CN115038971A - 用于自动化血液学检测平台的稳定参比物质 - Google Patents

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J·巴里
K·德富尔
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Abstract

本发明描述了一种通过生产合成水凝胶血细胞替代物来制备稳定的血液学参比物质的方法，当使用采用多种检测技术的自动血液学分析仪进行分析时，所述替代物在大小、形态、性能和功能上模拟人类血液组分。不同的水凝胶颗粒可经组合和混合以制备多参数、多水平的血液学标准物质，其可用于现代自动化血液分析仪的校准、线性验证、能力评估和日常性能监测。这些水凝胶颗粒也可与经过处理和稳定化的人体血液组分结合来制备本发明的参比物质。

Description

用于自动化血液学检测平台的稳定参比物质
背景技术
质量控制是临床血液学中必不可少的常规操作。生物样品中细胞计数的准确性和区分血细胞亚群(例如，血小板、淋巴细胞、粒细胞等)的能力部分取决于采用合适的对照产品。本发明提供了用于自动化血液学测试平台的稳定参比物质。
发明内容
流式细胞术可以快速分离、计数和表征个体细胞，并可用于实验和临床。流式细胞术根据被分析的液体流中的细胞引起的光散射来区分细胞。为了区分细胞，采用检测器来确定前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)。FSC与细胞体积相关，并且由与传输到液体流中的光束一致的检测器测量。SSC通过使用垂直(或基本垂直)于传输到液体流中的光的检测器测量光散射来确定。不同的具体细胞类型表现出不同的FSC和SSC，从而可以识别各个不同的细胞类型。
本发明涉及在等渗pH中性基础基质流体中制备、组合和混合合成水凝胶血细胞替代物，以制备多参数和多水平血液学参比物质(HRM)。本发明提供的HRM可用于采用多种检测技术的现代自动血液分析仪的校准、线性验证、能力评估和/或常规性能监测。本文所述的HRM包含一种或多种合成组分(例如，调谐水凝胶颗粒)、一种或多种动物血液组分和/或一种或多种人体血液组分。
附图简要说明
图1-4是自动血液分析仪Sysmex XN 1000(图1)、Beckman-Coulter DxH 800(图2)、Abbott CELL-DYN Ruby(图3)和Siemens Advia 1220(图4)生成的典型血液学报告。这些分析仪识别、测量并枚举各种细胞血液组分，并为所分析的各血液样品生成直方图、散点图和细胞图。例如，Sysmex XN 1000生成32个参数、2个直方图和5个散点图，而Beckman-Coulter DxH 800生成25个参数、3个直方图和4个散点图。这些分析仪生成的报告之间的差异归因于这些制造商使用的技术不同(吸收分光光度法、流式细胞术和电阻抗)。
图5是使用Abbott Cell-Dyn Emerald血液学分析仪针对本发明的典型HRM生成的血液学报告。
图6是本发明HRM样品的显微照片。
具体实施方式
流式细胞术可以快速分离、计数和表征个体细胞，并可用于实验和临床。流式细胞术根据被分析的液体流中的细胞引起的光散射来区分细胞。为了区分细胞，采用检测器来确定前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)。FSC与细胞体积相关，并且由与传输到液体流中的光束一致的检测器测量。SSC通过使用垂直(或基本垂直)于传输到液体流中的光的检测器测量光散射来确定。不同的具体细胞类型表现出不同的FSC和SSC，从而可以识别各个不同的细胞类型。
如本文所用，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，就在具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包括”，“包含”，“具有”，“含有”，“有”或其变化形式的程度而言，这些术语意在以类似术语“包含”的方式表示包含在内(inclusive)。过渡术语/短语“包含”、“包括”、“含有”、“基本上由……组成”、“基本上由……构成”、“由……组成”和“由……构成”(及其任何语法变体)，可互换使用。
术语“约”或“大约”是指给定值的至多0-20％、0至10％、0至5％或至多1％的范围。在使用术语“约”或“大约”的组合物或温度的上下文中，这些组合物包含给定量的组分，其变化(误差范围)围绕该值浮动0％-10％(X±10％)。在本公开内容中，范围是简写形式，以避免不必要详细列出并描述范围内的每个值。适当时，可选择该范围内的任何合适值作为该范围的上限值，下限值或终点。例如，范围0.1-1.0表示终值0.1和1.0，以及中间值0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，并且所有中间范围都包含在0.1-1.0内，例如0.2-0.5、0.2-0.8、0.7-1.0等。设想在一个范围内具有至少两个有效数字的值，例如，5-10的范围表示5.0和10.0之间以及5.00和10.00之间的所有值，包括端点值。
本发明涉及在等渗pH中性悬浮液中制备、组合和混合血细胞替代物(类似物)，以制备多参数和多水平血液学参比物质(HRM)。本发明提供的HRM可用于采用多种检测技术的现代自动血液分析仪的校准、线性验证、能力评估和/或常规性能监测。本文描述的HRM包含一种或多种合成组分(例如，调谐(tuned)水凝胶颗粒)和/或一种或多种生物组分(例如，一种或多种动物血液组分，和/或一种或多种人类血液组分，其经调谐以代表特定的细胞类型)。特别排除为HRM的是从人类或非人类对象获得的包含本文公开的各组分的生物样品。
调谐HRM的组分，以代表它们所代表的细胞类型(例如，红细胞、血小板等)，并且HRM的不同组分可被混合以获得特定的HRM。此外，HRM的各组分在大小(例如形状、直径和/或体积)上与其天然存在的对应物相似，无论它是由红细胞制备还是合成的(例如水凝胶颗粒)皆如此。HRM的各组分在光学上也与它所代表的细胞类型基本相似，并具有一种或多种光学特性，例如侧向散射分布、前向散射分布或与其人类对应物基本相似的次级标志物概况。在一些实施方式中，HRM的一种或多种组分可以混合物形式提供，所述混合物包含约0.1％至约99.9％的生物组分和约0.1％至约99.9％的合成组分，对于该具体组分，其百分比总计100％。例如，如果HRM组分是血小板组分，则该组分的5％可以是生物的，而该组分的95％可以是合成的，从而使得总血小板组分，例如每微升总血小板细胞数是HRM的血小板含量的预期值的100％。
因此，HRM包含以下一种或多种组分：
悬浮液：具有中性pH值的水性等渗溶液，其含有各种添加剂，例如抗微生物剂、表面活性剂、稳定剂、缓冲剂、盐、酶抑制剂、白蛋白和脂蛋白。在一些实施方式中，悬浮液包含磷酸盐缓冲盐水溶液和血浆物质的水性溶液，例如血清脂质的水性溶液。血清脂质包括胆固醇、胆固醇酯和胆固醇，它们已与血清血浆中存在的一种或多种其它化合物及其混合物(例如，脂蛋白和磷脂及其混合物)组合。悬浮液还可以包含血浆中所含的一种或多种蛋白质，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白、纤维蛋白原及其混合物。如上所述，悬浮液还可以包含各种添加剂，例如抗微生物剂、表面活性剂、稳定剂、缓冲剂、盐、酶抑制剂。
红细胞(RBC)组分：经分离和洗涤的人红细胞，其用以下固定：低浓度的交联剂(如戊二醛)或大小(直径和体积)与含有血红蛋白的人红细胞相似的水凝胶颗粒。选择用于包含在HRM中的RBC组分具有一种或多种光学特性，例如与人类RBC基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
血小板组分：经分离和洗涤的山羊红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂(如戊二醛)或大小(直径和体积)与人血小板相似的水凝胶颗粒。选择用于包含在HRM中的血小板组分具有一种或多种光学特性，例如与人血小板基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
网织红细胞组分：经分离和洗涤的人红细胞，其用各种包封工艺(例如可逆渗透裂解或电穿孔)与RNA包封，然后进行软戊二醛固定或大小(直径和体积)与人网织红细胞相似的水凝胶颗粒，其含有RNA或加标有网织红细胞测试中所用的荧光染料。选择用于包含在HRM中的网织红细胞组分具有一种或多种光学特性，例如与人网织红细胞基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
淋巴细胞组分：经分离和洗涤的鸡红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂(如戊二醛)或大小与人淋巴细胞相似的水凝胶颗粒，它们可经选择性调谐以具有基本类似于人淋巴细胞的光学特性(例如，直径和体积相似)。选择用于包含在HRM中的淋巴细胞组分具有一种或多种光学特性，例如与人淋巴细胞基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
单核细胞组分：经分离和洗涤的火鸡红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂(如戊二醛)或大小与人单核细胞相似的水凝胶颗粒，它们可经选择性调谐以具有与人淋巴细胞基本相似的光学特性。选择用于包含在HRM中的单核细胞组分具有一种或多种光学特性，例如与人单核细胞基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
嗜碱性粒细胞组分：经分离和洗涤的鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂(如戊二醛)或大小与人嗜碱性粒细胞相似的水凝胶颗粒，它们可经选择性调谐以具有与人嗜碱性粒细胞基本相似的光学特性。选择用于包含在HRM中的嗜碱性粒细胞组分具有一种或多种光学特性，例如与人嗜碱性粒细胞基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
中性粒细胞组分：经分离和洗涤的鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂(如戊二醛)或大小与人中性粒细胞相似的水凝胶颗粒，它们可经选择性调谐以具有与人中性粒细胞基本相似的光学特性。选择用于包含在HRM中的中性粒细胞组分具有一种或多种光学特性，例如与人中性粒细胞基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
嗜酸性粒细胞组分：经分离和洗涤的鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂(如戊二醛)或大小与人嗜酸性粒细胞组分相似的水凝胶颗粒，它们可经选择性调谐以具有与人嗜酸性粒细胞组分基本相似的光学特性。选择用于包含在HRM中的嗜酸性粒细胞组分具有一种或多种光学特性，例如与人嗜酸性粒细胞基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
未成熟的网织红细胞组分：分离和洗涤的人红细胞，其与以下包封：RNA或与人网织红细胞大小相似的含大量RNA的水凝胶颗粒或用网织红细胞分析常用染料标记的水凝胶颗粒。选择用于包含在HRM中的未成熟网织红细胞组分具有一种或多种光学特性，例如与未成熟人网织红细胞基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
未成熟粒细胞组分：经分离和洗涤的鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂(如戊二醛)或大小与人未成熟粒细胞组分相似的水凝胶颗粒，它们可经选择性调谐以具有与人未成熟粒细胞组分基本相似的光学特性。选择用于包含在HRM中的未成熟粒细胞组分具有一种或多种光学特性，例如与未成熟人粒细胞基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
未成熟血小板组分：经分离和洗涤的山羊红细胞，用以下固定：高浓度的交联剂(如戊二醛)或大小与人血小板相似的含核酸或用未成熟血小板分析的常用染料标记的水凝胶颗粒。选择用于包含在HRM中的未成熟血小板组分具有一种或多种光学特性，例如与未成熟人血小板基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
有核红细胞组分：经分离和鸡红细胞用以下固定：高浓度的交联剂(如戊二醛)或大小与有核红细胞相似的水凝胶颗粒，其可经选择性调谐以具有与人有核红细胞基本相似的光学特性。选择用于包含在HRM中的有核RBC组分具有一种或多种光学特性，例如与有核人RBC基本相似的侧向散射分布、前向散射分布等。
为了制造本发明的参比物质，所公开的组分可以按比例组合，这将导致血液学参数低于、等于和高于医学决策点。然后可以将所得组合物混合并填充在适当的容器(小瓶和试管)中。然后可以将这些容器盖上盖子并贴上标签，并在推荐的约2至8℃的储存条件下储存。可以使用统计上有效的采样和测试方案对参比物质的各种血液学参数进行测试，并且可以根据测试结果计算得到的参比值(分析值)。例如，相关的血液学参数可以借鉴自《威廉姆斯血液学》(Williams Hematology)，第9版，其中包含来自不同来源的关键血液变量的参比范围(《威廉姆斯血液学》，第9版，麦格劳希尔出版社(McGraw Hill)，2016)。或者，Cheng等和/或Wakeman等提供了可以在所公开的发明的上下文中使用的各种血液学参数。
Figure BDA0003776389820000061
血液红细胞组分
在本发明的第一方面，HRM包含对应于人红细胞的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在本发明的一方面，HRM包含经分离和洗涤的人红细胞(hRBC)，其用低浓度的交联剂(如戊二醛)固定。在这个实施方式中，hRBC用生理缓冲液(如柠檬酸钠或磷酸盐缓冲盐水溶液)洗涤。在某些实施方式中，生理缓冲剂是等渗的。洗涤后，可以将hRBC组分重悬浮在生理缓冲液中，例如柠檬酸钠，并用戊二醛固定。戊二醛可以以约0.01至约0.1％(v/v)范围的量添加到重悬浮的hRBC中。在某些实施方式中，戊二醛以约0.05％v/v的量添加到重悬浮的hRBC中。hRBC在缓冲液/戊二醛溶液中保持约10分钟至约360分钟的时间段。在某些实施方式中，hRBC在缓冲液/戊二醛溶液中保持约100至约180分钟或约120分钟的时间段。固定后，将hRBC从缓冲液/戊二醛溶液中分离出来，并重悬浮在另一种缓冲液中，例如本文中称为流体23的缓冲液(表1)。在一些实施方式中，重悬浮在流体23中的hRBC可以在约2℃至约8℃的温度下储存约12小时至约24小时或约16小时至约20小时的时间段。在此储存期后，将hRBC从流体23中分离出来，重悬浮在液体23中并调整到以下目标细胞数：
Figure BDA0003776389820000071
Figure BDA0003776389820000072
Figure BDA0003776389820000081
在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与含有血红蛋白的人红细胞(hRBC)相似的调谐水凝胶颗粒。调谐的hRBC水凝胶颗粒表现出与含有血红蛋白的hRBC基本相似的FSC和SSC参数。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于hRBC的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。
血小板组分：
在本发明的第二方面，HRM包含对应于人血小板的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在一个实施方式中，HRM包括用高浓度的交联剂(如戊二醛)固定的经分离和洗涤的山羊红细胞。在这个实施方式中，山羊红细胞被分离并在生理缓冲液中洗涤，例如柠檬酸钠或磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些实施方式中，生理缓冲液是等渗的。
洗涤后，根据本领域已知的方法测量血细胞比容，如果需要，将细胞调节至约44％至约46％的血细胞比容水平。然后用去离子水或红细胞裂解溶液裂解洗涤过的细胞。裂解完成后，可以将细胞悬液转移到容器中。然后可以将包含裂解的山羊红细胞的容器浸入温度在约30至约45℃，例如约40℃的水浴中，并在该温度下保持约120分钟至约240分钟，例如约180分钟。可允许细胞冷却至室温，然后在约2℃至约8℃下储存约8至约12小时。然后以约15％至约25％v/v的量，例如以约20％v/v的量添加α-萘酚(α-N)。然后将经α-N处理的细胞在室温下孵育约60至约180分钟，优选约120分钟。然后将戊二醛以约35％至约50％(v/v)之间的量添加到α-N处理的细胞，以形成第一固定溶液。然后将用戊二醛和α-N处理的细胞在室温孵育约90分钟至约180分钟，例如约90分钟至约120分钟。该处理后，将细胞从固定溶液(α-N/戊二醛溶液)中分离出来，并用生理缓冲液、等渗缓冲液或去离子水洗涤。洗涤细胞后，可将细胞重悬浮在生理缓冲液、等渗缓冲液或去离子水中。然后将这些重悬的细胞用范围在约10％至约25％(v/v)，例如约15％v/v的第二体积的戊二醛(第二固定溶液)处理约48小时至约175小时，例如约40小时至约150小时。然后将细胞与第二固定溶液分离并用洗涤悬浮液洗涤并在室温避光储存。经处理的山羊红细胞(血小板类似物)可在约2℃至约8℃的温度储存长达约18个月，例如约12个月。血小板溶液可以以提供约50x103和约80x103血小板/μL之间的量添加到HRM。
在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与血小板，特别是人血小板相似的调谐水凝胶颗粒。调谐的hRBC水凝胶颗粒表现出与血小板基本相似的FSC和SSC参数。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于血小板的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。
网织红细胞组分：
在本发明的第三方面，HRM包含对应于人网织红细胞的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在一个实施方式中，HRM包含经分离和洗涤的用RNA包封的人红细胞，所述RNA代表全血中存在的网织红细胞组分。红细胞可以使用各种包封工艺进行包封，例如可逆渗透裂解或电穿孔，然后进行软戊二醛固定。制备网织红细胞组分的方法是本领域已知的(参见例如，美国专利号5,432,089或Ebrahim和Ryan，1996，Cytometry，25:156-163，其各自通过引用其全文方式纳入本文)。
在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与网织红细胞相似的含RNA或用网织红细胞测试中使用的荧光染料标记的调谐水凝胶颗粒。调谐的水凝胶颗粒表现出与网织红细胞基本相似的FSC和SSC参数。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于网织红细胞的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。
淋巴细胞组分：
在本发明的第四方面，HRM包含对应于人淋巴细胞的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在一个实施方式中，经分离和洗涤的人类鸟类、爬行动物或鱼类以代表生物样品例如人类全血样品中存在的淋巴细胞组分。红细胞可以用高浓度的交联剂(如戊二醛)处理。制备淋巴细胞组分的方法在本领域中是已知的(参见例如美国专利号5,320,964或US2010/0086962，其各自通过引用其全文方式纳入本文。
在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与淋巴细胞，特别是人淋巴细胞相似的调谐水凝胶颗粒。调谐的水凝胶颗粒表现出与淋巴细胞基本相似的FSC和SSC参数。调谐的水凝胶颗粒可具有与淋巴细胞，特别是人淋巴细胞基本相似的其它光学特性或表面特性。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于淋巴细胞的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。
单核细胞组分：
在本发明的第五方面，HRM包含对应于人单核细胞的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在另一个实施方式中，HRM包含单核细胞组分，其包含来自禽类动物例如火鸡、鸡、鸭和鹅红细胞或来自非人类脊椎动物包括鱼(特别是鲨鱼科成员)和爬行动物(例如鳄鱼)的红细胞的经分离和洗涤的红细胞，其用交联剂(例如戊二醛)固定。在一个优选的实施方式中，火鸡红细胞用于提供单核细胞组分。制备单核细胞组分的方法在本领域中是已知的(参见例如美国专利号5,320,964，其通过引用其全文方式纳入本文)。
在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与单核细胞，特别是人单核细胞相似的调谐水凝胶颗粒。调谐的水凝胶颗粒表现出与单核细胞基本相似的FSC和SSC参数。调谐的水凝胶颗粒可以具有与单核细胞，尤其是人单核细胞基本相似的其它光学特性和/或表面特性。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于单核细胞的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。
嗜碱性粒细胞组分：
在本发明的第六方面，HRM包含对应于人嗜碱性粒细胞的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与嗜碱性粒细胞，特别是人嗜碱性粒细胞相似的调谐水凝胶颗粒。调谐的水凝胶颗粒表现出与嗜碱性粒细胞基本相似的FSC和SSC参数。调谐的水凝胶颗粒可具有与嗜碱性粒细胞，特别是人嗜碱性粒细胞基本相似的其它光学性质和/或表面性质。水凝胶颗粒的大小与人嗜碱性粒细胞相似。调谐的水凝胶颗粒可以具有与嗜碱性粒细胞，特别是人嗜碱性粒细胞基本相似的其它光学性质或表面性质。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于嗜碱性粒细胞的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。
中性粒细胞组分：
在本发明的第七方面，HRM包含对应于人中性粒细胞的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在一个实施方式中，HRM包含中性粒细胞组分，其包含来自禽类动物例如火鸡、鸡、鸭和鹅红细胞或来自非人类脊椎动物包括鱼(特别是鲨鱼科成员)和爬行动物(例如鳄鱼)的红细胞的经分离和洗涤的红细胞，其用交联剂(例如戊二醛)固定。在一个优选的实施方式中，鳄鱼红细胞用于提供中性粒细胞组分。制备中性粒细胞组分的方法在本领域中是已知的(参见例如美国专利号5,320,964，其通过引用其全文方式纳入本文)。
在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与中性粒细胞，特别是人中性粒细胞相似的调谐水凝胶颗粒。调谐的水凝胶颗粒表现出与中性粒细胞基本相似的FSC和SSC参数。调谐的水凝胶颗粒可具有与中性粒细胞，特别是人中性粒细胞基本相似的附加光学性质和/或表面性质。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于中性粒细胞的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。
嗜酸性粒细胞组分：
在本发明的第八方面，HRM包含对应于人嗜酸性粒细胞的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在一个实施方式中，HRM包含嗜酸性粒细胞组分，其包含来自禽类动物例如火鸡、鸡、鸭和鹅红细胞或来自非人类脊椎动物包括鱼(特别是鲨鱼科成员)和爬行动物(例如鳄鱼)的红细胞的经分离和洗涤的红细胞，其用交联剂(例如戊二醛)固定。在一个优选的实施方式中，鳄鱼红细胞用于提供嗜酸性粒细胞组分。制备嗜酸性粒细胞组分的方法在本领域中是已知的(参见例如美国专利号5,320,964，其通过引用其全文方式纳入本文)。
在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与嗜酸性粒细胞，特别是人嗜酸性粒细胞相似的调谐水凝胶颗粒。调谐的水凝胶颗粒表现出与嗜酸性粒细胞基本相似的FSC和SSC参数。调谐的水凝胶颗粒可以具有与嗜酸性粒细胞，特别是人嗜酸性粒细胞基本相似的其它光学特性和/或表面特性。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于嗜酸性粒细胞的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。
未成熟网织红细胞组分：
在本发明的第九方面，HRM包含对应于未成熟人网织红细胞的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在一个实施方式中，HRM包含经分离和洗涤的用RNA包封的人红细胞，所述RNA代表全血中存在的未成熟网织红细胞组分。红细胞可以使用各种包封工艺进行包封，例如可逆渗透裂解或电穿孔，然后进行软戊二醛固定。制备未成熟网织红细胞组分的方法是本领域已知的(参见例如，美国专利号5,432,089或Ebrahim和Ryan，1996，Cytometry，25:156-163，其各自通过引用其全文方式纳入本文)。
在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与未成熟网织红细胞，特别是未成熟人网织红细胞相似的调谐水凝胶颗粒。调谐的水凝胶颗粒表现出与未成熟网织红细胞基本相似的FSC和SSC参数。调谐的水凝胶颗粒可具有与未成熟网织红细胞、特别是未成熟人网织红细胞基本相似的其它光学性质和/或表面性质。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于未成熟网织红细胞的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。此外，尺寸与未成熟网织红细胞(例如，未成熟的人网织红细胞)相似的水凝胶颗粒可以含有大量的RNA或用网织红细胞分析的常用染料进行标记。
未成熟粒细胞组分：
在本发明的第十方面，HRM包含对应于未成熟人粒细胞的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在一个实施方式中，HRM包含未成熟粒细胞组分，其包含来自禽类动物(例如鸵鸟或鸸鹋)红细胞或来自非人类脊椎动物包括鱼(特别是鲨鱼科成员)和爬行动物(例如鳄鱼)的红细胞的经分离和洗涤的红细胞，其用交联剂(例如戊二醛)固定。在一个优选的实施方式中，鳄鱼红细胞用于提供未成熟粒细胞组分。制备未成熟粒细胞组分的方法在本领域中是已知的(参见例如美国专利号7,109,036，其通过引用其全文方式纳入本文)。
在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与未成熟粒细胞，特别是未成熟人粒细胞相似的调谐水凝胶颗粒。调谐的水凝胶颗粒表现出与未成熟粒细胞基本相似的FSC和SSC参数。调谐的水凝胶颗粒可具有与未成熟粒细胞，特别是未成熟人粒细胞基本相似的附加光学特性和/或表面特性。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于未成熟粒细胞的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。
未成熟血小板组分：
在本发明的第十一方面，HRM包含对应于未成熟人血小板的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在一个实施方式中，HRM包括用高浓度的交联剂(如戊二醛)固定的经分离和洗涤的山羊红细胞，作为未成熟血小板的参比物质。该组分以与上文关于血小板所公开的方式相似的方式制备。光学性质与人未成熟血小板基本相似，大小与未成熟人血小板相似，含有核酸或用未成熟血小板分析的常用染料标记。
在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与未成熟血小板，特别是未成熟人血小板相似的调谐水凝胶颗粒。调谐的水凝胶颗粒表现出与未成熟血小板基本相似的FSC和SSC参数。调谐的水凝胶颗粒可以具有与未成熟血小板，特别是未成熟人血小板基本相似的其它光学特性和/或表面特性。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于未成熟血小板的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。此外，尺寸与未成熟血小板(例如，未成熟人血小板)相似的水凝胶颗粒可以含有大量的RNA或用网织红细胞分析的常用染料进行标记。
有核红细胞组分：
在本发明的第十二方面，HRM包含对应于有核人RBC的生物组分、合成组分或生物组分和合成组分的组合。在一个实施方式中，HRM包含经分离和洗涤的禽类(例如，鸡或火鸡)红细胞，其用高浓度的交联剂(如戊二醛)固定，作为有核RBC的参比物质。制备有核RBC组分的方法在本领域中是已知的(参见例如美国专利号6,406,915，其通过引用其全文方式纳入本文)。
在另一个实施方式中，HRM包含尺寸(直径和体积)与有核红细胞，特别是人有核红细胞相似的调谐水凝胶颗粒。调谐的水凝胶颗粒表现出与有核红细胞基本相似的FSC和SSC参数。调谐的水凝胶颗粒可以具有与有核红细胞，特别是人有核红细胞基本相似的其它光学特性和/或表面特性。可以根据美国专利号9,714,897中公开的方法制备对应于有核红细胞的调谐水凝胶颗粒，该专利的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。
交联剂
交联剂可以是任何合适的交联剂，包括但不限于包括醛、噁唑烷、醇、环脲等的那些。示例包括但不限于：甲醛、多聚甲醛、戊二醛、二唑烷基脲(DU)、咪唑烷基脲(IDU)、二羟甲基脲、二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇；季金刚烷、-羟甲基-1-氮杂3,7-二噁烷二环(3.3.0)辛烷和5-羟甲基-1-氮杂-3,7-二噁烷二环(3.3.0)辛烷和5-羟基聚-亚甲基氧基-甲基-1-氮杂-3,7-二氧杂二环(3.3.0)辛烷、羟甲基甘氨酸钠及其混合物等。
水凝胶颗粒：
在一个方面，提供了一种包含多个水凝胶颗粒的组合物，其用作HRM。在本发明的这个方面，各组多个水凝胶颗粒的个体水凝胶颗粒具有一种或多种光学性质，所述一种或多种光学性质与靶细胞的一种或多种光学性质基本相似。如上所述，在一个方面，本发明提供了个体的水凝胶颗粒，其各自具有与靶细胞的一种或多种光学性质基本相似的一种或多种光学性质。在一个实施方式中，所述一种或多种光学特性是侧向散射分布、前向散射分布或二级标志物概况，例如荧光标志物概况，例如结合至所述水凝胶颗粒的表面(该表面上具有与具体靶细胞相关联的表面标志物)的荧光标记抗体的荧光标志物概况。如本文所用，“基本上相似”表示至少40％相似、至少50％相似、至少60％相似、至少70％相似、至少80％相似、至少90％相似、至少95％相似、至少96％相似、至少97％相似、至少98％相似或至少99％相似于特定细胞类型(例如人红细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、血小板等)。
如美国专利号9,714,897中所公开的，一种或多种水凝胶颗粒可以被功能化以模拟靶细胞或标记的靶细胞的一种或多种光学性质和/或一种或多种细胞表面性质，其用一种或多种荧光染料(如'897专利的第17-30栏所公开的)功能化，用如'897专利的表4、7和/或8中所列的一种或多种细胞表面标志物(或其表位结合区域)功能化，或其组合。在各种其它实施方式中，水凝胶颗粒还可包含血型抗原，例如下文讨论的那些和/或抗原D(RhD)，其携带RH系统的主要抗原。例如，水凝胶颗粒可与至少一种双功能单体聚合，其随后可用于将细胞表面标志物、血型抗原、细胞表面标志物的表位结合区、荧光染料或其任何组合附接到颗粒，以提供所需的光学和/或细胞表面性质。游离官能团可以是胺基、羧基或羟基。取决于所需的功能化，应理解，可以使用多种双功能单体，例如，使用不同的化学物质和不同的元素(例如，荧光染料或细胞表面标志物)对颗粒进行功能化。与包含HRM的细胞相关联的细胞表面标志物是本领域已知的。
示例性血型抗原寡糖包括下述物质：A型血抗原：GalNacα1,3(Fucα1,2)Galβ1,3GlcNAcβ1-R；B型血抗原：Gala1,3(Fucα1,2)Galβ1,3GlcNAcβ1-R；O型血抗原：Fucα1,2Galβ1,3GlcNAcβ1-R，其中R代表多肽或血型抗原连接至水凝胶颗粒时的附接点。其它示例性血型抗原包括Rh(恒河猴)血型系统的抗原，例如抗原D(RhD；参见Le van等，PNAS，1992，89(22):10925-10929，其公开内容通过引用其全文方式纳入本文)。
在又一方面，提供了一种校准用于分析靶细胞的细胞计数装置的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：(a)将具有与生物样品(例如，人全血)中存在的靶细胞的光学性质基本相似的光学性质的HRM置入装置中；b)使用该细胞计数装置测量HRM的光学性质，从而校准用于分析生物样品的细胞计数装置。细胞计数装置在本领域中是已知的，并且包括用于进行流式细胞术和FACS的市售可得的装置。
本文所引用或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物(包括所有附图和表格)均通过引用全文并入本文，只要它们与本说明书的明确教导不矛盾即可。
以下是说明实施本发明的流程的实施例。这些实施例不应被理解为限制。除非另有说明，所有的百分比都是按重量计的，所有的溶剂混合物比例都是按体积计的。
实施例1
图5所示为使用Abbott Cell-Dyn Emerald血液学分析仪针对本发明的典型HRM生成的血液学报告。HRM通过以下方式制备：将模拟人白细胞大小和形态的合成颗粒和模拟人血小板大小和形态的稳定化山羊红细胞添加至悬浮在等渗和pH中性缓冲水性流体中的稳定化人红细胞中。通过组合这些组分制备的样品生成了HRM，它提供了16个参数，包括3部分(3-part)白细胞群(WBC、LYM、MID、GRA、LYM％、MID％、GRA％、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT和MPV)。
为制备上述质量控制物质，使人红细胞在pH 7.0的柠檬酸盐缓冲液中洗涤，在室温用0.024％戊二醛固定2小时，在稳定化缓冲液中洗涤一次，然后在2至8℃下保存直至使用。为了制造血小板(PLT)类似物，山羊红细胞在等渗盐水溶液中洗涤，然后暴露于40℃至42℃的低渗条件下，同时混合3小时，在室温冷却约1小时，然后然后在2至8℃储存过夜。在此步骤之后，山羊红细胞在室温分别暴露于3个连续处理步骤：3.9％α-萘酚、10.2％戊二醛和0.009％戊二醛，分别处理2小时、2小时和48小时，以固定细胞。最后，经处理的山羊红细胞用稳定化溶液洗涤一次，然后在室温避光7天平衡。
将固定的人RBC和固定的山羊RBC重悬于含有合成WBC的等渗流体中。通过离心浓集细胞组分或用等渗悬浮液稀释细胞组分，将这些组分的浓度调整至约2x106RBC/μL、50x103PLT/μL和3.3x103合成WBC/μL，然后使用自动血液分析仪进行测试。合成白细胞购自加利福尼亚州爱莫利维尔的Slingshot Biosciences公司(
Figure BDA0003776389820000162
产品编号：SSBS-004-A)。这三种组分以0.6RBC:0.230WBC:0.0023PLT:0.17等渗缓冲液的体积比混合，以制备本发明的HRM，如图5所示。
图6所示为本发明HRM样品的显微照片。该显微照片是使用配备400X放大倍率的Olympus BX43显微镜采集的。采用一种新的亚甲蓝染色剂来增强红细胞和水凝胶球体之间的对比度。材料的显微镜检表明，这些合成颗粒(显微照片中的大圆形颗粒)与HRM中的人类和动物血液组分相容，并且不会导致细胞组分的聚集或粘附。此外，它们的染色与WBC相似，并且不会干扰其它组分的染色特性。
对本发明的HRM进行了受限单一温度加速稳定性研究，以比实时稳定性研究期间观察到的情况更快地观察产品性能和稳定性问题。对于这项加速稳定性研究，质量控制样品在35℃储存7天，并在Abbott Cell-Dyn Emerald上进行测试。表1中列出了所有参数的第0天和第7天测试结果。需要指出的是，对于一种化学试剂，产品在35℃储存约10天相当于产品在5℃储存1年(基于20K Cal/mol模型的活化能)。表2中的数据预测本发明的HRM若储存在2至8℃可具有大于9个月的保质期。
表2：35℃受限加速稳定性研究
Figure BDA0003776389820000161
Figure BDA0003776389820000171
实施例2
在这个预判实施例中，本发明的HRM是通过充分利用悬浮液中的水凝胶颗粒来制备。通过组合这些组分制备的样品将生成HRM，其提供超过20种参数，包括5部分(5-part)白细胞群(WBC、LYM、MONO、EO、NEUT、BASO、LYM％、MONO％、EO％、NEUT％、BASO％、IG、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT、MPV、RETIC、RETIC％和其它相关参数)。
HRM将具有以下浓度的组分：
悬浮液(pH中性和等渗)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟红细胞(1x1012至7x1012/L)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟血小板(50x106至800x106/L)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟网织红细胞(0.5％至10％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟淋巴细胞(10％至50％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟单核细胞(1至10％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟嗜碱性粒细胞(1至10％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟中性粒细胞(20％至80％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟嗜酸性粒细胞(1％至10％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟未成熟的网织红细胞(0.1至0.9％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟未成熟粒细胞(0.2至7.0％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟未成熟血小板(1％至5％)；和
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟有核红细胞(0.1至1％)。
在将这些组分组合并达到各血液学参数所需的目标水平后，将细胞悬浮液装入适当的瓶子中，加盖、贴标签并在环境条件下储存。基于该实施例制造的产品会产生类似于图1、2、3和4中描述的血液学结果、直方图和散点图。
实施例3
在这个预判实施例中，本发明的HRM通过部分使用水凝胶颗粒以及悬浮液中的其它血细胞替代物来制备。通过组合这些组分制备的样品将生成HRM，其提供超过20种参数，包括5部分(5-part)白细胞群(WBC、LYM、MONO、EO、NEUT、BASO、LYM％、MONO％、EO％、NEUT％、BASO％、IG、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT、MPV、RETIC、RETIC％和其它相关参数)。
HRM将具有以下浓度的组分：
悬浮液(pH中性和等渗)；
软固定人红细胞(1x1012至7x1012/L)；
硬固定山羊红细胞以模拟血小板(50x106至800x106/L)；
RNA包封的人红细胞以模拟网织红细胞(0.5％至10％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟淋巴细胞(10％至50％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟单核细胞(1至10％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟嗜碱性粒细胞(1至10％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟中性粒细胞(20％至80％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟嗜酸性粒细胞(1％至10％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟未成熟的网织红细胞(0.1至0.9％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟未成熟粒细胞(0.2至7.0％)；
水凝胶颗粒经选择性调节以模拟未成熟血小板(1％至5％)；和
硬固定鸡红细胞以模拟有核红细胞(0.1至1％)。
在将这些组分组合并达到各血液学参数所需的目标水平后，将细胞悬浮液装入适当的瓶子中，加盖，贴标签，并在2至8℃储存。基于该实施例制造的产品将产生类似于图1、2、3和4中描述的那些的血液学结果、直方图和散点图。
以下是跨越典型血液学对照1-3级的范围。
表3.
HRM血液变量范围
变量 单位 LL UL
WBC K/μL 2.8 26.1
NEUT K/μL 1 20.1
NEUT ％ 40.5 84.6
LYMPH K/μL 0.6 6.2
LYMPH ％ 24.5 26
MONO K/μL 0 e1.2
MONO ％ 1 6
EOS K/μL 0 1.8
EOS ％ 0 8.4
BASO K/μL 0 0.6
BASO ％ 0 2.4
RBC M/μL 1.99 5.49
HGB g/dL 5.1 17.2
HCT ％ 13.6 46.2
MCV fL 66 87
MCH pg 22.5 33.9
MCHC g/dL 32.1 41.4
RDW ％ 10.8 13
PLT K/μL 53 555
MPV fL 2.5 8
NRBC K/μL 0 5.5
这些范围是由典型的市售可得的血液学对照(RDS Heme A L1–L3对照范围(插入))生成的。
LL＝1级的下限[平均值-(1/2x范围)]
UL＝3级的上限[平均值+(1/2x范围)]
实施例4
在这个预判实施例中，本发明的不同HRM通过部分使用水凝胶颗粒以及悬浮液中的其它血细胞替代物来制备。在该示例中，第一HRM包括(在相同或不同的水凝胶颗粒上)包含血型抗原A和RhD的水凝胶颗粒，第二HRM包括(在相同或不同的水凝胶颗粒上)包含血型抗原B和RhD的水凝胶颗粒、第三HRM包括包含血型抗原A但不包含RhD的水凝胶颗粒，以及第四HRM包括包含血型抗原B但不包含RhD的水凝胶颗粒。这些HRM可用作血型分析的阳性对照。通过组合这些组分制备的样品将生成HRM，其提供超过20种参数，包括5部分白细胞群(WBC、LYM、MONO、EO、NEUT、BASO、LYM％、MONO％、EO％、NEUT％、BASO％、IG、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT、MPV、RETIC、RETIC％和其它相关参数)以及允许血液分型的水凝胶颗粒。
将各HRM与包含对各血型具有特异性的抗体(抗A、抗B和抗RhD抗体)的样品接触，并观察水凝胶颗粒的凝集。当抗体引起包含血型抗原之一的水凝胶颗粒凝集时，观察到阳性反应。
应理解，本文所述的实际和预判实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。此外，本文公开的任何发明或其实施方式的任何元素或限定内容可以与本文公开的任何和/或所有其它元素或限定内容(单独或以任何组合)或任何其它发明或其实施方式组合，并且所有此类组合均包括在本发明的范围内，但不限于此。
参考文献
Cheng,CK,Chan J,Cembrowski GS,van Assendelft OW,源自NHANES iii的全血细胞计数参比区间图；按年龄、性别和种族进行分层(Complete blood count referenceinterval diagrams derived from NHANES iii；Stratification by age,sex,andrace).Lab Hematology 10:42-53,2004.
Wakeman L,Al-Ismail S,Benton A等:健康成人的稳健常规血液学参比范围(Robust routine hematology reference ranges for healthy adults).Int J labHematology 29:279-283,2007.

Claims (31)

1.一种血液学参比物质(HRM)，包括：
a)悬浮液；
b)人红细胞组分；
c)人血小板组分；
d)人淋巴细胞组分；
e)人单核细胞组分；
f)人嗜碱性粒细胞组分；
g)人中性粒细胞组分；
h)人嗜酸性粒细胞组分；
i)未成熟人网织红细胞组分；
j)未成熟人粒细胞组分；
k)未成熟人血小板组分；和
l)有核人红细胞组分。
2.如权利要求1所述的HRM，其中所述悬浮液是水性等渗溶液，其具有7.0至约7.6的pH，并且包含选自以下的添加剂：抗微生物剂、表面活性剂、稳定剂、缓冲剂、盐、酶抑制剂、白蛋白和脂蛋白。
3.如权利要求1或2所述的HRM，其中各组分是生物组分。
4.如权利要求1或2所述的HRM，其中各组分是合成组分。
5.如权利要求1或2所述的HRM，其中各组分是生物组分和合成组分的混合物。
6.如权利要求5所述的HRM，其中所述混合物包含约0.1％至约99.9％的生物组分和约0.1％至约99.9％的合成组分，所述组分的百分比总计为100％。
7.如权利要求1-6中任一项所述的HRM，其中：
红细胞(RBC)组分包括：人红细胞，其用以下固定：低浓度的交联剂和/或与含血红蛋白的人红细胞基本相似的水凝胶颗粒；
血小板组分包括：山羊红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与人血小板基本相似的水凝胶颗粒；
网织红细胞组分包括：与人网织红细胞基本相似的水凝胶颗粒和/或RNA包封的固定的人红细胞；
淋巴细胞组分包括：鸡红细胞，其用以下固定：高浓度交联剂和/或与人淋巴细胞基本相似的水凝胶颗粒；
单核细胞组分包括：火鸡红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与人单核细胞基本相似的水凝胶颗粒；
嗜碱性粒细胞组分包括：鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与人嗜碱性粒细胞基本相似的水凝胶颗粒；
中性粒细胞组分包括：鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与人中性粒细胞基本相似的水凝胶颗粒；
嗜酸性粒细胞组分包括：鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与人嗜酸性粒细胞基本相似的水凝胶颗粒；
未成熟网织红细胞组分包括：与未成熟人网织红细胞基本相似的水凝胶颗粒和/或RNA包封的固定的人红细胞；
未成熟粒细胞组分包括：鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度交联剂和/或与未成熟人粒细胞基本相似的水凝胶颗粒；
未成熟血小板组分包括：山羊红细胞，其用以下固定：高浓度交联剂和/或与未成熟人血小板基本相似的水凝胶颗粒；和
有核红细胞组分包括：鸡红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与有核人红细胞基本相似的水凝胶颗粒。
8.如权利要求1-7所述的HRM，其中所述HRM包含对应于以下项目的量的组分：白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞分布宽度(RDW)，血小板分布宽度(PDW)，红细胞比容(HCT)，平均细胞体积(MCV)，平均血小板体积(MPV)，嗜酸性粒细胞计数(EOS)，嗜酸性粒细胞百分比(EOS％)，嗜碱性粒细胞计数(BASO)、嗜碱性粒细胞百分比(BASO％)、单核细胞计数(MONO)、单核细胞百分比(MONO％)、淋巴细胞计数(LYM)、淋巴细胞百分比(LYM％)、网织红细胞计数(RETIC)、网织红细胞百分比(RETIC％)和有核红细胞(NRBC)，如表3中所列。
9.一种校准用于分析生物样品的细胞计数装置的方法，包括：
将如权利要求1-8中任一项所述的HRM置入细胞计数装置；
测量所述HRM的组分的侧向散射、前向散射和流体动力学特性；和
基于测量的侧向散射、前向散射和HRM的流体动力学特性，校准用于分析生物样品中的细胞的细胞计数装置。
10.一种用于确定样品是否包含一种或多种细胞类型的方法，包括：
将如权利要求1-8中任一项所述的HRM置入细胞计数装置；
使用细胞计数装置测量HRM的前向散射、侧向散射和流体动力学特性；
根据测量的HRM的前向散射、侧向散射和流体动力学特性校准细胞计数装置；
将包含多个细胞的样品添加至校准的细胞计数装置；和
使用校准的细胞计数装置测量多个细胞中的各细胞的前向散射、侧向散射和流体动力学性质，以确定样品是否包括一种或多种细胞类型。
11.如权利要求3-8中任一项所述的HRM，所述HRM还包括含有血型抗原的水凝胶颗粒。
12.如权利要求11所述的HRM，其中所述HRM包括：包含血型抗原A的水凝胶颗粒群、包含血型抗原B的水凝胶颗粒群、包含血型抗原RhD的水凝胶颗粒群，或所述水凝胶颗粒群的组合。
13.如权利要求12所述的HRM，其中所述水凝胶颗粒群包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原A和血型抗原RhD。
14.如权利要求12所述的HRM，其中所述水凝胶颗粒群包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原B和血型抗原RhD。
15.如权利要求12所述的HRM，其中包含血型抗原A的水凝胶颗粒群不包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原RhD。
16.如权利要求12所述的HRM，其中包含血型抗原B的水凝胶颗粒群不包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原RhD。
17.一种凝集HRM的方法，所述HRM包含含有血型抗原的水凝胶颗粒，所述方法包括：使如权利要求11-16中任一项所述的HRM与对血型抗原具有特异性的抗体接触，和凝集所述HRM中的水凝胶颗粒。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述HRM包括：包含血型抗原A的水凝胶颗粒群、包含血型抗原B的水凝胶颗粒群、包含血型抗原RhD的水凝胶颗粒群，或所述水凝胶颗粒群的组合。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述水凝胶颗粒群包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原A和血型抗原RhD。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述水凝胶颗粒群包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原B和血型抗原RhD。
21.如权利要求18所述的方法，其中包含血型抗原A的水凝胶颗粒群不包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原RhD。
22.如权利要求18所述的方法，其中包含血型抗原B的水凝胶颗粒群不包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原RhD。
23.如权利要求1所述的HRM，其中：
红细胞(RBC)组分包括：人红细胞，其用以下固定：低浓度的交联剂和/或与含血红蛋白的人红细胞基本相似的水凝胶颗粒；
血小板组分包括：山羊红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与人血小板基本相似的水凝胶颗粒；
网织红细胞组分包括：与人网织红细胞基本相似的水凝胶颗粒和/或RNA包封的固定的人红细胞；
淋巴细胞组分包括：鸡红细胞，其用以下固定：高浓度交联剂和/或与人淋巴细胞基本相似的水凝胶颗粒；
单核细胞组分包括：火鸡红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与人单核细胞基本相似的水凝胶颗粒；
嗜碱性粒细胞组分包括：鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与人嗜碱性粒细胞基本相似的水凝胶颗粒；
中性粒细胞组分包括：鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与人中性粒细胞基本相似的水凝胶颗粒；
嗜酸性粒细胞组分包括：鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与人嗜酸性粒细胞基本相似的水凝胶颗粒；
未成熟网织红细胞组分包括：与未成熟人网织红细胞基本相似的水凝胶颗粒和/或RNA包封的固定的人红细胞；
未成熟粒细胞组分包括：鳄鱼红细胞，其用以下固定：高浓度交联剂和/或与未成熟人粒细胞基本相似的水凝胶颗粒；
未成熟血小板组分包括：山羊红细胞，其用以下固定：高浓度交联剂和/或与未成熟人血小板基本相似的水凝胶颗粒；和
有核红细胞组分包括：鸡红细胞，其用以下固定：高浓度的交联剂和/或与有核人红细胞基本相似的水凝胶颗粒。
24.如权利要求23所述的HRM，其中所述HRM包含对应于以下项目的量的组分：白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞分布宽度(RDW)，血小板分布宽度(PDW)，红细胞比容(HCT)，平均细胞体积(MCV)，平均血小板体积(MPV)，嗜酸性粒细胞计数(EOS)，嗜酸性粒细胞百分比(EOS％)，嗜碱性粒细胞计数(BASO)、嗜碱性粒细胞百分比(BASO％)、单核细胞计数(MONO)、单核细胞百分比(MONO％)、淋巴细胞计数(LYM)、淋巴细胞百分比(LYM％)、网织红细胞计数(RETIC)、网织红细胞百分比(RETIC％)和有核红细胞(NRBC)，如表3中所列。
25.如权利要求3所述的HRM，所述HRM还包括含有血型抗原的水凝胶颗粒。
26.如权利要求25所述的HRM，其中所述HRM包括：包含血型抗原A的水凝胶颗粒群、包含血型抗原B的水凝胶颗粒群、包含血型抗原RhD的水凝胶颗粒群，或所述水凝胶颗粒群的组合。
27.如权利要求26所述的HRM，其中所述水凝胶颗粒群包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原A和血型抗原RhD。
28.如权利要求26所述的HRM，其中所述水凝胶颗粒群包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原B和血型抗原RhD。
29.如权利要求26所述的HRM，其中包含血型抗原A的水凝胶颗粒群不包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原RhD。
30.如权利要求26所述的HRM，其中包含血型抗原B的水凝胶颗粒群不包含附连于水凝胶颗粒的血型抗原RhD。
31.一种凝集HRM的方法，所述HRM包含含有血型抗原的水凝胶颗粒，所述方法包括使如权利要求26所述的HRM与对血型抗原具有特异性的抗体接触，和凝集所述HRM中的水凝胶颗粒。
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