CN116897281A - 包括光收集增强器的流式细胞仪及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
提供了包括光收集增强器的流式细胞仪。在实施例中，本主题流式细胞仪包括流动池、光源、用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光的物镜，以及光收集增强器，所述光收集增强器被配置为收集沿第二光收集锥中的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光以使得其沿着相同的光路反向传播并且由物镜聚焦以用于检测。感兴趣的光收集增强器包括反射光学元件(例如，反射镜)和位于反射光学元件和流动池之间的聚光透镜。还提供了用于分析样本的方法。
Description
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求对2021年1月13日提交的美国临时专利申请序列号63/136,906的提交日期的优先权；该申请的公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术
生物流体中分析物的表征已成为生物研究、医学诊断和患者整体健康和保健评估的重要部分。检测生物流体中的分析物，例如人类血液或血液衍生产品，可以提供可以在确定患有多种疾病的患者的治疗方案中发挥作用的结果。
流式细胞术是一种用于表征并经常对生物材料，例如血液样本的细胞或另一种类型的生物或化学样本中感兴趣的粒子，进行分选的技术。流式细胞仪通常包括用于接收流体样本(例如血液样本)的样本储存器和包含鞘液的鞘储存器。流式细胞仪将流体样本中的粒子(包括细胞)作为细胞流运输到流动池，同时将鞘液引导到流动池。为了表征流动流的成分，用光照射流动流。流动流中材料的变化，例如形态或荧光标记的存在，可能导致观察到的光的变化，并且这些变化允许表征和分离。为了表征流动流中的成分，光必须入射到流动流上并被收集。流式细胞仪中的光源可以是各种各样的，包括宽光谱灯、发光二极管以及单波长激光器。光源与流动流对准，并且来自被照射粒子的光学响应被收集并被量化。
在流动流中的粒子被照射之后，侧向散射光和荧光从粒子向所有方向发射。在传统的流式细胞仪系统中，物镜将散射的荧光收集在收集锥内，并将所收集的光聚焦以使其可以被检测到。然而，由于侧向散射光和荧光在所有方向上发射，并且典型的流式细胞仪仅在单个光收集锥内收集侧向散射光和荧光，因此不会检测到在该收集锥外部传播的任何侧向散射光和荧光。例如，图1示出了传统的光收集系统。粒子102在粒子流101中被输送。照射后，侧向散射光和荧光向所有方向发射。在光收集锥103内传播的光由与光轴105对准的物镜104收集并聚焦到光处理模块106上。然而，在光收集锥103外部传播的光没有被检测到。相似地，图2示出了由传统的光收集系统收集的光。如图2所示，只有在光收集锥202内的侧向散射光和荧光被收集并且在光束轮廓203中可见。
发明内容
由于传统的粒子分析方法要求不检测由流动流中的粒子发射的侧向散射光和荧光的大部分，因此发明人已经意识到，因此需要用于增强粒子调制光的收集的系统和方法。本发明的实施例满足此需要。
本发明的各方面包括具有光收集增强器的流式细胞仪。在实施例中，本主题流式细胞仪包括用于在流动流中输送粒子的流动池、用于在询问点照射流动流中的粒子的光源、用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光的物镜，以及用于收集在第二光收集锥内传播的粒子调制光的光收集增强器。所谓“光收集锥”，是指位于流动池附近的锥形区域，其中粒子调制光由物镜聚焦以用于检测。因此，在第一收集锥内传播的粒子调制光在第一方向上传播离开流动池，而在第二光收集锥内输送的粒子调制光在不同于第一方向的第二方向上传播远离流动池。例如，第一光收集锥可以由范围从100度到120度的顶角限定，而第二光收集锥可由范围从20度到100度的顶角限定。在实施例中，光收集增强器被配置为收集沿第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光以使得其沿相同的光路反向传播并由物镜聚焦。在某些情况下，光收集增强器包括反射光学元件和位于反射光学元件与流动池之间的聚光透镜。在一些情况下，反射光学元件是反射镜(例如，平面反射镜)。在一些实施例中，光收集增强器可以相对于物镜定位在流动池的相对侧上。在这样的实施例中，光收集增强器的聚光透镜可以沿着与物镜相同的光轴定位。在一些情况下，聚光透镜准直第二光收集锥内的粒子调制光，并将准直的粒子调制光引导到反射光学元件。在这些情况下，反射光学元件可以反射粒子调制光，使得光反向传播到聚光透镜并具有反向波前。聚光透镜随后可以将反向传播的粒子调制光聚焦到流动池的询问点上以使得光由物镜聚焦。
本发明的各方面还包括用于分析样本的方法。在实施例中，本主题方法包括将生物样本引入流式细胞仪，所述流式细胞仪具有用于在流动流中输送粒子的流动池、用于在询问点照射流动流中的粒子的光源、用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光的物镜，以及用于收集在第二光收集锥内传播的粒子调制光的光收集增强器。例如，第一光收集锥可以由范围从100度到120度的顶角限定，而第二光收集锥可由范围从20度到100度的顶角限定。在实施例中，方法包括收集沿第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光以使得其沿相同的光路反向传播并由物镜聚焦。在某些情况下，光收集增强器包括反射光学元件和位于反射光学元件与流动池之间的聚光透镜。在一些情况下，反射光学元件是反射镜(例如，平面反射镜)。在一些实施例中，光收集增强器可以相对于物镜定位在流动池的相对侧上。在这样的实施例中，光收集增强器的聚光透镜可以沿着与物镜相同的光轴定位。在一些情况下，聚光透镜准直第二光收集锥内的粒子调制光，并将准直的粒子调制光引导到反射光学元件。在这些情况下，反射光学元件可以反射粒子调制光以使得光反向传播到聚光透镜并具有反向波前。聚光透镜随后可以聚焦反向传播的粒子调制光以使得光由物镜聚焦。
还提供了用于组装流式细胞仪的方法。在实施例中，本主题方法包括在流式细胞仪内定位光收集增强器，所述流式细胞仪具有用于在流动流中输送粒子的流动池、用于在询问点照射流动流中的粒子的光源、用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光的物镜，以及光收集增强器。在一些情况下，方法还包括将光收集增强器与物镜光学对准以组装流式细胞仪。
附图说明
当结合附图阅读时，从下面的详细描述可以最好地理解本发明。图中包括以下附图：
图1描绘了传统的光收集系统的示意图。
图2描绘了由传统的光收集系统收集的光。
图3描绘了根据某些实施例的具有光收集增强器的流式细胞仪的示意图。
图4描绘了通过具有根据某些实施例的光收集增强器的流式细胞仪收集的光。
图5描绘了根据某些实施例的具有光收集元件的流式细胞仪。
图6描绘了根据某些实施例的分选控制系统的一个示例的功能框图。
图7A描绘了根据某些实施例的粒子分选系统的示意图。
图7B描绘了根据某些实施例的粒子分选系统的示意图。
图8描述了根据某些实施例的计算系统的框图。
具体实施方式
提供了包括光收集增强器的流式细胞仪。在实施例中，本主题流式细胞仪包括流动池、光源、用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光的物镜，以及光收集增强器，所述光收集增强器被配置为收集沿第二光收集锥中的光路传播的粒子调制光并重定向所收集的光，使得其沿着相同的光路反向传播并且由物镜聚焦以用于检测。感兴趣的光收集增强器包括反射光学元件(例如，反射镜)和位于反射光学元件和流动池之间的聚光透镜。还提供了用于分析样本的方法。
在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为这样当然会有所不同。还应当理解，由于本发明的范围将仅由所附权利要求书限制，这里使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在限制。
在提供了值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限与该范围内的任何其他所述或介入值之间的每一介入值(至下限单位的十分之一)都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，但受所述范围内任何特别排除的限制的限制。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，本发明还包括不包括那些包括的极限中的一个或两个的范围。
本文给出了某些范围，数值前面具有术语“大约”。术语“大约”在本文中用于为其前面的确切数字以及接近或近似于该术语前面的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，该接近或近似的未列举的数字可以是在该数字呈现的上下文中该数字提供了该具体列举的数字的实质等价物。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中也能够使用与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现在描述了代表性的说明性方法和材料。
如同每个单独的出版物或专利都被明确和单独地指示以引用的形式并入本文，并且通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物相关的方法和/或材料，本说明书中引用的所有出版物和专利均以引用的方式并入本文。任何出版物的引用均为了其在申请日之前的公开，并且不应被解释为承认本发明无权凭借现有发明提前发布。此外，所提供的出版日期可能不同于可能需要独立确认的实际出版日期。
应当注意，除非上下文另有明确说明，否则在本文和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”、“该”等包括多个所表示的对象。另外应当注意，可以起草权利要求书以排除任何可选元素。因此，本声明旨在作为在陈述权利要求要素或使用“否定”限制时使用“单独”、“仅”等专有术语的先行依据。
如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的，本文描述和说明的各个实施例中的每一个都具有分立的部件和特征，这些部件和特征可以容易地与其他几个实施例中任何一个的特征分离或组合，而不脱离本发明的范围或精神。按照所述事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序，能够执行任何所述方法。
虽然为了语法流动性和功能解释，已经或将描述该装置和方法，但应明确理解，除非根据35U.S.C.§112明文规定，否则权利要求不应被解释为以任何方式受到“手段”或“步骤”限制的限制，但应根据司法等同原则赋予权利要求所提供定义的全部含义和等同，如果权利要求是根据35U.S.C.§112明文规定的，则应根据35U.S.C.§112赋予其全部法定等同。
包括光收集增强器的流式细胞仪
如上所述，本发明的各方面涉及流式细胞仪，所述流式细胞仪具有用于在流动流中输送粒子的流动池、用于在询问点照射流动流中的粒子的光源、用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光的物镜，以及用于收集在第二光收集锥内传播的粒子调制光的光收集增强器。在一些情况下，本主题光收集增强器被配置为增加由物镜聚焦的粒子调制光的总量。在这种情况下，光收集增强器可以将原本不会被收集的粒子调制光的一部分引导到物镜。因此，本文所述的光收集增强器可以增加流式细胞仪的灵敏度，以使得信噪比增加。
所谓“粒子调制光”，是指在用来自光源的光照射粒子后，流动流中的粒子发出的光。在某些情况下，粒子调制光是荧光。例如，在用激发波长的光照射荧光染料之后，荧光可以由具有所述荧光染料的粒子发射。在其他情况下，粒子调制光是侧向散射光。如本文所述，侧向散射光是指从粒子的表面和内部结构折射和反射的光。在其他情况下，粒子调制光包括荧光和侧向散射光。如上所述，所谓“光收集锥”是指位于流动池附近的锥形区域，其中粒子调制光由物镜聚焦以用于检测。在一些实施例中，在光收集锥外部传播的粒子调制光不被物镜聚焦以用于检测。因此，在一些情况下，第一收集锥包括在第一方向上传播离开流动池的粒子调制光，该粒子调制光随后被物镜聚焦并被检测。本文讨论的“询问点”是指流动池内的一个区域，其中粒子受到来自光源的光的照射以用于分析。询问点的大小可以根据需要而变化。例如，其中0μm表示由光源发射的光的光轴，询问点的范围可能在-50μm至50μm，例如-25μm至40μm，并且包括-15μm至30μm。
如上所述，本主题流式细胞仪被配置为收集在第一光收集锥和第二光收集锥内传播的粒子调制光。第一光收集锥可以是任何方便的尺寸。光收集锥的尺寸可以在本文中根据锥的顶角来描述。“顶角”定义为圆锥体的两条母线(即圆锥体底部和顶点之间的线段)之间的角。与具有较小顶角的光收集锥相比，具有较大顶角的光收集锥包含从穿过流动池的被照射粒子发射的更多粒子调制光。因此，在一些实施例中，本主题第一光收集锥由范围从小于1度至120度的顶角限定，诸如50度至120度，并且包括100度至120度。在某些情况下，第一光收集锥由120度的顶角限定。在一些实施例中，第一收集锥的尺寸可以由物镜的尺寸(例如，直径)来确定。例如，具有大物镜的光学系统可以通过产生具有更宽顶角的第一光收集锥来增加所收集的粒子调制光的量。第一收集锥的尺寸也可以通过将流动池和物镜分隔开的距离来确定。例如，具有将流动池和物镜分隔开的短距离的光学系统可以通过产生具有更宽顶角的第一光收集锥来增加所收集的粒子调制光的量。
用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光的感兴趣物镜可以包括准直透镜、聚焦透镜、放大透镜、去放大透镜或其他透镜中的一个或其组合，其被配置为接收来自流动池的检测区的光并产生被输送到流式细胞仪中的一个或更多个检测器的成像光。
如上所述，本主题光收集增强器收集在第二光收集锥内传播的粒子调制光，并重定向所收集的光使得其(即，除了在第一光收集锥中传播的粒子调节光之外)也被物镜聚焦。因此，第二光收集锥包括在与第一光收集锥内的粒子调制光传播的第一方向不同的第二方向上远离流动池传播的粒子调制光。本主题第二光收集锥可以由任何方便的顶角限定。在一些实施例中，第二光收集锥由范围从小于1度至120度的顶角限定，诸如50度至120度，并且包括100度至120度。在某些实施例中，第二光收集锥由范围从20度至100度的顶角限定。在另外的情况下，第二光收集锥由45度的顶角限定。在一些情况下，第二光收集锥与第一光收集锥具有相同的尺寸。在其他情况下，第二光收集锥小于第一光收集锥。
在一些情况下，光收集增强器增加了从流动池收集的粒子调制光的总量。在这些情况下，光收集增强器可以被配置为在第二光收集锥内收集粒子调制光，否则第二光收集锥内的光将保持未被收集并且未被流式细胞仪检测到。例如，在一些实施例中，本主题光收集增强器可以重定向在第二光收集锥内传播的粒子调制光，使得从流动池收集的粒子调制光的总量增加1％至100％，例如20％至99％，并且包括30％至50％。在一些情况下，粒子调制光的总量的增加与第二光收集锥相对于第一光收集锥的尺寸成比例。例如，在第二收集锥和第一收集锥具有相同尺寸的情况下，本主题光收集增强器可以将所收集的光的总量增加100％，使收集的粒子调制光的总量有效地加倍。因此，感兴趣的光收集增强器可以增加检测到的信号量，从而提高信噪比。所谓“噪声”，是指流式细胞仪数据中因激光操作变化(即激光强度变化)而产生的不相关和受损的信号。因此，在某些情况下，本主题光收集增强器可以通过增加相对于噪声检测到的粒子调制光信号的量来提高流式细胞仪数据的质量。
在一些实施例中，光收集增强器和相应的第二光收集锥相对于物镜和第一收集锥位于流动池的相对侧。在这样的实施例中，光收集增强器重定向在第二光收集锥内传播的粒子调制光，使得光被反向传播到流动池。被反向传播的光随后穿过流动池的询问点，从而被引导到物镜，使得可以对其进行聚焦和检测。换言之，已经被光收集增强器重定向通过流动池的询问点的第二光收集锥内的粒子调制光与在第一光收集锥内传播的粒子调制光一起被物镜聚焦。
光收集增强器的各方面包括反射光学元件，该反射光学元件用于重定向所收集的光，使得其被物镜聚焦。用于反射光的任何方便的光学元件都可以用作本文所述的反射光学元件。在某些情况下，反射光学元件包括反射镜。在其他实施例中，反射光学元件包括一系列反射镜。在某些情况下，反射光学元件由一个或更多个平面反射镜组成。本文所述的平面反射镜具有平面的反射表面，其中反射角等于辐照度角(即，反射镜具有无穷远的焦距)。在另外的实施例中，反射光学元件被配置为反转在第二光收集锥内传播的重定向的粒子调制光的波前。在一些情况下，反向传播的粒子调制光的被反转波前防止与在第二光收集锥和/或第一光收集锥中传播离开流动池的光的光学干涉。反射光学元件可以相对于流动池定位在任何方便的距离处。例如，在一些实施例中，反射光学元件与流动池分离的距离范围从大于0mm至100mm(例如，0.1mm至100mm)，例如20mm至80mm，并且包括30mm至60mm。在一些情况下，本主题反射光学元件是消色差的。在这些情况下，反射光学元件不将粒子调制光分离成不同波长/颜色的光束。
光收集增强器的各方面还包括位于反射光学元件和流动池之间的聚光透镜。本文所讨论的聚光透镜是指将发散光束渲染为平行、准直光束的透镜。术语“准直”在其传统意义上是指光学调整光传播的共线性或减少来自公共传播轴的光的发散。在一些情况下，准直包括使光束的空间横截面变窄。如上所述，从穿过流动池的粒子发射的光在所有方向上传播。因此，本主题聚光透镜收集在第二光收集锥内传播的这种发散光线，并准直这些光线，使得它们相对于彼此平行传播。除了准直光束之外，本主题聚光透镜可以被配置为将在第二光收集锥内传播的粒子调制光引导到反射光学元件。在某些情况下，反射光学元件被定位成反射粒子调制光，使得光反向传播到聚光透镜。在返回聚光透镜之后，在某些情况下，反向传播的粒子调制光被聚光透镜聚焦到流动池的询问点上，使得光被物镜聚焦(例如，如上所述)。在某些情况下，本主题聚光透镜是消色差的。在这些情况下，聚光透镜不将粒子调制光分离成不同波长/颜色的光束。
在光收集增强器相对于物镜定位在流动池的相对侧的情况下，聚光透镜可以沿着与物镜相同的光轴定位。在这种情况下，一条假想的直线穿过准直透镜的中心、流动池的询问点和物镜的中心。在一些实施例中，第二收集锥的尺寸可以由聚光透镜的尺寸(例如，直径)来确定。例如，具有大聚光透镜的光学系统可以通过产生具有更宽顶角的第二光收集锥来增加所收集的粒子调制光的量。第二收集锥的尺寸也可以通过将流动池和物镜分隔开的距离来确定。例如，具有将流动池和物镜分隔开的短距离的光学系统可以通过产生具有更宽顶角的第一光收集锥来增加所收集的粒子调制光的量。在实施例中，本主题聚光透镜与流动池分隔开的距离为大于0mm至50mm(例如，0.1mm至50mm)，例如5mm至30mm，并且包括10mm至20mm。此外，反射光学元件可与聚光透镜分隔开的距离范围为大于0mm至20mm(例如，0.1mm至20mm)，例如3mm至15mm，并且包括5mm至10mm。
在本发明的附加方面中，光收集增强器收集沿着第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光，使得其在穿过流动池的询问点并被物镜聚焦之前沿着相同的光路反向传播。换句话说，在第二光收集锥内传播的不同光线在穿过光收集增强器时遵循特定的光路。在实施例中，光收集增强器重定向粒子调制光，使得其沿着其在被光收集增强器重定向之前行进的相同光路行进。在这些实施例中，光收集增强器可以被配置为使得聚光透镜将粒子调制光的准直光束投射到包括平面反射镜的反射光学元件上。在这种情况下，可能希望聚光透镜准直粒子调制光的光束，使得它们沿着相对于平面反射镜垂直的光路传播。因为平面反射镜具有平面的反射表面，其中反射角等于辐照度角，所以粒子调制光沿着与被聚光透镜重新聚焦并被引导到流动池的询问点相同的光路被反向反射到聚光透镜。
在本发明的一些方面中，本主题光收集增强器可从流式细胞仪上拆卸。在这种情况下，流式细胞仪和光收集增强器可以是模块化的，使得光收集增强器可根据需要从流式细胞仪移除并重新附接到流式细胞仪。在实施例中，光收集增强器被壳体包围，反射光学元件和聚光透镜固定在壳体内部。在一些实施例中，反射光学元件和聚光透镜在模块化壳体内的位置减少了这些部件与物镜和流动池的手动光学对准的需要。
图3描绘了根据某些实施例的具有光收集增强器的流式细胞仪系统。穿过流动流301的粒子在询问点302处被光源(未示出)照射。在照射之后，粒子调制光在所有方向上发射。在第一光收集锥303内传播的粒子调制光由物镜304收集并聚焦到光处理模块306上以用于检测。第二光收集锥307内的粒子调制光被光收集增强器310收集并重定向。聚光透镜311收集并准直来自第二光收集锥307的粒子调制光。收集和准直的光随后被引导到反射光学元件，如图3所示为反射镜312。粒子调制光被反射镜312反射，并沿着到达反射镜312之前所遵循的相同光路反向传播到聚光透镜311。聚光透镜311将反向传播的光聚焦到流动池内的询问点302上。随后，反向传播的光以及在第一光收集锥内传播的光被物镜304收集，并聚焦到光处理模块306上以用于检测。
图4描绘了根据某些实施例的通过具有光收集增强器的流式细胞仪系统进行的光收集。粒子调制光在所有方向上发射。第一光收集锥401由120度的顶角限定。第二光收集锥402由45度的顶角限定。第二光收集锥402内的光被聚光透镜403收集和准直。随后，被收集和被聚光的光被引导到反射光学元件，如图4所示为反射镜404。粒子调制光被反射光学元件重定向，使其反向传播到聚光透镜403并聚焦到询问点。随后收集并检测反向传播的粒子调制光以及在第一光收集锥401内传播的粒子调制光。检测到来自第一光收集锥和第二光收集锥两者的粒子调制光，如光束轮廓405所示。
如上所述，本主题流式细胞仪的各方面包括流动池，所述流动池配置为在流动流中传播粒子。可以使用将流体样本传播到样本询问区域的任何方便的流动池，其中在一些实施例中，流动池包括圆柱形流动池、圆锥形流动池或包括限定纵轴的近端圆柱形部分和终止于具有与纵轴横向的孔的平坦表面的远端圆锥形部分的流动池。
在一些实施例中，样本流动流从流动池远端的孔发出。根据流动流的所需特性，流动池孔可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线横截面形状，例如圆形、椭圆形以及不规则形状，例如，耦合到平面顶部的抛物线底部。在某些实施例中，感兴趣的流动池具有圆形孔。在一些实施例中，喷嘴孔的尺寸可以不同，范围从1μm至10000μm，例如从25μm至7500μm，例如从50μm至5000μm，例如从75μm至1000μm，例如从100μm至750μm，包括从150μm至500μm。在某些实施例中，喷嘴孔为100μm。
在一些实施例中，流动池包括被配置为向流动池提供样本的样本注入端口。样本注入端口可以是位于内腔的壁中的孔，也可以是位于内腔近端的导管。如果样本注入端口是位于内腔的壁上的孔，则样本注入端口孔可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线横截面形状，例如圆形、椭圆形等，以及不规则形状，例如，耦合到平面顶部的抛物线底部。在某些实施例中，样本注入端口具有圆形孔。在某些情况下，样本注入端口孔的尺寸可能根据形状而不同，其开口范围为0.1mm至5.0mm，例如0.2至3.0mm，例如0.5mm至2.5mm，例如0.75mm至2.25mm，例如1mm至2mm，包括1.25mm至1.75mm，例如1.5mm。
在某些情况下，样本注入端口是位于流动池内腔近端的导管。例如，样本注入端口可以是导管，该导管被定位成使样本注入端口的孔与流动池孔对齐。如果样本注入端口是与流动池孔对齐的导管，则样本注入管的横截面形状可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线横截面形状，例如圆形、椭圆形，以及不规则形状，例如，耦合到平面顶部的抛物线底部。导管的孔可以根据形状而不同，在某些情况下，其开口范围为0.1mm至5.0mm，例如0.2mm至3.0mm，例如0.5mm至2.5mm，例如0.75mm至2.25mm，例如1mm至2mm，包括1.25mm至1.75mm，例如1.5mm。样本注入端口的尖端的形状可以与样本注入管的横截面形状相同或不同。例如，样本注入端口的孔可以包括斜角尖端，该斜角尖端的斜角范围为1度至10度，例如2度至9度，例如3度至8度，例如4度至7度，并且包括5度的斜角。
在一些实施例中，流动池也包括被配置为向所述流动池提供鞘液的鞘液注入端口。在实施例中，鞘液注入系统被配置为向流动池内腔提供鞘液流，例如与样本结合以产生围绕样本流动流的鞘液的层压流动流。根据流动流的期望特性，由输送到流动池腔室的鞘液的速率可以是25μL/秒至2500μL/秒，例如50μL/秒至1000μL/秒并且包括75μL/秒或更大至750μL/秒。
在一些实施例中，鞘流体注入端口是定位在内腔的壁中的孔。鞘流体注入端口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线横截面形状，例如圆形、椭圆形以及不规则形状，例如，耦合到平面顶部的抛物线底部。在某些情况下，样本注入端口孔的尺寸可能根据形状而不同，其开口范围为0.1mm至5.0mm，例如0.2至3.0mm，例如0.5mm至2.5mm，例如0.75mm至2.25mm，例如1mm至2mm，包括1.25mm至1.75mm，例如1.5mm。
在一些实施例中，系统还包括与流动池流体连通以使流动流传播通过流动池的泵。可以采用任何方便的流体泵协议来控制流动流通过流动池的流动。在某些情况下，系统包括蠕动泵，例如具有脉冲阻尼器的蠕动泵。本主题系统中的泵被配置为以适合于来自流动流中的样本的光的多光子计数的速率来输送流体通过流动池。例如，该系统可以包括泵，该泵被配置为使样本以从1nL/min至500nL/min，例如从1nL/min至250nL/min，例如从1NL/min至100nL/min、例如从2nL/min至90nL/min、例如从3nL/min至80nL/min、如从4nL/min至70nL/min的速率流过流动池，例如从5nL/min至60nL/min并且包括从10nL/min至50nL/min。在某些实施例中，流动流的流速为5nL/min至6nL/min。
如上所述，本发明的各方面包括光源，该光源被配置为照射在询问点通过流动池的粒子。可以采用任何方便的光源作为本文所述的光源。在一些实施例中，所述光源是激光器。在实施例中，激光器可以是任何方便的激光器，例如连续波激光器。例如，激光器可以是二极管激光器，例如紫外二极管激光器、可见二极管激光器和近红外二极管激光器。在其他实施例中，激光器可以是氦氖(HeNe)激光器。在一些情况下，激光器是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光或氙氟(XeF)准分子激光器或其组合。在其他情况下，本主题流式细胞仪包括染料激光器，例如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器。但在其他情况下，相关激光器包括金属蒸气激光器，例如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器，锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在另一些情况下，本主题流式细胞仪包括固态激光器，例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器，Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO4激光器、Nd:YCa4O(BO3)3激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、Yb2O3激光器或铈掺杂激光器及其组合。
在一些实施例中，具有光收集增强器的流式细胞仪包括低功率激光器(例如，来自Kyocera的16mW 488nm Direct Diode Laser(https://www.ksoc.co.jp/en/seihin/lasers/ddfs488.html)。如上所述，本主题光收集增强器可以增加所收集的总粒子调制光的量。因为流式细胞仪系统接收的信号量增加，并且光学噪声水平保持恒定，所以系统的灵敏度总体上增加。在一些情况下，由光收集增强器引起的光收集效率的增加允许使用低功率激光器。在一些实施例中，具有光收集增强器和低功率激光器的流式细胞仪价格较低并且消耗较少的能量。在另外的实施例中，由于低功率激光器的较小重量和尺寸，具有光收集增强器和低功率激光的流式细胞仪可以更紧凑。
根据某些实施例的激光光源还可以包括一个或更多个光学调节部件。在某些实施例中，光学调节部件位于光源和流动池之间，并且可以包括能够改变照射的空间宽度或来自光源的照射的一些其他特性(例如，照射方向、波长、光束宽度、光束强度和焦斑)的任何装置。光学调节协议可以包括调节光源的一个或更多个特性的任何方便的装置，包括但不限于透镜、反射镜、滤波器、光纤、波长分离器、针孔、狭缝、准直协议及其组合。在某些实施例中，感兴趣的流式细胞仪包括一个或更多个聚焦透镜。在一个示例中，聚焦透镜可以是去放大透镜。在其他实施例中，感兴趣的流式细胞仪包括光纤。
在光学调节部件被配置为移动的情况下，光学调节部件可以被配置为连续地或以离散的间隔移动，例如以0.01μm或更大的增量移动，例如0.05μm或更大，例如0.1μm或更大、例如0.5m或更大，如1μm或更大(例如10μm或更大)、例如100μm或更大例如500μm或更大，例如1mm或更大，例如5mm或更大、例如10mm或更大并且包括25mm或更大的增量。
可以采用任何位移协议来移动光学调节部件结构，例如耦合到可移动支撑台或直接利用电机致动的平移台、丝杠平移组件、齿轮平移装置(例如采用步进电机、伺服电机、无刷电机、刷直流电机、微步进驱动电机、高分辨率步进电机以及其他类型的电机的那些)。
光源可以定位在离流动池任何合适的距离处，例如光源和流动池分隔开0.005毫米或更大的距离、例如0.01mm或更大、例如0.05mm或更大、例如0.1mm或更大、例如0.5mm或更大、例如1mm或更大、例如5mm或更大、例如10mm或更大、例如25mm或更大，并且包括100mm或更大的距离。此外，光源可以相对于流动池以任何合适的角度定位，例如以10度至90度、例如15度至85度、例如20度至80度、例如25度至75度并且包括30度至60度的角度，例如以90度的角度。
在一些实施例中，感兴趣的光源包括被配置为提供用于离散照射流动流的激光的1个或更多个激光器，例如被配置为提供用于离散照射流动流的激光的2个或更多个激光器，例如3个或更多个激光器，例如4个或更多个激光器，例如5个或更多个激光器，例如10个或更多个激光器，并且包括15个或更多个激光器。取决于用于照射流动流的期望波长的光，每个激光器可以具有200nm至1500nm的特定波长，例如250nm至1250nm、例如300nm至1000nm、例如350nm至900nm，并且包括400nm至800nm。在某些实施例中，感兴趣的激光器可以包括405nm激光器、488nm激光器、561nm激光器和635nm激光器中的一个或更多个。
在使用多于一个激光器的情况下，可以同时或顺序地用激光器或其组合照射样本。例如，可以用激光器中的每个同时照射样本。在其他实施例中，用激光器中的每个顺序地照射流动流。在采用多于一个的光源来顺序地照射样本的情况下，每个光源照射样本的时间可以独立地为0.001微秒或更多，例如0.01微秒或更多、例如0.1微秒或更多、例如1微秒或更高、例如5微秒或更多、例如10微秒或更多，诸如30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，方法可以包括用光源(例如激光)照射样本，持续时间为0.001微秒至100微秒，例如0.01微秒至75微秒，例如0.1微秒至50微秒，例如1微秒至25微秒，包括5微秒至10微秒。在用两个或更多个光源顺序照射样本的实施例中，每个光源照射样本的持续时间可以相同或不同。
根据需要，每个激光器照射之间的时间段也可以变化，该时间段以0.001微秒或更多的延迟独立地分开、例如0.01微秒或更多，例如0.1微秒或更多、例如1微秒或更多、例如5微秒或更高、例如10微秒或更多、例如15微秒或更多，诸如30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，每个光源照射之间的时间段可以从0.001微秒至60微秒变化，例如0.01微秒至50微秒，例如0.1微秒至35微秒，例如1微秒至25微秒，并且包括5微秒至10微秒。在某些实施例中，每个光源的照射之间的时间段是10微秒。在样本被多于两个(即，3个或更多个)激光器顺序照射的实施例中，每个激光器照射之间的延迟可以相同或不同。
可以连续地或以离散间隔照射样本。在一些情况下，光源被配置为连续地照射流动池中的样本。在其他实施例中，光源被配置为提供用于以离散间隔照射流动流的激光。术语“离散间隔”在本文中的传统意义上是指对流动流进行预定持续时间的激光照射，随后是流动流不被激光照射的一段时间(例如，通过关闭激光器或通过诸如用斩波器、光束光阑等阻挡从光传播部件输送的激光)。在一些实施例中，激光以0.001μs或更多的离散间隔输送到流动流中，例如0.005μs或更多、例如0.01μs或更多、例如0.05μs或更多、例如0.1μs或更多、例如0.5μs或更多、例如1μs或更多、例如5μs或更多、例如10μs或更多、例如50μs或更多，例如100μs或更多，并且包括500μs或更多。在某些情况下，激光以0.0001μs至500ms的离散间隔输送到流动流中，例如0.0005μs至250ms，例如0.001μs至50ms，如0.005μs至5ms，例如0.01μs至1000μs，例如0.05μs至750μs，例如0.1μs至500μs，例如0.5μs至250μs，例如1μs至100μs，并且包括10μs至100μs。每个离散间隔之间的持续时间可以是0.001μs或更多，例如0.005μs或更多、例如0.01μs或更多、例如0.05μs或更多、例如0.1μs或更多、例如0.5μs或更多、例如1μs或更多、例如5μs或更多、例如10μs或更多、例如50μs或更多，例如100μs或更多，并且包括500μs或更多。例如，每个离散间隔之间的持续时间可能为0.0001μs至500ms，例如0.0005μs至250ms，例如0.001μs至50ms，如0.005μs至5ms，例如0.01μs至1000μs，例如0.05μs至750μs，例如0.1μs至500μs，例如0.5μs至250μs，例如1μs至100μs，并且包括10μs至100μs。
本主题流式细胞仪的各方面还包括用于检测粒子调制光的一个或更多个光检测器。如上所述，物镜被配置为将粒子调制光聚焦到一个或更多个光检测器上以用于检测。可以采用用于检测所收集的光的任何方便的检测器。例如，在粒子调制光包括侧向散射光的情况下，本发明的各方面可以包括侧向散射检测器，该侧向散射检测器被配置为检测光的侧向散射波长(例如，从粒子的表面和内部结构折射和反射的光)。在其他实施例中，流式细胞仪包括多个侧向散射检测器，例如2个或更多、例如3个或更多、例如4个或更多，并且包括5个或更多。
用于检测所收集的光的任何方便的检测器都可以用于本文所述的侧向散射检测器中。感兴趣的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，例如有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(PMTs)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合，以及其他检测器。在某些实施例中，利用电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器来测量所收集的光。在某些实施例中，检测器是光电倍增管，例如每个区域具有的有效检测表面积为0.01cm2至10cm2，例如0.05cm2至9cm2、例如0.1cm2至8cm2、例如0.5cm2至7cm2，并且包括1cm2至5cm2的光电倍增管。
在本主题流式细胞仪包括多个侧向散射检测器的情况下，每个侧向散射检测器可以是相同的，或者侧向散射检测器的集合可以是不同类型检测器的组合。例如，在本主题流式细胞仪包括两个侧向散射检测器的情况下，在一些实施例中，第一侧向散射检测器是CCD型器件，而第二侧向散射检测器(或成像传感器)是CMOS型器件。在其他实施例中，第一侧向散射检测器和第二侧向散射检测器两者都是CCD型器件。在其他实施例中，第一侧向散射检测器和第二侧向散射检测器两者都是CMOS型器件。在其他实施例中，第一侧向散射检测器是CCD型器件，第二侧向散射检测器为光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)。在其他实施例中，第一侧向散射检测器是CMOS型器件，第二侧向散射检测器为光电倍增管。在其他实施例中，第一侧向散射检测器和第二侧向散射检测器两者都是光电倍增管。
本发明的实施例还包括位于流动池和侧向散射检测器之间的光散射/分离器模块。感兴趣的光散射装置包括但不限于彩色玻璃、带通滤波器、干涉滤波器、二向色镜、衍射光栅、单色器及其组合以及其他波长分离装置。
在实施例中，本主题流式细胞仪还包括被配置为检测一个或更多个荧光波长的光的荧光检测器。在其他实施例中，流式细胞仪包括多个荧光检测器，例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如10个或更多个、例如15个或更多个，并且包括20个或更多个。
用于检测所收集的光的任何方便的检测器都可以用于本文所述的荧光检测器中。感兴趣的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，例如有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(PMTs)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合，以及其他检测器。在某些实施例中，利用电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器来测量所收集的光。在某些实施例中，检测器是光电倍增管，例如每个区域具有的有效检测表面积为0.01cm2至10cm2，例如0.05cm2至9cm2、例如0.1cm2至8cm2、例如0.5cm2至7cm2，并且包括1cm2至5cm2的光电倍增管。
在本主题流式细胞仪包括多个荧光检测器的情况下，每个荧光检测器可以是相同的，或者荧光检测器的集合可以是不同类型检测器的组合。例如，在本主题流式细胞仪包括两个荧光检测器的情况下，在一些实施例中，第一荧光检测器是CCD型器件，而第二荧光检测器(或成像传感器)是CMOS型器件。在其他实施例中，第一荧光检测器和第二荧光检测器两者都是CCD型器件。在其他实施例中，第一荧光检测器和第二荧光检测器两者都是CMOS型器件。在其他实施例中，第一荧光检测器是CCD型器件，第二荧光检测器为光电倍增管(PMT)。在其他实施例中，第一荧光检测器是CMOS型器件，第二荧光检测器为光电倍增管。在其他实施例中，第一荧光检测器和第二荧光检测器两者都是光电倍增管。
本发明的实施例还包括位于流动池和荧光检测器之间的光散射/分离器模块。感兴趣的光散射装置包括但不限于彩色玻璃、带通滤波器、干涉滤波器、二向色镜、衍射光栅、单色器及其组合以及其他波长分离装置。
在本公开的实施例中，感兴趣的荧光检测器被配置为在一个或更多个波长下测量所收集的光，例如在2个或更多个波长下、例如在5个或更多个不同波长下、例如在10个或更多个不同波长下、诸例如在25个或更多个不同波长下、例如在50个或更多个不同波长下、例如在300个或更多个不同波长下，并且包括测量在400个或更多个不同波长下由流动流中的样本发出的光。在一些实施例中，如本文所述的流式细胞仪中的2个或更多个检测器被配置为测量所收集的光的相同或重叠波长。
在一些实施例中，感兴趣的荧光检测器被配置为测量在一波长范围(例如，200nm至1000nm)内收集的光。在某些实施例中，感兴趣的检测器被配置为收集一波长范围内的光的光谱。例如，流式细胞仪可以包括被配置为收集在200nm至1000nm的波长范围中的一个或更多个内的光的光谱的一个或更多个检测器。在其他实施例中，感兴趣的检测器被配置为测量由流动流中的样本在一个或更多个特定波长下发射的光。例如，流式细胞仪可以包括一个或更多个检测器，该检测器被配置为测量450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及其任意组合中的一个或更多个处的光。在某些实施例中，一个或更多个检测器可以被配置为与特定荧光团配对，例如在荧光测定中与样本一起使用的那些荧光团。
本发明的各方面还包括被配置为检测前向散射光的前向散射检测器。本主题流式细胞仪中的前向散射检测器的数量可以根据需要而变化。例如，本主题粒子分析器可以包括1个前向散射检测器或多个前向散射检测器，例如2个或更多，例如3个或更多，例如4个或更多并且包括5个或更多。在某些实施例中，流式细胞仪包括1个前向散射检测器。在其他实施例中，流式细胞仪包括2个前向散射检测器。
用于检测所收集的光的任何方便的检测器都可以用于本文所述的前向散射检测器中。感兴趣的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，例如有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(PMT)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合，以及其他检测器。在某些实施例中，利用电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器来测量所收集的光。在某些实施例中，检测器是光电倍增管，例如每个区域具有的有效检测表面积为0.01cm2至10cm2，例如0.05cm2至9cm2、例如0.1cm2至8cm2、例如0.5cm2至7cm2，并且包括1cm2至5cm2的光电倍增管。
当本主题粒子分析仪包括多个前向散射检测器时，每个检测器可以是相同的，或者检测器的集合可以是不同类型检测器的组合。例如，在本主题粒子分析仪包括两个前向散射检测器的情况下，在一些实施例中，第一前向散射检测器是CCD型器件，而第二前向散射检测器(或成像传感器)是CMOS型器件。在其他实施例中，第一前向散射检测器和第二前向散射检测器两者都是CCD型器件。在其他实施例中，第一前向散射检测器和第二前向散射检测器两者都是CMOS型器件。在其他实施例中，第一前向散射检测器是CCD型器件，第二前向散射检测器为光电倍增管(PMT)。在其他实施例中，第一前向散射检测器是CMOS型器件，第二前向散射检测器为光电倍增管。在其他实施例中，第一前向散射检测器和第二前向散射检测器两者都是光电倍增管。
本发明的实施例还包括位于流动池和前向散射检测器之间的光散射/分离器模块。感兴趣的光散射装置包括但不限于彩色玻璃、带通滤波器、干涉滤波器、二向色镜、衍射光栅、单色器及其组合以及其他波长分离装置。在一些实施例中，带通滤波器被定位在流动池和前向散射检测器之间。在其它实施例中，多于一个的带通滤波器定位在流动池和前向散射检测器之间，例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个，并且包括5个或更多个。在实施例中，带通滤波器具有的最小带宽为从2nm到100nm，例如从3nm到95nm，例如从5nm到95nm，例如从10nm到90nm，例如从12nm到85nm，例如从15nm到80nm，并且包括具有的最小带宽为从20nm到50nm波长范围的带通滤波器，并且将具有其他波长的光反射到前向散射检测器。
在实施例中，本主题光检测器被配置为连续地或以离散的间隔测量光。在一些情况下，光检测器被配置为连续地对所收集的光进行测量。在其他情况下，感兴趣的光收集元件被配置为以离散间隔进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每隔10毫秒、每100毫秒，并且包括每1000毫秒，或某其他间隔测量光。
本发明的实施例还包括定位在物镜和一个或更多个光检测器之间的光学调节部件。所谓“光学调节”是指可以根据需要改变粒子调制光的参数，例如增加或减少光束的宽度、光束照射方向、波长、光束轮廓、光束宽度、光束强度、焦点、脉冲宽度或其他参数。在一些情况下，光学调节是一种放大协议，其被配置为增加束斑的空间尺寸，例如增加1％或更大，例如增加5％或更大、例如增加10％或更大、例如增加25％或更大，例如增加50％或更大并且包括将束斑的空间尺寸增加75％或更大。在其他情况下，光学调节是一种去放大协议，其被配置为减小激光束斑的空间尺寸，例如减小1％或更多，例如减小5％或更多、例如减小10％或更多、例如减小25％或更多，例如减小50％或更多并且包括将激光束斑的空间尺寸减小75％或更多。在其他情况下，光学调整包括在经由光束准直器照射光收集元件之前准直至少第一光束和第二光束。
合适的流式细胞仪系统可以包括但不限于Ormerod(ed.),Flow Cytometry:APractical Approach,Oxford Univ.Press(1997)；Jaroszeski et al.(eds.),FlowCytometry Protocols,Methods in Molecular Biology No.91,Humana Press(1997)；Practical Flow Cytometry,3rd ed.,Wiley-Liss(1995)；Virgo,et al.(2012)Ann ClinBiochem.Jan；49(pt 1):17-28；Linden,et.al.,Semin Throm Hemost.2004Oct；30(5):502-11；Alison,et al.J Pathol,2010Dec；222(4):335-344；以及Herbig,et al.(2007)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.24(3):203-255；其公开内容通过引用并入本文。在某些情况下，感兴趣的流式细胞仪系统包括BD Biosciences FACSCantoTM流式细胞仪,BDBiosciences FACSCantoTMII流式细胞仪,BD AccuriTM流式细胞仪,BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪,BD Biosciences FACSCelestaTM流式细胞仪,BD Biosciences FACSLyricTM流式细胞仪,BD Biosciences FACSVerseTM流式细胞仪,BD Biosciences FACSymphonyTM流式细胞仪,BD Biosciences LSRFortessaTM流式细胞仪,BD Biosciences LSRFortessaTM X-20流式细胞仪,BD Biosciences FACSPrestoTM流式细胞仪,BD Biosciences FACSViaTM流式细胞仪和BD Biosciences FACSCaliburTM细胞分选机,BD Biosciences FACSCountTM细胞分选机,BD Biosciences FACSLyricTM细胞分选机,BD Biosciences ViaTM细胞分选机,BDBiosciences InfluxTM细胞分选机,BD Biosciences JazzTM细胞分选机,BD BiosciencesAriaTM细胞分选机,BD Biosciences FACSAriaTMII细胞分选机,BD BiosciencesFACSAriaTMIII细胞分选机,BD Biosciences FACSAriaTM Fusion细胞分选机以及BDBiosciences FACSMelodyTM细胞分选机,BD Biosciences FACSymphonyTM S6细胞分选机或类似物。
在一些实施例中，本主题系统是流式细胞仪系统，如美国专利10,663,476；10,620,111；10,613,017；10,605,713；10,585,031；10,578,542；10,578,469；10,481,074；10,302,545；10,145,793；10,113,967；10,006,852；9,952,076；9,933,341；9,726,527；9,453,789；9,200,334；9,097,640；9,095,494；9,092,034；8,975,595；8,753,573；8,233,146；8,140,300；7,544,326；7,201,875；7,129,505；6,821,740；6,813,017；6,809,804；6,372,506；5,700,692；5,643,796；5,627,040；5,620,842；5,602,039；4,987,086；4,498,766中所述，其公开内容通过其引用并入本文。
在某些情况下，本发明的流式细胞仪系统被配置用于通过使用射频标记发射(radiofrequency tagged emission，FIRE)的荧光成像来对流动流中的粒子进行成像，例如Diebold等在Nature Photonics Vol.7(10)；806-810(2013)中描述的，以及在美国专利Nos.9,423,353；9,784,661；9,983,132；10,006,852；10,078,045；10,036,699；10,222,316；10,288,546；10,324,019；10,408,758；10,451,538；10,620,111中描述的；以及美国专利公开Nos.2017/0133857；2017/0328826；2017/0350803；2018/0275042；2019/0376895和2019/0376894，其公开内容通过引用并入本文。
图5示出了用于根据本发明的说明性实施例的流式细胞仪的系统500。系统500包括流式细胞仪510、控制器/处理器590和存储器595。流式细胞仪510包括一个或更多个激发激光器515a-515c、聚焦透镜520、流动池525、光收集增强器570、前向散射检测器530、侧向散射检测器535、物镜540、一个或更多个分束器545a-545g、一个或更多个带通滤波器550a-550e、一个或更多个长通(“LP”)滤波器555a-555b和一个或更多个荧光检测器560a-560f。
激发激光器515a-c发射激光束形式的光。在图5的示例系统中，从激发激光器515a-515c发射的激光束的波长分别为488nm、633nm和325nm。激光束首先被引导通过分束器545a和545b中的一个或更多个。分束器545a透射488nm的光并反射633nm的光。分束器545b透射UV光(波长为10至400nm的光)并反射488nm和633nm的光。
然后，激光束被引导到聚焦透镜520，聚焦透镜将光束聚焦到流动池525内样本粒子所在的流体流部分上。流动室是流体系统的一部分，该流动室将流中的粒子(通常一次一个)引导至聚焦激光束进行询问。流动室能够包括台式细胞仪(benchtop cytometer)中的流动池或空气流式细胞仪(stream-in-air cytometer)中的喷嘴尖端。
来自激光束的光通过衍射、折射、反射、散射和吸收与样本中的粒子相互作用，并根据粒子的特性(例如其尺寸、内部结构以及附着在粒子上或粒子中的一种或更多种荧光分子的存在)以不同波长再发射。粒子调制光在所有方向上发射。在第一光检测锥526内传播的粒子调制光通过分束器545a-545g、带通滤波器550a-550e、长通滤波器555a-555b和物镜540中的一个或更多个被路由到侧向散射检测器535和一个或更多个荧光检测器560a-560f中的一者或更多者。另一方面，在第二光收集锥527内传播的粒子调制光被光收集增强器570重定向，使得其反向传播通过流动池525并被物镜540聚焦。光收集增强器570包括聚光透镜571和反射光学元件572。
物镜540收集从粒子-激光束相互作用发出的光，并将该光路由向一个或更多个分束器和滤波器。带通滤波器，例如带通滤波器550a-550e，允许窄范围的波长通过滤波器。例如，带通滤波器550a是510/20滤波器。第一个数字表示光谱带的中心。第二个数字提供了光谱带的范围。因此，510/20滤波器在光谱带中心的每一侧延伸10nm，或从500nm延伸到520nm。短通滤波器传输等于或短于指定波长的光。长通滤波器，例如长通滤波器555a-555b，透射等于或长于指定波长的光的波长。例如，为670nm长通滤波器的长通滤波器555a透射等于或长于670nm的光。通常选择滤波器以优化检测器对特定荧光染料的特异性。滤波器能够被配置为使得透射到检测器的光的光谱带接近荧光染料的发射峰。
分束器将不同波长的光导向不同的方向。分束器能够通过诸如短通和长通的滤波器特性来表征。例如，分束器505g是620SP分束器，这意味着分束器545g透射620nm或更短的波长的光，并在不同方向上反射长于620nm的波长的光。在一个实施例中，分束器545a-545g能够包括光学镜，例如分色镜。
前向散射检测器530定位为与穿过流动池的直射光束偏离轴线，并被配置成检测衍射光，该衍射光是在大部分向前方向上穿过或围绕粒子传播的激发光。前向散射检测器检测到的光的强度取决于粒子的总体尺寸。前向散射检测器能够包括光电二极管。侧向散射检测器535被配置为检测来自粒子表面和内部结构的折射光和反射光，并且倾向于随着结构的粒子复杂性的增加而增加。来自与粒子相关联的荧光分子的荧光发射能够由一个或更多个荧光检测器560a-560f检测。侧向散射检测器535和荧光检测器能够包括光电倍增管。在前向散射检测器530、侧向散射检测器535和荧光检测器处检测到的信号能够由检测器转换成电信号(电压)。这些数据能够提供有关样本的信息。
流式细胞仪运行由控制器/处理器590控制，并且来自检测器的测量数据能够存储在存储器595中并由控制器/处理器590处理。尽管未明确示出，但控制器/处理器590耦合到检测器以从其接收输出信号，并且还可以耦合到流式细胞仪500的电气和机电部件以控制激光器、流体流动参数及类似物。也可以在系统中提供输入/输出(I/O)能力597。存储器595、控制器/处理器590和I/O 597可以被整体提供为流式细胞仪510的整体部分。在这样的实施例中，显示器还可以形成用于向细胞仪500的用户呈现实验数据的I/O能力597的一部分。可选地，存储器595和控制器/处理器590以及I/O能力中的一些或全部可以是一个或更多个外部设备(例如通用计算机)的一部分。在一些实施例中，存储器595和控制器/处理器590中的一些或全部能够与细胞仪510进行无线或有线通信。控制器/处理器590结合存储器595和I/O 597，能够被配置为执行与流式细胞仪实验的准备和分析相关的各种功能。
图5所示的系统包括六个不同的检测器，其检测由从流动池525到每个检测器的光束路径中的滤光器和/或分离器的配置所定义的六个不同波长带(这里可以称为用于给定检测器的“滤窗”)中的荧光。用于流式细胞仪实验的不同荧光分子将以其自身的特征波长带发光。用于实验的特定荧光标记及其相关的荧光发射带可以被选择为大体上与检测器的滤窗一致。然而，由于提供了更多的检测器，并且使用了更多的标签，滤窗和荧光发射光谱之间的完美对应是不可能的。一般来说，尽管特定荧光分子的发射光谱的峰值可能位于一个特定检测器的滤窗内，但该标签的一些发射光谱也将与一个或更多个其他检测器的滤窗重叠。这可以称为溢出(spillover)。I/O 597能够被配置为接收与具有一组荧光标记的流式细胞仪实验以及具有多个标记的多个细胞群相关的数据，每个细胞群具有多个标记的子集。I/O 597还能够被配置为接收将一个或更多个标记分配给一个或更多个细胞群的生物数据、标记密度数据、发射光谱数据、将标签分配到一个或更多个标记的数据以及细胞仪配置数据。流式细胞仪实验数据(例如标签光谱特性和流式细胞仪配置数据)也能够存储在存储器595中。控制器/处理器590能够被配置为评估标签到标记的一个或更多个分配。
本领域技术人员将认识到，根据本发明的实施例的流式细胞仪不限于图5所示的流式细胞仪但能够包括本领域已知的任何流式细胞仪。例如，流式细胞仪能够具有各种波长和各种不同配置的任意数量的激光器、分束器、滤波器和检测器。
在一些实施例中，本主题系统是配置为使用封闭的粒子分选模块对粒子进行分选的粒子分选系统，例如2017年3月28日提交的美国专利公开No.2017/0299493中所述的那些系统，其公开内容通过引用并入本文。在某些实施例中，使用具有多个分选决策单元的分选决策模块来对样本的粒子(例如，细胞)进行分选，例如在2020年8月13日提交的美国专利公开No.2020/0256781中描述的那些分选决策单元，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施例中，用于分选样本组分的系统包括具有偏转器板的粒子分选模块，例如2017年3月28日提交的美国专利公开No.2017/0299493中所述的那些系统，其公开内容通过引用并入本文。
图6示出了用于分析和显示生物事件的分选控制系统(例如处理器600)的一个示例的功能框图。处理器600能够被配置为实现用于控制生物事件的图形显示的各种过程。
流式细胞仪或分选系统602能够被配置为获取生物事件数据。例如，流式细胞仪能够生成流式细胞术事件数据。流式细胞仪602能够被配置为向处理器600提供生物事件数据。数据通信信道可以包括在流式细胞仪602和处理器600之间。生物事件数据能够经由数据通信信道提供给处理器600。
处理器600能够被配置为从流式细胞仪602接收生物事件数据。从流式细胞仪602接收的生物事件数据能够包括流式细胞仪事件数据。处理器600能够被配置为向显示设备606提供包括生物事件数据的第一绘图的图形显示。处理器600还能够被配置为例如将感兴趣区域渲染为覆盖在第一绘图上的、由显示设备606显示的生物事件数据群周围的门。在一些实施例中，门可以是在单参数直方图或双变量图上绘制的一个或更多个图形化的感兴趣区域的逻辑组合。在一些实施例中，显示器可用于显示粒子参数或饱和检测器数据。
处理器600还能够被配置为在门内的显示设备606上显示不同于门外的生物事件数据中的其他事件的生物事件数据。例如，处理器600能够被配置为将包含在门内的生物事件数据的颜色渲染为不同于门外的生物事件的颜色。显示设备606能够被实现为监视器、平板电脑、智能手机或被配置为呈现图形界面的其他电子设备。
处理器600能够被配置为从第一输入设备接收识别门的门选择信号。例如，第一输入设备能够被实现为鼠标610。鼠标610能够向处理器600发起门选择信号，该门选择信号识别要在显示设备606上显示或经由显示设备306操纵的门(例如，当光标位于所需门上时，通过在期望门上或期望门中点击)。在一些实现中，第一设备能够被实现为键盘608或用于向处理器600提供输入信号的其他装置，例如触摸屏、触笔、光学检测器或语音识别系统。一些输入设备能够包括多个输入功能。在这样的实现中，每个输入功能均能够被视为输入设备。例如，如图6，鼠标610能够包括鼠标右键和鼠标左键，鼠标右键和鼠标左键中的每一个都能够生成触发事件。
触发事件能够使处理器600改变数据的显示方式，数据的哪些部分实际显示在显示设备606上，和/或向另外的过程提供输入，例如选择感兴趣的群进行粒子分选。
在一些实施例中，处理器600能够被配置为检测何时由鼠标610发起门选择。处理器600另外能够被配置为自动修改绘图可视化以促进门过程。该修改能够基于由处理器600接收的生物事件数据的特定分布。
处理器600能够连接到存储设备604。存储设备604能够被配置为从处理器600接收和存储生物事件数据。存储设备604也能够被配置为从处理器600接收和存储流式细胞术事件数据。存储设备604另外能够被配置为允许处理器600检索生物事件数据(例如流式细胞术事件数据)。
显示设备606能够被配置为从处理器600接收显示数据。显示数据能够包括生物事件数据的绘图和勾画绘图的部分的门。显示设备606另外能够被配置为根据从处理器300接收的输入以及来自流式细胞仪602、存储设备604、键盘608和/或鼠标610的输入来改变所呈现的信息。
在一些实现中，处理器600能够生成用户界面以接收用于分选的示例事件。例如，用户界面能够包括用于接收示例事件或示例图像的控件。示例事件或图像或示例门能够在收集样本的事件数据之前或基于样本的一部分的初始事件集来提供。
图7A是根据本文提出的一个实施例的粒子分选系统700(例如流式细胞仪602)的示意图。在一些实施例中，粒子分选系统700是细胞分选系统。如图7A所示，小滴形成换能器702(例如，压电振荡器)耦合到流体导管701，流体导管能够耦合到、能够包括或能够是喷嘴703。在流体导管701内，鞘流体704流体动力学地将包括粒子709的样本流体706聚焦到移动的流体柱708(例如流)中。在移动的流体柱708内，粒子709(例如，细胞)以单列排列，以穿过被照射源712(例如，激光器)照射的监测区域711(例如，激光-流相交的地方)。小滴形成换能器702的振动导致移动的流体柱708破裂成多个小滴710，其中一些小滴含有粒子709。
在运行中，检测站714(例如，事件检测器)识别感兴趣粒子(或感兴趣细胞)何时穿过监测区域711。检测站714馈入定时电路728，定时电路526又馈入闪充电路730。在由定时小滴延迟(Δt)通知的小滴中断点处，能够向移动的流体柱708施加闪充，使得感兴趣的小滴携带电荷。感兴趣的小滴能够包括一个或更多个待分选的粒子或细胞。然后，能够通过激活偏转板(未示出)将带电小滴偏转到容器(例如收集管或多孔或微孔样本板)中来对带电小滴进行分选，其中孔或微孔能够与特定感兴趣的小滴相关联。如图7A所示，小滴能够收集在排放接收器738中。
检测系统716(例如，小滴边界检测器)用于在感兴趣的粒子通过监测区域711时自动确定小滴驱动信号的相位。在美国专利No.7,679,039中描述了示例性的小滴边界检测器，其通过引用全部并入本文。检测系统716允许仪器准确地计算每个检测到的粒子在小滴中的位置。检测系统716能够馈入幅值信号720和/或相位718信号中，该信号(经由放大器722)又馈入幅值控制电路726和/或频率控制电路724中。幅值控制电路726和/或频率控制电路724又控制小滴形成换能器702。幅值控制电路726和/或频率控制电路724能够包括在控制系统中。
在一些实现中，分选电子设备(例如，检测系统716、检测站714和处理器740)能够与存储器耦合，所述存储器被配置为存储检测到的事件和基于其的分选决策。所述分选决策能够包括在粒子的事件数据中。在一些实现中，检测系统716和检测站714能够被实现为单个检测单元或通信耦合，使得事件测量能够由检测系统716或检测站714中的一个收集并提供给非收集元件。
图7B是根据本文提出的一个实施例的粒子分选系统的示意图。图7B所示的粒子分选系统700包括偏转板752和754。电荷能够通过倒钩中的流充电线施加。这产生了包含用于分析的粒子710的小滴流710。能够用一个或更多个光源(例如激光器)照射粒子以产生光散射和荧光信息。例如通过分选电子设备或其他检测系统(图7B中未示出)来分析粒子的信息。偏转板752和754能够被独立地控制以吸引或排斥带电小滴，以将小滴导向目的收集接收器(例如，772、774、776或778中的一个)。如图7B所示，偏转板752和754能够被控制为沿着第一路径762朝向容器774或沿着第二路径768朝向容器778引导粒子。如果粒子是非感兴趣的(例如，在指定的分选范围内不显示散射或照明信息)，偏转板可以允许粒子沿着流动路径764继续。这种不带电的小滴可以例如经由抽吸器770进入废物接收器。
能够包括分选电子设备，以启动测量的收集、接收粒子的荧光信号、并确定如何调整偏转板以使粒子分选。图7B所示实施例的示例实现包括由Becton，Dickinson andCompany(Franklin Lakes，NJ)商业提供的流式细胞仪BD FACSAriaTM系列。
用于分析样本的方法
本发明的各方面还包括分析样本的方法。本主题方法的实施例包括将样本引入流式细胞仪，所述流式细胞仪包括用于在流动流中输送粒子的流动池、用于在询问点照射流动流中的粒子的光源、用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光的物镜，以及光收集增强器。该方法中感兴趣的光收集增强器被配置为收集沿第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光，使得其沿相同的光路反向传播并由物镜聚焦。
所分析的样本可以是用户感兴趣的任何样本。在某些实施例中，样本包含生物成分，或者是生物样本。术语“生物样本”在其传统意义上是指来源于或包含整个生物体的样本，例如原核细胞、真核细胞、植物、真菌或动物组织、细胞或组成部分的子集，在某些情况下，这些组织、细胞和组成部分可以在血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、支气管肺泡灌洗、羊水、脐带血、尿液、阴道液和精液中找到。因此，“生物样本”既指原生生物或其组织的子集，也指：匀浆；分离、纯化或富集的生物粒子(例如DNA、RNA、蛋白质、亚细胞器等)；以及从生物体或其组织的子集制备的裂解物或提取物，包括但不限于，例如，血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤切片、呼吸道、胃肠道、心血管和泌尿生殖道、眼泪、唾液、奶水、血细胞、肿瘤、器官。生物样本可以是任何类型的有机体组织，包括健康组织和病变组织(例如癌组织、恶性组织、坏死组织等)。在某些实施例中，生物样本是液体样本，例如血液或其衍生物，例如血浆、眼泪、尿液、精液等，其中在某些情况下样本是血液样本，包括全血，例如从静脉穿刺或手指针刺中获得的血液(血液在分析前可能或可能不与任何试剂结合，如防腐剂、抗凝剂等)。
在某些实施例中，样本的来源是“哺乳动物”或“哺乳类”，其中这些术语广泛用于描述哺乳动物类内的生物体，包括食肉目(例如狗和猫)、啮齿动物(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如人类、黑猩猩和猴子)。在某些情况下，受试者是人。所述方法可应用于从两性和处于任何发育阶段(即，新生儿、婴儿、少年、青少年、成人)的人类受试者获得的样本，其中在某些实施例中，人类受试者是少年、青少年或成人。虽然本发明的实施例可应用于来自人类受试者的样本，但应理解，该方法也可对来自其他动物受试者(即，在“非人受试者”中)的样本实施，例如但不限于鸟类、小鼠、大鼠、狗、猫、牲畜和马。
在根据某些实施例的实践方法中，用来自光源的光照射样本(例如，在流式细胞仪的流动流中的样本)。可以使用任何方便的光源。在某些情况下，方法包括用激光器照射流动池。在某些实施例中，激光器可以是任何方便的激光器，例如连续波激光器。例如，激光器可以是二极管激光器，例如紫外二极管激光器、可见二极管激光器和近红外二极管激光器。在其他实施例中，激光器可以是氦氖(HeNe)激光器。在一些情况下，激光器是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光或氙氟(XeF)准分子激光器或其组合。在其他情况下，用于实践本主题方法的激光器包括染料激光器，例如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器。但在其他情况下，相关激光器包括金属蒸气激光器，例如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器，锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在另一些情况下，用于实践本主题方法的激光器包括固态激光器，例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器，Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO4激光器、Nd:YCa4O(BO3)3激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、Yb2O3激光器或铈掺杂激光器及其组合。在一些实施例中，方法包括用低功率激光器产生的光照射样本。在一些情况下，由光收集增强器引起的光收集效率的增加允许使用低功率激光器。在一些实施例中，具有光收集增强器和低功率激光器的流式细胞仪价格较低并且消耗较少的能量。在另外的实施例中，由于低功率激光器的较小重量和尺寸，具有光收集增强器和低功率激光器的流式细胞仪可以更紧凑。
如上所述，方法包括收集在第一光收集锥和第二光收集锥内传播的粒子调制光。第一光收集锥可以是任何方便的尺寸。在一些实施例中，本主题第一光收集锥由范围从小于1度至120度的顶角限定，诸如50度至120度，并且包括100度至120度。在某些情况下，第一光收集锥由120度的顶角限定。在一些实施例中，第一收集锥的尺寸可以由物镜的尺寸(例如，直径)来确定。例如，具有大物镜的光学系统可以通过产生具有更宽顶角的第一光收集锥来增加所收集的粒子调制光的量。第一收集锥的尺寸也可以通过将流动池和物镜分隔开的距离来确定。例如，具有将流动池和物镜分隔开的短距离的光学系统可以通过产生具有更宽顶角的第一光收集锥来增加所收集的粒子调制光的量。
在某些实施例中，方法包括经由光收集增强器收集在第二光收集锥内传播的粒子调制光，并重定向所收集的光，使得其(即，除了在第一光收集锥中传播的粒子调节光之外)也被物镜聚焦。因此，第二光收集锥包括在与第一光收集锥内的粒子调制光传播的第一方向不同的第二方向上远离流动池传播的粒子调制光。本主题第二光收集锥可以由任何方便的顶角限定。在一些实施例中，第二光收集锥由范围从小于1度至120度的顶角限定，诸如50度至120度，并且包括100度至120度。在某些实施例中，第二光收集锥由范围从20度至100度的顶角限定。在另外的情况下，第二光收集锥由45度的顶角限定。在一些情况下，第二光收集锥与第一光收集锥具有相同的尺寸。在其他情况下，第二光收集锥小于第一光收集锥。
在一些情况下，光收集增强器增加了从流动池收集的粒子调制光的总量。例如，在一些实施例中，本主题光收集增强器可以重定向在第二光收集锥内传播的粒子调制光，使得从流动池收集的粒子调制光的总量可以增加小于1％至100％，例如20％至99％，并且包括30％至50％。在一些情况下，粒子调制光总量的增加与第二光收集锥相对于第一光收集锥的尺寸成比例。例如，在第二收集锥和第一收集锥具有相同尺寸的情况下，本主题光收集增强器可以将所收集的光的总量增加100％，使收集的粒子调制光的总量有效地加倍。因此，光收集增强器可以被配置为收集第二光收集锥内的粒子调制光，否则第二光收集锥内的粒子调制光将保持未被收集并且未被流式细胞仪检测到。因此，感兴趣的光收集增强器可以增加检测到的信号量，从而提高信噪比。所谓“噪声”，是指流式细胞仪数据中因激光操作变化(即激光强度变化)而产生的不相关和受损的信号。因此，在某些情况下，本主题光收集增强器可以通过增加相对于噪声检测到的粒子调制光信号的量来提高流式细胞仪数据的质量。
在一些实施例中，光收集增强器和相应的第二光收集锥相对于物镜和第一收集锥位于流动池的相对侧。在这样的实施例中，光收集增强器重定向在第二光收集锥内传播的粒子调制光，使得光反向传播到流动池。反向传播的光随后穿过流动池的询问点，从而被引导到物镜，使得可以对其进行聚焦和检测。换言之，已经被光收集增强器重定向通过流动池的询问点的第二光收集锥内的粒子调制光与在第一光收集锥内传播的粒子调制光一起被物镜聚焦。
光收集增强器的各方面包括反射光学元件，该反射光学元件用于重定向所收集的光，使得其被物镜聚焦。用于反射光的任何方便的光学元件都可以用作本文所描述的反射光学元件。在某些情况下，反射光学元件包括反射镜。在其他实施例中，反射光学元件包括一系列反射镜。在某些情况下，反射光学元件由一个或更多个平面反射镜组成。本文所述的平面反射镜具有平面的反射表面，其中反射角等于辐照度角(即，反射镜具有无穷远的焦距)。在另外的实施例中，反射光学元件被配置为反转在第二光收集锥内传播的重定向的粒子调制光的波前。在一些情况下，反向传播的粒子调制光的反向波前防止与在第二光收集锥和/或第一光收集锥中传播离开流动池的光的光学干涉。反射光学元件可以相对于流动池定位在任何方便的距离处。例如，在一些实施例中，将反射光学元件与流动池分隔开的距离范围从大于0mm至100mm(例如，0.1mm至100mm)，例如20mm至80mm，并且包括30mm至60mm。在一些情况下，本主题反射光学元件是消色差的。在这些情况下，反射光学元件不将粒子调制光分隔成不同波长/颜色的光束。
光收集增强器的各方面还包括位于反射光学元件和流动池之间的聚光透镜。如上所述，从穿过流动池的粒子发射的光在所有方向上传播。因此，本主题聚光透镜收集在第二光收集锥内传播的这种发散光线，并准直这些光线，使得它们相对于彼此平行行进。除了准直光束之外，本主题聚光透镜将在第二光收集锥内传播的粒子调制光引导到反射光学元件。在某些情况下，反射光学元件被定位成反射粒子调制光，使得光反向传播到聚光透镜。在返回聚光透镜之后，在某些情况下，反向传播的粒子调制光被聚光透镜聚焦到流动池的询问点上，使得光被物镜聚焦(例如，如上所述)。在某些情况下，本主题聚光透镜是消色差的。在这些情况下，聚光透镜不将粒子调制光分隔成不同波长/颜色的光束。
在光收集增强器相对于物镜定位在流动池的相对侧的情况下，聚光透镜可以沿着与物镜相同的光轴定位。在这种情况下，一条假想的直线穿过准直透镜的中心、流动池的询问点和物镜的中心。在一些实施例中，第二收集锥的尺寸可以由聚光透镜的尺寸(例如，直径)来确定。例如，具有大聚光透镜的光学系统可以通过产生具有更宽顶角的第二光收集锥来增加所收集的粒子调制光的量。第二收集锥的尺寸也可以通过将流动池和物镜分隔开的距离来确定。例如，具有将流动池和物镜分隔开的短距离的光学系统可以通过产生具有更宽顶角的第一光收集锥来增加所收集的粒子调制光的量。在实施例中，本主题聚光透镜与流动池分隔开的距离为大于0mm至50mm(例如，0.1mm至50mm)，例如5mm至30mm，并且包括10mm至20mm。此外，反射光学元件可与聚光透镜分隔开的距离范围为大于0mm至20mm(例如，0.1mm至20mm)，例如3mm至15mm，并且包括5mm至10mm。
在本发明的附加方面中，方法包括收集沿着第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光，使得其在穿过流动池的询问点并被物镜聚焦之前沿着相同的光路反向传播。换句话说，在第二光收集锥内传播的不同光线在穿过光收集增强器时遵循特定的光路。在实施例中，光收集增强器重定向粒子调制光，使得其沿着其在被重定向之前行进的相同光路行进。在这些实施例中，光收集增强器可以被配置为使得聚光透镜将粒子调制光的准直光束投射到包括平面反射镜的反射光学元件上。在这种情况下，可能希望聚光透镜准直粒子调制光束，使得它们沿着相对于平面反射镜垂直的光路传播。因为平面反射镜具有平面的反射表面，其中反射角等于辐照度角，所以粒子调制光沿着与被聚光透镜重新聚焦并被引导到流动池的询问点相同的光路被反向反射到聚光透镜。
如上所述，方法还包括经由物镜将粒子调制光聚焦到光检测器上。用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光的感兴趣的物镜可以包括准直透镜、聚焦透镜、放大透镜、去放大透镜或其他透镜的一个或其组合，其被配置为接收来自流动池的检测区域的光并产生透射到一个或更多个检测器的成像光。
在粒子调制光包括侧向散射光的情况下，方法可以包括用侧向散射光检测器检测侧向散射光。本主题方法中的侧向散射光检测器的数量可以根据需要而不同。例如，本主题方法可以包括1个侧向散射光检测器或多个侧向散射光检测器，例如2个或更多，例如3个或更多，例如4个或更多并且包括5个或更多。在某些实施例中，方法包括1个侧向散射光检测器。在其他实施例中，方法包括2个侧向散射光检测器。
在粒子调制光包括荧光的情况下，方法可以包括用荧光检测器检测荧光。本主题方法中的荧光检测器的数量可以根据需要而不同。例如，本主题方法可以涉及1个荧光或多个侧向散射光检测器，例如2个或更多，例如3个或更多，例如4个或更多，例如5个或更多、例如6个或多、例如7个或更多、例如8个或多、例如9个或更多并且包括10个或更多。在某些实施例中，方法包括3个荧光检测器。在其他实施例中，方法包括6个荧光检测器。
在实施例中，方法包括用前向散射检测器检测前向散射光。本主题方法中的前向散射检测器的数量可以根据需要而不同。例如，方法可以包括1个前向散射检测器或多个前向散射检测器，例如2个或更多，例如3个或更多，例如4个或更多并且包括5个或更多。在某些实施例中，方法包括1个前向散射检测器。在其他实施例中，方法包括2个前向散射检测器。
在实施例中，光检测器被配置为连续地或以离散的间隔测量光。在某些情况下，相关检测器被配置为连续地测量所收集的光。在其他情况下，相关检测器被配置为以离散间隔进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每隔10毫秒、每100毫秒，并且包括每1000毫秒，或某个其他间隔来测量光。
组装流式细胞仪的方法
如上所述，还提供了用于组装流式细胞仪的方法。在实施例中，方法包括在流式细胞仪内定位光收集增强器(例如，诸如上面描述的那些)。在一些实施例中，方法包括将光收集增强器相对于物镜定位在流动池的相对侧上。本发明方法的实施例还包括将光收集增强器与流式细胞仪的物镜光学对准以组装流式细仪。所谓“光学对准”，是指调整光收集增强器相对于流动池和物镜的位置，使得元件处于适当的光学通信。在一些实施例中，光学对准光收集增强器和物镜包括沿着与物镜相同的光轴定位光收集增强器的聚光透镜。方法还可以包括将光收集增强器的反射光学元件定位在流式细胞仪内。在某些情况下，反射光学元件是平面反射镜。因此，方法可以包括将反射光学元件定位在流式细胞仪内，使得在第二光收集锥内传播的粒子调制光被聚光透镜准直，并且以相对于反射光学元件的表面垂直的光束接触反射光学元件。
感兴趣的方法可以进一步包括将光收集增强器定位在现有的流式细胞仪内，即已经在使用的流式细胞仪。在一些情况下，光收集增强器是模块化的，使得光收集增强器可根据需要从流式细胞仪移除并重新附接到流式细胞仪。在实施例中，光收集增强器被壳体包围，反射光学元件和聚光透镜固定在壳体内部。在一些实施例中，反射光学元件和聚光透镜在模块化壳体内的位置减少了这些部件与物镜和流动池的手动光学对准的需要。
计算机控制系统
本公开的方面还包括计算机控制系统，其中所述系统还包括用于完全自动化或部分自动化的一个或更多个计算机。在一些实施例中，系统包括具有其上存储有计算机程序的计算机可读存储介质的计算机，其中当将计算机程序加载到计算机上时，所述计算机程序包括用于处理流式细胞仪收集的流式细胞仪数据的指令，本主题流式细胞仪包括用于在流动流中输送粒子的流动池、用于在询问点照射流中的粒子的光源、用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光的物镜，以及光收集增强器，所述光收集增强器被配置为收集沿第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光，使得其沿相同的光路反向传播并由物镜聚焦。
在实施例中，系统包括输入模块，处理模块和输出模块。本主题系统可以包括硬件和软件部件，其中硬件部件可以采取一个或更多个平台的形式，例如服务器的形式。执行系统的特定任务(例如管理信息的输入和输出、处理信息等)的系统的那些元件可以通过在由系统表示的一个或更多个计算机平台上和跨其执行软件应用来执行。
系统可以包括显示器和算子输入设备。算子输入设备可以是例如键盘、鼠标，或类似物。处理模块包括处理器，其可以访问其上存储有用于执行本主题方法的步骤的指令的存储器。处理模块可以包括操作系统、图形用户界面(GUI)控制器、系统存储器、存储器存储设备和输入输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元以及许多其他设备。处理器可以是市售处理器，也可以是已经或将要可用的其他处理器之一。如本领域已知的，处理器以众所周知的方式执行操作系统和操作系统与固件和硬件的接口，并便于处理器协调和执行各种计算机程序的功能，这些计算机程序可以用各种编程语言编写，例如Java、Perl、C++、Python和其他高级或低级语言，以及它们的组合。操作系统通常与处理器协作，协调并执行计算机的其他部件的功能。在一些实施例中，本主题计算机程序包括流式细胞仪数据分析软件，例如操作系统还根据已知技术提供调度、输入输出控制、文件和数据管理、存储器管理、通信控制和相关服务。处理器可以是任何合适的模拟或数字系统。在一些实施例中，处理器包括模拟电子器件，其允许用户基于第一光信号和第二光信号将光源与流手动地对齐。在一些实施例中，处理器包括提供反馈控制(例如负反馈控制)的模拟电子器件。
系统存储器可以是各种已知或未来的存储器存储设备中的任何一种。示例包括任何常用的随机存取存储器(RAM)、例如常驻硬盘或磁带之类的磁介质、例如读写光盘之类的光学介质、闪存设备或其他存储器存储设备。存储器存储设备可以是各种已知的或未来的设备中的任何一种，包括光盘驱动器、磁带驱动器或软盘驱动器。这种类型的存储器存储设备通常从程序存储介质(未示出)读取和/或写入程序存储介质，例如光盘。这些程序存储介质中的任何一种，或现在正在使用或将来可能开发的其他介质，都可以被视为计算机程序产品。应当理解，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序，也称为计算机控制逻辑，通常存储在系统存储器和/或与存储器存储设备结合使用的程序存储设备中。
在一些实施例中，描述了计算机程序产品，包括其中存储有控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)的计算机可用介质。当由处理器或计算机执行时，控制逻辑使处理器执行本文描述的功能。在其他实施例中，一些功能主要使用例如硬件状态机在硬件中实现。实现硬件状态机以执行本文所述的功能对于相关领域的技术人员将是显而易见的。
存储器可以是处理器可以存储和检索数据的任何合适的设备，例如磁、光或固态存储设备(包括磁盘或光盘或磁带或RAM，或任何其他合适的固定或便携式设备)。处理器可以包括通用数字微处理器，其从携带必要程序代码的计算机可读介质适当编程。编程可以通过通信信道远程提供给处理器，或者使用与存储器连接的那些设备中的任何一个预先保存在计算机程序产品中，例如存储器或某些其他便携式或固定计算机可读存储介质中。例如，磁盘或光盘可以承载编程，并且能够由磁盘写入器/读取器读取。本发明的系统还包括编程(例如以计算机程序产品的形式)，用于实践上述方法的算法。根据本发明的编程能够记录在计算机可读介质上(例如能够由计算机直接读取和访问的任何介质上)。此类介质包括但不限于：例如CD-ROM的光存储介质；例如RAM和ROM的电存储介质；便携式闪存驱动器；以及这些类别的混合，例如磁/光存储介质。
处理器还可以访问通信信道以与远程位置的用户通信。远程位置是指用户不直接与系统接触，并将输入信息从外部设备(例如连接到广域网(WAN)、电话网络、卫星网络或任何其他合适的通信信道的计算机，包括移动电话(即智能手机))中继到输入管理器。
在一些实施例中，根据本公开的系统可以被配置为包括通信接口。在一些实施例中，通信接口包括用于与网络和/或另一设备通信的接收机和/或发射机。通信接口可以被配置用于有线或无线通信，包括但不限于射频(RF)通信(例如，射频识别(RFID))、Zigbee通信协议、WiFi、红外、无线通用串行总线(USB)、超宽带(UWB)、通信协议和蜂窝通信(例如码分多址(CDMA)或全球移动通信系统(GSM))。
在一个实施例中，通信接口被配置为包括一个或更多个通信端口，例如物理端口或接口，如USB端口、RS-232端口或任何其他合适的电气连接端口，以允许本主题系统与其他外部设备之间的数据通信，如计算机终端(例如，在医生办公室或医院环境中)，该终端被配置为类似的互补数据通信。
在一个实施例中，通信接口被配置用于红外通信、通信或任何其他合适的无线通信协议，以使本主题系统能够与其他设备通信，例如计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助理，或者用户可以结合使用的任何其他通信设备。
在一个实施例中，通信接口被配置为提供连接，该连接通过通过蜂窝电话网络、短消息服务(SMS)、连接到因特网的局域网(LAN)上的个人计算机(PC)的无线连接或在WiFi热点处的到因特网的WiFi连接，利用因特网协议(IP)进行数据传输。
在一个实施例中，本主题系统被配置为通过通信接口(例如，使用诸如802.11或RF协议或IrDA红外协议的通用标准)与服务器设备无线通信。服务器设备可以是另一便携式设备，例如智能电话、个人数字助理(PDA)或笔记本电脑；在一些实施例中，服务器设备具有显示器，例如液晶显示器(LCD)，以及输入设备，例如按钮、键盘、鼠标或触摸屏。
在一些实施例中，通信接口被配置为使用上述通信协议和/或机制中的一个或更多个与网络或服务器设备自动或半自动地通信存储在本主题系统中(例如存储在可选数据存储单元中)的数据。
输出控制器可以包括用于各种已知的用于向无论是人还是机器，无论是本地的还是远程的用户呈现信息的显示设备中的任何一种的控制器。如果显示设备之一提供了视觉信息，则该信息通常可以逻辑地和/或物理地组织为图像元素的阵列。图形用户界面(GUI)控制器可以包括用于在系统和用户之间提供图形输入和输出接口以及用于处理用户输入的各种已知或未来软件程序中的任何一种。计算机的功能元件可以经由系统总线彼此通信。这些通信中的一些可以在替代实施例中使用网络或其他类型的远程通信来实现。根据已知技术，输出管理器还可以例如通过因特网、电话或卫星网络向远程位置的用户提供由处理模块产生的信息。输出管理器对数据的呈现可以根据各种已知技术来实现。例如，数据可能包括SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件，或其他形式的数据。数据可以包括因特网URL地址，以便用户可以从远程源检索附加的SQL、HTML、XML或其他文档或数据。在本主题系统中存在的一个或更多个平台可能是已知的任何类型的计算机平台或将要开发的类型，尽管它们通常将是计算机的一类(通常称为服务器)。然而，它们也可以是主机、工作站或其他计算机类型。它们可以通过任何已知或未来类型的电缆或包括无线系统(无论是联网的还是其他的)的其他通信系统连接。它们可能位于同一地点，或者也可能在物理上分开。可能取决于所选择的计算机平台的类型和/或品牌，可以在任何计算机平台上采用各种操作系统。适当的操作系统包括WindowsWindows XP、Windows 7、Windows 8、Windows 10、iOS、macOS、Linux、OS/400、Android、SGI IRIX、Siemens Reliant Unix等其他。
图8描绘了根据一些实施例的示例计算设备800的一般架构。图8中描绘的计算设备800的一般架构包括计算机硬件和软件部件的设置。计算设备800可以包括比图8中所示的元件多得多(或少得多)的元件。然而，没有必要为了提供使能的公开而示出所有这些通常常规的元件。如图所示，计算设备800包括处理单元810、网络接口820、计算机可读介质驱动器830、输入/输出设备接口840、显示器850和输入设备860，所有这些都可以通过通信总线彼此通信。网络接口820可以提供到一个或更多个网络或计算系统的连接。因此，处理单元810可以经由网络从其他计算系统或服务接收信息和指令。处理单元810还可以通信至存储器870和数据储存器890以及从存储器870和数据储存器890通信，并且还可以经由输入/输出设备接口840为可选显示器850提供输出信息。输入/输出设备接口840还可以接受来自可选输入设备860的输入，例如键盘、鼠标、数字笔、麦克风、触摸屏、手势识别系统、语音识别系统、游戏板、加速度计、陀螺仪或其他输入设备。
存储器870可以包含处理单元810为了实现一个或更多个实施例而执行的计算机程序指令(在一些实施例中被分组为模块或部件)。存储器870通常包括RAM、ROM和/或其他永久性、辅助性或非易失性计算机可读介质。存储器870可以存储操作系统872，其提供计算机程序指令以供处理单元810在计算设备800的一般管理和操作中使用。存储器870还可以包括用于实现本公开的方面的计算机程序指令和其他信息。
实用性
本主题流式细胞仪和方法可用于各种应用中，其中希望提高生物样本中粒子参数测定的分辨率和准确性。例如，本公开发现用于准确地确定关于粒子形态的参数，例如粒子的直径以及表面和内部结构。通过收集第二光收集锥内的粒子调制光，否则第二光收集锥内的粒子调制光将保持未被收集和未被检测到，本发明的流式细胞仪和方法还可以增加检测到的信号量，从而提高信噪比。因此，在某些情况下，本主题流式细胞仪可以用于期望通过增加相对于噪声检测到的粒子调制光信号的量来提高流式细胞仪数据的质量。
此外，本公开可用于期望降低流式细胞仪的制造和操作中的尺寸、复杂性和成本。如上所述，本主题光收集增强器可以通过收集第二光收集锥内的光来增加粒子调制光的总量，否则这些光将被系统损失。因为光收集增强器增加了粒子调制光的量，所以本发明的流式细胞仪和方法可以允许使用更小、更不复杂和更便宜的激光器来照射样本。在实施例中，结合本文所述的光收集增强器使用这种低功率激光器可以降低流式细胞仪的总体尺寸和复杂性。此外，由于低功率激光器消耗较少的能量，因此本公开可以用于降低流式细胞仪的操作成本。
在实施例中，本公开减少了在使用流式细胞仪进行样本分析期间对用户输入或手动调整的需要。在一些实施例中，本主题方法和系统提供了完全自动化的协议，使得在使用期间对流式细胞仪数据的调整几乎不需要人工输入。
本公开可用于表征许多类型的分析物，特别是与医疗诊断或护理患者的方案相关的分析物的特征，包括但不限于：蛋白质(包括游离蛋白质和蛋白质以及结合到结构(如细胞)表面的蛋白质)、核酸、病毒粒子等。此外，样本可以来自体外或体内源，并且样本可以是诊断样本。
套件
还提供了包括本主题流式细胞仪的一个或更多个部件的套件。根据某些实施例的套件包括一个或更多个光源部件，例如一个或更多个连续波激光器。在某些情况下，套件包括一个或更多个低功率激光器。在一些情况下，套件包括一个或更多个物镜，用于将粒子调制光聚焦在第一光收集锥内。此外，感兴趣的套件包括一个或更多个光收集增强器，所述光收集增强器被配置为收集沿第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光，使得其沿相同的光路反向传播并由物镜聚焦。因此，套件可以包括一个或更多个反射光学元件(例如，反射镜)和一个或更多个聚光透镜
套件的各种部件可以存在于单独的容器中，或者它们中的一些或全部可以预先组合/组装。在本发明的实施例中，本主题光收集增强器是模块化的，套件可以包括由壳体包围的反射光学元件和聚光透镜。在一些实施例中，反射光学元件和聚光透镜在模块化壳体内的位置减少了这些部件与物镜和流动池的手动光学对准的需要。
除了上述部件之外，本主题套件还可以包括(在一些实施方案中)指令，例如，用于将上述部件添加到流式细胞仪中或使用根据本发明各方面的具有光收集增强器的流式细胞仪。这些指令可能以多种形式存在于本主题套件中，其中一种或更多种形式可能存在于单个套件中。这些指令可以呈现的一种形式是在合适的介质或基底上打印信息，例如，在套件的包装中、在包装插入物，及类似物中打印信息的一张或更多张纸。这些指令的另一种形式是已记录了信息的计算机可读介质，例如软盘、光盘(CD)、便携式闪存驱动器，及类似物。可能存在的这些指令的另一种形式是网站地址，该网站地址可以通过互联网访问被移除的站点的信息。
尽管有所附权利要求，本公开也由以下条款定义：
1、一种流式细胞仪，包括：
流动池，用于在流动流中输送粒子；
光源，用于在询问点照射流动流中的粒子；
物镜，用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光；和
光收集增强器，配置为收集沿第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光以使得其沿相同的光路反向传播并由物镜聚焦。
2、根据条款1所述的流式细胞仪，其中所述光收集增强器包括：
反射光学元件；和
聚光透镜，所述聚光透镜定位在所述反射光学元件和所述流动池之间。
3、根据条款2所述的流式细胞仪，其中所述光收集增强器相对于物镜定位在流动池的相对侧上。
4、根据条款3所述的流式细胞仪，其中所述聚光透镜沿着与所述物镜相同的光轴定位。
5、根据条款2至4所述的流式细胞仪，其中所述聚光透镜与所述流动池分隔开大于0mm至50mm的距离。
6、根据条款2至5所述的流式细胞仪，其中所述反射光学元件与所述聚光透镜分隔开大于0mm至100mm的距离。
7、根据条款2至6中任一项所述的流式细胞仪，其中所述聚光透镜准直在所述第二光收集锥内传播的粒子调制光。
8、根据条款2至7所述的流式细胞仪，其中所述反射光学元件包括反射镜。
9、根据条款2至8中任一项所述的流式细胞仪，其中所述聚光透镜将在所述第二光收集锥内传播的粒子调制光引导至反射光学元件。
10、根据条款9所述的流式细胞仪，其中所述反射光学元件反射所述粒子调制光以使得所述光反向传播到所述聚光透镜。
11、根据条款10所述的流式细胞仪，其中所述反射光学元件被配置为反转反向传播的粒子调制光的波前。
12、根据条款10或11所述的流式细胞仪，其中所述聚光透镜被配置为将反向传播的粒子调制光聚焦到流动池的询问区域上以使得所述光由物镜聚焦。
13、根据前述条款中任一项所述的流式细胞仪，还包括光检测器。
14、根据条款13所述的流式细胞仪，其中所述物镜被配置为将粒子调制光聚焦到所述光检测器上。
15、根据前述条款中任一项所述的流式细胞仪，其中所述第一光收集锥由范围从100度至120度的顶角限定。
16、根据条款15所述的流式细胞仪，其中所述第二光收集锥与第一光收集锥具有相同的尺寸。
17、根据条款16所述的流式细胞仪，其中所述第二光收集锥小于第一光收集锥。
18、根据条款17所述的流式细胞仪，其中所述第二光收集锥由范围从20度至100度的顶角限定。
19、根据前述条款中任一项所述的流式细胞仪，其中所述光收集增强器是可拆卸的。
20、根据前述条款中任一项所述的流式细胞仪，其中所述粒子调制光包括荧光。
21、根据前述条款中任一项所述的流式细胞仪，其中所述粒子调制光包括侧向散射光。
22、根据前述条款中任一项所述的流式细胞仪，其中所述光源包括激光器。
23、一种分析样本的方法，所述方法包括：
(a)将所述样本引入流式细胞仪，所述流式细胞仪包括：
流动池，用于在流动流中输送粒子；
光源，用于在询问点照射流动流中的粒子；
物镜，用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光；和
光收集增强器，配置为收集沿第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光以使得其沿相同的光路反向传播并由物镜聚焦；和
(b)对所述样本进行流式细胞分析。
24、根据条款23所述的方法，其中所述光收集增强器包括：
反射光学元件；和
聚光透镜，所述聚光透镜定位在所述反射光学元件和所述流动池之间。
25、根据条款24所述的方法，其中所述光收集增强器相对于物镜定位在流动池的相对侧上。
26、根据条款25所述的方法，其中所述聚光透镜沿着与所述物镜相同的光轴定位。
27、根据条款24所述的方法，其中所述聚光透镜与所述流动池分隔开大于0mm至50mm的距离。
28、根据条款24所述的方法，其中所述反射光学元件与所述聚光透镜分隔开大于0mm至100mm的距离。
29、根据条款24至28中任一项所述的方法，其中所述聚光透镜准直在所述第二光收集锥内传播的粒子调制光。
30、根据条款24所述的方法，其中所述反射光学元件包括反射镜。
31、根据条款24至30中任一项所述的方法，其中所述聚光透镜将在所述第二光收集锥内传播的粒子调制光引导至反射光学元件。
32、根据条款31所述的方法，其中所述反射光学元件反射所述粒子调制光以使得所述光反向传播到所述聚光透镜。
33、根据条款32所述的方法，其中所述反射光学元件被配置为反转反向传播的粒子调制光的波前。
34、根据条款32或33所述的方法，其中所述聚光透镜被配置为将反向传播的粒子调制光聚焦到流动池的询问区域上以使得所述光由物镜聚焦。
35、根据前述条款中任一项所述的方法，其中对所述样本进行流式细胞分析包括通过光检测器检测粒子调制光。
36、根据条款35所述的方法，其中所述物镜被配置为将粒子调制光聚焦到所述光检测器上。
37、根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述第一光收集锥由范围从100度至120度的顶角限定。
38、根据条款37所述的方法，其中所述第二光收集锥与第一光收集锥具有相同的尺寸。
39、根据条款38所述的方法，其中所述第二光收集锥小于第一光收集锥。
40、根据条款39所述的方法，其中所述第二光收集锥由范围从20度至100度的顶角限定。
41、根据条款23所述的方法，其中所述粒子调制光包括荧光。
42、根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述粒子调制光包括侧向散射光。
43、一种组装流式细胞仪的方法，所述方法包括：
(a)将光收集增强器定位在流式细胞仪内，其中：
所述流式细胞仪包括：流动池，用于在流动流中输送粒子；光源，用于在询问点照射流动流中的粒子；以及物镜，用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光；以及光收集增强器，所述光收集增强器被配置为收集沿第二光收集锥中的光路传播的粒子调制光并重定向所收集的光以使得其沿着相同的光路反向传播并且由物镜聚焦；和
(b)将光收集增强器与物镜光学对准以组装流式细胞仪。
44、根据条款43所述的方法，其中所述光收集增强器包括：
反射光学元件；和
聚光透镜，所述聚光透镜定位在所述反射光学元件和所述流动池之间。
45、根据条款44所述的方法，其中所述光收集增强器相对于物镜定位在流动池的相对侧上。
46、根据条款45所述的方法，其中所述聚光透镜沿着与所述物镜相同的光轴定位。
47、根据条款44所述的方法，其中所述聚光透镜与所述流动池分隔开大于0mm至50mm的距离。
48、根据条款44所述的方法，其中所述反射光学元件与所述聚光透镜分隔开大于0mm至100mm的距离。
49、根据条款44至48中任一项所述的方法，其中所述聚光透镜准直在所述第二光收集锥内传播的粒子调制光。
50、根据条款44所述的方法，其中所述反射光学元件包括反射镜。
51、根据条款44至50中任一项所述的方法，其中所述聚光透镜将在所述第二光收集锥内传播的粒子调制光引导至反射光学元件。
52、根据条款51所述的方法，其中所述反射光学元件反射所述粒子调制光以使得所述光反向传播到所述聚光透镜。
53、根据条款52所述的方法，其中所述反射光学元件被配置为反转反向传播的粒子调制光的波前。
54、根据条款52或53所述的方法，其中所述聚光透镜被配置为将反向传播的粒子调制光聚焦到流动池的询问区域上以使得所述光由物镜聚焦。
55、根据前述条款中任一项所述的方法，还包括将物镜与光检测器光学对准。
56、根据条款55所述的方法，其中所述物镜被配置为将粒子调制光聚焦到所述光检测器上。
57、根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述第一光收集锥由范围从100度至120度的顶角限定。
58、根据条款57所述的方法，其中所述第二光收集锥与第一光收集锥具有相同的尺寸。
59、根据条款57所述的方法，其中所述第二光收集锥小于第一光收集锥。
60、根据条款59所述的方法，其中所述第二光收集锥由范围从20度至100度的顶角限定。
61、根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述粒子调制光包括荧光。
62、根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述粒子调制光包括侧向散射光。
63、根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述光源包括激光器。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过图示和示例的方式对上述发明进行了一些详细描述，但是根据本发明的教导，本领域普通技术人员很容易理解，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行一些改变和修改。
因此，前面仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计各种装置，尽管这里没有明确描述或示出，但这些装置体现了本发明的原理，并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文所述的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人对本领域的进一步发展所贡献的概念，并且应理解为不限于这些具体列举的示例和条件。此外，本文中描述本发明的原理、方面和实施例以及其具体示例的所有陈述旨在包括其结构和功能等效物。此外，预期此类等效物包括当前已知的等效物和未来开发的等效物(即，无论结构如何，开发的执行相同功能的任何元件)。此外，本文所公开的任何内容都不意在贡献给公众，无论这种公开是否在权利要求书中明确地列出。
因此，本发明的范围不限于本文所示和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。在权利要求书中，35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)明确定义为仅当权利要求书的此类限制的开列出了确切短语“意味着”或确切短语“步骤为”时，才援引权利要求中的限制；如果在权利要求中的限制中没有使用该确切短语，则不援引35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)。
Claims (15)
1.一种流式细胞仪，包括：
流动池，用于在流动流中输送粒子；
光源，用于在询问点照射流动流中的粒子；
物镜，用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光；和
光收集增强器，配置为收集沿第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光以使得其沿相同的光路反向传播并由物镜聚焦。
2.根据权利要求1所述的流式细胞仪，其中所述光收集增强器包括：
反射光学元件；和
聚光透镜，所述聚光透镜定位在所述反射光学元件和所述流动池之间。
3.根据权利要求2所述的流式细胞仪，其中所述光收集增强器相对于物镜定位在流动池的相对侧上。
4.根据权利要求3所述的流式细胞仪，其中所述聚光透镜沿着与所述物镜相同的光轴定位。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的流式细胞仪，其中所述聚光透镜准直在所述第二光收集锥内传播的粒子调制光。
6.根据权利要求2至5所述的流式细胞仪，其中所述反射光学元件包括反射镜。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的流式细胞仪，其中所述聚光透镜将在所述第二光收集锥内传播的粒子调制光引导至反射光学元件。
8.根据权利要求7所述的流式细胞仪，其中所述反射光学元件反射所述粒子调制光以使得光反向传播到所述聚光透镜。
9.根据权利要求8所述的流式细胞仪，其中所述反射光学元件被配置为反转反向传播的粒子调制光的波前。
10.根据权利要求8或9所述的流式细胞仪，其中所述聚光透镜被配置为将反向传播的粒子调制光聚焦到流动池的询问区域上以使得光由物镜聚焦。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的流式细胞仪，还包括光检测器。
12.根据权利要求11所述的流式细胞仪，其中所述物镜被配置为将粒子调制光聚焦到所述光检测器上。
13.根据前述权利要求中任一项所述的流式细胞仪，其中所述光收集增强器是可拆卸的。
14.一种分析样本的方法，所述方法包括：
(a)将所述样本引入流式细胞仪，所述流式细胞仪包括：
流动池，用于在流动流中输送粒子；
光源，用于在询问点照射流动流中的粒子；
物镜，用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光；和
光收集增强器，配置为收集沿第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光以使得其沿相同的光路反向传播并由物镜聚焦；和
(b)对所述样本进行流式细胞分析。
15.一种组装流式细胞仪的方法，所述方法包括：
(a)将光收集增强器定位在流式细胞仪内，其中：
所述流式细胞仪包括：
流动池，用于在流动流中输送粒子；
光源，用于在询问点照射流动流中的粒子；和
物镜，用于聚焦在第一光收集锥内传播的粒子调制光；和
光收集增强器，配置为收集沿第二光收集锥内的光路传播的粒子调制光，并重定向所收集的光以使得其沿相同的光路反向传播并由物镜聚焦；和
(b)将光收集增强器与物镜光学对准以组装流式细胞仪。
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