CN112423786B - 用于病毒感染的细胞佐剂 - Google Patents

用于病毒感染的细胞佐剂 Download PDF

Info

Publication number
CN112423786B
CN112423786B CN201980031529.0A CN201980031529A CN112423786B CN 112423786 B CN112423786 B CN 112423786B CN 201980031529 A CN201980031529 A CN 201980031529A CN 112423786 B CN112423786 B CN 112423786B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
adenovirus
host cell
cells
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980031529.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112423786A (zh
Inventor
K·尼亚兹
R·王
P·西林
P·T·刘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nantes Biological Co
Original Assignee
Nantes Biological Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nantes Biological Co filed Critical Nantes Biological Co
Publication of CN112423786A publication Critical patent/CN112423786A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112423786B publication Critical patent/CN112423786B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0002—Fungal antigens, e.g. Trichophyton, Aspergillus, Candida
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

本发明设想了双组分疫苗配制品和方法，其中该疫苗具有佐剂组分和治疗组分。该治疗组分优选地包含编码治疗性抗原的重组治疗病毒，而该佐剂组分包含非宿主细胞或其免疫刺激部分。值得注意的是，该佐剂组分的使用将导致治疗组分大量地摄取到免疫感受态细胞中，即使在没有该治疗组分的进入受体的存在下。此外，这样的佐剂还刺激治疗性抗原的表达。

Description

用于病毒感染的细胞佐剂
本申请要求2018年8月10日提交的序列号为62/717,560的共同未决的美国临时申请的优先权。
技术领域
本发明的技术领域是改进的基于病毒的免疫疗法的组合物和方法，尤其是涉及重组病毒核酸的感染和表达的改进，例如，在癌症疗法中的改进。
背景技术
背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地提到的任何出版物是现有技术。
本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。
在本领域中，疫苗接种用于治疗或预防疾病、和/或产生抗体或抗原反应性免疫感受态细胞是常见且众所周知的。在大多数情况下，疫苗接种使用协助刺激免疫反应的佐剂进行。例如，小分子或无机佐剂包括各种铝盐、各种简单油类(如石蜡或鲨烯)、和更复杂的化合物(如皂苷和细胞因子)。某些佐剂也能明显地更复杂，并且这样的佐剂包括杀灭的细菌(例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)等)，在某些情况下被配制为弗氏佐剂(即，具有杀灭的结核分枝杆菌的油包水乳剂)。通常，并且在大多数情况下，使用佐剂以增强针对单一抗原(例如，在预期产生抗体的情况下)或典型灭活病原体(例如，预期在治疗免疫的情况下)的免疫反应。
因此，在需要针对抗原的中和活性的情况下，佐剂通常是有益的。然而，在使用触发由重组病毒感染的细胞内抗原产生的重组病毒颗粒进行免疫的情况下，不需要针对该重组病毒颗粒的免疫反应，因此，佐剂的使用也不被认为是有利的。此外，在大多数使用重组病毒颗粒的免疫疗法中，抗原蛋白在细胞内产生，且同样地不能与佐剂“组合”。
为了提高使用重组病毒颗粒的免疫疗法的效果，提出将IL-12用作增强剂(例如，JImmunol.[免疫学杂志]1996；156(9):3357-3365)。然而，IL-12可能并不总是被很好的耐受，并且也可能使免疫应答产生偏离。在仍其他已知方法中，IL15从重组病毒基因组中共表达(例如，WO2017/139725)。尽管这样的方法在表达抗原的情况下经常有利于刺激免疫应答，但首先IL-15的期望活性取决于病毒摄取和重组IL-15基因的表达。
因此，尽管许多增强免疫应答的方法在本领域是已知的，但所有或几乎所有的这些方法都具有各种缺点，在免疫反应针对在重组病毒中编码的抗原的情况下尤其如此。因此，仍然需要提供改进的组合物和方法，这些组合物和方法增加使用重组病毒颗粒在免疫疗法中治疗应答的可能性。
发明内容
本发明主题是针对各种免疫治疗组合物和方法，并且特别是用于重组病毒表达系统的基于细胞的佐剂，其中该基于细胞的佐剂增加病毒的感染性和重组有效荷载的表达度。
在本发明主题的一个方面，发明人设想了增加重组抗原在宿主细胞中的表达的方法。特别优选的方法包括提供病毒的步骤，该病毒的病毒基因组具有包括在其中的、编码抗原的重组序列，其中该序列可操作地连接到启动子上以驱动该抗原在宿主细胞中的表达；提供非宿主细胞或其免疫刺激部分的另一个步骤；和在允许将病毒摄取到细胞和允许重组序列表达的条件下，将宿主细胞同时暴露于该病毒和该非宿主细胞或其免疫刺激部分的进一步步骤。
例如，合适的非宿主细胞典型地属于不同于宿主细胞物种的物种，且在一些实施例中是致病性非宿主细胞、或细菌细胞(例如，ΔLPS-大肠杆菌)、或酵母细胞(酿酒酵母)。在其他实例中，非宿主细胞的免疫刺激部分包括病原体相关分子模式(PAMP)蛋白和/或损伤相关分子模式(DAMP)蛋白。从不同角度看，免疫刺激部分也可包括toll样受体(TLR)配体和/或模式识别受体(PRR)配体。设想的病毒包括腺病毒(例如，Ad5[E1-,E2b-]病毒)或柯萨奇病毒，并且抗原典型地包括患者和肿瘤特异性新表位和/或肿瘤相关抗原。在进一步的实施例中，同时暴露的步骤在体内进行，典型地使用包含病毒和非宿主细胞或其免疫刺激部分的疫苗组合物。
因此，在本发明主题的另一方面，诸位发明人设想了使用免疫疗法治疗患者的方法。最典型地，这种方法包括向患者施用双组分疫苗配制品的方法，其中该疫苗配制品有佐剂组分和治疗组分。优选的治疗组分包含病毒，该病毒的病毒基因组具有包括在其中的、编码抗原的重组序列，其中该序列可操作地连接到启动子上以驱动该抗原在患者细胞中的表达；并且优选的佐剂组分包含非宿主细胞或其免疫刺激部分。对于非宿主细胞、免疫刺激部分、病毒、和抗原，适用如上所述相同的考虑。
在本发明主题的又另一个方面，诸位发明人设想了转染病毒进入缺乏该病毒进入免疫感受态细胞的受体的免疫感受态细胞的方法。这种方法典型地包括在允许将该病毒摄取到该细胞的条件下，将该免疫感受态细胞同时暴露于该病毒和该非宿主细胞或其免疫刺激部分的步骤。优选地，该病毒具有包括编码抗原的重组序列的病毒基因组，其中该序列可操作的连接到启动子上以驱动该抗原在免疫感受态细胞中的表达，且非宿主细胞或其免疫刺激部分是细菌(例如，ΔLPS-大肠杆菌)或酵母细胞(例如，酿酒酵母)。
例如，合适的免疫感受态细胞包括树突细胞、巨噬细胞、和B淋巴细胞。设想的病毒包括腺病毒(例如，Ad5[E1-,E2b-]病毒)和柯萨奇病毒，而该受体是CXADR受体。此外，同时暴露的步骤在体内进行通常是优选的，典型地使用包含该病毒和该非宿主细胞或其免疫刺激部分的疫苗组合物进行。关于免疫刺激部分，适用如上所述相同的考虑。
因此，诸位发明人也设想了包含佐剂组分和治疗组分的疫苗组合物，其中该治疗组分包含病毒，该病毒的病毒基因组具有包括在其中的、编码抗原的重组序列，其中该序列可操作地连接到启动子上以驱动该抗原在患者的细胞中的表达，并且其中该佐剂组分包含非宿主细胞或其免疫刺激部分。对于非宿主细胞、免疫刺激部分、病毒、和抗原，适用如上所述相同的考虑。除其他用途外，诸位发明人尤其设想这样的疫苗组合物在癌症或感染性疾病治疗中的用途。
从以下对优选实施例的详细描述以及附图中，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，在附图中相同的数字表示相同的组成部分。
附图说明
图1描述表明改进的AdV摄取和货物(cargo)表达的、腺病毒与ΔLPS-大肠杆菌共孵育的示例性结果。
图2是图1示例性结果的图示。
图3描述在不同量的ΔLPS-大肠杆菌佐剂下，重组腺病毒有效载荷的表达的示例性结果。
图4描述在不同量的酿酒酵母佐剂下，重组腺病毒有效载荷的表达的示例性结果。
图5描述在不同量的ΔLPS-大肠杆菌佐剂下，重组腺病毒有效载荷的表达的示例性结果。
图6描述在不同量的酿酒酵母佐剂下，重组腺病毒有效载荷的表达的示例性结果。
图7描述根据本发明主题的实验的示例性工作流程。
图8描述使用各种佐剂的、图7实验的示例性结果。
图9描述使用各种佐剂的、图7实验的示例性FACS结果。
图10描述表明BCG佐剂的可能毒性的示例性结果。
图11描述低剂量BCG佐剂的示例性结果。
图12描述低剂量BCG佐剂的进一步示例性结果。
具体实施方式
诸位发明人已经发现病毒疫苗组合物的施用可补充基于细胞的佐剂以增加摄取病毒到多种细胞、特别是免疫感受态细胞中(即使其中这样的细胞缺少病毒进入受体如CXADR)和/或增加病毒携带的重组基因的表达水平。值得注意的是，在多种基于细胞的佐剂中可观察病毒摄取的增加和病毒携带的重组基因的表达水平的增加，特别是在基于细胞的佐剂中的细胞与待转染的细胞不同时。
例如，为了重组病毒疫苗(即，编码重组抗原的病毒)有效，专职抗原呈递细胞或免疫感受态细胞(如树突细胞、B淋巴细胞、或巨噬细胞)首先必须摄取病毒和其重组核酸，然后在呈递给抗原特异性T细胞之前有效表达和处理该重组抗原以诱导期望的免疫应答和免疫记忆。在其他病毒中，腺病毒亚组C型5经常被用于重组病毒疫苗。然而，腺病毒对表达CXADR蛋白(柯萨奇病毒和腺病毒受体)的细胞具有主向性(primary tropism)。不同于许多上皮细胞，抗原呈递细胞通常不表达CXADR，极大地抑制基因转移进这种类型细胞的有效性。
诸位发明人现在发现基于细胞的佐剂(如细菌和/或酵母细胞、和其免疫刺激部分)的使用能显著地激活抗原呈递细胞，其方式为改进(AdV5型)基因转移、增加转导的细胞的数量、和在一个细胞接着一个细胞的基础上增加货物基因表达的程度。非常出人意料地，这样的基于细胞的佐剂的使用不导致病毒和/或表达抗原的降解增加，但导致病毒摄取和病毒核酸表达增强。
关于适合病毒，设想在其他病毒中，优选的病毒被遗传修饰为含有会发生期望蛋白和大多数典型抗原蛋白(如下面更详细的讨论)的表达，以帮助引发针对蛋白质的免疫应答的重组核酸构建体。例如，特别适合的病毒包括腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、慢病毒等。然而，腺病毒是特别优选的，并且进一步优选的病毒是复制缺陷和/或非免疫原性病毒，该病毒可通过所选择的病毒蛋白(例如，腺病毒中的E1、E3蛋白)的靶向删除来实现。这样理想的特性能通过删除E2b基因功能来进一步加强。这样的重组病毒尽管存在复制缺陷，可以使用遗传修饰的人293细胞实现高效价，如其他地方已经报道的(例如，J Virol[病毒学杂志]1998年2月；72(2):926-933)。因此，应该理解到，所有的病毒都被认为适合本文使用，特别是那些用于基因疗法或免疫疗法的病毒。
可替代地，免疫疗法不必需依赖病毒，但可以受到使用RNA或DNA、或导致新表位(例如，作为单一肽、串联小基因等)在所希望的细胞(并且尤其是免疫感受态细胞)中表达的其他重组载体，用核酸转染或疫苗接种的影响。因此，设想的方法也适用于非包膜病毒和甚至是裸DNA或RNA(如已知的来自于DNA或RNA疫苗接种)的宿主细胞的转染。
因此，应当理解，遗传修饰的病毒包括至少一个重组序列元件，当在宿主细胞中表达时，该元件将提供一个或多个典型的免疫原性抗原(抗原性寡肽或多肽)，从而提供治疗效果。例如，如以下更详细描述的，可被构建的重组核酸包括一个或多个表达盒，用于细菌或病毒抗原、肿瘤相关抗原、或患者和肿瘤特异新表位的表达。此外，设想的重组核酸也包括编码一个或多个多肽或蛋白质佐剂的表达盒。关于重组免疫原性抗原，通常优选的是以引导抗原向MHC-I和/或MHC-II呈递的方式工程化这些抗原。另外或可替代地，应该注意的是抗原多肽或蛋白能被表达为膜结合蛋白或可溶性分泌蛋白。
因此，在本发明主题的示例性方面，癌症免疫疗法能使用重组腺病毒，该重组腺病毒具有如有效荷载(例如，癌症表位或TAA)和如下更详细讨论的其他可选功能元件。然而，在优选的方面，癌症表位是肿瘤和患者特异性新表位，这些新表位是根据一个或多个指标筛选的(例如，依据在肿瘤中的表达强度，依据在MHC-I或MHC-II复合物中的呈递能力等)。
在这种情况下，应该认识到新表位可以被表征为在肿瘤细胞中表达的产生独特的和肿瘤特异性抗原的随机突变。因此并且从不同的角度来看，可以通过考虑突变的类型(例如，缺失、插入、颠换、转换、易位)和突变的影响(例如，无义、错义、移码等)来鉴定新表位，因此这些新表位可以被用作内容过滤器，通过该过滤器可以消除沉默突变和其他不相关的(例如，未表达的)突变。还应当理解，新表位序列可以被定义为具有相对较短长度(例如，8-12mer或14-20mer)的序列延伸物，其中此类延伸物将包括氨基酸序列中的一个或多个变化。最典型地，但非必需地，发生改变的氨基酸将在中心氨基酸位置处或附近。例如，典型的新表位可以具有A4-N-A4、或A3-N-A5、或A2-N-A7、或A5-N-A3、或A7-N-A2的结构，其中A是蛋白原野生型或常态的(即，来自同一患者的相应健康组织)氨基酸，并且N是发生改变的氨基酸(相对于野生型或相对于匹配的常态)。因此，本文设想的新表位序列包括具有相对较短长度(例如，5-30mer，更典型地8-12mer或14-20mer)的序列延伸物，其中此类延伸物包括氨基酸序列中的一个或多个改变。当需要时，可以将另外的氨基酸置于发生改变的氨基酸的上游或下游，例如，以允许在细胞的不同区室中进行另外的抗原加工(例如，胞质溶胶中的蛋白酶体加工，或内吞体和/或溶酶体区室中的特定蛋白酶加工)。
治疗有关的新表位的鉴定或发现可通过本领域已知的各种方法进行。然而，最典型的是，将进行患者肿瘤的序列数据(例如，肿瘤与匹配的正常物)的计算分析。在优选的方法中，如US 2012/0059670和US 2012/0066001中所披露的，使用BAM文件和BAM服务器通过肿瘤和常态样品的位置引导的同步比对来在计算机中进行这样的计算分析。这样的分析有利地减少假阳性新表位，并且显著地减少对存储器和计算资源的需求。从另一个角度来看，可以建立患者和癌症特异性计算机模拟序列集合，这些序列集合编码具有预定长度为例如5和25个之间的氨基酸的新表位，并且包括至少一个发生改变的氨基酸。对于每个发生改变的氨基酸，这种集合将典型地包括至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个成员，其中发生改变的氨基酸的位置是不同的。这种集合有利地增加了适用于免疫疗法的潜在候选分子，并然后可以用于进一步过滤(例如，依据亚细胞定位、转录/表达水平、MHC-I和/或II亲和力等)。
在仍进一步设想的本发明主题的方面，应注意，新表位/多表位可以被导向特定的亚细胞区室(例如，胞质溶胶、内吞体、溶酶体)，并因此被导向特定的MHC呈递类型。这样的定向表达、加工和呈递是特别有利的，因为可以制备将免疫应答导向CD8+型应答(其中多表位被导向细胞质空间)或导向CD4+型应答(其中多表位被导向内吞体/溶酶体区室)的设想的组合物。此外，应当认识到通常经由MHC-I途径呈递的多表位可以经由MHC-II途径呈递(并因此模拟新表位的交叉呈递)。因此，应当理解，可以使用合适的序列元件设计新表位和多表位序列并将其导向一个或两个MHC呈递途径。关于将这样表达的新表位送到所希望的MHC系统，应注意，MHC-I呈递的肽将通常通过蛋白酶体加工从细胞质中产生并通过内质网递送。因此，如在下文中更详细讨论的，旨在用于MHC-I呈递的表位的表达将通常被导向细胞质。在其他方面，MHC-II呈递的肽将通常在递送至细胞膜之前经由酸性蛋白酶(例如，豆荚蛋白、组织蛋白酶L和组织蛋白酶S)的降解和加工自内吞体和溶酶体区室而产生。
此外，设想的表达构建体(例如，重组病毒表达载体或质粒)可以进一步编码至少一种、更典型地至少两种、甚至更典型地至少三种、并且最典型地至少四种共刺激分子，以增强感染的细胞(例如，抗原呈递细胞)和T细胞之间的相互作用。例如，适合的共刺激分子包括CD80、CD86、CD30、CD40、CD30L、CD40L、ICOS-L、B7-H3、B7-H4、CD70、OX40L、4-1BBL，而具有较少定义的(或理解的)作用机制的其他刺激分子包括GITR-L、TIM-3、TIM-4、CD48、CD58、TL1A、ICAM-1、LFA3和SLAM家族成员。然而，用于与癌症相关序列协同表达的特别优选的分子包括CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD54(ICAM-1)和CD11(LFA-1)。除共刺激分子之外，诸位发明人还预期可以从重组核酸表达一种或多种细胞因子或细胞因子类似物，并且特别优选的细胞因子和细胞因子类似物包括IL-2、IL-15和IL-a5超激动剂(ALT-803)。此外，应当理解，共刺激分子和/或细胞因子的表达将优选地是协同的，使得新表位或多表位与一种或多种共刺激分子和/或细胞因子同时表达。因此，典型地设想从单个转录物(其可以包括或可以不包括编码多表位的序列部分)例如使用内部核糖体进入位点或2A序列、或从多个转录物产生共刺激分子和/或细胞因子。
同样，设想的表达构建体还可包括编码与检查点受体结合的一种或多种肽配体的序列部分。最典型地，结合将抑制或至少减少经由受体的信号传导，并且特别设想的受体包括CTLA-4(尤其是针对CD8+细胞)、PD-1(尤其是针对CD4+细胞)、TIM1受体、2B4和CD160。例如，适合的肽结合剂可包括特异性结合受体的抗体片段以及尤其是scFv，还有小分子肽配体(例如，经由RNA展示或噬菌体淘选分离)。再次，应当理解，肽分子的表达将优选地是协同的，使得新表位或多表位与一种或多种肽配体同时表达。因此，典型地设想从单个转录物(其可以包括或可以不包括编码多表位的序列部分)例如使用内部核糖体进入位点或2A序列、或从多个转录物产生肽配体。
应当理解，上述所有的共刺激基因和编码干扰/下调检查点抑制的抑制蛋白的基因是本领域熟知的，并且这些基因、同种型和变体的序列信息可以从各种公共资源(包括在NCBI、EMBL、GenBank、RefSeq等可访问的序列数据库)检索。此外，尽管上述示例性刺激分子优选以在人中表达的全长形式表达，但是经修饰的和非人形式也被认为是适合的，只要此类形式有助于刺激或激活T细胞。因此，本文明确设想了截短形式和嵌合形式的突变蛋白。
最典型地，所期望的核酸序列(用于从病毒感染的细胞表达)在本领域熟知的合适调节元件的控制下。例如，适合的启动子元件包括组成型强启动子(例如，SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK、CAGG启动子)，但诱导型启动子也被认为适合用于本文，特别是在对于肿瘤微环境典型的诱导条件下。例如，诱导型启动子包括对缺氧敏感的启动子和对TGF-β或IL-8敏感的启动子(例如，经由TRAF、JNK、Erk，或其他应答元件启动子)。在其他实例中，适合的诱导型启动子包括四环素-诱导型启动子、粘病毒抗性1(Mx1)启动子等。
含有抗原序列和另外的功能元件的示例性病毒构建体描述在2018年4月23日提交的PCT/US 18/28889中。
应该意识到，取决于特定病毒和治疗目的，合适的宿主细胞(即，重组病毒感染或核酸转染的细胞)可以是相当不同的。然而，通常设想宿主细胞是真核生物，更典型地是哺乳动物细胞。当这样的细胞被用于治疗，优选宿主细胞对受体而言是自体的或至少HLA相容的(例如，匹配至少4位的至少一种HLA型的)。另一方面，合适的宿主细胞也包括非匹配的细胞或不然是同种异体的细胞，在这样的非匹配或同种异体细胞是治疗细胞(例如，同种异体干细胞、NK92细胞等)的情况下尤其如此。此外，应该注意的是，这些宿主细胞是现有组织的一部分、彼此分开、或在原代或传代细胞培养中培养。
例如，合适的宿主细胞包括哺乳动物和尤其是人类细胞(优选是自体的)。如之前注意的，应该认识到，这些用于病毒感染的宿主细胞不必有相应的病毒进入蛋白(例如，如CXADR)。因此，合适的宿主细胞尤其包括各种血细胞，尤其是免疫感受态细胞(如树突细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、单核细胞等)。另一方面，在病毒感染是在组织上发生的情况下，优选的宿主细胞包括各种上皮细胞。因此，应该认识到宿主细胞可在体外或体内与重组病毒(或重组DNA或RNA)接触。
相对于合适的非宿主细胞，通常设想非宿主细胞是属于除了宿主细胞物种以外的物种的细胞。然而，在非宿主细胞是属于与宿主细胞物种相同物种的细胞的情况下，设想非宿主细胞将展示一个或多个应激或危险信号(例如，其可通过放射或暴露于化学治疗剂等以触发NKG2DL的表达、应激标记、促凋亡标记等来实现)。然而，最典型地设想合适的非宿主细胞是细菌细胞和/酵母细胞(可能是或可能不是致病性的)。
例如，设想细菌细胞包括被修饰为不具有脂多糖的表达或具有减少的脂多糖的表达，否则将触发免疫应答并引起内毒素应答，其可导致潜在的致命败血症(例如，CD-14介导的败血症)。因此，具有修饰的脂多糖的一种示例性细菌菌株包括BL21(DE3)电感受态细胞。该细菌菌株是BL21，具有基因型F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm lon λ(DE3[lacI lacUV5-T7基因1 ind1 sam7 nin5])msbA148ΔgutQΔkdsDΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptA。在这种情况下，应该理解，几个特定的缺失突变(ΔgutQΔkdsDΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptA)编码LPS对脂质IVA的修饰，而一个另外的补偿突变(msbA148)使细胞能够在LPS前体脂质IVA存在下保持活力。这些突变导致寡糖链从LPS缺失。更具体地，六条酰基链中的两条发生缺失。LPS的六条酰基链是触发物，由与髓样分化因子2(MD-2)复合的Toll样受体4(TLR4)识别，从而引起/>的激活和促炎细胞因子的产生。仅含有四条酰基链的脂质IVA不被TLR4识别，并因此不会触发内毒素应答。尽管提供电感受态BL21细菌作为实例，诸位发明人设想经遗传修饰的细菌也可以是化学感受态细菌。
可替代地，诸位发明人还设想了患者自身的内共生细菌可以用作非宿主细胞。如本文所使用的，患者的内共生细菌是指存在于患者体内的细菌，而与患者的健康状况无关，没有引起任何实质性的免疫应答。因此，设想患者的内共生细菌是患者的正常菌群。例如，患者的内共生细菌可以包括通常在人的肠或胃中发现的大肠杆菌或链球菌属(Streptococcus)细菌。在这些实施例中，患者自身的内共生细菌可以获得自来自肠、胃、口腔粘膜或结膜的一部分的活检样品、或获得自粪便样品。然后可以在体外培养患者的内共生细菌，并用编码一种或多种人疾病相关抗原的核苷酸转染。在仍进一步设想的方面，细菌非宿主细胞也可以是致病性细胞，包括百日咳杆菌和/或牛分枝杆菌。最典型地但非必须地，细菌非宿主细胞在暴露于宿主细胞之前将被杀灭。
类似地，有许多适用于本发明的酵母菌株，最典型的非致病性酵母包括酿酒酵母、布拉迪酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母、星状假丝酵母等。如上提到的，可以对这些酵母菌株进行进一步的遗传修饰以减少一种或多种不良性状、和/或表达进一步增加病毒感染性和/或表达的重组蛋白。设想的酵母菌株通常是可商购的，并且可以使用本领域众所周知的方案进行修饰。
尽管不通过任何特定的理论或假设来限制本发明的主题，但是诸位发明人设想非宿主细胞的一种或多种组分可以充当危险或破坏信号，特别是在宿主细胞是免疫感受态细胞的情况下。因此，诸位发明人不仅设想使用非宿主细胞本身，而且设想其一个或多个免疫刺激部分。因此，尤其设想的部分包括PAMP受体的配体、DAMP受体的配体、TLR配体、CpG、ssDNA和毒胡萝卜素。
关于非宿主细胞相对于宿主细胞的比例，应该认识到，取决于宿主细胞的类型、非宿主细胞的类型(或其元件)、和病毒(或DNA/RNA)，准确比例可以是相当不同的。然而，通常优选宿主细胞相对于非宿主细胞的比例是1:1至约1:100、或1:10至约1:1,000、或1:50至约1:5,000、或1:100至约1:10,000，在免疫感受态细胞是宿主细胞且细菌细胞是非宿主细胞的情况下尤其如此。相似地，设想宿主细胞相对于非宿主细胞的比例包括100:1至约10:1、或1:1至约1:10、或1:50至约1:500、或1:100至约1:1000，在免疫感受态细胞是宿主细胞且酵母细胞是非宿主细胞的情况下尤其如此。
在非宿主细胞存在时，宿主细胞在重组病毒(或DNA/RNA)中的暴露可以是相当不同的。然而，通常设想暴露时间是在几分钟到几小时之间，或几小时到几天之间。例如，在体外进行暴露时，暴露时间是在10分钟到2小时之间、或在30分钟到4小时之间、或在60分钟到6小时之间、或在2小时到8小时之间、或在6小时到12小时之间、或在12小时到24小时之间、或在24小时到48之间、或甚至更长。另一方面，在体内(例如，经由疫苗配制品)进行暴露时，暴露时间是在60分钟到6小时之间、或在6小时到12小时之间、或在12小时到24小时之间、或在24小时到48之间、或甚至更长。在这样的疫苗接种方案中，典型地设想宿主细胞、非宿主细胞、和重组病毒(或DNA或RNA)是在相同配制品中共同施用的。
因此，发明人设想典型地配制用于注射或吸入的各种疫苗配制品。此外，设想疫苗配制品还包括另外的佐剂，如下文进一步所述。最典型地，设想疫苗配制品包括非宿主细胞(优选地辐照的或以其他的方式使其不能分裂或复制)和如上所述的重组病毒。一般来说，病毒的剂量可以是相当不同的，然而，通常优选地是每个疫苗剂量具有至少106、至少107、至少、108、至少109、或至少1010个病毒颗粒。同样的，非宿主细胞的数量也非常地不同。然而，通常优选地是每个疫苗剂量具有至少103-5、至少105-7、至少107-9、至少109-11、或至少1012个非宿主细胞，对于细菌非宿主细胞具有较高计数，对于酵母非宿主细胞具有较低计数。
相对于另外的佐剂，设想所有已知的佐剂可与本文呈现的教导结合。因此，设想另外的佐剂包括各种无机化合物如明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙氢氧化物(calciumphosphate hydroxide)、矿物油、尤其是石蜡油。还合适的佐剂包括小分子化合物(如角鲨烯)以及各种细菌产品(如杀灭的细菌百日咳杆菌、牛分枝杆菌类毒素等)。
例如，在重组病毒包括腺病毒(尤其是E1和E2b删除的AdV)的情况下，设想重组病毒可与大肠杆菌clearcoli组合且配制成药物组合物的中治疗性疫苗，典型地为无菌注射组合物，具有每剂量单位在106-1013个病毒颗粒之间和更典型地在109-1012个病毒颗粒之间的病毒滴度，和每剂量单位在105-107之间的细菌细胞和更典型地在106-1011之间的细菌细胞。可替代地，病毒可以用于在非宿主细胞存在下、离体感染患者(或其他HLA匹配的)细胞，并且然后将如此感染的细胞输注给患者。
在需要时，可以采用基于新表位的(例如，如WO 2016/172722中所述针对新表位的合成抗体)，单独地或与自体或同种异体NK细胞、并且尤其是haNK细胞或taNK细胞(例如，二者均可从NantKwest公司，9920杰弗逊大街卡尔弗城(Jefferson Blvd.Culver City)，加利福尼亚州90232商购)组合的另外的治疗模式。在采用haNK或taNK细胞的情况下，特别优选的是，haNK细胞在CD16变体上携带与所治疗的患者的新表位结合的重组抗体，并且在采用taNK细胞的情况下，优选的是taNK细胞的嵌合抗原受体与所治疗的患者的新表位结合。另外的治疗模式还可以不依赖新表位，并且尤其优选的模式包括基于细胞(例如激活的NK细胞(例如，aNK细胞，可从NantKwest公司，9920杰弗逊大街卡尔弗城，加利福尼亚州90232商购))的疗法；以及非基于细胞的疗法(例如，化学疗法和/或放射疗法)。在仍进一步设想的方面，可以单独地或与一种或多种检查点抑制剂(例如，伊匹木单抗、纳武单抗等)组合施用免疫刺激细胞因子(并且尤其是IL-2、IL15和IL-21)。类似地，仍进一步设想，另外的药物干预可以包括施用一种或多种抑制免疫抑制性细胞(并且尤其是MDSC、Treg和M2巨噬细胞)的药物。因此，适合的药物包括IL-8或干扰素-γ抑制剂或结合IL-8或干扰素-γ的抗体；以及使MDSC失活的药物(例如，NO抑制剂、精氨酸酶抑制剂、ROS抑制剂)；阻断细胞发育或分化为MDSC的药物(例如，IL-12、VEGF抑制剂、双膦酸盐)；或对MDSC有毒性的药剂(例如，吉西他滨、顺铂、5-FU)。同样，可以使用诸如环磷酰胺、达利珠单抗和抗GITR或抗OX40抗体的药物来抑制Treg。
为了触发应力信号的过表达或转录，还设想可以使用低剂量方案，优选以节律的方式对患者进行化学疗法和/或放射。例如，通常优选这样的治疗将使用有效影响蛋白质表达、细胞分裂和细胞周期中至少一种的剂量，优选诱导细胞凋亡或至少诱导或增加应激相关基因的表达(并且特别是NKG2D配体)。因此，在另外设想的方面，这种治疗将包括使用一种或多种化学治疗剂的低剂量治疗。最典型地，针对化学治疗剂，低剂量治疗的暴露量将是LD50或IC50的等于或小于70％、等于或小于50％、等于或小于40％、等于或小于30％、等于或小于20％、等于或小于10％、或等于或小于5％。另外地，在有利的情况下，这种低剂量方案可以按如例如在US 7758891、US 7771751、US 7780984、US 7981445和US 8034375中所述的节律方式进行。
关于在这种低剂量方案中使用的特定药物，设想所有化学治疗剂都被视为是合适的。在其他适合的药物中，激酶抑制剂、受体激动剂和拮抗剂、抗代谢药物、细胞抑制剂和细胞毒性药物在本文中均有设想。然而，特别优选的药剂包括那些被鉴定为干扰或抑制驱动肿瘤生长或发育的途径组分的药剂。可以使用例如WO 2011/139345和WO 2013/062505中所述的对组学数据的途径分析来鉴定适合的药物。最值得注意的是，如此获得的肿瘤细胞中应激相关基因的表达将导致NKG2D、NKP30、NKP44和/或NKP46配体的表面呈递，该表面呈递进而激活NK细胞以特异性破坏肿瘤细胞。因此，应理解可以将低剂量化学疗法用作肿瘤细胞中的触发物，以表达和展示压力相关的蛋白质，这进而将触发NK细胞激活和/或NK细胞介导的肿瘤细胞杀灭。另外地，NK细胞介导的杀灭将与细胞内肿瘤特异性抗原的释放相关联，这被认为可以进一步增强免疫应答。
因此，鉴于上述考虑和下述实例，发明人也设想了大量的用与非宿主细胞组合的重组病毒(和/或DNA/RNA)转染宿主细胞的方法，特别是转染病毒(例如，重组腺病毒)到缺乏病毒进入细胞的受体(例如，CXADR)的免疫感受态细胞(例如，树突细胞)的方法。如容易地理解的，这样的方法能在体外或体内进行，因此也代表了使用免疫疗法(例如，以治疗癌症或感染)使用重组病毒(或DNA/RNA)和非宿主细胞治疗患者的方法。从不同角度看，发明人设想了在宿主细胞中使用重组病毒(或DNA/RNA)和非宿主细胞(如上文所述和下文所示)增加重组抗原表达的方法。以如前所述，重组病毒在非宿主细胞存在下被用于离体或体内感染患者(或非患者)细胞。例如，可以皮下或静脉内注射病毒和非宿主细胞，或可以经鼻内或经吸入施用以此感染患者的细胞(并且尤其是抗原呈递细胞)。可替代地，可以在体外感染患者(或来自同种异体来源)的免疫感受态细胞(例如，NK细胞、T细胞、巨噬细胞、树突细胞等)，并然后输送进患者。
实例
在第一批实验中，诸位发明人使用树突细胞作为重组腺病毒AdV5构建体(包括编码GFP(绿色荧光蛋白)的序列部分)的宿主细胞。大肠杆菌Clearcoli BL21菌株(商购于Lucigen公司，帕门特街2905(Parmenter)，米德尔顿(Middleton)，威斯康星州53562，美国)以相对于树突细胞的不同比例用作非宿主细胞佐剂。在共孵育(使用合适的对照)后，分析树突细胞的GFP表达，且三种样品的示例性结果如图1所示。从图表中可以很容易看出(上排，DC)，树突细胞自身基本上没有可归因于GFP的可测量荧光。树突细胞与重组腺病毒AdV5构建体(第二排，+AdV-GFP)孵育时，观察到了一些荧光。重组腺病毒AdV5构建体进入到树突细胞的病毒进入推测是经由内吞作用或独立于CXADR的其他机制实现的。在重组腺病毒AdV5构建体(第三排，+大肠杆菌)不存在时，向树突细胞添加大肠杆菌Clearcoli BL21再次导致没有可测量的大量荧光。相反，在重组腺病毒AdV5构建体与大肠杆菌Clearcoli BL21共孵育时，观察到了显著和实质的摄取和表达增加(第四排，+AdV-GFP&大肠杆菌)。上述实验的结果的数据分析如图2中的图表所示。
人单核细胞来源的树突细胞的体外培养。人单核细胞来源的树突细胞(MoDC)在体外与重组人GM-CSF(200U/ml)和重组人IL-4(100U/ml)组合72-96h产生(参见Sieling等人，Evidence for Human CD4+T Cells in the CD1-Restricted Repertoire:Derivation ofMycobacteria-Reactive T Cells from Leprosy Lesions[CD1限制性库中CD4+T细胞的证据：源自麻风病灶的分枝杆菌反应性T细胞]J Immunol[免疫学杂志]2000 1644790)。在PBS/EDTA(0.5mM)中孵育收获细胞以分离黏附细胞并且通过流式细胞术分析CD1表达。在1000至1(病毒比MoDC)的感染复数(MOI)下，将MoDC用含有GFP的Adv5感染，并培养24h以允许感染和基因表达的发生。在某些情况下，大肠杆菌Clearcoli BL21(MOI＝800)与Adv同时被添加到培养物中。在24h培养后，使用PBS/EDTA收获细胞并使用流式细胞术评估GFP表达。一式三份制备培养物以建立平均值。使用学生T检验确定组间差异的显著性(p<0.05)。
使用实质上相似的实验方法，更详细的分析如图3所示，其中使用不同比例的树突细胞和大肠杆菌来确定感染和表达强度。从结果很容易看出，重组腺病毒AdV5构建体不存在(无AdV)下，获得0％的荧光阳性树突细胞。无大肠杆菌但具有重组腺病毒AdV5构建体，29.8％的树突细胞显示荧光。值得注意的是，在大肠杆菌作为佐剂以超过两个对数单位(1.6e5->1.6e7)的递增的量存在下，荧光极大增加(72.4％->85.9％)。这样的增加是出乎意料的且大量的。图3的图表(左下)显示每20,000个树突细胞的转染随大肠杆菌细胞的增加而增加。甚至更令人惊讶的是发现不仅感染率在增加的大肠杆菌计数下大量增加，而且在DC区域通过平均荧光强度测量的重组GFP的表达强度也极大增加，如图表(右下)所示。这样的结果也特别令人惊讶，因为树突细胞缺乏CXADR和因为通过其他机制增加的摄取将表明蛋白质降解的增加(即降低的GFP)。
如上所述制备单核细胞来源的树突细胞。将MoDC(2×105)用表达GFP的Adv5感染(MOI-1000)，并在培养物中保持24h。在用Adv感染的24h期间以增加的量(1.6×105至1.6×107)添加大肠杆菌Clearcoli BL21，以确定大肠杆菌的存在是否提高了GFP表达的水平。在24h培养后，使用PBS/EDTA收获细胞并使用流式细胞术评估GFP表达。一式三份制备培养物以建立平均值。使用学生T检验确定组间差异的显著性(p<0.05)。
为了证实摄取和表达度的这样的增加也能使用非宿主细胞(除大肠杆菌外)实现，发明人进行了一系列实质上与图3的实验相似但使用酿酒酵母作为非宿主细胞的实验。示例性结果如图4所示。从结果很容易看出，重组腺病毒AdV5构建体不存在(无AdV)下，获得0％的荧光阳性树突细胞。无酿酒酵母但具有重组腺病毒AdV5构建体，29.8％的树突细胞显示荧光。值得注意的是，在酿酒酵母作为佐剂以超过两个对数单位(2.0e3->2.0e5)的递增的量存在下，在所有的实验中荧光都极大增加，但不是线性的(74.3％->69.0％)。同样，这样的增加是出乎意料的且大量的。图4的图表(左下)显示每20,000个树突细胞的转染随酿酒酵母细胞的增加而增加。与大肠杆菌相似，在DC区域通过平均荧光强度测量的重组GFP的表达强度显著增加，如图表所示(右下)。
如上所述制备单核细胞来源的树突细胞。将MoDC(2×105)用表达GFP的Adv5感染(MOI-1000)，并在培养物中保持24h。在用Adv感染的24h期间以增加的量(2.0×103至2.0×105)添加酿酒酵母，以确定酿酒酵母的存在是否提高了GFP表达的水平。在24h培养后，使用PBS/EDTA收获细胞并使用流式细胞术评估GFP表达。一式三份制备培养物以建立平均值。使用学生T检验确定组间差异的显著性(p<0.05)。
图5和图6描述以图3和图4中描述的比例组合的树突细胞与重组腺病毒AdV5构建体的FACS扫描。这些数据不是活力的直接测量值，而是近似值。例如，在图6(酿酒酵母(S.cerv)加Adv-GFP)中，随着酿酒酵母增加，在围起区域中的细胞的％从34％稳定降低至0.16％。同时，点图的左下部分中的区域增加。左下角的事件表明细胞死亡。在大肠杆菌Clearcoli BL21(1.6×105至1.6×107)存在或不存在时，通过流式细胞术评估MoDC的Adv-GFP感染(MOI＝1000)。点图显示有代表性的(1/3)正向(细胞尺寸)和侧向(细胞内颗粒)散射特性。
在仍进一步的实例中，诸位发明人检查除了上述之外的佐剂组合物，图7描述了示例性工作流程。简而言之，产生人单核细胞来源的树突细胞(MoDC)并在各种所示佐剂(大肠杆菌BL21、BCG(卡介苗，减毒)、非靶向纳米颗粒、polyI:C、和polyU)存在下用编码GFP的重组AdV5病毒以1000MOI进行感染。在孵育24小时后，测量绿色荧光并确定细胞活力。
从图8可以看出，在转染活性和转染细胞活力方面，大肠杆菌都是特别成功的佐剂。值得注意的是，尽管低浓度BCG在转染活性和活力方面都有效，但较高的浓度似乎降低转染和活力。类似地，分离的TLR配体(polyI:C和polyU)和纳米颗粒(有或没有pU/pI:C)与仅ADV对照相比，测试的所有比例都具有很小的影响。图9说明如以上所示的这些实验条件各自运行的示例性FACS结果。再一次地，降低的BCG浓度具有显著的刺激效果。为了进一步调查BCG作为潜在佐剂在高浓度下的毒性，诸位发明人进行了进一步的FACS研究，该研究确定了潜在毒性，如图10所示。因此，应该注意的是用Ad5-GFP转导的BL21(空载体)在DC中产生最高的％GFP表达和MFI，高于5:1的MOI时BCG可能有毒，导致Ad5-GFP转导效率(GFP表达)的降低。
为了评估低浓度下BCG的有效性，诸位发明人于是测试了低MOI下的BCG，如图11所示。出乎意料地，从FACS结果中很容易地看出，甚至与大肠杆菌相比时，低MOI(对于BCG)具有优异的效果。有利地，低剂量BCG的佐剂效果没有负面影响表达水平，如从图12可见。
因此，值得赞赏的是基于细胞的佐剂显示比纳米颗粒或单独TLR配体刺激更优异的效果。因此，设想活细胞或减毒细胞、或辐照的(或以其他的方式杀灭的)细胞可以提供已知或未知的组分的协同组合，这些组分刺激重组DNA在病毒载体或其他重组系统(例如，重组细菌或酵母)中的摄取和/或表达。这样的发现特别值得注意，因为预期佐剂增加疫苗中所有组分的降解及加工和免疫呈递，这可导致重组有效载荷的破坏。然而，与此相反，本文提出的细胞佐剂增加重组有效载荷的更新和表达。同样的，设想的组合物和方法有助于改进疫苗配制品、和特别地重组病毒、细菌、和酵母疫苗组合物。
如本文所使用的，术语“施用”药物组合物或药物是指直接和间接施用药物组合物或药物，其中直接施用药物组合物或药物典型地通过健康护理专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括向健康护理专业人员提供药物组合物或药物或使健康护理专业人员可用药物组合物或药物以用于直接施用(例如，经由注射、输注、口服递送、局部递送等)。最优选地，重组病毒经由皮下或真皮下注射施用。然而，在其他设想的方面，施用还可以是静脉内注射。可替代地或另外地，可以从患者的细胞中分离抗原呈递细胞或使其生长，在体外感染，并然后输送至患者。因此，应理解，可以将设想的系统和方法视为用于高度个性化癌症治疗的完整药物发现系统(例如，药物发现、治疗方案、验证等)。
本文中对值的范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非在本文中另有说明，将每个单独的值并入说明书中，如同其在本文中单独引用一样。本文所述的所有方法都能够以任何合适的顺序进行，除非本文另外指示或另外与上下文明显矛盾。关于本文某些实施例而提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外，更多修改是可能的。因此，本发明主题仅受限于所附权利要求的范围。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含”(“comprises”和“comprising”)应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在说明书权利要求书提及选自由A、B、C……和N组成的组的某物的至少一种的情况下，该文字应当被解释为只需要该组中的一个要素，而不是A加N、或B加N等。

Claims (29)

1.一种增加重组抗原在宿主细胞中的表达的方法，该方法包括：
提供腺病毒，该腺病毒的病毒基因组具有包括在其中的、编码抗原的重组序列，其中该序列可操作地连接到启动子上以驱动该抗原在宿主细胞中的表达；
提供选自大肠杆菌细胞和酿酒酵母细胞的非宿主细胞；以及
在允许将该腺病毒摄取到该宿主细胞和允许在该宿主细胞表达该重组序列的条件下，将该宿主细胞同时暴露于该腺病毒和非宿主细胞，并且其中与将该宿主细胞仅暴露于该腺病毒相比，该腺病毒摄取到该宿主细胞中和/或该重组序列在该宿主细胞中的表达增加。
2.如权利要求1所述的方法，其中，该非宿主细胞是ΔLPS-大肠杆菌细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中该非宿主细胞是酿酒酵母细胞。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该抗原包括患者和肿瘤特异性新表位或肿瘤相关抗原。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该同时暴露步骤在体内进行。
6.如权利要求5所述的方法，其中该体内步骤使用包含该腺病毒和该非宿主细胞的疫苗组合物。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该同时暴露步骤在体外进行。
8.双组分疫苗配制品在制备用于使用免疫疗法治疗患者的药物中的用途，其中该疫苗配制品具有佐剂组分和治疗组分；
其中，该治疗组分包含腺病毒，该腺病毒的病毒基因组具有包括在其中的、编码抗原的重组序列，其中该序列可操作地连接到启动子上以驱动该抗原在该患者的细胞中的表达；以及
其中，该佐剂组分包含选自大肠杆菌细胞和酿酒酵母细胞的非宿主细胞，并且其中与将该患者的细胞仅与该腺病毒接触相比，该腺病毒摄取到该患者的细胞中和/或该重组序列在该患者的细胞中的表达增加。
9.如权利要求8所述的用途，其中该非宿主细胞是ΔLPS-大肠杆菌细胞。
10.如权利要求8所述的用途，其中该非宿主细胞是酿酒酵母细胞。
11.如权利要求8-10中任一项所述的用途，其中该抗原包括患者和肿瘤特异性新表位或肿瘤相关抗原。
12.如权利要求8-11中任一项所述的用途，其中该治疗包括该双组分疫苗的注射。
13.如权利要求12所述的用途，其中该双组分疫苗包含ΔLPS-大肠杆菌和酿酒酵母中的至少一种以及腺病毒。
14.一种将腺病毒转染进免疫感受态细胞中的方法，该免疫感受态细胞缺乏该腺病毒进入该细胞的受体，该方法包括：
在允许将该腺病毒摄取到该细胞的条件下，将该免疫感受态细胞同时暴露于该腺病毒和选自大肠杆菌细胞和酿酒酵母细胞的非宿主细胞；
其中该腺病毒具有包括编码抗原的重组序列的病毒基因组，其中该序列可操作地连接到启动子上以驱动该抗原在该免疫感受态细胞中的表达；以及
其中与将该免疫感受态细胞仅与腺该病毒接触相比，该腺病毒摄取到该免疫感受态细胞中和/或该重组序列在该免疫感受态细胞中的表达增加。
15.如权利要求14所述的方法，其中该免疫感受态细胞是树突细胞、巨噬细胞、或B淋巴细胞。
16.如权利要求14所述的方法，其中该腺病毒是Ad5[E1-,E2b-]病毒。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中该受体是CXADR受体。
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中该同时暴露步骤在体内进行。
19.如权利要求18所述的方法，其中该体内步骤使用包含该腺病毒和该非宿主细胞的疫苗组合物。
20.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中该同时暴露步骤在体外进行。
21.如权利要求14-20中任一项所述的方法，其中该非宿主细胞是ΔLPS-大肠杆菌。
22.如权利要求14-20中任一项所述的方法，其中该非宿主细胞是酿酒酵母细胞。
23.一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含：
佐剂组分和治疗组分；
其中，该治疗组分包含腺病毒，该病毒的病毒基因组具有包括在其中的、编码抗原的重组序列，其中该序列可操作地连接到启动子上以驱动该抗原在该患者的细胞中的表达；以及
其中，该佐剂组分包含选自大肠杆菌细胞和酿酒酵母细胞的非宿主细胞，并且其中该佐剂组分增加该腺病毒摄取到免疫感受态细胞中和/或该重组序列在该免疫感受态细胞中的表达。
24.如权利要求23所述的疫苗组合物，其中该腺病毒是重组Ad5[E1-,E2b-]病毒。
25.如权利要求23-24中任一项所述的疫苗组合物，其中该抗原包括患者和肿瘤特异性新表位或肿瘤相关抗原。
26.如权利要求23-25中任一项所述的疫苗组合物，其中该非宿主细胞是ΔLPS-大肠杆菌细胞。
27.如权利要求23-26中任一项所述的疫苗组合物，其中该非宿主细胞是酿酒酵母细胞。
28.如权利要求23所述的疫苗组合物，其中该组合物被配制成用于注射。
29.如权利要求23-28中任一项所述的疫苗组合物在制备用于癌症或感染性疾病的治疗的药物中的用途。
CN201980031529.0A 2018-08-10 2019-08-09 用于病毒感染的细胞佐剂 Active CN112423786B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862717560P 2018-08-10 2018-08-10
US62/717560 2018-08-10
PCT/US2019/045977 WO2020033876A1 (en) 2018-08-10 2019-08-09 Cellular adjuvants for viral infection

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112423786A CN112423786A (zh) 2021-02-26
CN112423786B true CN112423786B (zh) 2024-03-22

Family

ID=69415666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980031529.0A Active CN112423786B (zh) 2018-08-10 2019-08-09 用于病毒感染的细胞佐剂

Country Status (4)

Country Link
US (2) US11298414B2 (zh)
EP (1) EP3737411A4 (zh)
CN (1) CN112423786B (zh)
WO (1) WO2020033876A1 (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101321781A (zh) * 2005-11-30 2008-12-10 哥本哈根大学 一种核苷酸疫苗
CN108135991A (zh) * 2015-07-27 2018-06-08 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 新型腺病毒

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6121043A (en) * 1985-09-06 2000-09-19 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys comprising a foreign DNA inserted into a non-essential region of the herpesvirus of turkeys genome
CA2200835A1 (en) * 1994-09-23 1996-03-28 Frederick M. Boyce Use of a non-mammalian dna virus to express an exogenous gene in a mammalian cell
EP2798069B1 (en) 2011-12-15 2017-03-29 Washington University Porcine knob xenotype chimeric adenoviral vector for dendritic cell infection
SG11201606625RA (en) * 2014-02-14 2016-09-29 Immune Design Corp Immunotherapy of cancer through combination of local and systemic immune stimulation

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101321781A (zh) * 2005-11-30 2008-12-10 哥本哈根大学 一种核苷酸疫苗
CN108135991A (zh) * 2015-07-27 2018-06-08 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 新型腺病毒
CN108367061A (zh) * 2015-07-27 2018-08-03 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于诱导免疫应答的新方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Baker’s Yeast Sensitizes Metastatic Breast Cancer Cells to Paclitaxel In Vitro;Nariman K. Badr El-Din等;《Integrative Cancer Therapies》;第17卷(第2期);第542-550页 *
Combined bacterial and viral treatment: a novel anticancer strategy;Marcin P. Krzykawski;《Central European Journal of Immunology》;第40卷(第3期);第366-372页 *
Construction of Escherichia coli Mutant with Decreased Endotoxic Activity by Modifying Lipid A Structure;Qiong Liu等;《marine drugs》;第13卷;第3388-3406页 *
Expression of a foreign epitope on the surface of the adenovirus hexon;Janet Crompton等;《Journal of General Virology》;第75卷;第133-139页 *
Flagellin FljB as an adjuvant to the recombinant adenovirus rabies glycoprotein vaccine increases immune responses against rabies in mice;Xingxing Xiao等;《Arch Virol》;第162卷;第2655-2665页 *
MucosalSIVvaccinescomprisinginactivatedvirusparticlesandbacterialadjuvantsinduceCD8CT-regulatorycellsthatsuppressSIV-positiveCD4CT-cellactivationandpreventSIVinfectioninthemacaquemodel;Jean Marie Andrieu等;《frontiers In immunology》;第5卷;Article297 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3737411A1 (en) 2020-11-18
US11298414B2 (en) 2022-04-12
US20200101149A1 (en) 2020-04-02
EP3737411A4 (en) 2022-01-05
CN112423786A (zh) 2021-02-26
WO2020033876A1 (en) 2020-02-13
US20220370587A1 (en) 2022-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2021192630A (ja) 生体分子の免疫細胞への送達
Shahabi et al. Development of a Listeria monocytogenes based vaccine against prostate cancer
CN110520438A (zh) 溶瘤病毒疗法
Panagioti et al. Immunostimulatory bacterial antigen–armed oncolytic measles virotherapy significantly increases the potency of anti-PD1 checkpoint therapy
CA3015818A1 (en) Recombinant mva or mva.delta.e3l expressing human flt3l and use thereof as immuno-therapeutic agents against solid tumors
JP2022092001A (ja) 樹状細胞免疫療法
US10597731B2 (en) Allogeneic autophagosome-enriched composition for the treatment of disease
US11590217B2 (en) Neoepitope vaccine and immune stimulant combinations and methods
Zawit et al. Current status of intralesional agents in treatment of malignant melanoma
VanOosten et al. Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy
Pandya et al. The future of cancer immunotherapy: DNA vaccines leading the way
CN109937051A (zh) 治疗tim-3升高的方法
AU2018318125B2 (en) Hank cetuximab combinations and methods
CN112423786B (zh) 用于病毒感染的细胞佐剂
CA3028168C (en) Compositions and methods for activating antigen presenting cells with chimeric poliovirus
Martinez-Perez et al. Long-term antigen-specific immune response by an oncolytic adenovirus encoding SP-SA-E7-4-1BBL in HPV-16 cancer model
Tang Immunotherapy for murine glioma
KR20220116191A (ko) 4-1bbl 아쥬반트화 재조합 변형 백시니아 바이러스 앙카라 (mva)의 의약적 용도
Weiss et al. P06. 08. A CLINICAL OUTCOME AND TRANSLATIONAL INSIGHTS FROM A PHASE I/II TRIAL WITH THE TUMOR-TARGETING ANTIBODY-CYTOKINE FUSION PROTEIN L19TNF FOR PATIENTS WITH RECURRENT GLIOBLASTOMA
Denies Cancer immunotherapy: tumor vaccination, IL-12 gene therapy and metronomic chemotherapy
CN102458456A (zh) 表达胞内多核苷酸结合蛋白的载体作为佐剂的用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant