JP2003510557A - 全血液サンプルにおけるセル分析方法および装置 - Google Patents
全血液サンプルにおけるセル分析方法および装置Info
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Abstract
Description
区別して列挙する方法および装置の改良に関する。
で、成分の血球および血小板の様々なタイプを区別して列挙し、それらに関する
ある種のパラメータもしくは特徴を判定することは共通することである。種々の
タイプの血球の各濃度および比率は、それがどのような疾患であってこのような
病気が蔓延する程度を色濃く示すものである。一般に、全血液のサンプルは、様
々なセルのタイプを含み、それには、液体媒体もしくは血漿内に漂流している血
球および非血球(例えば腫瘍細胞、バクテリアなど)の両方がある。血球には3
つの基本タイプがある。すなわち、赤血球(erythrocytes)、白血球(leukocyt
es)および血小板である。発育のレベルに依存して、赤血球は、しばしば3つの
サブセットにさらに分類される。すなわち、有核赤血球(NRBC)、網状赤血
球(「レチクス(rectis)」)、および成熟赤血球(RBC)である。一方で、成
熟した白血球は、異なる5つのサブセットのうちの1つに当てはまる。すなわち
、単核細胞(monocyte)、リンパ球(lymphocyte)、好酸球(eosinophil)、好中球(n
eutrophil)および好塩基球(basophil)である。この白血球のサブセットのそれぞ
れは、発育、活性化、異常の各レベルに基づいたサブクラスにさらに分類するこ
とができる。一般に、赤血球の数は、白血球の数より1000対1で勝る。血小
板は、血を固める能力を制御するという観点から特に重要なものであり、成熟し
た血小板、網状の血小板、そして大型の血小板の、大体3つのタイプがある。
ることに加えて、血液サンプルを徹底的に分析することで、例えば、ヘモグロビ
ン(Hgb)濃度、ヘマトクリット値(hematocrit value)(Hct)、平均細胞
量(MCV)、赤血球、白血球および血小板の単位体積あたりの総数、赤血球の
分布幅(RDW)、血小板の分布幅(PDW)など、様々な血液のパラメータお
よび細胞の特性に関する情報が得られるであろう。
ータを判定することと共に、商業的に入手可能な血液分析機器(hematology inst
rument)のいくつかを使って実現することができる。このような機器としては、
Beckman CoulterのGEN・S(登録商標)およびMAXM(登
録商標)血液分析機器、Abbott LaboratoriesのCellD
yne3000/4000血液分析機器、そして、Toaの血液分析機器のSy
smexシリーズ、が含まれる。各細胞タイプに関するデータを自動的に獲得す
るとき、上述の血液分析機器の全ては、少なくとも2つの離散細胞分析トランス
ジューサを使う。これらトランスジューサのうちの1つ(もしくは複数)は、白
血球の5つの異なるタイプを区別し列挙するのに便利なデータを獲得するように
動作し、他のトランスジューサは、正確な分量のサンプル内での赤血球、白血球
および血小板の数およびサイズを測定することに専ら使われる。複数のトランス
ジューサの各出力は、中央処理装置によって処理され、統一的なセル分析レポー
トを得ることができる。Beckman Coulterの機器では、電気光学
フローセル(トランスジューサ)は、各白血球の分量(V)、電気伝導率(C)
および光拡散(S)の特性を示す信号を生成し、これらによって白血球の細胞の
5つのタイプである「5要素区別(five-part differential)」が得られる。さら
なるトランスジューサは、周知のCoulter原理に基づいて動作し、非常に
希釈サンプル内の赤血球および血小板を計数する役割と、溶解サンプルにおける
白血球を計数する役割とを果たす。3つのトランスジューサからの情報は処理さ
れ、ある場合は、関連付けされ(例えば、Coulterトランスジューサによ
って計数された白血球の絶対数を、電気光学フローセルから得られる、各白血球
のサブセットにおける比率をかけることによって)、各セルのタイプもしくはサ
ブセットに関する情報、例えば、分析された血液サンプル全体における各白血球
のサブセットの濃度(単位体積あたりの数)を提供する。Abbott機器では
、5要素区別情報は、光拡散および偏光の情報のみを検出する光学フローセルに
よって得られる。ここで再度確認するが、Coulter原理で動作するさらな
るトランスジューサのペアは、白血球、赤血球および血小板のサイズおよび数を
作成する役割を果たす。2つのトランスジューサのそれぞれの出力は、互いに関
連つけされて種々のセルのタイプおよびサブセットに関する情報をレポートする
。Toaの機器においては、5要素区別情報は、セルのDC量およびRF伝導率
を測定するのみの電気フローセル(Coulterトランスジューサ)のペアに
よって得られる。種々の溶解試薬は、2つのトランスジューサを通過する前に、
血液サンプルの2つ以上のアリコート(aliquots)を別々に処理するのに使われる
。第3のCoulterトランスジューサは、赤血球および血小板を検出して計
数するよう動作する。Beckman CoulterおよびAbbott機器
におけるように、いくつかのトランスジューサの出力のそれぞれは、関係付けさ
れて5要素区別情報を提供する。
およびサブセットを区別し列挙することができるが、全てのセルのサブセット、
特に異常もしくは未熟なセルのサブセットを容易には識別することはできない。
これらの異常もしくは未成熟なセルが検出され計数される「拡張区別」測定は、
まず、顕微鏡のガラススライド上に興味のあるサンプルの血液のスミア(smear)
を手動で生成し、このスミアを染料で着色して細胞を視覚化し、これによって興
味のある異常もしくは未熟を、他のセルから視覚的に区別できるようにし、そし
て、このようにして得られた着色された血液のスミアを顕微鏡で検査する。この
代替例として、拡張区別測定のいくつかの血液のタイプは、従来のフロー血球計
算器(cytometer)を使って検出することができる。このような機器においては、
例えば、(1)興味のあるセルに選択的に「タグをつける」役割を果たす蛍光色
素でラベル付けされた単一クローンの抗体などのようなものをサンプルに混ぜる
か、あるいは、(2)興味のある染料を選択的にマスクする蛍光染料をサンプル
に混ぜるかすることによって予め準備された血液サンプルが光学フローセルを通
過する。サンプル中の各セルはフローセルを通過する間、興味のあるセルに関連
する蛍光物質を励起するフォトンのビームが照射させられる。ラベルが付けられ
たセルのそれぞれによって発せられる蛍光の放出は、各セルにより拡散された放
射と共に検出され、サンプル内の他のセルから興味のあるセルを区別するのに使
われる。商用の、スタンドアロンの、フロー血球計算器は、Beckman C
oulter、Toa Medical Electronics、Cytom
ation、Bio−RadおよびBecton Dickinsonによって
作られる。フロー血球計算器と血液分析機器とを統合して単一の自動実験システ
ムにすることは従来技術として知られているが、このシステムでは、血液サンプ
ルは、順路に沿って自動的に区別機器を通過して進んでいく。サンプルを含むガ
ラス瓶は各機器を通過する間、血液サンプルが各ガラス瓶から吸引されて機器に
よって分析される。離散血液分析およびフロー血球計算器機器を結合する機器シ
ステムは、Beckman CoulterおよびToa Medical E
lectronicsで商業的に入手可能であり、参考として例えばToaのH
STシリーズがある。
計算装置の各機能を完全に統合して単一の装置とする試みがなされている。この
ような装置は、複数のトランスジューサであって、蛍光を発し、かつ、マルチア
ングル光拡散をする光学フローセルを含むトランスジューサと、電気インピーダ
ンス測定トランスジューサ(Coulterトランスジューサ)と、血液サンプ
ルの全ヘモグロビン含有量を測定するカラーメータと、を備える。これらのトラ
ンスジューサの各出力は、処理され関係付けされ、赤、白および蛍光のセルに関
するレポートを得ることができる。
ために、複数のトランスジューサの各出力を関係付けさせる必要があるという点
は、ある状況の下では、分析結果の不確かさを誘発するという問題点を含み得る
。必要不可欠である関連付けステップの妥当性は、1つのトランスジューサによ
って処理されたサンプルは、他のトランスジューサによって処理されたのと含有
量が一致するということを前提としている。いつもこうであるとは限らない。理
想的には、セルに関する測定の全ては、同じトランスジューサによって同時にな
されるべきである。このような場合、独立もしくは離散したトランスジューサか
らのデータを関連付けする必要なない。さらに、単一のトランスジューサを使っ
て単一のセルに関する複数のパラメータを同時に測定することは、離散したトラ
ンスジューサを使ってはできないような、あるいは、パラメータの測定がちょう
どそのときに空間的に離散している場合における単一のトランスジューサでさえ
使ってはできないような、多次元セル分析を可能とするのである。
伝導性(C)、光拡散(S)および蛍光(F)を同時に測定することの望ましさ
は、従来例において既に提案されている。上述のように、このようなトランスジ
ューサは、1つのトランスジューサで1つのセルに関していくつかの測定を行い
、他のトランスジューサを使って同じタイプの別のセルに関して別の測定を行い
、そして、2つのトランスジューサから得られた結果を関連付けする試みを行っ
てセルサンプルについてのある種の結論を引き出すものに比べ、同じセルについ
て同時に全て測定することができるという利点をもたらす。Thomas他によ
る開示であるJournal of Histochemistry and
Cytochemistry、Vol.25、No.7、pp827〜835(
1977)では、セルの自動マルチパラメータ分析器(AMAC)が提案されて
いる。このような分析器は、種々のセル特性、すなわち、上述のV、C、Sおよ
びF特性を同時に測定できる単一のトランスジューサを備える。このThoma
sらの文献では、2つの異なる電気光学フローセル(electro-optical flow cell
)が開示されており、一方のフローセル(AMAC III)は、一辺が100
マイクロメートルである正方形を横断面とするフロー通路を有し、もう一方のフ
ローセル(AMAC IV)は、円形の横断面を有する。AMAC IVフロー
セルは、製造し易さの点で利点を有するが、一方でAMAC IIIフローセル
は、その平面な幾何形状および光収差を低減する固有能力ゆえに好ましく、それ
によって、励起ビームの放射をセルのパスへよりよく焦点を合わせることができ
、また、セルの蛍光を光検出器によりよく結びつけることができる。V、C、S
およびFを同時に測定することは提案されているが、AMACのIIIもしくは
IVのフローセルのどちらについてもこのような測定に使われたかについては明
らかにしていない。このThomasらの文献では、例えば、AMAC III
フローセルを通過するしずく玉に対して処理されるRF測定(「非透過性(opaci
ty)」パラメータを判定するのに使われる)は、不正確な結果をもたらす。これ
らの結果は、フローセルの比較的大きな断面領域(100×100マイクロメー
トル)に関係する信号対ノイズ問題に起因する。さらに、光拡散の測定は、AM
ACフローセルを使っては決して実行されることがないことは明白である。この
ように、各セルに関して同時に測定するための単一のVCSFトランスジューサ
が他にも提案されているにもかかわらず、実践するためのこのような着想を低減
するもの、あるいは、そうするために技術的に可能な技術を提供しているものは
ない。
C量、RF伝導率(非透過性)、光拡散および蛍光特性のような特徴を同時に判
定できる自動装置を提供することにあり、これによって、個別のトランスジュー
サから集められたデータを関連付けする必要がなくなる。
自動化された方法を提供することにあり、この方法は、興味のあるセルのサブセ
ットに関する情報を抽出するために、複数の分離したトランスジューサから得ら
れるデータを関係付けする必要がないという点で改良されたものである。
ための、改良されたフローセル装置を提供することである。
それぞれの濃度を識別し判定するための好適な機器は、通常、以下のような組み
合された構成要素を備える。すなわち、 (a)血球が逐次流れることができるセル取調べゾーンを画定する単一のフロ
ーセル、 (b)容器から血液サンプル全体を吸引する手段、 (c)吸引された血液サンプル全体の少なくとも第1のアリコートを配送する
手段、 (d)全血液の第1のアリコートに溶解試薬(lysing reagent)を注入し、白血
球および有核赤血球を主として含む溶解サンプルを提供する手段、 (e)溶解サンプルに含まれるセルの1つもしくはそれより多いサブセットに
蛍光物質を注入し、それによってセルの前述のサブセットをこの蛍光物質でラベ
ル付けするようになる手段、 (f)測定された分量の溶解サンプルを配送する測定手段、 (g)測定された分量の溶解サンプルをフローセルのセル取調べゾーンへ通過
させ、測定された分量内の血球がセル取調べゾーン中を逐次流れるようにする手
段、 (h)(a)それぞれが、(i)セルの体積の関数でこのゾーンのDC電流を
変調し、(ii)セルの内部伝導率の関数でこのゾーンのRF電流を変調するの
に効果的であり、血球が流れている間にDCおよびRF電流がセル取調べゾーン
を流れることを同時に確立し、(b)このDCおよびRF電流の変調を検出する
回路手段、 (i)セル取調べゾーン中を流れる個々の血球に、サンプルが流れる方向に垂
直な軸に沿って伝播する放射ビームを照射する光学的手段であって、蛍光物質が
蛍光を発するようにこの放射がなされる手段、 (j)このゾーン内において照射された血球から拡散された放射を検出する放
射拡散検出手段であって、この放射拡散検出手段は、軸に関して測定された離散
的な複数の角度範囲内で拡散された放射を検出するように構成される手段、 (k)光学手段によって照射された結果、蛍光物質でラベル付けされたセルの
サブセットから蛍光が発せられる放射を検出する蛍光検出手段、および、 (l)回路手段と各放射拡散および蛍光検出手段とに動作可能に結合され、白
血球の様々なサブセットおよび蛍光物質でラベル付けされたセルの各濃度を識別
し判定する分析手段、である。
の第2のアリコートを配送し、また、この装置は以下の付加的な要素を更に備え
る。すなわち、 (m)血液全体の第2のアリコートを賦形薬に注入し、主として赤血球および
血小板を含む希釈サンプルを得る手段、 (n)希釈サンプルを蛍光物質に合わせて、それによって、赤血球もしくは血
小板のうちの少なくとも1つ選択されたサブセットが、この蛍光物質でラベル付
けされる手段、および、 (o)計測された分量の希釈サンプルを配送し、この計測された分量の希釈サ
ンプルを、フローセルのセル取調べゾーン中に流し、測定された分量内の血球が
、セル取調べゾーンを逐次通過するようにする手段、である。この実施例では、
分析手段はさらに、DC量(V)、RF伝導率(C)、光拡散(S)および蛍光
(F)の各特性に基づいて、赤血球および血小板の様々なサブセットの各濃度を
区別し、判定するよう動作する。
の組合せを分析することによって、成熟した白血球の5つの異なるサブセットと
して区別される。その他の白血球のサブセット、異常セルおよび未成熟セル(例
えば、NRBC、芽細胞、CD4/CD8ポジティブリンパ球、未熟顆粒白血球
、異常リンパ球および幹細胞)は、DC量、RF伝導率、蛍光および光拡散の各
特性に基づいて区別される。
V、C、SおよびFの特性を同時に判定することによって、赤血球および血小板
のこのサブセットを区別する手段をさらに備える。
その各サブセットを分析する自動化された方法は、 (a)トランスジューサ内の取調べゾーンを順次通過する血球のそれぞれのD
C量、RF伝導率、光拡散および蛍光特性を同時に測定することができる単一の
トランスジューサを有するフローセル装置を提供するステップと、 (b)容器から全血液のサンプルを吸引するステップと、 (c)吸引された全血液サンプルの第1および第2のアリコートを配送するス
テップと、 (d)全血液の第1のアリコートを溶解試薬に注入し、主として白血球の溶解
サンプルを得るステップと、 (e)全血液の第2のアリコートを賦形薬に注入し、希釈サンプルを得るステ
ップと、 (f)希釈もしくは溶解サンプルに含まれる1つもしくはそれより多いセルの
サブセットを蛍光材料に注入し、これによって、所定の波長の放射にさらされた
ときに蛍光を発する蛍光材料でセルのこのサブセットをラベル付けするステップ
と、 (g)測定した分量の溶解サンプルおよび希釈サンプルを配送し、測定した分
量の溶解サンプルおよび希釈サンプルが、取調べゾーン中を連続的に流すことで
、この測定された分量内における各血球が取調べゾーンを逐次流れるようにする
ステップと、 (h)DCおよびRF電流の取調べゾーン中での流れが確立している間、取調
べゾーン中を流れる個々の血球に軸に沿って伝播する波長を有する放射ビームを
照射するステップであって、血球のそれぞれが、取調べゾーンを通過している間
、(i)取調べゾーンのDC電流をセルの分量の関数で変調し、(ii)経路中
のRF電流の流れをセルの内部伝導率の関数で変調するのに有効であるステップ
と、 (i)取調べゾーンにおいて照射された血球による放射拡散、および、取調べ
ゾーンにおいて照射された血球から発せられる蛍光を検出する間、DCおよびR
F電流の変調を検出するステップと、 (j)各セルのDC量(V)、RF伝導率(C)、光拡散(S)および蛍光(
F)に関する特性に基づいて、溶解サンプル内の白血球の種々のタイプを区別し
計数するステップと、 (k)各セルのDC量(V)、RF伝導率(C)、蛍光ラベル(F)および光
の拡散(S)に関する特性に基づいて、希釈サンプル内の赤血球の種々のタイプ
を区別し計数するステップと、を備える。
3のアリコートを配送し、この第3のアリコートを、第3のアリコート内の選択
されたセルのサブセットに特有の単一クローンの抗体に結合される蛍光含有の試
薬に注入し、それによって、選択されたセルのサブセットはこの蛍光色素でラベ
ル付けされることになるステップと、(m)このサブセットのV、C、Sおよび
Fに関する特性に基づいて選択されたサブセットを区別し計数するステップと、
をさらに備える。また、本発明の方法が、セルのV、C、S、Fのパラメータに
基づいて、溶解サンプル内の、有核赤血球、異常細胞、未熟細胞を区別し計数す
るステップをさらに備えれば好適である。
溶解サンプル、希釈サンプルおよびラベル付けされたサンプル)のそれぞれにお
けるセルのV、C、S、F特性を検出することに関連するステップは、例えば、
白血球のみ分析したり、もしくは赤血球および血小板のみを分析したり、もしく
は蛍光セルのみを分析したりするように、個別に実行することができる。
を含む、形状を有する組織体のV、C、S、F特性を同時に検出する新しい光学
フローセルが提供される。このようなフローセルは、直角プリズムの形式で光学
的に透過性のある要素を備え、前記サンプルにおける形体が一度に1つ通過する
経路を画定する。好適には、経路の一部分は、各辺がおよそ50マイクロメート
ルの実質的に正方形の横断面(サンプルが流れる方向に垂直に決定される)と、
サンプルが流れる方向に対しておよそ65マイクロメートルの長さと、を有する
セル取調べゾーンを画定する。フローセルは、電気エネルギー源に接続可能で、
かつ、粒子が通過している間にフローセル中を流れる電流を発生する電極対を支
持し、また、放射がセル取調べゾーン内に発せられる光学的要素が、光検出器に
光学的に結合される。
詳細な説明でよりよく認識できるであろう。
概略的に例示している。この分析器は、容器すなわちガラス瓶10から全血液サ
ンプル( WBS)を吸引し、コントローラ11の指示によって細胞の構造を分
析し、調査結果をレポートするように、構成されている。例えば、単一のチュー
ブホルダ、サンプルトレイもしくはラックホルダのようなサンプル運搬装置(sam
ple transporter : ST)によって運ばれた1つもしくはそれより多いガラス瓶
10は、コンベア(図示せず)によって前進させられ、血液サンプルを吸引プロ
ーブPへ提示する。これは、所定の分量の血液を、ガラス瓶10から従来の血液
サンプリングバルブ12など(例えば、共通に譲渡された米国特許第5,255,568
号、第4,702,889号、第4,507,977号および第4,445,391号において開示されてい
るようなもの)へくみ出すよう、選択的に動作可能である。このバルブは、分析
のために、サンプルを正確なアリコートにマイクロリットルの分量で分割する公
知の方法で動作する。この複数のアリコートA1、A2、A3は、サンプル準備
ステーション14に分配されるが、ここでは、各アリコートは混合され、さもな
ければサンプル内の選択されたセルを処理する試薬が注入される。好適な実施例
によれば、サンプル準備ステーションは、例えば、溶解され着色されたサンプル
SL(蛍光色素で着色された主として白血球および他の細胞(例えばNRBC)
を備える)、希釈されて着色されたサンプルSD(非常に希釈された懸濁液内に
おいて血球の全タイプを含み、セルのいくつか(例えばレチックのサブセット)
が蛍光染料で着色される)、溶解されてタグが付けられたサンプルST(懸濁液
内において主として白血球を備え、この懸濁液には、例えば単一クローンの抗体
を介して、蛍光色素でタグもしくはラベルが付けられた選択された白血球(例え
ば、CD4およびCD8のポジティブセル)が含まれる)を生成することができ
る。そして、正確に測定された分量で準備されたサンプルは、測定機構16によ
って、単一のマルチパラメトリックトランスジューサ18を連続的に通過する。
マルチパラメトリックトランスジューサ18は、次に詳しく説明するように、上
述の蛍光染料の着色あるいは蛍光染料のタグもしくはラベルによって提供される
ように、各アリコート内の各細胞の異なる4つの特性、すなわち、各セルのDC
量(V)、そのRF伝導性(C)、その光の拡散特性(S)およびその蛍光(F
)に関する特性、を同時に計測するように動作する。DC量およびRF伝導率は
それぞれ単一の測定パラメータを提供する一方で、各セルの光拡散の特性は、そ
れぞれが異なる測定パラメータをもたらすいくつかの種々の離散的な角度範囲内
で測定される。
角度光拡散(medium angle light scatter)もしくはMALSと呼ばれる約20度
と約70度との間、(b)下方中域角度光拡散(lower medium angle light scat
ter)もしくはLMALSと呼ばれる約10度と約20度との間、(c)上方中域
角度光拡散(upper medium angle light scatter)もしくはUMALSと呼ばれる
約20度と約70度との間、(d)名目上は直交(orthogonal)であり、側方拡散
(side-scatter)もしくはSSと呼ばれる約80度と約100度との間、である。
同様に、セルの蛍光染料は、離散的な多数の波長範囲F1、F2およびF3内で
好適には測定されるが、この範囲は、興味のあるセルをラベル付けするのに使わ
れる染料および蛍光色素の各蛍光発散スペクトルによって決定される。それゆえ
、以下に記述する実施例においては、VおよびCに、4つの光拡散および3つの
蛍光の測定を+した異なる9個の測定が、各セルもしくは血小板に対して同時に
なされる。明らかに、光拡散測定値の数は、所望のとおり増加させることができ
、また、興味のあるセルにラベル付けするのに使われる染料および蛍光色素によ
って発せられる蛍光スペクトルの数に対応して光検出器の数を増加させることに
よって、蛍光測定の数を(常識の範囲内で)増加させることができる。V、Cお
よびSパラメータについての議論は、例えば回転光拡散(rotated light scatter
: RLS)および非透過性(RF/DCすなわちC/V)など、ここで述べた他の
様々なパラメータと共に、C.RodriguezおよびW.Coulterに
対して付与された、共通に譲渡された米国特許第5,125,737号において見ること
ができるが、この主題は、参照することによってここに組み込まれる。各トラン
スジューサの出力V、C、SおよびFは分析器20に供給されるが、分析器20
は、プログラムされたアルゴリズムに基づいて、サンプル内の種々のセルのタイ
プおよびサブセットを区別し列挙し、様々な血液およびセルのパラメータ、例え
ばHgb、Hct、MCVなどを判定し、そしてレポートRを提供よう動作する
。マルチパラメトリックトランスジューサ18は、4つのセルパラメータを同時
に測定するので、また、正確に計測された分量のサンプルがトランスジューサを
通過するので、従来のセル分析システム全てにおいて必要とされているような、
複数のトランスジューサの各出力を関係付ける必要はなく、したがって、分析器
の精度はさらに拡大する。また、単一のセルに対して4個のパラメータを同時に
測定することによって、各セルについての4パラメータ多次元分析が可能となり
、それによってより正確な(あいまいではない)セルのタイプの判定が可能とな
る。
リックトランスジューサ18である。図2〜7の拡大図でよりよく示したように
、トランスジューサ18は、分析のために、セルが1度に1つずつ(逐次)通過
することができる内部経路32を有する光学要素30を一般に備える血球計算フ
ローセルFCとして特に構成される。経路32の中心は、光学要素30の幾何学
的中心に位置しており、この光学要素30は細くなって、通過するセルのV、C
、SおよびFパラメータが同時に判定されるセル取調べゾーンZを画定している
。コーン形状カップ34、35は、光学要素の対向する各壁36に結合されてお
り、また、このコーン形状カップ34、35は、流体力学的に焦点が合わされる
かあるいはセル取調べゾーンにサンプルを中心に置くのに使われる、分析すべき
サンプルとシース液体との両方を、光学要素に導き、そこを通って排出されて廃
棄されるときに通過させる手段としての役割を果たす。カップ34、35によっ
てそれぞれ画定されて取り囲まれたチャンバ34A、35Aは、スペースが取ら
れた電極38、40を含むが、これらの電極は、DC/RF回路41(以下で説
明する)に接続可能である。この回路の構成要素は、(a)セルが一度に1つず
つ通過している間にセル取調べゾーンに流れるDCおよびRF電流を生成し、(
b)取調べゾーンをセルが通過することによって生成される各DCおよびRF電
流における変調を検出する。セルの電気抵抗は、サンプルおよびシース流体内の
浮遊流体の電気抵抗とは異なるので電流変調が発生することが理解できよう。各
セルが取調べゾーンを通過し、適切な連続波レーザ42によって発生する焦点が
合わされたレーザビームBで照射され、そして、各セルから拡散された放射(光
)が光拡散検出器LDS1およびLDS2のペアで検出される。同時に、もしあ
るならばレーザ放射により励起された結果としてのセルの蛍光着色もしくは蛍光
ラベルで発せられた蛍光放射が、以下で説明するように蛍光検出器FDによって
検出される。
の長方形の光学的に平坦な面50と上述の対向した各壁36とを備える。好適に
は各面50間の各幅Wは同じであって、好適にはそれぞれ約4.2mmであり、
また、各壁50の各長さLは約6.3mmである。光学的要素30は溶解したシ
リカもしくは石英で製造されるのが特に好ましい。光学的要素30の中央領域に
形成されるフロー経路32は、要素30の中心を通過する長手方向の軸Aに対し
て同心状に、かつサンプルが流れる方向に平行に構成される。フロー経路32は
、上述のセル取調べゾーンZと、先が細くなっている対向するホール穴54のペ
アと、を備え、ホール穴54は、各底面付近にセル取調べゾーンと流体的に通信
するための開口部を有する。好適には、セル取調べゾーンの横断面は方形の形状
であり、各辺の幅W’は名目上50マイクロメートル±10マイクロメートルで
ある。取調べゾーンの長さL’は軸Aに沿って測定すると、取調べゾーンの幅W
’の約1.2〜1.4倍であり、すなわち、好適には約65マイクロメートル±
10マイクロメートルである。この寸法は、取調べゾーンを通過するセルについ
てのDCおよびRF測定値(以下で説明する)を最適化するのに必要であること
がわかっている。先が細くなっているホール穴54の最大直径は、終端の壁36
で測定して、約1.2mmである。平凸レンズ51は、光学要素の平坦な面50
のうちの1つに(例えば光学セメントによって)適切に装着されるが、このレン
ズは、以下で説明するように、取り調べゾーンからの蛍光放射を、蛍光を検出す
る光検出器パッケージFDに、光学的に結合するように作動する。説明したタイ
プの光学的構造は50×50マイクロメートルの毛管状の開口部を含む石英の正
方形ロッドから作られ、そして、それに続いて通信するホール穴54を画定する
ために規定の寸法どおりに作りあげられる。
〜P8に備えられるが、それらは、1)分析すべき1つもしくはそれより多いサ
ンプルとシース流体とをフローセルに導き、2)サンプルおよびシース流体を廃
棄するために排出し、3)1つもしくは両方のカップチャンバを廃棄のために水
で洗い流し、そして4)フローセルラインに注入するために真空にするという役
割を果たす。ポートP1〜P3は、計測機構16に流体的に結合しており、分析
のためにアリコートを経路32に注入するのに使われる多チャンネルノズルN(
図4Bが最もよく示している)に、サンプルの測定されたアリコートSL、SD およびSTを導く役割を果たす。ポートP4もまた、計測機構16に結合してお
り、計測された分量のシース流体SFをカップ34に導く役割を果たすが、この
流体は、サンプルに対して水力学的に焦点を合わせるように、すなわちサンプル
をセル取調べゾーンの中心に置くようにする。図4Bを参照すると、サンプルノ
ズルNは、部分的に図示されているが、3つの並列チャンネルC1、C2、C3
を有しており、それらは各サンプルアリコートに対して1つ毎であり、サンプル
を配送するポートP1〜P3の1つ毎に対応している。図4Aに例示されるよう
に、図2の計測装置16は、正確に計測された分量のサンプルをサンプルノズル
Nの中央のチャンネルに配送しているのである。これは、取調べゾーンに向かっ
てサンプルを投入する役割を果たす。その間に、チャンバ34Aに入力された計
測された分量のシース流体SFは、圧力がかけられポートP4を介して経路32
を流れる。そのとき、シース流体は、サンプルストリームを一様に取り囲んでこ
のサンプルをセル取調べゾーンZの中央に流し、これによって、流体力学的な焦
点合わせを達成することができる。過度のシース流体は、ポートP5を介してチ
ャンバ34Aから排出される。ゾーンZを出るとき、サンプルおよびシース流体
は、サンプル出口チューブ58によって集められ、これによって、再循環するセ
ルがDCおよびRF測定値に影響を及ぼすことを防ぐ。図4Aにおいては、血球
BC1が、サンプル誘導ノズルNの中央ポートから出ているのが示されており、
血球BC2がゾーンZの中心にあって、楕円状に焦点が合わされたレーザビーム
B内にあることが示されており、血球BC3が、廃棄用に接続されているサンプ
ル出口チューブ58に流入しているのが示されている。チャンバ35A内の流体
の圧力を制御ししてそれによって取調べゾーンから出た後のサンプルの流れを制
御するために、チャンバ35Aは、シース流体を大量に維持し、この流体はポー
トP7を介して流入してポートP8を介して廃棄するために排出される。
図3〜5に示すように、興味のある選択されたセルによって運ばれた蛍光物質を
励起する波長を有するRビームBを放射するレーザ42のようなものと、セルが
通過させられる位置における取調べゾーンZ内に位置する、楕円形状のくびれ6
4にレーザビームの焦点を合わせるレンズ62と、を備える。適切なレーザ源は
、488ナノメートルを発する連続波アルゴンレーザと、532ナノメートルを
発するダイオードポンプソリッドステートレーザと、である。楕円くびれ64の
好適な1/e2のディメンジョンは、約10×100マイクロメートルであり、
小さい方のディメンジョンは、サンプルが流れる方向、すなわち軸Aに沿った方
向である。照射されたセルによって拡散される放射は、取調べゾーン内で、2つ
の光拡散検出器ユニットLDS1およびLDS2によって検出される。LDS1
は、ビームBの軸に関してほぼ法線方向(すなわち、約90度±10度)に拡散
する光を検出するような位置にあり、LDS2は、約20度と70度との間(M
ALS)の角度範囲内で前方面に拡散される光を検出するような位置に置かれ、
また、そのように構成される。LDS1は好適には焦点レンズ65を備え、この
焦点レンズ65は、側方拡散光をピンダイオード66のようなものに焦点を合わ
せるように動作する。これは、側面に拡散する放射を集め、プリアンプPを介し
て図1の分析器20へLS90パルス信号を出力する。MALS光拡散検出器L
DS2は、図7に詳細を示すが、上方中域角度光拡散(UMALS)領域78お
よび下方中域角度光拡散(LMALS)領域80の2つの光感知領域を有する。
上述のように、UMALS領域は、20〜70度の間の角度領域で拡散する光を
検出するようになっており、また、LMALS領域は、10〜20度の間の角度
領域で拡散する光を検出するようになっている。蝶ネクタイの形状をしたマスク
82は、拡散しないレーザ光および10度より小さい範囲で拡散する光が、LM
ALS領域に当たらないようにする。マスク82はまた、水平面付近で拡散もし
くは回折したどんな光も、UMALSおよびLMALS領域のどちらにも当たら
ないようにする。LDS2は、MALS、UMALSおよびLMALSパルス信
号を個別に生成するが、これらは適切なプリアンプPを介して分析器20へ出力
される。
0に取り付けられた上述のレンズ51によって集められ、レンズアセンブリ70
によってコリメートされかつ空間的にろ波され、ビームスプリット光二色性ミラ
ー(beam-splitting dichroic mirror)BS−1、BS−2ならびにフィルタ71
、72および73のネットワークを介して複数の光マルチプライヤチューブPM
T−1、PMT−2およびPMT−3に中継される。従来のやり方では、各光マ
ルチプライヤチューブは、光二色性ミラーおよびフィルタ状の光コーティングに
よって決定される波長範囲内の蛍光放射を検出する。光マルチプライヤチューブ
の各出力は、適度に増幅され、パルス信号FL1、FL2およびFL3として図
1の分析器20に供給される。
回路86と、プリアンプPとを備える。結合回路は、DC源およびRF発振器/
検出器によって生成される電流を線形に結合し、上述のセル取調べゾーンにこの
電流を加える。好適には、RF構成要素は、約22.5MHzの周波数を有する
。セルがゾーンZを通過するとき、ゾーンのインピーダンスは変動し、セルの物
理量V(しばしばDC量と呼ばれる)を関数とするDC電流の変調、およびセル
の内部伝導率Cを関数とするRF電流の変調が生じる。結合回路は変調された電
流を分離し、それにより、DCパルス信号はDCプリアンプPに運ばれ、また、
変調されたRF電流は発振器/検出器によって検出され、この結果、RFプリア
ンプPに運ばれるRFパルス信号が生じる。DCおよびRFパルス信号の両方は
、分析器20へ出力される。
のために全血液の複数のアリコートA1、A2、A3を準備する機能を有する。
したがって、ステーション14は、複数の混合チャンバMC1、MC2、MC3
を備え、適切なポンプ(図示せず)によって血液サンプルバルブ12から排出さ
れるアリコートA1、A2、A3をそれぞれ受ける。図示のように、混合チャン
バMC1は、全血液の第1のアリコートA1を受けるように位置しており、これ
を、蛍光染料を含んでもよい賦形薬Dと混合する。このやり方においては、希釈
サンプルSDは、赤血球/血小板の分析のために準備される。同様に、混合チャ
ンバMC2は、分析のために第2のアリコートを受けるように位置している。混
合チャンバMC2では、全血液サンプルは、適切な溶解試薬L、消光試薬Q、そ
してオプションとして蛍光染料Sと合わせられる。このやり方においては、赤血
球がサンプルから除去され、そしてこのサンプルは白血球区別分析のために準備
される。類似のやり方では、第3のアリコートA3は、混合チャンバMC3に分
配されるが、混合チャンバMC3は、選択されたセルを蛍光色素でラベル付けす
る単一クローンの抗体を使ってさらなる分析のためのサンプルを準備する試薬を
受けるように位置する。この試薬は、溶解試薬L、消光Qおよび蛍光色素でタグ
がつけられた単一クローンの抗体Mを含んでもよい。
5を備える。各ポンプは好適には注射器の一種であり、そのそれぞれは、コント
ローラ11の制御の下で動作する適切なステッピングモータ(図示せず)で駆動
し、正確なレートで液体をポンプする。計測ポンプMP1〜MP3は、各混合チ
ャンバMC1〜MC3からフローセルの入力ポートP1〜P3へ所定量のサンプ
ルSL、SD、STを一定のレートで配送するようになっている。公知の方法で
は、計測ポンプMP4およびMP5は、計量されたシース流体SFをフローセル
に供給するように機能し、この流体は、感知ゾーンZのセルに流体力学的に焦点
を合わせる役割をする。
行するように、サンプルSL、SDおよびSTのそれぞれを分析するように動作
することができるが、一方で、サンプルが分析間で明らかに変化しないようにす
ることを確実にするように、少なくとも2つの分析が実行されるのが好適である
。しかし、上述のように、1つの分析の結果を他のものに関係付けする必要はな
く、例えば、便利な結果を得るために赤血球分析を白血球分析に関係付ける必要
はない。それゆえ、例えばアリコートA1およびA2は各チャンバMC1および
MC2に配送される。希釈され着色されたサンプルSDはトランスジューサ18
に注入されて分析されるが、溶解され着色されたサンプルSLはまだ準備中であ
る。フローセルFCはすすぎ落とされ、次のサンプルを不純物無しで分析できる
ようにする。そして溶解され着色されたサンプルSLはトランスジューサ18に
注入されて分析される。
ータ90からなる。データ獲得モジュール88は、VCSFトランスジューサか
らパルス信号(FL1、FL2、FL3、DC、RF、UMALS、LMALS
、LS90)を入力し、このパルス信号を増幅、ろ波および計数し、例えばパル
ス信号のそれぞれからピーク電圧のようなパルス情報を得て、このパルス情報を
ディジタル値(FL1’、FL2’、FL3’、DC’、RF’、UMALS’
、LMALS’、LS90’)に変換する。パルスピークのディジタル値および
パルス数は、分類、列挙、特長付けのためにコンピュータ90に転送される。コ
ンピュータ90は、中央処理装置(CPU)、ランダムアクセスメモリ(RAM
)、読出し専用メモリ(ROM)、キーボード、ディスプレイ、プリンタおよび
ネットワーク接続のような基本的な構成要素を含む。
板を区別し列挙する方法を実行するのに使われる。本方法は、以下の構成要素を
備える賦形薬D(図2)を利用する。 1. リン酸塩で緩和された生理的食塩水(Phosphate Buffered Saline:P
BS) 2. コリフォスフィリンO(Coriphosphine-O:CPO) 8マイクログ
ラム/ミリリットル 3. ドデシル基βDマルトース(Dodecyl-β-D-maltose) 20マイクログ
ラム/ミリリットル 4. プロクリン300(Proclin 300) .05%
CPOは、適切な波長で励起されたときに、付着した物質の分子構造によって決
まる波長で蛍光を発する異染性分子である。DNAおよびRNA(共に核酸であ
る)の両方を含むセルを着色するのに使われたとき、CPOは、セルのDNA含
有に付着したときはある波長(FL1)で蛍光を発し、セルのRNA含有に付着
したときは他の波長(FL2)で蛍光を発する。図2を参照すると、2マイクロ
リットルの全血液のアリコートA1は、サンプル準備ステーション14における
混合チャンバMC1に配送され、約2秒間で2ミリリットルの賦形薬と混合され
、希釈サンプルSDが生成される。サンプルSDの一部は、チャンバMC1から
真空(フローセルポート5に割り当てられている)によってくみ出され、このチ
ャンバとフローセルポートP1とを接続するラインに入れられ、それによってサ
ンプルでラインを予め装填する。計測ポンプMP1は、ステップモータで動作さ
せられ、10秒間、2マイクロリットル/秒の割合でフローセルへサンプルを進
める。この間、取調べゾーンを通過する全セルは、計数され、区別(すなわち、
タイプもしくはサブセットに関して特徴付けられる)される。このようにして、
正確な分量である20マイクロリットルのサンプルは、分析に付される。同時に
、計測ポンプMP4は、約8マイクロリットル/秒の割合でシース流体を配送す
る。ポートP1およびP4の領域の相違のために、サンプルおよびシース流体は
、同じレートでフローセルを通過する。混合および注入を含めた全潜伏期は、名
目上5.5秒であり、5〜15秒の動作範囲である。既に述べたように、V、C
、SおよびF測定値は、単一のマルチパラメトリックトランスジューサ18内で
全てのセルが作られており、測定データは、従来の手法で分析器20によって処
理され、レポートが生成されるが、このレポートは、赤血球および血小板の絶対
数、網状赤血球および網状の血小板の絶対および相対計数、赤血球および網状赤
血球の細胞性のヘモグロビン情報、上述のセルタイプの平均量、サンプルに対す
る全ヘモグロビンを含む、抽出されたパラメータを提供する。
れ得る結果を作り出すことができる.ドデシル基βDマルトース成分は、2つの
機能を有する。すなわち、1)赤血球のセル毎のヘモグロビン(HC)を測定で
きる等容性のセル球体試薬として機能する、2)セルの膜を通過する染料の増加
を促進して核酸を染色し、染色時間(通常のフロー血球計算器で約60分)を1
00倍低減する。プロクリン300は、アンチバクテリア因子である。CPOは
、488ナノメートルのアルゴンイオンレーザもしくは532ナノメートルで動
作するダイオードポンプソリッドステートレーザで励起することができるが、こ
れはこの例についての好適な励起である。蛍光検出システムFDは、DNAに相
互作用する色素に主として応答する575ナノメートル(FL1)、およびRN
Aに相互作用する色素に主として応答する675ナノメートル(FL2)の各発
光を受信するように設定される。この例では、RNAは、興味のある信号(FL
2)であり、以下の図では「蛍光」としてラベル付けされる。図9Aは、赤血球
および血小板について、非透過性(RF/DC)に対してプロットされた分量(
DC)を示す拡散図である。成熟赤血球と網状赤血球とはオーバーラップし、赤
血球の単一母集団として現れる。血小板は低い分量で表れる。ゴースト(すなわ
ち、ヘモグロビンを失った赤血球)は非常に少ない数の赤血球を備え、その赤血
球はダメージを受けており、HC測定から取り除く必要がある。図9Bは、DC
量対UMALSを示す。パターンは図9Aのそれに対して不明瞭であるが、さら
なるクラスタである一致赤血球(coincident red cell)は、同時に孔を横切る2
つもしくはそれより多い赤血球によってもたらされ、識別される。一致赤血球も
また、HC測定から取り除かれるが、網状赤血球のパーセント(RET%)およ
び絶対濃度(RET#)を測定するときは考慮される。図9Cは、DC量対赤血
球および血小板の蛍光を示す。成熟赤血球と網状赤血球とは容易に見分けられる
。ゴーストの赤血球は、成熟赤血球もしくは網状赤血球であり得るが、結果には
影響を与えない。網状の血小板のクラスタは、メインの血小板の個体群の右側(
より高い蛍光)にはっきりと認められる。
非透過性は、血小板P、赤血球RおよびゴーストGを識別するのに使われる。図
10Bを参照すると、DC量およびUMALSは血小板PおよびゴーストG対赤
血球Rの識別をはっきりさせるのに使われる。一致赤血球Cと非一致の成熟赤血
球MC+網状RETとを識別する。図10Cは、DC量対FL2は、成熟赤血球
MCと網状RET(一致するものと非一致のものと両方)とを識別するのに使わ
れ、また、血小板Pのサブ個体群である網状血小板RPを識別するのに使われる
。白血球Wは、より高いDC量とFL2およびFL1(図示せず)の著しく高い
蛍光レベルとのために、本分析において区別される。分量、個体群、UMALS
および蛍光を含む分類を使って、ならびに、DC量から得られるセル計数情報を
使って、網状赤血球のパーセント(RET%)、網目状の血小板、もしくは未熟
血小板分数パーセント(IPF%)、ならびに、絶対濃度(IPF#)をレポー
トする。また、以下の個体群に対する絶対濃度をレポートする。すなわち、赤血
球(RBC)、網状赤血球(RET#)、血小板(PLT)、網状の血小板およ
び白血球(WBC)である。上述のパラメータを使って、赤血球のサブ個体群を
特徴付ける。すなわち、図10Bを参照し、かつ、UMALSおよび分量の関数
を使って、網状赤血球(CHr)および全赤血球(CH)についてセルごとのヘ
モグロビンを得るが、これらの両方から、さらなる臨床情報を得るためにヒスト
グラムを作ることができる。また、網状赤血球(MCHr)についてのセルごと
のヘモグロビンの平均、および、全赤血球(CH)の平均赤血球ヘモグロビン量
(MCH)をも得る。DC量を使って、平均血小板分量(MPV)、平均網状赤
血球量(MRV)、全赤血球の平均赤血球量(MCV)および赤血球分布幅(R
DW)、を計算する。ヘマトクリット値(HCT)はMCV×RBC/10で計
算される。全ヘモグロビン(HGB)はMCH×RBCで計算される。平均赤血
球ヘモグロビン濃度(MCHC)はMCH/MCVで計算される。
拡張された方法を実行するのに使われる。本方法は、異染性色素(CPO625
マイクログラム/ミリリットル)、赤血球溶解試薬および消光試薬を利用し、残
りの染色されていないセルへの溶解の影響を阻止もしくはさらに抑制する。2つ
異なる好適な溶解および消光の例として、それらの分量および露出時間を以下の
表に示す。代わりの溶解および消光試薬もまた、残りのセル(WBCおよびNR
BC)についての所望の電気光学特性を保持しつつRBCを効果的に溶解するた
めに必要なものとして利用される。
ユニット14内の混合チャンバMC2に運ばれ、3.4マイクロリットルのCP
Oと30秒間混ぜられる。上の表を参照すると、そして、507マイクロリット
ルのエリトライズ(Erythrolyse)IIがCPOで着色された血液に加えられてさ
らに5.3秒間混ぜられ、その間、200マイクロリットルのスタビライズ(Sta
bilyse)がさらに8.5秒間続けて混ぜられる。
を通過させ、例1で説明した手順を使って、40マイクロリットルの分量のサン
プルSL内の全セルが調べられる。既に述べたように、V、C、SおよびFの測
定は、サンプルの全てのセルから得られ、これらの測定は、分析器20によって
処理され、通常の5種類の白血球のタイプおよび絶対的および相対的な濃度およ
び少なくとも1つの異常なセルのタイプについてのリポートを作成するが、これ
らは、有核赤血球(NRBC)、芽細胞および未熟細胞を含むが、これに限定さ
れるわけではない。CPOは、488ナノメートルのアルゴンイオンレーザもし
くは532ナノメートルで動作するダイオードポンプソリッドステートレーザで
励起することができるが、これはこの例に関しては好適な励起である。蛍光検出
システムFDは、DNAに対して染色相互作用に原始的に反応する575マイク
ロメートル(FL1)、および、RNAに対して染色相互作用に原始的に反応す
る675マイクロメートル(FL2)の放射を受けるように設定される。
、通常の末梢血液標本についての測定値の種々の組合せの拡散図を示しており、
5つの正常の白血球の個体群である、リンパ球(Lymph)、単核白血球(M
ono)、好中球(Neut)、好酸球(Eo)および好塩基球(Baso)の
みが含まれている。デブリー(Debris)と呼ばれるクラスタもまた示されているが
、これは、赤血球フラグメントの血小板および非生存白血球を含み、また、有核
赤血球(NRBC)を含むかもしれない。図11Aは、DC量とLMALSとの
拡散図を示す。LMALSは、Lymph+Mono+Basoと、Neut+
Eoとの分離を最適にする。図11BはDC量とlogのULALSとの拡散図
である。UMALSは、Eoクラスタの最適な分離を提供する。図12AはDC
量とRLSとの拡散図とを示す。RLSは、LMALS測定値とUMALS測定
値との合計のlogを含む合計によって得られ、DC量の測定値に関する結果を
回転もしくは規格化する。図11Aおよび12Aは、MonoクラスタがDCに
よってLymph+Basoから分離されることは明らかである。図12Bは、
RF/DCによって分類されるBasoおよびLymphクラスタでの、DC量
とRF(伝導率)/DC(分量)との拡散図を示す。図11A〜12Aに示され
る光拡散測定で得られた分離の結果、NeutおよびEoでBasoをオーバー
ラップすることにより解決される。図13Aおよび13Bは、それぞれ、DC量
とFL2(上述のように測定されたRNA蛍光)との拡散図、および、DC量と
FL1(上述のように測定されたDNA蛍光)との拡散図である。これら2つの
図では、5個の通常の個体群が、種々の角度のオーバーラップで示されている。
図14Aは、FL1とFL2との拡散図を示す。この図を前の2つと比較すると
、5つ全ての正常の個体群が認識できるのが明らかである。さらに、ほとんど空
の領域BLは、もしサンプルが有しているならば芽細胞が見られる拡散図上での
位置として識別される。図14BはDCとFL2/FL1との拡散図である。2
つの蛍光測定値の比は、芽細胞領域BLを保持し、その領域に対して、ゲートを
設ける(gating)、すなわち、境界を決定するのを容易にする。図15A〜18B
は、異常なリンパ性白血病(ALL)の末梢血液標本に付いての測定値の種々の
組合せの拡散図を示しており、4つの正常の白血球の個体群であるリンパ球(L
ymph)、単核白血球(Mono)、好中球(Neut)および好酸球(Eo
)と、非常に高濃度の芽細胞(Blast)とを含んでいる。図15A〜16B
は、それぞれ、DC量対LMALS、DC量対UMALS、DC量対RLS、お
よびDC量対RF/DCの拡散図を示している。これら全ての図において、Bl
astの個体群が他のクラスタ全てに重なり合っているが、これにより、これら
の測定値だけで適切な分類を不可能にしている。図17A〜17Bは、それぞれ
、DC対FL1およびDC対FL2を示している。Blast個体群は、どちら
の場合も、他のクラスタと著しく重なり合っている。図18Aは、FL1対FL
2の拡散図を示す。この場合、BlastクラスタがLymphクラスタと重な
り合っている以外は、個体群のほとんどは溶解している。図18Bは、DC量と
FL2/FL1との拡散図である。Lymph、Blast、Mono、Neu
tは完全に溶解している。領域BAは好塩基球が見られる領域を示している。E
oクラスタは、UMALS(図15B)によって分類される。
血液サンプルとについて、LogFL2とLogFL1との拡散図を示す。クラ
スタWは白血球を含んでおり、図11A〜18Bに示す全白血球個体群と等価で
ある。クラスタDのセットは、赤血球フラグメントおよび血小板を含むクラスタ
RP、有核赤血球を含むクラスタNRBC、ならびに、非生存白血球を含むクラ
スタ126からなる。クラスタセットDは、図11A〜18Bに示すデブリー個
体群に等価である。3個の境界120、122、124は、クラスタセットDを
備えるクラスタを画定し分類する。境界120は、クラスタセットDから白血球
Wを分離する。境界122は、NRBCクラスタおよび非生存白血球126から
、赤血球フラグメントおよび血小板RPを分離する。境界124は、非生存白血
球クラスタ126からNRBCクラスタを分離する。
C量およびFL1は、デブリスD個体群を白血球Wから識別するのに使われる。
RLS、DC量、RF/DC、FL1およびFL2は、5個の正常の白血球個体
群を識別するのに使われる。すなわち、好中球Nおよび好酸球EはRLSで識別
され、単核白血球MはRLSおよびDC量で識別される。また、リンパ球Lおよ
び好塩基球Bは、RLSおよびDC量によって1つのグループとしてまず識別さ
れ、そして、RF/DCによって分離される。芽細胞はFL1、FL2およびD
C量によって識別される。FL2/FL1の計算されたパラメータは、分類を容
易にする、基準に合わせられた直交図(orthogonal view)を提供する。未熟顆粒
球IGは、FL1およびFL2の両方のパラメータにおいてより低い蛍光レベル
への重要なシフトと、より高いDC量レベルへのシフトとを計測することによっ
て識別される。上述の正常および異常の白血球の全タイプは、総白血球個体群に
おけるパーセントおよび絶対濃度(LYMPH%、LYMPH#、MONO%、
MONO#、NEUT%、NEUT#、EO%、EO#、BASO%、BASO
#、IMMGRAN%、IMMGRAN#、BLAST%、BLAST#)とし
てレポートされる。白血球の絶対総数(WBC)もまたレポートされる。図22
を参照すると、白血球Wは、境界120によってFL1と同一であるとみなされ
る。赤血球および血小板RPは、境界122によってFL1と同一であるとみな
される。有核赤血球NRBCおよび非生存白血球は、境界120、122によっ
てFL1と同一であるとみなされ、FL1およびFL2の関数である境界124
によって分類される。有核赤血球NRBCは、白血球に対するパーセンテージ(
NRBC%)として、および絶対濃度(NRBC#)としてレポートされる。非
生存白血球126が存在しない場合は、ぜい弱な白血球(Fragile White Cell )
に関する分子濃度(Fraction percentage)および絶対濃度(FWCF%、FWC
F#)としてレポートされ、絶対白血球数(WBC)がそれにしたがって調整さ
れる。
しくはそれより多い白血球個体群をさらに分析する方法について説明する。この
例では、リンパ球は、CD3、CD4およびCD8を含む単一クローン抗体のカ
クテルでラベル付けされるが、各抗体は、表2で示すような種々の蛍光色素が結
合されている。図2を参照すると、34マイクロリットルのアリコートA3は、
サンプル準備ユニット14内の混合チャンバMC3に運ばれ、10マイクロリッ
トルの単一クローンの抗体カクテルと混ぜられ、30〜60秒間培養される。溶
解および消光は、例2の表1にしたがってサンプルに加えられる。計測ポンプM
P3は、ある分量のサンプルSTを、例1で述べた処理によってフローセルへ運
ぶのに使われる。そして、このサンプルは、例1のようにフローセルによって調
べられる。この例では、ラベル付けされたリンパ球の種々の蛍光色素は、例1お
よび2で述べたレーザのいずれかで励起される。この例の蛍光色素の構成は次の
とおりである。
合
す。クラスタ140は、CD4ポジティブリンパ球を含む。第2のクラスタ14
2はCD8ポジティブリンパ球を含む。第3のクラスタ144はCD4ポジティ
ブでもCD8ポジティブでもないリンパ球を含む。図12A〜BのVCS(Volu
me-Conductivity-Scatter:分量−伝導性−拡散)の分析を参照すると、リンパ
球個体群は、絶縁され、すなわち、ゲートが設けられ、免疫蛍光検査分析が実行
できるようにし、かつサブセットが分類されて列挙され、リンパ球に対するパー
センテージおよび絶対濃度を得る。HIVの進行および治療を記録するのに使わ
れるCD4絶対数は特に興味深いものである。
挙し、白血球をさらに区別し、そして、1つもしくはそれより多い蛍光色素で興
味のあるセルをラベル付けすることによって1つもしくはそれより多い白血球の
個体群をさらに分析するのに使われる。この例では、例1〜3で述べたサンプル
取調べを連続的に実行する間に、上記例1〜3で述べたサンプル準備が同時に(
すなわち、並行して)実行される。それゆえ、分析全体は、約60秒で実行され
る。3つのセルの取調べの結果は照合することができるが、しかし、関係付ける
ことはできない。すなわち、各取調べのいずれの結果も、他の2つの取調べの結
果には依存しない。解釈上のレポートは、3個の個別の取調べからの情報全てを
結合することによって得ることができ、これにより、分析された血液サンプルの
疑いのある異常についてのさらなる情報を得ることができる。
。しかし、種々の変形例および修正例が、本発明の精神および添付の請求項によ
って字義どおりに画定される範囲を逸脱することなく実行することができること
が理解できよう。
した斜視図である。
角度光拡散(medium angle light scatter)もしくはMALSと呼ばれる約10度
と約70度との間、(b)下方中域角度光拡散(lower medium angle light scat
ter)もしくはLMALSと呼ばれる約10度と約20度との間、(c)上方中域
角度光拡散(upper medium angle light scatter)もしくはUMALSと呼ばれる
約20度と約70度との間、(d)名目上は直交(orthogonal)であり、側方拡散
(side-scatter)もしくはSSと呼ばれる約80度と約100度との間、である。
同様に、セルの蛍光染料は、離散的な多数の波長範囲F1、F2およびF3内で
好適には測定されるが、この範囲は、興味のあるセルをラベル付けするのに使わ
れる染料および蛍光色素の各蛍光発散スペクトルによって決定される。それゆえ
、以下に記述する実施例においては、VおよびCに、4つの光拡散および3つの
蛍光の測定を+した異なる9個の測定が、各セルもしくは血小板に対して同時に
なされる。明らかに、光拡散測定値の数は、所望のとおり増加させることができ
、また、興味のあるセルにラベル付けするのに使われる染料および蛍光色素によ
って発せられる蛍光スペクトルの数に対応して光検出器の数を増加させることに
よって、蛍光測定の数を(常識の範囲内で)増加させることができる。V、Cお
よびSパラメータについての議論は、例えば回転光拡散(rotated light scatter
: RLS)および非透過性(RF/DCすなわちC/V)など、ここで述べた他の
様々なパラメータと共に、C.RodriguezおよびW.Coulterに
対して付与された、共通に譲渡された米国特許第5,125,737号において見ること
ができる。各トランスジューサの出力V、C、SおよびFは分析器20に供給さ
れるが、分析器20は、プログラムされたアルゴリズムに基づいて、サンプル内
の種々のセルのタイプおよびサブセットを区別し列挙し、様々な血液およびセル
のパラメータ、例えばHgb、Hct、MCVなどを判定し、そしてレポートR
を提供よう動作する。マルチパラメトリックトランスジューサ18は、4つのセ
ルパラメータを同時に測定するので、また、正確に計測された分量のサンプルが
トランスジューサを通過するので、従来のセル分析システム全てにおいて必要と
されているような、複数のトランスジューサの各出力を関係付ける必要はなく、
したがって、分析器の精度はさらに拡大する。また、単一のセルに対して4個の
パラメータを同時に測定することによって、各セルについての4パラメータ多次
元分析が可能となり、それによってより正確な(あいまいではない)セルのタイ
プの判定が可能となる。
図3〜5に示すように、興味のある選択されたセルによって運ばれた蛍光物質を
励起する波長を有するRビームBを放射するレーザ42のようなものと、セルが
通過させられる位置における取調べゾーンZ内に位置する、楕円形状のくびれ6
4にレーザビームの焦点を合わせるレンズ62と、を備える。適切なレーザ源は
、488ナノメートルを発する連続波アルゴンレーザと、532ナノメートルを
発するダイオードポンプソリッドステートレーザと、である。楕円くびれ64の
好適な1/e2のディメンジョンは、約10×100マイクロメートルであり、
小さい方のディメンジョンは、サンプルが流れる方向、すなわち軸Aに沿った方
向である。照射されたセルによって拡散される放射は、取調べゾーン内で、2つ
の光拡散検出器ユニットLDS1およびLDS2によって検出される。LDS1
は、ビームBの軸に関してほぼ法線方向(すなわち、約90度±10度)に拡散
する光を検出するような位置にあり、LDS2は、約10度と70度との間(M
ALS)の角度範囲内で前方面に拡散される光を検出するような位置に置かれ、
また、そのように構成される。LDS1は好適には焦点レンズ65を備え、この
焦点レンズ65は、側方拡散光をピンダイオード66のようなものに焦点を合わ
せるように動作する。これは、側面に拡散する放射を集め、プリアンプPを介し
て図1の分析器20へLS90パルス信号を出力する。MALS光拡散検出器L
DS2は、図7に詳細を示すが、上方中域角度光拡散(UMALS)領域78お
よび下方中域角度光拡散(LMALS)領域80の2つの光感知領域を有する。
上述のように、UMALS領域は、20〜70度の間の角度領域で拡散する光を
検出するようになっており、また、LMALS領域は、10〜20度の間の角度
領域で拡散する光を検出するようになっている。蝶ネクタイの形状をしたマスク
82は、拡散しないレーザ光および10度より小さい範囲で拡散する光が、LM
ALS領域に当たらないようにする。マスク82はまた、水平面付近で拡散もし
くは回折したどんな光も、UMALSおよびLMALS領域のどちらにも当たら
ないようにする。LDS2は、MALS、UMALSおよびLMALSパルス信
号を個別に生成するが、これらは適切なプリアンプPを介して分析器20へ出力
される。
CPOは、適切な波長で励起されたときに、付着した物質の分子構造によって決
まる波長で蛍光を発する異染性分子である。DNAおよびRNA(共に核酸であ
る)の両方を含むセルを着色するのに使われたとき、CPOは、セルのDNA含
有に付着したときはある波長(FL1)で蛍光を発し、セルのRNA含有に付着
したときは他の波長(FL2)で蛍光を発する。図2を参照すると、2マイクロ
リットルの全血液のアリコートA2は、サンプル準備ステーション14における
混合チャンバMC2に配送され、約2秒間で2ミリリットルの賦形薬と混合され
、希釈サンプルSDが生成される。サンプルSDの一部は、チャンバMC2から
真空(フローセルポート5に割り当てられている)によってくみ出され、このチ
ャンバとフローセルポートP2とを接続するラインに入れられ、それによってサ
ンプルでラインを予め装填する。計測ポンプMP2は、ステップモータで動作さ
せられ、10秒間、2マイクロリットル/秒の割合でフローセルへサンプルを進
める。この間、取調べゾーンを通過する全セルは、計数され、区別(すなわち、
タイプもしくはサブセットに関して特徴付けられる)される。このようにして、
正確な分量である20マイクロリットルのサンプルは、分析に付される。同時に
、計測ポンプMP4は、約8マイクロリットル/秒の割合でシース流体を配送す
る。ポートP1およびP4の領域の相違のために、サンプルおよびシース流体は
、同じレートでフローセルを通過する。混合および注入を含めた全潜伏期は、名
目上5.5秒であり、5〜15秒の動作範囲である。既に述べたように、V、C
、SおよびF測定値は、単一のマルチパラメトリックトランスジューサ18内で
全てのセルが作られており、測定データは、従来の手法で分析器20によって処
理され、レポートが生成されるが、このレポートは、赤血球および血小板の絶対
数、網状赤血球および網状の血小板の絶対および相対計数、赤血球および網状赤
血球の細胞性のヘモグロビン情報、上述のセルタイプの平均量、サンプルに対す
る全ヘモグロビンを含む、抽出されたパラメータを提供する。
ユニット14内の混合チャンバMC1に運ばれ、3.4マイクロリットルのCP
Oと30秒間混ぜられる。上の表を参照すると、そして、507マイクロリット
ルのエリトライズ(Erythrolyse)IIがCPOで着色された血液に加えられてさ
らに5.3秒間混ぜられ、その間、200マイクロリットルのスタビライズ(Sta
bilyse)がさらに8.5秒間続けて混ぜられる。
を通過させ、例1で説明した手順を使って、40マイクロリットルの分量のサン
プルSL内の全セルが調べられる。既に述べたように、V、C、SおよびFの測
定は、サンプルの全てのセルから得られ、これらの測定は、分析器20によって
処理され、通常の5種類の白血球のタイプおよび絶対的および相対的な濃度およ
び少なくとも1つの異常なセルのタイプについてのリポートを作成するが、これ
らは、有核赤血球(NRBC)、芽細胞および未熟細胞を含むが、これに限定さ
れるわけではない。CPOは、488ナノメートルのアルゴンイオンレーザもし
くは532ナノメートルで動作するダイオードポンプソリッドステートレーザで
励起することができるが、これはこの例に関しては好適な励起である。蛍光検出
システムFDは、DNAに対して染色相互作用に原始的に反応する575マイク
ロメートル(FL1)、および、RNAに対して染色相互作用に原始的に反応す
る675マイクロメートル(FL2)の放射を受けるように設定される。
Claims (29)
- 【請求項1】 全血液サンプル内の血球の種々のタイプを区別し列挙する装
置であって、 (a) 血球が逐次流れることができるセル取調べゾーンを画定する単一のフロ
ーセルと、 (b) 容器から血液全体のサンプルを吸引する手段と、 (c) 前記吸引された全血液サンプルの少なくとも第1のアリコートを配送す
る手段と、 (d) 全血液の前記第1のアリコートを溶解試薬に注入し、主として白血球お
よび有核赤血球を含む溶解サンプルを生成する手段と、 (e) 前記溶解サンプルに含まれる1つもしくはそれより多いセルのサブセッ
トを蛍光物質に注入し、それによって前記セルのサブセットを前記蛍光物質でラ
ベル付けする手段と、 (f) 計測された分量の前記溶解サンプルを配送する計測手段と、 (g) 計測された前記分量の溶解サンプルを前記フローセルの前記セル取調べ
ゾーン中に流し、計測された前記分量の血球が前記セル取調べゾーン中を逐次流
れるようにする手段と、 (h) (a)それぞれが、(i)前記ゾーン中の前記DC電流を前記セルの分
量の関数で変調し、(ii)前記ゾーン中の前記RF電流を前記セルの内部伝導
率の関数で変調する血球が、前記セル取調べゾーン中を流れている間、同時にD
CおよびRF電流が前記セル取調べゾーン中を流れるようにし、(b)前記DC
およびRF電流の変調を検出する回路手段と、 (i) サンプルの流れる方向に垂直な軸に沿って伝播する放射のビームを、前
記セル取調べゾーン中を流れる個々の血球に照射する光学手段であって、前記放
射により前記蛍光物質が蛍光を発するようにする手段と、 (j) 前記ゾーン内の照射された血球から拡散した放射を検出する放射拡散検
出手段と、 (k) 前記光学手段によって照射された結果、蛍光物質でラベル付けされたセ
ルのサブセットから蛍光を発する放射を検出する蛍光検出手段と、 (l) 前記回路手段に、ならびに、それぞれ前記放射拡散手段および蛍光検出
手段に、動作可能に結合される分析手段であって、それぞれDC量(V)、RF
伝導率(C)、光拡散(S)、蛍光(F)の特性に基づいて、白血球および蛍光
物質でラベル付けされたセルの種々のサブセットの各濃度を区別し判定する手段
と、を備える装置。 - 【請求項2】 前記配送する手段は、吸引された前記全血液サンプルの少な
くとも第2のアリコートを配送し、また、前記装置は、 (m) 全血液の前記第2のアリコートを賦形薬に注入して、主として赤血球お
よび血小板を含む希釈サンプルを生成する手段と、 (n) 前記希釈サンプルを蛍光物質に注入し、それによって、少なくとも1つ
の選択された赤血球もしくは血小板のサブセットが、当該蛍光物質でラベル付け
される手段と、 (o) 計測された分量の前記希釈サンプルを配送し、計測された前記分量の前
記希釈サンプルを前記フローセルの前記セル取調べゾーン中に流し、この計測さ
れた分量の血球が前記セル取調べゾーン中を逐次流れるようにする手段と、をさ
らに備え、 前記分析手段は、それぞれDC量、RF伝導率、光拡散および蛍光の特性に基
づいて、赤血球および血小板の種々のサブセットのそれぞれの濃度を区別し判定
する請求項1に記載の装置。 - 【請求項3】 前記分析手段は、5個の異なる成熟白血球のサブセットを、
それらそれぞれのDC量(V)、RF伝導率(C)、光拡散(S)および蛍光(
F)の特性の組合せを分析することによって区別する請求項1に記載の装置。 - 【請求項4】 前記分析手段は、異常、未成熟、および成熟の白血球のサブ
セットを、それらそれぞれのDC量(V)、RF伝導率(C)、光拡散(S)お
よび蛍光(F)の特性に基づいて区別する請求項1に記載の装置。 - 【請求項5】 方形プリズム形状であり、かつ、前記サンプル内に形成され
た物体が一度に1つ通過することができる経路を画定する光学的透過性要素であ
って、前記経路は、各辺がおよそ50マイクロメートルである実質的に正方形の
、サンプルが流れる方向に垂直な横断面と、サンプルが流れる方向で計測したと
きおよそ65マイクロメートルの長さと、を有するセル取調べゾーンを画定する
光学的透過性要素を、前記フローセルは備える請求項1に記載の装置。 - 【請求項6】 前記フローセルは、電気エネルギー源に接続可能な電極のペ
アと、光学要素であって、前記セル取調べゾーン内で発している放射を外部の光
検出器へ前記光学要素を通じて光学的に結合することができる光学要素と、を支
持する請求項5に記載の装置。 - 【請求項7】 前記分析手段は、計測された前記分量の前記希釈サンプル内
の赤血球の絶対数を提供し、計測された前記分量の前記溶解サンプル内の白血球
の絶対数を提供する前記回路手段に応答する請求項2に記載の装置。 - 【請求項8】 前記放射拡散検出手段は、前記軸に対して10〜70度の間
の角度範囲内で拡散された放射を検出する第1の光検出器を備える請求項1に記
載の装置。 - 【請求項9】 前記第1の光検出器は、さらに、前記軸に対して、(a)約
10〜約20度の間、および(b)約20〜約70度の間、の角度範囲内で拡散
された放射を検出する請求項8に記載の装置。 - 【請求項10】 前記放射拡散検出手段は、前記軸に対して約90度の角度
で拡散された放射を検出する第2の光検出器を備える請求項1に記載の装置。 - 【請求項11】 全血液サンプル内の血球の種々のタイプを区別し列挙する
装置であって、該装置は、 (a) 血球が逐次流れることができるセル取調べゾーンを画定する単一のフロ
ーセルと、 (b) 容器から血液全体のサンプルを吸引する手段と、 (c) 前記吸引された全血液サンプルの少なくとも第1のアリコートを配送す
る手段と、 (d) 全血液の前記第1のアリコートを賦形薬に注入し、主として赤血球およ
び血小板を含む希釈サンプルを生成する手段と、 (e) 前記希釈サンプルに含まれる1つもしくはそれより多いセルのサブセッ
トを蛍光物質に注入し、それによって赤血球もしくは血小板の前記サブセットを
前記蛍光物質でラベル付けする手段と、 (f) 計測された分量の前記希釈サンプルを配送する計測手段と、 (g) 計測された前記分量の希釈サンプルを前記フローセルの前記セル取調べ
ゾーン中に流し、前記分量の血球が前記セル取調べゾーン中を逐次流れるように
する手段と、 (h) (a)それぞれが、(i)前記ゾーン中の前記DC電流を前記セルの分
量の関数で変調し、(ii)前記ゾーン中の前記RF電流を前記セルの内部伝導
率の関数で変調する前記血球のそれぞれが、前記セル取調べゾーン中を流れてい
る間、同時にDCおよびRF電流が前記セル取調べゾーン中を流れるようにし、
(b)前記DCおよびRF電流の変調を検出する回路手段と、 (i) サンプルの流れる方向に垂直な軸に沿って伝播する放射のビームを、前
記セル取調べゾーン中を流れる個々の血球に照射する光学手段であって、前記放
射により前記蛍光物質が蛍光を発するようにする手段と、 (j) 前記ゾーン内の照射された血球から拡散した放射を検出する放射拡散検
出手段であって、該放射拡散検出手段は、前記軸に対して測定された複数の離散
的な角度範囲内の拡散された放射を検出する手段と、 (k) 前記光学手段によって照射された結果、蛍光物質でラベル付けされたセ
ルのサブセットから蛍光を発する放射を検出する蛍光検出手段と、 (l) 前記回路手段に、ならびに、それぞれ前記放射拡散手段および蛍光検出
手段に、動作可能に結合される分析手段であって、赤血球および血小板の種々の
サブセットの各濃度を、それらそれぞれのDC量、RF伝導率、光拡散、蛍光の
特性に基づいて区別し判定する手段と、を備える装置。 - 【請求項12】 方形プリズムの形状であり、かつ、前記サンプル内に形成
された物体が一度に1つ通過することができる経路を画定する光学的透過性要素
であって、前記経路は、各辺がおよそ50マイクロメートルである実質的に正方
形の、サンプルが流れる方向に垂直な横断面と、サンプルが流れる方向で測定し
たときおよそ65マイクロメートルの長さと、を有するセル取調べゾーンを画定
する光学的透過性要素を、前記フローセルは備える請求項11に記載の装置。 - 【請求項13】 全血液サンプル内のセルの種々のタイプおよびその各サブ
セットの各濃度を判定する自動化された方法であって、 (a) トランスジューサ内の取調べゾーンを逐次通過する血球の各DC量(V
)、RF伝導率(C)、光拡散(S)および蛍光(F)の特性を同時に計測する
単一の前記トランスジューサを有するフローセル装置を提供するステップと、 (b) 容器から血液全体のサンプルを吸引するステップと、 (c) 前記吸引された全血液サンプルの第1および第2のアリコートを配送す
るステップと、 (d) 全血液の前記第1のアリコートを溶解試薬に注入し、主として白血球の
溶解サンプルを生成する手段と、 (e) 全血液の前記第2のアリコートを賦形薬に注入し、希釈サンプルを生成
するステップと、 (f) 前記希釈サンプルもしくは溶解サンプルに含まれる1つもしくはそれよ
り多いセルのサブセットを蛍光物質に注入し、それによって前記セルのサブセッ
トを前記蛍光物質でラベル付けするステップであって、前記蛍光物質は、所定の
波長の放射にさらされたときに蛍光を発するステップと、 (g) 計測された分量の前記溶解サンプルおよび希釈サンプルを配送し、それ
ぞれ計測された分量の前記溶解サンプルおよび希釈サンプルが前記取調べゾーン
中を流れるようにするステップであって、前記計測された分量内の各前記血球が
前記取調べゾーン中を逐次流れるステップと、 (h) DCおよびRF電流が前記取調べゾーン中を流れている間、軸に沿って
伝播する前記波長の放射のビームを前記取調べゾーン中を流れる個々の血球に照
射するステップであって、前記血球のそれぞれが、前記セル取調べゾーン中を流
れている間、(i)前記ゾーン中の前記DC電流を前記セルの分量の関数で変調
し、(ii)前記ゾーン中の前記RF電流を前記セルの内部伝導率の関数で変調
するステップと、 (i) 前記取調べゾーン内の照射された血球から発せられた蛍光によって拡散
した放射を検出している間において、前記DCおよびRF電流の変調を検出する
ステップと、 (j) 各セルのDC量(V)、RF伝導率(C)および光拡散(S)の特性に
基づいて、前記溶解サンプル内の異常、未熟およびは成熟白血球を区別し計数す
るステップと、 (k)各セルのDC量(V)、RF伝導率(C)および光拡散(S)の特性に基
づいて、前記希釈サンプル内の赤血球および血小板を区別し計数するステップと
、を備える方法。 - 【請求項14】 (l) 全血液の第3のアリコートを配送して、この第3
のアリコートを、前記第3のアリコート内の少なくとも1つ選択されたサブセッ
トのセルに特有の単一クローンの抗体に結合される蛍光色素を含む試薬に注入す
るステップであって、これによって、前記選択されたサブセットのセルが当該蛍
光色素でラベル付けされるステップと、(m)このサブセットのV、C、Sおよ
びFに基づいてこの選択されたサブセットを区別し計数するステップと、をさら
に備える請求項13に記載の方法。 - 【請求項15】 前記溶解サンプル内の有核赤血球、芽細胞および未熟セル
を、そのセルの各光拡散特性および蛍光に基づいて区別し計数するステップをさ
らに備える請求項13に記載の方法。 - 【請求項16】 前記溶解サンプル内の有核赤血球、芽細胞および未熟セル
を、そのセルの各光拡散特性およびDC量に基づいて区別し識別するステップを
さらに備える請求項13に記載の方法。 - 【請求項17】 前記溶解試薬は、前記蛍光物質を含む請求項13に記載の
方法。 - 【請求項18】 前記蛍光物質はCPOを備える請求項17に記載の方法。
- 【請求項19】 前記賦形薬は、前記蛍光物質を含む請求項13に記載の方
法。 - 【請求項20】 前記蛍光物質を前記溶解試薬へ注入する前に、前記第1の
アリコートは、前記蛍光物質が注入される請求項13に記載の方法。 - 【請求項21】 前記蛍光物質はCPOである請求項20に記載の方法。
- 【請求項22】 全血液サンプル内のセルの種々のタイプおよびその各サブ
セットの各濃度を判定する自動化された方法であって、 (a) トランスジューサ内の取調べゾーンを逐次通過する血球の各DC量、R
F伝導率、光拡散および蛍光の特性を同時に計測する単一の前記トランスジュー
サを有するフローセル装置を提供するステップと、 (b) 容器から血液全体のサンプルを吸引するステップと、 (c) 前記吸引された全血液サンプルのアリコートを配送するステップと、 (d) 全血液の前記アリコートを溶解試薬に注入し、主として白血球の溶解サ
ンプルを生成する手段と、 (e) 前記溶解サンプルに含まれる1つもしくはそれより多いセルのサブセッ
トを蛍光物質に注入し、それによって前記セルのサブセットを前記蛍光物質でラ
ベル付けするステップであって、前記蛍光物質は、所定の波長の放射にさらされ
たときに蛍光を発するステップと、 (f) 計測された分量の前記溶解サンプルを配送し、計測された前記分量の前
記溶解サンプルが前記取調べゾーン中を連続的に流れるようにするステップであ
って、計測された前記分量内の各前記血球が前記取調べゾーン中を逐次流れるこ
とになるステップと、 (g) DCおよびRF電流が前記取調べゾーン中を流れている間、軸に沿って
伝播する前記波長の放射のビームを前記取調べゾーン中を流れる個々の血球に照
射するステップであって、前記血球のそれぞれが、前記セル取調べゾーン中を流
れている間、(i)前記ゾーン中の前記DC電流を前記セルの分量の関数で変調
し、(ii)前記ゾーン中の前記RF電流を前記セルの内部伝導率の関数で変調
するステップと、 (h) 前記取調べゾーン内の照射された血球から発せられた蛍光によって拡散
した放射を検出している間において、前記DCおよびRF電流の変調を検出する
ステップと、 (i) 各セルのDC量(V)、RF伝導率(C)および光拡散(S)の特性に
基づいて、前記溶解サンプル内の成熟白血球のサブセットを区別し計数するステ
ップと、 (j) 各セルのDC量(V)、RF伝導率(C)、蛍光(F)および光拡散(
S)の特性に基づいて、蛍光物質でラベル付けされた白血球のサブセットを区別
し計数するステップと、を備える方法。 - 【請求項23】 全血液サンプル内のセルの種々のタイプおよびその各サブ
セットの各濃度を判定する自動化された方法であって、 (a) トランスジューサ内の取調べゾーンを逐次通過する血球の各DC量、R
F伝導率、光拡散および蛍光の特性を同時に計測する単一の前記トランスジュー
サを有するフローセル装置を提供するステップと、 (b) 容器から血液全体のサンプルを吸引するステップと、 (c) 前記吸引された全血液サンプルのアリコートを配送するステップと、 (d) 全血液の前記アリコートを賦形薬に注入し、主として赤血球、白血球お
よび血小板の希釈サンプルを生成する手段と、 (e) 前記希釈サンプルに含まれる1つもしくはそれより多いセルのサブセッ
トを蛍光物質に注入し、それによって前記セルのサブセットを前記蛍光物質でラ
ベル付けするステップであって、前記蛍光物質は、所定の波長の放射にさらされ
たときに蛍光を発するステップと、 (f) 計測された分量の前記希釈サンプルを配送し、計測された前記分量の前
記希釈サンプルが前記取調べゾーン中を連続的に流れるようにするステップであ
って、計測された前記分量内の各前記血球が前記取調べゾーン中を逐次流れるこ
とになるステップと、 (g) DCおよびRF電流が前記取調べゾーン中を流れている間、軸に沿って
伝播する前記波長の放射のビームを前記取調べゾーン中を流れる個々の血球に照
射するステップであって、前記血球のそれぞれが、前記セル取調べゾーン中を流
れている間、(i)前記ゾーン中の前記DC電流を前記セルの分量の関数で変調
し、(ii)前記ゾーン中の前記RF電流を前記セルの内部伝導率の関数で変調
するステップと、 (h) 前記取調べゾーン内の照射された血球から発せられた蛍光によって拡散
した放射を検出している間において、前記DCおよびRF電流の変調を検出する
ステップと、 (i) 各セルのDC量(V)、RF伝導率(C)および光拡散(S)の特性に
基づいて、前記希釈サンプル内の赤血球、白血球および血小板を区別し計数する
ステップと、 (j) 各セルのDC量(V)、RF伝導率(C)、蛍光(F)および光拡散(
S)の特性に基づいて、蛍光物質でラベル付けされた赤血球、白血球および血小
板の種々のサブセットを区別し計数するステップと、を備える方法。 - 【請求項24】 前記賦形薬は、リン酸塩で緩和された生理的食塩水、コリ
フォスフィリンO(CPO)、ドデシル基βDマルトースおよびプロクリン30
0を備える請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 各赤血球のヘモグロビン含有量を、その各DC量および光
拡散特性に基づいて判断するステップをさらに備える請求項24に記載の方法。 - 【請求項26】 各網状赤血球のヘモグロビン含有量を、その各DC量、光
拡散および蛍光特性に基づいて分析するステップをさらに備える請求項24に記
載の方法。 - 【請求項27】 懸濁液内の個々の粒子を分析する電気光学フローセルであ
って、該フローセルは、方形プリズムの形状であり、かつ、前記サンプル内に形
成された物体が一度に1つ通過することができる経路を画定する光学的透過性要
素であって、前記経路は、各辺がおよそ50マイクロメートルである実質的に正
方形の、サンプルが流れる方向に垂直な横断面と、サンプルが流れる方向で測定
したときおよそ65マイクロメートルの長さと、を有するセル取調べゾーンを画
定する光学的透過性要素を備える電気光学フローセル。 - 【請求項28】 前記フローセルは、電気エネルギー源に接続可能な電極の
ペアと、光学要素であって、前記セル取調べゾーン内で発している放射を外部の
光検出器へ前記光学要素を通じて光学的に結合することができる光学要素と、を
支持する請求項27に記載の電気光学フローセル。 - 【請求項29】 前記電気光学フローセルは、複数種の血液が前記セル取調
べゾーンに向かって注入されるときに通る複数のポートを有するノズルであって
、前記ポートは、間隔が空けられ、互いに実質的に平行であるノズルを含む請求
項27に記載の電気光学フローセル。
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