性があるという“標識”を与えるだけである。ノイズレベルの 上昇はＰＬＴ凝集体、巨大ＰＬＴまたは不完全溶解ＲＢＣに起因することもある ので、この種の標識付けは極めてしばしば誤った陽性結果を生じる。更に、干渉 が生じるため、ＮＲＢＣ含有サンプル中のＷＢＣ総数及びＷＢＣ百分率（ＷＢＣ ／Ｄｉｆｆ）の正確な結果を得ることは極めて難しい。また、正確なＷＢＣ百分 率及びＮＲＢＣカウント数を得るためには、熟練した技師が標識サンプルの血液 塗抹 標本を顕微鏡で観察しカウントしなければならない。これは極めて労働集約的で 主観的な方法である。 最近になって、１９９４年３月２９日にＩｎａｍｉらの米国特許第５，２９８ ，４２６号が許諾された。この特許は、特定の核染料によるＷＢＣ及びＮＲＢＣ の染色を含む２段階方法を教示している。この特許の方法では、血液サンプルを 、先ず、蛍光性核染料を含有する酸性低張溶液と混合する。次に、ｐＨ及びオス モル濃度を調整するためにアルカリ性塩バッファから成る溶液をサンプル／第一 試薬の溶液と混合する。次いで、この最終溶液をフローサイトメーターに充填し 、ＮＲＢＣを他の有核細胞と共に検出しカウントする。 Ｉｍａｎｉらの方法が受入れられない理由、特に全自動的方法に受入れられて いない理由はいくつか存在する。第一に、酸性低張溶液はすべての細胞の細胞膜 を損傷し、すべてのＷＢＣが漏出性になり易く、従って核染料によるＮＲＢＣの 選択的染色が不可能である。核物質（ＤＮＡ）は同じであるから、ＮＲＢＣ核だ けを染色しＷＢＣ核を染色しない公知の染料は存在しない。Ｉｎａｍｉらによっ て記載された核染料プロピジウム・イオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉ ｄｅ）は、損 傷した細胞膜を透過することによって死細胞の核を染色し、ＮＲＢＣ核だけでな く任意の核のＤＮＡヘリックスに侵入する常用の生体染色用核染料である。第二 に、該方法は、ＮＲＢＣ核の蛍光信号と、ハウエル−ジョリー体、好塩基性斑点 、溶解網状赤血球及び網状血小板のＲＮＡ、ＷＢＣのＤＮＡ及び巨核球の断片の ような他の核残遺物の蛍光信号とを分離または識別することができない。第三に 、Ｉｎａｍｉらの方法では、サンプルを予め複数の試薬でオフライン処理してプ レップサンプルを調製する必要があり、この処理後に漸くプレップサンプル／試 薬の溶液を装置に充填できる。発明の概要 全血サンプル中の有核赤血球及び白血球の同時的及び定量的なフローサイトメ トリー分析方法が提供される。方法は、生体染色用核染料をＮＲＢＣ核に接触さ せるため及び生体染色用核染料のＷＢＣ透過を最小限に抑制するように全血サン プルのアリコート中のＲＢＣ及びＮＲＢＣ細胞質を破壊する段階と、染色された アリコートをフローサイトメトリーによる光測定法で処理する段階と、第一及び 第二の範囲の散乱角度の散乱光と蛍光（ＦＬ）とを含むパラメーターに関する少 なくとも１つの信 号を発生させる段階と、得られた信号を認定するために、認定された信号が第二 の散乱信号閾値を上回り同時に第一の散乱信号閾値またはＦＬ閾値を上回る｛〔 （第一散乱角信号 ＯＲＦＬ信号）ＡＮＤ 第二散乱角信号〕｝信号であること を要求する組合せ論理を用いて処理する段階と、検出された信号から蛍光及び散 乱光の認定強度信号の三次元プロットを作成する段階と、作成した三次元プロッ トからＮＲＢＣとＷＢＣとを識別し、各々の細胞の数を決定する段階とから成る 。 本発明の別の実施態様においては、全血サンプル中のＮＲＢＳ及びＷＢＣの同 時定量分析デバイスが提供される。デバイスは、第一及び第二の範囲の散乱角度 の散乱光と蛍光（ＦＬまたはＦｌ）とを含むパラメーターに関する少なくとも１ つの信号を発生させるフローサイトメーターと、フローサイトメーターから得ら れた信号をＡＮＤ／ＯＲ論理によってデジタル化用に認定するトリプルトリガリ ング回路とを含む。認定された信号は、第二の散乱信号閾値を上回り、同時に、 第一の散乱信号閾値またはＦＬ閾値を上回る｛〔（第一散乱角信号 ＯＲ ＦＬ 信号）ＡＮＤ 第二散乱角信号〕｝ことが要求される。 本発明の別の実施態様においては、全血サンプル中の有核赤 血球及び白血球の同時定量分析方法が提供される。方法は、ＷＢＣの染色を最小 限に抑制しながらＮＲＢＣ核を核染料で染色するために全血サンプルのアリコー トから赤血球（“ＲＢＣ”）及びＮＲＢＣ細胞質を除去してＮＲＢＣ核を露出さ せる段階と、アリコートをフローサイトメトリーによる光測定法で処理する段階 と、約０°−約１°の散乱光消衰（ＡＬＬ）と約３°−１０°の散乱光（ＩＡＳ ）と蛍光（Ｆ１）とを含むパラメーターに関する少なくとも１つの信号を発生さ せる段階と、得られた信号を〔（ＡＬＬ信号）ＯＲ（Ｆｌ信号）ＡＮＤ（３°− １０°散乱信号〕から成るＡＮＤ／ＯＲ論理を用いて認定する段階と、検出され た信号から蛍光及び散乱光の認定強度信号の三次元プロットを作成する段階と、 作成した三次元プロットからＮＲＢＣとＷＢＣとを識別し、各々の細胞の数を決 定する段階とから成る。 本発明の別の実施態様においては、全血サンプル中の有核赤血球及び白血球を 定量分析するフローサイトメトリーデバイスが提供される。デバイスは、約０° −約１°の散乱光パラメーターと約３°−１０°の散乱光パラメーターと蛍光（ Ｆｌ）パラメーターとに関する少なくとも１つの信号を発生するフロー サイトメーターと、フローサイトメーターから得られた信号をＡＮＤ／ＯＲ論理 によってデジタル化用に認定するトリプルトリガリング回路とを含み、上記論理 は、以後の処理に対する信号の妥当性を検査するために、〔（０°−約１°の散 乱信号）ＯＲ（Ｆｌ信号）ＡＮＤ（３°−１０°散乱信号〕から成る。図面の簡単な説明 図１は、本発明方法を実施するために使用され得る臨床用フローサイトメータ ーの光学素子の概略図である。 図２は、「Ｖａｌｉｄ」トリプルトリガ回路の概略図である。 図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、標準または規準検出トリガを用いて実施例１に記載 のごとく処理した全血サンプルのＷＢＣ、ＮＲＢＣ、ＲＢＣ間質及び他のバック グラウンドノイズの分布を示す概略図である。 図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃは、０°−約１°の散乱角の軸方向光減損（ＡＬＬ）ト リガだけを用いて実施例１に記載のごとく処理した全血サンプルのＷＢＣ、ＮＲ ＢＣ、ＲＢＣ間質及び他のバックグラウンドノイズの分布を示す概略図である。 図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、３°−１０°の中角散乱（ＩＡＳ）トリガだけを用 いて実施例１に記載のごとく処理した全血サン プルのＷＢＣ、ＮＲＢＣ、ＲＢＣ間質及び他のバックグラウンドノイズの分布を 示す概略図である。 図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、蛍光（ＦＬ３）トリガだけを用いて実施例１に記載 のごとく処理した全血サンプルのＮＲＢＣ、ＲＢＣ間質及び他のバックグラウン ドノイズの分布を示す概略図である。 図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは、ノイズ信号を除去するために図６に使用したトリガ よりも高いＦＬ３トリガレベルを用いて実施例１に記載のごとく処理した全血サ ンプルのＮＲＢＣの分布を示す概略図である。 図８は、電子的に互いに「ＯＲ接続された」２つのトリガＡＬＬ及びＦＬ３を 用いて実施例１に記載のごとく処理した全血サンプルのＷＢＣ、ＮＲＢＣ及び他 のバックグラウンドノイズの分布を示す概略図である。 図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃは、電子的に互いに「ＯＲ接続された」２つのトリガＡ ＬＬ及びＦＬ３と図８よりも高い値に設定されたＦＬ３トリガレベルとを併用し て実施例１に記載のごとく処理した全血サンプルのＷＢＣ及びＮＲＢＣの分布を 示す概略図である。 図１０Ａ、１０Ｂ及び１０Ｃは、ＡＬＬ、ＩＡＳ及びＦＬ３のトリガを用いて 実施例１に記載のごとく処理した全血サンプルのＷＢＣ及びＮＲＢＣの分布を示 す概略図である。 図１１Ａ−１１Ｃは、規準または標準検出トリガを用いて実施例１に記載のご とく処理した正常血液サンプルのドットプロット図を示す。 図１２Ａ及び図１２Ｂは、標準または規準検出トリガを用いて実施例２に記載 のごとく処理したＮＲＢＣを含有する異常血液の細胞図を示す。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、規準検出トリガを用いて実施例３に記載のごとく処 理したＮＲＢＣ含有の異常血液の細胞図を示す。 図１４Ａ−１４Ｃは、本発明のトリプルトリガ（ＡＬＬ、ＦＬ３及びＩＡＳ） 検出方法を用いて処理した５６ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣを含む全血サンプルの分 布を示す。 図１５Ａ及び図１５Ｂは、同じく本発明のトリプルトリガ（ＡＬＬ、ＦＬ３及 びＩＡＳ）検出方法を用いて処理した１４０ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣを含む別の 全血サンプルの分布を示す。 図１６Ａ及び図１６Ｂは、本発明の方法を用いて実施例６に記載のごとく調製 及び処理した線形サンプル群の結果を示す。 図１７は、本発明の方法を用いた全自動血液分析装置のＮＲＢＣカウント数（ 縦座標）と顕微鏡を用いた手動操作によるＮＲＢＣカウント数（横座標）との相 関プロットである。データを実施例７に記載のごとく処理した。発明の詳細な説明 本発明は広義には、独特のトリプルトリガリング方法を用いた全血サンプル中 のＷＢＣ百分率及びＮＲＢＣを同時分析するための全自動方法に関する。本発明 方法によれば、ＮＲＢＣを含有する全血サンプルから正確なＮＲＢＣカウント数 とＷＢＣ百分率データとを同時に得ることが可能である。 本発明の重要な特徴は、（蛍光性及び非蛍光性の）落屑から生じる信号をトリ プルトリガリング方法によって遮断し、ＡＬＬトリガを下回りＦＬ３トリガを上 回る信号をＮＲＢＣとして同定しカウントすることである。従って、蛍光性核落 屑が本質的に夾雑しない正確なＮＲＢＣカウント数が得られる。壊れ易い幼若細 胞及び死細胞も本発明方法を利用して検出し得る。 トリプルトリガ方法においては、ＷＢＣを保存しながらＲＢ Ｃを速やかに溶解させて、露出したＮＲＢＣ核を染色する適当な核染料を添加し た血液希釈剤を血液サンプルと混合することによってＷＢＣ百分率とＮＲＢＣと を正確に同時にカウントすることが可能である。血液希釈剤は、１９９４年８月 ２９日出願の「全血サンプルを迅速に溶解するための多目的試薬系（ＭＵＬＴＩ ＰＵＲＰＯＳＥ ＲＥＡＧＥＮＴ ＳＹＳＴＥＭ ＦＯＲ ＲＡＰＩＤ ＬＹＳ ＩＳ ＯＦ ＷＨＯＬＥ ＢＬＯＯＤ ＳＡＭＰＬＥＳ）」という表題の米国特 許出願Ｎｏ．０８／２９７，６６２に開示されている。この特許の記載内容は参 照によって本発明に含まれるものとする。希釈剤／サンプルの混合物を、照射し た光学フローセルに本質的には一度に１細胞の割合で通す。通過する細胞は照射 光を散乱し、染色された核が存在するならばこの核が蛍光を発する。散乱光信号 及び蛍光信号を公知の手段によって検出し、検出した信号の処理にトリプルトリ ガリング方法を用いることによって、ＷＢＣ、ＷＢＣ百分率及びＮＲＢＣを同定 し定量することが可能である。本発明のトリプルトリガ方法と特に適合性である ことが判明した血液分析装置は、１９９４年８月１日出願の「全自動分析の実施 方法及び装置（ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＦＯＲ ＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧ ＡＵＴＯＭＡＴＥＤ ＡＮＡＬＹＳＩＳ）」と いう表題の米国特許出願Ｎｏ．０８／２８３，３７９に開示及び記載されている 。この特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。 トリプルトリガ方法の特徴は、溶解網状白血球のＲＮＡ、ハウエル−ジョリー 体、網状血小板、巨大血小板、ＷＢＣのＤＮＡ、巨核球断片、寄生生物及びＲＢ Ｃ断片のような他の細胞落屑から干渉されることなくＷＢＣ百分率とＮＲＢＣと の同時分析が自動的に正確にかつ迅速に行われることである。本発明の別の利点 は、ＷＢＣ、ＲＢＣ及び血小板をカウントするように標準的に校正された臨床用 血液分析装置において方法を使用することができるので臨床用な有効性が極めて 高いことである。このようなシステムは、臨床用血液サンプル中の正確なＷＢＣ 百分率とＮＲＢＣとのデータ（パーセント及び絶対カウント数）を供給し得る。 従来ではこのようなデータ処理は可能ではなかった。 また、トリプルトリガ方法によれば、ＷＢＣ百分率の分析を行う前に、ＮＲＢ Ｃとして同定された信号を全ＷＢＣ信号から減算することによって、ＮＲＢＣを 含有する血液サンプル中の 正確なＷＢＣ百分率の分析を行うことが可能である。ＮＲＢＣを染色するための １種類の染料が必要なだけであり、ＷＢＣ百分率の分析はＷＢＣサブクラスの光 散乱特性の違いによって行うことができる。 本発明は、軸方向光減損（ＡＬＬ）、中角散乱（ＩＡＳ）及び赤色蛍光（ＦＬ ３）の三次元空間における独特のトリプルトリガリング方法によって上記の目的 を全て達成する。 これを達成するために、前方中角散乱（ＩＡＳ）と前方小角散乱（ＳＡＳ）ま たは軸方向光減損（ＡＬＬ、前方減衰としても知られる）を測定するために１つ またはそれ以上の検出器を好ましくは前方光路内に配置する。ＡＬＬは通常は、 レーザービームの前方を通過し光ダイオードによって検出される細胞に起因する 光エネルギーの減少である。光減損は通常は、散乱によって生じるものであり、 レーザービームの光路内で検出器に到達する光エネルギーのビーム内の細胞通過 に起因する減少であると定義される（一般にＡＬＬは約０°−約１°の角度で検 出される）。対照的に、前方小角散乱（ＳＡＳ）は、ビームを通る細胞から散乱 されることによって入射レーザーの外部（約１°−３°の狭角内）で検出器に到 達する光エネルギーである。 レーザービームが検出器に侵入しないように通常はビームストップが配備されて いる。ＡＬＬ測定システムは、レーザー光線の入射コーンの内部の光を集め、小 角散乱システムはこのコーンの外部の光を集める。ＡＬＬ測定システムにおいて 、問題の信号は確実な定常レーザー信号から減算された負の信号であり、他方、 前方小角散乱測定においては、信号は極めて低いバックグラウンド光レベルに加 えられた小さい正の信号である。光が入射レーザービームよりも広角に散乱する こと以外は前方中角散乱（ＩＡＳ）は前方小角散乱と同様である。より詳細には 、ＩＡＳはレーザービームの入射線または中心線から約３°から１０°までの間 に環状に散乱する光に関する。好ましい実施態様においては、ＡＬＬはレーザー 軸から水平方向で約０．３°未満及び垂直方向で約１．２°未満の角度内に集ま り、ＩＡＳはレーザー軸から約３°から１０°までの間の角度に集まる。 開示されたシステムの別の技術的利点は、染料がＮＲＢＣの核に接近し易くな るようにＮＲＢＣの細胞質を完全に溶解させるので、正確な検出及びカウントを 行うためのＮＲＢＣの効率的で迅速な染色がはるかに低濃度の染料で可能なこと である。この条件によれば、ＮＲＢＣ検出において１００を上回る高い 信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比が得られる。ＷＢＣ百分率とＮＲＢＣとの同時的分析を 迅速に実施するためにこのシステムに必要な生体染色用染料の濃度はわずかに１ 〜２μｇ／ｍｌであり、これは従来技術の少なくとも５０／１以下である。 本発明で使用できる生体染色用染料（死細胞または損傷細胞だけを染色する核 染料）は核酸に結合しないときに比較的高い消衰係数を有し且つ低い蛍光強度を 有するいかなる生体染色用染料でもよい。生体染色用染料のスペクトル特性値、 即ち消衰（ＥＸ）最大値（ｎｍ）／発光（ＥＭ）最大値（ｎｍ）はシステムで使 用されるレーザー光源と適合性でなければならない。 開示されたシステムに適した生体染色用染料は以下の特性を有しているのが望 ましい。 高い消衰係数、 高い量子効率、 核酸に対する高い結合親和性、 核酸に結合しないときの低い蛍光、 スペクトル特性値の光源適合性 （例えば、アルゴンレーザー光源でＥＸ最大値は４８８ｎｍ以下及びＥＭ最大 値は６３０ｎｍ以下）。 適当な光源を用いる開示されたシステムで多数の核染料が適正に使用できると 認定された。開示されたシステムで使用できる市販の染料としては、ＹＯＹＯ− １、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−Ｐ ＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１があり、その他にも多数存在する。異なるＥＸ最大 値をもつ染料をヘリウム−ネオン、キセノンまたは水銀ランプのような適当な光 源で励起させ得ることは当業者によく知られている。 アルゴンレーザーと共に使用できると認定された同じく市販の染料は、プロピ ジウムヨージド（ＰＩ）、エチジウムブロミド（ＥＢｒ）、エチジウムホモダイ マー−１（ＥｔｈＤ−１）、エチジウムホモダイマー−２（ＥｔｈＤ−２）また はジエチレントリアミン（ＤＴＡ）である。本発明の１つの使用例では、使用さ れる生体染色用染料がＰＩである。ｐＨ約６．５、オスモル濃度約２６０を有し ており、酢酸塩バッファ（約１５ｍＭ）、塩化アンモニウム（約５．０ｇ／リッ トル）、炭酸水素カリウム（約２ｇ／リットル）、サポニン（約１００ｍｇ／リ ットル）及びホルムアルデヒド（約０．０７％）から成る多目的試薬系（米国特 許出願Ｎｏ．０８／２９７，６６２）を使用する と、約４２℃で１分間以内にＷＢＣ百分率とＮＲＢＣとの同時分析を１段階で実 施し得る。 参照によってその記載内容が本発明に含まれる１９９４年８月１日出願の「全 自動分析の実施方法及び装置（ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ Ｆ ＯＲ ＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧ ＡＵＴＯＭＡＴＥＤ ＡＮＡＬＹＳＩＳ）」とい う表題の米国特許出願Ｎｏ．０８／２８３，３７９は、特に光散乱信号ＡＬＬ及 びＩＡＳと種々の蛍光信号とを利用して全血サンプルから細胞及び細胞サブクラ スを識別する全自動血液分析装置を開示している。以下の記載はこの血液分析装 置を用いた場合に限定されている。しかしながらこれは単なる便宜的な記載であ り、本発明がこの分析装置の使用にのみ限定されることは全くない。 約８５０μｌの等張性溶解用試薬を収容したＷＢＣカップに約２５μｌの全血 サンプルの一部分をサンプル吸引プローブを用いて導入する。溶解用試薬は、血 液サンプル中の赤血球画分を溶解させ、ＮＲＢＣの細胞質を溶解させて、ＮＲＢ Ｃが存在するならばその核を露出させるために使用される。試薬は、血液の赤血 球画分を溶解させることに加えて、ＷＢＣ画分を保護 するかまたは損傷しないように十分に穏やかに作用しなければならない。このよ うな溶解用試薬系の一例が、１９９４年８月２９日出願の「全血サンプルを迅速 に溶解させる多目的試薬系（ＭＵＬＴＩＰＵＲＰＯＳＥ ＲＥＡＧＥＮＴ ＳＹ ＳＴＥＭ ＦＯＲ ＲＡＰＩＤ ＬＹＳＩＳ ＯＦ ＷＨＯＬＥ ＢＬＯＯＤ ＳＡＭＰＬＥＳ）」という表題の米国特許出願Ｎｏ．０８／２９７，６６２に開 示されている。該特許出願の記載内容も参照によって本発明に含まれるものとす る。この試薬系の特徴は、１試薬／１段階方法で多数の目的を達成し得ることで ある。この試薬はすべての壊れ易い白血球の形態を保存すべく十分に穏やかに作 用し、同時に、すべての赤血球を効率的に溶解させる。双方の目的は、溶解時間 の延長を要する血球疾病性（ｈｅｍａｇｌｏｂｉｎｏｐｈａｔｈｉｃ）のサンプ ル中でも達成される。トリプルトリガ方法でいかなる配合の溶解剤を使用するか に関わりなく、試薬は、末梢血液中に存在し得るＮＲＢＣを効率的に標識する生 体染色用核染料を低濃度で含有してもよくまたはこのような染料と併用されても よい。前述の分析装置と共に使用するためには、屈折率が被覆溶液（ｓｈｅａｔ ｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の屈折率と実質的に０．１％未満まで 一致する溶解作用が生じるような成分構成が好ましい。 溶解用試薬とサンプルとの混合物を通常は前述のＷＢＣカップに１１秒間だけ 維持する。カップ中で混合物を４２℃±３℃で溶解及び混合させる。この時点で 、ＷＢＣカップの内容物を図１に示す検出用の光学フローセル１００に直接導入 する。 細胞流がフローセル１００を通過するときに測定プロセスが開始される。細胞 流は、溶解剤の添加によって希釈され、レーザー被照射容積（ｖｏｌｕｍｅ）を 希釈剤／被覆溶液によって包囲された層流サンプル流として一列縦隊で通過する 。被照射容積は、流動軸に垂直な２つの次元の流体力学的に収束した細胞流、及 び、流動軸に平行な１つの次元のレーザービームの約１７ミクロンの垂直方向の 狭窄ビーム幅によって限定されている。この試験を実施するとき、サンプルの流 速は約２．５μｌ／秒であり、対応するＷＢＣ細胞及びＮＲＢＣ細胞を感知する 被照射容積は約８０×５×１７ミクロンの寸法をもつ楕円柱にほぼ等しい。 この時点で図１に示すように、細胞の存在は、軸方向光減損（ＡＬＬ）と中角 散乱（ＩＡＳ）とを検出するコンパウンドホトダイオード１０２と、赤色蛍光を 検出する光電子増倍管 １０４と、図２に示す独特のトリプルトリガ回路とによって、ＡＬＬ、ＩＡＳ及 びＦＬ３（赤色蛍光）の三次元の特徴空間として検出される。トリプルトリガ回 路はＡＮＤ／ＯＲ論理を用いてデジタル化用の信号を認定する。認定された信号 は、ＩＡＳトリガよりも大きく、同時に、ＡＬＬトリガまたはＦＬ３トリガより も大きい信号でなければならない。この独特なトリガリング回路の組合せ、及び 、平衡した固定剤を含む溶解特性によって、ＤＮＡフラグメント、ＲＢＣ間質及 び血小板のような蛍光性及び非蛍光性のバックグラウンドを原因とする通常は生 じ易い干渉を生じることなく、露出したＮＲＢＣ核を速やかに染色し、明白にか つ曖昧さを残さずにカウントし、ＷＢＣ百分率を分析するための細胞のカウント 数から除外し得る。 １つまたはそれ以上の検出器は、前方中角散乱（ＩＡＳ）及び前方小角散乱（ ＳＡＳ）または軸方向光減損（ＡＬＬ）前方消衰としても知られる）を測定する ために、前方光路に配置するのが好ましい。ＡＬＬは一般に、レーザービームの 前を通る細胞に起因する光エネルギーの減少であり、光ダイオードによって検出 される。光減損は一般に、散乱に起因するものであり、レーザービームの通路内 で検出器に到達する光エネルギーのビ ーム内の細胞通過に起因する減少であると定義される（一般にＡＬＬは約０°− 約１°の角度で検出される）。対照的に、前方小角散乱（ＳＡＳ）は、ビームを 通る細胞から散乱されることによって入射レーザービームの外部（但し約１°− ３°の狭角内）で検出器に到達する光エネルギーである。レーザービームが検出 器に侵入しないように通常はビームストップが配備されている。ＡＬＬ測定シス テムはレーザー光線の入射コーンの内部の光を集めるが、小角散乱システムはこ のコーンの外部の光を集める。ＡＬＬ測定システムにおいて、問題の信号は定常 状態のレーザー信号から減算された負の信号であり、他方、前方小角散乱測定に おいては、信号は極めて低いバックグラウンド光レベルに加えられた小さい正の 信号である。光が入射レーザービームよりも広角に散乱すること以外は前方中角 散乱（ＩＡＳ）は前方小角散乱と同様である。より詳細には、ＩＡＳは、レーザ ービームの入射線即ち中心線から約３°から１０°までの間の環状区域に散乱し た光に関する。好ましい実施態様において、ＡＬＬはレーザー軸から水平方向で 約０．３°未満及び垂直方向で約１．２°未満の角度に集まり、ＩＡＳはレーザ ー軸から約３°から１０°までの間の角度に集まる。 このようにトリガされると、細胞が前述の被照射容積を通過したときに、検出 器１０２、１０４、１０６及び１０８にパルスが発生する。これらのパルスの振 幅が濾波され、増幅され、デジタル化され、対応するＡＬＬ、ＩＡＳ、ＦＬ３、 ＰＳＳ（偏光した側方散乱）及びＤＳＳ（偏光の解消した側方散乱）から成る５ 次元の特徴空間にリストモードで記憶される。フローセル１００の標準カウント 時間は約１０秒である。上記の流速及び希釈率を用いた場合、１μｌあたり７０ ００個のＷＢＣ細胞を含む健常被験者の血液の場合、検査対象としてカウントさ れる数は５０００個であろう。カウント数が少ないサンプルでは、測定の統計を 改善するためにカウント時間が自動的に延長される。測定時間の経過後、サンプ ル流を排出管から廃棄し、プローブを洗浄し、乾燥して、以後のサンプル処理に 備える。 次に、ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＦＬ３、ＰＳＳ及びＤＳＳから成る上記特徴空間のリ ストモードデータにアルゴリズムを応用し、３０秒未満の処理時間で以下の細胞 型を計数及び／または標識する。 後述するように、ＷＢＣ百分率を分析するためにはＡＬＬ及びＩＡＳ信号を検 出して収集し、ＮＲＢＣを分析するためには染色したＮＲＢＣ核からＦＬ３信号 を収集する。図２に示すトリプルトリガ回路は、ＡＮＤ／ＯＲ論理を用いてこれ らの信号をデジタル化用に認定する。認定されるためには、信号がＩＡＳトリガ を上回り、同時にＡＬＬトリガまたはＦＬ３トリガの いずれかを上回ることが必要である。 図２に示す種々の構成素子及び発生する信号または使用される信号は以下のラ ベルに対応する。 ３００−ＡＬＬ電圧比較器 ３０２−ＡＬＬ信号 ３０４−ＡＬＬ閾値電圧（Ｖｔｈ１） ３０６−ＡＬＬ電圧比較器出力 ３１０−ＦＬ３信号 ３１２−ＦＬ３閾値電圧（Ｖｔｈ２） ３１４−ＦＬ３電圧比較器 ３１６−ＦＬ３電圧比較器出力 ３１８−ＩＡＳ信号 ３２０−ＩＡＳ閾値電圧（Ｖｔｈ３） ３２２−ＩＡＳ電圧比較器 ３２４−ＩＡＳ電圧比較器出力 ３２６−ＯＲゲート ３２８−ＯＲゲート出力 ３３０−ＡＮＤゲート ３３２−Ｖａｌｉｄトリガ出力 夫々のチャネルからのリアルタイム信号が電圧比較器の入力に存在する。電圧 比較器３００、３１４及び３２２は、“＋入力”（３０２、３１０及び３１８） を“−入力”（３０４、３１２及び３２０）に比較することによって機能し、出 力（３０６、３１６、３２４）を与える。“＋入力”が“−入力”よりも高い電 圧を有するときは、出力は高レベルである。“＋入力”が“−入力”よりも低い 電圧を有するときは、出力が低レベルである。 閾値電圧はシステムパラメーターによって決定される独立電圧である。 比較器３００及び３１４の出力はＯＲゲート３２６の入力に接続されており、 ＯＲゲートの出力３２８を与える。ＯＲゲートはその入力を比較することによっ て機能する。一方の入力または双方の入力が高レベルのとき、出力は高レベルで ある。 ＯＲゲート３２８の出力と比較器３２２の出力３２４とはＡＮＤゲート３３０ の入力に接続されている。ＡＮＤゲートはその入力を比較することによって機能 し、出力３３２を導く。これはｖａｌｉｄトリガ出力である。双方の入力が高レ ベルの場合にのみ出力が高レベルとなる。 ＩＡＳ信号３１８がその閾値電圧３２０よりも大きく、ＡＬＬ信号３０２がそ の閾値電圧３０４よりも大きいか及び／またはＦＬ３信号３１０がその閾値電圧 ３１２よりも大きいときにのみｖａｌｉｄトリガ出力３３２が高いレベルとなる 。 上記トリガリング回路を使用すると、図１４及び図１５に示すようにＮＲＢＣ が前述の三次元の空間に独特のクラスターを形成し、ＷＢＣ百分率の光学的分析 中にこのＮＲＢＣを容易にカウントすることができ、ＷＢＣカウント数から明確 に除外できる。従って、ＷＢＣ１００個あたりのＮＲＢＣカウント数及び患者血 液１μｌあたりのＮＲＢＣ絶対数が記録される。その結果として、ＮＲＢＣがＷ ＢＣカウント総数から減算され、血液サンプル中のＮＲＢＣの存在下でＷＢＣ総 数及びＷＢＣ百分率の正確な分析が可能である。ＤＮＡフラグメント、ＲＢＣ間 質、ハウエル−ジョリー体、好塩基性斑点、溶解網状赤血球のＲＮＡ、ＷＢＣの ＤＮＡ及び巨核球断片から発生する蛍光性及び非蛍光性のバックグウンドノイズ は実質的に除去される。本発明で開示された（ＡＬＬ、ＩＡＳ及びＦＬ３に基づ く）トリプルトリガリングプロセスによって、染色されたＮＲＢＣ核が種々のバ ックグウンドノイズから分離され、ＡＬＬ対ＦＬ３の ドットプロット上で、ＦＬ３トリガを上回るＮＲＢＣ核から発生したＦＬ３＋信 号だけがＮＲＢＣとしてカウントされる。 図３〜図１０において、以下の数字で示される細胞集団領域は以下の細胞型に 対応する。 ２０２＝リンパ球、 ２０４＝単球、 ２０６＝顆粒球、 ２０８＝初期ノイズ、２１０＝ＮＲＢＣ、２１２＝間質実施例１ ＥＤＴＡ−抗凝固処理新鮮正常血液を、１９９４年８月１日出願の「全自動分 析の実施方法及び装置（ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＦＯＲ ＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧ ＡＵＴＯＭＡＴＥＤ ＡＮＡＬＹＳＩＳ）」という表題 の米国特許出願Ｎｏ．０８／２８３，３７９に開示された前述の臨床用全自動血 液分析装置の実験ユニットで処理した。該特許出願の記載内容は参照によって本 発明に含まれるものとする。この実施例では上記分析装置を用いて本発明を実施 したが、以下の全ての実施例では必ずしもこの分析装置を使用しなかった。１９ ９４年８月２９日出願の「全血サンプルを迅速に溶解させる多目的試薬系（ＭＵ ＬＴＩＰＵＲＰＯＳＥ ＲＥＡＧＥＮＴ ＳＹＳＴＥＭ ＦＯＲ ＲＡＰＩＤ ＬＹＳＩＳ ＯＦ ＷＨＯＬＥ ＢＬＯＯＤ ＳＡＭＰＬＥＳ）」という表題の米国特許出願Ｎｏ． ０８／２９７，６６２に開示された６７５μｌの等張性多目的試薬（ｐＨ６．５ 、２６０ｍＯｓｍ／リットル）に、２５μｌの血液サンプルをオンラインで混合 した。該特許出願の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。 これらの実験に使用した多目的試薬系は、９５ｍＭの塩化アンモニウム（５ｇ ／リットル）と、約０．０７５容量％のホルムアルデヒドと、約１０ｍＭ〜約２ ０ｍＭの酢酸塩バッファと、約１０ｍＭの炭酸水素カリウムと、約０．０１重量 容量％（即ちｇ／１００ｍｌ）のサポニンとから成る。試薬系のｐＨは、約６． ２〜約７．０の範囲に調整され、試薬系のオスモル濃度は約２１５〜約２７０ｍ Ｏｓｍ／リットルの範囲である。 分析装置の加熱した混合室で試薬を４２℃±３℃に予熱し、ここでサンプルと 試薬とを混合し、１１秒間インキュベートする。次にＷＢＣ百分率及びＮＲＢＣ の分析を行うためにこの混合物を（８秒半を要して）フローセルに移した。シス テムの光学素子編成を図１に示す。トリプルトリガリング回路を使用しないで当 業界で常用のＡＬＬトリガとＦＬ３トリガとの２つだ けを用いて分析を実施した。図３Ａから図１０Ｃまでの全部を参照されたい。 図１１Ａに示す上段のドットプロット図は、サンプルから得られた光散乱信号 （ＡＬＬ対ＩＡＳ）の区域を図示しており、３つの異なるＷＢＣ集団を示す。好 塩基球クラスターは明らかでないが、その理由は、正常血液が好塩基球を多量に 含んでいないからである。好酸球クラスターは示されていないが、その理由は、 好酸球はＤＳＳ対ＰＳＳドットプロット（図示せず）を介して分離されるからで ある。図１１Ｂに示す中段の細胞図は、標識されたＡＬＬ信号及びＦＬ３信号の ドットプロット図である。正常血液はＮＲＢＣを全く含まないことに注目された い。図１１Ｂ及び１１Ｃに示す下段のＦＬ３＋クラスターは、明らかに前述のよ うなＲＮＡまたはＤＮＡを含む細胞落屑である。実施例２ 図１２Ａ及び図１２Ｂの夫々に示す上段及び下段の細胞図は、（４７ＮＲＢＣ ／１００ＷＢＣの割合で）ＮＲＢＣを含む異常血液を標準検出方法を用いて実施 例１に記載のごとく分析したときのドットプロット図である。上段の細胞図のリ ンパ球集団 直下のクラスターはＮＲＢＣに属し、下部左隅の小クラスターは、ＲＢＣ間質（ 網状細胞、ハウエル−ジョリー体など）、血小板及びＷＢＣの落屑を含む初期ノ イズに属する。図１２Ｂは、このサンプルの初期ノイズクラスターが核染料によ って鮮明に染色され、ＦＬ３チャネル中で染色されたＮＲＢＣクラスターの極め て近傍に随伴し、従って、ＮＲＢＣを正確にカウントするようにＦＬ３トリガを 設定することが不可能なことを示す。実施例３ 図１３Ａ及び図１３Ｂの細胞図は、（５１ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣの割合で） ＮＲＢＣを含む異常血液を標準検出方法を用いて実施例１に記載のごとく分析し たときのドットプロット図である。図１３Ａに示す上段の図のリンパ球集団直下 のクラスターはＮＲＢＣに属する。このサンプルではＦＬ３＋の初期ノイズの増 加が観察される。ノイズクラスターはＦＬ３チャネル中でＮＲＢＣクラスターの 極めて近接に存在する。従って、ＦＬ３ノイズはＦＬ３トリガの位置と干渉を生 じる。初期ノイズを完全に除去すべくＦＬ３トリガを十分な高さに設定すると、 図１３Ｂに示すようにＦＬ３トリガを下回るＮＲＢＣ集団の一部も失われる。実施例４ この実施例では、本発明に開示したトリプルトリガ回路（ＡＬＬ／ＩＡＳ／Ｆ Ｌ３）を実施例１から３で使用した分析装置と同じ分析装置に組み込んで使用し た。 ５６ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣを含有するＥＤＴＡ−抗凝固処理臨床サンプルを 実施例１に記載の手順で処理した。結果を図１４Ａから図１４Ｃに示す。ＦＬ３ ＋ノイズクラスターが消滅したことに注目されたい。ＩＡＳトリガの付加によっ てノイズ信号が遮断される。全ＮＲＢＣ集団を回収するためにＦＬ３トリガを十 分に低い値に設定した場合にも、ＦＬ３トリガを上回る蛍光性初期ノイズはこの 異常血液からもはや出現しない（ＮＲＢＣクラスターが円形であることに注目さ れたい）。実施例５ 図１５Ａ及び１５Ｂは、同じくポストトリプルトリガ（ＡＬＬ、ＦＬ３及びＩ ＡＳ）で処理した１４０ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣを含む別の臨床用全血サンプル のＮＲＢＣ分布のドットプロット図を示す。初期ノイズは観察されず、ＦＬ３ト リガを上回る全ＮＲＢＣ集団が回収される。このサンプルで注目すべきは、ＮＲ ＢＣの濃度が極めて高いのでＮＲＢＣクラス ターの密度が高いことである。実施例６ 種々の濃度の非固定ニワトリ赤血球をＥＤＴＡ−抗凝固処理正常ヒト血液に添 加することによって線形サンプル群を調製した。本発明のトリプルトリガ検出方 法を用いて実施例１に記載の手順でサンプルを処理した。ニワトリ赤血球の細胞 質は本発明の方法で溶解し、露出した核だけが残った（ＣＥＮ）。ＣＥＮは希釈 剤中の生体染色用核染料（ＰＩ）によって極めて迅速に染色され蛍光性となる（ ＦＬ３）。ＦＬ３＋ ＣＥＮをＮＲＢＣとしてカウントし、ＮＲＢＣ／１００Ｗ ＢＣの数として記録し、また、本発明方法の全血サンプル１μｌあたりの絶対カ ウント数として記録する。結果を図１６Ａ及び１６Ｂに示す。図中のＮＲＢＣ／ １００ＷＢＣとＮＲＢＣ絶対数との線形プロット群は、本発明の方法が線形ＮＲ ＢＣカウント数を生じることを証明する。実施例７ 図１７は、本発明方法によって得られた８５の臨床サンプルのＮＲＢＣカウン ト数（縦座標）の相関プロットを示す。結果と標準的な顕微鏡の手動操作によっ て得られたカウント数（横 座標）の結果とを相関させる。手動操作によるＮＲＢＣカウント数を得るために は、ライト−ギムザによって染色した各患者の血液塗抹標本の２００個の白血球 細胞のＷＢＣ百分率の分析を実施し、また、同一領域に存在するＮＲＢＣカウン ト数を２で除算して、ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣを記録した。相関係数（Ｒ）は０ ．９７３（Ｒ２＝０．９４６）であり、勾配０．８６及びＹ軸切点は１．３２で ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イー，マイクル・ダブリユ アメリカ合衆国、カリフオルニア・94087、 サニーベイル、マンゴー・アベニユー・ 1051 (72)発明者 メータ，スレツシユ・エヌ アメリカ合衆国、カリフオルニア・94588、 プレゼントン、グレシヤム・コート・3543 (72)発明者 サガラ，ジヨゼフイーノ・シイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・95148、 サン・ホセ、ダミコ・ドライブ・3001 (72)発明者 カンター，ジヨウハナ アメリカ合衆国、カリフオルニア・94306、 パロ・アルト、ミドルフイールド・ロー ド・3120

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．フローサイトメトリーによって有核赤血球（ＮＲＢＣ）を他の細胞から識別 する方法であって、 （ａ）赤血球溶解成分と白血球固定成分と有核赤血球の核を染色する生体染色用 核染料成分とから成る試薬系と血液サンプルのアリコートとを混合し、 （ｂ）混合アリコートに対して実質的に一度に１細胞の割合で光学刺激領域を作 用させ、 （ｃ）蛍光（ＦＬ）と第一及び第二の範囲の散乱角度の散乱光とを含むパラメー ターに関する少なくとも１つの信号を発生させ、 （ｄ）得られた信号を認定するために、認定された信号が第二の散乱信号閾値よ りも大きく同時に第一の散乱信号閾値またはＦＬ閾値よりも大きい信号であるこ とを要求する論理によって信号を処理し、 （ｅ）検出された信号からＦＬ及び散乱光の強度信号の三次元プロットを作成し 、 （ｆ）作成された三次元プロットと認定された信号とから有核 赤血球と白血球とを識別し、各々の細胞数を測定する段階から成る方法。 ２．第一散乱角が約０°−約１°であることを特徴とする請求項１に記載の方法 。 ３．第一散乱パラメーターが軸方向光減損（ＡＬＬ）であることを特徴とする請 求項１に記載の方法。 ４．ＡＬＬが約０°−約１°の角度で得られることを特徴とする請求項３に記載 の方法。 ５．第二散乱角が約３°−約１０°であることを特徴とする請求項１に記載の方 法。 ６．核染料が、プロピジウムヨージド（ＰＩ）、エチジウムブロミド（ＥＢｒ） 、エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）、エチジウムホモダイマー−２ （ＥｔｈＤ−２）及びジエチレントリアミン（ＤＴＡ）から成る生体染色用染料 のグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ７．フローサイトメトリーによって有核赤血球を他の細胞から識別する方法であ った、 （ａ）赤血球溶解成分と白血球固定成分と有核赤血球の核を染色する生体染色用 核染料成分とから成る試薬系と血液サンプル のアリコートとを混合し、 （ｂ）混合アリコートに対して実質的に一度に１細胞の割合で光学刺激領域を作 用させ、 （ｃ）蛍光（ＦＬ）と約０°−約１°及び約３°−約１０°の範囲の散乱角度の 散乱光とを含むパラメーターに関する少なくとも１つの信号を発生させ、少なく とも１つの散乱光パラメーターが軸方向光減損を含んでおり、 （ｄ）得られた信号を認定するために、認定された信号が３°−１０°の散乱信 号閾値よりも大きく同時に０°−約１°の信号閾値またはＦＬ閾値よりも大きい ことを要求する論理によって信号を処理し、 （ｅ）検出された信号からＦＬ及び散乱光の強度信号の三次元プロットを作成し 、 （ｆ）作成された三次元プロットと認定された信号とから有核赤血球と白血球と を識別し、各々の細胞数を測定する段階から成る方法。 ８．核染料が、プロピジウムヨージド（ＰＩ）、エチジウムブロミド（ＥＢｒ） 、エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）、エチジウムホモダイマー−２ （ＥｔｈＤ−２）及びジエ チレントリアミン（ＤＴＡ）から成るグループから選択されることを特徴とする 請求項７に記載の方法。 ９．光散乱信号と蛍光信号とから得られた信号を認定するために、論理式〔（０ °−約１°の散乱信号）ＯＲ（Ｆｌ信号）ＡＮＤ（３°−１０°の散乱信号）〕 を演算するトリプルトリガ回路を更に含むことを特徴とする血液サンプルから細 胞を識別するためのフローサイトメーター。