CN106771205A - 十色抗体组合物及其在白血病淋巴瘤分型中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗体技术领域，提供了一种抗体组合物，由十种抗体组成，包括抗CD71抗体、抗CD7抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体、抗CD19抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体、抗CD10抗体、抗HLA‑DR抗体和抗CD45抗体。本发明提供了包含以上抗体的白血病淋巴瘤初筛试剂盒及其应用等。

Description

十色抗体组合物及其在白血病淋巴瘤分型中的应用
技术领域
本发明属于抗体技术领域，具体而言，本发明涉及一种十色的抗体组合物及其在白血病和淋巴瘤分型中的应用及分型试剂盒等。
背景技术
白血病、淋巴瘤等血液肿瘤近年已经上升为最威胁人类健康的几大疾病之一。白血病的免疫分型在疾病的诊断中占有非常重要的地位。通过流式细胞术对白血病淋巴瘤等进行免疫分型，是血液肿瘤诊断的重要手段之一。我公司专利CN 105606797 B中公开了一种四色流式抗体组合物及其在白血病淋巴瘤分型中的应用，其包含了7种荧光标记的单克隆抗体，尽管利用较少的抗体对多方面的白血病进行了较全面的检测，但是需要使用两次上样。专利CN 103675277 A公开了一种流式细胞术鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病的荧光探针及试剂盒，包含四种荧光抗体GD2-FITC、CD90-PE、CD45-PerCP、CD56-APC。我们检索到的最多种抗体组合物出现在专利CN 103018463 A中，其公开了一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，包含七种单克隆抗体CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19、CD45。
大量抗体的组合使用，除了需避免互相之间的干扰，还需要高效地进行白血病/淋巴瘤细胞检测。目前尚未发现有“单管十色”组合(十种抗体组合)的白血病/淋巴瘤检测及其试剂盒。然而，本发明人没有在前人无法突破的困难面前退缩，根据十余年临床实践和研究的经验，令人意外地筛选出10种抗体的组合，只需要一次上样，就可有效进行多种血液肿瘤的免疫分型(特别是初筛)，而且节约了成本、操作更趋简单、快速，尤其是能区分多种相近的肿瘤(或发展阶段)，并可实现MDS流式积分的计算。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供新的抗体组合物及包括它们的试剂盒，用于进行白血病和淋巴瘤分型。另外，本发明还提供了使用它们进行白血病和淋巴瘤分型的方法和应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了抗体组合物，其包括抗CD71抗体、抗CD7抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体、抗CD19抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体、抗CD10抗体、抗HLA-DR抗体和抗CD45抗体。
优选本发明第一方面的抗体组合物由抗CD71抗体、抗CD7抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体、抗CD19抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体、抗CD10抗体、抗HLA-DR抗体、抗CD45抗体组成。
抗体(优选是单克隆抗体)组合物，其包括抗CD71抗体、抗CD7抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体、抗CD19抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体、抗CD10抗体、抗HLA-DR抗体和抗CD45抗体，优选其由抗CD71抗体、抗CD7抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体、抗CD19抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体、抗CD10抗体、抗HLA-DR抗体和抗CD45抗体组成。
在本文中，抗体本身是本领域技术人员所熟知的，其特异结合(抗)相应抗原。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，在本发明的具体实施方式中，优选是单克隆抗体。抗体可以是鼠源的，也可以是人源的。在本文中，如没有相反的指示，各抗体的抗原，即各细胞表面抗原(CD71、CD7、CD13、CD33、CD19、CD117、CD34、CD10、HLA-DR和CD45)，均为人细胞表面抗原。
更优选本发明第一方面的抗体组合物中的每种抗体被标记不同(即检测波长不同)的荧光标记，优选每种抗体分别被标记的荧光标记选自包括但不限于以下荧光标记：FITC、AlexaFluor 488、PE、ECD、PerCP、PerCP-cy5.5、PerCP-cy7、APC、AlexaFluor647、Alexa Fluor 680or 700、APC-Alexa Fluor700、APC-Alexa Fluor750、APC-cy7、APC-H7、PacificBlue、Horizon V450、AmCyan、PacificOrange、KromeOrange、Brilliant Violet421(BV421)、Brilliant Violet 510(BV510)、Brilliant Violet 570(BV570)、BrilliantViolet 605(BV605)、Brilliant Violet 650(BV650)、Brilliant Violet 711(BV711)、Brilliant Violet 785(BV785)等。这些荧光标记、甚至是连接了荧光标记的抗体通常是可通过商业渠道获得，例如，AlexaFluor系列可购自Invitrogen,Inc.，Brilliant Violet系列可购自Sirigen Group Ltd.，ECD和KromeOrage可购自Beckman Coulter，APC-H7和Horizon可购自BD Biosciences。
通过十色流式细胞仪，本发明第一方面的抗体组合物单管单次上机即可检测出抗CD71抗体、抗CD7抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体、抗CD19抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体、抗CD10抗体、抗HLA-DR抗体、抗CD45抗体的结果。
在第二方面，本发明提供了用于白血病和淋巴瘤分型的试剂盒，其包括第一容器，其中，第一容器包括本发明第一方面的抗体组合物。本发明第二方面的试剂盒采用包括抗CD71抗体在内的10种抗体，互相之间没有产生干扰，只需要一次上样，就可有效进行多种血液肿瘤的免疫分型(特别是初筛)，尤其是能区分多种相近的肿瘤(或发展阶段)，并可实现MDS流式积分的计算，在血液肿瘤免疫分型中应用前景广阔。
本发明第二方面的试剂盒还可以包括其他参与进行白血病和淋巴瘤分型的试剂和设备。优选本发明第二方面的试剂盒还包括第二容器，其中，第二容器包括红细胞裂解液(如，10×红细胞裂解液)。本发明第二方面的试剂盒中还可以包括缓冲液(如，磷酸盐缓冲液)、与流式细胞仪配套使用的流式管、细胞计数板、涡旋振荡器、移液器、离心机等，尤其是流式管、细胞计数板等耗材。
在本文中，第一容器和第二容器中的标号仅仅为表示不同容器，并不对容器本身的材质、形状构成限制，只要容器能容纳并保存本发明的抗体组合物即可。容器可以是管、瓶，其材质可以是塑料或玻璃。其中，装有本发明第一方面的抗体组合物的第一容器优选能避光。
另外，本发明第三方面的试剂盒还可以包括知道进行白血病和淋巴瘤分型的说明书或手册。
第三方面，本发明提供了本发明第一方面的抗体组合物在制备白血病和淋巴瘤分型的试剂盒中的应用。
优选在本发明第三方面的应用中，试剂盒是本发明第二方面的试剂盒。
还优选在本发明第三方面的应用中，白血病和淋巴瘤包括MDS转化的急性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病M3、骨髓增生异常综合征(MDS)、正常骨髓伴反应性B细胞增生、急性髓细胞白血病M5型、边缘区淋巴瘤(MZL)和Castleman病。
也优选在本发明第三方面的应用中，白血病和淋巴瘤分型的方法包括：
(1)处理骨髓或外周血样品，使呈单个细胞悬液状态；
(2)将步骤(1)处理的样品与本发明第一方面的抗体组合物混合加入流式管，混匀后孵育15分钟；
(3)向步骤(2)孵育的流式管中加入红细胞裂解液，混匀后孵育10分钟，500×g离心5分钟，去上清并重悬；和
(4)流式细胞仪检测步骤(3)得到的流式管，并计算结果。
由于是对已经诊断出白血病和淋巴瘤的病人样品进行分型，不再出具有诊断信息的结果(如果混有健康人的样品，反而干扰分型的准确性)，而且也没有样品的获取步骤，甚至可以是使用教学用样品来进行教授白血病和淋巴瘤分型的方法，因此上述方法可以是非诊断的免疫分型方法。优选上述方法是非诊断方法。
更优选在本发明第三方面的应用中，计算结果是计算抗以下细胞表面抗原的抗体对的荧光结果表达强度：CD117vs HLA-DR，CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD19vsCD34，CD34vs CD10，CD19vs HLA-DR，CD71vs CD117，CD19vs CD10，CD34vs CD117，CD7vsCD13，CD45vs CD34，CD19vs CD33，和/或CD19vs CD117。在本文中，如无相反指示，检测均是以CD45vs SSC(即CD45/SSC)设门。
进一步优选在本发明第三方面的应用中，对以下所述疾病计算抗以下所述细胞表面抗原的抗体对的荧光表达情况，包括但不限于以下组合：
(1)MDS转化的急性髓细胞白血病：CD117vs HLA-DR，CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD34vs CD10，和CD19vs HLA-DR；
(2)急性髓细胞白血病M3：CD7vs CD34，CD71vs CD117，CD33vs CD13，CD19vsCD34，CD19vs CD10，CD34vs CD117，和CD117vs HLA-DR；
(3)骨髓增生异常综合征：CD7vs CD13，CD71vs CD117，CD33vs CD13，CD19vsCD34，CD19vs CD10，CD34vs CD117，CD117vs HLA-DR，CD45vs CD34，和CD19vs CD33；
(4)正常骨髓伴反应性B细胞增生：CD7vs CD13，CD71vsCD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD19vs CD10，CD34vs CD117，和CD117vs HLA-DR；
(5)急性髓细胞白血病M5型：CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD19vsCD34，CD34vs CD10，CD19vs CD117，和CD117vs HLA-DR；
(6)边缘区淋巴瘤：CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD10vs CD34，CD34vsCD117，和CD117vs HLA-DR；和/或，
(7)Castleman病：CD7vs CD34，CD71vs CD 117，CD10vs CD19，CD33vs CD13，和CD117vs HLA-DR。
上述检测和计算可以单独针对其中的某一疾病进行，例如在仅在制备鉴定MDS转化的急性髓细胞白血病的试剂盒中的应用中，流式细胞仪检测流式管的以下抗原的抗体的荧光，并计算相应抗体对的荧光结果：CD117vs HLA-DR，CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vsCD13，CD19vs CD34，CD34vs CD10，和CD19vs HLA-DR。
本发明的有益效果在于：突破了现有技术的限制，只需要一次上样，就可有效进行多种血液肿瘤的免疫分型(特别是初筛)，而且节约了成本、操作更趋简单、快速，尤其是能区分多种相近的肿瘤(或发展阶段)，并可实现MDS流式积分的计算。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1显示了MDS转化的急性髓细胞白血病的检测图，其中原始髓系细胞群约占总数的13.38％(伴CD10dim)。
图2显示了急性髓细胞白血病M3型的检测图，其中异常幼稚粒细胞群约占总数的93.55％。
图3显示了骨髓增生异常综合征(MDS)的检测图，其中异常中性粒细胞群约占总数的38.16％(杆分为主，部分中晚幼)，CD33/CD13分化轨迹异常，伴CD19少量表达，流式MDS积分2分。
图4显示了(正常骨髓的)B细胞反应性增生的检测图，其中可见4类细胞，A群(中性粒细胞，中晚幼和杆分为主)约占总数的74.02％，B群(单核细胞)约占总数的5.01％，C群(淋巴细胞，T为主，少量B和NK)约占总数的5.27％，D群(早、中期B淋巴细胞)约占总数的6.28％。
图5显示了急性髓细胞白血病M5型的检测图，其中原始单核细胞群约占总数的63.87％，幼稚单核细胞群约占总数的19.31％。
图6显示了边缘区淋巴瘤(MZL)的检测图，其中异常B淋巴细胞群约占总数的49.51％。
图7显示了Castleman病的检测图，其中淋巴结组织的活细胞占总数50％以上，8.66％异常淋巴细胞的表型为CD7++CD34++CD71－CD117－CD19－CD10－CD33+HLA-DRdim。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《免疫检测技术》(科学出版社,北京,中国,1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的试剂原料均为市售品，可以通过公开渠道购买获得。
实施例1试剂的配制
本实施例使用抗体组合如下(其中的每种抗体以抗原和荧光标记连字命名)：CD71-FITC、CD7-PE、CD13-ECD、CD33-PerCP-cy5.5(简称为CD33 PC5.5)、CD19-PerCP-cy7(简称为CD19PC7)、CD117-APC、CD34-APC-Alexa Fluor700(简称为CD34 APC-A700)、CD10-APC-Alexa Fluor750(简称为CD10 APC-A750)、HLA-DR-BV421、CD45-KromeOrange(简称为CD45KO)，这些抗体均可直接通过公开渠道购买获得，本发明实施例的抗体均从上海达科为生物技术有限公司购买。
对以上单克隆抗体分别取样，梯度稀释，分别在流式细胞仪上检测，通过滴定确定每种抗体最佳用量，具体用量如下表所示。
取以上十种定量抗体试剂直接混合装于同一个容器(第一容器)内，任选再配以10×红细胞裂解液装于第二容器内，即构成本发明的试剂盒。其中，10×红细胞裂解液的配制方法如下：称取80.2gNH4Cl，8.4gNaHCO3和3.7g EDTA-2Na，加水至900ml，混匀，调节pH至7.4，加水至1L。
实施例2样品的处理
取肝素或EDTA抗凝的骨髓或外周血样本，调整至细胞密度为1～5×106/ml，然后通过200目工业筛网过滤，去除样本中团块样物质，保证单个细胞悬液状态，保存于2～8℃，即为处理好的标本。
实施例3样品的检测
取流式管，加入实施例1试剂盒中的抗体混合物。再取50μl实施例2处理好的标本，涡旋振荡器震荡混匀，室温(25℃)避光孵育15分钟。
用1×PBS缓冲液将10×红细胞裂解液稀释成1×红细胞裂解液，然后向孵育后的上述流式管加入稀释后的1×红细胞裂解液2ml，用涡旋振荡器震荡混匀，室温(25℃)避光静置10分钟。
将流式管以1500rpm离心5分钟，弃去上清，加入200μl 1×PBS重悬。样品处理完毕，上流式细胞仪进行检测，以荧光标记的十色波长检测。
大量不同来源的已知血液肿瘤的样品进行检测，以CD45vs SSC设门，考察各种疾病的检测结果，其能特异性表征相应疾病的检测结果如图1-7所示。通过一次上样即可检测区分出MDS转化的急性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病M3型、骨髓增生异常综合征(MDS)、(正常骨髓的)B细胞反应性增生、急性髓细胞白血病M5型、边缘区淋巴瘤(MZL)和Castleman病，尤其是能显著区分出MDS、MDS转化的急性髓细胞白血病和(正常骨髓的)B细胞反应性增生等，同时可实现MDS流式积分的计算。

Claims (10)

1.抗体(优选是单克隆抗体)组合物，其包括抗CD71抗体、抗CD7抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体、抗CD19抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体、抗CD10抗体、抗HLA-DR抗体和抗CD45抗体，优选其由抗CD71抗体、抗CD7抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体、抗CD19抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体、抗CD10抗体、抗HLA-DR抗体和抗CD45抗体组成。
2.权利要求1所述的抗体组合物，其中每种抗体被标记不同的荧光标记，优选荧光标记选自FITC、AlexaFluor 488、PE、ECD、PerCP、PerCP-cy5.5、PerCP-cy7、APC、AlexaFluor647、Alexa Fluor 680 or 700、APC-Alexa Fluor700、APC-Alexa Fluor750、APC-cy7、APC-H7、PacificBlue、Horizon V450、AmCyan、PacificOrange、KromeOrange、Brilliant Violet421(BV421)、Brilliant Violet 510(BV510)、Brilliant Violet 570(BV570)、BrilliantViolet 605(BV605)、Brilliant Violet 650(BV650)、Brilliant Violet 711(BV711)和Brilliant Violet 785(BV785)。
3.用于白血病和淋巴瘤分型的试剂盒，其包括第一容器，其中，第一容器包括权利要求1或2所述的抗体组合物。
4.权利要求3所述的试剂盒，其还包括第二容器，其中，第二容器包括红细胞裂解液(如，10×红细胞裂解液)。
5.权利要求1或2所述的抗体组合物在制备白血病和淋巴瘤分型的试剂盒中的应用。
6.权利要求5所述的应用，其中，试剂盒是权利要求3或4所述的试剂盒。
7.权利要求5所述的应用，其中，白血病和淋巴瘤包括MDS转化的急性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病M3、骨髓增生异常综合征(MDS)、正常骨髓伴反应性B细胞增生、急性髓细胞白血病M5型、边缘区淋巴瘤(MZL)和Castleman10病。
8.权利要求5所述的应用，其中白血病和淋巴瘤分型的方法包括：
(1)处理骨髓或外周血样品，使呈单个细胞悬液状态；
(2)将步骤(1)处理的样品与权利要求1或2所述的抗体组合物混合加入流式管，混匀后孵育15分钟；
(3)向步骤(2)孵育的流式管中加入红细胞裂解液，混匀后孵育10分钟，500×g离心5分钟，去上清并重悬；和
(4)流式细胞仪检测步骤(3)得到的流式管，并计算结果。
9.权利要求8所述的应用，其中，计算结果是计算抗以下细胞表面抗原的抗体对的荧光表达结果：CD117vs HLA-DR，CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD34vsCD10，CD19vs HLA-DR，CD71vs CD117，CD19vs CD10，CD34vs CD117，CD7vs CD13，CD45vsCD34，CD19vs CD33，和/或CD19vs CD117。
10.权利要求9所述的应用，其中，对以下所述疾病计算抗以下所述细胞表面抗原的抗体对的荧光表达结果：
(1)MDS转化的急性髓细胞白血病：CD117vs HLA-DR，CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vsCD13，CD19vs CD34，CD34vs CD10，和CD19vs HLA-DR；
(2)急性髓细胞白血病M3：CD7vs CD34，CD71vs CD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD19vs CD10，CD34vs CD117，和CD117vs HLA-DR；
(3)骨髓增生异常综合征：CD7vs CD13，CD71vs CD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD19vs CD10，CD34vs CD117，CD117vs HLA-DR，CD45vs CD34，和CD19vs CD33；
(4)正常骨髓伴反应性B细胞增生：CD7vs CD13，CD71vsCD117，CD33vs CD13，CD19vsCD34，CD19vs CD10，CD34vs CD117，和CD117vs HLA-DR；
(5)急性髓细胞白血病M5型：CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD34vs CD10，CD19vs CD117，和CD117vs HLA-DR；
(6)边缘区淋巴瘤：CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD10vs CD34，CD34vsCD117，和CD117vs HLA-DR；和/或，
(7)Castleman病：CD7vs CD34，CD71vs CD117，CD10vs CD19，CD33vs CD13，和CD117vsHLA-DR。
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