CN103975054B - 有核红细胞分析系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于分析血液样本、更具体来说用于进行有核红细胞(nRBC)分析的系统和方法。所述系统和方法借助于荧光染色和荧光触发策略来筛查血液样本以便鉴定所述血液样本内的含核粒子。因此，来自未溶解红细胞(RBC)和溶解RBC的片段的干扰被大致上消除。所述系统和方法还使得能够开发适用于测定含有易碎白细胞(WBC)的样本的相对温和的试剂。在一个实施方案中，所述系统和方法包括：(a)用专有细胞膜可透性荧光染料染色血液样本；(b)使用荧光触发器筛查所述血液样本的含核粒子；并且(c)使用光散射和荧光发射的测量结果来区分nRBC与WBC。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据美国法典35篇119条(e)款要求题为用于分析有核红细胞的方法(Method For Analyzing Nucleated Red Blood Cells)并在2011年5月4日提交的美国临时专利申请号61/482,545的权益，所述临时专利申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。
本申请还涉及2012年4月26日提交的、代理人案卷号为ADDV-016(11040USO1)、题为“白细胞分析系统和方法(WHITE BLOOD CELL ANALYSIS SYSTEM AND METHOD)”的申请号xx/xxx,xxx；和2012年4月26日提交的、代理人案卷号为ADDV-018(11042USO1)/题为“嗜碱性粒细胞分析系统和方法(BASOPHIL ANALYSIS SYSTEM AND METHOD)”的申请号xx/xxx,xxx，这些申请的全部公开内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及血液学系统和方法。更具体来说，本发明涉及用于分析血液样本以鉴定、分类和/或定量血液样本中的有核红细胞(nRBC)的系统和方法。
背景技术
有核红细胞常存在于胎儿中和新生儿外周血液中。然而，nRBC被视为对成人而言是异常的。成人外周血流中存在nRBC通常表明存在严重的骨髓应激。研究已显示在血流中出现nRBC与病危患者的重度疾病阶段和/或不良预后高度相关。因此，对临床诊断来说，准确鉴定和定量nRBC已变得日益重要。
因为nRBC与白细胞(WBC)共有众多类似性，所以nRBC在血液样本中的浓度通常被报道为血液样本中的总WBC的百分比(即nRBC%=nRBC/WBC×100%)。分析nRBC的传统方法包括：(1)根据大小来使nRBC与WBC分离；(2)借助于光散射区别nRBC与WBC；或(3)在溶解并用细胞膜不透性荧光染料染色之后，借助于荧光发射检测来分析nRBC。
以上所列的每一项技术都已被证实在临床实践中存在缺点。举例而言，在快速血液学测量中难以完全消除溶解的红细胞(RBC)的片段。因为RBC的片段和nRBC的核可能在尺寸和光散射特征方面是类似的，所以基于大小和/或光散射的分析有时具有误导性。同时，基于荧光发射的分析可能受以下各项的不利影响：(1)样本“溶解不足”以致细胞膜不透性染料不能到达nRBC的核；(2)样本“溶解过度”以致WBC的核被染色并干扰nRBC计数；(3)存在易碎淋巴细胞以致WBC出乎意料地对溶解试剂过度敏感(从而得到假阳性)；和/或(4)存在溶解抗性nRBC以致nRBC出乎意料地对溶解试剂不敏感(从而得到假阴性)。实际上，溶解过度或溶解不足通常是归结于血液样本之间的血细胞膜刚性的变化。因此，对已知光散射和/或荧光发射检测技术的依赖性可能导致对nRBC的分析不准确和不可靠，由此妨碍对病危患者的正确诊断和治疗。
发明内容
本文提供用于分析血液样本、更具体来说进行nRBC分析的系统和方法。所述系统和方法借助于用细胞膜可透性荧光染料进行荧光染色来筛查血液样本。接着使用荧光触发策略来鉴定、区分和分离血液样本内的含核粒子(例如nRBC和WBC)与非含核粒子(例如RBC和/或RBC片段)。因此，来自未溶解RBC和溶解RBC的片段的干扰可在随后分析之前被大致上消除。举例而言，在一个实施方案中，所述系统和方法包括：(a)用专有细胞膜可透性荧光染料染色血液样本；(b)使用荧光触发器筛查所述血液样本的含核粒子；并且接着(c)使用光散射和荧光发射的测量结果来区分nRBC与WBC。所述系统和方法使得能够开发适于测定含有易碎WBC的样本的相对温和试剂。
附图说明
并入本文的附图构成说明书的一部分。附图连同本书面描述一起进一步用于说明提供的系统和方法的原理，并且使得相关领域技术人员能够制造和使用提供的系统和方法。在附图中，相同参考数字指示相同或功能上类似的元件。
图1A至图1D显示全血样本的频率曲线(histogram)，其显示在溶解之后的WBC、nRBC以及RBC残余物。
图1A是显示轴向光损失(ALL)的测量结果的频率曲线。
图1B是显示中等角度散射(IAS)的测量结果的频率曲线。
图1C是显示90°偏振侧向散射(PSS)的测量结果的频率曲线。
图1D是显示荧光(FL1)的测量结果的频率曲线。
图2是示出血液学仪器的示意图。
图3A至图3F是示出对NRBC%为75%的含nRBC血液样本的分析的细胞图。
图3A是描绘轴向光损失对中等角度散射的细胞图。
图3B是描绘90°偏振侧向散射对轴向光损失的细胞图。
图3C是描绘90°偏振侧向散射对中等角度散射的细胞图。
图3D是描绘FL1对轴向光损失的细胞图。
图3E是描绘FL1对中等角度散射的细胞图。
图3F是描绘FL1对90°偏振侧向散射的细胞图。
图4A至图4F是示出对NRBC%为1.0%的含nRBC血液样本的分析的细胞图。
图4A是描绘轴向光损失对中等角度散射的细胞图。
图4B是描绘90°偏振侧向散射对轴向光损失的细胞图。
图4C是描绘90°偏振侧向散射对中等角度散射的细胞图。
图4D是描绘FL1对轴向光损失的细胞图。
图4E是描绘FL1对中等角度散射的细胞图。
图4F是描绘FL1对90°偏振侧向散射的细胞图。
图5是示出如通过手动门控测定的NRBC%与参考结果的相互关系的图，其中参考结果是通过显微镜复查获得。
图6是示出如通过手动门控测定的NRBC%与参考结果的相互关系的图，其中参考结果是通过“CELL-DYN”SapphireTM血液学分析仪获得。
图7是示出如通过自动聚类测定的NRBC%与参考结果的相互关系的图，其中参考结果是通过显微镜复查获得。
图8是示出如通过自动聚类测定的NRBC%与参考结果的相互关系的图，其中参考结果是通过“CELL-DYN”SapphireTM血液学分析仪获得。
具体实施方式
本文提供用于分析血液样本、更具体来说用于进行nRBC分析以鉴定、分类和计数血液样本中的nRBC的系统和方法。一般说来，所公开的系统和方法借助于荧光染色和荧光触发策略来筛查含核事件与非含核事件的对比。因此，来自如溶解抗性红细胞(rstRBC)的未溶解红细胞(RBC)和RBC片段的干扰在随后分析之前被大致上消除。换句话说，本文所述的系统和方法利用至少一种荧光染料和荧光触发系统来筛查含核事件，由此精确而可靠地鉴定和定量WBC和nRBC。接着，使用组合光散射信息与荧光信息来进一步使nRBC与WBC分离。所公开的系统和方法由此确保对nRBC、WBC和WBC子群体的精确计数和区别。所述系统和方法也使得能够开发适于测定含有易碎淋巴细胞(或其它易碎WBC)的样本(包括老化样本)的相对温和WBC试剂。
在一个实施方案中，举例而言，本文公开的系统和方法包括：(a)用专有细胞膜可透性荧光染料染色血液样本；(b)使用荧光触发器筛查所述血液样本的含核粒子；以及(c)使用光散射和荧光发射的测量结果来区分nRBC与WBC。本发明的系统和方法显示超过传统方法的巨大优势，因为来自RBC的片段的干扰被大致上消除，并且测定结果对溶解强度的敏感性变得小得多。换句话说，传统nRBC分析技术对溶解强度高度敏感。如果溶解剂（lysingagent，或裂解剂）的强度太弱，那么在对WBC的分析中也会收集RBC的片段或未溶解RBC。这些RBC片段或未溶解RBC在许多方面与nRBC重叠，从而在分析nRBC时产生困难。另一方面，如果溶解剂的强度太强(为了更好处理RBC的片段)，那么某一百分比的淋巴细胞可遭损伤并且可被认定为nRBC。因此，溶解剂的强度是WBC分析中的一个问题。本文所述的方法的一个关键特征是在WBC和nRBC分析中降低了来自RBC片段或未溶解RBC的干扰。因此，可更好地耐受溶解剂的强度变化。即使溶解剂弱于常用溶解剂强度，未溶解RBC也不会干扰对nRBC的测定。
在本文所述的系统和方法中，可在单一测定中同时获得对nRBC和WBC的定量和鉴定。或者，在本文所述的系统和方法中，可在不分析WBC下对nRBC进行定量和鉴定。
(1)荧光染料的使用。
WBC和nRBC在其核中含有相对较高浓度的DNA。然而，成熟RBC不含有DNA。因此，选择荧光染料来区别两类血细胞；即，含有核酸的血细胞和不含有核酸的血细胞。染料的目的在于易于穿透到活细胞中，以高亲和力结合DNA，并且在染料由适当光源激发时以足够斯托克斯位移(Stokes shift)发射强的荧光。染料在可见波段中的峰吸收大致上匹配光源波长(在50nm光源波长内、更优选在25nm光源波长内)以适当激发染料并获得最佳结果。
所选荧光染料优选：1)能够结合核酸，2)能够穿透WBC和nRBC的细胞膜，3)当经受光源时可在所选波长下激发，4)在由光源激发后发射荧光，并且5)在液体中具有生物稳定性和可溶性。染料可选自由以下组成的组：吖啶橙(acridine orange)、SYBR11、SYBR绿系列染料、碘化己锭(hexidium iodide)、SYTO11、SYTO12、SYTO13、SYTO14、SYTO16、SYTO21、RNA选择性SYTO、SYTO24、SYTO25及其任何等效物。染料用于“活化”WBC和nRBC，并且基于血液学分析仪中配置的荧光触发器来“筛出”未溶解RBC和RBC的片段。染料通常以约0.1ng/mL至约0.1mg/mL的浓度存在。尽管各种染料可用，但所选染料通常与血液学分析仪的激发源配对以便使用单一专有染料在意图受鉴定、定量和/或分析的nRBC和所有WBC子群体中进行染色并激发荧光发射。因此，单一(即专有)染料可用于同时鉴定、定量和分析nRBC以及所有WBC子群体。
在一个实施方案中，以试剂形式、以足以进行染色并且活化每微升多达1,000×103个细胞的量、与以下各物组合来提供荧光染料：1)至少一种表面活性剂，2)至少一种缓冲剂，3)至少一种盐，以及/或4)至少抗微生物剂。如“TRITON”X-100或皂素(saponin)的至少一种表面活性剂用于破坏RBC的膜，并且减小RBC的片段的大小。至少一种表面活性剂通常以约0.001%至约5%的浓度存在。如来自“TRIADINE”或“PROCLIN”家族的抗微生物剂的至少一种抗微生物剂用于防止试剂受微生物污染。至少一种抗微生物剂的浓度应足以持续所需保存期限来保存试剂。如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)的至少一种缓冲剂用于调整反应混合物的pH以控制RBC的溶解和保存WBC。至少一种缓冲剂通常以约0.01%至约3%的浓度存在。pH通常在约3至约12的范围内。如NaCl或Na2SO4的至少一种盐用于调整重量摩尔渗透浓度（osmolality，重量克分子渗透浓度）以增加溶解（lysing，裂解）效应和/或使WBC保存最优化。至少一种盐可以约0.01%至约3%的浓度存在。在某些情况下，至少一种缓冲剂可充当至少一种盐，或至少一种盐可充当至少一种缓冲剂。一般说来，较低重量摩尔渗透浓度或低张性用于加速RBC溶解。重量摩尔渗透浓度通常在约20mOsm至约250mOsm的范围内。
可在以约1体积份样本对约35体积份试剂的比率混合血液样本与试剂之后，使RBC在高于室温的温度(例如在约30℃至约50℃之间，如约40℃)下历经相对较短的时期(例如小于约25秒、小于约17秒、或甚至小于约9秒)发生溶解。用多个光学通道和至少一个荧光通道收集分析数据。
图1A至图1D显示全血样本的频率曲线（histogram，直方图），其显示在溶解之后基于光学和荧光测量结果分离WBC、nRBC和RBC残余物。更具体来说，图1A是显示基于轴向光损失(ALL)的测量结果的粒子分离的频率曲线。图1B是显示基于中等角度散射(IAS)的测量结果的粒子分离的频率曲线。图1C是显示基于90°偏振侧向散射(PSS)的测量结果的粒子分离的频率曲线。图1D是显示基于荧光(FL1)的测量结果的粒子分离的频率曲线。在频率曲线中，水平轴指示检测通道的值(或通道名称，即ALL、IAS、PSS或FL1)。垂直轴指示血液样本的组分的计数。在频率曲线中，线100指示RBC残余物，线200指示WBC，并且线300指示nRBC。如通过比较图1D与图1A至图1C所示，荧光信息而非光学测量结果显示含核粒子(例如WBC和nRBC)与非含核粒子(RBC残余物)之间的分离好得多。如本文所用，“RBC残余物”与“RBC的片段”同义。
(2)荧光触发器的使用。
在由光源激发荧光染料后，血细胞发射不同量级的荧光信号。荧光信号的量级差异由细胞内部的核酸(即DNA)的量产生。DNA的量越大，荧光信号较高的可能性越大。此外，穿透细胞膜的功效、染料尺寸、染料与DNA之间的结合动力学、染料与DNA之间的亲和力及其它因素也会影响荧光信号。成熟RBC发射最小荧光信号，因为在成熟RBC内不存在DNA。nRBC发射非常强的荧光信号，不仅因为nRBC的核内部存在DNA，而且因为nRBC的膜在溶解程序期间被破坏所以染色也更容易。未溶解RBC或RBC片段不发射荧光，但其可发射极弱自体荧光。如参照图1D所示，发射强得多的荧光信号的细胞是具有核的细胞，即所有WBC和nRBC(当存在时)。
因此，本文提供的系统和方法使用荧光触发器来收集和分析WBC和nRBC。举例而言，通常在来自RBC的信号与来自WBC和nRBC的信号之间设置的荧光触发器可用于收集来自WBC和nRBC的信号供随后分析用。
(3)用于分析的多个光学通道和至少一个荧光通道的使用。
如本文所用，表述“荧光信息”意指从血液学分析仪的荧光通道收集的数据。如本文所用，表述“荧光通道”意指设置在用于测量自样本发射的荧光的量的合适的波段下的检测装置，如光电倍增管。
在一个实施方案中，借助于多角度偏振散射分离技术(MAPSS)进行血液样本分析，其中荧光信息得以增强。至少一个光电二极管或至少一个光电倍增管或至少一个光电二极管与至少一个光电倍增管两者是检测由穿过流动池的各血细胞散射的光所需的。两个或更多个光电二极管用于测量度量约0°散射的ALL信号和度量低角度(例如约3°至约15°)散射的IAS信号。两个或更多个光电倍增管用于检测90°偏振侧向散射(PSS)信号和90°去偏振侧向散射(DSS)信号。对适当波长范围内的FL1测量来说，取决于对光源波长的选择而需要其它光电倍增管。因此，在系统上捕获的每一事件展现多方面的信息，如ALL、IAS(一个或多个通道)、PSS、DSS和荧光(一个或多个通道)。来自这些检测通道的信息用于进一步分析血细胞。
图2是示出适于血液学分析(包括流式细胞术)的装置的发光和检测光学器件的示意图。现参照图2，装置10包括光源12、用于光束弯曲的前镜14和后镜16、含有第一圆柱形透镜20和第二圆柱形透镜22的光束扩展器模块18、聚焦透镜24、精细光束调整器26、流动池28、前向散射透镜30、靶心检测器32、第一光电倍增管34、第二光电倍增管36和第三光电倍增管38。靶心检测器32具有用于0°光散射的内部检测器32a和用于7°光散射的外部检测器32b。
在随后论述中，光源优选是激光器。然而，也可使用其它光源，例如像灯(例如汞灯、氙灯)。光源12可为可商购自Coherent,Inc.,Santa Clara,CA的垂直偏振气冷CoherentCube激光器。可使用波长在350nm至700nm的范围内的激光器。激光器的操作条件大致上与当前与“CELL-DYN”自动血液学分析仪一起使用的激光器的操作条件类似。
关于流动池、透镜、聚焦透镜、精细光束调整机构和激光聚焦透镜的其它细节可见于以引用的方式并入本文的美国专利号5,631,165中，尤其在第41栏第32行至第43栏第11行。图2中所示的前向光路系统包括球面平凸透镜30和位于透镜的后聚焦平面中的两元件光电二级管检测器32。在这个构造中，两元件光电二极管检测器32内的每个点映射来自穿过流动池28移动的细胞的光的一个特定收集角。检测器32可为能够检测轴向光损失(ALL)和中等角度前向散射(IAS)的靶心检测器。美国专利号5,631,165在第43栏第12-52行描述这个检测器的各种替代物。
第一光电倍增管34(PMT1)测量去偏振侧向散射(DSS)。第二光电倍增管36(PMT2)测量偏振侧向散射(PSS)，并且视所选荧光染料和所用光源而定，第三光电倍增管38(PMT3)测量自440nm至680nm的荧光发射。光电倍增管在广泛波长范围内收集荧光信号以增加信号强度。侧向散射和荧光发射由二向色光束分离器40和42导向这些光电倍增管，所述二向色光束分离器在所需波长下高效传输和反射以使得能够进行高效检测。美国专利号5,631,165在第43栏第53行至第44栏第4行描述关于光电倍增管的各种其它细节。
当通过使用浸渍收集系统测量荧光时，在光电倍增管34、36和38处的灵敏性得以增强。浸渍收集系统是借助于折射率匹配层使第一透镜30光学连接于流动池28，从而使得能够在宽泛角度上收集光的收集系统。美国专利号5,631,165在第44栏第5-31行描述这个光学系统的各种其它细节。
集光器44是一种用于高分辨率显微术中的具有足够用于受衍射限制的成像的像差校正的光学透镜系统。美国专利号5,631,165在第44栏第32-60行描述这个光学系统的各种其它细节。
图2中所示的其它部件(即狭缝46、场透镜48和第二狭缝50)的功能描述于美国专利号5,631,165第44栏第63行至第45栏第26行中。插入光电倍增管的光路中以改变所检测光的波长或偏振化或波长与偏振化两者的光学滤光片52或56和偏光器52或56也描述于美国专利号5,631,165第44栏第63行至第45栏第26行中。适用于本文中的光学滤光片包括带通滤光片和长通滤光片。
光电倍增管34、36和38检测侧向散射(在轴近似垂直于入射激光光束的锥体中散射的光)或荧光(在与入射激光光束的波长不同的波长下自细胞发射的光)。
尽管以上参考美国专利号5,631,165的所选部分，但美国专利号5,631,165以引用的方式整体并入本文。
收集的光学和荧光信息可接着用于区分(或区别)nRBC与WBC(和WBC子群体)。举例而言，二维细胞图(例如显示PSS对ALL；ALL对IAS；和/或FL1对ALL/IAS/PSS的细胞图)可用于鉴定和区分粒子。
图3A至图3F是示出对NRBC%为75%的含nRBC血液样本的分析的细胞图。更具体来说，图3A是描绘轴向光损失对中等角度散射的细胞图。图3B是描绘90°偏振侧向散射对轴向光损失的细胞图。图3C是描绘90°偏振侧向散射对中等角度散射的细胞图。图3D是描绘FL1对轴向光损失的细胞图。图3E是描绘FL1对中等角度散射的细胞图。图3F是描绘FL1对90°偏振侧向散射的细胞图。从细胞图获得的NRBC%值是80.7(如使用PSS对ALL，通过手动门控所测定)和76.3(如通过用MATLAB软件进行的自动聚类分析所测定)。
图4A至图4F是示出对NRBC%为1.0%的含nRBC的血液样本的分析的细胞图。更具体来说，图4A是描绘轴向光损失对中等角度散射的细胞图。图4B是描绘90°偏振侧向散射对轴向光损失的细胞图。图4C是描绘90°偏振侧向散射对中等角度散射的细胞图。图4D是描绘FL1对轴向光损失的细胞图。图4E是描绘FL1对中等角度散射的细胞图。图4F是描绘FL1对90°偏振侧向散射的细胞图。从细胞图获得的NRBC%值是1.2(如使用PSS对ALL，通过手动门控所测定)和1.2(如通过用MATLAB软件进行的自动聚类分析所测定)。
在使用总计136个含有nRBC的样本的研究中，手动显微镜复查与“CELL-DYN”SapphireTM血液学分析仪结果两者均用作用于定量nRBC的参照。试剂中包括浓度为3μg/mL的吖啶橙。血液样本与试剂以1体积份样本对35体积份试剂的比率混合。在40℃的温度下持续25秒时期孵育混合物。应用9秒的样本测量持续时间，其中FL1用作唯一触发器。收集各样本的ALL、IAS、PSS和FL1测量结果。使用手动门控(PSS对ALL、或PSS对IAS)与利用MATLAB软件进行的自动聚类分析两者分析数据。由本发明方法获得的结果与参考结果之间的nRBC%关联如图5-8中所示加以报道。
举例而言，图5比较结果(通过手动门控获得)与参考结果，其中参考结果是通过显微镜复查获得。如所示，本发明的系统和方法根据斜率和R2公式产生结果：Y=1.0404X；(R2=0.968)。
图6比较结果(通过手动门控获得)与参考结果，其中参考结果是通过“CELL-DYN”SapphireTM血液学分析仪获得。如所示，本发明的系统和方法根据斜率和R2公式产生结果：Y=1.1004X；(R2=0.956)。
图7比较结果(通过自动聚类获得)与参考结果，其中参考结果是通过显微镜复查获得。如所示，本发明的系统和方法根据斜率和R2公式产生结果：Y=1.0215X；(R2=0.963)。
图8比较结果(通过自动聚类获得)与参考结果，其中参考结果是通过“CELL-DYN”SapphireTM血液学分析仪获得。如所示，本发明的系统和方法根据斜率和R2公式产生结果：Y=1.0800X(R2=0.950)。
也基于聚类的平均位置和分布差异系数计算nRBC与淋巴细胞之间的巴特查里亚距离(Bhattacharyya distance，BD)。如果BD超过3，那么聚类分离被视为“良好”，并且如果BD大于2且小于或等于3，那么聚类分离被视为“可接受”。对于136个样本，测试的平均BD值是4.64±1.89，在2.10至11.95的范围内。观察到在超过85%(116/136)的含有nRBC的样本中，nRBC与淋巴细胞之间良好分离(其中BD超过3)。
与测量nRBC的传统方法难以使“溶解过度”与“溶解不足”平衡不同，本文所述的方法保存WBC且提供nRBC与淋巴细胞(最接近nRBC的WBC子群体)之间的最佳分离。此外，来自RBC的片段的干扰被大致上消除。
其它实施方案
在另一实施方案中，提供一种用于对已用荧光染料染色的血液样本进行有核红细胞(nRBC)分析的血液学分析仪，其中所述荧光染料是细胞膜可透性和核酸结合性的。所述分析仪包括被定位来激发血液样本内的粒子的激发源。所述分析仪也包括多个检测器，包括：(1)轴向光损失检测器，其被定位来测量所激发血液样本的轴向光损失；(2)中等角度散射检测器，其被定位来测量所激发血液样本的中等角度散射；(3)侧向散射检测器，其被定位来测量所激发血液样本的90°侧向散射；以及(4)荧光检测器，其被定位来测量自所激发血液样本发射的荧光。所述分析仪也包括处理器，其被配置来：(a)接收来自多个检测器的(1)轴向光损失、(2)中等角度散射、(3)90°侧向散射和(4)荧光的测量结果，并且(b)基于发射高于荧光阈值的荧光的粒子的所有四种测量结果对血液样本进行nRBC差异分析。侧向散射检测器可为偏振侧向散射检测器，其被定位来测量所激发血液样本的90°偏振侧向散射。所述血液学分析仪可进一步包括去偏振侧向散射检测器，其被定位来测量所激发血液样本的90°去偏振侧向散射。处理器可进一步被配置来预筛查接收的测量结果以排除对不满足荧光阈值的任何粒子的考虑。轴向光损失检测器可测量在0°散射下的轴向光损失。中等角度散射检测器可测量在约3°至约15°下的光角度散射。多个检测器可包括一个或多个光电倍增管。激发源可为被配置来在对应于荧光染料的波长下发射光的激光器。可选择荧光染料以与激发源对应。
血液学分析仪可进一步包括用于以试剂稀释血液样本的孵育子系统。试剂可包括荧光染料和溶解剂。试剂可替代地包含(a)至少一种表面活性剂，(b)至少一种缓冲剂或至少一种盐，(c)至少一种抗微生物剂，以及(d)荧光染料。孵育子系统可被配置来持续小于约25秒、小于约17秒和/或小于约9秒的时期孵育血液样本与试剂。孵育子系统可被配置来在范围从约30℃至约50℃的温度，如约40℃的温度下孵育血液样本与试剂。
在另一实施方案中，提供一种用自动血液学分析仪进行有核红细胞nRBC分析的方法。所述方法包括以下步骤：(a)用试剂稀释全血的样本，其中所述试剂包括红细胞(RBC)溶解剂和细胞膜可透性核酸结合荧光染料；(b)在范围从约30℃至约50℃的温度下持续小于约25秒的孵育期孵育步骤(a)的所稀释血液样本；(c)将来自步骤(b)的所孵育样本递送至血液学分析仪中的流动池；(d)当所述孵育样本横穿过所述流动池时，用激发源激发来自步骤(c)的所述孵育样本；(e)收集来自所述激发样本的多个光散射信号和荧光发射信号；以及(f)基于步骤(e)中收集的所有信号进行nRBC分析，同时基于荧光发射信号排除对所述稀释血液样本内不满足荧光阈值的任何粒子的考虑。
试剂可包括：(a)至少一种表面活性剂，(b)至少一种缓冲剂或至少一种盐，(c)至少一种抗微生物剂，以及(d)至少一种荧光染料。激发源的波长可为约350nm至约700nm。可通过带通滤光片或长通滤光片在约360nm至约750nm的波长下收集荧光发射。多个光散射信号可包括：(1)轴向光损失，(2)中等角度散射，以及(3)90°侧向散射。多个光散射信号可包括：(1)轴向光损失，(2)中等角度散射，(3)90°偏振侧向散射，以及(4)90°去偏振侧向散射。
在另一实施方案中，提供用于借助于自动血液学分析仪来计数nRBC的系统和方法。所述系统和方法包括用于以下的装置和步骤：(a)用至少一种白细胞试剂稀释包含有核红细胞的全血样本；(b)在所选温度范围内持续足够时期孵育步骤(a)的所稀释样本以溶解红细胞，使有核红细胞的核暴露于所述至少一种白细胞试剂，并且使至少一种荧光染料染色有核红细胞的核并保存白细胞；(c)以液流形式将步骤(b)的所孵育样本递送至流动池；(d)当所孵育样本横穿过所述流动池时用光源激发所孵育样本；(e)同时收集多个光学散射信号与至少一个荧光发射信号；以及(f)借助于步骤(e)中收集的光学信息和荧光信息区别和定量有核红细胞。所述系统和方法进一步包括：(1)在溶解RBC的程序期间使用至少一种荧光染料结合且染色给定血液样本中的WBC中的核酸和nRBC的核，并且在由来自如激光光束的给定光源的光子在适当波长下激发后诱导荧光发射；(2)使用荧光触发器分离和收集发射强的荧光的事件(即WBC和nRBC)；以及(3)使用多个光学通道和至少一个荧光通道收集和分析数据来鉴定nRBC并且使nRBC与WBC分离。本文所述的系统和方法允许同时分析WBC与nRBC。不需要其它试剂、样本制备或分析程序。因此，所述方法高效、划算且切实可行地用于现代诊断用途。
在一个实施方案中，本发明涉及一种或多种能够执行本文所述的功能性的计算机系统。举例而言，本文论述的任何方法/分析步骤都可在具有一个或多个处理器、数据通信基础结构(例如通信总线、交叉条或网络)、显示器接口和/或存储体或存储单元的计算机系统中实施。存储体或存储单元可包括具有在执行时使处理器执行本文所述的一个或多个功能的指令(例如控制逻辑或软件)的计算机可读存储介质。术语“计算机可读存储介质”、“计算机程序介质”和“计算机可用介质”用于泛指介质，如可移动存储驱动器、可移动存储单元、通过通信接口传输的数据和/或安装在硬盘驱动器中的硬盘。所述计算机程序产品向计算机系统提供计算机软件、指令和/或数据，所述计算机程序产品也用于将所述计算机系统从通用计算机转变成被编程来执行本文所述的特定功能的专用计算机。当适当时，处理器、相关部件和等效系统以及子系统因此充当用于执行所选操作和功能的“装置”的实例。用于执行所选操作和功能的这类“装置”也用于将通用计算机转变成被编程来执行所述所选操作和功能的专用计算机。
结论
已出于说明和描述目的提出本发明的以上描述。本篇描述不意图是详尽的或将本发明限于所公开的精确形式。鉴于以上教导，其它修改和变化可为可能的。选择和描述这些实施方案是为最佳地说明本发明的原理和它的实际应用，并且由此使得本领域其他技术人员能够最佳地利用如适于所涵盖的特定用途的各种实施方案和各种修改形式中的发明内容。意图将随附权利要求解释为包括本发明的其它替代性实施方案；包括等效结构、部件、方法和装置。
以上详述涉及说明一个或多个示例性实施方案的附图。其它实施方案是可能的。可在不脱离本发明的精神和范围下对所述实施方案进行修改。因此，详述不意图具有限制性。此外，概述和摘要章节可阐述本发明的一个或多个而非所有如由发明者所设想的示例性实施方案，并且因此不意图以任何方式限制本发明和随附的权利要求。
Claims (19)
1.一种用于对包含多个核红细胞nRBC的血液样本进行nRBC分析的血液学分析仪，所述分析仪包括：
激发源，其被定位来激发所述血液样本内的粒子；
多个检测器，包括(1)轴向光损失检测器，其被定位来测量所激发血液样本的轴向光损失；(2)中等角度散射检测器，其被定位来测量所激发血液样本的中等角度散射；(3)侧向散射检测器，其被定位来测量所激发血液样本的90°侧向散射；以及(4)荧光检测器，其被定位来测量从所激发血液样本发射的荧光；以及
处理器和包括指令的计算机可读存储介质，其中所述处理器被配置为执行所述指令以使血液学分析仪进行以下功能：
(a)用试剂稀释血液的样本，所述试剂包括红细胞RBC溶解剂和细胞膜可透性核酸结合荧光染料；
(b)以孵育期孵育步骤(a)所稀释的血液样本；
(c)将来自步骤(b)的孵育样本递送至血液学分析仪中的流动池；
(d)当所述孵育样本横穿过所述流动池时，用激发源激发来自步骤(c)的所述孵育样本；
(e)收集来自所激发的样本的多个光散射信号和荧光发射信号；
(f)在执行nRBC差异分析之前，仅使用荧光触发器来排除非核事件而保留含核事件，所述荧光触发器限定于荧光发射信号并设定为比来自包括RBC片段在内的RBC的荧光发射信号大而比来自白细胞WBC和nRBC的荧光发射信号小的荧光量级：以及
(g)针对在步骤(f)中收集的含核事件进行nRBC差异分析。
2.如权利要求1所述的血液学分析仪，其中所述侧向散射检测器是偏振侧向散射检测器，其被定位来测量所激发血液样本的90°偏振侧向散射。
3.如权利要求2所述的血液学分析仪，其进一步包括：
去偏振侧向散射检测器，其被定位来测量所激发血液样本的90°去偏振侧向散射。
4.如权利要求1所述的血液学分析仪，其中所述轴向光损失检测器测量在0°散射下的轴向光损失。
5.如权利要求1所述的血液学分析仪，其中所述中等角度散射检测器测量在3°至15°下的光角度散射。
6.如权利要求1所述的血液学分析仪，其中所述多个检测器包括一个或多个光电倍增管。
7.如权利要求1所述的血液学分析仪，其中所述激发源是激光器。
8.如权利要求7所述的血液学分析仪，其中所述激光器被配置来在对应于所述荧光染料的波长下发射光。
9.如权利要求1所述的血液学分析仪，其中所述荧光染料被选择来与所述激发源对应。
10.如权利要求1所述的血液学分析仪，其进一步包括：
孵育子系统，其用于以试剂稀释所述血液样本。
11.如权利要求10所述的血液学分析仪，其中所述试剂包括所述荧光染料和溶解剂。
12.如权利要求10所述的血液学分析仪，其中所述试剂包括(a)至少一种表面活性剂，(b)至少一种缓冲剂或至少一种盐，(c)至少一种抗微生物剂，以及(d)所述荧光染料。
13.如权利要求10所述的血液学分析仪，其中所述孵育子系统被配置来在小于25秒的时期以所述试剂孵育所述血液样本。
14.如权利要求10所述的血液学分析仪，其中所述孵育子系统被配置来在小于17秒的时期以所述试剂孵育所述血液样本。
15.如权利要求10所述的血液学分析仪，其中所述孵育子系统被配置来在小于9秒的时期以所述试剂孵育所述血液样本。
16.如权利要求10所述的血液学分析仪，其中所述孵育子系统被配置来在范围从30℃至50℃的温度下以所述试剂孵育所述血液样本。
17.如权利要求10所述的血液学分析仪，其中所述孵育子系统被配置来在40℃的温度下以所述试剂孵育所述血液样本。
18.如权利要求1所述的血液学分析仪，其中所述激发源的波长是350nm至700nm。
19.如权利要求1所述的血液学分析仪，其中通过带通滤光片或长通滤光片在360nm至750nm的波长下收集荧光发射。
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| WO2014143332A1 (en) * | 2013-03-12 | 2014-09-18 | Abbott Laboratories | Reagents, systems and methods for analyzing white blood cells |
| WO2014186228A1 (en) | 2013-05-13 | 2014-11-20 | Chiranjit Deka | Apparatus and methods for cellular analysis |
| WO2016106688A1 (zh) * | 2014-12-31 | 2016-07-07 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种有核红细胞报警方法、装置及流式细胞分析仪 |
| US10215683B2 (en) | 2015-11-02 | 2019-02-26 | Chiranjit Deka | Light scatter based apparatus and methods for hematology analysis using only three detectors |
| CN108072637B (zh) * | 2016-11-15 | 2023-05-26 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 一种流式量子点血液多种成份分析系统及分析方法 |
| AU2018211462B2 (en) | 2017-01-26 | 2023-02-09 | Eternit Nv | Fiber cement decking products and methods for the production thereof |
| WO2018148946A1 (zh) * | 2017-02-17 | 2018-08-23 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 红细胞碎片识别方法和装置、血液细胞分析仪及分析方法 |
| US10720755B2 (en) * | 2018-02-07 | 2020-07-21 | Elfi-Tech Ltd. | Ensemble-averaged measurement of stochastic motion by current-modulating of VCSEL wavelength |
| FR3078777B1 (fr) * | 2018-03-07 | 2020-11-13 | Alain Rousseau | Procede d’analyse d’un echantillon biologique contenant des cellules biologiques, et appareil d’analyse pour la mise en œuvre du procede d’analyse |
| EP3789757A4 (en) * | 2018-04-28 | 2021-07-07 | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | BLOOD ANALYZER AND METHOD OF ANALYSIS |
| CN110887818B (zh) * | 2018-09-07 | 2023-05-02 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种血液样本的分析方法和血液细胞分析仪及存储介质 |
| WO2020133256A1 (zh) * | 2018-12-28 | 2020-07-02 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 分析有核红细胞的方法、血液细胞分析仪和存储介质 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5631165A (en) * | 1994-08-01 | 1997-05-20 | Abbott Laboratories | Method for performing automated hematology and cytometry analysis |
| US6197593B1 (en) * | 1998-10-20 | 2001-03-06 | Coulter International Corp. | Method for enumerating blood cells |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4661913A (en) | 1984-09-11 | 1987-04-28 | Becton, Dickinson And Company | Apparatus and method for the detection and classification of articles using flow cytometry techniques |
| US4727020A (en) | 1985-02-25 | 1988-02-23 | Becton, Dickinson And Company | Method for analysis of subpopulations of blood cells |
| US5175109A (en) | 1986-09-10 | 1992-12-29 | Toa Medical Electronics Co., Ltd. | Reagent for classifying leukocytes by flow cytometry |
| US4882284A (en) | 1987-04-13 | 1989-11-21 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Method for quantitating and differentiating white blood cells |
| JPH07113632B2 (ja) | 1991-04-22 | 1995-12-06 | 株式会社日立製作所 | 白血球分析方法 |
| US5627040A (en) | 1991-08-28 | 1997-05-06 | Becton Dickinson And Company | Flow cytometric method for autoclustering cells |
| US5776709A (en) | 1991-08-28 | 1998-07-07 | Becton Dickinson And Company | Method for preparation and analysis of leukocytes in whole blood |
| US5812419A (en) | 1994-08-01 | 1998-09-22 | Abbott Laboratories | Fully automated analysis method with optical system for blood cell analyzer |
| US5656499A (en) | 1994-08-01 | 1997-08-12 | Abbott Laboratories | Method for performing automated hematology and cytometry analysis |
| CA2193971C (en) * | 1994-08-01 | 2000-10-31 | Vernon L. Chupp | Pseudo telecentric optical design for flow cytometric blood cell analyzer |
| US5891734A (en) | 1994-08-01 | 1999-04-06 | Abbott Laboratories | Method for performing automated analysis |
| US5879900A (en) | 1994-12-15 | 1999-03-09 | Abbott Laboratories | Method for simultaneous analysis of cell viability, nucleated red blood cells and white blood cell differentials |
| US5559037A (en) * | 1994-12-15 | 1996-09-24 | Abbott Laboratories | Method for rapid and simultaneous analysis of nucleated red blood cells |
| ATE472725T1 (de) | 1995-12-15 | 2010-07-15 | Abbott Lab | Verfahren für gleichzeitige analyse von zelllebensfähigkeit, nukleierten roten blutkörperchen und leukozytendifferential |
| US6228652B1 (en) * | 1999-02-16 | 2001-05-08 | Coulter International Corp. | Method and apparatus for analyzing cells in a whole blood sample |
| US6900023B1 (en) | 1999-09-02 | 2005-05-31 | Sysmex Corporation | Method for classifying and counting leukocytes |
| US6368864B1 (en) * | 2000-05-05 | 2002-04-09 | Coulter International Corp. | Dyes and methods of reticulocyte enumeration |
| FR2821428B1 (fr) * | 2001-02-23 | 2004-08-06 | Abx Sa | Reactif et procede pour l'identification et le comptage de cellules biologiques |
| CA2463622A1 (en) | 2001-10-17 | 2003-04-24 | University Of Utah Research Foundation | Methods for identifying differentially expressed genes by multivariate analysis of microarray data |
| JP2003310299A (ja) | 2002-04-25 | 2003-11-05 | Sysmex Corp | 乳試料中に含まれる体細胞を測定するための乳試料処理方法及び試薬ならびに方法 |
| US7674598B2 (en) * | 2004-05-21 | 2010-03-09 | Beckman Coulter, Inc. | Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential |
| US7625712B2 (en) * | 2004-05-21 | 2009-12-01 | Beckman Coulter, Inc. | Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential |
| US7299135B2 (en) | 2005-11-10 | 2007-11-20 | Idexx Laboratories, Inc. | Methods for identifying discrete populations (e.g., clusters) of data within a flow cytometer multi-dimensional data set |
| WO2007085266A1 (en) | 2006-01-30 | 2007-08-02 | Dako Denmark A/S | High-speed quantification of antigen specific t-cells in whole blood by flow cytometry |
| JP4796443B2 (ja) * | 2006-06-08 | 2011-10-19 | シスメックス株式会社 | 試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法 |
| JP4914656B2 (ja) * | 2006-06-26 | 2012-04-11 | シスメックス株式会社 | 試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法 |
| US7674622B2 (en) | 2006-12-22 | 2010-03-09 | Abbott Laboratories, Inc. | Method for determination of nucleated red blood cells and leukocytes in a whole blood sample in an automated hematology analyzer |
| RU2435164C2 (ru) | 2007-06-25 | 2011-11-27 | Сисмекс Корпорейшн | Реактив и набор реактивов для анализа незрелых лейкоцитов |
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| CA2759392A1 (en) * | 2009-04-27 | 2010-11-04 | Abbott Laboratories | Method for discriminating red blood cells from white blood cells by using forward scattering from a laser in an automated hematology analyzer |
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US5631165A (en) * | 1994-08-01 | 1997-05-20 | Abbott Laboratories | Method for performing automated hematology and cytometry analysis |
| US6197593B1 (en) * | 1998-10-20 | 2001-03-06 | Coulter International Corp. | Method for enumerating blood cells |
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| US20210123912A1 (en) | Reagents, Systems and Methods for Analyzing White Blood Cells |
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