JPH08510330A - 光散乱技術を使用した網赤血球分析方法と装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 赤血球溶血した赤血球細胞の生物検体の流れ（１４）が、レーザ光などのような焦点を結んだ光ビーム（２２）を通り通過する網赤血球分析方法と装置である。光検出器（２８）は、光ビーム（２２）軸に対し、光散乱光線（２６）を収集するように配置され、個々の細胞通過を示す光出力パルスを出力する。光および光と電子的に生成された出力パルスまたは信号を結合することにより、他の周知の細胞型から区別可能なように、網赤血球の決定と定量を行う。

Description

【発明の詳細な説明】 光散乱技術を使用した網赤血球分析方法と装置 技術分野 本発明は、一般に、粒子分析装置、特に、蛍光染色技術または材料を用いず、 光散乱技術を用いた個々の赤血球細胞型、主として網赤血球の選択、識別、分画 分類を行う方法と装置に関する。 背景技術 網赤血球は医学文献では、未熟赤血球（または核が抽出された脱核細胞）と定 義されており、この種の細胞は、全赤血球数中に通常、０．７〜２．２％の比率 で存在する。例えば、様々な形態の貧血または急性内部出血などのような疾患の 診断の特定を同定または支援しようとする場合、網赤血球の決定は医学的な重要 性がある。 人間の血液をスライドガラスの表面に塗抹する顕微鏡による視算検査は、網赤 血球決定方法として古くから広く用いられている方法である。この方法は、時間 を節約するが、実際の網赤血球数の計数を人間の眼に頼っており、しばしば網赤 血球数を誤って計測してしまうことが多く、その結果、誤診につながることも少 なくなかった。 顕微鏡を用いて網赤血球を決定する方法の１つは、Ｂｊｏｒｋｍａｎによる「 Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｒｅｔｉ ｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｃｏｕｎｔ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．＆ Ｌａｂ．ｉｎｖｅｓｔｉｇ ａｔｉｏｎ， ４３５〜４３６，１９５８に開示されている。ここで用いた方法は 、新しいメチレンブルーを用いて毛細血管血液を染色し、希釈液により赤血球細 胞を固定する方法を用いている。希釈溶液は硫酸中に希釈したチオシアン酸カリ ウムからなっている。固定プロセスは、赤血球細胞からのヘモグロビンの溶出が 伴う。ヘモグロビン数が減少すると、スライドガラスに塗抹した血液中の細胞を 顕微鏡で観察したときに、小網の決定を向上させる。 自動化された網赤血球数の計数装置も市販されているが、赤血球数決定の基礎 として蛍光を用いた場合周知の機器の使用の信頼性は一般的である。蛍光を用い る装置は、高価で、複雑で、メンテナンス費用も比較的高くつく。 網赤血球は、蛍光染色法と組み合わせたとき、フローサイトメータを用いて識 別と分類ができることはよく知られている。このような方法の１つには、９０° または大きな角度の光散乱と組み合わせた小さな角度の光散乱を用いる方法が含 まれる。 従来技術に関する文献、科学雑誌、および報告書では、光軸に対し、さまざま な角度位置で光散乱技術を用いて検体の照射と検査をする方法を図示、説明、お よび議論している。しかし、入手可能な文献の多くは、網赤血球の検出に蛍光、 蛍光技術、および化学的方法に頼っているのが現状である。 この従来技術の例には、染色した検体の網赤血球蛍光の強さを強め、同時に、 蛍光を測定したとき、Ｓ／Ｎ比を高めるため検体のバックグラウンド蛍光を低減 する染料を含む試薬について記載したＫｕｒｏｄａ他による米国特許番号４，９ ８５，１７４が含まれる。これは、黄色蛍光色素オーラミンＯを含む試薬によっ て達成される。 Ｇｅｒｓｈｍａｎ他による米国特許番号４，３２５，７０６には、塩基性蛍光 色素アクリジン・オレンジで全血液検体を処理する方法を記載しており、この方 法では、検体を狭い流体力学的集中領域 を持つ光学的フローサイトメータを通す。赤い蛍光光と出力散乱光が検出される 。閾値との比較に基づき、閾値レベルを発展させて、網赤血球から赤血球細胞を 分離する。 Ｌｅｅ他による米国特許番号４，８８３，８６７には、蛍光組成に関して記載 している。チアゾール・オレンジを用いることは、網赤血球の染色に効果的な染 料であることが分かっている。 発明の開示 本発明は、生物細胞検体中の細胞型を高速、高精度で自動的に分析と分離をす る新規かつ有用でこれまで自明でなかった生物細胞のカウント、測定、および分 画をする方法と装置を提供する。 概略的に言えば、本発明は、流体力学的に集中した粒子の流状になって溶血し た赤血球細胞の生物検体が、電磁放射ビーム、レーザ光などのような焦点を絞っ たビーム光を通過するようにした構造的な組み合わせを提供する。光検出器は、 光ビーム軸に対し適切に配置され、個々の細胞の通過を示す光出力パルスを送出 する。 流動経路中の電気的導電接点は、個々の細胞の検査結果として、さらに電気パ ルス出力を送出することができる。適切に配置した光レセプタは、光ビーム軸に 対し角度を付けて配置され、移動検体中の網赤血球を示す電気パルスを出力する 。適切な電子回路を用いて、光と電子的に生成された出力パルスまたは信号とを 、他の周知の細胞型から区別可能に網赤血球の特定および定量をすべく結合する ことができる。 本発明は、光散乱技術だけを用いておよびＣｏｕｌｔｅｒ型技術と組み合わせ て網赤血球を示すデータを発生する装置と方法に関係するものである。 さらに、本発明は、特に、情報またはレーザ光の軸に対しある角 度範囲でマスクしたレーザビームの出力領域に配置されているパルス発生アセン ブリから得たデータを用いた新しい装置と方法を提供する。 本発明の実施において、赤血球の分離（Ｌｙｓｉｎｇ）または「赤血球溶血」 試薬で処理された網赤血球は、フロー装置中で光散乱により分析され、低出力レ ーザを照射して、分離した網赤血球の小集団として赤血球の検出と計数を行う。 効果は、例えば、１０°の小さな前方角から約１８０°を含む角度までの広範 囲の光散乱角内で明白である。分析に好ましい角度は、約２０°〜６５°の範囲 である。 Ｃｏｕｌｔｅｒ容積またはＤＣとして知られる低周波開口インピーダンスは、 全赤血球細胞の識別とカウントをするため、また他の細胞型から網赤血球を分離 するため、さらに、平均網赤血球量を得るため、同時に検知できる。 高周波または無線周波開口インピーダンスは、同時に検知して他の細胞型から 網赤血球を識別できる。 図面の簡単な説明 本発明の好適な実施例は、例と、この明細書に添付した図面を用いて説明する 。 図１は、理想化して表現した血球計数フローセルとこれに動作上関連する光検 出器アセンブリを含む構成を示す図である。 図１Ａは、信号受信領域を示す、本発明を用いた光検出器アセンブリの正面図 （一定の尺度ではないが）を示す図である。 図２は、本発明を実現する装置と演算電子回路を示すシステム・ブロック図で ある。 図３Ａ〜３Ｃは、本発明により網赤血球の分画と計数をする３つ の方法を示すフローチャートである。 図４Ａ〜４Ｄは、網赤血球を含む血液検体の染色および赤血球溶血の効果を示 すデータプロットである。 図５Ａ〜５Ｄは、網血球を含む血液検体についてさまざまな光散乱角で得られ た結果を示すデータプロットである。 図６Ａ〜６Ｃと７Ａ〜７Ｇは、光または光と電子的な検知技術を用いた自動集 団分類方法で得られた網赤血球分析報告を示すデータプロットである。 図８Ａ〜８Ｃ、９Ａ〜９Ｃ、１０Ａ〜１０Ｃ、および１１Ａ〜１１Ｃは、網赤 血球の０．０％〜約３０％までの広範囲にわたり多くの臨床的な人間の血液検体 体について網赤血球分析報告を示すデータプロットである。 図１２は、本発明により得た網赤血球の比率対基準方法によって得た網赤血球 の比率のプロットを示す図である。 発明の実施態様 多くの図とこの明細書中を通し、本発明により得た結果を得るため、および／ または説明するためいくつの名称と略語を用いる。 「ヒストグラム」は、単一変数に関する周波数分布のグラフであり、Ｘ軸上に プロットされた変数とＹ軸上に「＃」としてプロットされた周波数の２次元線グ ラフとして表示され、また、ヒストグラムは、コンピュータ、あるいは、ある形 態の電子回路内にグラフとして表現された抽象的な数値表としても定義されてい る。 「マトリックス」は、Ｘ軸上にプロットされた１変数を持つ３次元等高線グラ フとして表示された２つの独立変数、Ｙ軸上にプロットされた第２変数、および 等カウント等高線として表示された周波数またはカウントの周波数分布グラフと して定義されている。明確 にするため、１つの等カウント等高線だけを表示して外形を示す。また、マトリ ックスは、コンピュータ内に、あるいは、ある形態の電子回路として表現された 抽象的な数値表としても定義されている。この明細書中でマトリックスを説明す るときは、Ｘ軸変数を最初に記載し、次にＹ軸変数を記載する。 「パラメータ」は、独立変数の同義語であり、以降の明細書中で述べているよ うに本発明では、粒子分析器またはフローサイトメータで分析された細胞から得 られた任意の同時的かつ独立測定に関する。ある数学的関数の２つまたはそれ以 上の組み合わせは、別のパラメータを生成すると定義される。 「ゲーティング」は、フィルタ・プロセスとして定義され、１つまたはそれ以 上の他のパラメータの検査中に、複数パラメータ・データから、１パラメータの ヒストグラムを作成するのに用いたものである。フローセルを通過する１赤血球 細胞の通過およびパラメータ・トランスデューサによる細胞測定の各イベントに 対し、ゲーティングに用いられている各パラメータに対応する値または測定は、 １つ、または２つの基準値あるいは閾値と比較され、閾値以下か、閾値以上か、 または２つの閾値の中間にあるのか「テスト」される。もし、このテストにより 、考量中の全ゲーティング・パラメータに対して正しい結果が得られるなら、イ ベントはヒストグラムに含まれている。ゲーティングはまたマトリックスの作成 にも用いることができる。従って、ゲーティングを用いることにより、分析と複 数パラメータ・データのグラフィック表示とを単純化することが可能である。 「光検出器」は、光を収集し、光検出器で受光した光量に比例して電流を発生 する真空または固体の任意の種類のデバイスに関する。 「ビームダンプ」は、一般に、レーザビームとフローセル間の交差の結果、光 検出器を横切る水平ラインとして現れる不要なレーザ光を除去する障害物として 定義されており、もし、不要なレーザ光を遮断しないと検出した光散乱信号の品 質が低下する。 「マスク」は、不要な小さな角度の光散乱情報を除去し光検出器によるこの情 報の受信を防ぐ、円形または楕円形状の障害物として定義されている。 「ＤＣ」と「ＲＦ」は、開口インピーダンス細胞検知のＣｏｕｌｔｅｒ原理に 関する電子的な検知パラメータである。「ＤＣ」は、細胞膜を透過しないで、細 胞を電流が流れないように、直接または低周波電流を印加して得られたパルス・ ピーク情報として定義されている。ＤＣパルスのピーク振幅は細胞容積の関数で ある。 「ＲＦ」は、細胞膜が短絡して、細胞に電流が流れるごとき高周波電流を印加 して得られた測定から得たパルス・ピーク情報として定義されている。ＲＦは細 胞容積と内部導電率の関数である。 「不透明」は、すべての個々の細胞測定、あるいはイベントに対する、ＤＣ信 号データによりＲＦ信号データを割って得た信号又はデータとして定義されてお り、細胞容積とは無関係であるが内部導電率の関数である新しい細胞パラメータ を生成する。 「ＬＭＡＬＳ」は、Ｌｏｗｅｒ Ｍｅｄｉａｎ Ａｎｇｌｅ Ｌｉｇｔｈ Ｓ ｃａｔｔｅｒの略であり、光ビーム軸、例えば、レーザビーム２２の軸３０から １０°〜２０°の角度範囲にわたって散乱した光検出器アセンブリ２８が受光し た光である。 「ＵＭＡＬＳ」は、Ｕｐｐｅｒ Ａｎｇｌｅ Ｌｉｇｔｈ Ｓｃａｔｔｅｒの 略であり、散乱した、または、光ビーム軸、例えば、レーザビーム２２の軸３０ から２０°〜６５°の角度範囲にわたり光検出器アセンブリ２８が受光した光で ある。 「ＲＡＬＳ」は、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ａｎｇｌｅ Ｌｉｇｔｈ Ｓｃａｔｔｅｒ の略であり、約１６０°〜１７６°の角度範囲にある光ビーム２２に対し、反対 方向に位置する光検出器アセンブリで受光した光である。 「ＳＡＬＳ」は、Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｇｌｅ Ｌｉｇｔｈ ｓｃａｔｔｅｒの 略であり、光ビーム軸から約９０°〜２０°の角度範囲に位置する光検出器アセ ンブリで受光した光である。 「ＲＬＳ」は、Ｒｏｔａｔｅｄ Ｌｉｇｔｈ Ｓｃａｔｔｅｒの略であり、Ｄ Ｃで割ったＵＭＡＬＳの対数である。 「ＲＥＴＩＣとＲＥＴＩＣ％」は、全赤血球数の比率として示された網赤血球 数を示す。 「ＲＥＦ ＲＥＴＩＣ」は、ＮＣＣＬＳ文書Ｈ−１６Ｐに記載された顕微鏡を 用いた方法論に従って得た基準網赤血球の比率である。 「ＲＢＣ」は、通常、カウント×１０⁶／μＬで示される絶対的赤血球数、ま たは赤血球数である。 「ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳ」は、通常、カウント×１０⁶／μＬで示される絶対的 網赤血球数を示す。 「ＭＲＶ」は、網赤血球集団の平均ＤＣ値を測定して得た平均網赤血球容積と して定義されている。 「ＲＭＩ」と「ＭＩ」は、全網赤血球数に対する高密度光散乱網赤血球数の比 率として定義された網赤血球の成熟指数を示す。 「ＬＳ」は、Ｌｉｇｔｈ Ｓｃａｔｔｅｒの略であり、一般に、特定角度また は角度範囲を指定しない任意の光散乱を示す。 「ＬＬＳ」は、「ＬＳ」の対数として定義されており、ＬＬＳの好ましい角度 または角度範囲はＬＯＧ ＵＭＡＬＳである。 「ＲＬＳ」は、ＬＬＳ、好ましくは、上述したようにＤＣで割っ たＬＯＧ ＵＭＡＬＳである。 「ＬＳＲ」は、Ｌｏｗ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｓｃａｔｔｅｒ Ｒｅｔｉｃｕ ｌｏｃｙｔｅｓの略である。 「ＨＳＲ」は、Ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｓｃａｔｔｅｒ Ｒｅｔｉｃ ｕｌｏｃｙｔｅｓの略である。ＬＳＲとＨＳＲに関するさらに詳しい説明は、本 明細書中の以下の節に記載されている。 以下の説明において、光散乱角は、開口または検知区画内の生物細胞から出力 される光の角度として定義されている。後述する光検出器アセンブリに衝突（入 射）する散乱光の角度は、検体、希釈液、および／または流体力学的シース流流 体、空気、フローセル材料の屈折率の差により、またスネルの法則で予測したよ うなフローセルの構成により、開口内の真の角度から離れるかもしれない。 図１は、本発明の方法とプロセスを用いる粒子分析装置の１形式の一部を示す 。図１の装置には、例えば、溶融シリカなどの光学的に透明な物質からなるフロ ーセル１０を含む。この例において、血球計数フローセル１０の内部は、生物細 胞検体がこの図には示されていない周知の方法により、流体力学的に集中した流 れ１４として通過、または流れる狭い、あるいはくびれた開口を除き、全体的に 楕円形状である。フローセル１０の外壁表面は、平坦な１側面部１８を除き楕円 形状である。 レーザ２０は、レンズ、または開口あるいは検知区画１２の小さな点にビーム ２２の焦点を結ぶレンズ系２４にコヒーレントな光ビーム２２を放射する。レー ザ２０は任意の種類または波長である。 さらに、本発明は、光源としてレーザだけに制限されていない。フローサイト メータ分析に必要な大きさのオーダの点に光を収束できるのであれば、アーク灯 などのような他の光源も用いることができる。この例において、レーザ２０は、 ６３２．８ｎｍで放射する ０．８ｍＷの比較的低電力のヘリウム・ネオンレーザを用いている。レンズ系２ ４は、フローセル１０の開口１２内に水平に配置された細長い点にレーザ光ビー ム２２の焦点を結ぶように設計されている２つのクロス・シリンドリカル（ｃｒ ｏｓｓ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ）レンズを備えている。レーザビーム２２のこ のような光学的形状により、細胞や粒子がフローセル１０を流れると、細胞また は粒子位置への装置の感度を低くし、放射がより一様になり、同じ細胞や粒子へ の光散乱レベルがより一様になる。 生物細胞が、流体力学的に集中した流れ１４を流れると、生物細胞は個々に開 口１２と焦点を絞った光ビーム２２を通過し、図で点線で示されている光散乱光 線２６を放射する。光検出器アセンブリ２８は、光散乱放射レセプタとして動作 し、光を放射し、軸３０に集中するレーザ光の軸３０に直交する平面に位置して 、光散乱光線２６を収集する。 図１は、光検出器アセンブリ２８の斜視図を示す。図１Ａは、同じ光検出器ア センブリ２８の正平面図を示す。以下の説明は図１と１Ａに関するものである。 光検出器アセンブリ２８は、検出器３２の正面に位置し、平行に配置されている 光起電力検出器３２、ビームダンプ３４と、検出器３２の正面に置かれ、水平に 配置されているマスク３６との組み合わせを含む。マスク３６は、ビームダンプ ３４の中心に配置された円形または楕円形状の構造である。マスク３６は、レー ザ光ビーム軸３０と同軸に向き付けられている。 水平ビームダンプ３４は、中心よりその外端が大きいまたは広い蝶ネクタイ状 の形状をとりえる。水平ビームダンプ３４は、水平方向に引伸しあるいは平坦に して、細胞や粒子がフローセル１０を流れたとき、細胞または粒子位置に対する 装置の感度を低く抑えるため、レーザビームの形状を成形する状態に光学系を適 合させるのに 用いている。このような光学的形状の採用により、光散乱信号出力を電子的に用 いるため、より一様な光出力信号を出力する。 図１と１Ａにおいて、光検出器３２は、円形帯４２によって２つの区画３８、 ４０に分割されている。光検出器３２の大きさ、区画３８と４０の大きさ、マス ク３６の大きさの結果として、およびフローセル１０に対する光検出器アセンブ リ２８の距離の結果として、内部区画３８は、約１０°〜２０°の角度範囲で散 乱したＬＭＡＬＳ光を受光する。外部区画４０は、２０°〜６５°の角度範囲で 散乱したＵＭＡＬＳ光を受光する。 この説明のため、赤血球細胞は、図１に示すフローセル１０の開口１２を通っ て１つずつ通過すると見なされる。赤血球細胞または他の粒子がどのようにして フローセル１０に入るのか、また細胞の複数パラメータ・データをどのようにし て得て、分類、処理するのかという方法に関する装置の詳しい全体な説明は、共 有の米国特許番号５，１２５，７３７に記載されている。 図２は、本発明を実現する粒子分析装置、またはフローサイトメータのブロッ ク図を示しており、この図には図１と図１Ａおよび上述した構成要素を含む。レ ーザ２０は、開口またはフローサイトメータ１０の検知区画１２の小さな点にビ ーム２２の焦点を結ぶレンズまたはレンズ系２４に、コヒーレントなビーム２２ を放射する。ビーム２２は血球計数フローセル１０を透過して、光検出器アセン ブリ２８のマスク３６とビームダンプ３４に衝突（入射）する。希釈液中の赤血 球細胞は、ライン４４を通ってフローセル１０に入り、検体導入管４６を通って 流れる。シース流体４８は、細胞５０を流体力学的に集中させられ、開口１２を 個々に通過させる。細胞が開口１２から放出された後、第２シース５２は、その 細胞を検体出力管５４と廃棄室５６に導く。細胞５０が開口１２にあって、焦点 を絞ったレーザビーム２２で照射されたとき、細胞は多方向に光を散乱する。い くつかの光散乱光線５８、６０、６２、および６４が点線で図に示されている。 光検出器アセンブリ２８の光検出器３２は、２つの区画３８と４０を含む。２ つの区画３８と４０の角度範囲は、光検出器３２の大きさ、フローセル１０に対 する光検出器３２の距離と位置、およびマスク３６の直径によって決定される。 内部区画３８は、約１０°〜２０°の角度範囲で散乱したＬＭＡＬＳ光線５８を 収集し、ＬＭＡＬＳパルス６８を出力するプリアンプ６６に供給される信号を生 成する。外部区画４０は、約２０°〜６５°の角度範囲で散乱されたＵＭＡＬＳ 光線を収集し、ＵＭＡＬＳパルス７２を出力するプリアンプ７０に供給される信 号を生成する。光検出器・7４は、レーザビーム２２の軸３０に垂直に配置され （図の平面に垂直）、約９０°〜２０°の角度範囲で散乱されたＳＡＬＳ光線６ ２を収集し、ＳＡＬＳパルス７８を出力するプリアンプ７６に供給される信号を 生成する。光検出器対８０は、レーザビーム２２の周囲に対称的に配置され、レ ーザビーム２２に対し反対方向に散乱されたＲＡＬＳ光線６４を収集し、約１６ ０°〜１７６°の角度範囲でＲＡＬＳパルス８４を出力するプリアンプ８２に供 給される信号を生成する。 電子パルス発生装置８６は、ＲＦとＤＣ信号の電流発生源、検出、および増幅 手段を提供する。発振検出器８８からの無線周波電流とＤＣ発生源からの直流は 、結合回路９２で結合され、電極対９４と９６に供給される。電極９４と９６は 、周知の方法で開口１２の反対側のフローセル１０に位置している。電流はライ ン９８を介して結合され、開口１２を流れる電流を形成する。開口１２を横切る 粒子または細胞５０は、開口１２のインピーダンスを一時的に変化させ、開口を 通る電流のＲＦとＤＣ成分を変調する。ＲＦ電流の変 調はフィルタで除去され、結合回路９２を通って発振検出器８８に供給される。 発振検出器は、ＲＦパルス１０２を出力するＲＦプリアンプ１００へ、検出した パルスを供給する。 同時に、インピーダンスの変化による直流電流の変調は、フィルタで除去され 、結合回路９２を通ってＤＣプリアンプ１０４に供給され、ＤＣプリアンプから ＤＣパルス１０６を出力する。電子パルス発生装置８６の上述した説明は、好ま しい形態であり、「Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕ ｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅａｃｔａｎｃｅ ｏｆ ａ Ｐａｒｔｉｃｌｅ」と題された、共有者の米国特許番号４，７９１，３５ ５に詳細に記載されている。電子パルス発生装置８６には、実質的に同じ結果を もたらすことができる他の任意の設計を含むことができる。本発明のある実施例 では、ＤＣだけを用いてＲＦ電流を用いていないので、従って、これらの場合、 電子パルス発生装置８６は、ＤＣ発生源９０とＤＣプリアンプ１０４だけを含む 必要がある。 「パルス・プロセッサ」モジュール１０８、１１０、１１２、１１４、１１６ 、および１０８はそれぞれ、増幅器、ローパスフィルタ、ハイパスフィルタ、お よびベースライン・レストラを含む。「ピーク検出器」モジュール１２０、１２ ２、１２４、１２６、１２８、および１３０はそれぞれ、パルスピーク振幅に比 例している一定電圧「値」を供給する。対数増幅器（ログアンプ）モジュール１ ３２、１３４、１３６、および１３８は、切り換えて出力として、入力を対数変 換した、または変換しない線形入力を供給する回路である。アナログ／デジタル ・コンバータ（ＡＤＣ）１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１ ５２、および１５４は、さらなる処理のためコンピュータ１５６にデータを供給 する。 ＤＣパルス１０６は、パルス・プロセッサ１１０とピーク検出器１２２に供給 され、ＡＤＣ１４４に供給されるラインのＤＣ値を生成し、ＡＤＣ１４４は、デ ジタル化したパルス・ピーク値をコンピュータ１５６に供給する。ＲＦパルス１ ０２は、パルス・プロセッサ１０８とピーク検出器１２０に供給され、ＡＤＣ１ ４０に供給されるライン１６０のＲＦ値を生成し、ＡＤＣ１４０は、デジタル化 したパルス・ピーク値をコンピュータ１５６に供給する。デバイダ・モジュール １６２は、ＲＦ値をＤＣ値で割って、ＡＤＣ１４２に供給されるライン１６４の 不透明値を生成し、ＡＤＣ１４２は、デジタル化した値をコンピュータ１５６に 供給する。 ＵＭＡＬＳパルス７２は、パルス・プロセッサ１１２とピーク検出器１２４に 供給され、ログアンプ１３２を通ってＡＤＣ１４８に供給されるライン１６６の ＵＭＡＬＳ値を生成し、ＡＤＣ１４８は、デジタル化したパルス・ピーク値をコ ンピュータ１５６に供給する。デバイダ・モジュール１６８は、ログＵＭＡＬＳ 値をＤＣ値で割って、ＡＤＣ１４６に供給されるライン１７０のＲＬＳ値を生成 し、ＡＤＣｌ４６は、デジタル化した値をコンピュータ１５６に供給する。ＬＭ ＡＬＳパルス６８は、パルス・プロセッサ１１４とピーク検出器１２６に供給さ れ、ログアンプ１３４を通ってＡＤＣ１５０に供給されるライン１７２のＬＭＡ ＬＳ値を生成し、ＡＤＣ１５０は、デジタル化したパルス・ピーク値をコンピュ ータ１５６に供給する。ＳＡＬＳパルス７８は、パルス・プロセッサ１１６とピ ーク検出器１２８に供給され、ログアンプ１３６を通ってＡＤＣ１５２に供給さ れるライン１７４のＳＡＬＳ値を生成し、ＡＤＣ１５２は、デジタル化したパル ス・ピーク値をコンピュータ１５６に供給する。ＲＡＬＳパルス８４は、パルス ・プロセッサ１１８とピーク検出器１３０に供給され、ログアンプ１３８を通っ てＡＤＣ１５ ４に供給されるライン１７６のＲＡＬＳ値を生成し、ＡＤＣ１５４は、デジタル 化したパルス・ピーク値をコンピュータ１５６に供給する。 網赤血球の計数に用いた試薬装置は、赤血球細胞、チオシアン酸カリウム、お よび硫酸からなる網赤血球溶血液を含む。赤血球溶血液の機能は、赤血球細胞を 破裂させることなく、球状に効果的に膨張させ、赤血球細胞からヘモグロビンを 溶出させることである。さらに、赤血球溶血液は、固定特性を持っているので、 膨張して球状になった細胞をそのままの状態に保持する。 生網赤血球は、不規則な形状であり、０°〜９０°の角度範囲で光ビームに曝 したとき、フローサイトメータ中で予測し難い光散乱情報を生成する。球状に膨 張した赤血球細胞は、検体中の赤血球数を決定する基礎を形成する再生不能な光 散乱情報を生成する。 膨張した赤血球細胞からのヘモグロビンの除去は本発明の基本的な事柄である 。ヘモグロビン数を減少させると、小網の特定を向上させ、網赤血球の流動血球 計数を可能にする。 赤血球溶血プロセスは温度に影響されることが分かっている。特に、５５°Ｆ 以下の温度では赤血球溶血プロセスの進行が遅くなり、赤血球溶血プロセスが開 始するのに長い時間を要することが明らかになっている。その結果として、血液 検体を約３０秒の間約５５°〜９０°Ｆの温度で赤血球溶血液と混合することが 好ましい。 赤血球溶血液のＰＨは、約１．０〜３．０の範囲、好ましくは、１．０〜２． ０の範囲になければならない。さらに、酸性赤血球溶血液は、ヘモグロビンを溶 解して、赤血球細胞からのヘモグロビンの除去を容易にする。チオシアン酸カリ ウムを用いるとき、硫酸は混合して用いる好ましい酸であるとが知られている。 特に、硫酸のように作用しない他の酸としては、塩酸と硝酸を含む。チオシアン 酸カリウムの好ましい濃度は、約１．０〜６．０ｇ／１で、硫酸は約０．７〜３ ．０ｇ／１である。 赤血球溶血液の浸透圧は、迅速になるように制御しなければないが、赤血球細 胞の膨張は制御される。赤血球溶血液の浸透圧は、７５〜１１０ミリオスモル、 好ましくは８２〜１０５ミリオスモルの範囲にある。浸透圧により、赤血球細胞 を膨張させ、赤血球溶血液との混合液から３０秒間でヘモグロビンが溶出する。 もし、浸透圧が７５ミリオスモル以下である場合、赤血球細胞は、完全な細胞膜 を保持しないで崩壊する。特に、浸透圧が低いと赤血球細胞に損傷を与え、その 結果、網赤血球数の計数が信頼性のないものになる。もし、浸透圧が十分でない と、赤血球細胞は網赤血球の区別をしにくくするヘモグロビンを溶出しない。 本発明の好適な実施例において、赤血球溶血の前に網赤血球の染色を行う。網 赤血球染色の機能は、フローサイトメータの光散乱計数用の網赤血球の輪郭をよ りくっきりとさせることである。網赤血球染色は、網赤血球のリボ核酸（ＲＮＡ ）細胞内に沈澱する非蛍光染料である。適切な染料の例としては、新しいメチレ ン・ブルーとブリリアント・クレシル・ブルーが含まれる。網赤血球の測定に非 蛍光染料を用いると、蛍光染料を用いる他の成分の分析に血液検体を用いること ができるようになる。特に、網赤血球の計数に沈澱ＲＮＡ染料を用いると、適合 性のある蛍光染料を同じアッセイに用いて、網赤血球染色の蛍光を妨害すること なく、血液検体の他の成分を調べることができる。 好ましい網赤血球染料は、新しいメチレン・ブルーの水溶液からなる。水溶性 の新しいメチレン・ブルー溶液は、アルカリＰＨが約７．０〜８．０の範囲、好 ましくは７．０〜８．０の範囲である。水溶性の新しいメチレン・ブルー溶液は 、染色濃度が０．２〜２． ０ｇ／１、好ましくは、０．４〜１．２ｇ／１である。さらに、染色溶液の浸透 圧は、約１２０〜１６０ミリオスモルの範囲、好ましくは１３０〜１５０ミリオ スモルの範囲である。 高い温度では染色反応時間が短くなり、低い温度では長い染色時間を要するこ とが分かっている。反応の好ましい温度範囲は、６０°〜９０°Ｆの間である。 この温度範囲を用いれば、染料が赤血球細胞と十分に反応するのに必要とする時 間は、少なくとも５分である。 網赤血球の血液検体を分析する好適な方法では、抗凝固性の血液を用いる。使 用した抗凝固薬は、リン酸二水素カリウム塩、リン酸三水素カリウム塩、および 二ナトリウム塩などのようなＥＤＴＡ塩である。 細胞の染色は、血液検体のアルカリ度を上げ、染料混合液のＰＨを７．０〜７ ．５の範囲にすると向上することが分かっている。しかし、染色部位を指定する ことはできず、網赤血球の区別を向上させない。むしろ、染色は光散乱信号を高 いチャネルにオフセットする。 その上、網赤血球染色は、防腐剤として抗菌剤を含まなければならない。好ま しい抗菌剤は、プロピルパラベン、メチルパラベン、およびその混合剤である。 特に、好ましい抗菌剤は、０．３ｇ／１の濃度のポリピルパラベンと０．５ｇ／ １の濃度のメチルパラベンの混合剤である。 以下の染色試薬と赤血球溶血試薬の特殊な例は、図４〜１２に示す結果を得る のに用いている。 染色試薬 ＃１ Ｋ₃ ＥＤＴＡ １０ｇ／Ｌ 新しいメチレン・ブルー ０．６ｇ／Ｌ ＮａＣｌ ２ｇ／Ｌ 赤血球溶血試薬 ＃１ ＫＳＣＮ ３ｇ／Ｌ １Ｎ Ｈ₂ ＳＯ₄ ３０ｍＬ／Ｌ 図３Ａ〜３Ｃは、網赤血球の分類と計数をするための、血液検体の調合と分析 装置または方法の各種動作を示す。 図３Ａは、網赤血球の分類と計数を行う２つの方法または装置の動作をステッ プまたはフローチャートで示す。両動作において、ステップ１８０の全血液検体 は、赤血球溶血試薬１８２で処理される。赤血球溶血混合液は、ステップ１８４ で孵置され、ステップ１８０でフローサイトメータで分析される。第１オプショ ンにおいて、フローサイトメータからのデータは、ステップ１８８で少なくとも ＬＳを用いて分類され、ＲＥＴＩＣ％とＲＭＩを生成する。第２オプションにお いて、フローサイトメータからのデータは、ステップ１９０でＤＣを持つ少なく ともＬＳを用いて分類され、ＲＥＴＩＣ％、ＭＲＶおよびＲＭＩを生成する。両 オプションによって、ステップ１９２と１９４でＲＥＴＩＣ−ＡＢＳはＲＥＴＩ Ｃ％にＲＢＣを掛けて得られる。 図３Ｂは、網赤血球の分類と計数をする２つの他の方法または装置の動作を示 す。両動作において、全血液検体すなわち部分２００は、染色試薬２０２によっ て処理される。染色した血液混合液は、ステップ２０４でゆっくりと攪拌され、 ステップ２０６で孵置される。ステップ２０８の染色した血液混合液は、ステッ プ２１０で赤血球溶血試薬で処理される。赤血球溶血混合液はステップ２１２で 孵置され、ステップ２１４でフローサイトメータで分析される。再び、第１オプ ションとして、フローサイトメータからのデータは、ステップ２１６で少なくと もＬＳを用いて分類され、ＲＥＴＩＣ％とＲＭＩを生成する。第２オプションに おいて、フローサイトメータからのデータは、ステップ２１８でＤＣを持つ少な くともＬＳを 用いて分類され、ＲＥＴＩＣ％、ＭＲＶおよびＲＭＩを生成する。両オプション によって、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳは、ステップ２２０と２２２でＲＥＴＩＣ％にＲ ＢＣを掛けて得られる。 図３Ｃは、網赤血球の分類と計数をするさらに他の２つの方法または装置の動 作を示す。両方の場合において、ステップ３０の５０μＬの全血液をステップ２ ３２の１００μＬの染色試薬＃１ ２３２で処理する。染色した血液混合液をス テップ２３４で５秒間静かに攪拌して、ステップ２３６で５分間孵置する。ステ ップ２３８の染色した血液混合液の２μＬ部分を、ステップ２４０の２ｍＬの赤 血球溶血試薬＃１で処理する。赤血球溶血混合液をステップ２４２で３０秒間孵 置して、ステップ２４４にてフローサイトメータで分析する。第１オプションに おいて、ステップ２４６でフローサイトメータからのデータを少なくともＵＭＡ ＬＳを用いて分類し、ＲＥＴＩＣ％とＲＭＩを生成する。第２オプションにおい て、ステップ２４８でフローサイトメータからのデータは、ＤＣを持つ少なくと もＵＭＡＬＳを用いて分類して、ＲＥＴＩＣ％、ＭＲＶおよびＲＭＩを生成する 。両方のオプションによって、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳは、ＲＥＴＩＣ％にＲＢＣを 掛けて得られる。 図４Ａ〜４Ｄは、図２に示すような粒子分析器またはフローサイトメータで分 析された赤血球の染色および赤血球溶血の効果を示す。４つの図のそれぞれは、 マトリックス、すなわち染色試薬と赤血球溶血試薬をいろいろに組み合わせて調 合した、同じ全血液検体のＵＭＡＬＳ対ＤＣ（Ｘ軸のＬＯＧ ＵＭＡＬＳとＹ軸 のＤＣ）の２次元ドットプロットである。ＬＭＡＬＳ、ＳＡＬＳ、およびＲＡＬ Ｓなどのような他の光散乱角測定も用いることができるが、ＵＭＡＬＳが好まし い。図４Ａは、染色試薬または赤血球溶血試薬を含むどのような処理を施すこと なく、本発明の共有者により販売された 血液分析の希釈液として広く用いられている平衡電解溶液中に全血液検体を希釈 させて得られたデータ・パターンを示す。この溶液の いる。 図４Ａにおいて明らかなように、ＬＯＧ ＵＭＡＬＳで識別可能な１つの集団 ２６０だけがあり、一塊まりの成熟赤血球と網赤血球から構成される。図４Ｂは 、全血液検体を赤血球溶血試薬を用いないで、染色試薬だけを用いて得たデータ ・パターンを示す。図４Ｂのデータ・パターンは、ＬＯＧ ＵＭＡＬＳによって 識別されたように、成熟赤血球と網赤血球の１つの集団２６２を示す図４Ａのデ ータ・パターンに酷似している。図４Ｃは、全血液検体を染色試薬を用いないで 、赤血球溶血試薬でのみ処理して得たデータ・パターンを示し、網赤血球の集団 ２６４を右側に示す。すなわち成熟赤血球２６６より高いレベルのＬＯＧ ＵＭ ＡＬＳを示す。図４Ｃは、全血液検体を染色試薬と赤血球溶血試薬両方で処理し て得られたデータ・パターンであり、網赤血球の集団２６８を右側に示す。すな わち成熟赤血球２７０より高いレベルのＬＯＧ ＵＭＡＬＳと図４Ｃの網赤血球 集団２６４よりよく分離されたＬＯＧ ＵＭＡＬＳを示す。 図４Ａ〜４Ｄに示すデータとその説明から、蛍光を用いずに光散乱を用いて網 赤血球の識別と計数をする最少要件は、血液検体を赤血球溶血試薬で処理するこ とだと結論できる。また、血液検体を染色試薬と赤血球溶血試薬両方で処理する と、蛍光を用いずに光散乱を用いて網赤血球の識別と計数をする最適な構成が得 られると結論できる。 図５Ａ〜５Ｄは、染色試薬と赤血球溶血試薬で処理して、図２の粒子分析器ま たはフローサイトメータを用いさまざまな光散乱角で 分析して得た結果を示す。４つの図のそれぞれは、網赤血球集団２８０を成熟赤 血球集団２８２の右側に持つＸ軸の光散乱測定対Ｙ軸のＤＣのデータ・マトリッ クスを示す。図５Ａは、ＬＯＧ ＬＭＡＬＳ対ＤＣのデータ・マトリックスを示 す。図５Ｂは、ＬＯＧ ＵＭＡＬＳ対ＤＣのデータ・マトリックスを示す。図５ Ｃは、ＬＯＧ ＳＡＬＳ対ＤＣのデータ・マトリックスを示す。図５Ｄは、ＬＯ Ｇ ＲＡＬＳ対ＤＣのデータ・マトリックスを示す。図５Ａ〜５Ｄに示すデータ とその説明から、少なくとも赤血球溶血試薬で処理された網赤血球は、光散乱を 分析することにより、識別と計数ができ、光散乱は、蛍光を用いることなしに、 任意のさまざまな角度で収集できることが示されている。ＵＭＡＬＳは好ましい 光散乱角であり、本明細書の残り全体を通してもっぱら用いられる。 図３Ａ〜３Ｃに示す方法および本明細書中を通して、ＲＢＣを取得するステッ プは、２つの異なった方法で実現できる。図２を参照すると、第１の方法には、 網赤血球の分類と計数をするために処理および分析された同じ血液検体の絶対的 成熟赤血球数のカウントと、開口または検出区画１２を横切るときの赤血球細胞 ５０の計数が含まれる。ＤＣ、ＲＦ、ＬＭＡＬＳ、ＵＭＡＬＳ、ＳＡＬＳおよび ＲＡＬＳなどのような任意の同時に測定されたパラメータは、絶対的成熟赤血球 数ＲＢＣを得るのに用いることができる。ＤＣはＲＢＣを得るのに好ましいパラ メータである。ＲＢＣを得る第２の方法は、他の装置、粒子分析器、またはフロ ーサイトメータ（例えば、 など）を用いることであり、これらの装置は、例えば、図２の網赤血球細胞分析 器、または他の機器の一部かも知れない装置に物理的に接続できる。第１または 第２の方法のいずれかを用いて得たＲＢＣ、ＲＢＣおよびＲＥＴＩＣ％の結果は 、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳを計 算するため結合される。 図６Ａ〜６Ｃと図７Ａ〜７Ｇは、図３Ａ〜３Ｃのいずれかの方法で生成される データに適用可能なデータ分類方法を示す。図３Ｃの方法には、血液検体の染色 試薬＃１と赤血球溶血試薬＃１による処理と、例えば、図２に示すような粒子分 析器の少なくともＵＭＡＬＳにより処理した試料の分析を含み、本発明を実施す る最適な構成と図６Ａ〜１２に示す網赤血球データを提供する。 図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、少なくともＬＬＳとＤＣの組み合わせを用いて網 赤血球の分類と計数を行う数多くのデータ分類方法を示す。図６Ａに示す分類方 法により、境界２９０は、成熟赤血球集団２９４、２９６、２９８およびＤＣを 用いる白血球３００から、血小板集団２９２を分離する。ＬＬＳを用いると、境 界３０２は、網赤血球２９６、２９８から、成熟赤血球２９４を分離する。境界 ３２４は、白血球３００から網赤血球２９６、２９８を分離する。境界３０６は ＨＳＲ２９８からＬＳＲ２９６を分離する。従って、図６Ａから、ＬＬＳとＤＣ の組み合わせを用いて、および血液検体を染色試薬と赤血球溶血試薬で処理する と、血小板２９２、白血球３００、成熟赤血球２９４および網赤血球２９６、２ ９８の分類ができ、網赤血球２９６、２９８をＬＳＲ２９６とＨＳＲ２９８に小 分類できることが結論できた。 ここに説明した分類を行う他の方法は、１次元ヒストグラムを一度に１つずつ 分析し、上述した「ゲーティング」技術を適用することである。 １．図６ＣのＤＣヒストグラムを用い、成熟赤血球と白血球を含む１つのピー ク３０８から血小板集団２９２を分離する谷、すなわち境界２９０を見つける。 ２．連続した分析から血小板２９２を効果的に除去する図６Ｃの 境界２９０より大きいＤＣ値のゲーティングをし、図６ＢのＬＬＳヒストグラム を作成し、このヒストグラムを用いて以下のステップを実行する。 ａ）網赤血球２９６、２９８から成熟赤血球２９４を分離する境界３０２を見 つけ、ヒストグラムの始まり（一番左）から境界３０２までの間の成熟赤血球２ ９４の数をカウントする。 ｂ）白血球３００から網赤血球２９６、２９８を分離する境界３０４を見つけ 、境界３０２から境界３０４の範囲の網赤血球２９６、２９８をカウントする。 ｃ）ＨＳＲ２９８からＬＳＲ２９６を分離する境界３０６を見つけ、境界３０ ２から境界３０６の範囲のＬＳＲ２９６をカウントし、境界３０６から境界３０ ４の範囲のＨＳＲ２９８をカウントする。 ３．図６Ｃの境界２９０より大きいＤＣ値をゲーティングし、境界３０２より 大きいＬＬＳ値と図６Ｂの境界３０４より小さいＬＬＳ値をゲーティングし、網 赤血球のＤＣヒストグラム（図示せず）だけを作成し、これらの網赤血球の統計 的分析をして、平均ＤＣ値を得る。 ４．次の結果を計算する。 ａ）全赤血球＝成熟赤血球＋網赤血球を計算する ｂ）ＲＥＴＩＣ％＝（網赤血球／全網赤血球）＊１００を計算する ｃ）ＭＲＶ＝平均ＤＣ＊キャリブレーション係数を計算する ｄ）ＲＭＩ＝ＨＳＲ／網赤血球を計算する ５．上述したようにＲＣＢを得て、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳ＝ＲＥＴＩＣ％＊ＲＢ Ｃを計算する 網赤血球の分類と計数をする他の方法はＬＬＳの使用だけを含む 。 １．図６Ｂに示すようなＬＬＳヒストグラムを作成し、このヒストグラムを用 いて次のステップを実行する。 ａ）赤血球２９６、２９８から成熟赤血球２９４を分離する境界３０２を見つ け、ヒストグラムの始まり（一番左）から境界３０２の範囲の成熟赤血球２９４ をカウントする ｂ）白血球３００から赤血球２９６、２９８を分離する境界３０４を見つけ、 境界３０２から境界３０４の範囲の網赤血球２９６、２９８をカウントする ｃ）ＨＳＲ２９８からＬＳＲ２９６を分離する境界３０６を見つけ、境界３０ ２から境界３０６の範囲のＬＳＲ２９６をカウントし、境界３０６から境界３０ ４の範囲のＨＳＲ２９８をカウントする ２．次の結果を計算する ａ）ＲＥＴＩＣ％＝（網赤血球／全網赤血球）＊１００を計算する ｂ）ＲＭＩ＝ＨＳＲ／網赤血球を計算する ３．上述したようにＲＢＣを得て、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳ＝ＲＥＴＩＣ％＊ＲＢ Ｃを計算する ここに説明した方法の欠点は、血小板は分析から除外されておらず、ＲＥＴＩ Ｃ％と他の結果を歪めさせる結果になるかも知れないこということである。好ま しい方法は、個々の血液細胞の光散乱測定で得たＤＣまたは細胞容積の他の同等 の測定を必要とし、これにより小網を、赤血球分析から血小板を識別して除去す ることができる。 図７Ａ〜７Ｇは、少なくともＬＬＳとＤＣの組み合わせ、好ましくは、ＬＬＳ 、、ＤＣ、ＲＬＳ、および不透明の略語である「ＯＰ」の組み合わせを用いて、 網赤血球の分類と計数をする数多くのデ ータ分類方法を示す。適用可能であれば、図６Ａ〜６に用いているように同じ参 照番号を用いる。 図７Ａの分類方法により、境界２９０は、血小板２９２を網赤血球集団２９４ 、３１０、およびＤＣを用いている白血球３００から分離する。ＬＬＳを用いて 、斜めの境界３１２は、網赤血球３１０から成熟した赤血球２９４を分離する。 境界３０４は、白血球３００から網赤血球３１０を分離する。従って、図７Ａか ら、ＬＬＳとＤＣの組み合わせを用いて、および血液検体を染色試薬と赤血球溶 血試薬で処理すると、血小板２９２、白血球３００、成熟赤血球２９４、および 網赤血球３１０の分類と計数が行えることが結論できた。さらに、次のような結 果が報告できた。ＲＥＴＩＣ％、ＭＲＶ、およびＲＢＣを得ることによりＲＥＴ ＩＣ−ＡＢＳが得られた。 図７Ｂに示した分類方法は、得られた結果を拡張、洗練するため図７Ａに示し た今説明した方法と組み合わされる。図７Ｂに示すデータ・パターンは、ＲＬＳ がＸ軸に表示されデータが回転し、および図７Ａの白血球３００が分析からゲー ティングで阻止または除外されるという例外を除き、図７Ａのパターンと同じで ある。図７Ｂにおいて、境界２９０は成熟赤血球３１４、３１６、３１８から血 小板２９２を分離する。境界３２０は網赤血球３１６、３１８から成熟赤血球３ １４を分離する。境界３２２はＨＳＲ３１８からＬＳＲ３１６を分離する。ＲＬ Ｓパラメータと共に動作する利点は、見つけた境界３２０、３２２は、Ｘ軸とＹ 軸に完全に直交していることである。図７Ｂの境界３２０は、図７Ａに投影され たとき、斜めのライン３１２として現れる。従って、ＬＬＳとＤＣと一緒に用い 、染色試薬と赤血球溶血試薬で処理した血液検体を分析に用いる回転パラメータ ＲＬＳは、網赤血球の分類と計数の好ましい方法を提供し、次のような結果を得 る。ＲＥＴＩＣ％、ＭＲＶ、ＲＭＩ、お よびＲＢＣ、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳを得るとにより得られた。 図７Ｃに示す分類方法は、得られた結果をさらに洗練するため、図７Ａ〜７Ｂ に示す今説明した方法と組み合わされる。図７Ｃは、ＯＰ対ＤＣのマトリックス を示す。境界２９０は、ＤＣで分離された他のすべての細胞集団３２４、３２６ からなる血小板２９２を分離する。境界３２８は、血小板または血小板の塊まり ３２６から赤血球と白血球を含む集団を分離する。血小板の塊まり３２６は容易 に識別され阻止される。すなわち図７Ｃに示すように不透明を用いて行われる引 き続く分析から除去される。図７Ａを参照すると、血小板の塊まりは、識別され ず不透明によりゲーティングにより阻止されない場合、成熟赤血球２９４と網赤 血球３１０に重なって、ＲＥＴＩＣ％と他の結果をゆがめてしまう。血小板の塊 まりは滅多に現れることはないが、網赤血球の分析に影響を与えてはいけない。 このため、ＤＣ、ＬＬＳ、およびＲＬＳと共に用いられ、染色試薬と赤血球溶血 試薬で処理された血液検体の分析に用いられるＯＰパラメータは、網赤血球の分 類と計数の好ましい方法を提供し、次のような結果が得られる。ＲＥＴＩＣ％、 ＭＲＶ、ＲＭＩ、およびＲＢＣ、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳを得ることにより得られる 。 図７Ａ〜７Ｃに示された今説明した分類を行う別の方法は、図７Ｄ〜７Ｇの１ 次元ヒストグラムを一度に１つずつ分析し、上述した「ゲーティング」技術を適 用することである。 １．図７ＥのＤＣヒストグラムを用いて、赤血球、白血球、および血小板の塊 まりを含む単一のピーク３３０から血小板２９２を分離する境界２９０を見つけ る。 ２．連続した分析から効果的に血小板２９２を除去する図７Ｅの境界２９０よ り大きいＤＣ値をゲーティングし、図７ＧのＯＰヒストグラムを作成し、このヒ ストグラムを用いて、血小板の塊まり３ ２６から赤血球と白血球３２４を分離する境界３２８を見つける。 ３．連続した分析から効果的に血小板２９８を除去する図７Ｅの境界２９０よ り大きいＤＣ値のゲーティングと、連続した分析から効果的に血小板の塊３２６ を除去し、図７ＤのＬＬＳヒストグラムを作成し、このヒストグラムを用いて、 白血球３００から赤血球２９４、３１０を分離する境界３０４を見つける。 ４．連続した分析から効果的に血小板２９２を除去する図７Ｅの境界２９０よ り小さいＤＣ値のゲーティングと、連続した分析から効果的に血小板の塊まり３ ２６を除去する図７Ｇの境界３２８より小さいＯＰ値のゲーティングと、連続し た分析から効果的に白血球３００を除去する図７Ｄの境界３０４より小さいＬＬ Ｓ値をゲーティングして、図７ＦのＲＬＳヒストグラムを作成し、このヒストグ ラムを用いて、次のステップを実行する。 ａ）成熟赤血球集団３１４のピークを見つける ｂ）正規確率関数曲線を成熟赤血球ピーク３１４にあてはめる ｃ）あてはめた曲線と残りのデータが等しい確率で重なるチャネルを計算して 、網赤血球３１６、３１８から成熟赤血球３１４を分離する境界３２０を見つけ 、ヒストグラムの始まり（一番左）から境界３２０までの範囲の成熟赤血球３１ ４をカウントする ｄ）ＨＳＲ３１８からＬＳＲ３１６を分離する境界３２２を見つけ、境界３２ ０から境界３２８の範囲のＬＳＲ３１６をカウントし、境界３１８からヒストグ ラムの最大（一番右）の範囲のＨＳＲ３１８をカウントする ５．図７Ｅの境界２９２より大きいＤＣ値をゲーティングし、図７Ｇの境界３ ２８より小さいＯＰ値をゲーティングし、図７Ｄの境界３０４より小さいＬＬＳ 値をゲーティングし、図７Ｆの境界３２０より大きいＲＬＳ値をゲーティングし て、網赤血球だけのＤＣヒ ストグラム（図示せず）を作成し、これらの赤血球の統計的分析を行い、平均Ｄ Ｃを得る。 ６．次の結果を計算する。 ａ）全赤血球＝成熟赤血球＋網赤血球を計算する ｂ）ＲＥＴＩＣ％＝（網赤血球／全赤血球）＊１００を計算する ｃ）ＭＲＶ＝平均ＤＣ＊キャリブレーション係数を計算する ｄ）ＲＭＩ＝ＨＳＲ／網赤血球を計算する ７．上述したようにＲＢＣを得て、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳ＝ＲＥＴＩＣ％＊ＲＢ Ｃを計算する。 図８Ａ〜８Ｃ、図９Ａ〜９Ｃ、図１０Ａ〜１０Ｃ、および図１１Ａ〜１１Ｃは 、図３Ｃの赤血球処理方法により調合し、図２に示すように装置により、少なく ともＵＭＡＬＳとＤＣで分析し、図７Ａ〜７Ｇに示す方法により分類した人間の 血液検体の例を示す。図８〜１１のそれぞれのプロットは、境界と集団の数を除 き図７Ａと同じように描かかれている。実際の網赤血球分類は、図６Ａ〜１１Ｃ に示されている。 図１２は、Ｘ軸にプロットされた「基準％」とＹ軸にプロットされた「ＲＥＴ ＩＣ％」の人間の血液検体に対する相関について検討した結果研究を示す。「基 準％」は、提案したＮＣＣＬＳ規格Ｈ１６−Ｐに略述した基準方法によって得た 網赤血球の比率である。「ＲＥＴＩＣ％」は、上述したように好ましい方法と装 置によって得られた結果である。点線の４５°の線３３２は、完全に適合したデ ータ、すなわち１．０の相関係数を示す。実際に最適合したデータは実線３３４ で示されている。線間の差は０．９５の相関係数を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血球計数フローセルの全血液検体の少なくとも一部の網赤血球を分析する 方法において、 複数の細胞を含む全赤血球細胞の一部と赤血球溶血試薬とを組み合わせるステ ップと、 血球計数フローセルを前記全血液検体と赤血球溶血試薬の部分標本を通過させ るステップであって、前記血球計数フローセルの検出区画を一回に１つずつ前記 細胞を通過させ前記検出区画を少なくとも１本の光ビームを同時に通過させて、 前記細胞を横切ることを含むステップと、 個々の細胞が前記光ビームを横切るときに個々の細胞により散乱される光を検 出するステップと、 前記全血液検体中の網赤血球の比率を得るため個々の細胞により散乱された前 記光を分析するステップと、 とからなることを特徴とする方法。 ２．請求項１に記載の方法において、中央光散乱角を検出することをさらに特 徴とする方法。 ３．請求項１に記載の方法において、個々の細胞が前記検出区画を通過すると き、個々の細胞を電子的に検知をすることをさらに特徴とする方法。 ４．請求項３に記載の方法において、前記検出した光散乱と前記の電子的な検 知を組み合わせて、前記網赤血球の比率を得ることをさらに特徴とする方法。 ５．請求項１に記載の方法において、前記赤血球溶血試薬を加える前に、染色 試薬と前記全血液検体とを組み合わせることをさらに特徴とする方法。 ６．血球計数フローセルの全血液検体の少なくとも一部の網赤血球を分析する 装置において、 複数の細胞を含む全血液検体の一部とを赤血球溶血試薬とを組み合わせる手段 と、 血球計数フローセルを前記全血液検体と赤血球溶血試薬の部分標本を通過させ る手段であって、前記血球計数フローセルの検出区画を一回に１つずつ前記細胞 を通過させ前記検出区画を少なくとも１本の光ビームを同時に通過させて、前記 細胞を横切ることを含む手段と、 個々の細胞が前記光ビームを横切るときに個々の細胞により散乱された光を検 出する手段と、 前記全血液検体中の網赤血球の比率を得るため、個々の細胞により散乱された 前記光を分析する手段と、 を具備することを特徴とする装置。 ７．請求項６に記載の装置において、中央光散乱角を検出する手段をを有する ことをさらに特徴とする装置。 ８．請求項６に記載の装置において、個々の細胞が前記検出区画を通過すると きに、個々の細胞を電子的に検知をする手段を有することをさらに特徴とする装 置。 ９．請求項８に記載の装置において、前記検出した光散乱と前記の電子的検知 とを組み合わせて、前記網赤血球の比率を得る手段をさらに有することを特徴と する装置。 １０．請求項６に記載の装置において、前記赤血球溶血試薬を加える前に、染 色試薬と前記全血液検体とを組み合わせる手段を有するとをさらに特徴とする装 置。