CN106386785B - 一种细胞保存液及其在流式样本保存中的应用 - Google Patents

一种细胞保存液及其在流式样本保存中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了细胞保存液在流式细胞仪检测中的应用，其中检测是白血病和淋巴瘤分型，细胞保存液包括Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂。另外，本发明还公开了一种细胞保存液的制备方法以及流式细胞样本的保存方法。该细胞保存液可用于临床细胞标本的长期稳定保存，尤其对于流式细胞样本，具有长期稳定的保存效果。

Description

一种细胞保存液及其在流式样本保存中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体而言，本发明涉及用流式细胞仪检测的含细胞样本的保存方法。
背景技术
随着生物、医学技术的发展，科研检测、临床诊断已逐渐上升至细胞、基因水平，作为单细胞或生物离子定量分析重要手段之一的流式细胞技术的应用也日益广泛。流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。包括本发明人的中国专利第201610027214号在内的许多现有技术着重对流式细胞术本身的步骤和参数进行了研究。
然而，现有技术对于进行流式细胞检测的样本及其保存/处理方法的研究较少。美国专利US5753428A公开了一种细胞保存液，然而本发明人发现，由于其中使用了柠檬酸根等物质，使得对血液样本上的CD33、CD13等标记不稳定，用其保存的样本时间稍长，进行如中国专利第201610027214号所述的流式细胞检测，将产生与原始样本检测不同的结果。国内对此的研究也很少，例如中国专利第201410534999号公开了一种稳定血液样品细胞的试剂，尽管其声称可用于流式细胞仪检测，但是作为业内人士，其中使用了具有强细胞毒性和强氧化锌的重铬酸钾，其保存效果还不如目前常用的含多聚甲醛的细胞保存液。
本发明人发现，尤其是本发明人的中国专利第201610027214号所述的流式细胞检测，其涉及抗体对结果的判读，因此如果不能及时进行检测，或者采用合适方式处理样本，都会造成抗原表达强度发生不成比例的下降，从而使结果准确度大大降低，甚至可以造成白血病/淋巴瘤免疫分型病例的误诊。为此，本发明人在持续的研究下，开发出了一种细胞保存液，可稳定保存样本至少49天，保证长期保存的骨髓、外周血、组织等标本的质量，从而保证免疫分型、淋巴细胞亚群检测等多种白细胞相关检测的结果稳定和正确，特别适用于中国专利第201610027214号所述的流式细胞检测，实现样本采集和检测分离，采集时无需考虑检测仪器和试剂，为集约化检测奠定了基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供新的细胞保存液及其制备方法。另外，本发明还涉及基于该细胞保存液的保存含有细胞的样本的方法、保存产物以及在流式细胞术中的应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了细胞保存液，其pH7.2～7.5，其中溶质包括Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂。其中，可以包括抗凝剂，也可以不包括抗凝剂。通常不包括抗凝剂的细胞保存液保质期更长一些，适合大批量存储，待分装时再加入抗凝剂。
细胞保存液由溶质和溶剂组成，其中溶剂通常是水，优选是纯水。优选在本发明第一方面的细胞保存液中，溶质由Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂组成。
抗凝剂通常可以是肝素和/或EDTA。由于EDTA更适合中国专利第201610027214号所述的流式细胞检测，因此优选在本发明第一方面的细胞保存液中，抗凝剂是EDTA或其盐，如钾盐(即EDTA-K2)。
优选在本发明第一方面的细胞保存液中，每种组分的含量如下：Na2HPO4 10mmol/L、KH2PO4 2mmol/L、NaCl 137mmol/L、KCl 2.7mmol/L、聚乙二醇10-20％(wt)、氯化铬0.1％-1％(wt)。如果本发明第一方面的细胞保存液包括抗凝剂，则优选其中，细胞保存液中抗凝剂的含量为15～22g/L。
本发明的细胞保存液没有腐蚀性，也没有氧化性，可以装于多种材质的容器，如玻璃容器或塑料容器。
在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的细胞保存液的制备方法，其包括将Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂混合的步骤。
优选本发明第二方面的制备方法还包括混合后进行过滤和/或分装的步骤。对于不加抗凝剂的细胞保存液来说，通常可以不分装，直接装于大试剂瓶中储存；对于加抗凝剂的细胞保存液来说，优选进行分装，这样可以直接加入采集的含细胞的样本而进行保存。分装可以分装在非真空管中，也可以分装在真空管中。鉴于通常血液样本的采集体积为1～2ml，因此分装的体积对应为100～300μl/管，优选为200μl/管。
在第三方面，本发明提供了保存含有细胞的样本的方法，其包括：
(1)提供含有细胞的样本液；
(2)任选将抗凝剂与所述样本液混合；
(3)将本发明第一方面的细胞保存液与所述样本液混合，其中所述细胞保存液与所述样本液的体积比≥1:10；
(4)将步骤(3)获得的混合物保存。
含有细胞的样本液可以本身就是液体，如，血液、骨髓，这样提供该样本液本身即可。含有细胞的样本液本身可以是组织或细胞沉积，这样需要将组织中的细胞分离或将细胞沉积分散，形成细胞悬浮液，从而进行提供。
如果本发明第一方面的细胞保存液不含抗凝剂，则需向该细胞保存液中加入抗凝剂(如，EDTA或其盐)，优选加入抗凝剂至其含量达到1.5～2.2mg/ml。如果本发明第一方面的细胞保存液包含抗凝剂，则无需实施本发明第三方面的方法中的步骤(2)。
优选在本发明第三方面的方法中，在步骤(3)中，所述细胞保存液与所述样本液的体积比为1：5～10。
步骤(3)获得的混合物可以于室温(如25℃)保存，优选于2～8℃保存，这样可以有更长的保存期。优选保存期为3天以上，更优选为5天以上，进一步优选为10天以上，如保存期为15天、30天或49天。
在第四方面，本发明提供了本发明第三方面的方法获得的保存产物，优选其为保存了3天以上的保存产物，更优选其为保存了5天以上的保存产物，进一步优选其为保存了10天以上的保存产物，如保存了15天、30天或49天的保存产物。
在第五方面，本发明提供了本发明第四方面的保存产物在用流式细胞仪检测的方法中的应用；相应地，本发明也提供了本发明第四方面的保存产物在制备用于用流式细胞仪检测的方法的试剂盒。
优选在本发明第五方面的应用中，所述用流式细胞仪检测的方法是白血病和淋巴瘤分型的方法。
更优选在本发明第五方面的应用中，优选所述白血病和淋巴瘤分型的方法是在中国专利第201610027214号所述方法基础上的白血病和淋巴瘤分型的方法，其包括：
(1)进行本发明第三方面的方法；
(2)将步骤(1)的方法获得的保存产物等分，分别与由抗CD45抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体和抗CD7抗体组成的抗体组合物和由抗CD45抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体和抗CD19抗体组成的抗体组合物混合入两根流式管，混匀后孵育；
(3)向步骤(2)孵育的两根流式管加入红细胞裂解液，混匀后孵育，离心，去上清并重悬；和，
(4)四色流式细胞仪检测步骤(3)重悬的两根流式管，并计算结果。
进一步优选其中，计算结果是计算抗以下细胞表面抗原的抗体对的荧光结果：CD33vs CD13、CD33vs CD7、CD7vs CD13、CD117vs CD34、CD117vs CD19和CD19vs CD34。
也进一步优选其中，白血病和淋巴瘤是多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病M3型、急性髓细胞白血病M5型、边缘带淋巴瘤、T大颗粒淋巴细胞白血病和慢性B淋巴细胞白血病。
本发明的有益效果在于：没有受现有技术不重视细胞保存液的影响，提供了新的细胞保存液，可以长期保存骨髓、外周血、组织等，并保证免疫分型、淋巴细胞亚群检测等多种白细胞相关检测的结果稳定和正确，特别适用于中国专利第201610027214号所述的流式细胞检测。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1显示了长期保存的样品中粒细胞、单核细胞、淋巴细胞的比例变化情况。
图2示例性地显示了长期保存的样品在保存中不同时期的SSC以及各抗原的表达变化情况。
图3显示了6天保存的样品中T细胞表面CD62L和CD45RA、CD45RO等抗原的表达变化情况的缩略示意图。
图4显示了15天保存的淋巴结样本的检测结果缩略示意图。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《免疫检测技术》(科学出版社,北京,中国,1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的试剂原料均为市售品，可以通过公开渠道购买获得。
实施例1瓶装细胞保存液1及其制备
称取3.5814g Na2HPO4.12H2O、0.272gKH2PO4、8.0145g NaCl、0.20115g KCl、100g聚乙二醇(PEG-20000)、5g三氯化铬，溶于900ml纯化水后，定容至1L，其pH为7.25，0.22μm膜过滤，灌装至无菌试剂瓶内，密闭试剂瓶，由此制得细胞保存液1，经测试，其于2～8℃环境下可至少稳定保存2年，适合长期储存。对于已经加了抗凝剂的血液样本，将其进行分装即可投入使用。
实施例2瓶装细胞保存液2及其制备
称取3.5814g Na2HPO4.12H2O、0.272gKH2PO4、8.0145g NaCl、0.20115g KCl、100g聚乙二醇(PEG-20000)、5g三氯化铬、15g EDTA.K2，溶于900ml纯化水后，定容至1L，其pH为7.25，0.22μm膜过滤，灌装至无菌试剂瓶内，密闭试剂瓶，由此制得细胞保存液1，经测试，于2～8℃环境下可至少稳定保存18个月，适合较长期储存。对于原始的未加抗凝剂的血液样本，可以直接将其分装而投入使用。
实施例3非真空管装细胞保存液3及其制备
取实施例2制备的细胞保存液1，灌装至无菌塑料管中，每管灌装量为200μl，密闭管塞，由此制得细胞保存液3。其可以直接使用。
实施例4真空管装细胞保存液4及其制备
取实施例2制备的细胞保存液1，灌装至无菌塑料管中，每管灌装量为200μl，用抽真空设备以0.29个标准大气压抽真空处理并密闭管塞，由此制得细胞保存液4，经测试，于2～8℃环境下可至少稳定保存2年。其可以直接使用。
实施例5本发明的细胞保存液在流式样本保存中的应用
取按照实施例4制备得到的细胞保存液管，每管直接加入一例正常人外周血1.5mL，2～8℃放置保存，进行长期(2016年3月25日至2016年5月13日，历时49天)细胞保存测试，期间每隔五至九天取一管保存的样品，进行流式细胞仪检测，包括按照中国专利第201610027214号的方法进行检测，结果如图1和2所示。图1显示了长期保存的样品中粒细胞、单核细胞、淋巴细胞的比例变化情况，结果表明对这三类细胞总体而言，经历长期保存，均能保持良好的比例稳定性；图2示例性地显示了长期保存的样品在保存中不同时期(2016年4月8日和2016年4月22日)的SSC以及各抗原的表达情况，其他时间和抗原的检测结果也类似，结果表明SSC以及各抗原(尤其是CD13、CD7和CD33)的表达均无显著差异。上述实验共进行30例平行样本的测试，均取得与示例相似的结果。综上所述，采用本发明的细胞保存液保存的外周血样品用于中国专利第201610027214号的方法中时，在2～8℃条件下可以至少保存49天。
对于中国专利第201610027214号未涉及的抗原，也进行了一定期限的测试，如测试正常人外周血标本T细胞表面CD62L和CD45RA、CD45RO表达水平变化，结果如图3所示，经6天测试，T细胞比例和CD62L、CD45RA、CD45RO表达，均保持稳定。
另外，如上所述，对多发性骨髓瘤的浆细胞样本进行了保存和流式细胞仪检测，经历11天保存，检测发现浆细胞比例稳定，分群明显，仍旧可以进行临床分析；对慢性淋巴细胞白血病患者的骨髓样本，经历15天保存，检测发现无临床医生认定前后会发生变化的结果出现；对于淋巴结样本，淋巴结标本经研磨后的单细胞悬液用本发明的细胞保存液保存，经历15天保存，检测发现结果稳定(参见图4)。

Claims (22)

1.细胞保存液，其pH7.2～7.5，其中溶质由Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂组成。
2.权利要求1所述的细胞保存液，其中抗凝剂是EDTA或其盐。
3.权利要求2所述的细胞保存液，其中盐是钾盐。
4.权利要求1所述的细胞保存液，其中每种组分的含量如下：Na2HPO4 10mmol/L、KH2PO42mmol/L、NaCl 137mmol/L、KCl 2.7mmol/L、聚乙二醇10-20％(wt)、氯化铬0.1％-1％(wt)。
5.权利要求1所述的细胞保存液，其中抗凝剂的含量为15～22g/L。
6.权利要求1～5之一所述的细胞保存液的制备方法，其包括将Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化铬以及任选的抗凝剂混合的步骤。
7.权利要求6所述的制备方法，其进一步包括混合后进行过滤和/或分装的步骤。
8.权利要求7所述的制备方法，其中分装是分装成200μl/管。
9.保存含有细胞的样本的方法，其包括：
(1)提供含有细胞的样本液；
(2)任选将抗凝剂与所述样本液混合；
(3)将权利要求1～5之一所述的细胞保存液与所述样本液混合，其中所述细胞保存液与所述样本液的体积比≥1:10；
(4)将步骤(3)获得的混合物保存。
10.权利要求9所述的方法，其中步骤(1)中的样本液是血液、骨髓或细胞悬浮液。
11.权利要求9所述的方法，其中步骤(3)中的体积比为1:5～10。
12.权利要求9所述的方法，其中步骤(4)中的保存是保存于2～8℃保存。
13.权利要求9所述的方法，其中步骤(4)中的保存的保存期为3天以上。
14.权利要求13所述的方法，其中步骤(4)中的保存的保存期为5天以上。
15.权利要求14所述的方法，其中步骤(4)中的保存的保存期为10天以上。
16.权利要求15所述的方法，其中步骤(4)中的保存的保存期为15天、30天或49天。
17.权利要求9～16之一所述的方法获得的保存产物。
18.权利要求17所述的保存产物在制备用于用流式细胞仪检测的方法的试剂盒中的应用。
19.权利要求18所述的应用，其中，所述用流式细胞仪检测的方法是白血病和淋巴瘤分型的方法。
20.权利要求19所述的应用，其中，所述白血病和淋巴瘤分型的方法包括：
(1)进行权利要求9～16之一所述的方法；
(2)将步骤(1)的方法获得的保存产物等分，分别与由抗CD45抗体、抗CD13抗体、抗CD33抗体和抗CD7抗体组成的抗体组合物和由抗CD45抗体、抗CD117抗体、抗CD34抗体和抗CD19抗体组成的抗体组合物混合入两根流式管，混匀后孵育；
(3)向步骤(2)孵育的两根流式管加入红细胞裂解液，混匀后孵育，离心，去上清并重悬；和，
(4)四色流式细胞仪检测步骤(3)重悬的两根流式管，并计算结果。
21.权利要求20所述的应用，其中计算结果是计算抗以下细胞表面抗原的抗体对的荧光结果：CD33vs CD13、CD33vs CD7、CD7vs CD13、CD117vs CD34、CD117vs CD19和CD19vsCD34。
22.权利要求19所述的应用，其中白血病和淋巴瘤是多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病M3型、急性髓细胞白血病M5型、边缘带淋巴瘤、T大颗粒淋巴细胞白血病和慢性B淋巴细胞白血病。
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