JP2014520252A - 有核赤血球分析システムおよび方法 - Google Patents

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Abstract

血液試料分析のための、さらに具体的には、有核赤血球（ｎＲＢＣ）分析を実行するためのシステムおよび方法。蛍光染色および蛍光トリガー戦略を使って血液試料を選別し、血液試料内の核含有粒子を同定するシステムおよび方法。従って、不溶解赤血球（ＲＢＣ）および溶解ＲＢＣ断片からの干渉が、実質的に、除かれる。システムおよび方法は、また、脆い白血球（ＷＢＣ）を含む試料のアッセイに適する、比較的穏やかな薬剤の開発を可能とする。一実施形態では、システムおよび方法は、（ａ）血液試料を専用の細胞膜透過性蛍光染料で染色すること；（ｂ）蛍光トリガーを使って、血液試料から核含有粒子を選別すること；および（ｃ）光散乱および蛍光発光の測定値を使って、ｎＲＢＣとＷＢＣを識別すること、を含む。
【選択図】図１Ｄ

Description

関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、２０１１年５月４日出願の「有核赤血球の分析方法（Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｎｕｃｌｅａｔｅｄ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ）」と題する米国特許仮出願第６１／４８２，５４５号の利益を主張する。この特許の全開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、また、２０１２年４月２６日に出願の「白血球分析システムおよび方法（ＷＨＩＴＥ ＢＬＯＯＤ ＣＥＬＬ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ）」と題する出願番号第ｘｘ／ｘｘｘ、ｘｘｘ号（Ａｔｔｙ Ｄｋｔ Ｎｏ：ＡＤＤＶ−０１６（１１０４０ＵＳＯ１））；および２０１２年４月２６日出願の「好塩基球分析システムおよび方法（ＢＡＳＯＰＨＩＬ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ）」と題する出願番号第ｘｘ／ｘｘｘ、ｘｘｘ号（Ａｔｔｙ Ｄｋｔ Ｎｏ：ＡＤＤＶ−０１８（１１０４２ＵＳＯ１））に関連する。これらの特許の全開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、血液学システムおよび方法に関する。さらに具体的には、本発明は、血液試料を分析し、血液試料中の有核赤血球（ｎＲＢＣ）を同定、分類、および／または定量するシステムおよび方法に関する。
有核赤血球は、胎児および新生児の末梢血中に存在することが多い。しかし、ｎＲＢＣは、成人にとっては異常であると見なされる。成人の末梢血流中のｎＲＢＣの存在は、通常、重篤な骨髄ストレス徴候である。研究により、血流中のｎＲＢＣの出現は、重症患者に対する重篤な疾患ステージおよび／または予後不良と強く相関していることが示された。従って、ｎＲＢＣの正確な同定および定量化が、臨床診断とってますます重要になってきている。
ｎＲＢＣが、白血球（ＷＢＣ）と多くの類似性を共有しているために、血液試料中のｎＲＢＣの濃度は、典型的な例では、血液試料中の全ＷＢＣのパーセンテージ（すなわち、％ｎＲＢＣ＝ｎＲＢＣ／ＷＢＣｘ１００％）として報告される。ｎＲＢＣを分析する従来の手法には、（１）寸法によるＷＢＣからｎＲＢＣの分離；（２）光散乱を使って、ＷＢＣとｎＲＢＣの識別；または（３）溶解および細胞膜不透過性蛍光染料で染色後、蛍光発光検出を使ったｎＲＢＣの分析、が含まれる。
上に挙げた技術のそれぞれは、診療で弱点を示した。例えば、迅速な血液測定で、溶解した赤血球（ＲＢＣ）の断片を完全に除去することは困難である。ＲＢＣおよびｎＲＢＣの核の断片は、寸法および光散乱特性が類似である可能性があるために、寸法および／または光散乱に基づく分析は、誤った結果を与える場合がある。一方、蛍光発光に基づく分析は、（１）細胞膜不透過性染料がｎＲＢＣの核まで到達できないような試料の「不十分溶解」；（２）ＷＢＣが染色され、ｎＲＢＣ計算を妨害するような試料の「過剰溶解」；（３）ＷＢＣが溶解試薬に予想外に過敏性になる（擬陽性を与える）ような脆いリンパ球の存在；および／または（４）溶解試薬に対しｎＲＢＣが予想外に非感受性である（偽陰性を与える）ような溶解抵抗性のｎＲＢＣの存在、により悪影響を受ける場合がある。実際には、過剰溶解または不十分な溶解は、血液の試料中の血液細胞の膜の堅さの変動のために、よくあることである。このように、既知の光散乱および／または蛍光発光検出技術への依存は、不正確で、信頼できないｎＲＢＣの分析という結果になる場合があり、それにより、重症患者に対する正確な診断および治療を妨げる可能性がある。
本明細書で提供されるのは、血液試料を分析するシステムおよび方法であり、さらに具体的には、ｎＲＢＣ分析を行う方法である。このシステムおよび方法により、細胞膜透過性蛍光染料で蛍光染色を使って血液試料を選別する。次に、蛍光トリガー戦略を使って、血液試料中の非核含有粒子（例えば、ＲＢＣおよび／またはＲＢＣ断片）から核含有粒子（例えば、ｎＲＢＣおよびＷＢＣ）を同定、識別、および分離する。従って、非溶解ＲＢＣおよび溶解ＲＢＣの断片からの干渉は、それに続く分析の前に実質的に除去できる。例えば、一実施形態では、システムおよび方法は、（ａ）専用の細胞膜透過性蛍光染料で血液試料を染色し；（ｂ）蛍光トリガーを使って、核含有粒子用の血液試料を選別し；さらにその後（ｃ）光散乱および蛍光発光の測定を使って、ＷＢＣとｎＲＢＣを識別することを含む。システムおよび方法により、脆いＷＢＣを含む試料のアッセイに適した相対的に穏やかな試薬の開発が可能となる。
本明細書に組み込まれる添付の図面は、明細書の一部を構成する。本説明と一緒に、図面はさらに、提示されたシステムおよび方法の原理を説明しているので、当業者がこのシステムおよび方法を作成、使用できる。図面中、類似の参照番号は、同じか、または機能的に類似の要素を示している。
溶解後のＷＢＣ、ｎＲＢＣ、およびＲＢＣの残渣を示す全血試料のヒストグラムであり、軸方向光損失（ＡＬＬ）の測定を示す。 溶解後のＷＢＣ、ｎＲＢＣ、およびＲＢＣの残渣を示す全血試料のヒストグラムであり、中間角散乱（ＩＡＳ）の測定を示す。 溶解後のＷＢＣ、ｎＲＢＣ、およびＲＢＣの残渣を示す全血試料のヒストグラムであり、９０°偏光側方散乱（ＰＳＳ）の測定を示す。 溶解後のＷＢＣ、ｎＲＢＣ、およびＲＢＣの残渣を示す全血試料のヒストグラムであり、蛍光（ＦＬ１）の測定を示す。 血液分析器を示す模式図である。 ７５％の％ＮＲＢＣでｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、軸方向光損失対中間角散乱のプロットを示す。 ７５％の％ＮＲＢＣでｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、９０°偏光側方散乱対軸方向光損失のプロットを示す。 ７５％の％ＮＲＢＣでｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、９０°偏光側方散乱対中間角散乱のプロットを示す。 ７５％の％ＮＲＢＣでｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、ＦＬ１ 対軸方向光損失のプロットを示す。 ７５％の％ＮＲＢＣでｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、ＦＬ１対中間角散乱のプロットを示す。 ７５％の％ＮＲＢＣでｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、ＦＬ１対９０°偏光側方散乱のプロットを示す。 １．０％の％ＮＲＢＣとしてｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、軸方向光損失対中間角散乱のプロットを示す。 １．０％の％ＮＲＢＣとしてｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、９０°偏光側方散乱対軸方向光損失のプロットを示す。 １．０％の％ＮＲＢＣとしてｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、９０°偏光側方散乱対中間角散乱のプロットを示す。 １．０％の％ＮＲＢＣとしてｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、ＦＬ１対軸方向光損失のプロットを示す。 １．０％の％ＮＲＢＣとしてｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、ＦＬ１対中間角散乱のプロットを示す。 １．０％の％ＮＲＢＣとしてｎＲＢＣを含有する血液試料の分析を示すサイトグラムであり、ＦＬ１対９０°偏光側方散乱のプロットを示す。 マニュアルゲーティング対参照用測定結果により決定された％ＮＲＢＣの相関のプロットである。この場合、参照用測定結果は、顕微鏡検査により得た。 マニュアルゲーティング対参照用測定結果により決定された％ＮＲＢＣの相関のプロットである。この場合、参照用測定結果は、「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」Ｓａｐｐｈｉｒｅ（登録商標）血液分析器により得た。 自動クラスタリング対参照用測定結果により決定された％ＮＲＢＣの相関のプロットである。この場合、参照用測定結果は、顕微鏡検査により得た。 自動クラスタリング対参照用測定結果により決定された％ＮＲＢＣの相関のプロットである。この場合、参照用測定結果は、「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」Ｓａｐｐｈｉｒｅ（登録商標）血液分析器により得た。
（発明の詳細な説明）
本明細書では、血液試料を分析するシステムおよび方法が提供され、さらに具体的には、ｎＲＢＣ分析を行い、血液試料中のｎＲＢＣを同定、分類、および計数を行うシステムおよび方法が提供される。一般的には、開示システムおよび方法は、選別する蛍光染色および蛍光トリガー戦略を使って、核含有イベント対非核含有イベントの選別をする。従って、不溶解赤血球（ＲＢＣ）、例えば、溶解抵抗性赤血球（ｒｓｔＲＢＣ）、およびＲＢＣ断片からの干渉は、引き続き行われる分析の前に、実質的に除去される。言い換えれば、本明細書記載のシステムおよび方法は、少なくとも１つの蛍光染料および蛍光トリガーシステムを利用して、核含有イベントを選別し、それにより、正確に、信頼性高く、ＷＢＣおよびｎＲＢＣを同定し、定量する。その後、光散乱情報および蛍光情報の組み合わせを使って、ＷＢＣからｎＲＢＣをさらに分離する。開示システムおよび方法は、それにより、ｎＲＢＣ、ＷＢＣ、およびＷＢＣ亜集団の正確な計数および識別を確実にする。システムおよび方法は、また、古くなった試料を含む脆いリンパ球（または他の脆いＷＢＣ）を含む試料のアッセイに適した比較的穏やかなＷＢＣ試薬の開発を可能とする。
一実施形態では、例えば、本明細書の開示システムおよび方法は、（ａ）専用の細胞膜透過性蛍光染料で血液試料を染色すること；（ｂ）蛍光トリガーを使って核含有粒子用血液試料を選別すること；および（ｃ）光散乱および蛍光発光測定を使って、ＷＢＣとｎＲＢＣを識別すること、を含む。本発明のシステムおよび方法は、従来の方法に対し大きな利点を示す。理由は、ＲＢＣ断片からの干渉が実質的に除去され、アッセイ結果が溶解の度合に対しあまり敏感でなくなるためである。換言すれば、従来のｎＲＢＣ分析技術は、溶解の度合に非常に敏感である。溶解薬剤の力が弱すぎると、ＲＢＣの断片または非溶解ＲＢＣも、ＷＢＣの分析の中に集められることになる。これらのＲＢＣ断片または非溶解ＲＢＣは、多くの特性でｎＲＢＣとオーバーラップし、ｎＲＢＣの分析を困難にする。他方、溶解薬剤の力が強すぎると（ＲＢＣ断片をより良く取り扱うために）、ある程度のパーセンテージのリンパ球が、傷害される可能性があり、また、ｎＲＢＣと認識される可能性がある。従って、溶解薬剤の溶解力は、ＷＢＣの分析において１つの課題である。本明細書記載の方法の主要な特徴は、ＷＢＣおよびｎＲＢＣの分析におけるＲＢＣ断片または非溶解ＲＢＣからの干渉の減少である。従って、溶解薬剤の溶解力の変動に対する耐性をより高くできる。溶解薬剤が通常より弱い場合でも、非溶解ＲＢＣは、ｎＲＢＣのアッセイと干渉しない。
本明細書記載のシステムおよび方法では、ｎＲＢＣおよびＷＢＣの定量と同定を、１回のアッセイで同時に得ることができる。あるいは、本明細書記載のシステムおよび方法では、ｎＲＢＣの定量および同定をＷＢＣの分析なしに行うことができる。
（１）蛍光染料の使用
ＷＢＣおよびｎＲＢＣは、それらの核中に比較的高い濃度のＤＮＡを含む。しかし、成熟ＲＢＣは、ＤＮＡを含まない。従って、蛍光染料は、２つのクラスの血液細胞、すなわち、核酸を含む血液細胞と核酸を含まない血液細胞を識別するように選択される。染料の目的は、生細胞中に容易に侵入し、高親和性でＤＮＡと結合し、染料が適切な光源により励起されること、適切なストークスシフトを有する強力な蛍光を発光することである。可視バンド中の染料のピーク吸収は、染料を正確に励起し、最適な結果を得るために、実質的に光源の波長に一致する（光源の波長の５０ｎｍ以内、より好ましくは、光源の波長の２５ｎｍ以内で）。
選択蛍光染料は、好ましくは、１）核酸に結合できる、２）ＷＢＣおよびｎＲＢＣの細胞膜に侵入できる、３）光源にさらした場合、選択波長で励起可能である、４）光源による励起時、蛍光を発光する、および、５）生体安定性で、体液に可溶である。染料は、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＲ１１、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎシリーズ染料、ヨウ化ヘキシジウム、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１４、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ ＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔ、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２５およびこれらのいずれかの等価物、からなる群から選択できる。染料を使って、ＷＢＣおよびｎＲＢＣを「活性化（ａｃｔｉｖａｔｅ）」し、血液分析器中で形成された蛍光トリガーに基づいて、非溶解ＲＢＣおよびＲＢＣの断片を「選別除去する（ｓｃｒｅｅｎ ｏｕｔ）」。染料は、典型的な例では、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。種々の染料が利用可能であるが、選択染料は、通常、血液分析器の励起源と対になり、ただ１つの専用の染料を使って、同定、定量、および／または分析する対象のｎＲＢＣおよび全ＷＢＣ亜集団の染色および蛍光発光の励起を行う。従って、ただ１つの（すなわち、専用の）染料を使って、ｎＲＢＣおよびすべてのＷＢＣ亜集団を一気に同定、定量、および分析できる。
一実施形態では、蛍光染料は、１，０００ｘ１０３細胞／μｌまで染色および活性化を実行できるのに十分な量の、１）少なくとも１つの界面活性剤、２）少なくとも１つの緩衝液、３）少なくとも１つの塩、および／または４）少なくとも１つの抗菌剤と組み合わせた試薬で提供される。少なくとも１つの界面活性剤、例えば、「トリトン」Ｘ−１００またはサポニンを使って、ＲＢＣの膜を破壊し、ＲＢＣの断片の寸法を小さくする。少なくとも１つの界面活性剤は、典型的な例では、約０．００１％〜約５％の濃度で存在する。少なくとも１つの抗菌剤、例えば、「ＴＲＩＡＤＩＮＥ」または「ＰＲＯＣＬＩＮ」ファミリー由来のもの、を使って、試薬の微生物による汚染を防ぐ。少なくとも１つの抗菌剤の濃度は、必要な保存可能期間の間、試薬を保存するのに充分な濃度である。少なくとも１つの緩衝液、例えば、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）または４−（２−ヒドロキシエチル）−ｌ−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を使って、ＲＢＣおよび貯蔵ＷＢＣの溶解を制御するために、反応混合物のｐＨを調節する。少なくとも１つの緩衝液は、典型的な例では、約０．０１％〜約３％の濃度で存在する。ｐＨは、典型的な例では、約３〜約１２の範囲である。少なくとも１つの塩、例えば、ＮａＣｌまたはＮａ２ＳＯ４を使って、浸透圧を調節し、溶解の効果を高める、および／またはＷＢＣ残存を最適化する。少なくとも１つの塩は、約０．０１％〜約３％の濃度で存在してもよい。ある場合では、少なくとも１つの緩衝液は、少なくとも１つの塩としての役割を果たすことができ、または少なくとも１つの塩は、少なくとも１つの緩衝液としての役割を果たすことができる。一般的に、より低い浸透圧、または低張性を使って、ＲＢＣの溶解を加速する。浸透圧は、典型的な例では、約２０〜約２５０ｍＯｓｍの範囲である。
ＲＢＣの溶解は、血液試料および試薬を約３５容量部の試薬に対し、約１容量部の試料の比率で混合後、室温を超える温度（例えば、約３０℃〜約５０℃の間、例えば、約４０℃）で、比較的短い時間で（例えば、約２５秒未満で、約１７秒未満で、または約９秒未満ででも）起こさせることができる。分析用データを複数の光学的チャネルおよび少なくとも１つの蛍光チャネルで集める。
図１Ａ〜１Ｄは、全血試料のヒストグラムであり、光学的および蛍光測定に基づいて溶解後のＷＢＣ、ｎＲＢＣ、およびＲＢＣの残渣の分離を示す。さらに具体的には、図１Ａは、軸方向光損失（ＡＬＬ）の測定に基づく粒子の分離を示すヒストグラムである。図１Ｂは、中間角散乱（ＩＡＳ）の測定に基づく粒子の分離を示すヒストグラムである。図１Ｃは、９０°偏光側方散乱（ＰＳＳ）の測定に基づく粒子の分離を示すヒストグラムである。図１Ｄは、蛍光（ＦＬ１）の測定に基づく粒子の分離を示すヒストグラムである。ヒストグラムで、水平軸は、検出チャネルの値（またはチャネルの名称、すなわち、ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、またはＦＬ１）を示す。垂直軸は、血液試料の成分の数を示す。ヒストグラムで、線１００は、ＲＢＣの残渣を示し、線２００は、ＷＢＣを示し、さらに、線３００は、ｎＲＢＣを示す。図１Ｄを図１Ａ〜１Ｃと比べるとわかるように、蛍光情報が、光学的測定値よりも、核含有粒子（例えば、ＷＢＣおよびｎＲＢＣ）および非核含有粒子（ＲＢＣ残渣）との間でより良好な分離を示す。本明細書で使われる用語の「ＲＢＣの残渣」は、「ＲＢＣの断片」と同義である。
（２）蛍光トリガーの使用
血液細胞は、光源による蛍光染料の励起時に異なる大きさの蛍光シグナルを発光する。蛍光シグナルの大きさの差異は、細胞内の核酸、すなわち、ＤＮＡの量から生じる。ＤＮＡの量が多くなればなるほど、高い蛍光シグナルの可能性が大きくなる。また、細胞膜の浸透、染料の寸法、染料およびＤＮＡの間の結合動力学、染料およびＤＮＡの間の親和性、ならびに他の因子の効力は、蛍光シグナルに影響する。成熟ＲＢＣは、最小の蛍光シグナルを発光する。理由は、成熟ＲＢＣ内にはＤＮＡがないからである。ｎＲＢＣは、非常に強力な蛍光シグナルを放出する。理由は、ｎＲＢＣの核内にＤＮＡがあるからのみでなく、ｎＲＢＣの膜が溶解工程の間に破壊されているために染色がより容易であるからである。非溶解ＲＢＣまたはＲＢＣ断片は、蛍光を発光しないが、非常に弱い自己蛍光を発光できる。図１Ｄを参照して示すように、より強い蛍光シグナルを発する細胞は、核を有する細胞、すなわち、全ＷＢＣおよびｎＲＢＣ（存在する場合は）である。
従って、本明細書で提示のシステムおよび方法は、ＷＢＣおよびｎＲＢＣを集め、分析するための蛍光トリガーを使用する。例えば、ＲＢＣ由来シグナルおよびＷＢＣおよびｎＲＢＣ由来のシグナルの間に、通常、設定される蛍光トリガーを使って、ＷＢＣおよびｎＲＢＣ由来シグナルをその後の分析のために集めることができる。
（３）分析用の複数の光学的チャネルおよび少なくとも１つの蛍光チャネルの使用
本明細書で使われる表現の「蛍光情報」は、血液分析器の蛍光チャネルから集められたデータを意味する。本明細書で使われる表現の「蛍光チャネル」は、試料から発光された蛍光の量の測定のために適切な波長バンド用に設定された検出装置、例えば、光電子増倍管を意味する。
一実施形態では、血液試料分析は、蛍光情報を強化した多角偏光散乱分離技術（ＭＡＰＳＳ）を使って行われる。フローセルを通過する各血液細胞による光散乱を検出するには、少なくとも１つのフォトダイオード、または少なくとも１つの光電子増倍管、または少なくとも１つのフォトダイオードおよび少なくとも１つの光電子増倍管の両方が、必要である。２つ以上のフォトダイオードを使って、約０°散乱を測定するＡＬＬシグナル、および、低角（例えば、約３°〜約１５°）散乱を測定するＩＡＳシグナルを測定する。２つ以上の光電子増倍管を使って、９０°偏光側方散乱（ＰＳＳ）シグナルおよび９０°偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）シグナルを検出する。適切な波長範囲内のＦＬ１測定のためには、光源の波長の選択に応じて、追加の光電子増倍管が必要である。システムで捕捉された各イベントは、このように、複数の特性情報、例えば、ＡＬＬ、ＩＡＳ（１つまたは複数のチャネル）、ＰＳＳ、ＤＳＳ、および蛍光（１つまたは複数のチャネル）を示す。これらの検出チャネル由来の情報を使って、さらなる血液細胞の分析を行う。
図２は、血液分析に適する装置（フローサイトメトリーを含む）の照射および検出光学系を模式図で示す。図２を参照すると、装置１０は、光源１２、ビームを曲げるための前面ミラー１４および背面ミラー１６、第１の円柱状レンズ２０および第２の円柱状レンズ２２を含むビーム拡大器モジュール１８、焦点レンズ２４、ビーム微調整器２６、フローセル２８、前方散乱レンズ３０、ブルズアイ検出器３２、第１の光電子増倍管３４、第２の光電子増倍管３６、および第３の光電子増倍管３８、を備える。ブルズアイ検出器３２は、０°光散乱用内側検出器３２ａおよび７°光散乱用外側検出器３２ｂを有する。
以下の考察では、光源は、好ましくは、レーザーである。しかし、他の光源、例えば、ランプ（例えば、水銀、キセノン）も使用可能である。光源１２は、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡから市販されている垂直偏光空冷Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｕｂｅ ｌａｓｅｒ、であってもよい。３５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長のレーザーを使用できる。レーザー用操作条件は、「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」自動化血液分析器で現在使っているものと実質的に類似している。
フローセル、レンズ、焦点レンズ、ビーム微調整機構およびレーザー焦点レンズに関する追加の詳細は、米国特許第５，６３１，１６５号で見つけることができる。この特許は参照により、特に、カラム４１、行３２からカラム４３、行１１までが、本明細書に組み込まれる。図２の前方光路システムは、球形平凸レンズ３０およびレンズの後焦点面に位置する２素子フォトダイオード検出器３２を含む。この構成では、２素子フォトダイオード検出器３２内の各点は、フローセル２８を通過する細胞由来の特定の光収集角度に位置づけられる。検出器３２は、軸方向光損失（ＡＬＬ）および中間角前方散乱（ＩＡＳ）を検出できるブルズアイ検出器であってもよい。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４３、行１２〜５２に、この検出器の種々の代替装置について記載している。
第１の光電子増倍管３４（ＰＭＴ１）は、偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）を測定する。第２の光電子増倍管３６（ＰＭＴ２）は、偏光側方散乱（ＰＳＳ）を測定し、第３の光電子増倍管３８（ＰＭＴ３）は、選択蛍光染料および採用光源に応じて、４４０ｎｍ〜６８０ｎｍの蛍光発光を測定する。光電子増倍管は、波長の広い範囲で蛍光シグナルを集め、シグナル強度を強くする。側方散乱および蛍光発光は、効率的に必要な波長で伝達および反射し効率的な検出を可能とする二色性ビームスプリッター４０および４２により、これらの光電子増倍管の方に向けられる。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４３、行５３からカラム４４、行４に、光電子増倍管に関して種々の追加の詳細について記載している。
液浸集（ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）システムを使って蛍光を測定する場合、感度は、光電子増倍管３４、３６、および３８で高められる。液浸集システムは、第１のレンズ３０を、屈折率整合層を使ってフローセル２８に光学的に結合させ、広い角度にわたって光の収集を可能とするものである。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４４、行５〜３１で、この光学系の種々の追加の詳細について記載している。
集光レンズ４４は、高解像度顕微鏡で使われる回折限界画像処理に対し充分な収差補正を有する光学的レンズシステムである。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４４、行３２〜６０で、この光学系の種々の追加の詳細について記載している。
図２の他の部品、すなわち、スリット４６、視野レンズ４８、および第２のスリット５０の機能は、米国特許第５，６３１，１６５号のカラム４４、行６３〜カラム４５、行２６に記載されている。光電子増倍管の光路中に挿入され、検出光の波長もしくは偏光または波長と偏光の両方を変える光学フィルター５２または５６および偏光子５２または５６についても、米国特許第５，６３１，１６５号のカラム４４、行６３〜カラム４５、行２６に記載されている。本明細書での使用に適する光学的フィルターには、帯域フィルターおよびロングパスフィルターが含まれる。
光電子増倍管３４、３６、および３８は、側方散乱（軸が入射レーザービームにおよそ直角である円錐体中で散乱された光）または蛍光（入射レーザービームの波長とは違う波長での細胞からの光発光）を検出する。
米国特許第５，６３１，１６５号の選択された部分は、上記で参照しているが、米国特許第５，６３１，１６５号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
次に、集めた光学および蛍光情報を使って、ｎＲＢＣとＷＢＣ（およびＷＢＣ亜集団）を識別（または鑑別）できる。例えば、２次元サイトグラム（例えば、ＰＳＳ対ＡＬＬ；ＡＬＬ対ＩＡＳ；および／またはＦＬ１対ＡＬＬ／ＩＡＳ／ＰＳＳを示すサイトグラム）を使って、粒子を同定、識別できる。
図３Ａ〜３Ｆは、７５％の％ＮＲＢＣでｎＲＢＣを含む血液試料の分析を示すサイトグラムである。さらに具体的には、図３Ａは、軸方向光損失対中間角散乱を示すサイトグラムである。図３Ｂは、９０°偏光側方散乱対軸方向光損失を示すサイトグラムである。図３Ｃは、９０°偏光側方散乱対中間角散乱を示すサイトグラムである。図３Ｄは、ＦＬ１対軸方向光損失を示すサイトグラムである。図３Ｅは、ＦＬ１対中間角散乱を示すサイトグラムである。図３Ｆは、ＦＬ１対９０°偏光側方散乱を示すサイトグラムである。サイトグラムから得た％ＮＲＢＣ値は、８０．７（ＰＳＳｖ．ＡＬＬを使ってマニュアルゲーティングにより決定して）および７６．３（ＭＡＴＬＡＢソフトウェアを使って自動クラスタリング分析を行って決定して）であった。
図４Ａ〜４Ｆは、１．０％の％ＮＲＢＣとしてｎＲＢＣを含む血液試料の分析を示すサイトグラムである。さらに具体的には、図４Ａは、軸方向光損失対中間角散乱を示すサイトグラムである。図４Ｂは、９０°偏光側方散乱対軸方向光損失を示すサイトグラムである。図４Ｃは、９０°偏光側方散乱対中間角散乱を示すサイトグラムである。図４Ｄは、ＦＬ１対軸方向光損失を示すサイトグラムである。図４Ｅは、ＦＬ１対中間角散乱を示すサイトグラムである。図４Ｆは、ＦＬ１対９０°偏光側方散乱を示すサイトグラムである。サイトグラムから得た％ＮＲＢＣ値は、１．２（ＰＳＳｖ．ＡＬＬを使ってマニュアルゲーティングにより決定して）および１．２（ＭＡＴＬＡＢソフトウェアを使って自動クラスタリング分析を行って決定して）であった。
ｎＲＢＣを含む合計１３６試料を使った調査で、マニュアル顕微鏡検査および「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」Ｓａｐｐｈｉｒｅ（登録商標）血液分析器による結果の両方を、ｎＲＢＣの定量化用の参照として使った。３μｇ／ｍＬの濃度のアクリジンオレンジを試薬に含めた。血液試料および試薬を３５容量部の試薬に対し１容量部の試料の比率で混合した。混合物を２５秒間、４０℃の温度でインキュベートした。９秒の試料測定時間を適用し、ＦＬ１を単独トリガーとして使用した。各試料に対し、ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、およびＦＬ１の測定値を集めた。マニュアルゲーティング（ＰＳＳ対ＡＬＬ、またはＰＳＳ対ＩＡＳ）およびＭＡＴＬＡＢソフトウェアを使った自動クラスタリング分析の両方を使ってデータを分析した。本発明の方法による結果、および参照用測定結果の間の％ｎＲＢＣの相関を図５〜８に示す。
例えば、図５は、参照用測定結果に対し、結果（マニュアルゲーティングにより得られた）を比較する。この場合、参照用測定結果は、顕微鏡検査により得た。図からわかるように、本発明のシステムおよび方法は、Ｙ＝１．０４０４Ｘ；（Ｒ２＝０．９６８）の傾斜およびＲ２の式に従う結果をもたらした。
図６は、参照用測定結果に対し、結果（マニュアルゲーティングにより得られた）を比較する。この場合、参照用測定結果は、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」Ｓａｐｐｈｉｒｅ（登録商標）血液分析器により得た。図からわかるように、本発明のシステムおよび方法は、Ｙ＝１．１００４Ｘ；（Ｒ２＝０．９５６）の傾斜およびＲ２の式に従う結果をもたらした。
図７は、参照用測定結果に対し、結果（自動クラスタリングにより得られた）を比較する。この場合、参照用測定結果は、顕微鏡検査により得た。図からわかるように、本発明のシステムおよび方法は、Ｙ＝１．０２１５Ｘ；（Ｒ２＝０．９６３）の傾斜およびＲ２の式に従う結果をもたらした。
図８は、参照用測定結果に対し、結果（自動クラスタリングにより得られた）を比較する。この場合、参照用測定結果は、「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」Ｓａｐｐｈｉｒｅ（登録商標）血液分析器により得た。図からわかるように、本発明のシステムおよび方法は、Ｙ＝１．０８００Ｘ（Ｒ２＝０．９５０）の傾斜およびＲ２の式に従う結果をもたらした。
また、クラスターの平均位置および変動分布係数に基づいて、ｎＲＢＣおよびリンパ球の間のバッタチャリャ距離（ＢＤ）を計算した。ＢＤが３を越える場合は、クラスター分離は、「良好」と見なされ、ＢＤが２より大きく、３以下の場合は、「許容できる」と見なされる。１３６試料に対する試験の平均ＢＤ値は、４．６４±１．８９で、２．１０〜１１．９５の範囲であった。ｎＲＢＣ含有試料の８５％（１１６／１３６）超で、ｎＲＢＣおよびリンパ球の間の良好な分離（ＢＤが３を越える）が観察された。
ｎＲＢＣ測定の従来方法での「過剰溶解」および「不十分溶解」をバランスすることの困難さとは対照的に、本明細書記載の方法は、ＷＢＣを残存させ、ｎＲＢＣおよびリンパ球（ｎＲＢＣに最も近いＷＢＣ亜集団）の間の最良の分離を与える。さらに、ＲＢＣの断片からの干渉は、実質的に除去される。
追加の実施形態
別の実施形態では、蛍光染料で染色された血液試料の有核赤血球（ｎＲＢＣ）分析を行う血液分析器が提供され、蛍光染料は、細胞膜透過性であり、核酸結合性である。分析器は、血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源を含む。分析器は、また、（１）励起血液試料から軸方向光損失を測定するように配置された軸方向光損失検出器、（２）励起血液試料から中間角散乱を測定するように配置された中間角散乱検出器、（３）励起血液試料から９０°側方散乱を測定するように配置された側方散乱検出器、および（４）励起血液試料から発光された蛍光を測定するように配置された蛍光検出器を含む複数の検出器を含む。分析器は、また、（ａ）複数の検出器から（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°側方散乱、および（４）蛍光の測定値を受け、（ｂ）蛍光閾値を超える蛍光を発光する粒子に対し、全ての測定値に基づき血液試料のｎＲＢＣ識別分析を行うように構成されたプロセッサを含む。側方散乱検出器は、励起血液試料からの９０°偏光側方散乱を測定するように配置された偏光側方散乱検出器であってもよい。血液分析器は、励起血液試料からの９０°偏光解消側方散乱を測定するように配置された偏光解消側方散乱検出器をさらに含んでもよい。プロセッサは、受け取った測定値を予備選別し、蛍光閾値に適合しないいずれの粒子も検討対象から除くようにさらに構成されてもよい。軸方向光損失検出器は、０°散乱での軸方向光損失を測定できる。中間角散乱検出器は、約３°〜約１５°で光角度散乱（ｌｉｇｈｔ ａｎｇｌｅ ｓｃａｔｔｅｒ）を測定できる。複数の検出器は、１つまたは複数の光電子増倍管を含むことができる。励起源は、蛍光染料に対応する波長で光を放出するように構成されたレーザーであってもよい。蛍光染料は、励起源に対応するように選択できる。
血液分析器は、血液試料を試薬で希釈するためのインキュベーションサブシステムをさらに含んでもよい。試薬には、蛍光染料および溶解薬剤を含むことができる。試薬は、代わりに、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）蛍光染料を含んでもよい。インキュベーションサブシステムを形成して、約２５秒未満、約１７秒未満、および／または約９秒未満の時間、試薬と共に血液試料をインキュベートしてもよい。インキュベーションサブシステムを構成して、約３０℃〜約５０℃の範囲の温度、例えば、約４０℃の温度で、血液試料を試薬と共に、インキュベートしてもよい。
別の実施形態では、有核赤血球ｎＲＢＣ分析を自動化血液分析器を使って行う方法が提供される。方法は、（ａ）全血試料を、赤血球（ＲＢＣ）溶解薬剤および細胞膜透過性、核酸結合蛍光染料を含む試薬での希釈；（ｂ）ステップ（ａ）の希釈血液試料を、約２５秒未満のインキュベーション時間、約３０℃〜約５０℃の範囲の温度でのインキュベーション；（ｃ）ステップ（ｂ）でインキュベートした試料を、血液分析器のフローセルに送り出すこと；（ｄ）インキュベートした試料がフローセルを通過する間に、ステップ（ｃ）でインキュベートした試料の励起源による励起；（ｅ）励起試料からの複数の光散乱シグナルおよび蛍光発光シグナルの収集；および（ｆ）蛍光発光シグナルに基づいて、蛍光閾値に適合しない希釈血液試料内のいずれの粒子も検討対象から除く間に、ステップ（ｅ）で収集した全シグナルに基づいてｎＲＢＣ分析の実行、のステップを含む。
試薬は、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）少なくとも１つの蛍光染料を含んでもよい。励起源は、約３５０ｎｍ〜約７００ｎｍの波長であってもよい。蛍光発光は、帯域フィルターまたはロングパスフィルターを使って、約３６０ｎｍ〜約７５０ｎｍの波長で収集してもよい。複数の光散乱シグナルは、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、および（３）９０°側方散乱を含んでもよい。複数の光散乱シグナルは、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、および（４）９０°偏光解消側方散乱であってもよい。
また別の実施形態では、自動化血液分析器を使ったｎＲＢＣの計数システムおよび方法が提供される。システムおよび方法は、（ａ）有核赤血球を含む全血液試料を少なくとも１つの白血球試薬で希釈すること；（ｂ）ステップ（ａ）の希釈試料を、選択温度範囲内で赤血球を溶解するのに充分な時間、インキュベートし、有核赤血球の核を少なくとも１つの白血球試薬に露出させ、少なくとも１つの蛍光染料に有核赤血球の核を染色させることを可能とし、白血球を残存させること；（ｃ）インキュベートしたステップ（ｂ）の試料をフローセルに連続的に送り出すこと、；（ｄ）インキュベートした試料がフローセルを通過する間に、インキュベートした試料を光源で励起すること；（ｅ）複数の光学的散乱シグナルおよび少なくとも１つの蛍光発光シグナルを同時に収集すること；および（ｆ）ステップ（ｅ）で集めた光学的情報および蛍光情報を使って、有核赤血球を識別し、定量化すること、のための手段およびこれらのステップを含む。システムおよび方法は、（１）ＲＢＣ溶解処理の間に、所与の血液試料中のＷＢＣ中の核酸およびｎＲＢＣの核に結合し、染色するために、また、所与の光源、例えば、適切な波長のレーザービームからのフォトンにより励起される際に蛍光発光を誘導するために、少なくとも１つの蛍光染料の使用；（２）強力な蛍光放出イベント（すなわち、ＷＢＣおよびｎＲＢＣ）を分離し、収集するために、蛍光トリガーの使用；および（３）ｎＲＢＣを同定し、ｎＲＢＣをＷＢＣから分離するために、データを集め、分析する複数の光学的チャネルおよび少なくとも１つの蛍光チャネルの使用、をさらに含む。本明細書記載のシステムおよび方法は、ＷＢＣおよびｎＲＢＣの同時分析を可能とする。追加の試薬、試料調製、または分析手順は、必要ない。従って、方法は、最近の診断用途として、効率的で、対費用効果が高く、また、実用的である。
一実施形態では、本発明は、本明細書記載の機能を実行できる１つまたは複数のコンピュータシステムに関する。例えば、本明細書で検討した方法／分析ステップのいずれかは、１つまたは複数のプロセッサ、データ通信インフラ（例えば、通信バス、クロスオーバ・バー（互換レイヤー）、またはネットワーク）、ディスプレイインターフェイス、および／またはストレージまたは記憶装置を有するコンピュータシステムで実行されてもよい。ストレージまたは記憶装置は、実行時、プロセッサに１つまたは複数の本明細書記載の機能を実行させる命令（例えば、制御ロジックまたはソフトウェア）を含むコンピュータが読取り可能なストレージ媒体を含んでもよい。用語の「コンピュータが読取り可能なストレージ媒体」、「コンピュータプログラム媒体」、および「コンピュータが使える媒体」は、通常、媒体、例えば、リムーバブルストレージドライブ、リムーバブルストレージ装置、コミュニケーションインターフェイスを介して送信されたデータ、および／またはハードディスクドライブに組み込まれたハードディスクの意味に使われる。このようなコンピュータプログラム製品は、コンピュータソフトウェア、インストラクション、および／またはデータをコンピュータシステムに提供し、これが、さらに、コンピュータシステムを、一般目的コンピュータから本明細書記載の特定の機能を実行するようにプログラムされた特殊目的コンピュータに変換する役割をする。必要に応じ、プロセッサ、関連部品、ならびに等価システムおよびサブシステムは、選択操作および機能を実行する「手段（ｍｅａｎｓ ｆｏｒ）」の例としての機能を果たす。このような選択操作および機能を実行する「手段」もまた、一般目的コンピュータを、前記選択操作および機能を実行するようにプログラムされた特殊目的コンピュータに変換する機能を果たす。
（終わりに）
本発明の前出の説明は、例示および説明のために提示されている。完全に網羅するものではなく、または本発明を開示された正確な形態に限定するものではない。他の修正および種々の変更が上記の教示に照らして、可能であろう。実施形態は、本発明の原理および実際の適用を最良に説明するために、また、それにより他の当業者が種々の実施形態で、および特定の用途に適合するように種々の修正形態で、本発明を最良に利用できるようにするために、選択され、説明された。特許請求の範囲は、等価構造、成分、方法、および手段を含む他の代替の本発明の実施形態を含むように解釈されるべきである。
上記の発明の詳細な説明は、１つまたは複数の代表的実施形態を説明する添付の図面を参照する。
他の実施形態が可能である。本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、記載された実施形態に対し修正を行うことができる。従って、発明の詳細な説明は、制限を意味するものではない。さらに、発明の概要および要約セクションは、発明者に意図された１つまたは複数の本発明の、全てではない、代表的実施形態を説明するものであり、本発明および特許請求の範囲を何ら制限する意図はない。

Claims (24)

  1. 蛍光染料で染色されている血液試料の有核赤血球（ｎＲＢＣ）分析を行うための血液分析器であって、
    蛍光染料が細胞膜透過性および、核酸に結合し、
    血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源；（１）励起血液試料からの軸方向光損失を測定するように配置された軸方向光損失検出器、（２）励起血液試料からの中間角散乱を測定するように配置された中間角散乱検出器、（３）励起血液試料からの９０°側方散乱を測定するように配置された側方散乱検出器、および（４）励起血液試料からの蛍光発光を測定するように配置された蛍光検出器、を含む複数の検出器；ならびに、
    （ａ）複数の検出器からの（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°側方散乱、および（４）蛍光、の複数の測定値を受け取り、および
    （ｂ）蛍光閾値を超える蛍光を発光する粒子に対し、４つ全ての測定値に基づき血液試料のｎＲＢＣ識別分析を行うように構成されたプロセッサ；
    を含む血液分析器。
  2. 側方散乱検出器が、励起血液試料からの９０°偏光側方散乱を測定するように配置された偏光側方散乱検出器である請求項１に記載の血液分析器。
  3. 励起血液試料からの９０°偏光解消側方散乱を測定するように配置された偏光解消側方散乱検出器をさらに含む請求項２に記載の血液分析器。
  4. プロセッサが、蛍光閾値に適合しないいずれの粒子も検討対象から除くために受け取った測定値を予備選別して、さらに構成される請求項１に記載の血液分析器。
  5. 軸方向光損失検出器が、０°散乱での軸方向光損失を測定する請求項１に記載の血液分析器。
  6. 中間角散乱検出器が、約３°〜約１５°で光角度散乱を測定する請求項１に記載の血液分析器。
  7. 複数の検出器が、１つまたは複数の光電子増倍管を含む請求項１に記載の血液分析器。
  8. 励起源が、レーザーである請求項１に記載の血液分析器。
  9. レーザーが、蛍光染料に対応する波長の光を発光するように構成されている請求項８に記載の血液分析器。
  10. 蛍光染料が、励起源に対応するように選択される請求項１に記載の血液分析器。
  11. 血液試料を試薬で希釈するためのインキュベーションサブシステムをさらに含む請求項１に記載の血液分析器。
  12. 試薬が、蛍光染料および溶解薬剤を含む請求項１１に記載の血液分析器。
  13. 試薬が、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）蛍光染料を含む請求項１１に記載の血液分析器。
  14. インキュベーションサブシステムが、血液試料を試薬と共に、約２５秒未満の時間、インキュベートするように構成される請求項１１に記載の血液分析器。
  15. インキュベーションサブシステムが、血液試料を試薬と共に、約１７秒未満の時間、インキュベートするように構成される請求項１１に記載の血液分析器。
  16. インキュベーションサブシステムが、血液試料を試薬と共に、約９秒未満の時間、インキュベートするように構成される請求項１１に記載の血液分析器。
  17. インキュベーションサブシステムが、血液試料を試薬と共に、約３０℃〜約５０℃の温度範囲でインキュベートするように構成される請求項１１に記載の血液分析器。
  18. インキュベーションサブシステムが、血液試料を試薬と共に、約４０℃の温度でインキュベートするように構成される請求項１１に記載の血液分析器。
  19. 自動化血液分析器を使って有核赤血球ｎＲＢＣ分析を行う方法であって、
    （ａ）全血試料を、赤血球（ＲＢＣ）溶解薬剤および細胞膜透過性、核酸結合蛍光染料を含む試薬で希釈すること；
    （ｂ）ステップ（ａ）の希釈血液試料を、約２５秒未満のインキュベーション時間、約３０℃〜約５０℃の温度範囲で、インキュベートすること；
    （ｃ）ステップ（ｂ）でインキュベートした試料を血液分析器中のフローセルに送り出すこと；
    （ｄ）インキュベートした試料がフローセルを通過する間に、ステップ（ｃ）でインキュベートした試料を、励起源で励起すること；
    （ｅ）励起試料からの複数の光散乱シグナルおよび一個の蛍光発光シグナルを収集すること；および
    （ｆ）蛍光発光シグナルに基づいて蛍光閾値に適合しない希釈血液試料内のいずれの粒子も検討対象から除く間に、ステップ（ｅ）で収集した全シグナルに基づいてｎＲＢＣ分析を行うこと、
    を含む分析方法。
  20. 試薬が、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）少なくとも１つの蛍光染料、を含む請求項１９に記載の方法。
  21. 励起源が、約３５０ｎｍ〜約７００ｎｍの波長を有する請求項１９に記載の方法。
  22. 蛍光発光が、帯域フィルターまたはロングパスフィルターを使って、約３６０ｎｍ約７５０ｎｍの波長で収集される請求項１９に記載の方法。
  23. 複数の光散乱シグナルが、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、および（３）９０°側方散乱、を含む請求項１９に記載の方法。
  24. 複数の光散乱シグナルが、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、および（４）９０°偏光解消側方散乱、を含む請求項１９に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021516335A (ja) * 2018-03-07 2021-07-01 ダイアグノスティカ スターゴ 生体細胞を含む生体試料の分析方法及びその分析方法を実施する分析装置

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8986944B2 (en) * 2001-10-11 2015-03-24 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples
US8980568B2 (en) 2001-10-11 2015-03-17 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for detecting non-hematopoietic cells from a blood sample
CN101583722A (zh) 2006-07-14 2009-11-18 阿维瓦生物科学股份有限公司 从生物学样品检测稀有细胞的方法和组合物
WO2012151103A2 (en) * 2011-05-04 2012-11-08 Abbott Laboratories Nucleated red blood cell analysis system and method
CN104024437A (zh) * 2011-12-27 2014-09-03 雅培制药有限公司 体液的细胞分析
EP3869201A1 (en) * 2013-03-12 2021-08-25 Abbott Laboratories Reagents, systems and methods for analyzing white blood cells
EP2997363A4 (en) * 2013-05-13 2016-11-30 Chiranjit Deka APPARATUS AND METHODS FOR CELL ANALYSIS
WO2016106688A1 (zh) * 2014-12-31 2016-07-07 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 一种有核红细胞报警方法、装置及流式细胞分析仪
EP3371591A4 (en) 2015-11-02 2018-11-14 Chiranjit Deka Light scatter based apparatus and methods for hematology analysis using only three detectors
CN108072637B (zh) * 2016-11-15 2023-05-26 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种流式量子点血液多种成份分析系统及分析方法
AU2018211469A1 (en) 2017-01-26 2019-07-11 Eternit Nv Fiber cement flooring products and methods for the production thereof
CN110226083B (zh) 2017-02-17 2022-12-20 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 红细胞碎片识别方法和装置、血液细胞分析仪及分析方法
US10720755B2 (en) * 2018-02-07 2020-07-21 Elfi-Tech Ltd. Ensemble-averaged measurement of stochastic motion by current-modulating of VCSEL wavelength
EP3789757A4 (en) * 2018-04-28 2021-07-07 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. BLOOD ANALYZER AND METHOD OF ANALYSIS
CN110887818B (zh) * 2018-09-07 2023-05-02 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 一种血液样本的分析方法和血液细胞分析仪及存储介质
WO2020133256A1 (zh) * 2018-12-28 2020-07-02 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 分析有核红细胞的方法、血液细胞分析仪和存储介质

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09508703A (ja) * 1994-08-01 1997-09-02 アボツト・ラボラトリーズ フローサイトメトリック血液細胞分析器用の擬似テレセントリック光学設計
JP2938976B2 (ja) * 1994-12-15 1999-08-25 アボツト・ラボラトリーズ 有核赤血球の迅速な同時分析方法
JP2003510557A (ja) * 1999-02-16 2003-03-18 コールター インターナショナル コーポレイション 全血液サンプルにおけるセル分析方法および装置
JP2008003062A (ja) * 2006-06-26 2008-01-10 Sysmex Corp 試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法
JP2008500558A (ja) * 2004-05-21 2008-01-10 ベックマン コールター，インコーポレイティド 完全自動化したモノクローナル抗体による広範な識別法
JP2012525589A (ja) * 2009-04-27 2012-10-22 アボット・ラボラトリーズ 自動血液分析器において、レーザーからの前方散乱を用いることによる、赤血球細胞を白血球細胞から判別する方法
JP2014196958A (ja) * 2013-03-29 2014-10-16 シスメックス株式会社 血球分析装置および血球分析方法

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4661913A (en) 1984-09-11 1987-04-28 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for the detection and classification of articles using flow cytometry techniques
US4727020A (en) 1985-02-25 1988-02-23 Becton, Dickinson And Company Method for analysis of subpopulations of blood cells
US5175109A (en) 1986-09-10 1992-12-29 Toa Medical Electronics Co., Ltd. Reagent for classifying leukocytes by flow cytometry
US4882284A (en) 1987-04-13 1989-11-21 Ortho Pharmaceutical Corporation Method for quantitating and differentiating white blood cells
JPH07113632B2 (ja) 1991-04-22 1995-12-06 株式会社日立製作所 白血球分析方法
US5776709A (en) 1991-08-28 1998-07-07 Becton Dickinson And Company Method for preparation and analysis of leukocytes in whole blood
DE69218912T2 (de) 1991-08-28 1997-10-09 Becton Dickinson Co Schwerkraftsattraktionsmaschine zur anpassungsfähigen autoclusterbildung n-dimensionaler datenströme
US5656499A (en) 1994-08-01 1997-08-12 Abbott Laboratories Method for performing automated hematology and cytometry analysis
US5891734A (en) 1994-08-01 1999-04-06 Abbott Laboratories Method for performing automated analysis
US5631165A (en) * 1994-08-01 1997-05-20 Abbott Laboratories Method for performing automated hematology and cytometry analysis
US5812419A (en) 1994-08-01 1998-09-22 Abbott Laboratories Fully automated analysis method with optical system for blood cell analyzer
US5879900A (en) 1994-12-15 1999-03-09 Abbott Laboratories Method for simultaneous analysis of cell viability, nucleated red blood cells and white blood cell differentials
ES2347110T3 (es) 1995-12-15 2010-10-25 Abbott Laboratories Metodo para el analisis simultaneo de viabilidad celular, diferencial0de globulos blancos.
US6197593B1 (en) * 1998-10-20 2001-03-06 Coulter International Corp. Method for enumerating blood cells
US6900023B1 (en) 1999-09-02 2005-05-31 Sysmex Corporation Method for classifying and counting leukocytes
US6368864B1 (en) * 2000-05-05 2002-04-09 Coulter International Corp. Dyes and methods of reticulocyte enumeration
FR2821428B1 (fr) * 2001-02-23 2004-08-06 Abx Sa Reactif et procede pour l'identification et le comptage de cellules biologiques
EP1442141A4 (en) 2001-10-17 2005-05-18 Univ Utah Res Found METHODS FOR IDENTIFYING DIFFERENTIALLY EXPRESSED GENES BY MULTIVARIZABLE ANALYSIS OF MICROPUCLE DATA
JP2003310299A (ja) 2002-04-25 2003-11-05 Sysmex Corp 乳試料中に含まれる体細胞を測定するための乳試料処理方法及び試薬ならびに方法
US7674598B2 (en) * 2004-05-21 2010-03-09 Beckman Coulter, Inc. Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential
US7299135B2 (en) 2005-11-10 2007-11-20 Idexx Laboratories, Inc. Methods for identifying discrete populations (e.g., clusters) of data within a flow cytometer multi-dimensional data set
US20090061478A1 (en) 2006-01-30 2009-03-05 Lene Have Poulsen High-Speed Quantification of Antigen Specific T-Cells in Whole Blood by Flow Cytometry
JP4796443B2 (ja) * 2006-06-08 2011-10-19 シスメックス株式会社 試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法
US7674622B2 (en) 2006-12-22 2010-03-09 Abbott Laboratories, Inc. Method for determination of nucleated red blood cells and leukocytes in a whole blood sample in an automated hematology analyzer
PL2166353T3 (pl) 2007-06-25 2019-01-31 Sysmex Corporation Odczynnik i zestaw odczynników do analizy prymitywnego leukocytu
CN101349644B (zh) 2007-07-20 2012-06-27 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 一种白细胞分类试剂和其使用方法
US8148101B2 (en) 2008-07-22 2012-04-03 Abbott Laboratories Method for classifying and counting bacteria in body fluids
US8911669B2 (en) 2009-08-24 2014-12-16 Abbott Laboratories Method for flagging a sample
JP5530691B2 (ja) 2009-09-25 2014-06-25 シスメックス株式会社 血球計数装置、診断支援装置、診断支援方法及びコンピュータプログラム
WO2012151103A2 (en) * 2011-05-04 2012-11-08 Abbott Laboratories Nucleated red blood cell analysis system and method

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09508703A (ja) * 1994-08-01 1997-09-02 アボツト・ラボラトリーズ フローサイトメトリック血液細胞分析器用の擬似テレセントリック光学設計
JPH09508705A (ja) * 1994-08-01 1997-09-02 アボツト・ラボラトリーズ 自動分析の方法および装置
JP2938976B2 (ja) * 1994-12-15 1999-08-25 アボツト・ラボラトリーズ 有核赤血球の迅速な同時分析方法
JP2003510557A (ja) * 1999-02-16 2003-03-18 コールター インターナショナル コーポレイション 全血液サンプルにおけるセル分析方法および装置
JP2008500558A (ja) * 2004-05-21 2008-01-10 ベックマン コールター，インコーポレイティド 完全自動化したモノクローナル抗体による広範な識別法
JP2008003062A (ja) * 2006-06-26 2008-01-10 Sysmex Corp 試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法
JP2012525589A (ja) * 2009-04-27 2012-10-22 アボット・ラボラトリーズ 自動血液分析器において、レーザーからの前方散乱を用いることによる、赤血球細胞を白血球細胞から判別する方法
JP2014196958A (ja) * 2013-03-29 2014-10-16 シスメックス株式会社 血球分析装置および血球分析方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021516335A (ja) * 2018-03-07 2021-07-01 ダイアグノスティカ スターゴ 生体細胞を含む生体試料の分析方法及びその分析方法を実施する分析装置
JP7319986B2 (ja) 2018-03-07 2023-08-02 ダイアグノスティカ スターゴ 生体細胞を含む生体試料の分析方法及びその分析方法を実施する分析装置
US11953421B2 (en) 2018-03-07 2024-04-09 Diagnostica Stago Method for analyzing a biological sample containing biological cells, and analysis apparatus for implementing the analysis method

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