CN103430009A - 用于流式细胞术的轴向光损失传感器系统 - Google Patents

Abstract

本文提供一种轴向光损失传感器系统以及用于以提高的分辨率测量轴向光损失的方法。本发明的方面包括：轴向光损失传感器，其沿照射轴定位以检测由经过流体流中的光源交点的颗粒所造成的轴向光损失；以及障碍物，其沿所述照射轴定位在所述光源交点与所述轴向光损失传感器之间。所述障碍物被进一步定位以便具有同轴不透明表面。所述障碍物允许对在相对于被照射颗粒的远场中的条纹信号的测量，以便测量由所述颗粒所产生的轴向光损失。本文所描述的系统和方法在例如流式细胞术中发现用途。

Description

用于流式细胞术的轴向光损失传感器系统

相关申请的交叉引用

按照美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求2011年4月26日提交的美国临时专利申请序列号61/479,244的申请日的优先权；所述申请的公开内容通过引用并入本文。

介绍

流式细胞仪是用于对悬浮在一股流体中的微观颗粒进行计数、检查以及分选的强大工具。在流式细胞仪中，从来自由聚焦激光射束所激发的细胞和其它小颗粒的荧光和/或散射光得到信号。具体来说，光散射广泛用于对在调查中的颗粒的尺寸、折射率以及复杂性进行表征。例如，前向散射(FSC)，即在几乎平行于激发激光传播的方向(例如，约1°至约20°)上的由颗粒所散射的光，与颗粒的尺寸近似地成比例。例如，侧向散射(SSC)，即与激光传播成约90°被散射的光，与颗粒的内部结构有关。在流式细胞术应用中经常使用的另一个参数是轴向光损失(ALL)或消光，其被测量为由于受颗粒的散射和吸收，激光功率沿其传播方向的减小。

在所谓的点图中的SSC和FSC的组合提供将颗粒细胞(粒细胞)与单细胞核细胞(淋巴细胞和单核细胞)区分开的强大工具，在所述点图中，针对每个颗粒绘示出前向散射相对侧向散射的强度。SSC和FSC二者是“零背景”信号，意思是在没有散射中心时，很少的光撞击在被定位以检测这些信号的光检测器上。SSC和FSC因此广泛用于商业流式细胞仪仪器中。然而，由于不完全的溶解/洗涤周期或可能遇到的某些细胞生理机能，在样品中经常存在大量的细胞碎片。所述碎片经常阻止使用SSC-FSC点图对白细胞(WBC)的清晰表征。参见图1。

在20世纪80年代后期，曾提议用轴向光损失来代替FSC以用于白细胞(WBC)与碎片的分离(参见Stewart,C.C.等，Cytometry10，第426页，1989)。如图2中所示，在流式细胞仪中所使用的聚焦激光射束在远场中快速地发散。为监测沿激光传播方向的轴向光损失，将针孔掩膜放置在激光射束路径中，以使得仅沿光轴传播的光被放置在所述针孔后面的光检测器检测到。使用专门设计的流式细胞仪，Stewart等使用不同类型的溶解/洗涤的和溶解/未洗涤的血样、用ALL演示WBC与碎片的清晰分离。然而，由于专用仪器构造，这种途径在商业仪器中的复制是困难并且昂贵的(参见Steinkamp,JA.Cytometry4，第83页，1983)。

将WBC与碎片区别开的另一种途径是对存在于所有WBC中而不是碎片中的CD45标记染色。CD45+细胞的识别提供WBC与碎片的清晰划分。然而，染色法测定比散射图测定更加昂贵并且费时。因此，FSC和SSC依然是在大多数流式细胞术应用中用于将WBC与碎片区分开的主导工具。

概述

本发明的方面提供用于轴向光损失(ALL)的测量的简单实现方式，其中，这种实现方式与SSC结合允许流式细胞术应用中WBC与碎片的改进的分离。本发明的实施方案在对被广泛接受的使用FSC和SSC的流式细胞术实验方案的影响最小的情况下实施简单的ALL。例如，与采用常规针孔掩膜的那些系统相比，本发明的实施方案在测量ALL中提供提高的分辨率。

在一个实施方案中，双狭缝光掩膜代替常规针孔光掩膜被放置在轴向光损失光检测器的前面。因为在远场处的激光强度分布是在焦点处的那个强度的傅里叶变换，通过双狭缝的光因此源自具有图5中的曲线501所指示的强度图样的聚焦激光射束的一部分。所述图样类似于基于杨氏双狭缝实验的信号。与图5中的曲线501相反，曲线501指示激光射束在与单狭缝(类似于在常规ALL检测器中所使用的那些)相匹配的焦点处的强度分布。与常规针孔掩膜相比，双狭缝掩膜提供在焦斑处的更精细的分辨率。

在本发明的一个实现方式中，并行电线连接并且彼此机械分离的两个矩形光电二极管被用于FSC检测。通过介于两个FSC光电二极管之间的间隙的激光由双狭缝遮蔽。通过所述掩膜的光然后撞击在ALL检测器上。

当基于本发明的所得的未洗涤白细胞(WBC)的SSC-ALL点图与在相同条件下使用常规针孔掩膜所获得的类似的点图相比时，很显然：从双狭缝掩膜所获得的结果提供WBC亚群的最佳分辨率。

附图简述

并入本文的附图形成本说明书的一部分。与本书面说明一起，所述附图进一步用于解释具有根据本发明的轴向光损失传感器系统的流式细胞仪的原理，并且使得相关领域中的技术人员能够对所述流式细胞仪进行制造和使用。

图1是示出使用前向散射对比侧向散射的细胞表征的点图。

图2是示出使用针孔掩膜对流体流进行激光照射以及所得到的发散射束的示意图。

图3示出流式细胞仪系统的示意图。

图4是示出利用根据本文所提出的一个实施方案的掩膜对流体流进行激光照射以及所得到的发散射束的示意图。

图5示出从被照射流体流发射出的两个照明信号。

图6A显示基于本文所提出的实施方案所得到的未洗涤WBC的SSC-ALL点图。

图6B显示基于针孔掩膜所得到的未洗涤WBC的SSC-ALL点图。

图7是根据本文所提出的一个实施方案的示意图。

图8是根据本文所提出的一个实施方案的示意性电路图。

详述

本文提供轴向光损失传感器系统以及用于以提高的分辨率测量轴向光损失的方法。所描述的系统和方法的方面在例如流式细胞仪系统中发现用途。例如，在一个实施方案中，提供流式细胞仪系统，其包括：流体导管；光源，其被定位以沿照射轴照射存在于所述流体导管中的流体流；以及轴向光损失传感器，其沿所述照射轴定位以检测由经过所述流体流中的光源交点的颗粒所造成的轴向光损失。所述流式细胞仪系统进一步包括障碍物(或掩膜)，其沿照射轴定位在光源交点与轴向光损失传感器之间。所述掩膜被进一步定位以便具有同轴不透明表面。所述掩膜允许流式细胞仪系统测量在相对于被照射颗粒的远场中的条纹信号，以便测量由所述颗粒所产生的轴向光损失。

在一个实施方案中，掩膜被定位并且被取向，以使得所述掩膜允许轴向光损失传感器测量在相对于被照射颗粒的远场中的条纹信号。例如，双狭缝掩膜一般被定位以便具有包括两个相反的离轴狭缝的同轴不透明表面。所述离轴狭缝中的每一个可以具有范围从1-4mm、如约2mm的宽度。在一个实施方案中，掩膜可以定位在离光源交点一定距离处，所述距离比在所述光源交点处所形成的斑点尺寸大两倍或更多、或十倍或更多。另外，在一个实施方案中，双狭缝掩膜的不透明表面阻挡百分之十或更多、或百分之二十或更多的来自光源的射束强度。

流式细胞仪系统可以进一步包括：(1)第一前向散射传感器，其被定位以检测来自经过光源交点的颗粒的、处于离所述照射轴为约1-20度的角度的光散射；(2)第二前向散射传感器，其被定位成相对所述照射轴与所述第一前向散射传感器相反，以检测来自经过所述光源交点的颗粒的、处于离照射轴为约1-20度的角度的光散射；和/或(3)一个或多个侧向散射传感器，其被定位以检测来自经过所述光源交点的颗粒的、处于离所述照射轴为约90度的角度的光散射。

在一个实施方案中，提供流式细胞仪系统，其包括：流体导管；光源，其被定位以沿照射轴照射流体流；以及轴向光损失传感器，其沿所述照射轴定位以检测由经过所述流体流中的光源交点的颗粒所造成的轴向光损失。为了测量远场中的条纹信号，流式细胞仪进一步包括沿照射轴定位在光源交点与轴向光损失传感器之间的掩膜。所述掩膜被定位以便具有阻挡至少约百分之十的来自光源的射束强度的同轴不透明表面。在一个实施方案中，所述掩膜定位在离光源交点一定距离处，所述距离比在所述光源交点处所形成的斑点尺寸大至少约两倍。

以下对图的详述是指阐明用于流式细胞仪的轴向光损失传感器系统的示例性实施方案的附图。其它实施方案是可能的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本文所描述的实施方案做出修改。因此，以下详述不意指是限制性的。

图3示出流式细胞仪系统(如美国专利号4,284,412中所描述，所述专利通过引用整体并入在此)的示意图。

如图3中所示，流式细胞仪包括流动通道106，其中液体悬浮液中的颗粒在流体流中成单行地穿过感测区。感测区或光源交点由流体流与入射光射束沿照射轴的相交来界定。在颗粒通过感测区时，它以多种方式与入射光相互作用。一些光被颗粒吸收，其它光以相对照射轴成一定范围的角度被散射。此外，取决于颗粒本身的性质和所述颗粒可能预先已经受的任何着色或染色，还可能发生荧光发射。

因此，在相对流体流和照射轴的不同取向处被定位的光传感器允许检测针对每种给定类型的颗粒的一组独特的响应。例如，图3包括第一激光器101和第二激光器102，其中由各自所发射的相干光经由镜子103和104以及透镜105各自不同地转向到流动通道106的感测区。流体流以层流方式在流动的流体鞘内被运输，以确保颗粒成单行地排列起来并且在感测区中被单独照射。因此，在每个颗粒被来自透镜的光照射时，可以感测颗粒与光的相互作用。

如图3中所示，轴向光损失传感器108检测由颗粒所阻挡的光的量。由光传感器109和110检测处于在约1-20度之间的角度的前向光散射。由传感器108、109以及110所生成的电信号与放大器120和121耦合，所述放大器为随后的分析和/或显示提供电信号。

如图3中所示，凭借荧光响应而从颗粒发射出的光或处于约90度的角度的侧向散射在与流体流的方向并且与照射轴二者成直角处被感测。在图3中，球面镜125和聚光透镜107收集此光，并且使此光通过孔111相继地与分色镜112并且与第二镜子113耦合。第一滤色器114(例如，来传递相对长波长的光)将选定光从分色镜112传输至光传感器117(例如，光电倍增管)。第二过滤器115有选择地将不同颜色的光(例如，相对短波长的光)从第二镜子113传递至第二光传感器116。来自传感器116和117的电信号耦合至放大器118和119，并且从而还被提供用于随后的处理。

传感器选择器122利用来自放大器118至121的信号生成输出直方图。在显示器123处示出示例性直方图，其中所述直方图上的每个点表示一个单独的颗粒。直方图上的指示物的群集或聚集表示相似类型的颗粒的群组。

图4是示出本文所提出的一个实施方案的示意图。代替如图2中所示的常规针孔光掩膜，将双狭缝掩膜放置在ALL光传感器的前面。因为在远场处的激光强度分布是在光源交点处的那个激光强度的傅里叶变换，通过双狭缝掩膜的光因此源自具有图5中的曲线501所指示的强度图样的聚焦激光射束的一部分。与曲线501相反，曲线502指示激光射束在相对光源交点的近场处的强度分布，并且将会匹配由针孔掩膜ALL传感器系统所感知的曲线。双狭缝掩膜因此提供与用常规针孔掩膜所能实现的相比更大的在焦斑处的分辨率。

图6A显示根据本文所提出的一个实施方案的基于双狭缝掩膜的未洗涤WBC样品的SSC-ALL点图。为了进行比较，在图6B中示出使用针孔掩膜在相同条件下获得的相似的图。虽然两个图与图1中所示的SSC-FSC图相比提高了淋巴细胞群与碎片的分离和单核细胞的分辨率，但是很明显：从双狭缝掩膜所获得的结果提供WBC亚群的最佳分辨率。

图7是根据本文所提出的一个实施方案的示意图。图8是根据图7中所示的实施方案的示意性电路图。

如图所示，发散光射束780在两个光传感器(例如，光电二极管)710和709之间被传输。发散光射束780撞击在掩膜770(如图4中所示的双狭缝掩膜)上。在掩膜770的后面提供ALL光传感器(例如，光电二极管)708以测量光射束780的条纹信号。来自ALL光传感器708的信号然后通过如图8中所示的增益放大器来处理。

每个光传感器710和709由图8中的并行电线连接的光电二极管FSC_L和FSC_R表示。在一个实施方案中，光传感器710和709彼此机械分离，各自相对照射轴是相反的。光传感器710和709用于处于离照射轴为约1-20度的角度的FSC检测。

方法

以上所描述的系统可以用于测量例如流式细胞仪系统中的轴向光损失的方法。在一个实施方案中，提供一种方法，其包括：(1)用光源照射在流体流内的颗粒；以及(2)测量在相对于被照射颗粒的远场中的条纹信号，以便测量由所述颗粒所产生的轴向光损失。所述方法可以进一步包括：(3)将双狭缝掩膜定位在所述被照射颗粒与轴向光损失传感器之间，以使得所述双狭缝掩膜包括具有两个相反的离轴狭缝的同轴不透明表面；(4)将所述掩膜定位在离所述被照射颗粒一定距离处，所述距离比在照射点处所形成的斑点尺寸大至少约二至十倍；和/或(5)将所述掩膜定位，以使得所述双狭缝掩膜的不透明表面阻挡至少约百分之十至百分之二十的来自所述光源的射束强度。

在另一个实施方案中，提供测量流式细胞仪系统中的轴向光损失的方法，所述方法包括：(1)将颗粒样品插入至流式细胞仪系统中；(2)用光源照射所述颗粒；以及(3)读出在相对于被照射颗粒的远场中的条纹信号，以便测量由所述颗粒所产生的轴向光损失。流式细胞仪系统可以包括双狭缝掩膜，其被定位在所述被照射颗粒与轴向光损失传感器之间，以使得所述双狭缝掩膜包括具有两个相反的离轴狭缝的同轴不透明表面。在各个实施方案中，所述掩膜可以定位在离被照射颗粒一定距离处，所述距离比在照射点处所形成的斑点尺寸大两倍或更多、或十倍或更多。双狭缝掩膜的不透明表面可以阻挡百分之十或更多、或百分之二十或更多的来自光源的射束强度。

在又一个实施方案中，提供一种建立流式细胞仪的方法，所述方法是通过沿照射轴将障碍物定位在光源与轴向光损失传感器之间，以使得所述障碍物包括阻挡从所述光源发射的光的同轴不透明表面。所述障碍物允许轴向光损失传感器读出在相对于被照射颗粒的远场中的条纹信号，并且由此测量由所述被照射颗粒所产生的轴向光损失。所述方法可以进一步包括：(1)将所述障碍物定位在离被照射颗粒一定距离处，所述距离比在照射点处所形成的斑点尺寸大两倍或更多、或十倍或更多；和/或(2)将所述障碍物定位，以使得所述障碍物的不透明表面阻挡百分之十或更多、或百分之二十或更多的来自所述光源的射束强度。

总结

前述对本发明的描述已经出于解释和说明的目的被提出。不意图是详尽的或将本发明限制于所公开的精确形式。鉴于以上教义，其它修改和变化也是可能的。选择并且描述实施方案以便最佳解释本发明的原理及其实际应用，并且从而使得本领域中的其他技术人员能够以如适用于预期的特定用途的各种实施方案和各种修改来最佳地利用本发明。意图是，所附权利要求应理解为包括本发明的其它替代实施方案；包括等效结构、部件、方法以及手段。

应理解，详述部分而不是概述和摘要部分意图用于解释所述权利要求。概述和摘要部分可以陈述如本发明人所预期的本发明的示例性实施方案中的一个或多个而不是所有，并且因此概述和摘要部分不意图以任何方式限制本发明和所附权利要求。

应理解，本发明不限制于所描述的具体实施方案，当然因而可以发生变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并且不意图是限制性的，因为本发明的范围将仅受到所附权利要求的限制。

在提供值的范围时，应了解，在那个范围的上限与下限以及所规定的范围内的任何其它所规定值或居中值之间的每一个居中值（除非上下文另外明确指示，否则直至下限单位的十分之一）都涵盖在本发明内。这些更小范围的上限和下限可独立地包括于所述更小范围内并且也涵盖于本发明中，这取决于在所规定的范围内的任何特定排除的极限值。当所规定的范围包括所述极限值中的一个或两个时，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。

本文提出某些范围时所使用的数值之前冠以术语“约”。术语“约”在本文使用来为它之后的确切数字以及接近于或近似所述术语之后的数字的一个数字提供文字支持。在确定一个数字是否接近于或近似确切叙述的数字时，所述接近或近似的未叙述的数字可以是以下一个数字：在其中提出它的上下文中，所述数字提供所述确切叙述的数字的实质等效值。

除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似于或等效于本文所描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但是现在描述了代表性的说明性方法和材料。

本说明书中所引证的所有出版物和专利通过引用并入本文，犹如每个单独的出版物或专利曾被确切地并单独地指示为通过引用并入并且现通过引用并入本文，以便结合被引证的出版物来公开和描述所述方法和/或材料。任何出版物的引证是为了它在申请日之前的公开内容并且不应理解为对本发明无权凭借先前发明而先于所述出版物的承认。另外，所提供的出版物的日期可以不同于可能需要独立确认的实际出版日期。

应注意，如本文和所附权利要求中所使用，单数形式“一种”、“一个”以及“所述”包括复数对象，除非上下文另外清晰地指明。应进一步注意，所述权利要求可以被起草以排除任何任选的要素。因而，本声明意图用作与权利要求要素的叙述有关的如“只是”、“仅仅”等这类排除性术语的使用或“否定”限制的使用的前提基础。

应理解，出于清晰目的而在分开的实施方案的上下文中所描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，出于简洁目的而在单个实施方案的上下文中所描述的本发明的各种特征也可以分开地或以任何适合的子组合来提供。实施方案的所有组合确切地由本发明包含并且就犹如每个组合被单独地并明确地公开一样而在本文中公开，其公开程度为：这类组合包含可操作的过程和/或装置/系统/套件。此外，在描述这类变量的实施方案中所列举的所有子组合也明确地由本发明包含，并且就犹如每个这样的化学基团子组合被单独地并明确地公开在本文中一样而在本文中公开。

如本领域的普通技术人员在阅读本公开后将会明白的，本文所描述和说明的单独的实施方案中的每个具有离散的部件和特征，在不脱离本发明的范围或精神的情况下其可以容易地与任何其它若干实施方案的特征分离或组合。任何所叙述的方法可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其它顺序来执行。

Claims (15)

1.一种轴向光损失传感器系统，所述系统包括：

同轴轴向光损失传感器；以及

同轴障碍物，其沿照射轴定位在所述轴向光损失传感器与光源之间，以便在所述轴向光损失传感器处测量远场条纹信号。

2.如权利要求1所述的轴向光损失传感器系统，其中所述障碍物是双狭缝掩膜，其被定位以便具有包括两个相反的离轴狭缝的同轴不透明表面。

3.如权利要求2所述的轴向光损失传感器系统，其中所述双狭缝掩膜的所述不透明表面阻挡百分之十或更多的来自所述光源的射束强度。

4.如权利要求2所述的轴向光损失传感器系统，其中所述离轴狭缝中的每个具有范围从1-4mm的宽度。

5.如权利要求1至4中任一项所述的轴向光损失传感器系统，其中所述障碍物包括阻挡百分之十或更多的来自所述光源的射束强度的同轴不透明表面。

6.如权利要求1至5中任一项所述的轴向光损失传感器系统，其中所述障碍物定位在离被照射光源交点一定距离处，所述距离比在所述光源交点处所形成的斑点尺寸大两倍或更多。

7.一种流式细胞仪系统，所述系统包括：

流体导管；

光源，其被定位以沿照射轴照射存在于所述流体导管内的流体流；

根据权利要求1至6中任一项所述的轴向光损失传感器，其沿所述照射轴定位以检测由经过所述流体流中的光源交点的颗粒所造成的轴向光损失；以及

障碍物，其沿所述照射轴定位在所述光源交点与所述轴向光损失传感器之间。

8.如权利要求7所述的流式细胞仪系统，其进一步包括：

第一前向散射传感器，其被定位以检测来自经过所述光源交点的所述颗粒的、处于离所述照射轴为1-20度的角度的光散射。

9.如权利要求8所述的流式细胞仪系统，其进一步包括：

第二前向散射传感器，其被定位成相对所述照射轴与所述第一前向散射传感器相反，以检测来自经过所述光源交点的所述颗粒的、处于离所述照射轴为1-20度的角度的光散射。

10.如权利要求7至9中任一项所述的流式细胞仪系统，其进一步包括：

侧向散射传感器，其被定位以检测来自经过所述光源交点的所述颗粒的、处于离所述照射轴为约90度的角度的光散射。

11.一种建立流式细胞仪系统的方法，所述方法包括：

沿照射轴将障碍物定位在光源与根据权利要求1至6中任一项所述的轴向光损失传感器之间，以使得所述障碍物包括同轴不透明表面，所述同轴不透明表面阻挡从所述光源发射的光并且允许所述轴向光损失传感器读出相对于被照射颗粒的远场中的条纹信号，并且由此测量由所述被照射颗粒所产生的轴向光损失。

12.如权利要求11所述的方法，其进一步包括：

将所述障碍物定位在离所述被照射颗粒一定距离处，所述距离比在照射点处所形成的斑点尺寸大两倍或更多。

13.一种测量流式细胞仪系统中的轴向光损失的方法，所述方法包括：

将颗粒样品插入至流式细胞仪系统中；

用光源照射所述颗粒；以及

读出相对于所述被照射颗粒的远场中的条纹信号，以便测量由所述颗粒所产生的轴向光损失。

14.如权利要求13所述的方法，其中将双狭缝掩膜定位在所述被照射颗粒与轴向光损失传感器之间，以使得所述双狭缝掩膜包括具有两个相反的离轴狭缝的同轴不透明表面。

15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述离轴狭缝中的每个具有范围从1-4mm的宽度。

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