CN103018463A - 检测急性b淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，与七色流式细胞仪组成白血病相关免疫表型分类装备，该试剂盒中配置了下述单克隆抗体试剂组合：CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45，依前后顺序分别标准荧光素为：FITC、PE、PerCP-CY5,5、PE-CY7、APC、APC-Cy7和PacificBlue。采用本发明的试剂盒可以同时观察7个标志是否存在异常，增加了检测的灵敏度和准确性；而且可以不依赖于发病时的免疫表型资料，扩大了LAIP分析的范围和能力，简化了分析的前期条件，为临床检测MRD提供了更多的机会。

Description

检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒及其应用

技术领域

    本发明属于细胞表型确认过程中的专用试剂盒，具体涉及一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒及其应用。

背景技术

随着治疗策略的改进和新的化疗药物不断出现，急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）的缓解率和生存率有了很大的提高，但是仍有一部分患者预后较差，最终死于复发。复发后即使采用强化疗、甚至造血干细胞移植，仍然难以挽回患者的生命，给社会和家庭都造成了极其沉重的精神和经济负担。研究证明，治疗后微量残留病（MRD）的水平是复发的根源。

多参数流式细胞术（flow cytometry， FCM）是MRD检测的常用方法之一，该方法是根据患者发病时的免疫标志，确定该患者白血病细胞的特异性标志，亦称为白血病相关免疫表型（LAIP），通过对LAIP的识别来检测MRD。

目前，国内外的文献主要采用三色或四色的抗体组合来检测LAIP，不同的研究机构采用不同的抗体组合，抗体选择多样化、分析时设门的方法也不一致。例如，欧洲主要报道了5组三色的抗体组合，共应用15个抗体；美国St.jude儿童研究医院则利用多组四色抗体组合。

为了提高检测的灵敏度，三色FCM或四色FCM常常需要多组抗体组合，每组抗体组合中均有相同的抗体，这样一方面增加了抗体总数目，进而增加了试验成本和患者的经济负担；另一方面多组抗体组合需要在多管中分别检测，影响了对检测抗体的多参数分析：在分析LAIP时，有时需要多个标志设门来限定一群细胞，例如第一管抗体组合中发现一群可疑LAIP阳性细胞，表型为CD45⁺CD19⁺CD10⁺CD34^-，但此群细胞数较低（＜10^-4），此时往往需要观察此群细胞中其他抗原是否表达异常，以确定是否存在LAIP；但四色组合无法同时检测第4种以外的抗体，从而影响了检测的准确性；若要观察此群细胞的第五种或其他的抗原表达是否有异常，利用四色FCM则无法完成。为了提高LAIP检测的灵敏度，需要能够同时检测多个荧光参数的FCM、以及设计合适的更多荧光参数的抗体组合。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒及其应用，所述试剂盒采用七种荧光标记的抗体组合，利用该剂盒、并借助七色流式细胞仪的辅助，可快速准确地分析LAIP的种类、性质及判断LAIP阳性细胞水平，对预后判断和临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：

一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，与七色流式细胞仪组成白血病相关免疫表型分类装备，该试剂盒中配置了下述单克隆抗体试剂组合：CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45。

优选的，所述单克隆抗体试剂组合CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45依前后排列顺序依次进行特异性荧光素标记为：FITC、PE、Percp-CY5.5、PE-CY7、APC、APC-Cy7和Pacific Blue。

本发明还提供了上述试剂盒在制备检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的产品中的应用。

借助于上述的试剂盒和七色流式细胞仪对急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型进行分析的方法，包括下述步骤：

步骤一、试剂配制

1.1、配制pH为7.2~7.4的10×PBS缓冲液，并稀释10倍成为1×PBS缓冲液，

1.2、取溶红细胞液，并用1×PBS缓冲液稀释10倍，

1.3、取小牛血清加入至1×PBS缓冲液中，制备含0.5wt.%~2wt.%血清的PBS；

步骤二、对骨髓标本进行荧光标记，制备测试标本

2.1在同一专用试管中，依次分别加入荧光标记的单克隆抗体如下：3μLCD58-FITC、10μLCD10-PE、1μL CD34-PerCP-CY5.5、1μLCD123-PE-CY7、2μL CD38-APC、5μL CD19-APC-Cy7和1.3μL CD45-Pacific Blue，然后再加入100μL骨髓标本，混匀，室温避光放置15分钟孵育，

2.2、加入步骤1.2中稀释后的溶红细胞液2mL，混匀后避光，室温放置 8分钟，溶解红细胞，

2.3、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.3中2mL含0.5wt.%~2wt.%血清的PBS，混匀，

2.4、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.1中0.3mL1× PBS缓冲液，混匀，制成待测标本；

步骤三、按照七色流式细胞仪的操作要求对待测标本进行处理后检测，获得特异性荧光标记的骨髓细胞数据，用MACSQuant分析软件、在SSC/CD19和CD45/CD19双参数点图中对CD19⁺细胞进行连续两次设门，并进一步在CD19⁺细胞中对CD19⁺CD38^强+的浆细胞设门以去除浆细胞，最终的CD19⁺B细胞为待测的细胞，并与正常骨髓细胞CD19⁺B祖细胞表型进行比较。

采用上述试剂盒、并借助七色流式细胞仪分析B细胞来源急性白血病治疗前和治疗后肝素抗凝骨髓细胞中，是否具有LAIP细胞、LAIP细胞的表型及LAIP细胞的数量。该分析基于下列患者：（1）初诊B-ALL的患者 294例；（2）慢性髓细胞白血病（Chronic myelocytic leukemia，CML）-B细胞急性变患者20例；（3）复发的B-ALL患者70例（20例无发病免疫表型结果）；（4）治疗后MRD⁺患者146例。其中LAIP的表现包括：CD45和CD38的弱表达或不表达；CD10的强表达；及在CD34⁺TdT⁺CD10⁺分化阶段时不表达CD10； CD19、CD34、CD123、CD58强表达。结果表明：294例初诊B-ALL患者、20例CML-B细胞急性变、70例复发B-ALL患者中，LAIP阳性率占99.22%、其中92.2%患者的LAIP表现为两种抗原的表达异常。上述结果表明：采用本发明的试剂盒对LAIP的检测具有较高的敏感性和特异性。在146例MRD⁺患者的328份标本中均存在LAIP⁺，LAIP的表型特征与治疗前的相似。充分证明本发明的试剂盒适用于99%以上初诊的及治疗后的B细胞来源的急性白血病患者LAIP表型的判断和分析，为临床检测MRD提供依据。

采用上述技术方案产生的有益效果在于：（1）本发明的试剂盒首次采用7种标记有不同荧光素的抗体组合，能够同时分析7个抗原的特点，经过大量的临床验证证明，在B细胞来源的急性淋巴细胞白血病中LIAP的阳性率达到99%以上，可快速、准确地检测初诊为B-ALL患者、CML-B细胞急性变、复发B-ALL患者和MRD⁺患者骨髓中LAIP细胞，为B淋巴细胞白血病LAIP分析提供了一种可靠的、新的荧光标记的单克隆抗体组合；（2）本发明采用较少的抗体、能够检出较多的LAIP细胞，降低了试验成本和患者的经济负担，而且单管中抗体的种类增多、增加了检测的灵敏度和准确性；（3）采用本发明的试剂盒可以不依赖于发病时的免疫表型资料，扩大了LAIP分析的范围和能力，简化了分析的前期条件，为临床检测MRD提供了更多的机会；（4）利用本试剂盒中的一组抗体组合，利于LAIP分析的标准化和规范化。

附图说明

图1是正常骨髓B组细胞表型示例图；

图2~图4分别列举了B-ALL治疗后标本中LAIP⁺细胞的三种示例图；

具体实施方式

 本发明提供了一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，其包括下列荧光标记的单克隆抗体组合：CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45，依前后顺序分别依次对应下列荧光标记：FITC、PE、PerCP-CY5,5、PE-CY7、APC、APC-Cy7和Pacific Blue。各单克隆抗体的荧光标记及成分等信息参见表1。

                  表1  流式单克隆抗体信息

名称	荧光标记	成分	克隆	产品目录号	公司
						CD58	FITC	Mouse IgG2a	AICD58	IM1218	BECKMAN COULTER
CD10	PE	Mouse IgG1	HI10a	无	天津协和干细胞
						CD34	Percp-CY5.5	Mouse IgG1	581	343522	Biolegend
CD123	PE-CY7	Mouse IgG1	6H6	306010	Biolegend
						CD38	APC	Mouse IgG1	HB7	345807	BD
CD19	APC-Cy7	Mouse IgG1	HIB19	302218	Biolegend
						CD45	Pacific Blue	Mouse IgG1	HI30	304029	Biolegend

所述试剂盒中还包括红细胞溶解液和pH 为7.2~7.4的10×PBS缓冲液。所述试剂盒中还设置了配套计量的小牛血清试剂。

采用本发明的试剂盒进行B细胞来源-ALL患者骨髓LAIP细胞表型测定的步骤如下：

步骤一、试剂的制备

1、将pH 为7.2~7.4的10×PBS缓冲溶液稀释为1×PBS备用。

所述10×PBS缓冲液的配制方法：

Na₂HPO₄ ^.12H₂O   26.3g

NaH₂PO₄ ^.2H₂O     3.0g

NaCl            85.0g

加蒸馏水至1000mL，常温保存。

2、将红细胞溶解液用1×PBS缓冲液稀释10倍，备用。

3、在1×PBS缓冲液中加入小牛血清，制备0.5%~2%血清的PBS，于0.1%NaN₃，4°C保存。

步骤二、标本的制备

1、取洁净的流式细胞仪的专用试管，在同一试管中分别加入3μL的 CD58-FITC、10μL的 CD10-PE、1μL的 CD34-PerCP-CY5.5、1μL的 CD123 -PE-CY7、2μL的 CD38-APC、5μL的 CD19-APC-Cy7和1.3μL的 CD45-Pacific Blue，再加入100μL骨髓标本（应含有不少于2×10⁶个白细胞），轻轻混匀，室温（环境温度保持在22℃左右）避光放置15分钟孵育。

2、加入步骤一中用1×PBS稀释后的溶红细胞液2mL，混匀后避光，室温放置 8分钟，溶解红细胞。

3、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤一中2mL含0.5%~2%血清的PBS，混匀。

4、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入0.3mL1×PBS缓冲液、混匀，制成待测试样。

步骤三、采用流式细胞仪进行检测

按照流式细胞仪的操作规程，对步骤二中制备的待测标本进行测试。并用MACSQuant分析软件（德国Miltenyi Biotec公司）进行数据分析。采用二维点图形式进行结果分析：先建立FSC/SSC点图，将活细胞区域划为R1区，以排除死细胞和细胞碎片；采用两次对CD19⁺细胞设门方法，确定CD19⁺细胞。即首先在SSC/CD19点图中，设定CD19⁺SSC低的细胞，再将此群细胞显示在CD45/CD19点图中，第二次圈定CD19⁺细胞，进一步去除非特异性颗粒。然后对第二次圈定的CD19⁺细胞进行分析，分别建立CD45/CD10，CD45/CD34，CD10/CD34，CD123CD58， CD123/CD34点图，分析CD19⁺细胞中上述标志的表达强度及分布情况。在分析白血病患者前，首先需要检测正常骨髓中及治疗后MRD阴性患者骨髓中CD19⁺B祖细胞表型，以确定每个抗原在正常B祖细胞上的表达强度和分布情况。以此为基础，分析白血病患者LAIP及LAIP类型及LAIP⁺细胞的数量。如果检测的抗原出现在正常B祖细胞分布的区域外，并排除非特异性干扰，则认为是LAIP⁺。 

    图1是正常骨髓B祖细胞分析方法及表型。首先根据FSC和SSC设立活细胞门（P1），然后在SSC/CD19（一排左）和CD45/CD19图中（一排中），对CD19进行连续设门以确定CD19⁺细胞(P1P2P3),再根据CD10/CD38图，将CD38^强+CD10^-CD19⁺浆细胞去除（P4）后对CD19⁺B细胞进行进一步分析。其余图中显示的细胞均为CD19⁺B细胞。再根据CD45/CD10将CDD19⁺细胞分为4个不同分化阶段亚群。第一期为CD34⁺CD10^强+CD45^弱+CD38⁺细胞（P5），第二期为CD34^-CD10⁺CD45⁺CD38⁺细胞（P6），第三期为CD34^-CD10^弱/+CD45^强+CD38⁺细胞（P7），第四期为CD34^-CD10^弱/-CD45^强+CD38^+/-细胞（P8）。在全部CD19⁺细胞中，均不表达CD123和CD58。图中的P9-P15框为LAIP细胞经常出现的位置。

图2为B-ALL治疗后标本中存在LAIP⁺细胞的示例图中的一种。第2、3排图中显示P1P1P3门内CD19+B细胞，灰色为不同分化阶段CD19⁺正常B组细胞，黑色为LAIP⁺白血病细胞。其LAIP表型为CD45^-CD10^过强+CD38^-CD123⁺，CD34、CD58和CD19表型无异常。此患者同时存在4个抗原的表达异常。

图3也为B-ALL治疗后标本中存在LAIP⁺细胞的示例图中的一种。第2、3排图中显示P1P1P3门内CD19+B细胞，几乎均为异常的LAIP⁺白血病细胞（黑色）。其LAIP表型为CD45^-CD10^过强+CD34^强+CD38^-CD123⁺，CD58和CD19表型无异常。此患者同时存在5个抗原的表达异常。

图4也为B^-ALL治疗后标本中存在LAIP⁺细胞的一种示例图。第2、3排图中显示P1P1P3门内CD19+B细胞，黑色显示残留的正常CD19⁺ B细胞，均为第四阶段成熟B细胞，深灰色为LAIP⁺白血病细胞。其LAIP表型为CD34⁺细胞中出现CD45^强+CD10^-CD38^弱+CD123⁺CD19^强+，CD58表型无异常。此患者同时存在5个抗原的表达异常。

采用上述的检测方法以及分析方法，本实施例对2009年1月6日~2012年2月20日在北京大学人民医院、北京大学血液病研究进行免疫表型检测的急性B淋巴细胞白血病患者进行了LAIP分析，主要包括（1）初诊B-ALL 294例；（2）CML-B细胞急性变20例；（3）复发的B-ALL患者70例（20例无发病免疫表型结果）；（4）治疗后MRD⁺患者146例（在治疗后通过对558例患者3531份骨髓标本的连续监测，共发现146例患者的328份标本中存在LAIP⁺细胞），其中该146例患者中有76例在发病时未进行免疫分型检测或无法获得发病时免疫分型资料。≤14岁的儿童患者202例，≥15岁的成人患者282例，总体中位年龄19岁（0.1-78），具体情况参见表2。本研究已经通过北京大学人民医院伦理委员会审批，全部入组患者均签署了知情同意书。全部患者均在北京大学血液病研究所接受标准化诊断与治疗。

表2  530例患者的基本信息

	例数	男	女	≤14岁	≥15岁	中位年龄（范围）
							B-ALL	294	155	139	121	173	17（0.1-76）
CML	20	14	6	1	19	36.5(7-78）
							复发	70	41	29	24	46	18.5（4-78）
MRD+	146	84	62	56	90	19(1-70)
							总	530	294	236	202	282	19（0.1-78）

上表中，第一部分患者为初发的B-ALL患者；第二部分是由CML急变而来，第三部分患者为复发患者，第四部分为治疗后MRD⁺患者（这部分患者，是我们在治疗后通过对558例患者3531份骨髓标本的连续监测时发现的）。对上述四部分患者进行相关免疫表型的分析，结果发现LAIP的主要表现包括：CD45和CD38的弱表达或不表达；CD10的强表达；及在CD34⁺TdT⁺CD10⁺分化阶段时不表达CD10；CD19、CD34、CD123、CD58强表达；及在CD45^-时、不表达CD10或CD34。7个抗原的LAIP在四组患者中的发生率见表3。从表3可知：CD123强表达和CD10表达异常（强表达或CD34⁺/TDT⁺/CD45^-时不表达）的发生率在四组患者中均较高；而CD38弱表达在CML、复发及MRD⁺患者中发生率较高，在初治时较低；CD58强表达在初治、CML、及复发患者中发生率较高，在MRD⁺时稍低。

表3  530例B细胞来源急性白血病的LAIP表型分析结果

N表示例数。

通过对LAIP⁺患者的分析可知，对每一位患者可能同时出现几个抗原表达异常，为此，统计了384例患者（初诊B-ALL患者、CML-B细胞急性变和复发B-ALL患者）中LAIP的表现特征（参见表4），包括1个抗原表达异常、2个抗原表达异常及3个以上（包括3个）抗原表达异常的患者的比例。结果表明：在384例患者中，1个、2个和3个以上抗原表达异常的比例分别为7.03%、20.57%和71.61%；384例患者中只有3例没有检测到LAIP，占总体0.78%，即采用本发明的试剂盒可以适用99.22%的患者进行LAIP的分析。

表4    每例患者表现为LAIP的抗原数统计

N表示例数。

在146例MRD⁺患者中，出现1个、2个及3个以上（包括3个）抗原表达异常的患者的比例分别为6.16%、16.44%和77.40%。

表明：利用本实施例的试剂盒可以检测几乎所有的B细胞来源的LAIP细胞，包括治疗前和治疗后MRD⁺状态下。出现2个和2个以上LAIP的患者在四组中均>91%，而同时出现几个抗原异常表达，有利于鉴别特异性的LAIP⁺，增加检测的灵敏度和特异性，利于发现残留白血病细胞。

采用本发明的试剂盒，适用99%的B-ALL患者，而去可以不依赖于发病时的免疫表型资料，扩大了LAIP分析的范围和能力，简化了分析的前期条件，为临床检测MRD提供了更多的机会；由于利用本试剂盒中的一组抗体组合即可检测99%B-ALL患者的LAIP，可大大减少抗体组合的不一致性。因此，利于B-ALL白血病相关免疫表型的分析的标准化和规范化，降低MRD分析的成本、减轻白血病患者的经济负担。

综上所述，不论是初诊时B-ALL患者，还是CML急变患者及复发时B-ALL患者， LAIP的发生率在99%以上。通过本发明的试剂盒并借助七色流式细胞仪将对急性B淋巴细胞白血病患者LAIP的快速、准确分类具有重要的参考意义。有很多患者在发病时并未进行过免疫表型检测，或者资料很少，无参考价值，而临床需要掌握该患者MRD的水平；对这样的患者，国际上普遍认为无法进行检测，或者需要对患者进行全面的免疫表型检测，需要检测20余种抗体，采用本发明的试剂盒只需一组7色抗体组合即可。由于采用7色抗体组合，可以同时观察7个标志是否存在异常，增加了检测的灵敏度和准确性。

Claims (6)

1.一种检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，与七色流式细胞仪组成白血病相关免疫表型分类装备，其特征在于该试剂盒中配置了下述单克隆抗体试剂：CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45。

2.根据权利要求1所述的检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，其特征在于所述单克隆抗体试剂CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19和CD45依前后排列顺序依次进行特异性荧光素标记为：FITC、PE、Percp-CY5.5、PE-CY7、APC、APC-Cy7和Pacific Blue。

3.根据权利要求1所述的检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还设置了溶红细胞液和pH为7.2~7.4的10×PBS缓冲液。

4.根据权利要求3所述的检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还设置了配套计量的小牛血清试剂。

5.根据权利要求1~4任意一项所述试剂盒在制备检测急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型的产品中的应用。

6.借助于权利要求4所述的试剂盒和七色流式细胞仪对急性B淋巴细胞白血病相关免疫表型进行分析的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

步骤一、试剂配制

1.1、配制pH为7.2~7.4的10×PBS缓冲液，并稀释10倍成为1×PBS缓冲液，

1.2、取溶红细胞液，并用1×PBS缓冲液稀释10倍，

1.3、取小牛血清加入至1×PBS缓冲液中，制备含0.5wt.%~2wt.%血清的PBS；

步骤二、对骨髓标本进行荧光标记，制备测试标本

2.1在同一专用试管中，依次分别加入荧光标记的单克隆抗体如下：3μL CD58-FITC、10μL CD10-PE、1μL CD34-PerCP-CY5.5、1μL CD123-PE-CY7、2μL  CD38-APC、5μL CD19-APC-Cy7和1.3μL CD45-Pacific Blue，然后再加入100μL骨髓标本，混匀，室温避光放置15分钟孵育，

2.2、加入步骤1.2中稀释后的溶红细胞液2mL，混匀后避光，室温放置 8分钟，溶解红细胞，

2.3、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.3中2mL含0.5wt.%~2wt.%血清的PBS，混匀，

2.4、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.1中0.3mL1× PBS缓冲液，混匀，制成待测标本；

步骤三、按照七色流式细胞仪的操作要求对待测标本进行处理后检测，获得特异性荧光标记的骨髓细胞数据，用MACSQuant分析软件、在SSC/CD19和CD45/CD19双参数点图中对CD19⁺细胞进行连续两次设门，并进一步在CD19⁺细胞中对CD19⁺CD38^强+的浆细胞设门以去除浆细胞，最终的CD19⁺B细胞为待测的细胞，并与正常骨髓细胞CD19⁺B祖细胞表型进行比较。

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