CN105606797A - 抗体组合物及其在白血病淋巴瘤分型中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗体医药技术领域，提供了两种抗体组合物，其包括抗CD45抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体和抗CD7抗体，或者包括抗CD45抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体和抗CD19抗体。另外，本发明提供了包括这两种抗体组合物的白血病和淋巴瘤分型试剂盒，可与流式细胞仪配套使用，对各类血液肿瘤进行分型。

Description

抗体组合物及其在白血病淋巴瘤分型中的应用
技术领域
本发明属于抗体医药技术领域，具体而言，本发明涉及抗体组合物及其在白血病和淋巴瘤分型中的应用以及分型试剂盒等。
背景技术
常见的血液肿瘤主要包括各类白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤等，是严重危害人民生命健康的重大疾病。在诊断发现血液疾病后，通常需要进行分型。例如，中国专利第00133797号公开了可用于白血病分型的蛋白芯片，其包括抗至少19种细胞表面抗原的抗体；中国专利第200910082657号公开了可用于急性淋巴细胞白血病基因分型的基因芯片，其包括62种DNA片段；中国专利第201410250033号公开了可用于急性淋巴细胞白血病基因分型的试剂盒，其包括三组共58个引物对。这些分型的方案正在向越来越复杂的方向发展。
临床上也采用流式细胞术进行分型。由于CD45是白细胞共同的抗原，所以当前基本上是以CD45vsSSC(CD45/SSC)设门的流式细胞术免疫分型，尤其是在初筛中进行分型(初筛方案是每个血液肿瘤病人均需要做的)。例如，王卉等(四色流式细胞术分析B细胞型急性淋巴细胞白血病免疫表型.中国实验血液学杂志，11(2)：137)、张玮等(流式细胞术CD45/SSC设门在急性白血病免疫分型中的应用.西安交通大学学报(医学版)，28(4)：462)和刘光明等(六色流式细胞术用于儿童急性B系淋巴细胞白血病相关免疫表型的检测.中国小儿血液与肿瘤杂志，17(3)：104)均报道了以CD45/SSC设门对各类白血病进行流式细胞术免疫分型的技术，然而，本发明人发现，即便不计算抗CD45抗体，这些技术需要大量的抗不同细胞表面抗原的抗体，少则也要约10种，而且如上所述，分型的方案正在向越来越复杂的方向发展，使用的抗体种类有越来越多的趋势。这不但增加了分型的成本，而且增加了操作难度，所以推广得到了限制。
而本发明人没有受现有技术的发展趋势的限制，经过十余年临床实践和研究，令人意外地筛选出包括抗CD45抗体在内的七种抗体，组合为两种组合物，每组四种抗体，配合四色流式细胞仪，仅需一次上机操作，就可有效进行多种血液肿瘤的免疫分型(特别是初筛)，而且节约了成本、操作更趋简单、快速，特别适合于临床白血病、淋巴瘤的初筛中推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供两种新的抗体组合物及包括它们的试剂盒，用于进行白血病和淋巴瘤分型。另外，本发明还提供了使用它们进行白血病和淋巴瘤分型的方法和应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了抗体组合物，其包括抗CD45抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体和抗CD7抗体。
优选本发明第一方面的抗体组合物由抗CD45抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体和抗CD7抗体组成。
更优选本发明第一方面的抗体组合物中每种抗体被标记不同的荧光标记，优选每种抗体被分别标记FITC、PE、PerCP-cy5.5和APC。这样可以在四色流式细胞仪单管(检测一根流式管时)即可同时检测出抗CD45抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体和抗CD7抗体的结果。
在第二方面，本发明提供了抗体组合物，其包括抗CD45抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体和抗CD19抗体。
优选本发明第二方面的抗体组合物由抗CD45抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体和抗CD19抗体组成。
更优选本发明第二方面的抗体组合物中每种抗体被标记不同的荧光标记，优选每种抗体被分别标记FITC、PE、PerCP-cy5.5和APC。这样可以在四色流式细胞仪单管(检测一根流式管时)即可同时检测出抗CD45抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体和抗CD19抗体的结果。
在本文中，抗体本身是本领域技术人员所熟知的，特异结合(抗)相应抗体。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，在本发明的具体实施方式中，优选是单克隆抗体。抗体可以是鼠源的，也可以是人源的。在本文中，如没有相反的指示，各抗体的抗原，即各细胞表面抗原(CD45、CD13、CD33、CD7、CD117、CD34和CD19)，均为人细胞表面抗原。
在第三方面，本发明提供了用于白血病和淋巴瘤分型的试剂盒，其包括第一容器和第二容器，其中，第一容器包括本发明第一方面的抗体组合物，第二容器包括本发明第二方面的抗体组合物。
本发明第三方面的试剂盒可以仅采用包括抗CD45抗体在内的7种抗体，就能对多种血液肿瘤(白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征等)进行初筛分型，在血液肿瘤免疫分型中应用前景广阔。
在本文中，第一容器和第二容器中的标号仅仅为表示不同容器，并不对容器本身的材质、形状构成限制，只要容器能容纳并保存本发明的抗体组合物即可。容器可以是管、瓶，其材质可以是塑料或玻璃。
本发明第三方面的试剂盒还可以包括其他参与进行白血病和淋巴瘤分型的试剂和设备。优选本发明第三方面的试剂盒中还包括红细胞裂解液(如，10×红细胞裂解液)和/或缓冲液(如，磷酸盐缓冲液)。本发明第三方面的试剂盒中还可以包括与流式细胞仪配套使用的流式管、细胞计数板、涡旋振荡器、移液器、离心机等，尤其是流式管、细胞计数板等耗材。
另外，本发明第三方面的试剂盒还可以包括指导进行白血病和淋巴瘤分型的说明书或手册。
在第四方面，本发明提供了白血病和淋巴瘤分型的方法，其包括：
(1)处理骨髓或外周血样品，使得呈单个细胞悬液状态；
(2)将步骤(1)处理的样品等分，分别与权利要求2所述的抗体组合物和权利要求4所述的抗体组合物混合入两根流式管，混匀后孵育；
(3)向步骤(2)孵育的两根流式管加入红细胞裂解液，混匀后孵育，离心，去上清并重悬；和，
(4)四色流式细胞仪检测步骤(3)重悬的两根流式管，并计算结果。
由于是对已经诊断出白血病和淋巴瘤的病人样品进行分型，不再出具有诊断信息的结果(如果混有健康人的样品，反而干扰分型的准确性)，而且也没有样品的获取步骤，甚至可以是使用教学用样品来进行教授白血病和淋巴瘤分型的方法，因此本发明第四方面的方法是非诊断的免疫分型方法。
优选在本发明第四方面的方法中，计算结果是计算抗以下细胞表面抗原的抗体对的荧光结果(流式细胞仪检测的荧光结果)：CD33vsCD13、CD33vsCD7、CD7vsCD13、CD117vsCD34、CD117vsCD19和CD19vsCD34，即，计算以下抗体对的荧光结果：抗CD33抗体vs抗CD13抗体、抗CD33抗体vs抗CD7抗体、抗CD7抗体vs抗CD13抗体、抗CD117抗体vs抗CD34抗体、抗CD117抗体vs抗CD19抗体和抗CD19抗体vs抗CD34抗体。在本文中，如无相反指示，检测均是以CD45vsSSC(即CD45/SSC)设门。
在第五方面，本发明提供了本发明第一方面的抗体组合物和本发明第二方面的抗体组合物联合在制备白血病和淋巴瘤分型的试剂盒中的应用。
优选在本发明第五方面的应用中，试剂盒是本发明第三方面的试剂盒。
也优选在本发明第五方面的应用中，白血病和淋巴瘤分型的方法是本发明第四方面的方法。
本发明的有益效果在于：优化了抗体组合和标记对应抗体的荧光标记组合以及结果判读方法，只需要使用7种抗体即可有效对多种血液肿瘤(白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征等)进行初筛分型，节约了成本，操作更趋简单、快速。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1显示了多发性骨髓瘤(MM)的检测分布点图。
图2显示了骨髓增生异常综合征(MDS)的检测分布点图。
图3显示了急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的检测分布点图。
图4显示了急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)的检测分布点图。
图5显示了急性髓细胞白血病M3型(AML-M3)的检测分布点图。
图6显示了急性髓细胞白血病M5型(AML-M5)的检测分布点图。
图7显示了边缘带淋巴瘤(MZL)的检测分布点图。
图8显示了T大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGL)的检测分布点图。
图9显示了慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)的检测分布点图。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《免疫检测技术》(科学出版社,北京,中国,1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的试剂原料均为市售品，可以通过公开渠道购买获得。
实施例1试剂的配制
下述实施例中使用抗如下两组细胞表面抗原的单克隆抗体，每组中不同单克隆抗体分别用不同的选自FITC、PE、PerCP-cy5.5和APC的荧光标记来标记：
组1：CD45、CD13、CD33和CD7；
组2：CD45、CD117、CD34和CD19。
这些荧光标记的单克隆抗体可以直接通过公开渠道购买获得，具体来源参见表1。
表1产品相关单克隆抗体信息
原材料 抗体克隆号 制造商 供应商
APC-CD7单克隆抗体 CD7-6B7 美国Biolegend 达科为生物技术有限公司
PE-CD13单克隆抗体 WM15 美国Biolegend 达科为生物技术有限公司
APC-CD19单克隆抗体 HIB19 美国Biolegend 达科为生物技术有限公司
PerCP-cy5.5-CD33单克隆抗体 WM53 美国Biolegend 达科为生物技术有限公司
PerCP-cy5.5-CD34单克隆抗体 581 美国Biolegend 达科为生物技术有限公司
FITC-CD45单克隆抗体 HI30 美国Biolegend 达科为生物技术有限公司
PE-CD117单克隆抗体 104D2 美国Biolegend 达科为生物技术有限公司
对这些单克隆抗体分别取样，梯度稀释，分别进样于四色流式细胞仪对相应抗原进行检测，确定最佳抗体用量为5μl，从而取以下量的荧光标记的单克隆抗体分别装于A、B两管试剂管中：
A管：5μLCD45-FITC、5μLCD13-PE、5μLCD33-PerCP-cy5.5、5μLCD7-APC；
B管：5μLCD45-FITC、5μLCD117-PE、5μLCD34-PerCP-cy5.5、5μLCD19-APC。A管和B管可构成本发明的试剂盒。
本发明的试剂盒还可以包括分别装有10×红细胞裂解液的容器和装有10×PBS缓冲液(pH7.2)的容器，其中10×红细胞裂解液的配制方法如下：称取80.2gNH4Cl，8.4gNaHCO3和3.7gEDTA-2Na，加水至900ml，混匀，用1MNaOH或1MHCl调节pH至7.4，加水至1L。
实施例2样品的处理
将保存于肝素或EDTA抗凝管中的骨髓或外周血样品调整至细胞密度为1～5×106/ml，然后通过200目工业筛网过滤，去除样本中团块样物质，保证单个细胞悬液状态，保存于2～8℃，得到处理的样品。
实施例3样品的分型检测
取两根流式管，分别标记①、②，然后分别加入实施例1的试剂盒中A、B管的抗体混合物，加入量分别为3μL。然后，取实施例2处理的样品100μL，等分后在流式管①、②中分别加入50μL，使用涡旋振荡器振荡混匀，室温(25℃)避光孵育15分钟。
用蒸馏水将10×PBS缓冲液稀释至1×PBS缓冲液，然后用1×PBS缓冲液将10×红细胞裂解液稀释成1×红细胞裂解液，然后向孵育后的流式管①、②中各加入1×红细胞裂解液1ml，使用涡旋振荡器振荡均匀，室温(25℃)避光静置10分钟。
然后，流式管①、②以1500rpm离心5分钟，去上清，加入200μL1×PBS重悬，用四色流式细胞仪检测。分别对大量不同来源的已知血液肿瘤的样品进行检测，以CD45vsSSC设门，考察CD33vsCD13、CD33vsCD7、CD7vsCD13、CD117vsCD34、CD117vsCD19和CD19vsCD34的分布情况，其分布如图1-9所示，不同血液肿瘤之间的分布在至少一个点图中差异显著，因此可以快速地对多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、急性髓细胞白血病M3型(AML-M3)、急性髓细胞白血病M5型(AML-M5)、边缘带淋巴瘤(MZL)、T大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGL)和慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)等进行有效分型，尤其是可以应用在初筛中进行分型。

Claims (10)

1.抗体(优选是单克隆抗体)组合物，其包括抗CD45抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体和抗CD7抗体，优选其由抗CD45抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体和抗CD7抗体组成。
2.权利要求1所述的抗体组合物，其中每种抗体被标记不同的荧光标记，优选每种抗体被分别标记FITC、PE、PerCP-cy5.5和APC。
3.抗体(优选是单克隆抗体)组合物，其包括抗CD45抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体和抗CD19抗体，优选其由抗CD45抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体和抗CD19抗体组成。
4.权利要求3所述的抗体组合物，其中每种抗体被标记不同的荧光标记，优选每种抗体被分别标记FITC、PE、PerCP-cy5.5和APC。
5.用于白血病和淋巴瘤分型的试剂盒，其包括第一容器和第二容器，其中，第一容器包括权利要求1或2所述的抗体组合物，第二容器包括权利要求3或4所述的抗体组合物。
6.权利要求5所述的试剂盒，其中还包括红细胞裂解液(如，10×红细胞裂解液)和/或缓冲液(如，磷酸盐缓冲液)。
7.白血病和淋巴瘤分型的方法，其包括：
(1)处理骨髓或外周血样品，使得呈单个细胞悬液状态；
(2)将步骤(1)处理的样品等分，分别与权利要求1或2所述的抗体组合物和权利要求3或4所述的抗体组合物混合入两根流式管，混匀后孵育；
(3)向步骤(2)孵育的两根流式管加入红细胞裂解液，混匀后孵育，离心，去上清并重悬；和，
(4)四色流式细胞仪检测步骤(3)重悬的两根流式管，并计算结果。
8.权利要求7所述的方法，其中计算结果是计算抗以下细胞表面抗原的抗体对的荧光结果：CD33vsCD13、CD33vsCD7、CD7vsCD13、CD117vsCD34、CD117vsCD19和CD19vsCD34。
9.权利要求1或2所述的抗体组合物和权利要求3或4所述的抗体组合物联合在制备白血病和淋巴瘤分型的试剂盒中的应用。
10.权利要求9所述的应用，其中，试剂盒是权利要求5或6所述的试剂盒；和/或，白血病和淋巴瘤分型的方法是权利要求7或8所述的方法。
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