CN105378066A - 鉴定细胞群体、特别是间充质干细胞群体的多色流式细胞术方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于鉴定领域,进而是借助差示特异性荧光活化细胞分选(FACS)对间充质干细胞(MSC)和其它细胞类型的分离。
Description
技术领域
本发明属于借助于差示特异性荧光活化细胞分选(FACS)对间充质干细胞(MSC)和其它细胞类型的进行鉴定并进而进行分离的领域。即,本发明是处于各种相对特定浓度的试剂或物质组合物,所述试剂或物质组合物由于试剂中的标记的细胞标志物的各种特定浓度而令人意外地对标记的细胞提供了医学(或生理学)效应。本发明是用于借助于特定的相对试剂浓度对细胞进行选择性分离的试剂和方法。本发明人提供了一种令人意外的手段,通过这种手段,可以使物质组合物作为药物区别地作用于细胞上,从而使得能够利用荧光活化细胞分选(FACS)在七种以上细胞表面标志物存在或不存在时对细胞进行同时鉴定。
背景技术
间充质干细胞(MSC)由于其在再生医学领域的潜力而受到巨大关注,且被用于针对多种病症的临床试验中。MSC已在患急性心肌梗死[1,2]、脑卒中[3]、多系统萎缩(MSA)[4]、移植物抗宿主疾病[5]和脊髓损伤[6]的患者中显示出治疗益处的潜力。国际细胞疗法协会(ISCT)建立了一套用于鉴定MSC的最低标准[7]。这些标准是:i)对塑料的粘附性,ii)分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞,和iii)细胞表面分子的特定表达模式。前两个标准在不同条件下的细胞培养物中进行评估,而第三个标准可以利用多色流式细胞术(MFC)来评估。为了被鉴定为MSC,细胞群体中大于95%必须表达CD73(外5’-核苷酸酶)、CD90(Thy-1)和CD105(内皮因子),并且对于CD11b或CD14、CD34、CD45、CD19或CD79α和HLA-DR为阴性(≤2%阳性细胞)[7]。
传统上一直使用平行管法对MSC的表面标志物模式进行分析:多个样品管,每管具有两至四种抗体的组合,所述抗体各自缀合至不同的荧光团。这具有实践上的限制。例如,在假设细胞群体是均质的前提下对来自这些平行管的结果进行分析,并报告表面标志物的百分比表达。
迄今为止所公布的针对MSC的多色试剂组的实例忽视了所推荐的细胞标志物的ISCT标准(Martins等,2009;Jones等,2006)、利用平行管而不是单管法(Tucker和Bunnell,2011)或者利用定制的缀合物和最常见的荧光色素(Bradford和Clarke,2011)从而产生一种不灵活的无法适用于个体研究要求的工具。在某些情形中,研究人员并没有确认被流式细胞术鉴定为MSC的细胞也符合另外两条最低标准:对塑料的粘附性和三系分化能力(Martins等,2009)。
发明内容
本发明人出人意料地开发了一种多色流式细胞术(MFC)试剂组(panel),其包括ISCT推荐的在塑料粘附性细胞上的间充质干细胞MSC标志物,所述塑料粘附性细胞已证实能分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。本发明人已设计了一种核心试剂组,其不采用与三种最常用的荧光色素缀合物(即FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)和APC(别藻蓝蛋白))缀合的试剂,从而使得上述三个位置能被用作可交换的占位位置(placeholder),并允许将所述核心试剂组与其它所关注的抗原结合使用。本发明人已经验证了利用来自两种常用组织来源(即脐带基质和BM抽吸物)的MSC的试剂组。本发明人还确保了所述试剂组可以用于鉴定非均质群体中的MSC。
多色流式细胞术(MFC)与单色流式细胞术不同,其在检测试验的开发中带来了更高的技术难度。为了同时分析几种表面标志物,每种表面标志物需要特定的检测用抗体。在流式细胞术中,最好是使用与荧光色素直接缀合的抗体,而不是使用用于检测的一抗和用于信号放大的二抗。因此,当同时使用多种抗体时,必须明智地选取与其缀合的荧光色素从而使它们不会在其发射波长上重叠。简而言之,应该选择在彩色光谱中尽可能相互远离的荧光色素。成功主要取决于三个因素:最佳滴定的抗体,准确的补偿,和抗原-荧光色素平衡。下文将更详细地讨论如何将此实现。
本发明的方法相比平行管法具有几个优点。首先,对于在临床设定中对患者样品或治疗性细胞产品中的特定细胞类型进行准确定量而言,关键在于在单细胞水平鉴定细胞表型的准确性的提高。这也会带来提高的检测灵敏度,使得能够利用成熟的分析策略在混合细胞样品中鉴定出MSC。这在研究可能是非均质的临床样品时尤为优越。其次,单管流式细胞术使得能从例如活组织检查物或儿科样本等小样品中获得最大化的信息,并且其还有助于更大的研究项目,因为对每个研究对象仅需一个试管。最后,多色法有助于检测不同类型的MSC,并允许同时分析表型和功能性,例如细胞因子生成、凋亡和细胞周期分析(DeRosa等,2003)。
本发明提供了鉴定和分离/俘获新型细胞类型的高通量细胞药物发现技术以及与高通量细胞分选/自动化细胞筛选结合的算法。本发明使得能够通过该算法对上千种标志物、颜色和标志物-颜色组合进行自动化和计算分析以鉴定新型细胞类型,从而鉴定候选细胞,例如鉴定具有7种经典MSC标志物而且对于例如CD62呈阳性的新型细胞。利用下文的算法可以限定FACS实验,测试标志物、抗体和颜色的组合,以在候选细胞存在时对其进行鉴定/俘获。这一过程首次允许将『合理的』药物设计方法应用于细胞医药,从而使得研究人员能够设计新型细胞类型并对其进行经验测试。因此,这使研究人员在实践中能够:(i)构建理论上最佳的细胞,例如表达7种经典MSC标志物以及CXCR4和CD62的细胞,(ii)计算所要测试的潜在FACS试剂组,用来分离上述细胞(如果存在),然后(iii)与自动化分选结合来从上千种组织样品中分离/捕获这种细胞,和(iv)通过其独特的FACS标志物谱来严格地测试并证实候选细胞的新颖性。在没有本发明的情况下,过程(i-iv)需要数月的『试错』研究,其涉及到上百次实验室实验。利用本发明的组合物和算法的组合,使研究人员能使细胞药物发现自动化和合理化,并能够利用计算方法(包括超计算)来计算得到对新型细胞的更快、更准确且更高效和有效的鉴定和捕获。
本发明存在几个方面。间充质干细胞(MSC)免疫荧光标记试剂包括单克隆抗体与MSC的缀合物,所述MSC表达CD73(外5’-核苷酸酶)、CD90(Thy-1)和CD105(内皮因子)并且对于CD11b或CD14、CD34、CD45、CD19或CD79α和HLA-DR呈阴性[7],已在实验中针对会产生药物效应的相对特定浓度对它们进行了选择,所述药物效应呈现出特定表型,该特定表型允许对特定的细胞类型实现改善的鉴定甚至样品收集。本发明的一个方面是作为改变检测测试中的对象细胞的表型性表达的试剂药(药物),即,作为对间充质干细胞(MSC)进行免疫荧光标记以便通过在不同测试中选择性地改变免疫荧光抗体标记的相应浓度来对所述细胞进行更好地表征的试剂,以及包含抗体的实验室试剂,所述抗体包括但不限于针对以下细胞类型的抗体:成纤维细胞(CD10、CD29、CD106);VSELS(Sca-1、CD45R、Gr-1、TCRα-β、TCRγ-δ、CD11b、Ter119、Oct-4;HSC:CD133);EPC(KDR、VE-钙粘蛋白、CD31);MSC亚型(CD181、CD184);和组织定向干细胞(tissue-committedstemcell)(CD117+、CD184、c-met、AC133)。另外,另一方面是执行这些程序的试剂盒。
在本发明中,新型FACS并非仅用于鉴定表达特定标志物的细胞,而且还出人意料地提供了影响细胞表型的物质组合物,从而允许借助于改变(活性成分)的对应浓度来对细胞群体中的间充质干细胞(MSC)容易地进行鉴定甚至分离,所述活性成分是单克隆抗体与MSC的缀合物但不限于此。由此,所述试剂的活性成分允许利用荧光活化细胞分选(FACS)来在一定浓度范围内对各种MSC进行同时鉴定。由此,所述试剂允许对群体中的在表面上展示出可检测水平的CD73、CD90和CD105但不展示可检测水平的CD14、CD19、CD34和CD45的MSC进行差示性检测,并且分离出具有该表面标记物模式的MSC细胞。本发明还提供了一种试剂,其用于借助于其反应性组分的测得相对浓度来鉴定和分离细胞群体中的特定细胞类型,所述鉴定和分离包括利用FACS来同时鉴定在所述群体中的细胞表面上是否存在指示特定细胞类型的七种以上细胞表面标志物,并分离出具有指示性细胞表面标志物的细胞。其中,所述试剂可以在体外、体内和离体使用,以便在人或动物中起作用并作用于干细胞和非干细胞,包括但不限于与介质、赋形剂、无活性添加剂、血液、组织和其它体液组合应用;包括但不限于与流式细胞术结合应用,而其应用可以包括但不限于对来自组织、血液、溶液和包括冷冻样品的固体以及病理样本的细胞的分离、检测和辅助收集。
本发明人在本文中提供了一种令人惊讶的手段,通过该手段,物质组合物可以作为药物作用于细胞上,从而允许用户利用荧光活化细胞分选(FACS)同时鉴定是否存在七种以上细胞表面标志物。
由此提出了一种表型分型的算法和试剂组,其是一种从其他细胞中鉴定、分离和区分出间充质干细胞(MSC)的手段,但不限于此,所述其它细胞为外周血、骨髓、脂肪、活组织检查样品中的细胞,或为分离自任何其它组织的细胞或借助于转分化而由IPS产生或改造获得的细胞。发明人提供了对MSC表型的改良的预测,这通过荧光团ISCT核心组和算法手段来实现,通过该手段可更好地预测MSC表型。MSC具有在再生医学疗法领域中应用的潜力,且正被用在多种病症的临床试验中。由此,国际细胞疗法协会(ISCT)已建立了一套用于鉴定MSC的最低标准,包括通过多色流式细胞术(MFC)测定的特定的细胞表面分子表达模式。针对MSC的表面标志物表达的MFC方法在传统上一直使用多个平行样品。能够进行MSC单样品多色分析具有许多优点。在本研究中,本发明人报道了对由7荧光团MSC鉴定用ISCT核心组和3个占位位置(其可用在用来鉴定不同MSC亚型的试剂中)组成的10荧光团试剂组的开发。该试剂组可以用来对骨髓和脐带基质MSC进行表型分型,并且区分成纤维细胞和外周血单个核细胞的混合群体中的稀有MSC事件。该工具提供了鉴定和定量血液和骨髓中的MSC的有价值的方法,并且还能用于来自经消化的组织的单细胞悬浮液。
发明人出人预料地展示出,可以利用荧光活化细胞分选(FACS)来同时鉴定是否存在七种以上的细胞表面标志物。
本发明提供了一种鉴定并可选地分离细胞群体中的MSC的方法,其包括利用FACS同时鉴定群体中的在表面上展示出可检测水平的CD73、CD90和CD105但不展示可检测水平的CD14、CD19、CD34和CD45的细胞,并由此鉴定并可选地分离细胞群体中的间充质干细胞(MSC)。所述七种标志物的存在或不存在利用FACS来同时鉴定。所述七种标志物的存在或不存在在同一时间得到鉴定。本发明的方法利用群体的一个样品。其不涉及平行管法。
本发明还提供了一种鉴定并可选地分离细胞群体中的特定细胞类型的方法,其包括利用FACS同时鉴定在所述群体中的细胞的表面上是否存在指示所述特定细胞类型的七种以上细胞表面标志物。
本发明提供了一种用于鉴定并可选地分离细胞群体中的间充质干细胞(MSC)的试剂盒,其包括七种以上带荧光标记的抗体,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34和CD45的每一种特异性结合。
本发明还提供了一种用于鉴定并可选地分离细胞群体中的特定细胞类型的试剂盒,其包括七种以上带荧光标记的抗体,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与指示所述特定细胞类型的七种以上细胞表面标志物中的一种特异性结合。
本发明提供了一种用于鉴定并可选地分离细胞群体中的MSC的试剂和试剂盒,所述鉴定包括利用FACS同时鉴定群体中的在其表面展示出可检测水平的CD73、CD90和CD105但不展示可检测水平的CD14、CD19、CD34和CD45的细胞,并由此鉴定细胞群体中的间充质干细胞(MSC)。这七种标志物的存在或不存在利用FACS来同时鉴定。
本发明还提供了一种用于鉴定并可选地分离细胞群体中的特定细胞类型的试剂,所述鉴定包括利用FACS同时鉴定在所述群体中的细胞的表面上是否存在指示所述特定细胞类型的七种以上细胞表面标志物。
本发明还提供了一种产生荧光标记抗体组的方法,所述荧光标记抗体组用于利用FACS分析来同时鉴定是否存在七种以上细胞表面标志物,所述方法包括:(a)选择七种以上细胞表面标志物;(b)将阳性标志物分散在不同的激光器上;(c)选择七种以上带荧光标记的抗体;(d)滴定所述抗体以确保在已知所述七种以上标志物的表达(阳性和阴性)的细胞上实现最佳浓度和最小的光谱重叠;(e)测试针对阳性细胞表面标志物的抗体;(f)测试抗体核心组;(g)诱导或刺激细胞以表达占位标志物;(h)测试并滴定占位抗体;(i)优化占位条件;和(j)在不存在其它细胞类型时和在混合的群体中在细胞上对完整的组进行测试。
本发明还提供了使用本发明的方法产生的荧光标记抗体组,其用于利用FACS分析来同时鉴定是否存在七种以上细胞表面标志物。
本发明还提供了一种鉴定并可选地分离细胞群体中的新型细胞类型的方法,其包括利用FACS同时鉴定在所述群体中的细胞的表面上是否存在七种以上细胞表面标志物,其中所述七种以上标志物中的至少一些指示特定的细胞类型,并且所述七种以上的标志物中的至少一种未被所述特定细胞类型可检测地表达。
附图说明
图1显示了用10色试剂组染色的UCMMSC。A)CD14-FMO,其用于设定门(gate)以使CD14+事件低于1%。B)利用CD19-FMO修饰的A中的门,其用于设定CD19+阈值以使CD19+事件低于1%。C)应用于经完整组染色的样品的门,以进行表型分析。
图2显示了6步设门(gating)策略,在上方以示意性形式显示,并且由UCMMSC样品例示。1)FSC-SSC图上的来自以所有10种抗体染色的管的所有未设门的记录事件。绘出了门以排除碎片和双粘体(doublet)。2)CD14-CD19图,对CD14-/CD19-事件进行设门。3)CD34-CD45图,对CD34-/CD45-事件进行设门。4)CD73-CD90图,对CD73+/CD90+事件进行设门。5)CD105-SSC图,展示CD105-强度。6)未经染色和染色的细胞的叠加,展示出明显的CD105-强度的偏移,证实了最后的阳性ISCT-标志物。黑色=未经染色,红色=染色。
图3显示了在亮或暗的占位物存在时的核心表面标志物的表达。利用之前所述的设门策略对UCMMSC(n=6)和BMMSC(n=6)进行设门。UCMMSC展示出比BMMSC更均匀的前向角和侧向角散射特性。与商购BM吸出物(#4)以及BMMSC(#1)和UCMMSC相比,从获自创伤患者的BM吸出物分离出的BMMSC显示出小的CD34暗群(样品#2、#3、#5、#6)。与未经染色的对照比较时,所有样品都表达了CD105(叠加直方图)。
图4显示了BMMSC和UCMMSC之间的占位组表达的差异。使用亮10色试剂组(UCMMSC,n=3;BMMSC,n=3)或暗10色试剂组(UCMMSC,n=6;BMMSC,n=4)将样品染色。用在亮组中的占位抗体是CD29-FITC、CD164-PE和CD44-APC,而用在暗组中的占位抗体是CD49d-FITC、CD29-PE和CD182-APC。在构成暗占位组的标志物(CD29-PE、CD49d-FITC、CD182-APC)当中,在BMMSC和UCMMSC之间仅在CD49d方面存在表达差异,其在UCMMSC中有更高的表达(p=0.006)。
图5显示了在成纤维细胞占主导的混合物中对MSC的鉴定。将UCM-MSC(2%)与HSF混合。A1)来自用10色试剂组染色的UCM-MSC的管的所有未设门的记录事件。绘出了细胞门以排除碎片和双粘体。B1)来自HSF管的所有未设门的记录事件。细胞门包括HSF。C1)添加有2%MSC的HSF。在60,000个记录的细胞事件中,基于前向角和侧向角散射无法将MSC与HSF区分。C2~C6)如图2所示的MSC设门策略,产生了2.0%的经鉴定的MSC(59,550个细胞事件中有1,164个MSC)。
图6显示了在PBMC占主导的混合物中对MSC的鉴定。将UCM-MSC(1%)与PBMC混合。A1)来自用10色试剂组染色的UCM-MSC的管的所有未设门的记录事件。绘出了细胞门以排除碎片和双粘体。B1)来自PBMC管的所有未设门的记录事件。细胞门包括PBMC。C1)添加有1%MSC的PBMC。在100,000个记录的细胞事件中,基于前向角和侧向角散射无法将MSC与PBMC区分。C2~C6)如图2所示的MSC设门策略,产生了0.63%的经鉴定的MSC。
具体实施方式
细胞类型检测
本发明的方法可以用于利用细胞表面标志物模式对多种特定细胞类型进行鉴定和可选的分离。这些细胞类型包括但不限于间充质干细胞(MSC)、中胚层谱系的祖细胞、成纤维细胞、极小胚胎/外胚层样干细胞(VSEL)、造血干细胞(HSC)、内皮祖细胞(EPC)和组织定向干细胞。这些细胞的细胞表面标志物模式如权利要求书中所述。
所述方法涉及利用FACS来同时鉴定是否存在七种以上细胞表面标志物。可以同时鉴定任何数目的标志物。例如,本发明可以涉及利用FACS鉴定是否存在8种以上、9种以上、10种以上、12种以上、15种以上、20种以上、25种以上、30种以上、35种以上、40种以上、45种以上、50种以上、55种以上、60种以上、65种以上、70种以上、75种以上、80种以上、85种以上、90种以上、95种以上、100种以上、150种以上、200种以上、250种以上、300种以上、350种以上、400种以上、500种以上、600种以上、700种以上、800种以上、900种以上、1000种以上、1500种以上、2000种以上、2500种以上或5000种以上的表面标志物。这可以如下文更详细所讨论的进行。
七种以上细胞表面标志物的存在或不存在是同时(即,在同一时间)确定的。利用本发明,可以在细胞群体上进行一次FACS分析并且可以由此确定所述七种标志物是否存在。不必运行多于一次FACS分析或者用多个样品进行FACS分析。本发明避免了平行管方法的使用。
能够特异性结合各种细胞表面标志物的抗体在本领域是已知的。当抗体与某细胞表面标志物序列以优先或高的亲和力结合但与其它细胞表面标志物或其它蛋白基本不结合、不结合或仅以低亲和力结合时,则该抗体与所述细胞表面标志物序列『特异性结合』。例如,当抗体以优先或高的亲和力与CD73结合但与其它细胞表面标志物或蛋白(例如CD90、CD105、CD14、CD19、CD34和CD45)基本不结合、不结合或仅以低亲和力结合时,则该抗体与CD73『特异性结合』。
如果抗体以1x10-7M以下、更优选5x10-8M以下、更优选1x10-8M以下、或更优选5x10-9M以下的Kd结合,则其以优先或高的亲和力结合。如果某部分以1x10-6M以上、更优选1x10-5M以上、更优选1x10-4M以上、更优选1x10-3M以上、进而更优选1x10-2M以上的Kd结合,则该部分以低亲和力结合。用于确定化合物(例如抗体或抗体构建体和寡核苷酸)的特异性结合能力的竞争性结合检测或免疫放射计量检测的各种规程是本领域公知的(参见例如Maddox等,J.Exp.Med.158,1211-1226,1993)。
抗体可以是例如单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体或人源化抗体。抗体可以是完整免疫球蛋白分子或其片段,例如Fab、F(ab’)2或Fv片段。
下文将参照本发明的试剂盒对适用于本发明的方法的荧光标记进行阐述。
MSC在其表面上展示出可检测水平的CD73、CD90和CD105,但不展示可检测水平的CD14、CD19、CD34和CD45。这种表达模式可以利用本发明的方法来检测。因此,可以鉴定并可选地分离MSC。
中胚层谱系的祖细胞表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD271,而(b)不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45。优选地,这些细胞还表达CXCR1、CXCR2或CXCR4。更优选地,它们表达CXCR1、CXCR2和CXCR4的全部。这公开在国际申请PCT/GB2012/051600(公开号WO2013/005053)中。这种表达模式可以用本发明的方法来检测。因此,能够鉴定并可选地分离PML。
特定细胞类型优选是基质细胞。可以利用本发明的方法鉴定的其它特定基质细胞类型及其表面标志物表达如下所示。『+』意味着细胞展示可检测水平的该标志物。『-』意味着细胞不展示可检测水平的该标志物。小鼠和人所共有的标志物在该标志物后以『(m/h)』标识,小鼠所特有(m)或人所特有(h)的标志物也这样标出。这取自JohannaA.Joyce&JeffreyW.Pollard,NatureReviewsCancer9,239-252(2009年4月)。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM):CD11b+CD14+CD31-CD34-CD45+CD68+CD117-CD133-CD146-CD204+CD206+CCR2+CSF1R+MHCII+VEGFR1+VEGFR2-(m/h)F4/80+(m)CD23+CD163+CXCR4+。
髓系衍生抑制细胞(MDSC):CD11b+CD14+/-MHCI+MHCII低(m/h)GR1+CD11b+,且能进而细分为LY6G+LY6C低CD11b+CD11c+/-CD33+CD34+CD86-
表达血管生成素受体TIE2的单核细胞(TEM):CD11b+CD14+CD31低CD34-CD45+CD117-CD133-TIE2+VEGFR2-(m/h)F4/80+GR1低SCA1-(m)CD11c+CD13+CD16+CD33+CD62L-CD146-CCR2-CCR5+CSF1R+(h)
嗜中性粒细胞:CD11b+CD14低CD31+CD66B+CXCR2+(m/h)GR1+VEGFR1+CXCR1-(m)CD15+CXCR1+(h)
肥大细胞:CD43+CD117+CD123+CD153+(m/h)CD11b+CD16+CD34+SCA1+(m)CCR1+CCR3+CCR4+CCR5+CXCR1+CXCR2+CXCR4+(h)
内皮细胞:CD31+CD34+CD105+CD106+CD144+(m/h)
周细胞:结蛋白+/-NG2+/-SMA+/-PDGFR+/-
成纤维细胞:波形蛋白+结蛋白+SMA+/-FSP1+FAP+(m/h)
血小板:CD41+CD42a-dCD51+CD110+(m/h)
CD4+T细胞:CD3+CD4+CD45+(m/h)
CD8+T细胞:CD3+CD8+CD45+(m/h)
B细胞:CD3-CD19+CD20+CD45+(m/h)CD45RA+B220+(m)
NK细胞:CD11b+CD27+CD3-CD16+/-CD56+CD3-CD335+NKp46+(m/h)
本发明还提供了一种鉴定并可选地分离新型细胞类型的方法。所述方法包括利用FACS同时鉴定群体中的细胞的表面上是否存在七种以上细胞表面标志物,其中所述七种标志物中的至少一些指示所述特定细胞类型,并且所述七种标志物中的至少一种未被所述特定细胞类型可检测地表达。所述特定细胞类型可以是上文所讨论的任何一种。所述特定细胞类型优选为MSC。所述方法可以涉及利用FACS同时鉴定群体中的细胞的表面上是否存在八种以上细胞表面标志物,其中所述八种以上标志物包括CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34和CD45,且所述八种以上标志物中的至少一种未被MSC表达。MSC上的细胞表面标志物已经得到很好地表征,且鉴定未被MSC表达的至少一种细胞表面标志物是常规的。本领域技术人员可以利用下文的算法设计出标志物组和对应的抗体来以高通量方式鉴定出新型细胞类型。
FACS分析是公知的技术。执行该技术的一种方式如实施例中所公开。FACS可以分离单个细胞。本发明的方法可以用于鉴定并可选地分离特定类型的单个细胞,例如单个MSC或单个中胚层谱系祖细胞,或者如上文所述的新型细胞类型的单个细胞。作为另一种选择,本发明的方法可以用于鉴定并可选地分离特定类型的两个以上的细胞,例如两个以上的MSC或两个以上的中胚层谱系祖细胞。
FACS还可以分离表达特定标志物的细胞。因此,本发明还提供了鉴定和分离细胞群体中的间充质干细胞(MSC)的方法,其包括利用荧光活化细胞分选(FACS)同时鉴定群体中的在其表面上展示出可检测水平的CD73、CD90和CD105且不展示可检测水平的CD14、CD19、CD34和CD45的细胞,并分离出具有该表面标志物模式的细胞。本发明还提供了鉴定和分离细胞群体中的特定细胞类型的方法,其包括利用FACS同时鉴定该群体中的细胞表面上是否存在指示所述特定细胞类型的七种以上细胞表面标志物,并且分离出具有所述指示性细胞表面标志物的细胞。
通常对FACS方法中所用的抗体进行滴定以用在下文所讨论的方法中。
细胞群体通常存在于样品中。样品优选为液体样品。样品通常包括患者的体液。样品可以是尿液、淋巴液、唾液、粘液、乳或羊膜液,但优选为血液、血浆或血清。样品可以来自骨髓。通常,样品为人来源,但作为另一种选择,其可以来自其他哺乳动物,例如来自商业畜养的动物,例如马、牛、绵羊或猪,或作为另一选择可以为如猫或狗等宠物。
样品通常在检测前经过处理,例如通过离心或者通过穿过过滤掉不希望的分子或细胞(例如血红细胞)的膜来进行。样品可以在取样后立即进行测定。此外,样品通常也可在检测之前储存,优选在低于-70℃储存。
试剂盒和试剂
本发明还提供了用于鉴定并可选地分离间充质细胞(MSC)或特定细胞类型的试剂盒。本发明的试剂盒可以用于鉴定并可选地分离特定类型的单个细胞,例如单个MSC或单个中胚层谱系祖细胞,或者新细胞类型的单个细胞。作为另一种选择,本发明的试剂盒可以用于鉴定并可选地分离特定类型的两个以上的细胞,例如两个以上的MSC或两个以上的中胚层谱系祖细胞,或者一个MSC和一个中胚层谱系祖细胞。
所述试剂盒包括七种以上带荧光标记的抗体。所述试剂盒中的至少一种抗体与用于鉴定并可选地分离MSC或特定细胞类型的细胞表面标志物中的每一种特异性结合。例如,在一个实施方式中,试剂盒包括七种以上荧光标记抗体,且所述试剂盒中的至少一种抗体与CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34和CD45中的每一种特异性结合。其它特定的试剂盒如权利要求书中所述。
特异性结合如上文所讨论。
本发明的试剂盒可以用在本发明的方法中,从而利用FACS鉴定并可选地分离细胞群体中的MSC或特定细胞类型。所述试剂盒可以用于鉴定和可选地分离上文所讨论的任何细胞类型。
针对各种标志物的抗体可商购获得。表1总结了针对CD11b、CD14、CD19和CD79α的抗体的商业来源。
试剂盒中的每种抗体通常用不同的荧光标记来标记。七种以上的荧光标记通常被选择成使得其可利用FACS鉴定。所述七种以上荧光标记优选选自BV605、K-橙、eF450、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、PE、FITC/AF488、APC-eF780、AF700和APC。所述七种以上荧光标记优选选自BV605、K-橙、eF450、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、APC-eF780和AF700。可以使用这些标记的任意组合。与这些标记使用的合适的FACS配置如下文所示。
所述七种以上的荧光标记抗体优选包括抗CD14-APC-eFluor780(克隆61D3,eBioscience,Hatfield,Ireland,英国)、抗CD19-PE-Cy7(克隆J3-119,BeckmanCoulter,London,英国)、抗CD34-PerCP-Cy5.5(克隆581,BioLegend,SanDiego,CA,美国)、抗CD45-Krome橙(克隆J.33,BeckmanCoulter)、抗CD73-eFluor450(克隆AD2,eBioscience)、抗CD90-AlexaFluor700(克隆5E10,BioLegend)、抗CD105-亮紫605(克隆266,BDBioscience,Oxford,英国)。所有抗体均为小鼠同种型IgG1,κ。
所述七种以上荧光标记抗体中的每一种通常被滴定至适当的浓度以用于本发明的FACS方法中。每种抗体通常滴定为1:10至1:1000000,例如1:50、1:100、1:500、1:1000、1:10,000、1:50,000、1:100,000。滴定在本发明的方法中很重要,如下文所详细讨论的。
本发明的试剂盒可以额外地包含一种以上的使得上文提及的任何实施方式能够进行的其它试剂或仪器。所述试剂或仪器包括以下中的一种或多于一种:合适的缓冲液(水溶液)、从受试对象获取样品的器具(例如,容器或包括针的仪器)和/或FACS分析所需的其他试剂。试剂可以以干态存在于试剂盒中,从而可用液体样品将该试剂重悬浮。试剂盒也可以可选地包括使该试剂盒可用于本发明的方法中的说明书或者关于所述方法可用于何种患者的详细内容。
算法
本发明允许同时鉴定是否存在七种以上细胞表面标志物。为此,必须使用以下算法以将几个因素考虑在内。
本发明的目的在于:(i)开发出多色流式细胞术试剂组,其包括被ISCT推荐的在塑料附着性细胞上的阳性和阴性表面标志物;(ii)设计出不使用与三种最常见的荧光染料FITC(荧光素异硫氰酸酯)、PE(藻红蛋白)或APC(别藻蓝蛋白)缀合的试剂的试剂组,从而使得这三个位置能够被用作可交换的占位位置,以允许研究人员将所述试剂组与其它关注抗原组合使用;和(iii)利用诸如来自脐带基质和骨髓吸出物的MSC等细胞来验证所述试剂组。
所述方法的成功依赖于:(i)待鉴定的所选标记物的数目;(ii)FACS仪中的荧光通道/检测器的数目;(iii)FACS仪的每个通道/检测器上的激光器的数目;(iv)对于每种标志物可利用的抗体的数目;(v)抗体的灵敏度(在光谱区域中的信号亮度);(vi)抗体缀合物的表现(荧光染料的亮度和标志物的表达水平);和(vii)同一细胞上其它抗体的存在。当设计合适的荧光标记抗体组时,这些均需被考虑在内。
本发明提供了一种产生荧光标记抗体组的方法,所述荧光标记抗体组用于利用FACS分析同时鉴定是否存在七种以上的细胞表面标志物,所述方法包括:(a)选择七种以上的细胞表面标志物;(b)将阳性标志物分散在不同的激光器上;(c)选择七种以上带荧光标记的抗体;(d)滴定所述抗体以确保在已知所述七种以上标志物的表达(阳性和阴性)的细胞上实现最佳浓度和最小的光谱重叠;(e)测试针对所述阳性细胞表面标志物的抗体;(f)测试抗体核心组;(g)诱导或刺激细胞以表达占位标志物;(h)测试并滴定占位抗体;(i)优化占位条件;和(j)在不存在其它细胞类型时和在混合的群体中在细胞上对完整的组进行测试。
步骤(b)确保了最小的光谱重叠和对其他标志物的干扰。所述不同的激光器位于FACS仪中。(c)中的七种以上荧光标记抗体与所述七种以上标志物特异性结合。通常,存在一种抗体与所述七种以上标志物的每一种特异性结合。然而,所述组可以包括多于一种的与所述七种以上标志物中的一种以上特异性结合的抗体。合适的抗体和荧光标记如上文所讨论。
步骤(d)中的滴定可以用常规方法进行。用于本发明中的合适的抗体浓度如上文所述。利用FACS分析来测试所述七种以上抗体的浓度,以确保最小的光谱重叠和对与其它标志物特异性结合的其它抗体的干扰。
步骤(e)、(f)、(h)、(i)和(j)通常利用FACS分析进行。这使得抗体能够得到测试和滴定,并且条件能够得到优化。
(f)中的抗体核心组与针对所关注的特定细胞类型的细胞标志物核心组(例如上文讨论的任何核心组)特异性地结合。对于MSC,可以在可商购获得的MSC细胞系及其混合群体(即,非MSC和MSC)上对特异性结合CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34和CD45的七种抗体的核心组进行测试。上文所讨论和实施例中的10色试剂组也可以在上述两种条件下进行测试。这即实施例中所进行的。荧光标记抗体的核心组通常不包括FITC(荧光素异硫氰酸酯)、PE(藻红蛋白)或APC(别藻蓝蛋白)。
(g)中的占位抗体可以包括FITC(荧光素异硫氰酸酯)、PE(藻红蛋白)或APC(别藻蓝蛋白)。可互换的占位抗体使得核心组可以与所关注的其它细胞表面标志物组合来进行测试。例如,对于MSC,特异性结合CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34和CD45的七种抗体的核心组可以与其它细胞表面标志物(例如CD62)组合进行测试。这使得能够如上文所讨论那样鉴定新的细胞类型。
如步骤(d)和/或(h)那样对用于流式细胞术的抗体进行滴定的原因在于:在不会不必要地浪费抗体的情况下使阳性信号和阴性信号得到最优分离,由此降低背景噪声和方法的整体成本。染色液中的过高的抗体浓度还可能导致非特异性抗体结合。因此,滴定是良好的措施,其不仅增加了检测法的特异性,而且降低了试剂消耗并由此降低了成本(ICSH/ICCS,2013)。滴定的目的在于鉴定出会产生最高的染色指数的抗体浓度。这在本领域中是常规的。
本发明的产生荧光标记抗体组的方法可以自动化。自动化的方法消除了手动/人工处理的限制,并允许进行自动化筛选,并使计算能力能够进行理论的高通量细胞药物开发。这使得能够产生利用FACS分析对1000种以上的细胞表面标志物的存在或不存在进行同时鉴定的荧光标记抗体组。
本发明还提供了荧光标记抗体组,其用于利用本发明的方法使用FACS分析同时鉴定是否存在七种以上的细胞表面标志物。
本发明还提供了鉴定细胞群体中的间充质干细胞(MSC)的方法,其包括:产生荧光标记抗体组,其用于利用荧光活化细胞分选(FACS)并使用上述(b)至(j)对CD73、CD90和CD105的存在以及CD14、CD19、CD34和CD45的不存在进行同时鉴定;和利用所述荧光标记抗体组并使用荧光活化细胞分选(FACS)来鉴定群体中的在其表面展示出可检测水平的CD73、CD90和CD105且不展示可检测水平的CD14、CD19、CD34和CD45的细胞,并由此鉴定出细胞群体中的间充质干细胞(MSC)。
本发明还提供了鉴定细胞群体中的特定细胞类型的方法,其包括:产生荧光标记抗体组,其用于利用荧光活化细胞分选(FACS)并使用上述(b)至(j)对所述特定细胞类型中的七种以上细胞表面标志物的存在或不存在进行同时鉴定;和利用所述荧光标记抗体组并使用FACS来同时鉴定在所述群体中细胞的表面上是否存在指示所述特定细胞类型的七种以上细胞表面标志物。
所述方法可以包括产生用于鉴定是否存在指示MSC或特定细胞类型的十种以上细胞表面标志物的荧光标记抗体组。上文讨论的任何实施方式都同等地适用于该实施方式。
本发明的一个具体实施方式涉及一种算法和方法,其用于:(i)开发MFC试剂组,其包括被ISCT推荐的在塑料附着性细胞上的MSC标志物,所述塑料附着性细胞已证实会分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞;(ii)设计出不使用与三种最常用荧光染料缀合物(即FITC(荧光素异硫氰酸酯)、PE(藻红蛋白)或APC(别藻蓝蛋白))缀合的试剂的核心组,以使得这三个位置可用作可互换的占位物,从而使得研究人员能将该组与所关注的其他抗原组合使用;(iii)利用来自两种常用组织来源(即,脐带基质和骨髓吸出物)的MSC来验证所述组;(iv)确保所述组能用于鉴定异质群体内的MSC。
另一个具体实施方式涉及开发一种利用聚合分类与回归树模型来处理包括样品数据项在内的来自MFC组的数据的更好的手段,所述聚合分类与回归树模型利用统计系综或委员会方法(例如自助(Bootstrap)、自助聚合(Bagging)或弧(Arcing)算法)来形成。在另一个实施方式中,聚合分类与回归树模型通过预处理来训练。
i)历史数据,包括此前记录了百分比MSC含量的样品的实际样品数据,和
ii)这些样品的对应的有利MSC分析后结果,以学习如何预测有利的MSC分析后结果。在一个具体实施方式中,所述预处理包括:减少历史样品数据和对应的有利MSC分析后结果的量;利用分类与回归树减少在历史样品数据和对应的有利MSC分析后结果中所包含的变量的数量;转化历史样品数据和对应的样品有利MSC分析后结果的数值;对提取出的特征应用增强(boosting)算法;和从增强的提取特征中产生用来预测有利结果(高MSC产率)的分类与回归树模型。在另一个实施方式中,在随机选取的90%训练样品中反复训练所述模型并随后在剩余10%保留测试集中进行预测以产生对有利MSC分析后结果的筛选相关改善的评估值,由此来交叉验证所述模型。
在再一个实施方式中,对有利结果(高产率)的预测包括利用使用自助算法形成的聚合分类与回归树模型来处理数据项,所述模型包括许多不同树的组合,每个模型在从原始样品中抽取的一系列自助样品中进行估算,且其中,基于平均预测的有利交叉自助树和多数票决标准(其包括:大多数自助树是否预测为有利且高于预定阈值水平)的组合,作出用来计算MSC细胞表型的筛选决定以针对样品进行预测。
在一个具体实施方式中,开发了一种利用聚合分类与回归树模型来处理样品信息项的更好的手段,所述聚合分类与回归树模型利用统计系综或委员会方法(例如自助、自助聚合或弧算法)来形成。在另一个实施方式中,聚合分类与回归树模型通过预处理来训练。
i)历史数据,包括此前记录了百分比MSC含量的样品的实际样品数据,和
ii)这些样品的对应的有利MSC分析后结果,以学习如何预测有利的MSC分析后结果。在一个具体实施方式中,所述预处理包括:减少历史样品数据和对应的有利MSC分析后结果的量;利用分类与回归树减少在历史样品数据和对应的有利MSC分析后结果中所包含的变量的数量;转化历史样品数据和对应的样品有利MSC分析后结果的数值;对提取出的特征应用增强算法;和从增强的提取特征中产生用来预测有利结果(高MSC产率)的分类与回归树模型。在另一个实施方式中,在随机选取的90%训练样品中反复训练所述模型并随后在剩余10%保留测试集中进行预测以产生对有利MSC分析后结果的筛选相关改善的评估值,由此来交叉验证所述模型。
在再一个实施方式中,对有利结果的预测包括利用使用自助算法形成的聚合分类与回归树模型来处理数据项,所述模型包括许多不同树的组合,每个模型在从原始样品中抽取的一系列自助样品中进行估算,且其中,基于平均预测的有利交叉自助树和多数票决标准(其包括:大多数自助树是否预测为有利且高于预定阈值水平)的组合,作出用来计算MSC细胞数的筛选决定以针对样品进行预测。
实施例
材料和方法
人脐带基质样品的收集
在选择性剖腹产分娩术后从足月生产中收集人脐带和胎盘,并且在转运期间于室温无菌储存低于90分钟(从分娩至处理)。将脐带与胎盘分离,移取近胎盘端的10cm段置于无菌容器中。将脐带用磷酸盐缓冲盐水(PBS;LifeTechnologiesLtd,Paisley,英国)洗涤以洗去血液,并于4℃在补充有抗生素-抗真菌素(均来自LifeTechnologies)的Hanks缓冲盐溶液(HBSS)中温育2小时。该研究获得了当地研究伦理委员会的许可,且所有母亲均给予了书面知情同意。根据经部分修正的公开方法[13,14]制备脐带基质MSC。然后采集细胞并计数,将第3次传代的细胞在补充有10%二甲亚砜(SigmaAldrich,Poole,英国)的培养基中冻存至-80℃,并在液氮中保存待用。
人骨髓吸出物样品的收集
在进行骨科创伤手术时收集骨髓吸出物。从髂嵴采集1ml至8ml的样品置于肝素化注射器中,并在转运期间在室温储存,1小时内进行处理。将骨髓用HBSS(LifeTechnologies)以1:2稀释并层积在Ficoll-PaquePLUS1.077(GEHealthcare,Uppsala,瑞典)上,离心分离骨髓单个核细胞(BMMC)。该研究获得了当地研究伦理委员会的许可,且患者给予了书面知情同意。在T25烧瓶中,将BMMC以1x105细胞/cm2接种于5ml细胞培养基αMEM(LifeTechnologies)、从过期的机采血小板制备的10%血小板裂解液、2mMGlutaMAX(LifeTechnologies)、1%青霉素-链霉素(LifeTechnologies)、5U/ml肝素(CalBiochem,MerckKGaA,Darmstadt,德国)中,并在37℃、空气中5%CO2下温育。第8天,用Accutase(SigmaAldrich)覆盖培养物表面并将烧瓶在37℃下温育5分钟以使细胞脱附,从而除去用过的培养基,而后采集细胞。离心收集细胞、重悬于完整培养基中并如上计数;然后以500细胞/cm2培养细胞至95%汇合。采集细胞并计数,并将第2次传代的细胞如上在培养基/10%DMSO中冻存。来自年轻健康志愿者(22岁男性)的一个额外骨髓样品以及在第2次传代时冻存的分离MSC(22岁女性)购自Lonza(Lonza,Slough,英国),作为处理和细胞分离规程的内部对照。
人成纤维细胞系
人皮肤成纤维细胞(HSF)细胞系1184用作阴性对照,以测试是否可能利用所述试剂组来鉴定混合细胞群体中的MSC。在高葡萄糖DMEM(SigmaAldrich)、10%FCS(SigmaAldrich)、2mMGlutaMAX(LifeTechnologies)、1%青霉素/链霉素(LifeTechnologies)中培养细胞直至80%至90%汇合。如上利用Accutase将其收集。
外周血单个核细胞(PBMC)
在当地研究伦理委员会许可下,在书面知情同意后将来自健康志愿者的外周血采集至肝素化Vacutainer管(GreinerBio-One)中。将血样用HBSS(Invitrogen)稀释为1:2,层积在Ficoll-PaquePLUS1.073(GEHealthcare)上并离心分离PBMC。如上对细胞进行计数,并与MSC混合以评估所述试剂组是否能鉴定异源性样品中的MSC。
MSC的制备
将UCM和BMMSC解冻,并使其在其如上所述的相应应培养基中于37℃、空气中5%CO2下以5,000细胞/cm2繁殖,并使用Accutase采集。UCMMSC和BMMSC以其第5代使用。采集时的细胞活力总是不小于82%。
表面标志物选择
阳性标志物
根据ISCT标准,MSC必须表达CD73、CD90和CD105,因此将这些包括在多色试剂组内。
阴性标志物
在ISCT阴性标志物中,纳入了以下这些:CD14、CD19、CD34和CD45。由于MSC的HLA-DR表达可以被诱导,不认为其是确定的阴性标志物,并因此从试剂组中将其省略[7]。在ISCT所推荐的两种单核细胞标志物CD11b和CD14中选择了CD14,因为有更多种类的靶向该抗原的产品可用,尤其是与抗CD14抗体缀合的各种荧光团。基于同样理由,选择了B淋巴细胞标志物CD19而不是CD79α。在2012年7月审核了13个供应商:CD11b:79个产品,CD14:100个产品,CD19:108个产品,CD79α:26个产品,参见表1。
单克隆抗体选择
7色核心组
鉴定靶向上述选定的表面标志物的单克隆抗体的标准是:其不应与FITC、PE和APC缀合,从而使这些常用荧光染料可用来研究所关注的其他标志物。类似地,需要将紫色激光以其全部潜力使用(对于发明人所能利用的BDFACSAriaI而言为3x光电倍增管),因为适合于紫色激光的荧光团较少见。此外,决定将阳性标志物分散在不同的激光器上,以使光谱重叠和对其它标志物的干扰最小化。考虑到这些标准,筛选了13个供应商以获得其针对CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105的荧光团缀合单克隆抗体。选择用于开发试剂组的单克隆抗体为:抗CD14-APC-eFluor780(克隆61D3,eBioscience,Hatfield,Ireland,英国)、抗CD19-PE-Cy7(克隆J3-119,BeckmanCoulter,London,英国)、抗CD34-PerCP-Cy5.5(克隆581,BioLegend,SanDiego,CA,美国)、抗CD45-Krome橙(克隆J.33,BeckmanCoulter)、抗CD73-eFluor450(克隆AD2,eBioscience)、抗CD90-AlexaFluor700(克隆5E10,BioLegend)、抗CD105-亮紫605(克隆266,BDBioscience,Oxford,英国)。所有抗体均为小鼠同种型IgG1,κ。
占位物
为了测试占位物概念,将以下报导的阳性MSC标志物与核心组结合使用:抗CD29-FITC(克隆TS2/16,eBioscience)、抗CD29-PE(克隆HUTS-21,BDBioscience)[15]、抗CD44-APC(克隆IM7,eBioscience)[16]、抗CD49d-FITC(克隆44H6,Serotec,Kidlington,英国)[17]、抗CD164-PE(克隆N6B6,BDBioscience)[18]和抗CD182-APC(克隆5E8/CXCR2,BioLegend)[19]。除CD44-APC(IgG2b,κ)、CD29-PE和CD164-PE(二者均为IgG2α,κ)以外,所有抗体均为小鼠同种型IgG1,κ。基于来自初步数据的信号强度,将占位物分为两组。一个为亮组(CD29-FITC、CD164-PE和CD44-APC),另一个为暗组(CD49d-FITC、CD29-PE和CD182-APC),以确保占位抗体的亮度不会影响核心组的表现。
抗体滴定
将阴性MSC标志物抗体(CD14、CD19和CD45)在外周血上滴定。利用ISHAGE程序在脐带血上滴定CD34以检测CD34+细胞[20]。阳性MSC标志物抗体(CD29、CD44、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD164和CD182)在UCMMSC上滴定。
单克隆抗体染色策略
分阶段建立试剂组以确保试剂可以组合使用。首先,用针对阳性标志物CD73、CD90和CD105的抗体将UCMMSC单染色,以所有三种可能的组合将其双染色,然后将其三染色。分析结果以比较所有组合的信号。然后用亮10色试剂组(UCMMSC,n=3;BMMSC,n=3)或暗10色试剂组(UCMMSC,n=6;BMMSC,n=4)将样品染色。使用抗体俘获(AbC)珠(LifeTechnologies)来建立所有试剂的补偿对照。通过用除一种抗体外的所有抗体以所有10种组合进行染色来平行地创建“荧光减一”(Fluorescence-minus-one)(FMO)对照[21],以鉴定在何处设置门。将UCMMSC样品(n=4)与HSF1184或PBMC混合,以确保MSC能作为混合细胞群体中的稀有事件得到鉴定。
单克隆抗体染色条件
将在100μlFACS缓冲液(Dulbecco’sPBS,LifeTechnologies;0.2%BSA和0.05%叠氮化钠,均来自SigmaAldrich)中的细胞(3x105)与适量的此前滴定实验所确定的每种抗体一起于冰上在暗处温育30分钟。然后在4℃以515g离心7分钟以使细胞成团,弃去上清液,将细胞再悬浮于3ml相同的缓冲液中,并通过离心再次成团。在快速倾去上清液后,通过轻敲管将细胞团再悬浮于留在管中的少量缓冲液中。制备了使用成纤维细胞和PBMC的混合群体样品,以使最终细胞数在染色前为3x105。
流式细胞术数据采集
利用BDFACSAriaI流式细胞仪(BDBioscience)用FACSDiva6.1.3软件在2小时内分析经染色的细胞。所用的滤波器配置如表2所述。在每次运行前至少1小时启动仪器以使激光器预热,并使用CytometerSetup&TrackingBeads(BDBioscience)检验仪器性能。所有样品都在无补偿的情况下记录。对于每个单克隆抗体组合记录最少10,000个细胞事件。在对混合细胞群体进行数据采集期间,对于成纤维细胞记录了60,000个细胞事件,而对PBMC记录了100,000个细胞事件。对未染色样品设定电压[22]。
流式细胞术数据分析
利用来自AbC珠的数据在Kaluza1.2(BeckmanCoulter)中对FCS文件进行自动补偿和分析,以创建补偿规则。在整个研究中,在对数(双指数)轴上显示中位数荧光强度(MFI)以使阴性事件能够显现在轴下方[23]。为传达关于事件密度的信息,选择具有可见离群值的轮廓密度图作为标准图[24]。获得了来自整个细胞群体的中位数荧光强度(MFI)。描述性统计学数据包括中位数、最低值和最高值。统计学显著性通过学生T检验来评估。
结果
用于鉴定MSC的设门策略
利用“荧光减一”(FMO)对照来设定所有门,以确保准确的设门(图1)[21]。举例而言,CD14-FMO在CD14-CD19图上以象限门显示。调节CD14门直至<1%的事件落入右侧象限内(A)。然后,CD19-FMO样品显示在同一图上,并相应的针对CD19来调节门(B)。最后,利用所设定的门将用所有抗体染色的样品可视化(C)。对所有FMO执行同一程序。
利用用FMO设定的门,开发了用于鉴定MSC的多步设门策略,其在图2中示意性概括示出并以UCMMSC为例。首先,在前向角散射-侧向角散射图上使所有记录事件可视化,并围绕细胞绘制门以排除碎片和双粘体(步骤1)。侧向角散射显示在对数轴上,而前向角散射显示在线性轴上。将门控的细胞显示在CD14-CD19图上以鉴定双阴性(CD14-/CD19-)事件(步骤2)。将CD14-/CD19-事件显示在CD34-CD45图上,并对CD34-/CD45-事件设门(步骤3)。将这些显示于CD73-CD90图上并对双阳性(CD73+/CD90+)事件设门(步骤4)。将双阳性事件显示于CD105-侧向角散射图上以观察CD105强度(步骤5)。在阳性标志物中,发现CD105强度在样品间变化最大。由于CD73和CD90一直较亮,在设门策略中将其在CD105之前使用。将CD73+/CD90+/CD105+细胞的直方图与未染色细胞的直方图叠加,证实了整个群体均为CD105+(步骤6)。CD105FMO与未染色细胞在CD105MFI方面没有差异,因此可以使用未染色对照。
表型分析
通过设门策略所展示的核心表面标记物模式对于BMMSC和UCMMSC而言是一致的,且不受占位物的信号强度的影响(图3)。UCMMSC展示出更均一的前向角和侧向角散射谱。在2号和3号样品中在BMMSC细胞门以外见到的非均一性最可能是细胞碎片,反映出其低的活力(分别为82%和86%)。与商购BM吸出物(4号样品)、商购BMMSC(1号)和UCMMSC相比,从来自创伤患者的BM吸出物中分离出的BMMSC展示出了较小的CD34暗群(2、3、5和6号样品)。
骨髓与脐带基质MSC上的表面抗原的强度分析
就阳性和阴性ISCT标志物的MFI而言,在BMMSC和UCMMSC之间不存在统计学显著性差异(数据未示出)。在亮组中,CD14和CD34的MFI高于未染色对照,这表明了利用FMO来设定门以排除假阳性的重要性。UCMMSC中的CD49dMFI比BMMSC更高(p=0.006)(图4)。与UCMMSC相比,BMMSC中CD44在信号强度方面显示出更宽的范围。暗组和亮组的确揭示出,抗原的表达(在该情形中为CD29)非常依赖于所用的克隆和/或荧光染料:在用于对同一样品染色时,CD29-FITC比CD29-PE给出更高的MFI。
鉴定混合细胞群体中的MSC
能够以2%(2.0%,59,550个细胞事件中有1,164个MSC)、5%(4.6%,59,587个细胞事件中有2730个MSC)和10%(10.4%,59,474个细胞事件中有6193个MSC)鉴定出与成纤维细胞群混合的MSC(图5),重复两次。还可以以1%(0.63%,98,071个细胞事件中有620个MSC)、2%(1.9%,97,705个细胞事件中有1860个MSC)、5%(3.7%,97,360个细胞事件中有3627个MSC)和10%(6.8%,95,772个细胞事件中有6535个MSC)鉴定出添加至PBMC的MSC(图6),执行一次。然而,PBMC制备物由表达阴性ISCTMSC标志物——CD14、CD19、CD34和CD45的细胞所主导。因此,必须用针对这些标志物的FMO修改设门策略,其中针对对这些标志物的表达呈阳性的MNC来重新计算FMO。培养的MSC在紫色通道中还具有比原始PBMC更高的自体荧光,这导致某些MSC对于CD45显现为假阳性,由此在设门步骤3中将其排除。这导致了鉴定率的略微降低。
结论
MSC在体内是稀有细胞群体,而MFC使得能够对MSC进行鉴定和研究。举例而言,将MSC以低浓度(1%至10%)与HSF混合和与PBMC混合,并且可以利用该试剂组对它们进行检测。成纤维细胞的表面标志物表达与MSC类似[25],且其存在于许多相同组织中。成纤维细胞是几种组织中的常见细胞类型。据显示它们共享ISCT标志物[25],并分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞[26]。因此,在从原生组织中分离出纯MSC起始原料很重要时,例如用于临床应用时,理想的是能够将这两种细胞类型进行区分。在本研究中,所用的人皮肤成纤维细胞系是CD90阴性的,这使得能基于该标志物来进行细胞分离。然而,由于已显示原生成纤维细胞为CD90+,因此可以使用占位物,其利用成纤维细胞的上述阳性标志物(例如,CD10、CD29和CD106)来更好地区分成纤维细胞[25]。
PBMC主要由淋巴细胞和单核细胞组成,将MSC与这些细胞混合距离鉴定骨髓、血液和其它复杂组织样品中的MSC又近了一步。由于所述组可以用于检测这种异质样品中的MSC,其可以用于对各种疾病状态下的循环MSC的研究进行再评估,所述研究已进行过3-4色分析和/或尚未包括ISCT标志物[27-31]。通过利用定量珠的直接单平台方法,或通过间接地利用双平台方法(该方法将组数据与用于CD34+细胞定量的自动化血液学白细胞计数相结合),可以使用所述试剂组来定量MSC/μl样品。该试剂组因而可以用于以标准化方式评估非骨髓MSC来源。
如在本研究中用两种CD29缀合物时所见(图4),不同的克隆和缀合物可产生极为不同的强度信号。重要的是鉴定出对于预期研究具有最佳性能的抗体,因为性能可能会变化[32]。亮组和暗组并未影响所述7色核心组的性能。当出于其它目的对该组进行改良时,应将细胞用7色核心组染色、单独用每种额外的占位抗体(或功能性染料)染色、然后用其组合染色,以确保该添加不会影响核心组的结果。
测定来自细胞的信号的能力方面的不准确性与由光子计数统计学产生的误差有关,该误差可能导致群体扩散,在该群体中,即使用常规方式进行了统计学补偿的数据也可能产生可能显现为阳性的假数据事件。这种『扩散误差』在用远红色染料(例如,用于检测本试剂组中的CD14的APC-eFluor780)时最为显著。因此,在使用本试剂组时,重要的是使用对数轴来显示数据以调节这种扩散,并使用CD14-FMO来设定阈值。扩散误差也可以通过使用利用自助算法形成的聚合分类和回归树模型来补偿,所述模型包括许多不同树的组合,每个模型在从原始样品中抽取的一系列自助样品中进行估算,此处,基于平均预测的有利交叉自助树和多数票决标准(其包括:大多数自助树是否预测为有利且高于预定阈值水平)的组合,使用筛选决定来计算MSC细胞的表型。
综上,本申请中提出的创新性10色试剂组和算法由统计学模型化程序和7种ISCT核心组标志物构成,且可以进而包括至多3个根据需要来占据的占位位置,其可以用于对骨髓和脐带MSC进行表型分型。这为研究者在MSC研究的任何方面提供了灵活的流式细胞术工具,以对MSC及其亚型与功能性细胞染料的组合进行研究,从而在逐细胞的基础上对诸如凋亡、细胞周期分析和增殖等事件进行可视化。
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表
表1
对于每个单核细胞标志物(CD11b和CD14)和每个B细胞标志物(CD19和CD79α)的抗体缀合物的数目的评估。研究于2012年7月进行。第13位供应商ImmuQuest没有任何可利用的合适产品。
表2.FACSAriaI滤波器配置
Claims (30)
1.一种鉴定细胞群体中的间充质干细胞(MSC)的方法,该方法包括:利用荧光活化细胞分选(FACS)同时鉴定所述群体中的在其表面展示出可检测水平的CD73、CD90和CD105而不展示可检测水平的CD14、CD19、CD34和CD45的细胞,并由此鉴定出细胞群体中的间充质干细胞(MSC)。
2.一种鉴定细胞群体中的特定细胞类型的方法,该方法包括:利用FACS同时鉴定在所述群体中的细胞的表面上是否存在七种以上的指示所述特定细胞类型的细胞表面标志物。
3.如权利要求2所述的方法,其中,所述方法包括:鉴定在所述群体中的细胞表面上是否存在十种以上的指示所述特定细胞类型的细胞表面标志物。
4.如权利要求2或3所述的方法,其中,所述特定细胞类型是间充质干细胞(MSC),其中所述方法包括同时鉴定是否存在CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34和CD45,且其中细胞表面上存在可检测水平的CD73、CD90和CD105且不存在可检测水平的CD14、CD19、CD34和CD45指示该细胞为MSC。
5.如权利要求4所述的方法,其中,所述方法还包括鉴定是否存在可检测水平的CD181和CD184,且其中细胞表面上存在可检测水平的CD181和CD184指示该细胞为MSC的特定亚型。
6.如权利要求2或3所述的方法,其中所述特定细胞类型是中胚层谱系祖细胞,其中所述方法包括鉴定是否存在CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271、CD14、CD34和CD45,且其中细胞表面上存在可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD271且不存在可检测水平的CD14、CD34和CD45指示该细胞为中胚层谱系祖细胞。
7.如权利要求6所述的方法,其中所述方法还包括鉴定是否存在1型C-X-C趋化因子受体(CXCR1)、CXCR2或CXCR4,且其中细胞表面上存在可检测水平的CXCR1、CXCR2或CXCR4指示该细胞能够迁移至患者中的特定受损组织。
8.如权利要求7所述的方法,其中细胞表面上存在可检测水平的CXCR4指示该细胞能够迁移至患者中的受损的心肌组织、肾组织或骨组织。
9.如权利要求2或3所述的方法,其中所述特定细胞类型是成纤维细胞,其中所述方法包括特别鉴定是否存在CD10、CD29和CD106,且其中细胞表面上存在可检测水平的CD10、CD29和CD106指示该细胞为成纤维细胞。
10.如权利要求2或3所述的方法,其中所述特定细胞类型是极小胚胎/外胚层样干细胞(VSEL),其中所述方法包括鉴定是否存在可检测水平的Sca-1、CD45R、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b、Ter119和Oct-4,且其中细胞表面上存在可检测水平的Sca-1、CD45R、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b、Ter119和Oct-4指示该细胞为VSEL。
11.如权利要求2或3所述的方法,其中所述特定细胞类型是造血干细胞(HSC),其中所述方法包括特别鉴定是否存在可检测水平的CD133,且其中细胞表面上存在可检测水平的CD133指示该细胞为HSC。
12.如权利要求2或3所述的方法,其中所述特定细胞类型是内皮祖细胞(EPC),其中所述方法包括特别鉴定是否存在可检测水平的KDR、VE-钙粘蛋白和CD31,且其中细胞表面上存在可检测水平的KDR、VE-钙粘蛋白和CD31指示该细胞为EPC。
13.如权利要求2或3所述的方法,其中所述特定细胞类型是组织定向干细胞,其中所述方法包括特别鉴定是否存在可检测水平的CD117+、CD184、c-met和AC133,且其中细胞表面上存在可检测水平的CD117+、CD184、c-met和AC133指示该细胞为组织定向干细胞。
14.一种用于鉴定细胞群体中的间充质干细胞(MSC)的试剂盒,该试剂盒包括七种以上带荧光标记的抗体,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34和CD45中的每一种特异性结合。
15.一种用于鉴定细胞群体中的特定细胞类型的试剂盒,该试剂盒包括七种以上带荧光标记的抗体,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与指示所述特定细胞类型的七种以上细胞表面标志物中的一种特异性结合。
16.如权利要求15所述的试剂盒,其中该试剂盒包括十种以上带荧光标记的抗体,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与指示所述特定细胞类型的十种以上细胞表面标志物中的一种特异性结合。
17.如权利要求15或16所述的试剂盒,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34和CD45中的每一种特异性结合。
18.如权利要求17所述的试剂盒,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与CD181和CD184的每一种特异性结合。
19.如权利要求15或16所述的试剂盒,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD271、CD14、CD34和CD45中的每一种特异性结合。
20.如权利要求19所述的试剂盒,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与1型C-X-C趋化因子受体(CXCR1)、CXCR2和CXCR4中的每一种特异性结合。
21.如权利要求15或16所述的试剂盒,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与CD10、CD29和CD106中的每一种特异性结合。
22.如权利要求15或16所述的试剂盒,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与Sca-1、CD45R、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b、Ter119和Oct-4中的每一种特异性结合。
23.如权利要求15或16所述的试剂盒,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与CD133特异性结合。
24.如权利要求15或16所述的试剂盒,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与KDR、VE-钙粘蛋白和CD31中的每一种特异性结合。
25.如权利要求15或16所述的试剂盒,其中所述试剂盒中的至少一种抗体与CD117+、CD184、c-met和AC133中的每一种特异性结合。
26.一种试剂或物质组合物,其用于借助于FAC试剂的活性成分的相对特定浓度来鉴定细胞群体中的间充质干细胞(MSC),所述鉴定包括利用荧光活化细胞分析(FACS)同时鉴定所述群体中的在其表面上展示出可检测水平的CD73、CD90和CD105且不展示可检测水平的CD14、CD19、CD34和CD45的细胞,并由此鉴定细胞群体中的间充质干细胞(MSC)。
27.一种试剂或物质组合物,用于借助于FAC试剂的活性成分的相对特定浓度来鉴定细胞群体中的特定细胞类型,所述鉴定包括利用FACS同时鉴定在所述群体中的细胞表面上是否存在指示所述特定细胞类型的七种以上细胞表面标志物。
28.一种产生荧光标记抗体组的方法,所述荧光标记抗体组用于利用FACS分析来同时鉴定是否存在七种以上细胞表面标志物,所述方法包括:(a)选择七种以上细胞表面标志物;(b)将阳性标志物分散在不同的激光器上;(c)选择七种以上的带荧光标记的抗体;(d)滴定所述抗体以确保在已知所述七种以上标志物的表达(阳性和阴性)的细胞上实现最佳浓度和最小的光谱重叠;(e)测试针对阳性细胞表面标志物的抗体;(f)测试抗体核心组;(g)诱导或刺激细胞以表达占位标志物;(h)测试并滴定占位抗体;(i)优化占位条件;和(j)在不存在其它细胞类型时和在混合的群体中在细胞上对完整的组进行测试。
29.利用权利要求28所述的方法产生的荧光标记抗体组,所述荧光标记抗体组用于利用FACS分析同时鉴定是否存在七种以上的细胞表面标志物。
30.一种鉴定细胞群体中的新型细胞类型的方法,所述方法包括利用FACS同时鉴定在所述群体中的细胞的表面上是否存在七种以上细胞表面标志物,其中所述七种以上标志物中的至少一些指示特定细胞类型,并且所述七种以上标志物中的至少一种未被所述特定细胞类型可检测地表达。
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