CN116113424A - 快速疫苗平台 - Google Patents

Abstract

本文提供了使用基于去核细胞的平台制备和递送疫苗组合物的方法。还提供了使用基于去核细胞的平台清除对象中病原体感染的方法。与常规生物疫苗相比，这种基于去核细胞的平台减少了疫苗开发时间线，并提高了疫苗功效。

Description

快速疫苗平台

交叉引用

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序列表

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背景技术

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)流行病及其伴随的发病率和死亡率强调了诱导保护性和持久免疫应答的安全和有效疫苗的需要。该流行病还显示出满足紧急医疗需要，例如冠状病毒病2019(COVID-19)的广泛传播的世界各地常规疫苗开发管线的严重缺陷。存在对一种新的疫苗开发平台的迫切和未满足的需要，其能够缩短安全有效的疫苗和治疗剂的上市时间，以治疗由快速发展的病原体如SARS-CoV-2引起的疾病或病症。

发明内容

在一些实施方案中，本文描述了一种无细胞核的细胞，该无细胞核的细胞包含：一种或多种细胞内细胞器，所述细胞器用于在不存在细胞核的情况下合成或分泌抗病原体的疫苗。在一些实施方案中，病原体是病毒。在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒。在一些实施方案中，SARS冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。在一些实施方案中，病毒是溶瘤病毒。在一些实施方案中，病原体是细菌。在一些实施方案中，细菌是炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌属(Shigella)、鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鹦鹉热衣原体、贝氏考克斯菌(Coxiella burnetii)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、霍乱弧菌或微小隐孢子虫或其任何组合。在一些实施方案中，病原体是毒素。在一些实施方案中，毒素是肉毒梭菌毒素、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B或来自蓖麻的蓖麻毒素或其任何组合。在一些实施方案中，一种或多种细胞内细胞器是内质网或高尔基体。在一些实施方案中，疫苗偶联至无细胞核的细胞的表面。在一些实施方案中，疫苗包含将疫苗偶联至无细胞核的细胞表面的跨膜结构域。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的免疫调节剂。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含归巢受体，该归巢受体包含：(a)白细胞唾液酸蛋白(Leukosialin)；(b)L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1；(c)极晚期抗原4；(a)至(c)中任一项的一部分；或(a)至(d)的任何组合。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。在一些实施方案中，直径为约8μm。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温休眠至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温休眠至少48小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温保存至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在冻干至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被低温保存(cryopreserved)、低温休眠(cryohybernated)或冻干(lyophilized)。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被分离或纯化。在一些实施方案中，使用本文所述的台盼蓝染料排除法测量活力。在一些实施方案中，台盼蓝染料排除法通过以下方法进行：(a)离心悬浮液中的多个无细胞核的细胞的等分试样以产生细胞沉淀；(b)将细胞沉淀再悬浮于无血清培养基中以产生无血清细胞悬浮液；(c)将1份台盼蓝染料和1份无血清细胞悬浮液混合；(d)在(c)的3-5分钟内对多个无细胞核的细胞进行计数，其中多个无细胞核的细胞中的至少一些未被台盼蓝染料染色，这指示活力。在一些实施方案中，使用本文所述的膜联蛋白-5细胞表面染色测量活力。在一些实施方案中，无细胞核的细胞不是红细胞或红细胞前体。

在一些实施方案中，本文描述了一种药物制剂，其包含：本文所述的无细胞核的细胞或多个无细胞核的细胞；以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

在一些实施方案中，本文描述了一种生产疫苗的方法，该方法包括：(a)从细胞中去除细胞核以产生包含一种或多种细胞内细胞器的去核细胞(enucleated cell)，所述细胞器用于合成或分泌抗病原体的疫苗；以及(b)将编码疫苗的外源性mRNA引入去核细胞，其中去核细胞在不存在细胞核的情况下表达疫苗。在一些实施方案中，病原体是病毒。在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒。在一些实施方案中，SARS冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。在一些实施方案中，病毒是溶瘤病毒。在一些实施方案中，病原体是细菌。在一些实施方案中，细菌是炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌属(Shigella)、鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鹦鹉热衣原体、贝氏考克斯菌(Coxiella burnetii)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、霍乱弧菌或微小隐孢子虫或其任何组合。在一些实施方案中，病原体是毒素。在一些实施方案中，毒素是肉毒梭菌毒素、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B或来自蓖麻的蓖麻毒素或其任何组合。在一些实施方案中，将去核细胞储存在4℃或低于4℃以可逆地减慢或停止去核细胞的生物活性，并且随后在(b)中引入之前解冻。在一些实施方案中，将无细胞核的细胞冻干，并且随后在(b)中引入之前进行再水合。在一些实施方案中，将去核细胞储存在-120℃或低于-120℃以可逆地减慢或停止去核细胞的生物活性，并且随后在(b)中引入之前解冻。在一些实施方案中，(a)中从细胞中去除细胞核是在不分化细胞的情况下进行的。在一些实施方案中，一种或多种细胞内细胞器是内质网或高尔基体。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。在一些实施方案中，直径为约8μm。在一些实施方案中，该方法还包括在(a)中去除细胞核之前，向细胞中引入具有编码免疫调节剂的核酸序列的外源性核酸分子，免疫调节剂包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。在一些实施方案中，该方法还包括在(a)中去除细胞核之前向细胞中引入具有编码归巢受体的核酸序列的外源性核酸分子，该归巢受体包含：白细胞唾液酸蛋白；L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1；极晚期抗原4；C-X-C趋化因子受体3型；CD44抗原；C-C趋化因子受体7型；其任何一种归巢受体的一部分；或其任何一种归巢受体的任何组合。在一些实施方案中，该方法还包括向无细胞核的细胞中引入包含编码免疫调节剂的序列的外源性mRNA分子，该免疫调节剂包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。在一些实施方案中，该方法还包括向无细胞核的细胞中引入包含编码归巢受体的序列的外源性mRNA分子，该归巢受体包含：白细胞唾液酸蛋白；L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1；极晚期抗原4；C-X-C趋化因子受体3型；CD44抗原；C-C趋化因子受体7型；其任何一种归巢受体的一部分；或其任何一种归巢受体的任何组合。在一些实施方案中，无细胞核的细胞不是红细胞或红细胞前体。

在一些实施方案中，本文描述了一种向对象递送抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的疫苗的方法，该方法包括：向对象施用包含一种或多种细胞内细胞器的无细胞核的细胞，所述细胞器用于在不存在细胞核的情况下合成或分泌抗SARS-CoV-2的疫苗。在一些实施方案中，一种或多种细胞内细胞器是内质网或高尔基体。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的免疫调节剂。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含归巢受体，该归巢受体包含：白细胞唾液酸蛋白；L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1；极晚期抗原4；C-X-C趋化因子受体3型；CD44抗原；C-C趋化因子受体7型；其任何一种归巢受体的一部分；或其任何一种归巢受体的任何组合。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。在一些实施方案中，直径为约8μm。在一些实施方案中，施用包括全身施用。在一些实施方案中，无细胞核的细胞以约10³个细胞/kg体重至约10¹²个细胞/kg体重的剂量施用。在一些实施方案中，在至少1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、1天、2天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年或4年内向对象施用无细胞核的细胞两次。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，该方法还包括施用佐剂。在一些实施方案中，无细胞核的细胞不是红细胞或红细胞前体。

在一些实施方案中，本文描述了一种试剂盒，其包含：多个基本上不含细胞核的细胞，其中多个基本上不含细胞核的细胞中至少一个无细胞核的细胞包含一种或多种细胞内细胞器，所述细胞器用于在不存在细胞核的情况下合成或分泌抗病原体的疫苗；以及说明书，用于将多个基本上不含细胞核的细胞施用于对象。在一些实施方案中，多个基本上不含细胞核的细胞被低温保存、低温休眠或冻干。在一些实施方案中，试剂盒还包含说明书，用于在将多个基本上不含细胞核的细胞施用于对象之前恢复多个基本上不含细胞核的细胞的生物活性。在一些实施方案中，试剂盒还包含说明书，用于将编码疫苗的外源性mRNA引入去核细胞。

在一些实施方案中，本文描述了一种无细胞核的细胞，该无细胞核的细胞包含一种或多种细胞内细胞器，所述细胞器用于在不存在细胞核的情况下合成病原体抗原或其病原体抗原结合片段的受体，其中受体或受体的表达水平对于无细胞核的细胞是外源性的。在一些实施方案中，一种或多种细胞内细胞器是内质网或高尔基体。在一些实施方案中，病原体抗原或其病原体抗原结合片段的受体偶联至无细胞核的细胞的表面。在一些实施方案中，病原体抗原或其病原体抗原结合片段的受体在无细胞核的细胞的细胞膜内包含跨膜结构域。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含具有编码免疫调节剂或其部分的序列的外源性mRNA分子，该免疫调节剂包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。在一些实施方案中，直径为约8μm。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温休眠至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温休眠至少48小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温保存至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在冻干至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被低温保存、低温休眠或冻干。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被分离或纯化。在一些实施方案中，使用本文所述的台盼蓝染料排除法测量活力。在一些实施方案中，台盼蓝染料排除法通过以下方法进行：(a)离心悬浮液中的多个无细胞核的细胞的等分试样以产生细胞沉淀；(b)将细胞沉淀再悬浮于无血清培养基中以产生无血清细胞悬浮液；(c)将1份台盼蓝染料和1份无血清细胞悬浮液混合；(d)在(c)的3-5分钟内对多个无细胞核的细胞进行计数，其中多个无细胞核的细胞中的至少一些未被台盼蓝染料染色，这指示活力。在一些实施方案中，使用本文所述的膜联蛋白-5细胞表面染色测量活力。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被分离或纯化。在一些实施方案中，细胞还包含阻断病原体抗原与其由宿主细胞产生的天然受体之间的结合的中和抗体。在一些实施方案中，中和抗体由无细胞核的细胞的一种或多种细胞内细胞器合成。在一些实施方案中，细胞还包含：归巢受体，该归巢受体包含：白细胞唾液酸蛋白；L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1；极晚期抗原4；C-X-C趋化因子受体3型；CD44抗原；C-C趋化因子受体7型；其任何一种归巢受体的一部分；或其任何一种归巢受体的任何组合。在一些实施方案中，病原体是病毒。在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒。在一些实施方案中，SARS冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。在一些实施方案中，病毒是溶瘤病毒。在一些实施方案中，病原体是细菌。在一些实施方案中，细菌是炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌属(Shigella)、鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鹦鹉热衣原体、贝氏考克斯菌(Coxiella burnetii)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、霍乱弧菌或微小隐孢子虫或其任何组合。在一些实施方案中，病原体是毒素。在一些实施方案中，毒素是肉毒梭菌毒素、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B或来自蓖麻的蓖麻毒素或其任何组合。在一些实施方案中，疫苗是本文所述的疫苗。在一些实施方案中，无细胞核的细胞不是红细胞或红细胞前体。

在一些实施方案中，本文描述了一种减少对象中由病原体引起的感染的方法或减少感染对象过程中的病原体的方法，该方法包括：将本文所述的无细胞核的细胞或本文所述的药物制剂施用于对象，从而在细胞中捕获具有病原体抗原的病原体并阻止病原体在细胞内繁殖。在一些实施方案中，在施用后少于或等于约14天病原体从对象中清除。在一些实施方案中，无细胞核的细胞释放中和抗体或纳米抗体，从而阻断病原体的病原体抗原与其由宿主细胞产生的天然受体之间的结合。在一些实施方案中，施用包括全身施用。在一些实施方案中，无细胞核的细胞以约10³个细胞/kg体重至约10¹²个细胞/kg体重的剂量施用。在一些实施方案中，在至少1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、1天、2天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年或4年内向对象施用无细胞核的细胞两次。在一些实施方案中，病原体是病毒。在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒。在一些实施方案中，SARS冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。在一些实施方案中，病毒是溶瘤病毒。在一些实施方案中，病原体是细菌。在一些实施方案中，细菌是炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌属(Shigella)、鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鹦鹉热衣原体、贝氏考克斯菌(Coxiellaburnetii)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、霍乱弧菌或微小隐孢子虫或其任何组合。在一些实施方案中，病原体是毒素。在一些实施方案中，毒素是肉毒梭菌毒素、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B或来自蓖麻的蓖麻毒素或其任何组合。在一些实施方案中，疫苗是本文所述的疫苗。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的免疫调节剂。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含对淋巴组织中一种或多种细胞上表达的配体具有特异性的归巢受体。在一些实施方案中，归巢受体包含C-X-C趋化因子受体3型、白细胞唾液酸蛋白、CD44抗原、C-C趋化因子受体7型、L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1或极晚期抗原4或其组合。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的直径为约8μm。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温休眠至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温休眠至少48小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温保存至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在冻干至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被低温保存、低温休眠或冻干。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被分离或纯化。在一些实施方案中，使用本文所述的台盼蓝染料排除法测量活力。在一些实施方案中，台盼蓝染料排除法通过以下方法进行：(a)离心悬浮液中的多个无细胞核的细胞的等分试样以产生细胞沉淀；(b)将细胞沉淀再悬浮于无血清培养基中以产生无血清细胞悬浮液；(c)将1份台盼蓝染料和1份无血清细胞悬浮液混合；(d)在(c)的3-5分钟内对多个无细胞核的细胞进行计数，其中多个无细胞核的细胞中的至少一些未被台盼蓝染料染色，这指示活力。在一些实施方案中，使用本文所述的膜联蛋白-5细胞表面染色测量活力。在一些实施方案中，无细胞核的细胞不是红细胞或红细胞前体。

本文公开的方面提供了一种无细胞核的细胞，该细胞包含：一种或多种细胞内细胞器，所述细胞器用于在不存在细胞核的情况下合成或分泌抗病毒的疫苗，该病毒由与SEQID NO:1、301-347或501-512的一个或多个具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，无细胞核的细胞不是红细胞或红细胞前体。在一些实施方案中，无细胞核的细胞来源于一种或多种细胞内细胞器为内源的有核亲本细胞。在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，疫苗组合物是DNA、RNA、抗原肽、减毒活病毒或灭活病毒或其组合。在一些实施方案中，抗原肽包含与SEQ ID NO:2、3-7、151-154、251-260、401-447、551-562、651-660、751-761、851-859、951-984、1051-1057或1151-1153中的一个或多个具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原肽包含与SEQ IDNO:2、8、401-447或551-562中的一个或多个具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原肽由与SEQ ID NO:101-104、201-209、301-347、501-512、601-610、701-711、801-809、901-934、1001-1007或1101-1103中的一个或多个具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，抗原肽还包含编码白蛋白或其部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，疫苗偶联至细胞表面。在一些实施方案中，疫苗是分泌型的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的免疫调节剂。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含对淋巴组织中一种或多种细胞上表达的配体具有特异性的归巢受体。在一些实施方案中，归巢受体包含C-X-C趋化因子受体3型、白细胞唾液酸蛋白、CD44抗原、C-C趋化因子受体7型、L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1或极晚期抗原4或其组合。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的直径为约8μm。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温休眠至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温保存至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温休眠至少48小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温保存至少48小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在冻干至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，使用本文所述的台盼蓝染料排除法测量活力。在一些实施方案中，台盼蓝染料排除法通过以下方法进行：(a)离心悬浮液中的多个无细胞核的细胞的等分试样以产生细胞沉淀；(b)将细胞沉淀再悬浮于无血清培养基中以产生无血清细胞悬浮液；(c)将1份台盼蓝染料和1份无血清细胞悬浮液混合；(d)在(c)的3-5分钟内对多个无细胞核的细胞进行计数，其中多个无细胞核的细胞中的至少一些未被台盼蓝染料染色，这指示活力。在一些实施方案中，使用本文所述的膜联蛋白-5细胞表面染色测量活力。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被低温保存、低温休眠或冻干。在一些实施方案中，在不存在细胞核的情况下疫苗的合成或分泌由无细胞核的细胞进行大于或等于约3天。在一些实施方案中，无细胞核的细胞位于药学上可接受的载体中。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的剂量为约10³个细胞/kg体重至约10¹²个细胞/kg体重。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的剂量为至少或约10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²个细胞/kg体重。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的剂量为至多或约10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²个细胞/kg体重。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被分离和纯化。

本文公开的方面提供了一种无细胞核的细胞，该细胞包含：一种或多种细胞内细胞器，所述细胞器用于在不存在细胞核的情况下合成或分泌抗细菌或毒素的疫苗。在一些实施方案中，无细胞核的细胞不是红细胞或红细胞前体。在一些实施方案中，无细胞核的细胞来源于一种或多种细胞内细胞器为内源的有核亲本细胞。在一些实施方案中，毒素是肉毒梭菌毒素、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B或来自蓖麻的蓖麻毒素或其任何组合。在一些实施方案中，细菌是炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌属(Shigella)、鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鹦鹉热衣原体、贝氏考克斯菌(Coxiellaburnetii)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、霍乱弧菌或微小隐孢子虫或其任何组合。在一些实施方案中，疫苗偶联至细胞表面。在一些实施方案中，疫苗是分泌型的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的免疫调节剂。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含对淋巴组织中一种或多种细胞上表达的配体具有特异性的归巢受体。在一些实施方案中，归巢受体包含C-X-C趋化因子受体3型、白细胞唾液酸蛋白、CD44抗原、C-C趋化因子受体7型、L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1或极晚期抗原4或其组合。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的直径为约8μm。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温休眠至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温保存至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温休眠至少48小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在低温保存至少48小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在冻干至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被低温保存、低温休眠或冻干。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被分离或纯化。在一些实施方案中，使用本文所述的台盼蓝染料排除法测量活力。在一些实施方案中，台盼蓝染料排除法通过以下方法进行：(a)离心悬浮液中的多个无细胞核的细胞的等分试样以产生细胞沉淀；(b)将细胞沉淀再悬浮于无血清培养基中以产生无血清细胞悬浮液；(c)将1份台盼蓝染料和1份无血清细胞悬浮液混合；(d)在(c)的3-5分钟内对多个无细胞核的细胞进行计数，其中多个无细胞核的细胞中的至少一些未被台盼蓝染料染色，这指示活力。在一些实施方案中，使用本文所述的膜联蛋白-5细胞表面染色测量活力。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被低温保存、低温休眠或冻干。在一些实施方案中，在不存在细胞核的情况下疫苗的合成或分泌由无细胞核的细胞进行大于或等于约3天。在一些实施方案中，无细胞核的细胞位于药学上可接受的载体中。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的剂量为约10³个细胞/kg体重至约10¹²个细胞/kg体重。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的剂量为至少或约10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²个细胞/kg体重。在一些实施方案中，无细胞核的细胞的剂量为至多或约10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²个细胞/kg体重。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被分离和纯化。

本文公开的方面提供了包含本文所述的多个无细胞核的细胞的细胞群。

本文公开的方面提供了向对象递送疫苗的方法，该方法包括将第一剂量的本文所述的多个细胞中的细胞施用于对象。在一些实施方案中，对象在施用后接种疫苗。在一些实施方案中，在将细胞从低温休眠或低温保存中取出后至少24小时进行施用。在一些实施方案中，在将细胞从低温休眠或低温保存中取出后至少48小时进行施用。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在冻干至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，使用本文所述的台盼蓝染料排除法测量活力。在一些实施方案中，台盼蓝染料排除法通过以下方法进行：(a)离心悬浮液中的多个无细胞核的细胞的等分试样以产生细胞沉淀；(b)将细胞沉淀再悬浮于无血清培养基中以产生无血清细胞悬浮液；(c)将1份台盼蓝染料和1份无血清细胞悬浮液混合；(d)在(c)的3-5分钟内对多个无细胞核的细胞进行计数，其中多个无细胞核的细胞中的至少一些未被台盼蓝染料染色，这指示活力。在一些实施方案中，使用本文所述的膜联蛋白-5细胞表面染色测量活力。在一些实施方案中，细胞在不存在细胞核的情况下在对象中合成或分泌疫苗超过或等于约3天。在一些实施方案中，细胞在不存在细胞核的情况下在对象中合成或分泌疫苗约3至5天。在一些实施方案中，方法还包括在施用第一剂量的细胞后至少1个月将第二剂量的细胞群中的第二细胞施用于对象。在一些实施方案中，方法还包括在施用第一剂量的细胞后至少2个月将第三剂量的细胞群中的第二细胞施用于对象。

本文公开的方面提供了包括向有需要的对象施用无细胞核的细胞的方法，该无细胞核的细胞在不存在细胞核的情况下合成或分泌治疗剂，其中该治疗剂对治疗与病毒引起的感染有关的疾病或病症是治疗有效的，该疫苗由与SEQ ID NO:1具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，方法还包括治疗对象的疾病或病症。在一些实施方案中，治疗剂是：(a)白细胞介素10的激动剂；(b)白细胞介素10的拮抗剂；(c)白细胞介素6；(d)肿瘤坏死因子(TNF)；(e)(a)至(d)中任一项的一部分；或(e)(a)至(d)中任一项的组合。在一些实施方案中，白细胞介素10的激动剂是白细胞介素10或其部分，其包含与SEQ ID NO:13具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，白细胞介素10的激动剂或其部分还包含编码白蛋白或其部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，治疗剂由细胞分泌。在一些实施方案中，白细胞介素6的激动剂或其部分包含与SEQ ID NO:14具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，TNF的激动剂包含与SEQ IDNO:15具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含对对象的肺组织中一种或多种细胞上表达的配体具有特异性的归巢受体。在一些实施方案中，归巢受体包含P-选择素糖蛋白配体1、C-C基序趋化因子受体2或C-X-C基序趋化因子受体4或其组合。在一些实施方案中，细胞还包含对对象的淋巴组织中一种或多种细胞上表达的配体具有特异性的归巢受体。在一些实施方案中，归巢受体包含C-X-C趋化因子受体3型、白细胞唾液酸蛋白、CD44抗原、C-C趋化因子受体7型、L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1或极晚期抗原4或其组合。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的免疫调节剂。在一些实施方案中，疾病或病症是呼吸系统疾病或病症。在一些实施方案中，疾病或病症包括冠状病毒疾病(COVID)的症状。在一些实施方案中，COVID是COVID-19。

本文公开的方面提供了包括向有需要的对象施用无细胞核的细胞的方法，该无细胞核的细胞在不存在细胞核的情况下合成或分泌治疗剂，其中治疗剂对于治疗至少部分由病原体感染引起的疾病或病症是治疗有效的。在一些实施方案中，病原体是病毒、细菌、真菌或毒素。在一些实施方案中，病毒是溶瘤病毒。在一些实施方案中，毒素是肉毒梭菌毒素、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B或来自蓖麻的蓖麻毒素或其任何组合。在一些实施方案中，细菌是炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌属(Shigella)、鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鹦鹉热衣原体、贝氏考克斯菌(Coxiella burnetii)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、霍乱弧菌或微小隐孢子虫或其任何组合。在一些实施方案中，治疗剂是：(a)白细胞介素10的激动剂；(b)白细胞介素10的拮抗剂(例如，GIT27、AS101、美索普兰(mesopram)或利妥昔单抗)；(c)白细胞介素6；(d)肿瘤坏死因子(TNF)；(e)(a)至(d)中任一项的一部分；或(e)(a)至(d)中任一项的组合。在一些实施方案中，白细胞介素10的激动剂是白细胞介素10或其部分，其包含与SEQ ID NO:13具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，白细胞介素10的激动剂或其部分还包含编码白蛋白或其部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，治疗剂由细胞分泌。在一些实施方案中，白细胞介素6的激动剂或其部分包含与SEQ ID NO:14具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，TNF的激动剂包含与SEQ ID NO:15具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含对对象的肺组织中一种或多种细胞上表达的配体具有特异性的归巢受体。在一些实施方案中，归巢受体包含P-选择素糖蛋白配体1、C-C基序趋化因子受体2或C-X-C基序趋化因子受体4或其组合。在一些实施方案中，细胞还包含对对象的淋巴组织中一种或多种细胞上表达的配体具有特异性的归巢受体。在一些实施方案中，归巢受体包含C-X-C趋化因子受体3型、白细胞唾液酸蛋白、CD44抗原、C-C趋化因子受体7型、L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1或极晚期抗原4或其组合。在一些实施方案中，无细胞核的细胞还包含含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的免疫调节剂。在一些实施方案中，疾病或病症提供于表3-6中。

本文公开的方面提供了治疗病原体相关的疾病或病症的方法，该方法包括：(a)向患有由病原体引起的感染的对象施用多个基本上不含细胞核的细胞，从而通过以下步骤在体内将病原体与对象隔离：(i)允许病原体感染(a)中施用于对象的多个细胞中至少一个无细胞核的细胞；和(ii)在(i)之后，阻止病原体在至少一个无细胞核的细胞中繁殖；以及(b)通过以下步骤中的至少一个治疗病原体相关的疾病或病症：(i)在体内从多个细胞中的至少一种细胞去除或减少病原体；和(ii)从对象中基本上去除至少一个无细胞核的细胞。在一些实施方案中，至少一个无细胞核的细胞包含对对象的淋巴组织中的一种或多种细胞上表达的配体具有特异性的归巢受体。在一些实施方案中，归巢受体包含C-X-C趋化因子受体3型、白细胞唾液酸蛋白、CD44抗原、C-C趋化因子受体7型、L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1或极晚期抗原4或其组合。在一些实施方案中，病原体是冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒由与SEQ ID NO:1具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，至少一个无细胞核的细胞包含免疫调节剂，该免疫调节剂包括：(a)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；(b)细胞因子；(c)(a)或(b)的一部分；或(d)(a)至(c)的任何组合。在一些实施方案中，至少一个无细胞核的细胞包含一种或多种足以合成或分泌(a)至(d)中的一种或多种的细胞内细胞器。在一些实施方案中，细胞因子包含与SEQ ID NO:13、14或15或其组合具有大于或等于约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞因子是分泌型的。在一些实施方案中，至少一个无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。在一些实施方案中，至少一个无细胞核的细胞的直径为约8μm。在一些实施方案中，方法还包括在(a)中施用之前从低温休眠或低温保存中去除多个基本上不含细胞核的细胞。在一些实施方案中，在从低温休眠、低温保存或冻干中去除多个基本上不含细胞核的细胞后至少24小时内，多个基本上不含细胞核的细胞是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞在冻干至少24小时后是有活力的。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被低温保存、低温休眠或冻干。在一些实施方案中，无细胞核的细胞被分离或纯化。在一些实施方案中，使用本文所述的台盼蓝染料排除法测量活力。在一些实施方案中，台盼蓝染料排除法通过以下方法进行：(a)离心悬浮液中的多个无细胞核的细胞的等分试样以产生细胞沉淀；(b)将细胞沉淀再悬浮于无血清培养基中以产生无血清细胞悬浮液；(c)将1份台盼蓝染料和1份无血清细胞悬浮液混合；(d)在(c)的3-5分钟内对多个无细胞核的细胞进行计数，其中多个无细胞核的细胞中的至少一些未被台盼蓝染料染色，这指示活力。在一些实施方案中，使用本文所述的膜联蛋白-5细胞表面染色测量活力。在一些实施方案中，在(b)中治疗病原体相关的疾病或病症是通过从多个细胞中的至少一个细胞中去除或减少病原体。在一些实施方案中，至少一个细胞包含有效减少或去除来自该至少一个细胞的病原体的抗病毒剂。在一些实施方案中，在(b)中治疗病原体相关的疾病或病症是通过从对象中基本上去除至少一个无细胞核的细胞。在一些实施方案中，该多个细胞不是红细胞或红细胞前体。在一些实施方案中，至少一个无细胞核的细胞包含编码中和抗体的异源多核苷酸，该中和抗体阻断病原体与对象的细胞表达的病原体识别的受体之间的结合。

在一些实施方案中，方法还包括在不存在细胞核的情况下由至少一个无细胞核的细胞分泌中和抗体，从而减少或改善病原体与对象的细胞的病原体识别部分之间的结合。在一些实施方案中，病原体是病毒、细菌、毒素或真菌。在一些实施方案中，病毒是溶瘤病毒。在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV-2或其变体。在一些实施方案中，毒素是肉毒梭菌毒素、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B或来自蓖麻的蓖麻毒素或其任何组合。在一些实施方案中，细菌是炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌属(Shigella)、鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapseudomallei)、鹦鹉热衣原体、贝氏考克斯菌(Coxiella burnetii)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、霍乱弧菌或微小隐孢子虫或其任何组合。

援引并入

在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入的程度相同。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。

附图说明

本文公开的方法和组合物的一些新颖特征在本公开中阐述。通过参考以下阐述说明性实施方案的详细描述和附图，将获得对本文所公开的方法和组合物的特征和优点的更好理解，在说明性实施方案中利用了所公开的组合物和方法的原理，附图中：

图1示出了根据本公开的实施方案的用于快速病毒疫苗平台的用于工程改造细胞的方法。

图2示出了与传统疫苗开发时间线相比，使用根据本公开的实施方案的快速病毒疫苗平台生产疫苗的时间线。

图3示出了根据本公开的实施方案的用于部署快速病毒疫苗平台以处理新识别的病毒的方法。

图4示出了根据本公开的实施方案的本文所述的细胞质捕获和清除活病毒(例如冠状病毒)的方法。

图5示出了本文所述的快速病毒疫苗平台的益处的非限制性实例。

图6A是示出了在4摄氏度下从低温休眠中恢复指定时间量之后即时的MSC和MSC来源的细胞质的活力的代表性线图。使用台盼蓝染料排除法在自动细胞计数仪(CellCountess)中评定活力，并且活力显示为与输入细胞数的比率。

图6B是代表性的条形图，比较了在4摄氏度下从低温休眠中恢复指定时间量之后即时在Boyden小室测定(Boyden chamber assay)中迁移的MSC和MSC来源的细胞质。在底室中无血清(阴性对照)或10％优级FBS(P-FBS)作为化学引诱物的情况下使细胞和细胞质迁移3小时，并将计数标准化为上样对照。

图7A是转染到MSC和细胞质中的白细胞介素10(IL-10)mRNA的示意图。在IL-10mRNA编码区(CDS)的起始密码子之前添加Kozak序列。将人β珠蛋白(HBB)mRNA的5'UTR和3'UTR分别加入到IL-10CDS的5'和3'端。将人工5'帽添加到IL-10mRNA的5'端，并设计假尿苷修饰以增加mRNA稳定性。

图7B是示出了转染的(++)或未转染的(--)MSC或MSC来源的细胞质的培养基中IL-10浓度的条形图。将MSC来源的细胞质用IL-10mRNA转染，然后以2.5×10⁴个细胞/孔接种在24孔板中。转染后24小时收集条件培养基(CM)并通过ELISA测定IL-10浓度。

图7C是示出了在用来自MSC的所示条件培养基(CM)或如图7B处理1小时的细胞质处理的血清饥饿RAW巨噬细胞中Stat3和磷酸化Stat3(P-Stat3，IL-10活化的标记)的蛋白表达的免疫印迹。未处理的＝没有CM处理的对照。完全培养基＝用MSC完全培养基处理的RAW细胞。MSC对照＝用来自未转染的MSC的CM处理的RAW细胞。MSC IL-10＝用来自IL-10mRNA转染的MSC的CM处理的RAW细胞。细胞质对照＝用来自未转染的细胞质的CM处理的RAW细胞。细胞质IL-10＝用来自IL-10mRNA转染的细胞质的CM处理的RAW细胞。

图7D是示出了通过ELISA测定的小鼠血液中分泌的IL-10细胞因子浓度的条形图。如图7B所示处理MSC或MSC来源的细胞质，并经眶后注射到C57BL/6小鼠的脉管系统中。注射后2小时，将动物安乐死，并通过心脏穿刺收集血样。平均值±SEM；n＝3。

图8A是在Boyden小室测定中结晶紫染色的MSC或MSC来源的细胞质的代表性明视野显微镜图像，MSC或MSC来源的细胞质侵入到涂覆有基底膜提取物(BME)的8.0μm多孔过滤器的下表面，朝向作为化学引诱物的10％ FBS达24小时。阴性＝无FBS(阴性对照)。比例尺＝50μm。

图8B是示出了与上样对照相比的如图8A处理的侵入膜下表面的MSC或MSC来源的细胞质的比例的代表性条形图。平均值±SEM；n＝18。

图9A是悬浮培养基中MSC和细胞质的代表性落射荧光显微镜图像(上图)和相差显微镜图像(下图)。肌动蛋白皮质用Lifeact RFP染色，而细胞核用

Dyecycle^TMGreen染色。箭头指向细胞质，三角箭头指向MSC细胞核。比例尺＝20μm。

图9B是示出了用Nikon Element软件测量的MSC和细胞质的大小分布的代表性散点图。平均值±SEM；n＝80。

图9C是示出了肺中存在的检测的

DiD标记的MSC或细胞质的代表性条形图。MSC或细胞质用DiD染料标记，并经眶后注射到C57BL/6小鼠的脉管系统中。24小时后收获组织并通过流式细胞仪分析细胞悬浮液。平均值±SEM；n＝3。

图9D是示出了肝脏中存在的检测的

DiD标记的MSC或细胞质的代表性条形图。平均值±SEM；n＝3。MSC或细胞质用DiD染料标记，并经眶后注射到C57BL/6小鼠的脉管系统中。24小时后收获组织并通过流式细胞仪分析细胞悬浮液。

图10A是显示出了在肺中检测到的DiD标记的MSC或细胞质的数量的代表性散点图。在标准贴壁条件(2D)下培养或通过悬滴法(3D)悬浮培养MSC以产生3D细胞质。MSC和细胞质用

DiD染料标记，并经眶后注射到C57BL/6小鼠的脉管系统中。24小时后收获组织并通过流式细胞仪分析细胞悬浮液。平均值±SEM；n＝2。

图10B是示出了在肝脏中检测到的DiD标记的MSC或细胞质的数量的代表性散点图。在标准贴壁条件(2D)下培养或通过悬滴法(3D)悬浮培养MSC以产生3D细胞质。MSC和细胞质用

DiD染料标记，并经眶后注射到C57BL/6小鼠的脉管系统中。24小时后收获组织并通过流式细胞仪分析细胞悬浮液。平均值±SEM；n＝2。

图10C是示出了在脾中检测到的

DiD标记的MSC或细胞质的数量的代表性散点图。在标准贴壁条件(2D)下培养或通过悬滴法(3D)悬浮培养MSC以产生3D细胞质。MSC和细胞质用DiD染料标记，并经眶后注射到C57BL/6小鼠的脉管系统中。24小时后收获组织并通过流式细胞仪分析细胞悬浮液。平均值±SEM；n＝2。

图11A-11B显示了感染后12小时以MOI 0.05用VSV-GFP(箭头)感染的有核亲本MSC(顶部)和MSC来源的细胞质(底部)的落射荧光显微图像。GFP抗原被无细胞核的MSC清楚且强有力地表达，表明在去核细胞中的病毒复制和抗原产生。比例尺＝50μm。图11B感染后12小时，以MOI 0.1用VSV-GFP(三角箭头)感染的MSC来源的无细胞核的细胞的高倍放大落射荧光图像。还使用若丹明鬼笔环肽(箭头)和细胞核染色DAPI对细胞质进行F-肌动蛋白丝染色以说明细胞核的缺乏。

图12A-12D显示了感染后48小时以MOI 0.05用编码GFP抗原的oHSV感染的MSC和无细胞核的MSC的落射荧光显微镜图像(图12A)。用oHSV-GFP接种后18小时，从MSC产生无细胞核的MSC(细胞质)。比例尺＝50μm。图12B显示了以0.05MOI用编码GFP的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV-GFP)感染表达lifeact-RFP的MSC或无细胞核的MSC，然后将其注射到生长在裸鼠中的已建立的U87成胶质细胞瘤肿瘤中。注射后7天拍摄图像。如强GFP信号所示，MSC和无细胞核的MSC都将oHSV递送至肿瘤细胞。值得注意的是，7天后在肿瘤中检测到非常少的无细胞核的MSC，而大量MSC存在于生长的肿瘤的中心(注射部位)和外缘。图12C是示出了GFP覆盖的肿瘤面积的百分比的条形图，其表示被携带oHSV-GFP病毒的MSC或无细胞核的MSC感染的肿瘤细胞的部分。图12D是示出了与PBS注射对照相比的用IL-12(佐剂)工程改造的无细胞核的MSC和oHSV工程改造的无细胞核的MSC的组合处理的已建立的成胶质细胞瘤肿瘤中存在的CD8+效应T细胞的比例增加的图。

图13A-13B显示了去核间充质基质细胞(MSC)(细胞质)容易摄取细胞可渗透的抗原肽。图13A示出了与100μM的细胞可渗透的抗原肽(Arg)9-FAM(6-羧基荧光素，FAM-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH)孵育的MSC(左)和去核的MSC(细胞质)(右)。比例尺＝50μm。箭头指示Hoechst染色的细胞核，三角箭头指示阳性(Arg)9-FAM。图13B示出了表示在ImageJ中测量的相对荧光强度的条形图。校正的总细胞荧光＝积分密度-(所选细胞的面积×背景读数的平均荧光)。平均值±SEM；n＝10。

具体实施方式

本文公开了组合物和试剂盒以及它们用于治疗或预防病原性感染(例如，病毒、真菌、寄生虫、细菌)或与此类病原性感染相关的疾病或病症的方法。本公开的组合物包含细胞质，该细胞质是经工程改造以含有且在一些情况下产生有效治疗与病原性感染相关的疾病或病症和/或预防病原性感染的治疗剂的去核细胞。在一些实施方案中，本文所述的治疗剂可以是疫苗(例如，减毒病毒抗原)、有效治疗急性病毒感染的病毒靶向剂或两者的组合。在一些实施方案中，细胞质还可以经工程改造以(例如，体内)捕获病原体并使其失活以治疗急性感染和预防进一步的感染。在一些实施方案中，病原体是一种或多种病毒，例如冠状病毒。

现有的基于细胞的疗法具有许多缺点。开发有效的基于细胞的治疗剂通常需要基因工程并将新的遗传物质引入离体细胞的基因组中。然而，这个过程可能会将危险的突变引入基因组，从而产生癌症和其他危及生命的疾病，特别是如果工程改造的细胞永久植入体内或与宿主细胞融合。许多现有的基于细胞的治疗剂的另一个显著问题是，在递送至身体后，细胞会不受控制地增殖并且可以永久地移植到身体中，这可能危及生命。此外，在施用给对象后缺乏细胞控制可使得难以递送精确剂量的治疗性细胞及其生物活性产物(例如，药代动力学差)。因此，需要一种安全且可控的基于细胞的疗法来递送治疗剂或其他生物分子。

在递送至患者或对象之前，传统的基于细胞的治疗剂通常被离体修饰或遗传改变以产生期望的细胞和治疗功能。然而，当将这些细胞引入对象时，新的宿主环境可显著重新编程和负面改变，或以其他方式使它们失效。因此，需要一种更可预测的基于细胞的疗法，其不能响应重新编程和有害的外部信号。

目前存在的基于细胞的疗法受到DNA损伤/基因靶向剂的量的限制，该DNA损伤/基因靶向剂可装载到其中以递送至对象作为针对癌症或其他疾病的治疗剂。这包括但不限于DNA损伤化疗药物、DNA整合病毒、溶瘤病毒和基因治疗应用/递送，包括但不限于成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、小簇Cas(CRISPR/Cas系统)和质粒。因此，需要没有这种限制的基于细胞的疗法，其可以是递送高剂量细胞毒性治疗剂的理想平台。

使用本公开的细胞质将治疗剂递送至对象有诸多优点。与将DNA从其细胞核(例如，核编码基因或外来或突变DNA)无意中转移到宿主细胞的常规基于细胞的疗法不同，本公开的细胞质在没有细胞核的情况下不能这样做。另外，使用本文所述的细胞质向对象递送治疗剂是可控的和有限的(例如，14天或更少)，至少因为没有细胞核，细胞质不能增殖或分化成其他细胞类型。在不存在细胞核的情况下，本公开的细胞质可以表达和/或分泌本文所述的治疗剂或其他生物分子，以及在体内迁移或归巢至靶细胞或靶组织或环境。这至少部分地通过使用本文所述的方法使亲本细胞去核，使得所得细胞质保留来自亲本细胞的细胞器来实现，该细胞器足以用于正常生物功能(例如，蛋白质产生/分泌、细胞运动性、趋化因子感测等)。即使当全身递送至对象时，本文所述的细胞质以安全和可控的方式有效且高效地将治疗剂递送至对象中的靶组织或靶细胞(例如，淋巴组织、肺组织)。此外，制造大量传统的基于细胞的疗法既费时又昂贵，这限制了它们的临床应用。尽管认为使用含有细胞核的永生化细胞(例如，hTERT)来增加制造能力可增加制造规模和降低制造成本，但存在永生化细胞易于染色体异常并促进肿瘤或异位组织形成，使其对于临床应用不安全的担忧。根据本公开的实施方案，通过将这样的细胞或任何细胞类型去核，可以实现与制造细胞质相关的增加的规模和更低的成本，同时减轻由常规的基于细胞的疗法对人类健康造成的风险。

本文所述组合物的改善的生产规模和成本、安全性和效率对于疫苗开发具有重要的益处。生产本文所述组合物的方法比常规疫苗开发时间线更快，常规疫苗开发时间线通常需要从生产细胞系分离和纯化疫苗(例如，抗原、mRNA)。相反，本公开的细胞质经工程改造以连续产生抗病毒组合物，避免了分离和纯化疫苗的需要。在需要时，本文所述的组合物可以全身施用(例如，吸入)，而不是通过肌内注射，从而避免需要医疗设施来施用疫苗并改善患者体验。由于细胞质快速归巢淋巴组织(或其他靶组织)的能力，疫苗可以在全身施用某些常规的基于细胞的疗法(例如，外泌体)所花费的时间的一小部分时间内部署到对象的淋巴系统。此外，细胞质的小尺寸(例如，约8微米)确保细胞质不被脉管系统和组织实质中的小开口(opening)捕获，从而与传统的基于细胞的疗法相比改善了生物分布。本文公开的细胞质可以经工程改造以表达几乎任何类型的疫苗或抗病毒剂(例如，抗病毒和/或中和抗体)以对抗活动性感染以及预防未来的感染。此外，本文所述的细胞质可经工程改造以表达多于一种类型的疫苗(例如，针对多于一种类型的病原体)，使得一组疫苗能够以单一剂型施用于对象。这对于快速进化的病原体(例如，SARS-CoV-2)是特别有益的，其在未来可能需要多种疫苗用于有效的免疫策略。

本文公开的细胞质是满足紧急医疗需要的一种现成解决方案。细胞质可以在去核之前或之后进行工程改造，以表达靶向部分(例如，归巢受体)、免疫逃避部分(例如，“不要吃我”信号肽)以及足以将细胞质靶向淋巴组织的其他生物分子，而在他们到达那里之前没有被免疫系统清除的风险。细胞质可以低温保存、低温休眠或冷冻干燥并长期保存，其生物活性减慢或停止。当存在迫切的医学需要时，细胞质的生物学功能可以被恢复(例如，解冻、再水化)，并且在递送之前根据需要保持活力至多5天以用于进一步工程改造(例如，表达疫苗或抗病毒剂)。这些生物学功能包括但不限于表达治疗性表面蛋白、免疫刺激抗原或受体、分泌细胞因子、激素或蛋白、释放外泌体、脱落膜颗粒、通过死亡过程刺激免疫系统或产生隧道纳米管(tunneling nanotube)。本公开的细胞质可以在制造和分销过程中冷冻和解冻多次，而不会不利地影响细胞质预期的功能，使它们成为快速疫苗部署的理想平台。

在一些实施方案中，本公开的细胞质可以是治疗性的，而无需经工程改造以产生或递送外源性疫苗或本文所述的其他生物分子。例如，当递送至患者或对象时，未处理的细胞质本身可具有治疗特性，例如来源于对目标病原体免疫的对象获得的细胞的细胞质，类似于恢复期血浆治疗方法。这种细胞可天然产生阻断病原体-宿主受体接合的中和抗体。在一些实施方案中，未操作的细胞质可以天然产生本文所述的治疗剂或生物分子中的任一种，其可以用于在有此需要的对象中实现治疗效果。

本文所述的快速疫苗平台的许多益处的非限制性实例提供于图5中。细胞质的生产可以迅速扩大，其中可容易地生产经工程改造以表达病毒抗原的数亿个细胞质并可储存直至需要。本文所述的细胞质除了经工程改造以表达病毒抗原外，还可作为陷阱(trap)。该技术特征允许工程改造的细胞质被病原体感染，从而隔离病原体并阻止病原体感染其他细胞。例如，本文所述的细胞质可以经工程改造以表达ACE2受体，从而被表达刺突蛋白的SARS-CoV-2病毒感染。感染后，SARS-CoV-2病毒被捕获在细胞质中，可能不再复制。被感染的细胞质可被免疫系统靶向降解。可以将细胞质工程改造以表达趋化因子受体，从而将细胞质归巢到靶组织或微环境如淋巴结。

本文提供了用于预防或治疗对象中的病原体感染的组合物、方法和试剂盒。在一些实施方案中，病原体感染是病毒感染，例如冠状病毒或流感病毒的感染。在一些实施方案中，病原体感染是细菌感染。本文公开了经工程改造以表达抗病毒组合物的细胞质，该抗病毒组合物适于预防病毒感染或爆发或治疗急性感染。当被递送至对象时，细胞质通过在细胞质表面呈递抗病毒组合物或通过分泌抗病毒组合物进入靶组织周围的细胞外空间而将抗病毒组合物递送至靶组织。

在一些实施方案中，本公开的细胞质还适于通过允许细胞质被病原体感染并阻止病原体在体内繁殖来捕获对象中的病原体。如图4所示，本文所述的细胞质可表达可被病原体识别的病毒受体，促进细胞质的感染。病原体在感染细胞质时被隔离在细胞质中，在没有核基因组的情况下无法复制或繁殖。在5天或更短时间之后，使用吞噬作用的自然过程从对象中清除细胞质。在一些实施方案中，细胞质激活免疫系统以加速病毒在对象中的清除。本文公开的用于阻止病原体在体内繁殖的细胞质的至少一个优点是它们缺乏许多病原体复制所需的含有遗传信息的细胞核。

参考图1，在一些实施方案中，在去核之前经基因工程改造以表达粘附分子、趋化因子或滞留受体或两者的细胞(例如，干细胞)，其靶向靶细胞或组织，例如对象的淋巴组织(例如，淋巴结)或肺组织(步骤1)。接下来，使用本文所述的方法将工程改造的细胞去核以产生细胞质(步骤2)。然后可以将细胞质工程改造以表达并且在一些实施方案中分泌疫苗或其他生物分子(例如，治疗剂、中和抗体)和/或免疫调节剂(例如，免疫活化剂)以增强对象中的适应性免疫应答(步骤3)。根据所需的功能按需要进一步工程改造细胞质。所得细胞质可用作病毒陷阱的陷阱或部署疫苗。在病毒陷阱的非限制性实例中，细胞质可以不用治疗剂(例如，疫苗)有效载荷(payload)进行工程改造。尽管在一些情况下，表达和/或分泌针对目的病原体的中和抗体以预防病毒的未来感染可能是有利的。在一些实施方案中，该实施例中的病毒是冠状病毒，如SARS-CoV-2。然而，图1中的工作流程可适用于本文所述的任何病原体，包括对人类健康造成显著风险的细菌病原体(例如炭疽芽孢杆菌)或毒素。

与传统的疫苗开发(12个月或更长)相比，制造本公开的细胞质的过程从鉴定新病原体(例如，病毒)到分销大约需要2个月。如图2所示，本公开的细胞质可以在病毒爆发之前制备并低温保存一段时间。这意味着，本公开的细胞质(例如，经工程改造以表达归巢受体、免疫活化剂)可快速部署以解决下一次病毒爆发。参考图3，预先制备并低温保存的细胞质经工程改造以分泌减毒病毒蛋白。当施用于有此需要的对象时，细胞质驱动免疫活化并在对象中产生抗病毒的中和抗体。

提供了产生本公开的细胞质的方法。在一些实施方案中，可以用细胞松弛素B处理细胞以软化皮质肌动蛋白细胞骨架。然后在Ficoll梯度中通过高速离心从细胞体中物理提取细胞核以产生无核(去核)细胞质。由于细胞质和完整的有核细胞在Ficoll梯度中沉降到不同的层，在一些实施方案中，细胞质可以容易地分离并制备用于治疗目的或与其他细胞融合(有核或去核)。去核过程可在临床上扩展以处理数千万细胞。

本文公开了使用或递送本公开的细胞质的方法。细胞质可用作归巢载体以递送临床相关载物(cargo)/有效载荷以治疗健康个体(例如，提高能量、从运动中恢复或递送天然产物)或各种疾病(例如，本文所述的任何疾病)。例如，细胞质可用于向健康个体，例如未被诊断为患有所递送的治疗剂对其有效的特定病症的个体递送补充剂、抗衰老因子、预防性治疗等。

此外，本文提供了包含本文所述的任何组合物的试剂盒。例如，试剂盒可包含使用本文所述的任何组合物或方法的说明书。在一些实施方案中，试剂盒可包含至少一个剂量的本文所述的任何组合物。

I.组合物

本文提供了可用于治疗或预防对象中的病原体相关的疾病或病症的组合物。在一些实施方案中，本文公开的组合物包含细胞质(例如去核细胞)，其经工程改造以表达适合于治疗或预防病原体相关的疾病或病症的活性剂。在一些实施方案中，病原体相关的疾病或病症是病毒感染，例如冠状病毒感染。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达抗病毒组合物，例如减毒病毒抗原或抗病毒抗体或其组合。在一些实施方案中，细胞质在细胞质表面包含抗病毒组合物(例如，抗原呈递)。在一些实施方案中，抗病毒组合物由细胞质分泌到靶组织的细胞外间隙中。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以通过允许细胞质感染和阻止病原体在体内繁殖来体内诱捕或捕获病原体，从而治疗急性病原体感染或病原体相关的疾病或病症。

本文所述的细胞质经工程改造以具有有限的或限定的(例如，已知的或可编程的)寿命。本文所述的细胞质与一些其他基于细胞的疗法(例如，外泌体、红细胞、过继性细胞疗法)中的细胞相比具有减小的尺寸，这在一些实施方案中改善了生物分布。

本文所述的细胞质在低温休眠或低温保存后保持活力，使得它们独特地适合于广泛采用作为药物递送的平台。低温保存(cryopreservation)包括在非常低的温度下(例如，在固体CO₂中-80℃，在液氮中-196℃等)短期或长期冷却或冷冻并储存生物材料(例如，细胞、细胞质)。低温休眠(Cryohibernation)包括在非冷冻温度(例如4℃)下生物材料(例如，细胞、细胞质)在休眠(suspended animation)状态下的短期冷却和储存。由于以下原因中的一个或多个，细胞质的低温休眠可能是有利的：与低温保存相比，低温休眠的劳动强度较低，并且经过低温休眠的细胞质可以被运输(例如，船运)。在一些实施方案中，细胞细胞质被低温保存。在一些实施方案中，细胞细胞质被低温休眠。从低温休眠或低温保存中取出细胞质后，可以根据本文所述的方法使用细胞质。在一些实施方案中，细胞质在从低温休眠或低温保存中取出后至少或约24小时、48小时、72小时或24至72小时之间的任何时间增量内是有活力的。在一些实施方案中，细胞质在约24至约48小时内是有活力的。在一些实施方案中，细胞质在约48至约72小时内是有活力的。在一些实施方案中，使用本文所述的台盼蓝染料排除法测量活力。在一些实施方案中，使用本文所述的膜联蛋白-5细胞表面染色测量活力。

本文所述的细胞质经过广泛的工程改造，以最适合给定的治疗应用。例如，细胞质是工程改造的(例如，用细胞表面受体)，其增加细胞质被靶病原体的感染。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达用作疫苗的减毒病毒抗原或用于治疗急性病毒感染的抗病毒抗体。在另一个实例中，细胞质经工程改造以产生或表达特异性靶向困难组织(例如，肌肉)的蛋白质和活性剂，如减毒病毒抗原或抗病毒抗体。此外，在一些实施方案中，用免疫逃避部分(例如，CD34+)工程改造细胞质以避免宿主中的抗原反应。细胞质还经工程改造以表达细胞表面受体(例如，粘附分子、趋化因子受体)，其用于细胞归巢、趋化因子感测和靶向主要受影响区域中的受损组织所必需的其他生物功能。

在一些实施方案中，细胞质的限定寿命少于1小时至14天(例如，少于1小时至1小时、少于1小时至6小时、6小时至12小时、12小时至1天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、13天、14天、1至14天、1至12天、1至10天、1至9天、1至8天、1至7天、1至6天、1至5天、1至4天、1至3天、1至2天、2至14天、2至12天、2至10天、2至8天、2至7天、2至6天、2至5天、2至4天、2至3天、3至14天、3至12天、3至10天、3至8天、3至7天、3至6天、3至5天、3至4天、4至14天、4至12天、4至10天、4至8天、4至7天、4至6天、4至5天、4至7天、5至14天、5至12天、5至10天、5至8天、5至7天、5至6天、6至14天、6至12天、6至10天、6至8天、6至7天、7至14天、7至12天、7至10天、7至8天、8至14天、8至12天、8至10天、10至14天、10至12天、12至14天、少于14天、少于12天、少于10天、少于8天、少于7天、少于6天、少于5天、少于4天、少于3天、少于2天、少于1天、少于12小时、或少于6小时)。在一些实施方案中，可以通过确定一部分细胞质群体(例如至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的群体)被确定为死亡的平均时间来评估细胞质群体的寿命。细胞死亡可通过本领域已知的任何方法测定。在一些实施方案中，例如在一个或多个时间点，细胞质的活力可以通过确定形态测定或功能参数是否完整(例如，通过台盼蓝染料排除、评估完整细胞膜、评估对塑料的粘附(例如，在贴壁的细胞质中)、评估细胞质迁移、用凋亡标记物的负染色等)来评估。在一些实施方案中，细胞质的寿命可能与获得细胞质的细胞的寿命有关。例如，在一些实施方案中，从巨噬细胞获得的细胞质可以存活12至24小时。

在一些实施方案中，细胞质的直径为至少或等于1μm。在一些实施方案中，细胞质的直径大于1μm。在一些实施方案中，细胞质的直径为1-100μm(例如，1-90μm、1-80μm、1-70μm、1-60μm、1-50μm、1-40μm、1-30μm、1-20μm、1-10μm、1-5μm、5-90μm、5-80μm、5-70μm、5-60μm、5-50μm、5-40μm、5-30μm、5-20μm、5-10μm、10-90μm、10-80μm、10-70μm、10-60μm、10-50μm、10-40μm、10-30μm、10-20μm、10-15μm 15-90μm、15-80μm、15-70μm、15-60μm、15-50μm、15-40μm、15-30μm、15-20μm)。在一些实施方案中，细胞质的直径为10-30μm。在一些实施方案中，细胞质的直径为5-25μm(例如，5-20μm、5-15μm、5-10μm、10-25μm、10-20μm、10-15μm、15-25μm、15-20μm或20-25μm。在一些实施方案中，细胞质不是外泌体。不受任何特定理论的束缚，认为在一些实施方案中，一些细胞质可有利地足够小以允许更好的生物分布或不太可能被捕获在对象的肺中。

在一些实施方案中，可以将细胞质应用于细胞或与细胞(例如，异种培养的细胞)一起培养以改变它们的性质。例如，在一些实施方案中，细胞质(例如，未处理的细胞质或工程改造的细胞质)可以上调异种培养的细胞中的健康促进因子，并且在一些实施方案中，可以将异种培养的细胞返回至从中取出它们的对象。

A.细胞

本文提供了经工程改造以产生本公开的细胞质的细胞和细胞系。细胞质可以来源于相应的亲本细胞，例如有核亲本细胞。亲本细胞的非限制性实例包括永生化细胞、癌细胞(例如，任何癌细胞)、原代(例如，宿主来源的)细胞或细胞系。在一些实施方案中，亲本细胞来源于使用合适的方法(例如，Huang等人，J.Exp.Clin.Med.2010Oct.22l2(5):202-217中所述的方法)永生化的细胞。在一些实施方案中，细胞质来源于使用美国专利申请第16/715,859号中提供的合适方法的亲本细胞，该专利申请通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，细胞可源自具有一种或多种细胞的任何生物体。一些非限制性实例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞、藻类细胞、真菌细胞、动物细胞、来自无脊椎动物的细胞、来自脊椎动物的细胞、来自哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长类动物、人等)的细胞等。在一些实施方案中，细胞是体细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，细胞是间充质干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，细胞是间充质基质细胞。细胞可源自具有一种或多种细胞的任何生物体。

细胞的一些非限制性实例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞(例如，来自植物作物、水果、蔬菜、谷物、大豆、玉米、玉米、小麦、种子、番茄、水稻、木薯、甘蔗、南瓜、干草、马铃薯、棉花、大麻、烟草、开花植物、针叶树、裸子植物、蕨类植物、石松、金鱼藻、苔类植物、藓类植物的细胞)、藻类细胞(例如，布朗葡萄藻、莱茵衣藻、微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)、蛋白核小球藻、展枝马尾藻等)、海藻(例如，海带)、真菌细胞(例如，酵母细胞、来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如，果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟、哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长类动物、人等)的细胞等。有时细胞不是源生自天然生物体(例如，细胞可以是合成制备的，有时称为人工细胞)。在一些实施方案中，细胞是体细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，细胞是间充质干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，细胞是肌肉细胞、皮肤细胞、血细胞或免疫细胞。其他示例性细胞可以包括淋巴样细胞，例如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞，辅助T细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞；髓样细胞，例如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/分叶过多中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、红细胞(网织红细胞)、肥大细胞、血小板/巨核细胞、树突细胞；来自内分泌系统的细胞，包括甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)、松果体(松果体细胞)细胞；神经系统的细胞，包括神经胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞(Boettcher cell)和垂体细胞(促性腺激素、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、促生长激素细胞、催乳激素)；呼吸系统细胞，包括肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、噬尘细胞；循环系统的细胞，包括心肌细胞、红细胞；消化系统细胞，包括胃(胃粘膜主细胞、壁细胞)、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞；肠内分泌细胞，包括肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝脏(肝细胞、枯否细胞)、软骨/骨/肌肉；骨细胞，包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、牙齿(成牙骨质细胞、成釉细胞)；软骨细胞，包括成软骨细胞、软骨细胞；皮肤细胞，包括毛细胞、角质形成细胞、黑素细胞(Nevus细胞)；肌肉细胞，包括肌细胞；泌尿系统细胞，包括足状突细胞、近肾小球细胞(Juxtaglomerularcell)、球内系膜细胞/球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞、致密斑细胞；生殖系统细胞，包括精子细胞、足细胞、莱氏细胞、卵细胞；以及其他细胞，包括脂肪细胞、成纤维细胞、肌腱细胞、表皮角质形成细胞(分化表皮细胞)、表皮基底细胞(干细胞)、指甲和趾甲角质形成细胞、甲床基底细胞(干细胞)、髓质毛干细胞、皮质毛干细胞、角质层毛干细胞、角质层毛根鞘细胞、赫氏层毛根鞘细胞、亨利层毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞(干细胞)、湿分层屏障上皮细胞、角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端尿道和阴道的复层鳞状上皮的表面上皮细胞、角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端尿道和阴道上皮的基底细胞(干细胞)、泌尿上皮细胞(内衬膀胱和尿管)、外分泌上皮细胞、唾液腺粘液细胞(富含多糖的分泌)、唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶的分泌)、舌内冯·埃布纳腺细胞(Von Ebner's gland cell in tongue)(清洗味蕾)、乳腺细胞(乳汁分泌)、泪腺细胞(泪液分泌)、耳内蜡样腺细胞(蜡分泌)、外分泌汗腺暗细胞(糖蛋白分泌)、外分泌汗腺透明细胞(小分子分泌)；顶泌汗腺细胞(气味分泌物、性激素敏感物)、眼睑中的Moll腺细胞(特化汗腺)、皮脂腺细胞(富脂质皮脂分泌)、鼻中的Bowman腺细胞(清洗嗅上皮)、十二指肠中的Brunner腺细胞(酶和碱性粘液)、精囊泡细胞(分泌精液组分，包括用于游泳精子的果糖)、前列腺腺细胞(分泌精液组分)、尿道球腺细胞(粘液分泌)、前庭大腺细胞(阴道润滑剂分泌)、Littre腺细胞(粘液分泌)、子宫内膜细胞(碳水化合物分泌)、分离的呼吸道和消化道杯状细胞(粘液分泌)、胃粘膜粘液细胞(粘液分泌)、胃腺酶原细胞(胃蛋白酶原分泌)、胃腺泌酸细胞(盐酸分泌)、胰腺腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌)、小肠潘氏细胞(溶菌酶分泌)、肺II型肺细胞(表面活性物质分泌)、肺克拉拉细胞、激素分泌细胞、垂体前叶细胞、促生长激素细胞、垂体催乳素细胞、促甲状腺激素细胞、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸Leydig细胞、卵泡内膜细胞、破裂卵泡的黄体细胞、颗粒层黄体素细胞、膜黄体细胞、近肾小球细胞(肾素分泌)、肾的致密斑细胞、代谢和储存细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肾、I型肺细胞(肺粘膜空气空间)、胰腺导管细胞(中央腺泡细胞)、非横纹管细胞(汗腺、唾液腺、乳腺等)、导管细胞(精囊、前列腺等)、封闭内腔上皮细胞、具有推进功能的纤毛细胞、细胞外基质分泌细胞、收缩细胞；骨骼肌细胞、干细胞、心肌细胞、血液和免疫系统细胞、红细胞(红细胞)、巨核细胞(血小板前体)、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞(骨骼中)、树突细胞(淋巴组织中)、小胶质细胞(中枢神经系统中)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞、血液和免疫系统的干细胞和定向祖细胞(各种类型)、多能干细胞、全能干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞、感觉转导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和外周神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵原细胞/卵母细胞、精细胞、精母细胞、精原细胞(精母细胞的干细胞)、精子、营养细胞、卵巢卵泡细胞、足细胞(睾丸中)、胸腺上皮细胞、间质细胞和间质肾细胞。

真核细胞的非限制性实例包括哺乳动物(例如，啮齿动物、非人灵长类动物或人)、非哺乳动物(例如，鱼、鸟、爬行动物或两栖动物)、无脊椎动物、昆虫、真菌或植物细胞。在一些实施方案中，真核细胞是酵母细胞，如酿酒酵母。在一些实施方案中，真核细胞是高等真核生物，如哺乳动物、鸟类、植物或昆虫细胞。在一些实施方案中，有核细胞是原代细胞。在一些实施方案中，有核细胞是免疫细胞(例如，淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞)、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、单核细胞、骨髓来源的抑制细胞、嗜酸性粒细胞)。在一些实施方案中，有核细胞是吞噬细胞或白细胞。在一些实施方案中，有核细胞是干细胞(例如，成体干细胞(例如，造血干细胞、乳腺干细胞、肠干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉成体干细胞、神经嵴干细胞、睾丸细胞)、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞(iPS))。在一些实施方案中，有核细胞是祖细胞。在一些实施方案中，有核细胞来自细胞系。在一些实施方案中，有核细胞是悬浮细胞。在一些实施方案中，有核细胞是贴壁细胞。在一些实施方案中，有核细胞是已经通过表达癌基因而永生化的细胞。在一些实施方案中，有核细胞通过表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)或任何癌基因而永生化。在一些实施方案中，有核细胞是患者或对象来源的细胞(例如，自体患者来源的细胞或同种异体患者来源的细胞)。在一些实施方案中，在使用本文所述和本领域已知的任何去核技术将有核细胞去核之前，用载体(例如，病毒载体(例如，逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)、腺相关病毒(AAV)载体、水泡病毒载体(例如，水泡性口炎病毒(VSV)载体)或杂合病毒载体)、质粒)转染有核细胞。

在一些实施方案中，细胞质可来源于对象自体的细胞。在一些实施方案中，细胞质可来源于与对象异源的细胞。

在一些实施方案中，细胞质来源于免疫细胞。在一些实施方案中，细胞质源自自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、成体干细胞(例如，造血干细胞、乳腺干细胞、肠干细胞、间充质干细胞、间充质基质细胞、内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉成体干细胞、神经嵴干细胞、皮肤干细胞或睾丸细胞)、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或诱导型多能干细胞。

在一些实施方案中，在去核之前，通过本文公开的或本领域已知的任何方法融合两种或更多种细胞(例如，本文公开的任何细胞)。融合产物的去核可产生细胞质。

在一些实施方案中，第一细胞质与细胞或第二细胞质融合。在一些实施方案中，细胞是任何有核细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞或本文所述的任何哺乳动物细胞)、原生动物细胞(例如，阿米巴细胞)、藻类细胞、植物细胞、真菌细胞、无脊椎动物细胞、鱼类细胞、两栖动物细胞、爬行动物细胞或鸟细胞)。在一些实施方案中，第二细胞是合成细胞。因此，提供了改变细胞行为的方法，包括将细胞与本文所述的任何细胞质融合。本文还提供了包括将治疗有效量的已经融合细胞质的细胞施用于对象的方法。

在一些实施方案中，第二细胞质来源于与第一细胞质相同类型的细胞。在一些实施方案中，第二细胞质来源于与第一细胞质不同类型的细胞。在一些实施方案中，第二细胞质包含或表达至少一种治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子治疗剂、治疗性基因编辑因子、治疗性纳米颗粒、或与第一细胞质中包含或表达的治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子治疗剂、治疗性基因编辑因子、治疗性纳米颗粒相同的另一种活性剂。在一些实施方案中，第二细胞质包含或表达至少一种治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子治疗剂、治疗性基因编辑因子、治疗性纳米颗粒、或与第一细胞质中包含或表达的治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子治疗剂、治疗性基因编辑因子、治疗性纳米颗粒不同的另一种活性剂。在一些实施方案中，可以使用本领域已知的任何方法(例如，使用基于病毒的细胞表面肽的电融合或病毒融合)将第一细胞质融合到细胞或第二细胞质。

在一些实施方案中，细胞质不是天然存在的去核细胞。在一些实施方案中，细胞质不是获自自然去核的细胞。在一些实施方案中，细胞质不是已经在对象体内被去核的细胞。在一些实施方案中，细胞质不是获自对象体内将被去核的细胞。在一些实施方案中，细胞质不是获自有核红细胞。在一些实施方案中，细胞质获自在其寿命期间(例如，在不存在诸如本文所述的去核的操作的情况下)维持细胞核的细胞。在一些实施方案中，细胞质不是在对象中作为无细胞核的细胞(例如，红细胞、血小板、晶状体细胞或其直接有核前体细胞)发现的细胞。在一些实施方案中，细胞质包括一种或多种选自内质网、高尔基体、线粒体、核糖体、蛋白酶体或剪接体的组分。在一些实施方案中，细胞质的特征在于一个或多个以下特征：粘附、隧道纳米管形成、肌动蛋白介导的扩散(2D和/或3D)、迁移、化学引诱物梯度感测、线粒体转移、mRNA翻译、蛋白质合成和外泌体和/或其他生物活性分子的分泌。在一些实施方案中，细胞质的特征在于(例如，使用外泌体)分泌蛋白质能力。在一些实施方案中，细胞质已经离体去核。在一些实施方案中，细胞质已经在体外去核。在一些实施方案中，细胞质已经(例如，通过离心)被物理去核。在一些实施方案中，细胞质是工程改造的去核细胞。在一些实施方案中，细胞质不是红细胞。在一些实施方案中，细胞质不含血红蛋白。在一些实施方案中，细胞质不具有双凹面形状。

在一些实施方案中，细胞质不是获自有核红细胞。在一些实施方案中，细胞质获自不会变成红细胞(RBC)的细胞。与RBC不同，细胞质可以是能保留许多活性生物过程和所有细胞器(例如ER/高尔基体、线粒体、核内体、溶酶体、细胞骨架等)的活细胞样实体。因此，细胞质可以像有核细胞一样起作用，并且表现出关键的生物学功能，例如粘附、隧道纳米管形成、肌动蛋白介导的扩散(2D和3D)、迁移、化学引诱物梯度感测、线粒体转移、mRNA翻译、蛋白质合成以及外泌体和其他生物活性分子的分泌。RBC可能不会表现出这些功能中的一项或多项。与源自成红细胞的RBC相比，细胞质可源自任何类型的有核细胞，包括但不限于iPSC(诱导型多能干细胞)、任何永生化细胞、干细胞、原代细胞(例如，宿主来源的细胞)、细胞系、任何免疫细胞、癌细胞或源自任何真核细胞。在一些实施方案中，细胞质获自淋巴祖细胞。在一些实施方案中，细胞质获自淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞质(例如，从骨髓)获得间充质干细胞。在一些实施方案中，细胞质获自内皮干细胞。在一些实施方案中，细胞质获自神经干细胞。在一些实施方案中，细胞质获自皮肤干细胞。

B.病原体

在一些实施方案中，本文所述的细胞质和含有细胞质的组合物包含靶向和/或杀死病原体或以其他方式使其不可操作的生物分子(例如，疫苗、治疗剂、靶向部分)。在一些实施方案中，病原体是细菌、病毒、真菌或毒素。在一些实施方案中，病原体是天然存在的。在一些实施方案中，病原体是合成的。

在一些实施方案中，病原体是病毒。在一些实施方案中，病毒是动物病毒、植物病毒、细菌病毒或古细菌病毒。在一些实施方案中，动物病毒在相同或不同的动物中引起疾病或病症。在一些实施方案中，病毒是RNA病毒或DNA病毒。在一些实施方案中，RNA或DNA病毒是单链或双链的。在一些实施方案中，DNA或RNA病毒是正义或反义病毒。

在一些实施方案中，双链病毒(dsDNA)病毒来自以下家族：肌病毒科(Myoviridae)、短尾病毒科(Podoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、鱼疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、贝类疱疹病毒科(Malacoherpesviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、瓶状病毒科(Ampullaviridae)、囊泡病毒科(Ascoviridae)、非洲猪瘟病毒科(Asfaviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、双尾病毒科(Bicaudaviridae)、棒状病毒科(Clavaviridae)、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、微小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、球状病毒科(Globuloviridae)、滴状病毒科(Guttaviridae)、肥大唾腺炎病毒科(Hytrosaviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、Marseilleviridae、拟菌病毒科(Mimiviridae)、线头病毒科(Nimaviridae)、Pandoraviridae、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、藻类脱氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、多DNA病毒(Polydnaviruses)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、球脂状病毒科(Sphaerolipoviridae)和复层病毒科(Tectiviridae)。

在一些实施方案中，单链(ssDNA)病毒来自以下家族：指环病毒科(Anelloviridae)、Bacillariodnaviridae、二分DNA病毒科(Bidnaviridae)、环病毒科(Circoviridae)、双生病毒科(Geminiviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、微病毒科(Microviridae)、矮化病毒科(Nanoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)和Spiraviridae。

含有ss和dsDNA区的DNA病毒可以来自于pleolipoviruse群。在一些实施方案中，pleolipoviruse包括西班牙盐盒菌多形性病毒1(Haloarcula hispanica pleomorphicvirus 1)、波多黎各盐几何形菌多形性病毒1(Halogeometricum pleomorphic virus 1)、盐红菌属多形性病毒1(Halorubrum pleomorphic virus 1)、盐红菌属多形性病毒2、盐红菌属多形性病毒3和盐红菌属多形性病毒6。

在一些实施方案中，dsRNA病毒来自以下家族：双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、金色病毒科(Chrysoviridae)、囊状噬菌科(Cystoviridae)、内源核糖核酸病毒科(Endornaviridae)、减毒病毒科(Hypoviridae)、巨大病毒科(Megavirnaviridae)、分体病毒科(Partitiviridae)、小双节RNA病毒(Picobirnaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、轮状病毒(Rotavirus)和全病毒科(Totiviridae)。

在一些实施方案中，正义ssRNA病毒可以来自以下家族：甲型线形病毒科(Alphaflexiviridae)、甲型四体病毒科(Alphatetraviridae)、Alvernaviridae、动脉炎病毒科(Arteriviridae、星状病毒科(Astroviridae)、Barnaviridae、乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、Carmotetraviridae、长线形病毒科(Closteroviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、二顺反子病毒科(Dicistroviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、丙型线形病毒科(Gammaflexiviridae)、Iflaviridae、光滑病毒科(Leviviridae)、黄症病毒科(Luteoviridae)、Marnaviridae、海洋病毒科(Mesoniviridae)、裸露RNA病毒科(Narnaviridae)、野田村病毒科(Nodaviridae)、转置四T病毒科(Permutotetraviridae)、微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、杆套病毒科(Roniviridae)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)和帚状病毒科(Virgaviridae)。

在一些实施方案中，负义ssRNA病毒可以来自以下家族：博尔纳病毒科(Bornaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、Nyamiviridae、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、蛇形病毒科(Ophioviridae)和正粘病毒科(Orthomyxoviridae)。

病毒的非限制性实例包括：Abelson白血病病毒、Abelson鼠白血病病毒、Abelson病毒、急性喉气管支气管炎病毒、阿德莱德河病毒、腺相关病毒群、腺病毒、非洲马瘟病毒、非洲猪瘟病毒、AIDS病毒、水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease parvovirus)、甲型逆转录病毒属、甲病毒属、ALV相关病毒、阿马帕里病毒、口蹄疫病毒属、水生呼肠孤病毒、虫媒病毒、虫媒病毒C型、虫媒病毒A群、虫媒病毒B群、沙粒病毒群、阿根廷出血热病毒、阿根廷出血热病毒、动脉炎病毒、星状病毒、侏猴疱疹病毒群(Ateline herpesvirus group)、猪疱疹病毒(Aujezky'sdisease virus)、奥拉病毒、Ausuku病病毒、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒、禽腺病毒、鸟类成红细胞增多症病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒(avian leukemiavirus)、禽白血病病毒(avian leukosis virus)、禽淋巴瘤病毒、禽类成髓细胞性白血病病毒(avian myeloblastosis virus)、禽副粘病毒(avian paramyxovirus)、禽肺脑炎病毒、禽网状内皮细胞增殖病病毒(avian reticuloendotheliosis virus)、禽肉瘤病毒(aviansarcoma virus)、禽C型逆转录酶病毒群、禽肝病毒属(Avihepadnavirus)、禽痘病毒属(Avipoxvirus)、B病毒、B19病毒、巴班肯病毒(Babanki virus)、狒狒疱疹病毒、杆状病毒、巴马哈森林病毒、贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、Berimah病毒、乙型逆转录病毒(Betartrevirus)、双RNA病毒、Bittner病毒、BK病毒、黑港渠病毒(Black Creek Canalvirus)、蓝舌病毒、玻利维亚出血热病毒、Boma病毒、绵羊边境病毒、博尔纳病毒、牛α疱疹病毒1型、牛α疱疹病毒2型、牛冠状病毒、牛流行热病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒(bovine leukemia virus)、牛白血病病毒(bovine leukosis virus)、牛乳头炎病毒、牛乳头瘤病毒、牛丘疹性口炎病毒、牛细小病毒、牛合胞病毒、牛C型肿瘤病毒、牛病毒性腹泻病毒、博吉河病毒(Buggy Creek virus)、弹形病毒群、布尼奥罗病毒超群(Bunyamwera virussupergroup)、布尼亚病毒、伯基特淋巴瘤病毒、布汪巴热(Bwamba Fever)、CA病毒、杯状病毒、加利福利亚脑炎病毒、骆驼痘病毒、金丝雀痘病毒、犬疱疹病毒(canid herpesvirus)、犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬疱疹病毒(canine herpesvirus)、犬微小病毒(canine minutevirus)、犬细小病毒、卡尼奥德尔加蒂图病毒(Cano Delgadito virus)、山羊关节炎病毒、山羊脑炎病毒、山羊疱疹病毒、山羊痘病毒、心脏病毒、豚鼠疱疹病毒1型(caviidherpesvirus 1)、猕猴疱疹病毒1型、猴疱疹病毒1型(cercopithecine herpesvirus 1)、猴疱疹病毒2型、钱迪普拉病毒(Chandipura virus)、张格罗拉病毒(Changuinola virus)、斑点叉尾鮰病毒(channel catfish virus)、查里维勒河病毒(Charleville virus)、水痘病毒、奇昆古尼亚病毒(Chikungunya virus)、黑猩猩疱疹病毒、鱼呼肠孤病毒(chubreovirus)、大马哈鱼病毒、可卡耳病毒(Cocal virus)、银大马哈鱼呼肠病毒、媾疹病毒(coital exanthema virus)、科罗拉多蜱传热病毒、科罗拉多壁虱热病毒Coltivirus、哥伦比亚SK病毒、普通感冒病毒、传染性皮疹病毒、传染性脓疱性皮炎病毒、冠状病毒、科里帕塔病毒(Corriparta virus)、鼻炎病毒、牛痘病毒、柯萨奇病毒、CPV(胞质多角体病毒)、蟋蟀麻痹病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、哮吼伴随病毒、隐病毒、质型多角体病毒属(Cypovirus)、巨细胞病毒、巨细胞病毒群、胞质多角体病毒、鹿乳头瘤病毒、δ逆转录病毒、登革热病毒、浓核病毒属(Densovirus)、依赖病毒属(Dependovirus)、多里病毒(Dhorivirus)、双体瘤病毒(diploma virus)、果蝇丙型病毒、鸭乙型肝炎病毒、鸭肝炎病毒1、鸭肝炎病毒2、轮状病毒duovirus、杜文海格病毒(Duvenhage virus)、羽翼畸形病毒(Deformedwing virus 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virus)、蝮蛇逆转录病毒、病毒性出血性败血症病毒、维斯纳一梅迪病毒、绵羊髓鞘脱落病毒、田鼠痘病毒、VSV(水泡性口炎病毒)、沃洛尔病毒、沃雷戈病毒、疣病毒、WEE病毒、西尼罗病毒、西部马脑炎病毒、西部马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒、冬季呕吐病毒、土拨鼠乙肝病毒、绒毛猴肉瘤病毒、伤口肿瘤病毒、WRSV病毒、雅巴猴瘤病毒、雅巴病毒、亚塔痘病毒、黄热病毒和尤格波格丹诺夫奇病毒(Yug Bogdanovac virus)。

在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒可以选自：α冠状病毒、β冠状病毒、δ冠状病毒和γ冠状病毒。甲冠状病毒的实例可包括但不限于蝙蝠冠状病毒CDPHE15、蝙蝠冠状病毒HKU10、人冠状病毒229E、人冠状病毒NL63、长翼蝠属蝙蝠冠状病毒1、长翼蝠属蝙蝠冠状病毒HKU8、水貂冠状病毒1、猪流行性腹泻病毒、菊头蝠属蝙蝠冠状病毒HKU2、黄蝠属蝙蝠冠状病毒512。β冠状病毒的实例可包括但不限于β冠状病毒1、长冠状病毒1、人冠状病毒HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒、鼠冠状病毒、伏翼属蝙蝠冠状病毒HKU5、果蝇属蝙蝠冠状病毒HKU9、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒、扁颅蝠属蝙蝠冠状病毒HKU4。δ冠状病毒的实例可包括但不限于夜莺冠状病毒HKU11、黑水鸡冠状病毒HKU21、冠状病毒HKU15、南亚文鸟冠状病毒HKU13、夜鹭冠状病毒HKU19、画眉冠状病毒HKU12、绣眼鸟冠状病毒HKU16、野鸭冠状病毒HKU20。γ冠状病毒的实例可包括但不限于禽类冠状病毒、白鲸冠状病毒SW1。冠状病毒的其他实例可包括MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2。在一些实施方案中，冠状病毒可以是SARS-CoV-2。

在一些实施方案中，病原体能够：容易在人与人之间传播或传输；导致高死亡率，并可能对公共卫生产生重大影响；造成公众恐慌和社会破坏；以及需要采取特别行动做好公共卫生准备。这些病原体的实例可包括炭疽(炭疽芽孢杆菌)、肉毒中毒(肉毒梭状芽胞杆菌毒素)、鼠疫(鼠疫耶尔森氏菌)、天花(大天花)、兔热病(土拉热弗朗西丝氏菌)或病毒出血热、包括丝状病毒(埃博拉、马尔堡)和沙粒病毒(拉沙病毒、马秋波病毒)。

在一些实施方案中，病原体能够：适度易于散播；导致中等发病率和低死亡率；以及需要特别加强诊断能力和加强疾病监测。这些病原体的实例可以包括布鲁氏菌病(布鲁氏菌属)、产气荚膜梭菌的ε毒素、食品安全威胁(例如，沙门氏菌属、大肠杆菌O157:H7或志贺氏菌属)、鼻疽病(鼻疽病)、类鼻疽(鼻疽病)、鹦鹉热(鼻疽病)、Q热病(伯纳特氏立克次氏体)、来自蓖麻(蓖麻子)的蓖麻毒素、葡萄球菌肠毒素B、斑疹伤寒(普氏立克次氏体)、病毒性脑炎(甲病毒属，例如东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎和西方马脑炎)或水安全威胁(例如，霍乱弧菌和微小隐孢子虫)。

在一些实施方案中，病原体是具有尚未鉴定的序列的新出现的病原体。在一些实施方案中，新出现的病原体具有高发病率和死亡率以及主要健康影响的潜力。这些病原体的实例可以包括尼帕病毒和汉坦病毒。

在一些实施方案中，病原体可包含毒素。在一些实施方案中，毒素可由本文所述的任一种病原体分泌。

在一些实施方案中，病原体包含细菌。在一些实施方案中，细菌可以是革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，细菌是对β-内酰胺酶具有抗性的菌株。在一些实施方案中，抗原来源于产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、产志贺毒素大肠杆菌(STEC)、空肠弯曲杆菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、变异链球菌、幽门螺杆菌或炭疽芽孢杆菌。

可用本文所述的去核细胞、组合物或药物组合物治疗的病原体和与这些病原体相关的疾病或病症的示例性列表可见于表3-6。

表3可通过细胞质治疗或接种疫苗的示例性病毒和病毒性疾病

表4可通过细胞质治疗或接种疫苗的示例性细菌和细菌性疾病

表5可通过细胞质治疗或接种疫苗的示例性寄生虫和真菌以及寄生虫和真菌性疾病

靶标	疾病
		VSG	布氏锥虫
VSG	人非洲锥虫
		副鞭毛杆蛋白	检测所有锥虫属物种(诊断学)
细胞壁蛋白Malf1	糠秕马拉色菌
		肌球蛋白尾相互作用蛋白	恶性疟原虫

表6可通过细胞质治疗或接种疫苗的示例性毒素和毒素疾病

C.活性药剂

本公开的细胞质表达或含有活性药剂，例如抗病毒组合物(例如，疫苗、针对病原体的中和抗体)。活性药剂可以包含治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质(例如，酶、抗体、抗原、毒素、细胞因子、蛋白质激素、生长因子、细胞表面受体或疫苗)、治疗性肽(例如，肽激素或抗原)、小分子活性药剂(例如，类固醇、聚酮化合物、生物碱、毒素、抗生素、抗病毒剂、秋水仙碱、紫杉醇、丝裂霉素或emtansine)和治疗性基因编辑因子中的至少一种。在一些实施方案中，细胞质可以经工程改造以产生(例如，表达，并且在一些实施方案中，分泌)治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、治疗性小分子或治疗性基因编辑组分中的至少一种。或者，或另外，有核细胞(如本文所用的“亲本”细胞)可以经工程改造以在去核成细胞质之前产生治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子活性药剂和基因编辑因子中的至少一种。

治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子活性药剂或治疗性基因编辑因子可以包括靶向部分。可以由细胞质产生或包含在细胞质中的非限制性示例性靶向部分包括趋化因子受体、粘附分子和抗原。

本公开的细胞质可以施用至对象，并且可以含有治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质(例如，酶、抗体、抗原、毒素、细胞因子、蛋白质激素、生长因子、细胞表面受体或疫苗，或者目前可获得的或正在开发中的任何治疗性蛋白质)、治疗性肽(例如，肽激素或抗原，或者目前可获得的或正在开发中的任何治疗性肽)、小分子活性药剂(例如，类固醇、聚酮化合物、生物碱、毒素、抗生素、抗病毒剂、止痛剂、抗凝血剂、抗抑郁剂、抗癌药、抗癫痫剂、抗精神病药、镇静剂、秋水仙碱、紫杉醇、丝裂霉素、emtansine，或者目前可获得的或正在开发中的任何小分子活性药剂)、治疗性基因编辑因子、治疗性纳米颗粒或另一种活性药剂(例如，细菌、细菌孢子、噬菌体、细菌组分、病毒(例如，溶瘤病毒)、外泌体、脂质或离子)。溶瘤病毒的非限制性实例包括Talimogene laherparepvec、Onyx-015、GL-ONC1、CV706、Voyager-V1和HSV-1716。一些野生型病毒也表现出溶瘤行为，例如牛痘病毒、水泡性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡病毒(Senecavirus)、ECHO-7和塞姆利基森林病毒。

在一些实施方案中，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子是重组表达的。在一些实施方案中，细胞质来源于其中或获得细胞质的细胞经工程改造以产生DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子中的一种或多种。在一些实施方案中，细胞质来源于其中或获得细胞质的细胞经工程改造以稳定地(例如，永久地)表达DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子中的一种或多种。在一些实施方案中，细胞质来源于其中或获得细胞质的细胞经工程改造以瞬时表达DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子中的一种或多种。在一些实施方案中，细胞质来源于其中或获得细胞质的细胞在去核之前经工程改造。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以瞬时表达DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子中的一种或多种(例如，在去核后经工程改造)。

在一些实施方案中，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子在细胞质来源于其中或获得细胞质的细胞中不天然表达(例如，在缺乏工程改造的情况下)(例如，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子对于细胞质是外源性的)。在一些实施方案中，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子在对象中不天然表达(例如，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子对于对象是外源性的)。在一些实施方案中，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子在对象的预期治疗部位(例如，肿瘤或特定组织，例如脑、肠、肺、心脏、肝、脾、胰腺、肌肉、眼等)中不天然表达(例如，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子对于预期治疗部位是外源性的)。

在一些实施方案中，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子在细胞质来源于其中或获得细胞质的细胞中天然表达(例如，在缺乏工程改造的情况下)(例如，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子对于细胞质是天生内源的)(例如，在细胞质来源于其中或获得细胞质的细胞没有工程改造的情况下)。在一些实施方案中，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子在对象中天然表达(例如，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子对于对象是内源的)。在一些实施方案中，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子在对象的预期治疗部位(例如，肿瘤或特定组织，例如脑、肠、肺、心脏、肝、脾、胰腺、肌肉、眼等)中天然表达(例如，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子对于预期治疗部位是内源的)。

在一些实施方案中，治疗剂(例如，DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子)来源于合成细胞并装载到细胞质中。

在一些实施方案中，与细胞质来源于其中或获得细胞质的细胞相比，细胞质表达DNA分子、RNA分子、蛋白质、肽、小分子活性药剂和/或基因编辑因子的校正、截短或非突变形式和/或拷贝。在一些实施方案中，细胞质获自任何有核细胞(例如，真核细胞、哺乳动物细胞(例如，人类细胞或本文所述的任何哺乳动物细胞)、原生动物细胞(例如，变形虫细胞)、藻类细胞、植物细胞、真菌细胞、无脊椎动物细胞、鱼类细胞、两栖动物细胞、爬行动物细胞或鸟类细胞)。

在一些实施方案中，细胞质以任何组合产生或含有至少2种(例如，至少2种、3种、4种、5种或更多)不同的治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子活性药剂或治疗性基因编辑因子。例如，在一些实施方案中，细胞质可以产生或含有治疗性DNA分子和小分子活性药剂。例如，在一些实施方案中，细胞质可以产生或含有两种不同的小分子活性药剂。例如，在一些实施方案中，细胞质可以产生或含有趋化因子受体(例如，用于靶向)和小分子活性药剂。

在一些实施方案中，治疗性RNA分子是信使RNA(mRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)或RNA病毒。在一些实施方案中，治疗性DNA分子是单链DNA、双链DNA、寡核苷酸、质粒、细菌DNA分子或DNA病毒。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是细胞因子、生长因子、激素、抗体、基于小肽的药物或酶。在一些实施方案中，细胞质瞬时表达治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子治疗剂和/或治疗性基因编辑因子。在一些实施方案中，治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子治疗剂和/或治疗性基因编辑因子的表达是可诱导的。在一些实施方案中，有核细胞永久地经工程改造以表达治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子治疗剂和/或治疗性基因编辑因子。在一些实施方案中，治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子治疗剂和/或治疗性基因编辑因子的表达。在本文所述的方法中的任一种的一些实施方案中，细胞质包含活性药剂或纳米颗粒。在一些实施方案中，活性药剂是小分子或细菌或外泌体。

对于治疗性细胞的全身施用，它们成功归巢到病变组织存在两个主要问题。首先，细胞中的大多数可能被困在肺或其他组织中的小毛细血管中，这也可能引起严重的副作用，例如肺栓塞。在一些实施方案中，细胞质比其亲本细胞小得多(例如，亲本细胞直径的约60％和体积的1/8)，并且不具有刚性核，因此，细胞质可以比其亲本细胞更好地通过小毛细血管和血管。其次，细胞向病变组织的特异性归巢可以取决于趋化因子受体信号传导，例如SDF-1α/CXCR4、CCL2/CCR2和粘附分子，例如PSGL-1。如本文所示，细胞质可以经工程改造以特异性表达功能性CXCR4、CCR2以及糖基化PSGL-1，这可以极大地促进经工程改造的细胞质的特异性归巢。

在一些实施方案中，细胞质还可以包括(例如，通过工程改造或来自获得它们的细胞)靶向部分，其在细胞质的细胞表面上表达，例如，CXCR4、CCR2或PSGL-1。可以在细胞质的细胞表面上表达的细胞表面蛋白质的非限制性实例包括趋化因子，例如CXCR4、CCR2、CCR1、CCR5、CXCR7、CXCR2和CXCR1。可以在细胞质的细胞表面上作为归巢受体表达的细胞表面蛋白质的其他实例可以包括C-X-C趋化因子受体3型、白细胞唾液酸蛋白、CD44抗原、C-C趋化因子受体7型、L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1或极晚期抗原4(very late antigen-4)或其组合。在一些实施方案中，细胞质还可以包括(例如，通过工程改造或来自获得它们的细胞)细胞靶向部分，其由细胞质分泌或系至细胞外基质，例如，SDF1α或CCL2。可以由细胞质分泌用于细胞归巢的蛋白质的非限制性实例包括：SDF1α、CCL2、CCL3、CCL5、CCL8、CCL1、CXCL9、CXCL10、CCL11和CXCL12。靶向部分可以将细胞质引导至靶细胞、靶组织或靶环境。在一些实施方案中，靶向部分基于趋化因子/趋化因子受体传感引导细胞质。在一些实施方案中，靶向部分基于直接结合引导细胞质。例如，靶向部分可以包含抗体，其可结合至靶细胞表达的抗原。

在一些实施方案中，细胞质可以表达和/或分泌选自以下的细胞因子中的至少一种：4-1BBL、酰化刺激蛋白、脂肪因子、albinterferon、APRIL、Arh、BAFF、Bcl-6、CCL1、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCR10、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CD153、CD154、CD178、CD40LG、CD70、CD95L/CD178、Cerberus(蛋白质)、趋化因子、CLCF1、CNTF、集落刺激因子、共同b链(CD131)、共同g链(CD132)、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL9、CXCR3、CXCR4、CXCR5、EDA-A1、Epo、红细胞生成素、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4、FAM19A5、Flt-3L、FMS样酪氨酸激酶3配体、Foxp3、GATA-3、GcMAF、G-CSF、GITRL、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、肝细胞生长因子、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA5/IFNaG、IFNA7、IFNA8、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFNω/IFNW1、IL-1、IL-10、IL-10家族、IL-10样、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17家族、IL-17A-F、IL-18、IL-18BP、IL-19、IL-1A、IL-1B、IL-1F10、IL-1F3/IL-1RA、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1样、IL-1RA、IL-1RL2、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-3、IL-31、IL-33、IL-35、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6样、IL-7、IL-8/CXCL8、IL-9、炎性体、干扰素组(interferome)、干扰素、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ、I型干扰素、II型干扰素、III型干扰素、干扰素类、白细胞介素、白细胞介素1受体拮抗剂、白细胞介素8、IRF4、瘦素、白血病抑制因子(LIF)、白血球促进因子、LIGHT、LTA/TNFB、LT-β、淋巴因子、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白、巨噬细胞激活因子、M-CSF、MHC III类、杂类血细胞生成素、单核因子、MSP、肌肉因子(myokine)、肌连素(myonectin)、烟酰胺磷酸核糖基转移酶、抑瘤素M(OSM)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、OX40L、血小板因子4、原形成素、RANKL、SCF、STAT3、STAT4、STAT6、基质细胞来源因子1、TALL-1、TBX21、TGF-α、TGF-β、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TNF、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF4、TNFSF8、TNF-α、TNF-β、Tpo、TRAIL、TRANCE、TWEAK、血管内皮生长抑制剂、XCL1或XCL2。

在一些实施方案中，细胞质可以表达和/或分泌至少一种细胞因子，以调节骨髓细胞、T细胞(例如，αβ细胞毒性T细胞、γδT细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞或各种基质细胞中的任一种的生物活性。

在一些实施方案中，细胞质可以进一步包括(例如，通过工程改造或来自获得它们的细胞)表面标志物，其帮助它们逃避对象免疫系统。例如，在一些实施方案中，细胞质可以包括CD47标志物。不受任何特定理论的束缚，认为CD47标志物有助于防止细胞质被巨噬细胞吞噬。细胞-基质受体和细胞-细胞粘附分子的非限制性实例包括整联蛋白、钙粘素、糖蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖。治疗性分子的非限制性实例包括肿瘤抗原和免疫调节肽、聚胺和ATP。

1.疫苗组合物

在一些实施方案中，本文描述了经工程改造以表达或递送作为疫苗组合物的活性药剂的细胞质。在一些实施方案中，使用本文所述的方法将编码疫苗组合物的核酸分子引入细胞质或其亲本细胞中。在一些实施方案中，使用对于相应亲本细胞内源的细胞机制(例如，mRNA翻译机制、蛋白质合成)在细胞质中表达疫苗组合物。在一些实施方案中，一旦施用至对象，细胞质就利用相应亲本细胞的内源性蛋白质分泌机制将疫苗组合物分泌至细胞外空间。细胞质也可以用特异于分泌疫苗组合物的对象的靶组织(例如，肺、淋巴)的归巢受体进行工程改造。细胞质也可以经工程改造以表达免疫系统激活剂，例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或者本文所述的细胞因子或细胞因子受体中的任一种。

在一些实施方案中，疫苗组合物针对病原体的抗原。抗原的非限制性实例包括包含天然序列的蛋白质、包含天然或非天然氨基酸和/或具有修饰(例如，糖基化、棕榈酰化、肉豆蔻酰化等)的多肽，以及包含天然或非天然碱基的核酸。病原体可以是引起哺乳动物感染的任何细菌、病毒或真菌。在一些实施方案中，病原体可以是病毒。在一些实施方案中，病毒抗原可以由病毒蛋白、病毒蛋白的片段、或编码病毒蛋白或病毒蛋白的片段的核酸制备。在一些实施方案中，疫苗包含本文所述的病毒的灭活形式。在一些实施方案中，疫苗包含本文所述的病毒的减毒活形式。在一些实施方案中，减毒活病毒是活的但复制缺陷的病毒。在其他情况下，减毒活病毒是活的但没有传染性的病毒。

在一些实施方案中，在向对象施用包含疫苗组合物的细胞质后，包含本文所述的细胞质的疫苗诱导对象的适应性免疫应答。在一些实施方案中，本文所述的疫苗诱导适应性免疫应答，其足以使对象针对病毒感染进行免疫或减轻由病毒感染引起的疾病或病症的严重程度。

在一些实施方案中，本文提供了经工程改造以表达针对本文所公开的病原体的病毒抗原的疫苗组合物的细胞质。病毒可以是DNA病毒或RNA病毒。DNA病毒可以是单链(ss)DNA病毒、双链(ds)DNA病毒或含有ssDNA和dsDNA区域的DNA病毒。RNA病毒可以是单链(ss)RNA病毒或双链(ds)RNA病毒。ssRNA病毒可以进一步分为正义RNA病毒或负义RNA病毒。

在一些实施方案中，病毒抗原与由流感的任何属、菌株或亚型编码的流感蛋白具有至少或等于50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性。示例性流感属可以包括A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒。在一些实施方案中，本文所述的细胞质可以经工程改造以表达血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的流感病毒蛋白的组合。可由本文所述的细胞质表达的流感血凝素(HA)可以包括HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18。可由本文所述的细胞质表达的流感神经氨酸酶(NA)可以包括NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10或N11。在一些实施方案中，本文所述的细胞质可以表达本文所述的HA和NA亚型中的任一种的组合。可由单一细胞质表达的示例性组合可以包括H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9或H6N1。其他附加的示例性组合可以包括H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1NG、H1N7、H1N8、H1N9、H1N10、H1N11、H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2NG、H2N7、H2N8、H2NB、H2N1D、H2N11、H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3NB、H3N7、H3N8、H3NB、H3N1D、H3N11、H4N1、H4N2、H4N3、H4N4、H4N5、H4NB、H4N7、H4N8、H4N9、H4N10、H4N11、H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5NB、H5N7、H5N8、H5N3、H5N1D、H5N11、HBN1、HBN2、HBN3、HBN4、HBN5、HBNB、HBN7、HBN8、HBN9、HBN10、HBN11、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7NB、H7N7、H7N8、H7N9、H7N10、H7N11、H8N1、H8N2、H8N3、H8N4、H8N5、H8NG、H8N7、H8N8,5H8N9、H8N10、HBN11、HBN1、H9N2、HBN3、H9N4、H3N5、H3N7、H3N8、H3N3、H9N1D、HBN11、H1DN1、H10N2、H1DN3、H1DN4、H1DN5、H1DNG、H1DN7、H1DN8、H1DN3、H10N10、H1DN11、H11N1、H11N2、H11N3、H11N4、H11N5、HUNG、H11N7、HUNS、H11NS、H11N10、H11N11、H12N1、H12N2、H12N3、H12N4、H12N5、H12NB、H12N7、H12N8、H12N3、H12N1D、H12N11、H13N1、H13N2、H13N3、H13N4、H13N5、H13NB、H13N7、H13N8、H13N3、H13N1D、H13N11、H14N1、H14N2、H14N3、H14N4、H14N5、H14NB、H14N7、H14N8、H14N9、H14N10、H14N11、H15N1、H15N2、H15N3、H15N4、H15N5、H15NB、H15N7、H15N8、H15N3、H15N1D、H15N11、H1BN1、H1BN2、H1BN3、H1BN4、H1BN5、H1BNB、H1BN7、H1BN8、H1GN3、H1BN10、H1BN11、H17N1、H17N2、H17N3、H17N4、H17N5、H17NB、H17N7、H17N8、H17N3、H17N10、H17N11、H1BN1、H18N2、H18N3、H18N4、H18N5、H1BNB、H18N7、H18N8、H18N3、H1BN10或H1BN11。

在一些实施方案中，本文提供了经工程改造以表达针对细菌抗原的疫苗组合物的细胞质。在一些实施方案中，细菌抗原来源于炭疽(炭疽芽孢杆菌)、肉毒杆菌中毒(肉毒杆菌毒素)、鼠疫(鼠疫耶尔森菌)、土拉菌病(土拉弗朗西斯菌)、布鲁氏菌病(布鲁氏菌属物种)、产气荚膜梭菌的ε毒素、沙门氏菌属物种、大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌属、鼻疽(鼻疽伯克霍尔德菌)、类鼻疽(类鼻疽伯克霍尔德菌)、鹦鹉热(鹦鹉热衣原体)、Q热(伯氏考克斯氏体)、葡萄球菌肠毒素B、斑疹伤寒(普氏立克次体)、霍乱弧菌、微小隐孢子虫。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达针对蓖麻(蓖麻子)的蓖麻毒蛋白的疫苗组合物。

在一些实施方案中，本文提供了经工程改造以表达针对肿瘤抗原的疫苗组合物的细胞质。如本文所用，“肿瘤抗原”是指由癌细胞产生的抗原。如本公开中所用的癌细胞或肿瘤细胞的非限制性实例可以包括癌症的细胞，包括棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、肢端汗腺瘤、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性巨核细胞白血病、急性单核细胞白血病、成熟的急性成髓细胞白血病、急性髓样树突细胞白血病、急性髓样白血病、急性早幼粒细胞白血病、釉质瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺瘤样牙源性肿瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、间变性甲状腺癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管肌脂瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样瘤、基底细胞癌、基底样癌、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤、Bellini导管癌、胆道癌、膀胱癌、胚细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、布伦纳瘤、支气管肿瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌(Cancer of UnknownPrimary Site)、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、原发部位不明癌(Carcinoma of UnknownPrimary Site)、癌肉瘤、卡斯尔曼病、中枢神经系统胚胎性肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性单核细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓性增生性障碍、慢性中性粒细胞性白血病、透明细胞肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、德戈斯病、隆凸性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、结缔组织增生性小圆细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、发育不良性神经上皮肿瘤、胚胎性癌、内胚窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、子宫内膜样瘤、肠病相关的T细胞淋巴瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文家族肿瘤、尤文家族肉瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、乳房外佩吉特氏病、输卵管癌、寄生胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞肿瘤、生殖细胞瘤、妊娠绒毛膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、骨巨细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、性腺胚细胞瘤、粒层细胞瘤、毛细胞白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌、成血管细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、恶性血液肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺-卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型粒单核细胞白血病、卡波西肉瘤、卡波西肉瘤、肾癌、Klatskin肿瘤、克鲁肯伯格肿瘤、喉癌、喉癌、恶性雀斑样痣黑色素瘤、白血病、白血病、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴样白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨的恶性纤维组织细胞瘤、恶性神经胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性外周神经鞘瘤、恶性横纹肌样瘤、恶性蝾螈瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵隔生殖细胞瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、成神经管细胞瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、转移性尿路上皮癌、混合苗勒管瘤、单核细胞白血病、口腔癌、粘液性肿瘤、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、蕈样真菌病、骨髓增生异常疾病、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、髓样肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌(NasopharyngealCancer)、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、赘生物、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳腺佩吉特病、肺上沟瘤、胰腺癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周围上皮样细胞肿瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中间分化的松果体实质肿瘤、松果体母细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T淋巴细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层肿瘤、前列腺癌、腹膜假粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及15号染色体上NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、里希特的转变、骶尾畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤病、皮脂腺癌、继发性肿瘤、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、支持间质细胞瘤、性索间质瘤、塞萨里综合征、印戒细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞肿瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓肿瘤、脊柱肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表扩散性黑色素瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、表面上皮间质瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞幼淋巴细胞白血病、畸胎瘤、终末淋巴癌、睾丸癌、泡膜细胞瘤、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖道肿瘤、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、弗纳莫里森综合征、疣状癌、视觉通路神经胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、沃辛瘤、威尔姆斯瘤及其组合。在一些实施方案中，靶向的癌细胞代表癌细胞群体内的亚群，例如癌症干细胞。在一些实施方案中，癌症是造血谱系的癌症，例如淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症可以是肺癌，包括非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)或任何其他肺癌类型。例如，肺癌可以包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞(未分化)癌、大细胞神经内分泌癌、腺鳞癌、肉瘤样癌、肺类癌瘤或腺样囊性癌。其他示例性肺癌可以包括淋巴瘤、肉瘤、良性肺肿瘤或错构瘤。

a.抗原

在一些实施方案中，本文描述了包含由细胞质表达的至少一种抗原或其部分的细胞质。在一些实施方案中，至少一种抗原可以是由癌细胞表达或释放的抗原。在一些实施方案中，至少一种抗原可以是由病原体表达或释放的抗原。在一些实施方案中，至少一种抗原可以是由病毒表达或释放的抗原。在一些实施方案中，至少一种抗原可以是由细菌表达或释放的抗原。在一些实施方案中，至少一种抗原可以是由真菌表达或释放的抗原。在一些实施方案中，至少一种抗原可以由至少一种异源多核苷酸编码，其中至少一种异源多核苷酸可以是细胞质的载物(cargo)。在一些实施方案中，异源多核苷酸可以包含病毒载体或质粒。在一些实施方案中，细胞质将异源多核苷酸递送至靶组织。在一些实施方案中，包含至少一种抗原或包含编码至少一种抗原的异源多核苷酸的细胞质可以是本说明书中描述的疫苗的一部分。

在一些实施方案中，至少一种抗原或其部分可以是表达癌细胞或与癌细胞相关的癌抗原。在一些实施方案中，细胞质在细胞质表面上表达至少一种癌抗原。在一些实施方案中，细胞质释放或分泌至少一种癌抗原。在一些实施方案中，至少一种癌抗原可以是细胞质的载物。在一些实施方案中，细胞质将至少一种癌抗原递送至靶细胞或组织。癌抗原可以由本文所述的癌细胞中的任一种表达。在一些实施方案中，当将细胞质施用至对象时，由本文所述的细胞质表达或释放的癌抗原可以足以引发免疫应答(例如，B细胞激活)。

在一些实施方案中，细胞质包含至少一种癌抗原或其部分。在一些实施方案中，细胞质包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、20种、50种、100种、200种、500种、1000种、2000种、5000种、10000种或更多癌抗原。在一些实施方案中，癌抗原与表达癌细胞或与癌细胞相关的抗原的肽基序列具有至少或等于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性。

在一些实施方案中，细胞质包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、20种、50种、100种、200种、500种、1000种、2000种、5000种、10000种或更多抗原。在一些实施方案中，抗原与本文所述的抗原的肽基序列具有大于或等于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性。在一些实施方案中，抗原或其部分包含约5个氨基酸至约5,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，抗原或其部分包含约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约50个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约200个氨基酸、约5个氨基酸至约500个氨基酸、约5个氨基酸至约1,000个氨基酸、约5个氨基酸至约2,000个氨基酸、约5个氨基酸至约5,000个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约50个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约200个氨基酸、约10个氨基酸至约500个氨基酸、约10个氨基酸至约1,000个氨基酸、约10个氨基酸至约2,000个氨基酸、约10个氨基酸至约5,000个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约50个氨基酸、约15个氨基酸至约100个氨基酸、约15个氨基酸至约200个氨基酸、约15个氨基酸至约500个氨基酸、约15个氨基酸至约1,000个氨基酸、约15个氨基酸至约2,000个氨基酸、约15个氨基酸至约5,000个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约20个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约200个氨基酸、约20个氨基酸至约500个氨基酸、约20个氨基酸至约1,000个氨基酸、约20个氨基酸至约2,000个氨基酸、约20个氨基酸至约5,000个氨基酸、约25个氨基酸至约50个氨基酸、约25个氨基酸至约100个氨基酸、约25个氨基酸至约200个氨基酸、约25个氨基酸至约500个氨基酸、约25个氨基酸至约1,000个氨基酸、约25个氨基酸至约2,000个氨基酸、约25个氨基酸至约5,000个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、约50个氨基酸至约200个氨基酸、约50个氨基酸至约500个氨基酸、约50个氨基酸至约1,000个氨基酸、约50个氨基酸至约2,000个氨基酸、约50个氨基酸至约5,000个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约500个氨基酸、约100个氨基酸至约1,000个氨基酸、约100个氨基酸至约2,000个氨基酸、约100个氨基酸至约5,000个氨基酸、约200个氨基酸至约500个氨基酸、约200个氨基酸至约1,000个氨基酸、约200个氨基酸至约2,000个氨基酸、约200个氨基酸至约5,000个氨基酸、约500个氨基酸至约1,000个氨基酸、约500个氨基酸至约2,000个氨基酸、约500个氨基酸至约5,000个氨基酸、约1,000个氨基酸至约2,000个氨基酸、约1,000个氨基酸至约5,000个氨基酸、或约2,000个氨基酸至约5,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，癌抗原包含约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约500个氨基酸、约1,000个氨基酸、约2,000个氨基酸或约5,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，癌抗原包含至少约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约500个氨基酸、约1,000个氨基酸或约2,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，癌抗原包含至多约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约500个氨基酸、约1,000个氨基酸、约2,000个氨基酸或约5,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，癌抗原包含至少约5个氨基酸至约5,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，癌抗原包含至少约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约50个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约200个氨基酸、约5个氨基酸至约500个氨基酸、约5个氨基酸至约1,000个氨基酸、约5个氨基酸至约2,000个氨基酸、约5个氨基酸至约5,000个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约50个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约200个氨基酸、约10个氨基酸至约500个氨基酸、约10个氨基酸至约1,000个氨基酸、约10个氨基酸至约2,000个氨基酸、约10个氨基酸至约5,000个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约50个氨基酸、约15个氨基酸至约100个氨基酸、约15个氨基酸至约200个氨基酸、约15个氨基酸至约500个氨基酸、约15个氨基酸至约1,000个氨基酸、约15个氨基酸至约2,000个氨基酸、约15个氨基酸至约5,000个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约20个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约200个氨基酸、约20个氨基酸至约500个氨基酸、约20个氨基酸至约1,000个氨基酸、约20个氨基酸至约2,000个氨基酸、约20个氨基酸至约5,000个氨基酸、约25个氨基酸至约50个氨基酸、约25个氨基酸至约100个氨基酸、约25个氨基酸至约200个氨基酸、约25个氨基酸至约500个氨基酸、约25个氨基酸至约1,000个氨基酸、约25个氨基酸至约2,000个氨基酸、约25个氨基酸至约5,000个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、约50个氨基酸至约200个氨基酸、约50个氨基酸至约500个氨基酸、约50个氨基酸至约1,000个氨基酸、约50个氨基酸至约2,000个氨基酸、约50个氨基酸至约5,000个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约500个氨基酸、约100个氨基酸至约1,000个氨基酸、约100个氨基酸至约2,000个氨基酸、约100个氨基酸至约5,000个氨基酸、约200个氨基酸至约500个氨基酸、约200个氨基酸至约1,000个氨基酸、约200个氨基酸至约2,000个氨基酸、约200个氨基酸至约5,000个氨基酸、约500个氨基酸至约1,000个氨基酸、约500个氨基酸至约2,000个氨基酸、约500个氨基酸至约5,000个氨基酸、约1,000个氨基酸至约2,000个氨基酸、约1,000个氨基酸至约5,000个氨基酸、或约2,000个氨基酸至约5,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，抗原或其部分包含至少约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约500个氨基酸、约1,000个氨基酸、约2,000个氨基酸或约5,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，癌抗原包含至少约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约500个氨基酸、约1,000个氨基酸或约2,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，癌抗原包含至少至多约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约500个氨基酸、约1,000个氨基酸、约2,000个氨基酸或约5,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，抗原或其部分包含至多约5个氨基酸至约5,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，癌抗原包含至多约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约50个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约200个氨基酸、约5个氨基酸至约500个氨基酸、约5个氨基酸至约1,000个氨基酸、约5个氨基酸至约2,000个氨基酸、约5个氨基酸至约5,000个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约50个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约200个氨基酸、约10个氨基酸至约500个氨基酸、约10个氨基酸至约1,000个氨基酸、约10个氨基酸至约2,000个氨基酸、约10个氨基酸至约5,000个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约50个氨基酸、约15个氨基酸至约100个氨基酸、约15个氨基酸至约200个氨基酸、约15个氨基酸至约500个氨基酸、约15个氨基酸至约1,000个氨基酸、约15个氨基酸至约2,000个氨基酸、约15个氨基酸至约5,000个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约20个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约200个氨基酸、约20个氨基酸至约500个氨基酸、约20个氨基酸至约1,000个氨基酸、约20个氨基酸至约2,000个氨基酸、约20个氨基酸至约5,000个氨基酸、约25个氨基酸至约50个氨基酸、约25个氨基酸至约100个氨基酸、约25个氨基酸至约200个氨基酸、约25个氨基酸至约500个氨基酸、约25个氨基酸至约1,000个氨基酸、约25个氨基酸至约2,000个氨基酸、约25个氨基酸至约5,000个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、约50个氨基酸至约200个氨基酸、约50个氨基酸至约500个氨基酸、约50个氨基酸至约1,000个氨基酸、约50个氨基酸至约2,000个氨基酸、约50个氨基酸至约5,000个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约500个氨基酸、约100个氨基酸至约1,000个氨基酸、约100个氨基酸至约2,000个氨基酸、约100个氨基酸至约5,000个氨基酸、约200个氨基酸至约500个氨基酸、约200个氨基酸至约1,000个氨基酸、约200个氨基酸至约2,000个氨基酸、约200个氨基酸至约5,000个氨基酸、约500个氨基酸至约1,000个氨基酸、约500个氨基酸至约2,000个氨基酸、约500个氨基酸至约5,000个氨基酸、约1,000个氨基酸至约2,000个氨基酸、约1,000个氨基酸至约5,000个氨基酸、或约2,000个氨基酸至约5,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，癌抗原包含至多约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约500个氨基酸、约1,000个氨基酸、约2,000个氨基酸或约5,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，癌抗原包含至多至少约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约500个氨基酸、约1,000个氨基酸或约2,000个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，癌抗原包含至多约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约500个氨基酸、约1,000个氨基酸、约2,000个氨基酸或约5,000个氨基酸的氨基酸长度。

在一些实施方案中，细胞质在细胞质表面上表达抗原。在一些实施方案中，细胞质释放或分泌抗原。在一些实施方案中，抗原可以是细胞质的载物。在一些实施方案中，细胞质将抗原递送至靶细胞或组织。在一些实施方案中，当将细胞质施用至对象时，由本文所述的细胞质表达或释放的抗原可以足以引发免疫应答(例如，B细胞激活)。

在一些实施方案中，抗原或其部分是癌抗原。在一些实施方案中，癌抗原是被引入癌细胞中的病原体抗原。例如，细胞质可以经工程改造以将SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白引入癌细胞中。在这种情况下，已接种抗SARS-CoV-2的疫苗的对象将获得适应性免疫系统，其可以靶向并杀死癌细胞。在一些实施方案中，通过利用溶瘤病毒作为载体(装载到细胞质中)将mRNA引入癌细胞中，可以将癌抗原引入癌细胞中。

在一些实施方案中，至少一种抗原可以是病原体抗原。在一些实施方案中，病原体抗原是病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或毒素抗原。抗原可以由本文所述的任一种(例如，表3-6的病原体中的任一种)表达。在一些实施方案中，至少一种抗原可以是病毒抗原。病毒抗原可以是本文所述的病毒(例如，SARS-CoV-2)的抗原。在一些实施方案中，抗原来源于冠状病毒。在一些实施方案中，细胞质包含至少一种病毒抗原，其是冠状病毒的刺突蛋白(S蛋白)或刺突蛋白的片段。在一些实施方案中，刺突蛋白或其片段可以是单体或三聚体。在一些实施方案中，刺突蛋白是融合前稳定的刺突蛋白。在一些实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV-2。

在一些实施方案中，刺突蛋白或其片段的病毒抗原与SEQ IDNO:2或8具有至少或等于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性。在一些实施方案中，包含刺突蛋白或其片段的病毒抗原包含如da Silva Filipe,A.,Shepherd,J.G.,Williams,T.等人Genomic epidemiology reveals multiple introductions of SARS-CoV-2frommainland Europe into Scotland.Nat Microbiol 6,112–122(2021)中所述的至少一个突变或变体，其整体并入本文。在一些实施方案中，包含刺突蛋白或其片段的病毒抗原包含至少一个包含Asp614Gly的突变，参照SEQ ID NO:2。

在一些实施方案中，刺突蛋白或其片段的病毒抗原包含至少或等于5个氨基酸、10个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、50个氨基酸、100个氨基酸、200个氨基酸或更多的氨基酸长度。在一些实施方案中，刺突蛋白或其片段在细胞质表面上表达。在一些实施方案中，刺突蛋白或其片段由细胞质分泌。在一些实施方案中，刺突蛋白或其片段是细胞质的载物。在一些实施方案中，刺突蛋白或其片段通过细胞质递送至靶组织。在一些实施方案中，包含刺突蛋白或其片段的细胞质可以诱导对象的免疫应答。在一些实施方案中，包含刺突蛋白或其片段的细胞质可以诱导并赋予对SARS-CoV-2感染的适应性免疫。在一些实施方案中，包含刺突蛋白或其片段的细胞质可以治疗或预防SARS-CoV-2感染。在一些实施方案中，细胞质在细胞质表面上表达刺突蛋白。在一些实施方案中，细胞质分泌刺突蛋白。在一些实施方案中，细胞质将刺突蛋白递送至靶组织。在一些实施方案中，细胞质在细胞质表面上表达刺突蛋白、分泌刺突蛋白和/或将刺突蛋白递送至靶组织。

在一些实施方案中，细胞质包含至少一种病毒抗原，其是核衣壳蛋白(N蛋白)或n蛋白片段。在一些实施方案中，核衣壳蛋白或其片段的病毒抗原与SEQ ID NO:9具有至少或等于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性。在一些实施方案中，核衣壳蛋白或其片段的病毒抗原包含至少或等于5个氨基酸、10个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、50个氨基酸、100个氨基酸、200个氨基酸或更多的氨基酸长度。在一些实施方案中，核衣壳蛋白或其片段在细胞质表面上表达。在一些实施方案中，核衣壳蛋白或其片段由细胞质分泌。在一些实施方案中，核衣壳蛋白或其片段是细胞质的载物。在一些实施方案中，核衣壳蛋白或其片段通过细胞质递送至靶组织。在一些实施方案中，包含核衣壳蛋白或其片段的细胞质可以诱导对象的免疫应答。在一些实施方案中，包含核衣壳蛋白或其片段的细胞质可以诱导并赋予对SARS-CoV-2感染的适应性免疫。在一些实施方案中，包含核衣壳蛋白或其片段的细胞质可以治疗或预防SARS-CoV-2感染。在一些实施方案中，细胞质在细胞质表面上表达核衣壳蛋白。在一些实施方案中，细胞质分泌核衣壳蛋白。在一些实施方案中，细胞质将核衣壳蛋白递送至靶组织。在一些实施方案中，细胞质在细胞质表面上表达核衣壳蛋白、分泌核衣壳蛋白和/或将核衣壳蛋白递送至靶组织。

在一些实施方案中，细胞质包含至少一种病毒抗原，其是膜蛋白(M蛋白)或n蛋白片段。在一些实施方案中，膜蛋白或其片段的病毒抗原与SEQ ID NO:10具有至少或等于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性。在一些实施方案中，膜蛋白或其片段的病毒抗原包含至少或等于5个氨基酸、10个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、50个氨基酸、100个氨基酸、200个氨基酸或更多的氨基酸长度。在一些实施方案中，膜蛋白或其片段在细胞质表面上表达。在一些实施方案中，膜蛋白或其片段由细胞质分泌。在一些实施方案中，膜蛋白或其片段是细胞质的载物。在一些实施方案中，膜蛋白或其片段通过细胞质递送至靶组织。在一些实施方案中，包含膜蛋白或其片段的细胞质可以诱导对象的免疫应答。在一些实施方案中，包含膜蛋白或其片段的细胞质可以诱导并赋予对SARS-CoV-2感染的适应性免疫。在一些实施方案中，包含膜蛋白或其片段的细胞质可以治疗或预防SARS-CoV-2感染。在一些实施方案中，细胞质在细胞质表面上表达膜蛋白。在一些实施方案中，细胞质分泌膜蛋白。在一些实施方案中，细胞质将膜蛋白递送至靶组织。在一些实施方案中，细胞质在细胞质表面上表达膜蛋白、分泌膜蛋白和/或将膜蛋白递送至靶组织。

在一些实施方案中，细胞质包含至少一种病毒抗原，其为包膜蛋白(E蛋白)或n蛋白片段。在一些实施方案中，包膜蛋白或其片段的病毒抗原与SEQ ID NO:11具有至少或等于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性。在一些实施方案中，包膜蛋白或其片段的病毒抗原包含至少或等于5个氨基酸、10个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、50个氨基酸、100个氨基酸、200个氨基酸或更多的氨基酸长度。在一些实施方案中，包膜蛋白或其片段在细胞质表面上表达。在一些实施方案中，包膜蛋白或其片段由细胞质分泌。在一些实施方案中，包膜蛋白或其片段是细胞质的载物。在一些实施方案中，包膜蛋白或其片段通过细胞质递送至靶组织。在一些实施方案中，包含包膜蛋白或其片段的细胞质可以诱导对象的免疫应答。在一些实施方案中，包含包膜蛋白或其片段的细胞质可以诱导并赋予对SARS-CoV-2感染的适应性免疫。在一些实施方案中，包含包膜蛋白或其片段的细胞质可以治疗或预防SARS-CoV-2感染。在一些实施方案中，细胞质在细胞质表面上表达包膜蛋白。在一些实施方案中，细胞质分泌包膜蛋白。在一些实施方案中，细胞质将包膜蛋白递送至靶组织。在一些实施方案中，细胞质在细胞质表面上表达包膜蛋白、分泌包膜蛋白和/或将包膜蛋白递送至靶组织。

在一些实施方案中，病毒抗原由与SEQ ID NO:4-7中任一项的片段具有至少或等于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，细胞质包含至少一种由与SEQ ID NO:4-7中任一项的片段具有100％的同一性的核酸序列编码的病毒抗原。

在一些实施方案中，病毒抗原来源于冠状病毒变体。在一些实施方案中，冠状病毒变体抗原包含与SEQ ID NO:401-447或551-562中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，冠状病毒变体抗原由与SEQ ID NO:301-347或501-512中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，向对象施用表达来源于冠状病毒变体的抗原的细胞质对于赋予对象针对冠状病毒变体感染的免疫或降低由冠状病毒变体引起的疾病的严重程度是治疗有效的。

在一些实施方案中，病毒抗原来源于禽冠状病毒。在一些实施方案中，禽冠状病毒抗原包含与SEQ ID NO:251-260中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，禽冠状病毒抗原由与SEQ ID NO:201-209中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，向对象施用表达来源于禽冠状病毒的抗原的细胞质对于赋予对象针对禽冠状病毒感染的免疫或降低由禽冠状病毒引起的疾病的严重程度是治疗有效的。

在一些实施方案中，抗原来源于埃博拉病毒。在一些实施方案中，抗原与埃博拉病毒糖蛋白、基质蛋白、核蛋白、核衣壳蛋白(例如，VP30、VP35或VP24)或聚合酶(L)蛋白具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性。在一些实施方案中，抗原包含与SEQ ID NO:851-859中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原由与SEQ ID NO:801-809中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，向对象施用表达来源于埃博拉病毒的抗原的细胞质对于赋予对象针对埃博拉病毒感染的免疫或降低由埃博拉病毒引起的疾病的严重程度是治疗有效的。

在一些实施方案中，病毒抗原来源于汉坦病毒(Hantavirus)。在一些实施方案中，抗原与汉坦病毒聚合酶具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性，M片段编码两种病毒表面糖蛋白(Gn和Gc)的前体(GPC)，并且S片段编码核衣壳(N)蛋白。在一些实施方案中，抗原包含与SEQ ID NO:151-154中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原由与SEQ ID NO:101-104中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，向对象施用表达来源于汉坦病毒的抗原的细胞质对于赋予对象针对汉坦病毒感染的免疫或降低由汉坦病毒引起的疾病的严重程度是治疗有效的。

在一些实施方案中，病毒抗原来源于人免疫缺陷病毒(HIV)。在一些实施方案中，HIV抗原包含与SEQ ID NO:651-660中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，HIV抗原由与SEQ ID NO:601-610中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，向对象施用表达来源于HIV的抗原的细胞质对于赋予对象针对HIV感染的免疫或降低由HIV引起的疾病的严重程度是治疗有效的。

在一些实施方案中，病毒抗原来源于呼吸道合胞病毒(RSV)，例如RSV Memphis37。在一些实施方案中，RSV抗原包含与SEQ IDNO:751-761中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，RSV抗原由与SEQ ID NO:701-711中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，向对象施用表达来源于RSV的抗原的细胞质对于赋予对象针对RSV感染的免疫或降低由RSV引起的疾病的严重程度是治疗有效的。

在一些实施方案中，细胞质可以包含多种病毒抗原，其中病毒抗原相同(例如仅包含刺突蛋白作为病毒抗原的细胞质)。在一些实施方案中，细胞质可以包含多种病毒抗原，其中病毒抗原不同。例如，细胞质可以包含病毒抗原，该病毒抗原包含刺突蛋白、核衣壳蛋白、膜蛋白或包膜蛋白的组合。在一些实施方案中，细胞质可以包含病毒抗原的组合，该病毒抗原可以在细胞质表面上表达、由细胞质包封和/或由细胞质分泌。

在一些实施方案中，抗原来源于细菌。细菌可以是革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，细菌是对β-内酰胺酶具有抗性的菌株。在一些实施方案中，抗原来源于产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、产志贺毒素大肠杆菌(STEC)、空肠弯曲杆菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、变异链球菌、幽门螺杆菌或炭疽芽孢杆菌。

在一些实施方案中，细菌抗原来源于炭疽芽孢杆菌(例如，炭疽)。在一些实施方案中，细菌抗原与保护性抗原(PA)以及两种酶组分(水肿因子(EF)和致死因子(LF))具有大于或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性。在一些实施方案中，细菌抗原包含与SEQ ID NO:1151－1153中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细菌抗原由与SEQ ID NO:1101-1103中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，向对象施用表达来源于炭疽芽孢杆菌的细菌抗原的细胞质对于使对象免疫炭疽芽孢杆菌感染或降低由炭疽芽孢杆菌感染引起的疾病或病症的严重程度是治疗有效的。

在一些实施方案中，细菌抗原来源于梭菌属。在一些实施方案中，梭菌属抗原包含与SEQ ID NO:951-984中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，梭菌属抗原由与SEQID NO:901-934中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，向对象施用表达来源于梭菌属的抗原的细胞质对于赋予对象针对梭菌属感染的免疫或降低由梭菌属引起的疾病的严重程度是治疗有效的。

在一些实施方案中，疫苗抗原来源于蓖麻毒蛋白。在一些实施方案中，蓖麻毒蛋白抗原包含与SEQ ID NO:1051-1057中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，蓖麻毒蛋白抗原由与SEQ ID NO:1001-1007中的一个或多个具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，向对象施用表达来源于蓖麻毒蛋白的抗原的细胞质对于赋予对象针对蓖麻毒蛋白的免疫或降低由蓖麻毒蛋白引起的毒性作用是治疗有效的。

在一些实施方案中，抗原可以是融合蛋白，其中本文所述的蛋白质中的任一种或其片段可以与另一种肽融合。在一些实施方案中，本文所述的抗原可以与细胞膜蛋白或跨膜蛋白融合。示例性细胞膜蛋白或跨膜蛋白可以包括CD63、CD81、CD82、CD47、异源三聚体G蛋白、MHC I类、整联蛋白、转铁蛋白受体(TFR2)、LAMP1/2、硫酸类肝素蛋白多糖、EMMPRIN、ADAM10、GPI锚定的5’核苷酸酶、CD73、补体结合蛋白CD55和CD59、音猬因子(SHH)、TSPAN8、CD37、CD53、CD9、PECAM1、ERBB2、EPCAM、CD90、CD45、CD41、CD42a、血型糖蛋白A、CD14、MHC II类、CD3、乙酰胆碱酯酶/AChE-S、AChE-E、淀粉样蛋白βA4/APP以及多药耐药性相关蛋白。

在一些实施方案中，抗原可以与糖基磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区融合。在一些实施方案中，抗原可以与白蛋白融合。在一些实施方案中，抗原可以与包含分子钳的多肽一起表达。在一些实施方案中，当在同一细胞质中与抗原一起表达时，分子钳将抗原保持在融合前形式。在一些实施方案中，分子钳包含编码在每两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个氨基酸残基之后重复的模式的多肽。在一些实施方案中，编码分子钳的多肽的长度为至少七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，分子钳自组装成双螺旋，其中一条链向前，而另一条链反向。在一些实施方案中，通过疏水和亲水氨基酸的模式确保链中氨基酸的配对。在一些实施方案中，模式经排列，使得钳中没有一个与病毒抗原结合。在一些实施方案中，分子钳自组装成硬杆。在一些实施方案中，分子钳通过接头连接至病毒抗原的所需部分，其可以提供其他功能，例如允许从混合物中纯化表达分子钳的细胞质。

在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原或其部分，例如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA0125、MUC-1、上皮肿瘤抗原(ETA)。在一些实施方案中，抗原包含与通常已知的任何癌症表位具有至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，向对象施用表达肿瘤抗原的细胞质或其部分对于使对象针对肿瘤病毒感染进行免疫或降低由肿瘤病毒引起的癌症的严重程度是治疗有效的。

b.异源核酸

在一些实施方案中，本文描述了包含至少一种异源多核苷酸的疫苗。可以是异源的多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、自扩增RNA、含尿苷RNA(uRNA)、自扩增mRNA、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)的无细胞多核苷酸、核酸探针以及引物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。在一些实施方案中，从异源多核苷酸翻译的抗原可以诱导对象的免疫应答。在一些实施方案中，从异源多核苷酸翻译的抗原可以赋予对象对本文所述的病原体中的任一种引起的感染的适应性免疫。在一些实施方案中，从异源多核苷酸翻译的抗原可以治疗或预防对象的由本文所述的病原体中的任一种引起的病原体感染。

在一些实施方案中，异源多核苷酸可以编码本文所述的免疫调节剂中的一种或多种。在一些实施方案中，免疫调节剂增强由本文所述的抗原中的任一种诱导的免疫应答。在一些实施方案中，免疫调节剂是Ii-key/MHC II类表位肽。在一些实施方案中，免疫调节剂是本文所述的细胞因子中的任一种。在一些实施方案中，异源多核苷酸可以编码本文所述的归巢蛋白中的一种或多种或归巢受体中的一种或多种。在一些实施方案中，归巢蛋白可以由细胞质分泌。在一些实施方案中，归巢受体可以在细胞质表面上表达。在一些实施方案中，一种或多种归巢受体可以特异于在淋巴组织中的一个或多个细胞上表达的一种或多种配体，淋巴组织中的细胞可以包含内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞或网状细胞或其组合。

在一些实施方案中，异源多核苷酸可以编码本文所述的靶向部分中的一种或多种。在一些实施方案中，异源多核苷酸可以编码本文所述的免疫调节剂中的一种或多种。在一些实施方案中，异源多核苷酸可以编码本文所述的归巢受体中的一种或多种。在一些实施方案中，异源多核苷酸可以编码本文所述的归巢蛋白中的一种或多种。在一些实施方案中，异源多核苷酸可以编码本文所述的抗病毒组合物中的一种或多种。

在一些实施方案中，异源多核苷酸包含编码病毒抗原的异源DNA序列。在一些实施方案中，异源DNA序列编码orf1a、orf1ab、刺突蛋白(S蛋白)、3a、3b、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、p6、7a、7b、8b、9b、核衣壳蛋白(N蛋白)、orf14、nsp1(前导蛋白)、nsp2、nsp3、nsp4、nsp5(3C样蛋白酶)、nsp6、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10(生长因子样蛋白)、nsp12(RNA依赖性RNA聚合酶或RdRp)、nsp13(RNA 5’-三磷酸酶)、nsp14(3’-至-5’核酸外切酶)、nsp15(内切RNA酶)和nsp16(2’-O-核糖甲基转移酶)中的任一种。在一些实施方案中，细胞质包含编码刺突蛋白或其片段的异源DNA序列。在一些实施方案中，细胞质包含编码核衣壳蛋白或其片段的异源DNA序列。在一些实施方案中，细胞质包含编码膜蛋白或其片段的异源DNA序列。在一些实施方案中，细胞质包含编码包膜蛋白或其片段的异源DNA序列。在一些实施方案中，异源多核苷酸可以包含编码一种或多种抗原的一个或多个异源DNA序列。例如，异源多核苷酸可以编码S蛋白抗原和N蛋白抗原。在一些实施方案中，异源DNA序列可以编码本文所述的不同病毒抗原中的任一种。在一些实施方案中，细胞质将异源DNA序列转录和翻译成病毒抗原。在一些实施方案中，细胞质将异源DNA序列递送至靶组织，其中靶组织将异源DNA序列转录，然后翻译成病毒抗原。在一些实施方案中，异源多核苷酸包含质粒，该质粒包含编码本文所述的抗原中的任一种的异源DNA序列。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含DNA疫苗(GX-19)，DNA疫苗包含编码来源于SARS-CoV-2的刺突蛋白的抗原的核酸。

在一些实施方案中，至少一种异源多核苷酸与SEQ ID NO:4-7中任一项的片段具有至少或等于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性。在一些实施方案中，至少一种异源多核苷酸与SEQ IDNO:4-7中任一项的片段具有约100％的同一性。在一些实施方案中，至少一种异源多核苷酸编码与SEQ ID NO:8的片段具有至少或等于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性的病毒抗原。在一些实施方案中，至少一种异源多核苷酸编码与SEQ ID NO:8的片段具有100％的同一性的病毒抗原。在一些实施方案中，至少一种异源多核苷酸编码与SEQ ID NO:9的片段具有至少或等于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性的病毒抗原。在一些实施方案中，至少一种异源多核苷酸编码与SEQ ID NO:9的片段具有约100％的同一性的病毒抗原。在一些实施方案中，至少一种异源多核苷酸编码与SEQ ID NO:10的片段具有至少或等于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性的病毒抗原。在一些实施方案中，至少一种异源多核苷酸编码与SEQ IDNO:10的片段具有约100％的同一性的病毒抗原。在一些实施方案中，至少一种异源多核苷酸编码与SEQ ID NO:11的片段具有至少或等于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性的病毒抗原。在一些实施方案中，至少一种异源多核苷酸编码与SEQ ID NO:11的片段具有约100％的同一性的病毒抗原。

在一些实施方案中，异源多核苷酸包含编码病毒抗原的异源RNA序列。在一些实施方案中，异源RNA序列包含编码病毒抗原的mRNA序列。在一些实施方案中，mRNA编码orf1a、orf1ab、刺突蛋白(S蛋白)、3a、3b、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、p6、7a、7b、8b、9b、核衣壳蛋白(N蛋白)、orf14、nsp1(前导蛋白)、nsp2、nsp3、nsp4、nsp5(3C样蛋白酶)、nsp6、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10(生长因子样蛋白)、nsp12(RNA依赖性RNA聚合酶或RdRp)、nsp13(RNA 5’-三磷酸酶)、nsp14(3’-至-5’核酸外切酶)、nsp15(内切RNA酶)和nsp16(2’-O-核糖甲基转移酶)中的任一种。在一些实施方案中，细胞质包含编码刺突蛋白或其片段的mRNA。在一些实施方案中，细胞质包含编码核衣壳蛋白或其片段的mRNA。在一些实施方案中，细胞质包含编码膜蛋白或其片段的mRNA。在一些实施方案中，细胞质包含编码包膜蛋白或其片段的mRNA。在一些实施方案中，异源多核苷酸可以包含一个或多个mRNA序列。在一些实施方案中，mRNA序列可以编码本文所述的不同病毒抗原中的任一种。在一些实施方案中，细胞质将mRNA翻译成病毒抗原。在一些实施方案中，细胞质将mRNA递送至靶组织，其中靶组织将mRNA翻译成病毒抗原。在一些实施方案中，mRNA是自扩增mRNA(saRNA)。在一些实施方案中，mRNA包含尿苷(uRNA)。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含编码全长融合前稳定的刺突(S)蛋白(mRNA-1273)的mRNA。在一些实施方案中，异源多核苷酸包含编码本文所述的抗原中的一种或多种的一个或多个异源RNA序列。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗(mRNA-LNP疫苗)，该SARS-CoV-2疫苗包含编码来源于SARS-CoV-2的蛋白质的抗原的mRNA。mRNA被包封并经由使用脂质纳米颗粒递送。

在一些实施方案中，细胞质包含DNA或RNA载体，该载体包含至少一种编码病毒抗原的异源多核苷酸。在一些实施方案中，DNA或RNA载体可以是质粒。在一些实施方案中，DNA或RNA载体可以是病毒载体。病毒载体(尤其是逆转录病毒载体)可以经工程改造以包含编码本文所述的病毒抗原中的任一种的核酸序列，并通过细胞质递送至靶组织。在一些实施方案中，病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。示例性病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、复制缺陷型黑猩猩腺病毒、ChAdOx1、新城疫病毒载体、M2缺陷型单一复制(M2SR)流感载体、痘载体、细小病毒载体、杆状病毒载体、麻疹病毒载体、水泡性口炎病毒(VSV)载体或单纯疱疹病毒载体(HSV)。在一些实施方案中，逆转录病毒载体包括γ-逆转录病毒载体，例如来源于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV、MMLV、MuLV或MLV)或鼠干细胞病毒(MSCV)基因组的载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体还包括慢病毒载体，例如来源于人免疫缺陷病毒(HIV)基因组的那些。在一些实施方案中，AAV载体包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9血清型。在一些实施方案中，病毒载体是嵌合病毒载体，其包含来自两种或更多种病毒的病毒部分。在其他情况下，病毒载体是重组病毒载体。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗(Gam-COVID-Vac或Gam-COVID-Vac lyo)非复制型病毒载体，其包含编码SARS-CoV-2的S蛋白或其片段的核酸。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含腺病毒载体，该载体包含SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白(Ad5-nCoV)的核酸序列。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含复制缺陷型黑猩猩腺病毒ChAdOx1，其经工程改造以表达SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含非复制型腺病毒载体(AdVac)，该载体包含编码来源于SARS-CoV-2的蛋白质的抗原的核酸。在一些实施方案中，用PER.C6细胞制备AdVac疫苗。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含具有编码SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白的核酸作为插入物的INO-4800pGX DNA质粒。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含表达SARS-CoV-2(BNT162)的刺突(S)蛋白或其片段的mRNA或修饰的mRNA。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含麻疹载体，该载体包含编码SARS-CoV-2的刺突蛋白或其片段的核酸。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含编码刺突蛋白的DNA，刺突蛋白经由注射和随后的电穿孔递送至对象的肌肉。

c.灭活病原体及其部分

在一些实施方案中，细胞质包含灭活病原体(例如，病毒、细菌、寄生虫或真菌)或其部分。在一些实施方案中，灭活病原体是灭活病毒或其部分。在一些实施方案中，灭活病毒是本文所述的病毒中的任一种。在一些实施方案中，灭活病毒来源于冠状病毒、汉坦病毒、埃博拉病毒、流感病毒，呼吸道合胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、肝炎病毒或猪繁殖与呼吸综合征病毒。在一些实施方案中，灭活病毒来源于冠状病毒。在一些实施方案中，灭活病毒是β冠状病毒，例如SARS-CoV-2。在一些实施方案中，灭活病毒是灭活SARS-CoV-2。

在一些实施方案中，细胞质包含灭活SARS-CoV-2。在一些实施方案中，与武汉菌株的全长氨基酸序列相比，SARS-CoV-2包含突变，包括Asp614Gly、Pro323Leu、Ile599Val、pro585Ser、Phe308Tyr、Thr141Ile、Asp248Glu、Thr85Ile、Ala18Val、Asn439Lys、Glu251Val、Pro10Ser、Ser194Leu、Ser197Leu、Gly196Val、Leu108Phe、Gln213Lys、Leu84Ser、Thr175Met、Ser563Leu、Val13Leu、Gln57His或Thr14Ile。

在一些实施方案中，当包含灭活SARS-CoV-2的细胞质被对象的免疫细胞吞噬时，包含灭活SARS-CoV-2的细胞质诱导对象针对SARS-CoV-2的免疫应答和适应性免疫。当吞噬细胞质时，免疫细胞接触灭活SARS-CoV-2，随后产生针对SARS-CoV-2的适应性免疫应答。在一些实施方案中，灭活SARS-CoV-2病毒是福尔马林灭活SARS-CoV-2病毒。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗(PiCoVacc)，该SARS-CoV-2疫苗包含从vero细胞培养物获得的福尔马林灭活SARS-CoV-2病毒。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含卡介苗(BCG)。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗(bacTRL-Spike)，该SARS-CoV-2疫苗包含经工程改造以表达SARS-CoV-2的刺突蛋白的双歧杆菌。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗(PittCoVacc)，该SARS-CoV-2疫苗包括经由使用微针阵列递送SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白或其片段。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗(NVX-CoV2373)，该SARS-CoV-2疫苗包含多重重组纳米颗粒疫苗，其包含SARS-CoV-2的融合前形式的刺突蛋白。在一些实施方案中，包含NVX-CoV2373的细胞质包含佐剂或免疫调节剂。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含模拟SARS-CoV-2的病毒结构的病毒样颗粒(VLP)，其中VLP由基于植物的生产方法制成。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗(LUNAR-COV19)，该SARS-CoV-2疫苗包含编码SARS-CoV-2的刺突蛋白的mRNA。mRNA被包封并经由使用脂质介导的递送系统递送。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗，该SARS-CoV-2疫苗包含来源于刺突蛋白的抗原，所述疫苗还包含T细胞的共刺激物gp96和OX40L。在一些实施方案中，细胞质包含SARS-CoV-2疫苗(T-COVIDTM)，该SARS-CoV-2疫苗包含复制缺陷型腺病毒5(RD-Ad5)载体、该载体包含编码SARS-CoV-2的刺突蛋白或其片段的核酸，其中T-COVIDTM疫苗被配制用于鼻内递送。在一些实施方案中，包含SARS-CoV-2疫苗的细胞质被配制用于经由任何合适的途径施用，例如，皮下、静脉内、动脉、眼、口服、肌内、鼻内(例如，吸入)、腹膜内、局部、粘膜、硬膜外、舌下、表皮、羊膜外、关节间、皮内、骨内、鞘内、子宫内、阴道内、膀胱内、玻璃体内、血管周和/或直肠施用，或已知施用方法的任何组合。

在一些实施方案中，灭活病毒来源于引起病毒性出血热的病毒，包括丝状病毒(埃博拉、马尔堡病)和沙粒病毒(拉沙热、马秋波)。在一些实施方案中，灭活病毒来源于引起病毒性脑炎的病毒(甲病毒属，例如东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎和西方马脑炎)。在一些实施方案中，灭活病毒来源于汉坦病毒、埃博拉病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、肝炎病毒或猪繁殖与呼吸综合征病毒。

在一些实施方案中，灭活病原体是灭活细菌或其部分。在一些实施方案中，抗原来源于灭活细菌。灭活细菌可以来源于革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，灭活细菌来源于革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，灭活细菌来源于对β-内酰胺酶具有抗性的菌株。在一些实施方案中，灭活细菌来源于产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、产志贺毒素大肠杆菌(STEC)、空肠弯曲杆菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、变异链球菌、幽门螺杆菌或炭疽芽孢杆菌。在一些实施方案中，灭活细菌来源于布鲁氏菌病(布鲁氏菌属物种)的细菌、产气荚膜梭菌的ε毒素、食品安全威胁(沙门氏菌属物种、大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌属)、鼻疽(鼻疽伯克霍尔德菌)、类鼻疽(类鼻疽伯克霍尔德菌)、鹦鹉热(鹦鹉热衣原体)、Q热(伯氏考克斯氏体)、蓖麻(蓖麻子)的蓖麻毒蛋白、葡萄球菌肠毒素B、斑疹伤寒(普氏立克次体)、水安全威胁(霍乱弧菌、微小隐孢子虫)、炭疽(炭疽芽孢杆菌)、肉毒杆菌中毒(肉毒杆菌毒素)、鼠疫(鼠疫耶尔森菌)、天花(大天花)或土拉菌病(土拉弗朗西斯菌)。

2.附加的外源性药剂

本公开的细胞质可以经工程改造以表达附加的外源性药剂，例如免疫调节剂。在一些实施方案中，细胞质包含一种或多种本文所述的免疫调节剂。免疫调节剂可以是直接或间接刺激对象免疫应答的分子。在一些实施方案中，免疫调节剂可以是引发对象适应性免疫应答的免疫激活剂。在一些实施方案中，免疫激活剂可以是抑制对象(例如，患有增殖性疾病或障碍的对象)过度激活的免疫系统的免疫抑制剂。在一些实施方案中，免疫调节剂可以在细胞质表面上表达。在一些实施方案中，免疫调节剂可以由细胞质释放。在一些实施方案中，免疫调节剂可以由细胞质分泌。在一些实施方案中，免疫调节剂可以是细胞质的载物。在一些实施方案中，免疫调节剂可以是与本文所述的抗原融合的肽或蛋白质。在一些实施方案中，免疫调节剂可以是佐剂。

在非限制性实例中，免疫调节剂可以通过结合至免疫细胞表面上的同源受体而直接刺激免疫应答，这导致免疫细胞释放细胞因子，从而激活免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞的激活促进针对病毒的适应性免疫的发展。作为另一实例，免疫调节剂通过抑制靶细胞产生和分泌IL-10和/或通过抑制调节性T细胞的活性而间接刺激免疫应答，从而导致例如免疫细胞的抗肿瘤应答增加。相反，作为免疫抑制剂的免疫调节剂可以直接或间接抑制对象的免疫应答。

在某些实施方案中，免疫调节剂靶向模式识别受体(PRR)。这些受体可以是跨膜蛋白或内体蛋白，其可以引发免疫系统响应传染原(例如，病原体)的激活。PRR可以识别病原体相关分子模式(PAMP)分子和损伤相关分子模式(DAMP)分子。PRR可以是膜结合的。PRR可以是细胞溶质的。膜结合PRR包括toll样受体和C型凝集素受体，例如甘露糖受体和脱唾液酸糖蛋白受体。细胞质PRR包括NOD样受体和RIG-I样受体。

在某些实施方案中，免疫调节剂是损伤相关分子模式(DAMP)分子或病原体相关分子模式(PAMP)分子，例如DAMP激动剂或PAMP激动剂。DAMP分子和PAMP分子可以被先天免疫系统的受体识别，例如Toll样受体(TLR)、Nod样受体、C型凝集素和RIG-I样受体。在某些实施方案中，免疫调节剂是Toll样受体激动剂、STING激动剂或RIG-I激动剂。DAMP分子的实例可以包括蛋白质，例如染色质相关蛋白高迁移率族匣1(HMGB1)、钙调节的蛋白质和聚糖家族的S100分子，例如透明质酸片段和聚糖缀合物。当在细胞凋亡或坏死后从肿瘤细胞释放时，DAMP分子也可以是核酸，例如DNA。附加的DAMP核酸的实例可以包括存在于细胞核或线粒体外的RNA和嘌呤代谢物，例如ATP、腺苷和尿酸。

在一些实施方案中，免疫调节剂是由干扰素调节因子(IRF)或干扰素基因刺激物(STING)识别的称为环状二核苷酸的细胞溶质DNA和细菌核酸，其可以充当细胞溶质DNA传感器。干扰素调节因子(IRF)识别的化合物可以在TLR和其他模式识别受体的免疫调节中起作用。

免疫调节剂可以是toll样受体(TLR)激动剂。免疫调节药剂可以是RIG-I样受体配体。免疫调节药剂可以是C型凝集素受体配体。免疫调节药剂可以是NOD样受体配体。

在一些实施方案中，免疫调节剂是TLR激动剂。在一些实施方案中，根据动物物种，免疫调节剂选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13激动剂。

在一些实施方案中，免疫调节剂激活剂是TLR2的配体，其包含：(a)热灭活的细菌产物，优选HKAL、HKEB、HKHP、HKLM、HKLP、HKLR、HKMF、HKPA、HKPG或HKSA、HKSP，以及(b)细胞壁组分产物，优选LAM、LM、LPS、LIA、LIA、PGN、FSL、Pam2CSK4、Pam3CSK4或酵母聚糖。

在一些实施方案中，免疫调节剂是TLR3的配体，选自：利他莫德(rintatolimod)、聚ICLC、

Apoxxim、

IPH-33、MCT-465、MCT-475和ND-1.1。

在一些实施方案中，免疫调节剂是TLR4的配体，选自LPS、MPLA或嘧啶并[5,4-b]吲哚(例如在WO2014/052828(Cal的U(U of Cal))中描述的那些)、AZ126(N-(2-(环戊基氨基)-2-氧代-1-(吡啶-4-基)乙基)-N-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-5-苯基-1H-吡咯-2-甲酰胺)或AZ368((E)-3-(4-(2-(环戊基氨基)-1-(N-(4-异丙基苯基)-1,5-二苯基-1H-吡唑-3-甲酰胺基)-2-氧代乙基)苯基)丙烯酸)。

在一些实施方案中，免疫调节剂是TLR5的配体，其选自FLA和鞭毛蛋白。在一些实施方案中，免疫调节剂是TLR6的配体。在某些实施方案中，免疫调节剂是TLR7激动剂和/或TLR8激动剂。在某些实施方案中，免疫调节剂是TLR7激动剂。在某些实施方案中，免疫调节剂是TLR8激动剂。在一些实施方案中，免疫调节剂选择性激动TLR7而非TLR8。在其他实施方案中，免疫刺激物激动TLR8而非TLR7。

在某些实施方案中，免疫调节剂是TLR7激动剂。在某些实施方案中，TLR7激动剂选自咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶、杂芳噻二嗪-2,2-二氧化物、苯并萘啶、鸟苷类似物、腺苷类似物、胸苷均聚物、ssRNA、CpG-A、PolyG10和PolyG3。在某些实施方案中，TLR7激动剂选自咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶、杂芳噻二嗪-2,2-二氧化物或苯并萘啶，但不是鸟苷类似物、腺苷类似物、胸苷均聚物、ssRNA、CpG-A、PolyG10和PolyG3。在一些实施方案中，TLR7激动剂是非天然存在的化合物。TLR7调节剂的实例包括GS-9620、GSK-2245035、咪喹莫特、瑞喹莫德、DSR-6434、DSP-3025、IMO-4200、MCT-465、MEDI-9197、3M-051、SB-9922、3M-052、Limtop、TMX-30X、TMX-202、RG-7863、RG-7795，以及在US 20160168164(Janssen)、US 20150299194(Roche)、US 20110098248(吉利德科学)、US 20100143301(吉利德科学)和US 20090047249(吉利德科学)中所公开的化合物。在一些实施方案中，通过PBMC试验测量TNFα或IFNα产量，TLR7激动剂的EC50值为500nM或更小。在一些实施方案中，通过PBMC试验测量TNFα或IFNα产量，TLR7激动剂的EC50值为100nM或更小。在一些实施方案中，通过PBMC试验测量TNFα或IFNα产量，TLR7激动剂的EC50值为50nM或更小。在一些实施方案中，通过PBMC试验测量TNFα或IFNα产量，TLR7激动剂的EC50值为10nM或更小。

在某些实施方案中，免疫调节剂是TLR8激动剂。在某些实施方案中，TLR8激动剂选自苯并氮杂卓、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶或ssRNA。在某些实施方案中，TLR8激动剂选自苯并氮杂卓、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶和其他ssRNA。在一些实施方案中，免疫调节剂是TLR8激动剂，而不是天然存在的TLR8激动剂或TLR8的苯并氮杂卓激动剂。

在一个实施方案中，本文所述的细胞质可以表达和/或分泌至少一种包含共刺激配体的免疫调节剂，该共刺激配体是对免疫细胞的完全激活重要的非抗原特异性信号。共刺激配体包括但不限于肿瘤坏死因子(TNF)配体、细胞因子(例如IL-2、IL-12、IL-15或IL21)和免疫球蛋白(Ig)超家族配体。肿瘤坏死因子(TNF)是参与全身炎症并刺激急性期反应的细胞因子。其主要作用是调节免疫细胞。肿瘤坏死因子(TNF)配体具有许多共同特征。配体中的大多数合成为含有短的细胞质片段和相对长的细胞外区域的II型跨膜蛋白。TNF配体包括但不限于神经生长因子(NGF)、CD4OL(CD4OL)/CD154、CD137L/4-1BBL、肿瘤坏死因子α(TNFa)、CD134L/OX4OL/CD252、CD27L/CD70、Fas配体(FasL)、CD3OL/CD153、肿瘤坏死因子f3(TNF(3)/淋巴毒素-α(LTa)、淋巴毒素-β(ur(3))、CD257/B细胞激活因子(BAFF)/Blys/THANK/Ta11-1、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)，以及TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、LIGHT(TNFSF14)。免疫球蛋白(Ig)超家族是一大群细胞表面和可溶性蛋白质，其参与细胞的识别、结合或粘附过程。这些蛋白质与免疫球蛋白共有结构特征，它们具有免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括但不限于CD80和CD86，两者都是CD28的配体。

在一些实施方案中，免疫调节剂可以是佐剂。在一些实施方案中，佐剂可以包含镇痛佐剂。在一些实施方案中，佐剂可以包含无机化合物，例如明矾、氢氧化铝、磷酸铝或磷酸钙氢氧化物。在一些实施方案中，佐剂可以包含矿物油或石蜡油。在一些实施方案中，佐剂可以包含细菌产物，例如灭活百日咳博德特氏菌、牛分枝杆菌、tor oxoids。在一些实施方案中，佐剂可以包含非细菌有机物，如角鲨烯。在一些实施方案中，佐剂可以包括使用递送系统，例如洗涤剂(Quil A)。在一些实施方案中，佐剂可以包含植物皂苷，例如来源于皂树、大豆或远志属的皂苷。在一些实施方案中，佐剂可以包含弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。在一些实施方案中，佐剂可以包含基于食物的油，如花生油。

在一些实施方案中，细胞质包含一种或多种附加的治疗性药剂，例如本文所述的抗病毒组合物。在一些实施方案中，一种或多种附加的治疗性药剂可以是治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质(例如，酶、抗体、抗原、毒素、细胞因子、蛋白质激素、生长因子、细胞表面受体或疫苗)、治疗性肽(例如，肽激素或抗原)、小分子活性药剂(例如，类固醇、聚酮化合物、生物碱、毒素、抗生素、抗病毒剂、秋水仙碱、紫杉醇、丝裂霉素或emtansine)和治疗性基因编辑因子中的任何组合的任一种。

D.药物组合物、制剂、剂量和施用途径

本文提供了包含细胞质(例如，从本文所述的任何细胞获得的细胞质)的药物组合物。在一些实施方案中，组合物被配制用于不同的施用途径(例如，静脉内、皮下、肌内、眶后、腹膜内、淋巴结内)。在一些实施方案中，组合物可包含药学上可接受的载体(例如，磷酸盐缓冲生理盐水)。术语“药物组合物”是指本文公开的细胞质与其他化学成分如稀释剂或载体的混合物。药物组合物可以促进将化合物施用于生物体。

通常，本文公开的方法包括通过全身施用来施用细胞质组合物。在一些实施方案中，方法包括通过口服施用细胞质组合物。在一些实施方案中，方法包括通过腹膜内注射施用细胞质组合物。在一些实施方案中，方法包括施用肛门栓剂形式的细胞质组合物。在一些实施方案中，方法包括通过静脉内(“i.v.”)施用来施用细胞质组合物。可以想到，还可以通过其他途径施用本文公开的细胞质组合物，例如皮下注射、肌内注射、皮内注射、透皮注射、经皮施用、鼻内施用、淋巴管内注射、直肠施用、胃内施用、眼内施用、脑室内施用、鞘内施用或任何其他合适的肠胃外施用。在一些实施方案中，与全身途径相比，优选更靠近损伤或炎症部位的局部递送途径。可以调节施用治疗剂的途径、剂量、时间点和持续时间。在一些实施方案中，在与病原体相关的疾病或病症的急性和慢性症状之一或两者发作之前或之后施用治疗剂。

本文公开的用于预防或治疗本文公开的疾病或病症的细胞质的有效剂量和剂量定义为观察到的与疾病或病症相关的有益反应、或疾病或病症的症状。有益反应包括预防、缓解、阻止或治愈疾病或病症、或疾病或病症的症状。在一些实施方案中，可以通过检测对象中生物标志物的存在、水平或活性、转录组风险谱或肠道微生物组的可测量的改善来测量有益应答。如本文所用，“改善”是指存在、水平或活性向在正常(例如未患有疾病或病症的个体)个体中观察到的存在、水平或活性转变。在细胞质组合物不是治疗有效的或不提供疾病或病症或疾病或病症的症状的充分缓解的情况下，则可以改变给药的剂量和/或途径，或可以将另外的药剂与细胞质组合物一起施用于对象。在一些实施方案中，当患者开始采用细胞质组合物的方案时，患者也脱离(例如，剂量逐步减少)第二治疗方案。

在一些实施方案中，本文公开了适用于递送本文所述的细胞质组合物的药学上可接受的赋形剂和载体溶液的制剂，以及适用于在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的给药和治疗方案。在一些实施方案中，在每种治疗上有用的组合物中的治疗性基因表达产物的量可以这样的方式制备，使得在化合物的任何给定单位剂量中将获得合适的剂量。诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保存期限以及其他药理学考虑的因素将被制备此类药物制剂的本领域技术人员考虑，并且因此，多种剂量和治疗方案可能是期望的。在一些实施方案中，细胞质组合物是本文公开的合适配制的药物组合物，其通过眼内、玻璃体内、肠胃外、皮下、静脉内、脑室内、肌内、鞘内、口服、腹膜内、通过口服或鼻吸入、或通过直接注射至一种或多种细胞、组织或器官。

在一些实施方案中，适于注射使用的细胞质组合物的药物形式包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。

在一些实施方案中，对于可注射水溶液的施用，例如，如果需要，溶液可以适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。剂量的一些变化必然会根据被治疗对象的状况而发生在任何情况下，负责施用的人员将确定个体对象的适当剂量。此外，对于人类施用，制剂应满足FDA生物制剂标准办公室所要求的无菌、致热原性和一般安全性和纯度标准。

其他药物组合物任选地包括一种或多种防腐剂以抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质如硼酸苯汞(merfen)和硫柳汞(thiomersal)；稳定的二氧化氯；和季铵化合物如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵和氯化十六烷基吡啶。

在一个实施方案中，本文所述的水性悬浮液和分散体保持在均匀状态至少4小时。在一个实施方案中，通过持续小于1分钟的物理搅拌将水性悬浮液再悬浮成均匀悬浮液。在另一个实施方案中，不需要搅拌来保持均匀的水分散体。

用于鼻腔施用的气雾剂制剂通常是设计成以滴剂或喷雾剂形式施用至鼻腔通道的水溶液。鼻用溶液可类似于鼻分泌物，因为它们通常是等渗的和轻微缓冲的以保持约5.5至约6.5的pH，尽管可另外使用该范围之外的pH值。抗微生物剂或防腐剂也可包括在制剂中。

用于吸入的气雾剂制剂和吸入剂可被设计成使得当通过鼻或口腔呼吸途径施用时，药剂或药剂的组合被携带到对象的呼吸树中。吸入溶液可以例如通过喷雾器施用。包含细粉状或液体药物的吸入剂或吹入剂可作为药剂或药剂组合在推进剂中的溶液或悬浮液的药用气雾剂(pharmaceutical aerosol)递送至呼吸系统，例如以帮助分配。推进剂可以是液化气，包括卤化碳，例如碳氟化合物如氟化氯化烃、氢氯氟烃和氢氯烃以及烃和烃醚。

卤代烃推进剂可包括其中所有氢被氟替代的氟烃推进剂、其中所有氢被氯和至少一个氟替代的氯氟烃推进剂、含氢的氟烃推进剂以及含氢的氯氟烃推进剂。有用的烃推进剂包括例如丙烷、异丁烷、正丁烷、戊烷、异戊烷和新戊烷。烃的共混物也可用作推进剂。醚推进剂包括例如二甲醚以及醚。气雾剂制剂也可包含一种以上的推进剂。例如，气雾剂制剂可包含一种以上来自相同类别的推进剂，例如两种或更多种碳氟化合物；或一种以上、两种以上、三种以上不同类别的推进剂，如氟烃和烃。本公开的药物组合物还可以用压缩气体例如惰性气体如二氧化碳、一氧化二氮或氮气分配。

气雾剂制剂还可以包括其他组分，例如乙醇、异丙醇、丙二醇以及表面活性剂或其他组分如油和洗涤剂。这些组分可用于稳定制剂和/或润滑阀组分。

气雾剂制剂可以在压力下包装，并且可以使用溶液、悬浮液、乳液、粉末和半固体制剂配制成气雾剂。例如，溶液气雾剂制剂可包含诸如转运蛋白、载体或离子通道抑制剂等药剂在(基本上)纯推进剂中的溶液或作为推进剂和溶剂的混合物。溶剂可用于溶解药剂和/或延缓推进剂的蒸发。溶剂可包括例如水、乙醇和二醇。可以使用合适溶剂的任何组合，任选地与防腐剂、抗氧化剂和/或其他气雾剂组分组合。

气雾剂制剂可以是分散体或悬浮液。悬浮气雾剂制剂可包含药剂或药剂组合(例如，转运蛋白、载体或离子通道抑制剂)和分散剂的悬浮液。分散剂可包括例如脱水山梨糖醇三油酸酯、油醇、油酸、卵磷脂和玉米油。悬浮气雾剂制剂还可以包括润滑剂、防腐剂、抗氧化剂和/或其他气雾剂组分。

气雾剂制剂可类似地配制成乳剂。乳液气雾剂制剂可包括例如醇如乙醇、表面活性剂、水和推进剂，以及试剂或试剂的组合，例如转运蛋白、载体或离子通道。使用的表面活性剂可以是非离子的、阴离子的或阳离子的。乳液气雾剂制剂的一个实例包括例如乙醇、表面活性剂、水和推进剂。乳液气雾剂制剂的另一个实例包括例如植物油、单硬脂酸甘油酯和丙烷。

本文公开了包含本文公开的细胞质组合物的无菌可注射溶液，其通过将本文公开的细胞质组合物以需要的量与以上列举的几种其他成分(根据需要)一起掺入合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入到无菌载体中来制备分散体，该无菌载体含有基本分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。

在一些实施方案中，本文公开的组合物还可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐也可以来源于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制时，溶液将以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效的量施用。制剂易于以各种剂型施用，例如注射溶液、药物释放胶囊等。

施用于对象的合适剂量和剂量由包括但不限于特定细胞质组成、疾病状况及其严重程度、需要治疗的对象的身份(例如，体重、性别、年龄)的因素确定，并且可根据病例周围的特定情况确定，包括例如，所施用的特定药剂、施用途径、所治疗的状况和所治疗的对象或宿主。

细胞质组合物的量和这种组合物的施用时间将在受益于本教导技术人员的能力范围内。然而，可能的是，治疗有效量的所公开的组合物的施用可以通过单次施用来实现，例如单次注射足够数量的细胞质以向经历此类治疗的患者提供治疗益处。

或者，在某些情况下，可能需要提供细胞质组合物的多次或连续施用，或者在相对短的时间内，或者在相对长的时间内，这可以由监督这种组合物施用的执业医师确定。例如，施用于哺乳动物的细胞质的数量可以是约10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或甚至更高的数量级，细胞质作为单剂量给予，或根据需要分成两次或多次施用，以实现所治疗的特定疾病或障碍的治疗。事实上，在某些实施方案中，可能需要单独或与一种或多种其他治疗药物组合施用两种或更多种不同的细胞质组合物以实现特定治疗方案的期望效果。在各种实施方案中，日剂量和单位剂量根据许多变量而改变，变量包括但不限于所用细胞质组合物的活性、待治疗的疾病或病症、施用方式、个体对象的需要、待治疗的疾病或病症的严重程度和医师的判断。

在一些实施方案中，细胞质组合物的施用是每小时、每2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年或5年或10年一次。有效剂量范围可基于对象对治疗的反应来调整。一些施用途径需要比其他途径更高浓度的有效量的治疗剂。

尽管没有考虑到本公开的优点，但在其中患者的病症没有改善的某些实施方案中，根据医生的判断，长期施用细胞质组合物，即，持续延长的时间段，包括贯穿患者生命的整个持续时间，以便改善或以其他方式控制或限制患者的疾病或病症的症状。在其中患者的状态确实改善的某些实施方案中，所施用的细胞质组合物的剂量可以暂时减少或暂时中止一定的时间长度(即，“药物假期”)。在具体的实施方案中，药物假期的长度在2天和1年之间，包括例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天或超过28天。仅举例来说，药物假期期间的剂量减少为10％-100％，包括仅举例的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。在某些实施方案中，所施用的药物的剂量减少或暂时中止一定时间长度(即，“药物转移(drugdiversion)”)。在具体的实施方案中，药物转移的长度在2天和1年之间，包括例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天或超过28天。仅举例来说，药物转移期间的剂量减少为10％-100％，包括仅举例的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。在合适的时间长度之后，任选地恢复正常的给药方案。

在一些实施方案中，一旦患者病症有所改善，如有必要施用维持剂量。随后，在具体实施方案中，根据症状将施用的剂量或频率或两者降低至保持改善的疾病、障碍或病症的水平。然而，在某些实施方案中，患者在任何症状复发时需要长期间歇性治疗。

这样的治疗方案的毒性和治疗效果通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中测定，包括但不限于测定LD50和ED50。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，并将其表示为LD50和ED50之间的比率。在某些实施方案中，从细胞培养试验和动物研究中获得的数据用于配制用于哺乳动物(包括人)的治疗有效日剂量范围和/或治疗有效单位剂量。在一些实施方案中，本文所述的细胞质组合物的剂量在包括具有最小毒性的ED50的循环浓度范围内。在某些实施方案中，日剂量范围和/或单位剂量在该范围内变化，这取决于所用的剂型和所用的施用途径。

E.病原体捕获细胞质

在一些实施方案中，本文公开了一种细胞质，其经工程改造以通过允许病原体感染细胞质并阻止病原体在细胞质内繁殖或复制来捕获病原体。细胞质的可控和有限的寿命使得当细胞质死亡时，细胞质能够杀死病原体，其中病原体在死亡时被捕获在细胞质中。细胞质的死亡可以是天然过程，如通过细胞凋亡或自噬。经工程改造以捕获病原体的细胞质可经工程改造以表达病原体识别的部分，如促进病原体感染细胞质的宿主受体。此外，或备选地，细胞质可以经工程改造以表达或含有本文描述的活性剂，其治疗有效地治疗或预防对象的细胞中的病原体感染。例如，这样的活性剂可以是中和抗体，当从细胞质分泌时，其在功能上阻断细胞外空间中的病原体与宿主细胞之间的结合。在预防SARS-CoV-2感染的情况下，中和抗体阻断SARS-CoV-2刺突蛋白和在宿主细胞上表达的人血管紧张素转化酶2(ACE2)之间的结合以预防感染。

病原体可以是可以感染本文所述细胞的任何细菌、病毒或真菌，其至少部分地需要核遗传信息来复制或繁殖，例如本文公开的那些。受感染的细胞质缺乏在宿主细胞核中具有复制阶段的病原体的复制或繁殖所需的核组分，因此减少了对对象中病原体感染的预防或治疗。

在减少或预防SARS-CoV-2感染的情况下，细胞质经工程改造以表达SARS-CoV-2的病原体识别部分(例如，ACE2)，并且当细胞质通过刺突蛋白和ACE2结合被SARS-CoV-2感染时，细胞质可以天然地或经工程改造以募集巨噬细胞用于巨噬细胞吞噬作用。如图4所示，作为非限制性实例，被感染的细胞质的吞噬作用可以激活免疫细胞如辅助T细胞和B细胞以产生针对SARS-CoV-2的抗体。在一些实施方案中，被感染的细胞质的吞噬作用激活T细胞以治疗病毒感染。

在一些实施方案中，本文所述的细胞质经工程改造以表达，并且在一些情况下，展示病原体识别的部分。在一些实施方案中，病原体识别部分是宿主受体(目的病原体的同源受体)，或其足以促进病原体和宿主细胞之间结合的部分。病原体识别的部分可以由细胞质在细胞质表面上表达。在一些实施方案中，病原体识别部分来源于至少部分暴露于细胞外环境的蛋白质。在一些实施方案中，病原体识别的部分来源于编码细胞表面受体或跨膜蛋白的多肽。在一些实施方案中，病原体识别的部分来源于在病毒感染期间被病毒蛋白结合的蛋白。例如，病原体识别的部分可以来源于血管紧张素I转化酶2(ACE2)，其在病毒感染期间被SARS-CoV-2的刺突蛋白结合。在一些实施方案中，病原体识别的部分来源于细胞表面受体或可被本文所述的任一种病毒识别和结合的跨膜蛋白。在一些实施方案中，病原体识别的部分来源于细胞表面受体或可被本文所述的任一种冠状病毒识别和结合的跨膜蛋白。在一些实施方案中，病原体识别的部分是糖。在一些实施方案中，病原体识别的部分是多肽。冠状病毒识别的非限制性受体包括ACE2、丙氨酸氨肽酶(ANPEP)、癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM1)、二肽基肽酶-4(DPP4)或糖。

在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达人血管紧张素转化酶2(ACE2)或其一部分，其可被ACE2特异性冠状病毒(例如SARS-CoV、SARS-CoV-2和NL63)识别和结合。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以在细胞质表面上表达ACE2或其部分。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达全长ACE2。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达ACE2的片段。在一些实施方案中，ACE2部分包含ACE2多肽的氨基酸序列的约5个氨基酸至约805个氨基酸。在一些实施方案中，包含ACE2部分的病原体识别部分来源于细胞外结构域或在细胞外表达的ACE2部分。在一些实施方案中，ACE2部分包含ACE2氨基酸序列的N-末端部分。在一些实施方案中，ACE2部分包含ACE2氨基酸序列的C-末端部分。在一些实施方案中，ACE2部分包含ACE2多肽的氨基酸序列，其包含约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约50个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约200个氨基酸、约5个氨基酸至约400个氨基酸、约5个氨基酸至约500个氨基酸、约5个氨基酸至约600个氨基酸、约5个氨基酸至约805个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约50个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约200个氨基酸、约10个氨基酸至约400个氨基酸、约10个氨基酸至约500个氨基酸、约10个氨基酸至约600个氨基酸、约10个氨基酸至约805个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约50个氨基酸、约15个氨基酸至约100个氨基酸、约15个氨基酸至约200个氨基酸、约15个氨基酸至约400个氨基酸、约15个氨基酸至约500个氨基酸、约15个氨基酸至约600个氨基酸、约15个氨基酸至约805个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约20个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约200个氨基酸、约20个氨基酸至约400个氨基酸、约20个氨基酸至约500个氨基酸、约20个氨基酸至约600个氨基酸、约20个氨基酸至约805个氨基酸、约25个氨基酸至约50个氨基酸、约25个氨基酸至约100个氨基酸、约25个氨基酸至约200个氨基酸、约25个氨基酸至约400个氨基酸、约25个氨基酸至约500个氨基酸、约25个氨基酸至约600个氨基酸、约25个氨基酸至约805个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、约50个氨基酸至约200个氨基酸、约50个氨基酸至约400个氨基酸、约50个氨基酸至约500个氨基酸、约50个氨基酸至约600个氨基酸、约50个氨基酸至约805个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约400个氨基酸、约100个氨基酸至约500个氨基酸、约100个氨基酸至约600个氨基酸、约100个氨基酸至约805个氨基酸、约200个氨基酸至约400个氨基酸、约200个氨基酸至约500个氨基酸、约200个氨基酸至约600个氨基酸、约200个氨基酸至约805个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸、约400个氨基酸至约600个氨基酸、约400个氨基酸至约805个氨基酸、约500个氨基酸至约600个氨基酸、约500个氨基酸至约805个氨基酸或约600个氨基酸至约805个氨基酸。在一些实施方案中，ACE2部分包含ACE2多肽的氨基酸序列的约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸、约600个氨基酸或约805个氨基酸。在一些实施方案中、ACE2的部分包含ACE2多肽的氨基酸序列的至少或等于约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸或约600个氨基酸。在一些实施方案中、ACE2部分包含ACE2多肽的氨基酸序列的至多约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约200个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸、约600个氨基酸或约805个氨基酸。在一些实施方案中，ACE2是人ACE2(huACE2)。在一些实施方案中，huACE2的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:12中。

在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达与SEQ ID NO:12具有至少或等于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的异源多肽。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达与SEQ ID NO:12的片段具有至少或等于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的异源多肽。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达与SEQ ID NO:12具有100％同一性的异源多肽。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达与SEQ ID NO:12的片段具有100％同一性的异源多肽。

在一些实施方案中，与以内源水平表达ACE2并可被SARS-CoV-2感染的细胞相比，细胞质可经工程改造以表达更多的ACE2。在一些实施方案中，与以内源水平表达ACE2的细胞相比，细胞质可表达至少或等于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多的ACE2。在一些实施方案中，与以内源水平表达ACE并可被SARS-CoV-2感染的细胞相比，细胞质可表达至少或等于2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍、10000倍或更多倍的ACE2。在一些实施方案中，与在细胞表面以内源水平表达ACE2的细胞相比，细胞质可经工程改造以在细胞质表面表达更多的ACE2。在一些实施方案中，与在细胞表面以内源性水平表达ACE2的细胞相比，细胞质可在细胞表面或细胞质上表达至少或等于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多的ACE2。在一些实施方案中，与在细胞表面上以内源水平表达ACE2的细胞相比，细胞质可在细胞质表面上表达至少或等于2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍、10000倍或更多倍的ACE2。

在一些实施方案中，与参照细胞相比，表达ACE2的细胞质可具有更高的病毒感染性。本文中的“参照细胞”可以是能够被SARS-CoV-2感染的天然存在的细胞(例如，天然表达ACE2)。在一些实施方案中，参照细胞与细胞质的细胞类型相同。在一些实施方案中，参照细胞在其他方面与细胞质相同，除了它不表达ACE2。病毒感染性可通过通常已知的测定法测量和测定。病毒感染性的示例性测量可包括病毒噬菌斑测定、荧光聚焦测定(FFA)和终点稀释测定(TCID50)。这些测定法中的每一种均可依赖于加入到细胞质和/或细胞中的连续病毒稀释液来测量病毒感染性。用于测定病毒感染性的其他示例性测量可包括qPCR或ELISA，用于定量感染设定数量的细胞质和/或细胞所需的病毒基因组或颗粒的量。在一些实施方案中，表达ACE2的细胞质可具有至少或等于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的病毒感染性。在一些实施方案中，表达ACE2的细胞质可具有比参照细胞高至少或等于约2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍或10000倍的病毒感染性。

在一些实施方案中，本文描述了经工程改造以表达至少一个靶向部分(例如归巢蛋白或受体)的细胞质。在一些实施方案中，靶向部分由细胞质分泌。在一些实施方案中，靶向部分是本文所述的趋化因子受体的配体。在一些实施方案中，靶向部分是本文所述的细胞因子。在一些实施方案中，靶向部分是归巢受体。在一些实施方案中，靶向部分在细胞质的表面上表达。在一些实施方案中，靶向部分是本文所述的趋化因子受体。在一些实施方案中，靶向部分是本文所述的任一种细胞因子的受体。

在一些实施方案中，靶向部分可特异于在淋巴组织中的一种或多种细胞上表达的一种或多种配体，淋巴组织中的细胞可包括内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞或网状细胞或其组合。分泌性靶向部分的非限制性实例包括SDF1α、CCL2、CCL3、CCL5、CCL8、CCL1、CXCL9、CXCL10、CCL11、CXCL12或其组合。在一些实施方案中，靶向部分在细胞质的表面上表达。在细胞质表面上表达的靶向部分的非限制性实例包括CXCR4、CCR2或PSGL-1。可在细胞表面表达的细胞表面蛋白的非限制性实例包括CXCR4、CCR2、CCR1、CCR5、CXCR7、CXCR2、CXCR1、C-X-C趋化因子受体3型、白细胞唾液酸蛋白、CD44抗原、C-C趋化因子受体7型、L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1或极晚期抗原4或其组合。

在一些实施方案中，表达靶向部分(例如，归巢蛋白或归巢受体)的细胞质还表达本文公开的活性剂。在一些实施方案中，活性剂是本文所述的另外的外源性试剂。在一些实施方案中，活性剂是本文所述的病原体识别的部分。在一些实施方案中，活性剂包含与以下结合的抗体或单域抗体：由病原体表达的表位；与病原体相关的微环境相关的表位；或与病原体释放的生物分子相关的表位。在一些实施方案中，抗体或单域抗体与表位的结合赋予了针对病原体的治疗或接种疫苗特性。在一些实施方案中，抗体或单域抗体与表位的结合募集免疫细胞以激活免疫应答，从而赋予了针对病原体的治疗特性。

II.治疗和预防方法

本文提供了通过向有需要的对象施用本公开的细胞质或含有细胞质的药物组合物来治疗或预防病原体相关的疾病或病症的方法。在一些实施方案中，细胞质及其药物组合物适于治疗本文所述的疾病或病症。在一些情况下，此类疾病或病状可(至少部分)由本文所述病原体的感染引起。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症，例如由溶瘤病毒感染引起的癌症。

在一些实施方案中，方法包括将细胞质或含有细胞质的药物组合物全身施用于对象。

在一些实施方案中，本文公开了通过将细胞质或含有细胞质的药物组合物施用于有需要对象来治疗癌症的方法。在一些实施方案中，细胞质包含编码抗癌活性剂的外源性核酸。在一些实施方案中，抗癌活性剂是针对溶瘤病毒的疫苗。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达对癌细胞特异的抗体或小分子。在一些实施方案中，抗体可以是靶向癌细胞并随后激活适应性免疫系统以中和癌细胞的中和抗体。在一些实施方案中，抗体可以是单域抗体(例如，纳米抗体)。在一些实施方案中，抗体可以缀合至药物如细胞毒性药物以形成抗体药物缀合物(ADC)。在一些实施方案中，细胞质通过直接接触癌细胞而赋予治疗性质。在一些实施方案中，细胞质通过募集和激活对癌细胞的免疫应答(例如，免疫细胞)而赋予治疗性质。

还公开了针对本文所述的病原体对对象进行接种疫苗的方法。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达用作病原体疫苗的病原体抗原。在一些实施方案中，病原体可以是选自表3-6中的任一种病原体中。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达选自表3-6中的任一种病原体的抗原。在一些实施方案中，抗原包含与SEQ ID NO:1、3-7、151-154、251-260、401-447、551-562、651-660、751-761、851-859、951-984、1051-1057或1151-1153中的一个或多个至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原由与SEQ ID NO:2、8、101-104、201-209、301-347、501-512、601-610、701-711、801-809、901-934、1001-1007或1101-1103中的一个或多个至少或等于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达用作病毒疫苗的病毒抗原。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达用作细菌疫苗的细菌抗原。

本文还描述了用于针对病原体感染治疗对象的方法。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达对病原体特异性的抗体或小分子，其有效减少有需要的对象中的病原体。在一些实施方案中，抗体可以是可靶向病原体并随后激活适应性免疫系统以中和病原体的中和抗体。在一些实施方案中，抗体可以是单域抗体(例如，纳米抗体)。在一些实施方案中，抗体可以缀合至药物如细胞毒性药物以形成抗体药物缀合物(ADC)。在一些实施方案中，细胞质通过直接接触病原体而赋予治疗特性。在一些实施方案中，细胞质通过募集和激活对病原体的免疫应答(例如，免疫细胞)而赋予治疗特性。

在一些实施方案中，本文公开了通过向对象施用细胞质或含有细胞质的药物组合物来治疗对象中的由病原体引起的感染的方法，其中细胞质经工程改造以将病原体捕获在对象的任何组织(例如，血液、肌肉或淋巴)中，阻止病原体在对象中繁殖，并且任选地，例如通过吞噬作用从对象中清除病原体。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达有效治疗病原体相关疾病或病症的治疗剂。在一些实施方案中，细胞质经工程改造以表达有效治疗癌症的治疗剂。在一些实施方案中，该方法还包括向对象施用一种或多种附加治疗剂。在一些实施方案中，上述一种或多种附加治疗剂选自：基于细胞的疗法、小分子、免疫疗法、化学疗法、放射疗法、基因疗法和手术。附加疗法可与本公开的细胞质同时施用于对象。附加疗法可以在本公开的细胞质之前或之后施用。

A.疾病或病症

本文公开的病原体相关疾病或病症包括病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染和原生动物感染以及与本文公开的感染相关的疾病或病症。在一些实施方案中，病原体可以选自表3-6中所列的任一种病原体。可通过组合物和利用本文所述的组合物的方法治疗或预防的感染的非限制性实例可包括：不动杆菌感染、放线菌病、非洲昏睡病(非洲锥虫病)、AIDS(获得性免疫缺陷综合症)、阿米巴病、无形体病、血管紧张素转化酶抑制剂、异尖线虫病、炭疽菌、溶血芽孢杆菌感染、阿根廷出血热、蛔虫病、曲霉病、星状病毒感染、巴贝虫病、蜡样芽孢杆菌感染、细菌性肺炎、细菌性阴道病、类杆菌感染、龟头炎、巴尔通氏症、贝蛔虫感染(Baylisascaris infection)、BK病毒感染、黑毛孢子菌病、人芽囊原虫病、芽生真菌病、博利维亚出血热、肉毒杆菌病(和婴幼儿肉毒杆菌病)、巴西出血热、布鲁氏菌病、淋巴腺鼠疫、伯克霍尔德氏菌感染、囊虫溃疡、杯状病毒感染(诺如病毒和萨泊病毒)、弯曲杆菌病、念球菌病(念珠菌病；鹅口疮)、毛细血管病、卡罗里昂氏病、猫抓病、蜂窝组织炎、查加斯病(美洲锥虫病)、软下疳、水痘、奇昆古尼亚热病、衣原体、肺炎嗜衣原体C感染(台湾急性呼吸系统因子或TWAR)、霍乱弧菌、着色芽生真菌病、壶菌病、支睾吸虫病、艰难梭菌结肠炎、球孢子菌病、科罗拉多蜱虫清热(CTF)、感冒(急性病毒性鼻咽炎；急性鼻炎)、冠状病毒感染、克罗伊茨菲尔德-雅各布二氏病(CJD)、克里米亚-刚果出血热(CCHF)、隐球菌病、隐孢子虫病、皮肤幼虫移行症(CLM)、环孢菌素、囊尾幼虫病、巨细胞病毒感染、登革热、链霉菌感染、齿虫病、白喉、二叶草病、麦地那龙线虫病、埃博拉出血热、包虫病、埃立克体病、蛲虫病(蛲虫感染)、肠球菌感染、肠病毒性感染、流行性斑疹伤寒、传染性红斑(第五种疾病)、幼儿急疹(第六种疾病)、片形吸虫病、姜片虫病、致命的家族性失眠症(FFI)、丝虫病、产气荚膜梭菌食物中毒、自生生活阿米巴感染、梭杆菌感染、气性坏疽(梭菌性肌坏死)、地毛虫病、Gerstmann-

-Scheinker综合征(GSS)、贾第鞭毛虫病、鼻疽病、颚口虫病、淋病、腹股沟肉芽肿(多诺瓦诺病)、A群链球菌感染、B群链球菌感染、嗜血杆菌感染、手足口病(HFMD)、汉坦病毒肺综合征(HPS)、Heartland病毒病、幽门螺杆菌感染、溶血性尿毒症综合征(HUS)、肾综合征出血热(HFRS)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、单纯疱疹、组织胞浆菌病、钩虫感染、人类博卡病毒感染、人类艾氏埃立克体病、人粒细胞无形体病(HGA)、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、人偏肺病毒感染、人单核细胞埃立克体病、人乳头瘤病毒(HPV)感染、人类副流感病毒感染、处女膜脱垂、爱泼斯坦-巴尔病毒传染性单核细胞增多症(Mono)、流行性感冒(流感)、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、D型流感病毒、流感病毒pr8、等孢子虫病、川崎病、角膜炎、金氏菌属感染、库鲁病、拉萨热、军团病(军团病)、军团病(庞蒂亚克热)、利什曼病、麻风、钩端螺旋体病、李斯特菌病、莱姆病(莱姆疏螺旋体病)、淋巴丝虫病(象皮病)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、疟疾、马尔堡出血热(MHF)、麻疹、中东呼吸综合征(MERS)、类鼻疽(惠特莫尔病)、脑膜炎、脑膜炎球菌病、变吸虫病、微孢子虫病、传染性软疣(MC)、猴痘、腮腺炎、鼠斑疹伤寒(地方性斑疹伤寒)、肺炎支原体、生殖支原体感染、足菌肿(消歧义)、蝇蛆病、新生儿结膜炎(新生儿眼炎)、诺如病毒(儿童和婴儿)、(新)变异型克罗伊茨菲尔德-雅各布二氏病(vCJD；nvCJD)、诺卡菌病、盘尾丝虫病(河盲症)、后睾症、副球孢子菌病(南美芽生菌病)、肺吸虫病、巴氏杆菌病、头虱病(头虱)、体虱(体虱)、耻骨虱(阴虱、蟹虱)、盆腔炎(PID)、百日咳(百日咳)、瘟疫、肺炎球菌感染、肺孢子菌肺炎(PCP)、肺炎、脊髓灰质炎、普氏菌感染、原发性阿米巴脑膜脑炎(PAM)、进行性多灶性白质脑病、鹦鹉热、Q热、狂犬病、回归热、呼吸道合胞病毒感染、鼻孢子虫病、鼻病毒感染、立克次体感染、立克次体痘、裂谷热(RVF)、落基山斑疹热(RMSF)、轮状病毒感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹、沙门氏菌病、SARS(严重急性呼吸系统综合症)、疥螨病、猩红热、血吸虫病、败血症、志贺氏菌病(细菌性痢疾)、带状疱疹(带状疱疹)、天花(痘疮)、孢子丝菌病、葡萄球菌食物中毒、葡萄球菌感染、类圆线虫病、亚急性硬化性全脑炎、梅毒、绦虫病、破伤风(锁颚)、须癣(触染性须疮)、头癣(头皮癣)、体癣(体癣)、股癣(股癣)、手癣(手癣)、黑癣、足癣(运动员的脚)、甲癣(甲癣)、花斑癣(花斑癣)、弓蛔虫病(眼幼虫移行症(OLM))、弓蛔虫病(内脏幼虫移行症(VLM))、弓形虫病、沙眼、旋毛虫病、滴虫病、鞭虫病(鞭虫感染)、结核、兔热病、伤寒、斑疹伤寒、解脲脲原体感染、谷热、委内瑞拉马脑炎、委内瑞拉出血热、创伤弧菌感染、副溶血性弧菌肠炎、病毒性肺炎、西尼罗热、白色毛结节菌病(白秃疮)、耶尔森菌假结核感染、耶尔森氏菌病、黄热病、寨卡热和接合菌病。

冠状病毒感染可以是α冠状病毒或β冠状病毒的感染。α冠状病毒的非限制性实例包括229E和NL63。β冠状病毒的非限制性实例包括OC43、HKU1、严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒或中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒。在一些实施方案中，SARS冠状病毒是SARS-CoV、SARS-CoV-2或其变体。在一些实施方案中，MERS冠状病毒是MERS-CoV或其变体。在一些实施方案中，SARS冠状病毒引起疾病或病症，例如冠状病毒疾病2019(COVID-19)。

在一些实施方案中，本文所述的冠状病毒由SEQ ID NO:1和3-7中任一项提供的核酸序列编码。在一些实施方案中，冠状病毒(或其变体)由与SEQ ID NO:1和3-7中的任一项具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。

在一些实施方案中，冠状病毒包含编码SEQ ID NO:2或8中提供的氨基酸序列的刺突蛋白。在一些实施方案中，S蛋白由与SEQ ID NO:2或8具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列编码。

在一些实施方案中，冠状病毒包含由SEQ ID NO:9中提供的氨基酸序列编码的核壳(N)蛋白。在一些实施方案中，N蛋白由与SEQ ID NO:9具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列编码。

在一些实施方案中，冠状病毒包含由SEQ ID NO:10提供的氨基酸序列编码的膜(M)蛋白。在一些实施方案中，M蛋白由与SEQ ID NO:10具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列编码。

在一些实施方案中，冠状病毒包含由SEQ ID NO:11中提供的氨基酸序列编码的包膜(E)蛋白。在一些实施方案中，E蛋白由与SEQ ID NO:11具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列编码。

B.对象

在一些实施方案中，对象需要、已经确定需要或怀疑需要治疗。如本文所用，术语“对象”是指任何有机体。例如，对象可以是哺乳动物、两栖动物、鱼、爬行动物、无脊椎动物、鸟、植物、古细菌、真菌或细菌。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象可以是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠)、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、马科动物(例如，马)、绵羊、牛、猪、非人灵长类动物、例如猿(例如，猴)、猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，对象为0至120岁(例如，出生至一个月(例如，新生儿)、一个月至两年(例如，婴儿)、2年至12年(例如，儿童)、12年至16年(例如，青少年)、1至120岁、1至115岁、1至110岁、1至105岁、1至100岁、1至95岁、1至90岁、1至85岁、1至80岁、1至75岁、1至70岁、1至65岁、1至60岁、1至50岁、1至40岁、1至30岁、1至25岁、1至20岁、1至15岁、1至10岁、5至120岁、5至110岁、5至100岁、5至90岁、5至60岁、5至50岁、5至40岁、5至30岁、5至20岁、5至10岁、10至120岁、10至110岁、10至100岁、10至90岁、10至80岁、10至60岁、10至50岁、10至40岁、10至30岁、10至20岁、20至120岁、20至110岁、20至100岁、20至90岁、20至70岁、20至60岁、20至50岁、20至40岁、20至30岁、30至120岁、30至110岁、30至100岁、30至90岁、30至70岁、30至60岁、30至50岁、40至120岁、40至110岁、40至100岁、40至90岁、40至80岁、40至60岁、40至50岁、50至120岁、50至110岁、50至100岁、50至90岁、50至80岁、50至70岁、50至60岁、60至120岁、60至110岁、60至100岁、60至90岁、60至80岁、60至70岁、70至120岁、70至110岁、70至100岁、70至90岁、70至80岁、80至120岁、80至110岁、80至100岁、80至90岁、90至120岁、90至110岁、90至100岁、100至120岁或110至120岁)。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，对象尚未出生，例如在子宫内。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，对象为至少1个月大(例如，至少2岁、至少12岁、至少16岁或至少18岁)。本文所述的任何方法可用于治疗对象，例如患病的对象(即，患有疾病的对象，例如，已被诊断患有疾病的对象)、或无症状的对象(即，临床上表现为健康的对象或未被诊断患有疾病的对象)。如本文所用，治疗包括“预防性治疗”和“治疗性治疗”，“预防性治疗”意指在处于疾病风险的对象中降低疾病的体征或症状的发生率或预防疾病的体征或症状(或降低疾病的风险)，“治疗性治疗”意指在诊断患有疾病的对象中降低疾病的体征或症状、降低疾病的进展、降低疾病的严重度、复发。如本文所用，术语“治疗”意指改善疾病的至少一种临床参数和/或提供益处(例如，抗老化、抗瘢痕形成、伤口愈合、抗抑郁、抗炎、体重减轻)。

C.给药频率和施用

在本文提供的任何方法的一些实施方案中，在一段时间内(例如，每天、每2天、每周两次、每周一次、每月三次、每月两次、每月一次、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月、每年一次)施用组合物至少一次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100次)。还考虑每月治疗，例如，每月至少施用一次，持续至少1个月(例如，至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或更多个月，例如，12个月或更多个月)，以及每年治疗(例如，每年施用一次，持续1年或多年)。施用频率可与特定事件相关，例如，病原体相关疾病或障碍的第一症状、疫苗组合物的第一剂量、前往另一州、县、国家或大陆等。

施用可以通过任何合适的途径，例如，皮下、静脉内、动脉、眼内、口服、肌内、鼻内(例如，吸入)、腹膜内、局部、粘膜、硬膜外、舌下、表皮、羊膜外、关节间、皮内、骨内、鞘内、子宫内、阴道内、膀胱内、玻璃体内、血管周围和/或直肠施用或已知施用方法的任何组合。

在一些实施方案中，细胞质的死亡过程可对对象具有治疗效果。例如，在一些实施方案中，细胞质的死亡过程可以是免疫刺激性的。因此，本文提供了向对象施用细胞质的方法，其中细胞质的死亡对对象具有治疗效果。在一些实施方案中，施用于对象的细胞质是死亡的。在一些实施方案中，施用于对象的细胞质在施用时具有少于5天(例如，少于4天、少于3天、少于2天、少于36小时、少于1天、少于18小时、少于12小时、少于6小时、少于2小时或少于1小时)的剩余寿命。

在一些实施方案中，细胞可以从对象中取出并去核。在一些实施方案中，细胞在去核之前经工程改造(例如，以产生或含有治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子治疗剂、治疗性基因编辑因子、治疗性纳米颗粒和/或另一种治疗剂)。在一些实施方案中，将来自对象的细胞去核，然后工程改造(例如，以产生或含有治疗性DNA分子、治疗性RNA分子、治疗性蛋白质、治疗性肽、小分子治疗剂、治疗性基因编辑因子、治疗性纳米颗粒和/或另一种治疗剂)。在一些实施方案中，将细胞质(无论它们是否已经经工程改造)施用于从中去除细胞的对象。

在一些实施方案中，其中培养和/或储存细胞质的培养基(“条件培养基”)可具有治疗益处。在一些实施方案中，其中细胞质与细胞共培养和/或储存(例如，去核后)的培养基(“条件培养基”)可具有治疗益处。在一些实施方案中，其中与细胞融合的细胞质与细胞一起培养和/或储存的培养基(“条件培养基”)可具有治疗益处。

因此，本文提供了治疗、预防或预防性地治疗或促进对象的健康的方法，包括向对象施用条件培养基。不受任何特定理论的束缚，认为在一些实施方案中，培养基的治疗益处可归因于在培养基中存在由细胞质分泌的外泌体(例如，含有治疗性蛋白质)。

在本文提供的任何方法的一些实施方案中，组合物与一种或多种附加疗法(例如，任何药物(例如，抗生素、抗病毒剂、抗炎药物)或化学疗法(例如，化学治疗剂(例如，多柔比星、紫杉醇、环磷酰胺)或本文描述的任何小分子治疗剂)、基于细胞的疗法、放射疗法、免疫疗法、小分子、抑制性核酸(例如、反义RNA、反义DNA、miRNA、siRNA、lncRNA)、基于外泌体的疗法、基因疗法或手术)一起施用。在一些实施方案中，一种或多种附加疗法包括抑制免疫检查点蛋白质如PD-1/PDCD1/CD279、CTLA-4/CD152、TIM-3/HAVCR2、TIGIT、LAG3、VISTA/C10orf54、BTLA/CD272、A2AR、KIR、CD28、ICOS/CD278、CD40L/CD154、CD137/4-1BB、CD27、OX40/CD134/TNFRSF4、GITR或SIRPα的组合疗法。

在本文提供的一些实施方案中，组合物还包括一种或多种附加疗法(例如，任何药物(例如，抗生素、抗病毒剂)或化学疗法(例如，化学治疗剂(例如，多柔比星、紫杉醇、环磷酰胺))、基于细胞的疗法、放射疗法、免疫疗法、小分子、抑制性核酸(例如，反义RNA、反义DNA、miRNA、siRNA、lncRNA)或手术)。

III.制造方法

本公开提供了制造本文公开的抗病毒组合物和细胞质的方法。在一些实施方案中，本公开提供了用于从来源于(例如，获得自)正常或癌细胞系的任何有核细胞中或从身体中取出的任何原代细胞中去除细胞核(也称为去核)的方法，这些原代细胞包括但不限于来源于(例如，获得自)免疫系统的常用治疗性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、干细胞(包括例如，iPSC(诱导的多能干细胞)、成体干细胞(例如，间充质干细胞)以及胚胎干细胞)和成纤维细胞。细胞去核可产生治疗性细胞质，其在有限的时间，例如最多5天内是有活力的。因此，在一些方面，本公开提供了细胞质作为不能执行以下一种或多种动作的安全治疗载体的新用途：增殖、分化、永久植入对象、癌变或将核编码的DNA/基因转移至对象(例如，将危险的核编码的DNA/基因转移至对象)。

对于基于细胞的疗法，在一些情况下，FDA的批准基于细胞稳定的证据，这意味着它们一旦进入对象体内就不会改变或变得危险。然而，目前的细胞产物，包括原代细胞、照射细胞或“死亡开关”控制的细胞，仍然具有响应或改变体内微环境的潜力。重要的是，目前的疗法仍能保留转录新基因的潜力，这在体内不是可控反应。这种基因转录妨碍了满足调控要求的能力。相反，缺乏细胞核的细胞质即使在非常不同的体内微环境中也通常不具有新基因转录的潜力，因此是更受控和更安全的基于细胞的疗法。

迄今为止，基于细胞的治疗剂通常使用正常或工程改造的有核细胞。一些基于细胞的疗法在对象施用之前照射细胞以防止细胞增殖和诱导的致死性DNA损伤。然而，该方法诱导突变并产生显著量的活性氧物质，该活性氧物质可不可逆地损伤细胞蛋白质和DNA，这些细胞蛋白质和DNA可将大量损伤/突变的DNA释放到对象体内。如果这些产物整合到其他细胞中和/或诱导不需要的抗DNA免疫应答，那么它们可能是危险的。辐射的细胞也可能是危险的，因为它们可以通过细胞-细胞融合将它们的突变DNA和基因转移到宿主细胞中。从细胞中去除整个细胞核是一种破坏性较小且明显更安全的限制细胞寿命的方法，其可以阻止将任何核DNA引入对象。此外，许多干细胞如间充质干细胞(MSC)对辐射诱导的死亡具有高度抗性，因此使用该方法无法保证安全。在其他情况下，治疗性细胞已经用药物诱导型自杀开关进行工程改造以限制细胞寿命。然而，体内开关的激活可能需要向对象施用具有有害副作用的有效且潜在有害的药物。虽然该方法可以在培养细胞中诱导自杀(例如，大于95％)，但是当将其转化至临床时预期是低效的。不受任何特定理论的束缚，认为药物诱导型自杀开关对于临床实践而言可能是不充分的安全措施，因为并非对象中的所有细胞都可能经历药物诱导的死亡。因此，在广泛工程改造的细胞或干细胞或癌细胞的情况下，药物诱导的自杀开关可被认为是危险的或不足以用于临床实践。此外，治疗性细胞的死亡可以释放大量的DNA(正常的或遗传改变的)，其可以整合到宿主细胞中或诱导危险的系统性抗DNA免疫应答。如果细胞突变和/或丧失或失活自杀开关，它可能变成不可控的突变细胞。此外，这些细胞可与对象中的宿主细胞融合，并因此转移DNA(例如，突变DNA)。这样的融合细胞可能是危险的，因为不是所有的宿主细胞都遗传自杀基因，而是可以在染色体重组和细胞杂交期间遗传一些治疗性细胞的基因/DNA。此外，出于相同的原因，具有自杀开关的治疗性细胞可能不适合用作体外细胞融合配偶体(partner)。限制治疗性细胞寿命的另一种方法是引起严重损伤的热诱导死亡，该严重损伤终止治疗用途中有益的生物功能(例如，蛋白质翻译)。与细胞质不同，有核细胞疗法和甚至一些通过上述方法灭活的细胞仍可将DNA转移至对象，因为它们保留了其细胞核和遗传物质。许多化学品在治疗性使用之前抑制细胞增殖和/或引起细胞死亡，包括化疗药物和丝裂霉素C等。然而，这些药物可具有显著的脱靶效应，其显著损害细胞，这由于高毒性对于临床应用是不期望的。许多抗增殖和死亡诱导药物由于抗性而不能有效抑制100％的细胞，并且与细胞质不同，许多药物作用是可逆的。因此，该方法不适于在体内防止永生化或癌细胞的细胞生长。

本文提供了制造本公开的细胞质的方法。在一些实施方案中，用细胞松弛素B处理有核细胞(例如，本文称为“亲本细胞”)以软化皮质肌动蛋白细胞骨架。在一些实施方案中，方法包括：将活性剂如病毒肽或蛋白质引入有核细胞；以及从亲本细胞机械去除细胞核以产生细胞质(去核)。在一些实施方案中，还在去核之前将亲本细胞引入第二活性剂。在一些实施方案中，在去核后将亲本细胞引入第二活性剂。第二活性剂可以是由细胞质递送至靶细胞的治疗剂。示例性的靶细胞是肌肉细胞，例如成肌细胞或成熟肌细胞。

使用合适的瞬时转染方法(例如，电穿孔)或转导(例如，病毒介导的)将活性剂引入亲本细胞。在一些实施方案中，将包含编码活性剂的转基因的质粒转染到亲本细胞中。在一些实施方案中，将包含编码活性剂的转基因的病毒载体转导到亲本细胞中。质粒可以是细菌质粒(例如，大肠杆菌)。在一些实施方案中，还通过类似方法将亲本细胞引入第二活性剂。在一些实施方案中，第二活性剂为治疗剂。

使用机械去核去除表达活性剂和任选的第二活性剂的亲本细胞的细胞核。在一些实施方案中，使用细胞可渗透的真菌毒素渗透亲本细胞壁。机械去核可包括使用不连续的Ficoll梯度进行密度梯度离心、进行高速离心，以形成细胞质。使用标准纯化方案分离和纯化细胞质。可以用外源性核酸(例如，mRNA、DNA、反义寡核苷酸)进一步工程改造细胞质。

本公开提供了用于制造细胞质的方法，该细胞质具有天然或可诱导的表达和/或摄取具有治疗功能的生物分子，该生物分子包括但不限于DNA/基因(例如质粒)、RNA(例如，mRNA、shRNA、siRNA、miRNA)、蛋白质、肽、小分子治疗剂(例如，小分子药物)、基因编辑组分、纳米颗粒和其他治疗剂(例如，细菌、细菌孢子、噬菌体、细菌组分、病毒(例如，溶瘤病毒)、外泌体、脂质或离子)。

可用于将生物分子(例如，RNA分子(例如，mRNA、miRNA、siRNA、shRNA、lncRNA)、DNA分子(例如，质粒)、蛋白质、基因编辑因子(例如，CRISPR/Cas9基因编辑因子)、肽、质粒)引入细胞质(例如，来源于本文所述的任何细胞的细胞质)的各种方法是本领域已知的。可用于将生物分子引入细胞质中的方法的非限制性实例包括：电穿孔、显微注射、脂质转染、转染、磷酸钙转染、基于树状聚体的转染、阳离子聚合物转染、细胞挤压、声孔效应(sonoporation)、光学转染、impalection、流体动力学递送、磁转染和纳米颗粒转染。基因编辑因子的非限制性实例包括：CRISPR/Cas9基因编辑、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶。

培养细胞(例如，本文所述的任何细胞)的方法是本领域熟知的。细胞可在有利于生长、增殖、活力、分化和/或诱导具有治疗能力/益处的特定生物功能的条件下体外维持，所述条件包括但不限于三维培养、低氧环境、在限定的细胞外基质组分上培养、用化学试剂、细胞因子、生长因子处理或暴露于诱导特定期望细胞应答的任何天然或合成的外源性试剂。

方法包括从任何有核细胞类型(例如，有核细胞类型(例如，哺乳动物细胞、人细胞)、原生动物细胞(例如，阿米巴细胞)、藻类细胞、植物细胞、真菌细胞、无脊椎动物细胞、鱼类细胞、两栖动物细胞、爬行动物细胞或鸟细胞)的细胞质的大规模体外生产。例如，细胞可以是天然的或通过基因工程进行永生化和/或致癌转化。

本文提供了储存本公开的纯化和分离的细胞质以使得细胞质的生物活性被减慢或完全停止的方法。在一些实施方案中，细胞质在至多10℃的温度下在休眠状态下储存。在一些实施方案中，温度为约4℃。在一些实施方案中，温度为4℃。在一些实施方案中，温度至多为4℃。在一些实施方案中，细胞质保存至多或约96小时。一段时间后，从休眠状态中取出细胞质以恢复细胞质的生物活性。所得细胞质是有活力的，并且适于递送至有此需要的对象。在一些实施方案中，与在4℃至10℃储存之前的细胞质相比，在4℃至10℃储存的细胞质表现出至少或等于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的活力。

在本文提供的任何组合物和方法的一些实施方案中，将细胞质冷却或冷冻以备后用。保存细胞的各种方法是本领域已知的，包括但不限于在超低温下使用血清(例如，胎牛血清)和二甲亚砜(DMSO)(冷冻低温保存)或在4℃下使用用于储存的休眠培养基(低温休眠)。在本文提供的任何组合物和方法的一些实施方案中，在使用前将细胞质解冻。

在一些实施方案中，细胞质可在约-80℃至约16℃(例如，约-80℃至约12℃、-80℃至约10℃、约-80℃至约8℃、约-80℃至约6℃、约-80℃至约4℃、约-80℃至约2℃、约-80℃至约0℃、约-80℃至约-4℃、约-80℃至约-10℃、约-80℃至约-16℃、约-80℃至约-20℃、约-80℃至约-25℃、约-80℃至约-30℃、约-80℃至约-35℃、约-80℃至约-40℃、约-80℃至约-45℃、约-80℃至约-50℃、约-80℃至约-55℃、约-80℃至约-60℃、约-80℃至约-65℃、约-80℃至约-70℃、约-60℃至约16℃、约-60℃至约12℃、约-60℃至约10℃、约-60℃至约8℃、约-60℃至约6℃、约-60℃至约4℃、约-60℃至约2℃、约-60℃至约0℃、约-60℃至约-4℃、约-60℃至约-10℃、约-60℃至约-10℃、约-60℃至约-16℃、约-60℃至约-20℃、约-60℃至约-25℃、约-60℃至约-30℃、约-60℃至约-35℃、约-60℃至约-40℃、约-60℃至约-50℃、约-50℃至约16℃、约-50℃至约12℃、约-50℃至约10℃、约-50℃至约8℃、约-50℃至约6℃、约-50℃至约4℃、约-50℃至约2℃、约-50℃至约0℃、约-50℃至约-4℃、约-50℃至约-10℃、约-50℃至约-16℃、约-50℃至约-20℃、约-50℃至约-30℃、约-50℃至约-40℃、约-20℃至约16℃、约-20℃至约12℃、约-20℃至约10℃、约-20℃至约8℃、约-20℃至约6℃、约-20℃至约4℃、约-20℃至约2℃、-约20℃至约0℃、约-20℃至约-4℃、约-20℃至约-10℃、约-20℃至约-15℃、约-10℃至约16℃、约-10℃至约12℃、约-10℃至约10℃、约-10℃至约8℃、约-10℃至约6℃、约-10℃至约4℃、约-10℃至约2℃、约-10℃至约0℃、约-10℃至约-4℃、约-10℃至约-6℃、约-4℃至约16℃、约-4℃至约10℃、约-4℃至约6℃、约-4℃至约4℃、约-4℃至约2℃、约-4℃至约0℃、约-2℃至约16℃、约-2℃至约12℃、约-2℃至约10℃、约-2℃至约6℃、约-2℃至约4℃、约-2℃至约2℃、约-2℃至约0℃、约0℃至约16℃、约0℃至约14℃、约0℃至约12℃、约0℃至约10℃、约0℃至约8℃、约0℃至约6℃、约0℃至约4℃、约2℃至约16℃、约2℃至约12℃、约2℃至约10℃、约2℃至约8℃、约2℃至约6℃、约2℃至约4℃、约4℃至约16℃、约4℃至约12℃、约4℃至约10℃、约4℃至约8℃、约4℃至约6℃、约6℃至约16℃、约6℃至约12℃、约6℃至约10℃、约6℃至约8℃、约8℃至约16℃、约8℃至约12℃、约8℃至约10℃、约10℃至约16℃、约10℃至约12℃或约12℃至约16℃)的温度下储存约1天至约7天(例如，约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约7天、约5天至约6天或约6天至约7天)。在一些实施方案中，与在相同温度范围储存之前的细胞质相比，在本文所述的温度范围储存的细胞质表现出至少或等于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的活力。

在一些实施方案中，将细胞质冻干。在一些实施方案中，将细胞质冻干用于储存。在一些实施方案中，将细胞质冻干至少或等于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、2月、3月、4月、5月、6月、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月、12月、18月、24月、30月、3年、4年、5年或10年。在一些实施方案中，与冻干前的细胞质相比，细胞质表现出至少或等于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的活力。

IV.试剂盒

在一些实施方案中，本文公开了使用本文所述的组合物、药物组合物或细胞质的试剂盒。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用于预防或治疗对象的疾病或病症；或选择对象以用于预防或治疗本文公开的疾病或病症。在一些实施方案中，试剂盒包含本文所述的药物组合物、组合物或细胞质，其可用于进行本文所述的方法。试剂盒包括材料或组分的组合。因此，在一些实施方案中，试剂盒含有包括药物组合物或细胞质的组合物，以用于治疗本文所述的疾病或病症。

在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含用于选择细胞质的同质群体的组分。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含用于选择细胞质的异源群体的组分。在一些实施方案中，试剂盒包含用于测定由细胞质合成或释放的外源性治疗剂的单位数量的组分。在一些实施方案中，试剂盒包含用于测定在细胞质表面上表达的外源性治疗剂的单位数量的组分。在一些实施方案中，试剂盒包含用于进行诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)、PCR和qPCR等测定的组分。试剂盒中配置的组分的确切性质取决于其预期目的。例如，一些实施方案被配置用于在对象中接种疫苗或治疗本文公开的疾病或病症(例如，呼吸系统疾病)的目的。在一些实施方案中，试剂盒被特别配置用于接种疫苗或治疗哺乳动物对象的目的。在一些实施方案中，该试剂盒被特别地配置用于接种疫苗或治疗人类对象的目的。

试剂盒中可包含使用说明书。例如，说明书可以指导保健服务提供者如何在医疗机构或护理能力点使用试剂盒的组分为对象接种疫苗。任选地，试剂盒还含有其他有用的组分，例如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、涂药器、移液或测量工具、绷带材料或其他有用的器具。装配在试剂盒中的材料或组分可以以保持其可操作性和实用性的任何方便和合适的方式提供给医师。例如，组分可以是溶解的、脱水的或冻干的形式；它们可以在室温、冷藏或冷冻温度下提供。这些组分通常包含在合适的包装材料中。如本文所用，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒的内容物(例如，组合物等)的一种或多种物理结构。包装材料通过公知的方法构造，优选提供无菌、无污染的环境。试剂盒中使用的包装材料是通常用于基因表达测定和治疗施用的包装材料。如本文所用，术语“包装”是指能够容纳各个试剂盒组分的合适的固体基质或材料，诸如玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装可以是用于容纳合适量的药物组合物的玻璃小瓶或预填充注射器。包装材料具有外部标签，其指示试剂盒及其组分的内容物和/或目的。

V.定义

除非另有限定，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或术语都旨在具有与要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在一些实施方案中，为了清楚和/或便于参考，本文定义了具有通常理解含义的术语，并且本文包含的这些定义不应必然解释为表示与本领域通常理解的实质差异。

贯穿本申请，各种实施方案可以以范围形式公开。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的硬性限制。因此，应该认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，如1至6的范围的描述应被认为具有具体公开的子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5、6。无论范围的广度如何，这都适用。

如说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。例如，术语“样品”包括多个样品，包括其混合物。

使用绝对或顺序术语，例如“将”、“将不”、“应”、“不应”、“必须”、“不得”、“首先”、“最初”、“接下来”、“随后”、“之前”、“之后”、“最后”和“最终”，并不旨在限制本文所公开的本实施方案的范围，而是作为示例。

如本文所使用的，短语“至少一种”、“一种或多种”和“和/或”是开放式表达，其在操作中既是联合的也是分离的。例如，表述“A、B和C中的至少一种”、“A、B或C中的至少一种”、“A、B和C中的一种或多种”、“A、B或C中的一种或多种”和“A、B和/或C”中的每一种是指单独的A、单独的B、单独的C、一起的A和B、一起的A和C、一起的B和C、或一起的A、B和C。

每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等同于大于或等于1、大于或等于2、或大于或等于3。

每当术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等同于小于或等于3、小于或等于2或小于或等于1。

本文描述的任何系统、方法、软件、组合物和平台是模块化的，并且不限于顺序步骤。因此，诸如“第一”和“第二”等术语不一定暗示优先级、重要性顺序或动作顺序。

如本文所用，术语“增加的”或“增加”通常是指增加静态显著量。在一些实施方案中，术语“增加的”或“增加”是指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平、标准或对照相比增加至少约10％、至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或多达并包括100％增加或10-100％之间的任何增加。“增加”的其他实例包括与参考水平相比增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多。

术语“减少的”或“减少”在本文中通常是指减少统计学上显著量。在一些实施方案中，“减少的”或“减少”是指与参照水平相比减少至少10％，例如，与参照水平相比减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多并包括100％减少(例如，与参照水平相比水平缺失或不可检测)，或与参照水平相比10-100％之间的任何减少。在标记或症状的上下文中，这些术语是指这种水平的统计学显著减少。减少可以是，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选地减少至对于没有给定疾病的个体在正常范围内可接受的水平。“减少”的其他实例包括与参考水平相比减少至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多。

如本文所用，“细胞”通常是指活生物体的生物单位。

如本文所用，术语“真核细胞”是指具有不同的膜结合核的细胞。此类细胞可包括例如哺乳动物(例如，啮齿动物、非人灵长类动物或人)、非哺乳动物(例如，鱼、鸟、爬行动物或两栖动物)、无脊椎动物、昆虫、真菌或植物细胞。在一些实施方案中，真核细胞是酵母细胞，如酿酒酵母。在一些实施方案中，真核细胞是高等真核生物，如哺乳动物、鸟类、植物或昆虫细胞。

如本文所用，术语“细胞质”、“无细胞核的细胞”或“去核细胞”可互换使用，是指从先前有核细胞(例如，本文所述的任何细胞)获得的无细胞核的细胞。在一些实施方案中，有核细胞包含细胞器，并且来源于有核细胞的细胞质保留了这种细胞器，其在一些情况下能够实现细胞功能，例如细胞运动性、蛋白质合成、蛋白质分泌等。在一些实施方案中，“获得”不包括使用天然方法或其他方法将有核细胞分化为去核细胞。

如本文所用，术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸组合。核苷酸可包括合成的核苷酸。核苷酸可包括合成的核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列(例如，脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))的单体单元。术语核苷酸可包括核糖核苷三磷酸腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞嘧啶三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)以及脱氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。此类衍生物可包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP以及赋予含有它们的核酸分子核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文所用，术语核苷酸可以指双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核苷三磷酸的说明性实例可包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未标记的或通过熟知的技术可检测地标记的。标记也可以用量子点进行。可检测标记可包括例如，放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。核苷酸的荧光标记可以包括但不限于荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2′7′-二甲氧基-4′5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4′二甲基氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)、Cascade Blue、俄勒冈绿(Oregon Green)、德克萨斯红(Texas Red)、花青和5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光标记的核苷酸的具体实例可以包括购自美国加州福斯特市珀金埃尔默(Perkin Elmer,Foster City,Calif)的[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP和[dROX]ddTTP；购自伊利诺伊州阿灵顿高地的安玛西亚公司(Amersham,Arlington Heights,Ill.)的FluoroLink DeoxyNucleotides、FluoroLinkCy3-dCTP、FluoroLink Cy5-dCTP、FluoroLink Fluor X-dCTP、FluoroLink Cy3-dUTP和FluoroLink Cy5-dUTP；购自印第安纳州印第安纳波利斯的宝灵曼公司(BoehringerMannheim,Indianapolis,Ind.)的荧光素-15-dATP、荧光素-12-dUTP、四甲基-罗丹明-6-dUTP、IR770-9-dATP、荧光素-12-ddUTP、荧光素-12-UTP和荧光素-15-2′-dATP；以及购自俄勒冈州尤金的分子探针公司(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)的染色体标记的核苷酸、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、Cascade Blue-7-UTP、Cascade Blue-7-dUTP、荧光素-12-UTP、荧光素-12-dUTP、俄勒冈绿488-5-dUTP、罗丹明绿-5-UTP、罗丹明绿-5-dUTP、四甲基罗丹明-6-UTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、德克萨斯红-5-UTP、德克萨斯红-5-dUTP和德克萨斯红-12-dUTP。核苷酸也可以通过化学修饰来标记(lable)或标识(marke)。化学修饰的单核苷酸可以是生物素-dNTP。生物素化dNTP的一些非限制性实例可包括生物素-dATP(例如，bio-N6-ddATP、生物素-14-dATP)、生物素-dCTP(例如，生物素-11-dCTP、生物素-14-dCTP)和生物素-dUTP(例如，生物素-11-dUTP、生物素-16-dUTP、生物素-20-dUTP)。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指任何长度的脱氧核糖核苷酸或其类似物的聚合形式的核苷酸，其为单链、双链或多链形式。多核苷酸对于细胞可以是外源性的或内源性的。多核苷酸可以存在于无细胞环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸可包含一种或多种类似物(例如。改变的主链、糖或核碱基)。如果存在，可以在组装聚合物之前或之后对核苷酸结构进行修饰。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸(xeno nucleic acid)、吗啉代、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素(cordycepin)、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，与糖连接的罗丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷(queuosine)和丫苷(wyosine)。多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析限定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)的无细胞多核苷酸、核酸探针和引物。核苷酸序列可以被非核苷酸组件中断。

术语“转染”或“转染的”通常指通过非病毒或基于病毒的方法将核酸引入细胞。核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的基因序列。参见，例如，Sambrook等人，1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,18.1-18.88。

如本文所用，术语“基因”是指编码单个蛋白质或RNA的核酸片段(也称为“编码序列”或“编码区”)，任选地连同相关的调节区如启动子、操纵子、终止子等，其可位于编码序列的上游或下游。术语“基因”应广义解释，并且可包括基因的mRNA、cDNA、cRNA和基因组DNA形式。在一些用途中，术语“基因”涵盖转录序列，包括5′和3′非翻译区(5′-UTR和3′-UTR)、外显子和内含子。在一些基因中，转录区将含有编码多肽的“开放阅读框”。在术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所必需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在一些方面，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转移RNA(tRNA)基因。在一些方面，术语“基因”不仅包括转录序列，而且还包括非转录区，包括上游和下游调节区、增强子和启动子。术语“基因”可包括基因的mRNA、cDNA和基因组形式。

如本文所用，术语“突变”可指序列(例如，核酸或氨基酸序列)内的残基被另一残基取代或序列内一个或多个残基的缺失或插入。一个或多个突变可以通过识别原始残基、然后是该残基在序列内的位置以及新取代的残基的身份来描述。突变可以是序列(例如，核酸序列、基因组序列、遗传序列如DNA、RNA或蛋白质序列)相对于参考序列的变化或改变。参考序列可以是野生型序列、健康或正常细胞的序列或与疾病或病症无关的序列。参考序列可以是与癌症无关的序列。突变的非限制性实例包括点突变、一个或多个核苷酸的取代、一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的插入、一个或多个核苷酸的融合、移码突变、畸变、选择性剪接、异常甲基化、错义突变、保守突变、非保守突变、无义突变、剪接变体、选择性剪接变体、转换、颠换、从头突变、有害突变、致病突变、表观突变、起始突变、种系突变、体细胞突变、诱病突变(predisposing mutation)、剪接位点突变或易感性基因突变。突变可以是增加个体对某一疾病或病症的易感性或倾向(predisposition)的致病变体或突变。突变可以是司机突变(driver mutation)(例如，可以赋予细胞在其微环境中的适应性优势，从而驱动细胞谱系进入癌症的突变)。司机突变可以是功能缺失突变。突变可以是功能缺失突变。突变可以是乘客突变(passenger mutation)(例如，在基因组中发生的具有司机突变的突变，并且可以与克隆扩增相关)。如本文所用，术语“基因”可指多核苷酸元件的组合，当以天然或重组方式可操作地连接时，其提供了一些产物或功能。

如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可在本文中关于氨基酸残基的聚合物互换使用。蛋白质可以指从编码开放阅读框翻译的全长多肽，或加工成其成熟形式的全长多肽，而多肽或肽可以指仍然独特地或可鉴别的定位于特定蛋白质的降解片段或加工片段。多肽可以是通过相邻氨基酸残基的羧基和氨基之间的肽键键合在一起的氨基酸的单线性聚合物链。多肽可以被修饰，例如通过添加碳水化合物、磷酸化等。蛋白质可以包含一种或多种多肽。

如本文所用，术语“部分(portion)”或“片段”或等效术语可指实体(例如，蛋白质)的一部分。在蛋白质或多肽的情况下，部分或片段小于蛋白质或多肽的全长。在一些实施方案中，部分或片段保持全长蛋白质的预期功能。

如本文所用，术语“互补体(complement/complements)”、“互补的(complementary)”和“互补性(complementarity)”通常是指与给定序列完全互补并且可与给定序列杂交的序列。在一些实施方案中，如果与给定核酸杂交的序列在给定区域上的碱基序列能够与其结合配偶体的序列互补结合，从而形成例如A-T、A-U、G-C和G-U碱基对，则该序列被称为给定分子的“互补体”或“反向互补体”。通常，可与第二序列杂交的第一序列可与第二序列特异性或选择性杂交，使得与第二序列或第二序列的组的杂交在杂交反应期间与非靶序列杂交是优选的(例如，在给定的条件组下，如本领域中通常使用的严格条件下，热力学更稳定)。通常，可杂交序列在其各自长度的全部或一部分上具有一定程度的序列互补性，例如25％-100％的互补性，包括至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列互补性。例如为了评定百分比互补性的目的，可以通过任何合适的比对算法来测量序列同一性，该比对算法包括但不限于Needleman-Wunsch算法(参见，例如，可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html获得的EMBOSS Needle比对器(aligner)，任选地具有默认设置)、BLAST算法(参见，例如，可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi获得的BLAST比对工具，任选地具有默认设置)或Smith-Waterman算法(参见，例如，可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html获得的EMBOSS Water比对器，任选地具有默认设置)。可使用所选算法的任何合适参数(包括默认参数)来评定最佳比对。

如本文所用，术语“百分比(％)同一性”通常是指在比对序列并引入空位(如果必要)以实现最大百分比同一性(即，可在候选序列和参考序列中的一者或两者中引入空位以用于最佳比对，且出于比较目的可忽略非同源序列)之后，候选序列的氨基酸(或核酸)残基与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。为了确定同一性百分比，可以用本领域技术人员已知的各种方法进行比对，例如使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、ALIGN、或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过使用BLAST比对测试序列与比较序列，确定比对的测试序列中与比较序列的相同位置中的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的数目，并将比较序列中相同的氨基酸或核苷酸的数目除以氨基酸或核苷酸的数目来计算两个序列的百分比同一性。

术语“确定”、“测量”、“评估”、“评定”、“测定”和“分析”在本文中通常可互换使用以指代测量形式。这些术语包括确定元素是否存在(例如，检测)。这些术语可包括定量、定性或定量和定性确定。评定可以是相对的或绝对的。“检测某物的存在”除了根据上下文确定某物存在或不存在之外，还可以包括确定某物存在的量。

术语“对象”和“个体”在本文中通常可互换使用，是指含有表达的遗传物质的生物实体。如本文所用，术语“对象”是指任何有机体。例如，对象可以是哺乳动物、两栖动物、鱼、爬行动物、无脊椎动物、鸟、植物、古细菌、真菌或细菌。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象可以是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠)、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、马科动物(例如，马)、绵羊、牛、猪、非人灵长类动物、例如猿(例如，猴)、猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人。对象可以是体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。对象可以是哺乳动物。哺乳动物可以是人。对象可以是“患者”，在一些实施方案中，其是指已被诊断或患有本文所述的疾病或病症的对象。在一些实施方案中，对象未被诊断、但被预测为处于发展或患有疾病或病症的高风险中。

术语“体内”用于描述在对象体内发生的事件。

术语“离体”用于描述在对象体外发生的事件。离体测定不在对象上进行。相反，它是在与对象分开的样品上进行的。对样品进行的离体测定的实例是“体外”测定。

术语“体外”用于描述在用于容纳实验室试剂的容器中发生的事件，使得实验室试剂与从其获得材料的生物源分离。体外测定可包括其中使用活细胞或死细胞的基于细胞的测定。体外测定也可包括其中不使用完整细胞的无细胞测定。

如本文所用，术语“约”数字是指该数字加上或减去该数字的10％。术语“约”范围是指该范围减去其最低值的10％并加上其最大值的10％。

如本文所用，术语“治疗(treatment/treating)”用于指用于在接受者中获得有益或期望结果的药物或其他干预方案。有益的或期望的结果包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处可指消除或改善所治疗的症状或潜在病症。此外，通过根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理症状可实现治疗益处，使得在对象中观察到改善，尽管对象可能仍然患有潜在病症。预防作用包括延迟、预防或消除疾病或病症的出现；延迟或消除疾病或病症的症状的发作；减缓、停止或逆转疾病或病症的进展或其任何组合。为了预防性益处，处于发展特定疾病的风险中的对象或报告疾病的一种或多种生理症状的对象可以经历治疗，即使可能尚未做出该疾病的诊断。

如本文所用，术语“适应性免疫应答”是指以抗原限制的方式应答的免疫应答组分，并且包括可归因于T淋巴细胞的细胞免疫应答和可归因于B细胞和浆细胞的体液或抗体应答。“细胞免疫应答”由以下任何一种或多种表示：由T细胞释放细胞因子/趋化因子；T细胞归巢至次级淋巴器官；T细胞增殖；和细胞毒性T细胞应答。几种方法可用于验证抗原特异性细胞免疫应答，包括T淋巴细胞的离体抗原刺激测定和体内测定，例如T淋巴细胞的四聚体染色。“抗体应答”通过以下任何一种或多种来表示：B细胞增殖、B细胞细胞因子/趋化因子释放、B细胞归巢至次级淋巴器官、抗体分泌、同种型转换为IgG型抗体或浆细胞分化。可通过几种方法验证抗体应答，但主要方法是检测接种疫苗个体的血清或血浆中的抗原特异性抗体。

本文所述的“佐剂”是指与抗原组合促进对抗原的适应性免疫应答的物质。“免疫刺激化合物”是指与先天免疫系统特异性相互作用以引发“危险信号”的物质，该“危险信号”最终导致免疫应答的适应性组分(例如，B细胞、T细胞)的发展。免疫刺激化合物包括病原体相关的分子模式(PAMP)，例如天然存在或合成的dsRNA、脂多糖和cpgDNA。免疫刺激化合物是各种先天免疫受体的激动剂，包括Toll样受体(TLR)、NOD样受体、RIG-1或MDA-5受体、C型凝集素受体或STING途径。

术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载体”或“生理学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。在与药物制剂的其他成分相容的意义上，组分可以是“药学上可接受的”。它还可以适用于与人和动物的组织或器官接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。参见，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版；Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients,第5版"；Rowe等人编著.,The Pharmaceutical Press and the American PharmaceuticalAssociation:2005；和Handbook of Pharmaceutical Additives,第3版；Ash和Ash编著.,Gower Publishing Company:2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation,Gibson编著.,CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2004)。

术语“药物组合物”是指本文公开的化合物与其他化学组分如稀释剂或载体的混合物。药物组合物可以促进将化合物施用于生物体。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于口服、注射、气雾剂、肠胃外和局部施用。本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。

VI.实施方案

组合物

本文公开了根据以下实施方案的组合物：

实施方案1.一种组合物，其包含去核的细胞并包含抗病毒剂。

实施方案2.根据实施方案1所述的组合物，其中所述抗病毒剂是减毒形式的病毒抗原、病毒或对所述病毒抗原具有特异性的抗体。

实施方案3.根据实施方案2所述的组合物，其中所述病毒抗原是病毒蛋白、肽片段、核酸或糖部分，并且其中对所述病毒抗原具有特异性的抗体对所述病毒蛋白、肽片段、核酸或糖部分具有特异性。

实施方案4.根据实施方案2所述的组合物，其中所述细胞包含一种或多种细胞内细胞器，所述细胞器用于所述抗病毒剂的体内蛋白质合成或蛋白质分泌。

实施方案5.根据实施方案4所述的组合物，其中所述一种或多种细胞内细胞器选自高尔基体、核糖体、内质网。

实施方案6.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述细胞的直径长度为约1微米至100微米。

实施方案7.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述细胞是干细胞。

实施方案8.根据实施方案7所述的组合物，其中所述干细胞是间充质干细胞或诱导多能干细胞。

实施方案9.根据实施方案8所述的组合物，其中所述间充质干细胞来自脂肪组织或骨骼。

实施方案10.根据实施方案8所述的组合物，其中所述诱导多能干细胞来自尿液、唾液、毛发、皮肤或粪便。

实施方案11.根据实施方案2-10所述的组合物，其中所述病毒抗原或对所述病毒抗原特异性的抗体在所述细胞的表面处表达或是分泌型的。

实施方案12.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述病毒的病毒抗原通过选自化学接头、肽接头或聚合物的接头拴系至所述细胞的表面。

实施方案13.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述抗病毒剂对选自以下的病毒具有特异性或来源于以下的病毒：

b)双链(ds)DNA病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)；

c)单链(ss)DNA病毒(+链或“正义”)DNA(例如，细小病毒)；

d)dsRNA病毒(例如，呼肠孤病毒)；

e)(+)ssRNA病毒(+单链或正义)RNA(例如，小核糖核酸病毒、披膜病毒)；

f)(-)ssRNA病毒(-单链或反义)RNA(例如，正粘病毒、弹状病毒)；

g)具有生命周期DNA中间体的ssRNA-RT病毒(+链或正义)RNA(例如，逆转录病毒)；或

h)具有生命周期中的RNA中间体的dsDNA-RT病毒DNA(例如，嗜肝DNA病毒)。

实施方案14.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述抗病毒剂来源于呼吸道病毒、皮肤病毒、食源性病毒、性传播病毒或溶瘤病毒或其组合。

实施方案15.根据实施方案14所述的组合物，其中所述呼吸道病毒选自鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和冠状病毒。

实施方案16.根据实施方案14所述的组合物，其中所述皮肤病毒选自传染性软疣、单纯疱疹病毒1和水痘带状疱疹病毒。

实施方案17.根据实施方案14所述的组合物，其中所述食源性病毒选自甲型肝炎病毒、诺如病毒和轮状病毒。

实施方案18.根据实施方案14所述的组合物，其中所述性传播病毒选自人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、生殖器疱疹和人免疫缺陷病毒。

实施方案19.根据实施方案14所述的组合物，其中所述溶瘤病毒是人乳头瘤病毒或乙型肝炎。

实施方案20.根据实施方案12所述的组合物，其中所述接头包含糖基-磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区。

实施方案21.根据实施方案3所述的组合物，其中所述病毒抗原是在细胞中表达的跨膜肽。

实施方案22.根据实施方案3-21所述的组合物，其中所述病毒抗原对人具有免疫原性。

实施方案23.根据实施方案3-22所述的组合物，其中所述病毒抗原是来源于冠状病毒的肽。

实施方案24.根据实施方案23所述的组合物，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)或其变体。

实施方案25.根据实施方案23或24所述的组合物，其中所述肽选自刺突蛋白、膜蛋白或源自冠状病毒的核蛋白。

实施方案26.根据实施方案25所述的组合物，其中所述细胞包含编码所述肽的mRNA。

实施方案27.根据实施方案26所述的组合物，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的mRNA序列。

实施方案28.根据实施方案26所述的组合物，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的mRNA序列。

实施方案29.根据实施方案26所述的组合物，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的mRNA序列。

实施方案30.根据实施方案26所述的组合物，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的mRNA序列。

实施方案31.根据实施方案26所述的组合物，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少100％同一性的mRNA序列。

实施方案32.根据实施方案23-26所述的组合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:2或8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

实施方案33.根据实施方案26-32所述的组合物，其中所述mRNA的半衰期为3-5天。

实施方案34.根据实施方案26-32所述的组合物，其中所述mRNA编码包含白蛋白肽的融合蛋白。

实施方案35.根据实施方案26-32所述的组合物，其中所述mRNA编码包含免疫调节剂的融合蛋白。

实施方案36.根据实施方案35所述的组合物，其中所述免疫调节剂是对象中免疫应答的激活剂。

实施方案37.根据实施方案36所述的组合物，其中所述免疫调节剂是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或细胞因子或其组合。

实施方案38.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述细胞还包含一种或多种归巢受体。

实施方案39.根据实施方案38所述的组合物，其中所述一种或多种归巢受体通过选自化学接头、肽接头或聚合物的接头拴系至所述细胞的表面。

实施方案40.根据实施方案39所述的组合物，其中所述接头包含糖基-磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区。

实施方案41.根据实施方案38所述的组合物，其中所述一种或多种归巢受体在所述细胞的表面上表达。

实施方案42.根据实施方案41所述的组合物，其中所述一种或多种归巢受体经遗传修饰以增加所述一种或多种归巢受体在所述细胞表面上的表达。

实施方案43.根据实施方案38-42所述的组合物，其中所述一种或多种归巢受体对淋巴组织中的一种或多种细胞上表达的一种或多种配体具有特异性。

实施方案44.根据实施方案43所述的组合物，其中所述淋巴组织中的所述一种或多种细胞包括内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞或网状细胞或其组合。

实施方案45.根据实施方案38-44所述的组合物，其中所述一种或多种归巢受体包含对两种或更多种不同配体具有特异性的两种或更多种归巢受体。

实施方案46.根据实施方案38-45所述的组合物，其中所述一种或多种归巢受体选自C-X-C趋化因子受体3型(CXCR3)、白细胞唾液酸蛋白(CD43)、CD44抗原(CD44)、C-C趋化因子受体7型(CCR7)、L-选择素(CD62L)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)或极晚期抗原4(VLA4)。

实施方案47.根据实施方案38-46所述的组合物，其中所述一种或多种归巢受体包含L-选择素(CD62L)和C-C趋化因子受体7型(CCR7)。

实施方案48.根据实施方案38-46所述的组合物，其中所述一种或多种归巢受体对在淋巴组织的内皮细胞中表达的配体具有特异性，并且当将组合物施用于对象时，所述病毒抗原有效地激活对象中针对冠状病毒的免疫应答。

实施方案49.根据任一前述实施方案所述的组合物，其中所述细胞还包含一种或多种免疫调节剂。

实施方案50.根据实施方案49所述的组合物，其中所述一种或多种免疫调节剂拴系至所述细胞表面。

实施方案51.根据实施方案50所述的组合物，其中所述一种或多种免疫调节剂使用包含糖基-磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区的接头拴系至所述细胞表面。

实施方案52.根据实施方案49-51所述的组合物，其中所述一种或多种免疫调节剂在所述细胞表面上表达。

实施方案53.根据实施方案49-52所述的组合物，其中所述一种或多种免疫调节剂选自粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、淋巴毒素α(LTA)、淋巴毒素β(LTB)、TNF超家族成员4(TNFSF4)、CD40配体(CD40LG)、fas配体(FASLG)、CD70分子(CD70)、TNF超家族成员8(TNFSF8)、TNF超家族成员9(TNFSF9)、TNF超家族成员10(TNFSF10)、TNF超家族成员11(TNFSF11)、TNF超家族成员12(TNFSF12)、TNF超家族成员13(TNFSF13)、TNF超家族成员13b(TNFSF13B)、TNF超家族成员14(TNFSF14)、TNF超家族成员15(TNFSF15)、TNF超家族18(TNFSF18)、外异蛋白A(ectodysplasin，EDA)、细胞因子和病毒抗原蛋白。

实施方案54.根据实施方案49-53所述的组合物，其中所述一种或多种免疫调节剂是包含白蛋白肽的融合蛋白。

实施方案55.根据实施方案1-54所述的组合物，其中所述组合物被分离。

实施方案56.根据实施方案1-54所述的组合物，其中所述组合物被纯化。

实施方案57.根据实施方案1-54所述的组合物，其包含在悬浮液或细胞培养物或两者中的多个细胞。

实施方案58.根据实施方案1-57所述的组合物，其中所述组合物被低温保存或预先低温保存至少48小时。

实施方案59.一种递送任一前述实施方案所述的组合物的方法，所述方法包括通过全身递送或直接递送向有需要的对象施用所述组合物。

实施方案60.根据实施方案59所述的方法，其中全身递送包括静脉内递送或吸入，并且其中直接递送包括肌内、腹膜内和淋巴结内递送。

实施方案61.根据实施方案59-60所述的方法，还包括在所述递送之后使所述对象基本上免于被包含所述组合物的活病毒感染。

实施方案62.一种预防对象中病毒感染的方法，所述方法包括向所述对象施用实施方案1-58所述的组合物，从而使所述对象基本上免于被包含所述组合物的活病毒感染。

实施方案63.一种治疗对象中急性病毒感染的方法，所述方法包括向所述对象施用实施方案1-58所述的组合物，从而降低所述对象中的病毒载量。

实施方案64.一种预防对象中由冠状病毒引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用实施方案1-58所述的组合物，从而预防由所述冠状病毒引起的疾病。

实施方案65.一种治疗对象中由冠状病毒引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用实施方案1-58所述的组合物，从而治疗由所述冠状病毒引起的疾病。

实施方案66.根据实施方案64和65所述的方法，其中所述疾病是2019冠状病毒病(COVID-19)。

实施方案67.根据实施方案59-66所述的方法，还包括：(a)接收在4摄氏度的悬浮液中储存至少48小时的组合物，其中所述组合物具有减缓的或停止的生物活性；和(b)从悬浮液中去除所述组合物，从而恢复所述组合物的生物活性。

制造方法

本文公开了根据以下实施方案的利用细胞质以产生组合物的方法：

实施方案1.一种制造组合物的方法，所述方法包括：

(a)将编码第一病毒抗原或抗病毒抗体的第一核酸引入亲本细胞，所述亲本细胞包含：

i)细胞核；和

ii)用于蛋白质合成或蛋白质分泌的一种或多种细胞内细胞器；以及

(b)从所述亲本干细胞机械去除所述细胞核以产生去核干细胞，其中所述去核干细胞包含所述一种或多种细胞内细胞器。

实施方案2.一种制造组合物的方法，所述方法包括：

(a)将编码第一病毒抗原或抗病毒抗体的第一核酸引入去核干细胞，所述去核干细胞包含用于所述第一病毒抗原或所述抗病毒抗体的蛋白质合成或蛋白质分泌的一种或多种细胞内细胞器；以及

(b)在所述去核干细胞中表达所述第一病毒抗原或所述抗病毒抗体。

实施方案3.根据实施方案1和2所述的方法，其中所述第一病毒抗原在所述去核干细胞的表面处表达。

实施方案4.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述第一病毒抗原或所述抗病毒抗体是分泌型的。

实施方案5.根据任一前述实施方案所述的方法，还包括在低于所述悬浮液的冷冻温度的温度下将所述去核干细胞储存在所述悬浮液中至少24小时、48小时或96小时。

实施方案6.根据任一前述实施方案所述的方法，还包括引入编码第二病毒抗原的第二核酸，其中所述第一核酸和第二核酸不相同且所述第一病毒抗原和第二病毒抗原不相同。

实施方案7.根据任一前述实施方案所述的方法，还包括引入编码不同于所述第一病毒抗原的多个病毒抗原的多个核酸。

实施方案8.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述核酸是信使RNA(mRNA)。

实施方案9.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述核酸是DNA。

实施方案10.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述第一病毒抗原来源于哺乳动物。

实施方案11.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述抗病毒抗体对冠状病毒具有特异性。

实施方案12.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述第一病毒抗原是来源于冠状病毒的减毒病毒颗粒。

实施方案13.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述第一病毒抗原通过选自化学接头、肽接头或聚合物的接头拴系至所述去核干细胞的表面。

实施方案14.根据实施方案13所述的方法，其中所述接头包含糖基-磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区。

实施方案15.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述第一病毒抗原是在去核干细胞中表达的跨膜肽。

实施方案16.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述第一病毒抗原对人具有免疫原性。

实施方案17.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述第一病毒抗原是来源于冠状病毒的肽。

实施方案18.根据实施方案17所述的方法，其中所述肽选自刺突蛋白、膜蛋白或源自冠状病毒的核蛋白。

实施方案19.根据实施方案18所述的方法，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)或其变体。

实施方案20.根据实施方案17-19所述的方法，其中所述去核干细胞包含编码所述肽的mRNA。

实施方案21.根据实施方案20所述的方法，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的mRNA序列。

实施方案22.根据实施方案20所述的方法，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的mRNA序列。

实施方案23.根据实施方案20所述的方法，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的mRNA序列。

实施方案24.根据实施方案20所述的方法，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的mRNA序列。

实施方案25.根据实施方案20所述的方法，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少100％同一性的mRNA序列。

实施方案26.根据实施方案17-20所述的方法，其中所述肽包含与SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

实施方案27.根据实施方案20-26所述的方法，其中所述mRNA的半衰期为3-5天。

实施方案28.根据实施方案20-26所述的方法，其中所述mRNA编码包含白蛋白肽的融合蛋白。

实施方案29.根据实施方案20-26所述的方法，其中所述mRNA编码包含免疫调节剂的融合蛋白。

实施方案30.根据实施方案29所述的方法，其中所述免疫调节剂是对象中免疫应答的激活剂。

实施方案31.根据实施方案30所述的方法，其中所述免疫调节剂是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或细胞因子或其组合。

实施方案32.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述去核干细胞还包含一种或多种归巢受体。

实施方案33.根据实施方案32所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体通过选自化学接头、肽接头或聚合物的接头拴系至所述去核干细胞的表面。

实施方案34.根据实施方案33所述的方法，其中所述接头包含糖基-磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区。

实施方案35.根据实施方案32所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体在所述去核干细胞的表面上表达。

实施方案36.根据实施方案32-35所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体经遗传修饰以增加所述一种或多种归巢受体在所述去核干细胞表面上的表达。

实施方案37.根据实施方案32-36所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体对淋巴组织中的一种或多种细胞上表达的一种或多种配体具有特异性。

实施方案38.根据实施方案37所述的方法，其中所述淋巴组织中的所述一种或多种细胞选自内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞或网状细胞或其组合。

实施方案39.根据实施方案32-38所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体包含对两种或更多种不同配体具有特异性的两种或更多种归巢受体。

实施方案40.根据实施方案32-39所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体选自C-X-C趋化因子受体3型(CXCR3)、白细胞唾液酸蛋白(CD43)、CD44抗原(CD44)、C-C趋化因子受体7型(CCR7)、L-选择素(CD62L)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)或极晚期抗原4(VLA4)。

实施方案41.根据实施方案32-40所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体包含L-选择素(CD62L)和C-C趋化因子受体7型(CCR7)。

实施方案42.根据实施方案32-41所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体对在淋巴组织的内皮细胞中表达的配体具有特异性，并且当将病毒抗原施用于对象时，所述病毒抗原有效地激活对象中针对冠状病毒的免疫应答。

实施方案43.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述去核干细胞还包含一种或多种免疫调节剂。

实施方案44.根据实施方案43所述的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂拴系至所述去核干细胞表面。

实施方案45.根据实施方案44所述的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂使用包含糖基-磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区的接头拴系至所述去核干细胞表面。

实施方案46.根据实施方案43-45所述的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂在所述去核干细胞的表面上表达。

实施方案47.根据实施方案43-46所述的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂选自粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、淋巴毒素α(LTA)、淋巴毒素β(LTB)、TNF超家族成员4(TNFSF4)、CD40配体(CD40LG)、fas配体(FASLG)、CD70分子(CD70)、TNF超家族成员8(TNFSF8)、TNF超家族成员9(TNFSF9)、TNF超家族成员10(TNFSF10)、TNF超家族成员11(TNFSF11)、TNF超家族成员12(TNFSF12)、TNF超家族成员13(TNFSF13)、TNF超家族成员13b(TNFSF13B)、TNF超家族成员14(TNFSF14)、TNF超家族成员15(TNFSF15)、TNF超家族18(TNFSF18)、外异蛋白A(ectodysplasin，EDA)、细胞因子和病毒抗原蛋白。

实施方案48.根据实施方案43-47所述的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂是包含白蛋白肽的融合蛋白。

实施方案49.根据实施方案1-48所述的方法，其中所述方法还包括分离所述去核干细胞。

实施方案50.根据实施方案1-48所述的方法，其中所述方法还包括纯化所述去核干细胞。

实施方案51.根据实施方案1-48所述的方法，其中所述去核干细胞是在悬浮液或在细胞培养物或两者中的多个去核干细胞。

实施方案52.根据实施方案1-48所述的方法，其中所述方法还包括将所述去核干细胞低温保存至少48小时。

实施方案53.一种预防对象中由冠状病毒引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用实施方案1-48所述的组合物，从而预防由所述冠状病毒引起的疾病。

实施方案54.一种治疗对象中由冠状病毒引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用实施方案1-48所述的组合物，从而治疗由所述冠状病毒引起的疾病。

实施方案55.根据实施方案53和54所述的方法，其中所述疾病是2019冠状病毒病(COVID-19)。

实施方案56.根据实施方案1-55所述的方法，还包括：(a)接收在4摄氏度的悬浮液中储存至少48小时的去核干细胞，其中所述去核干细胞具有减缓的或停止的生物活性；和(b)从悬浮液中去除所述去核干细胞，从而恢复所述去核干细胞的生物活性。

病毒捕获方法

实施方案1.一种清除对象中的病原体的方法，所述方法包括：

(a)向有需要的对象施用多个基本上不含细胞核的细胞；

(b)通过以下方法隔离对象组织中的病原体：

i.允许在(a)中施用于所述对象的所述多个细胞在体内被所述病原体感染；以及

ii.一旦所述多个细胞被感染，阻止所述病原体繁殖；

iii.通过吞噬作用从所述对象中去除多个细胞，从而从对象中消除病原体。

实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中，对于在(a)中施用所述多个细胞，病原体的数量以剂量依赖性方式减少。

实施方案3.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述多个细胞表达一种或多种免疫调节剂，并且其中所述一种或多种免疫调节剂在所述多个细胞中的细胞的表面处表达，或由所述多个细胞中的细胞分泌。

实施方案4.根据实施方案3所述的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂拴系至所述多个细胞的细胞表面。

实施方案5.根据实施方案4所述的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂使用包含糖基-磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区的接头拴系至所述细胞表面。

实施方案6.其中所述一种或多种免疫调节剂选自粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、淋巴毒素α(LTA)、淋巴毒素β(LTB)、TNF超家族成员4(TNFSF4)、CD40配体(CD40LG)、FAS配体(FASLG)、CD70分子(CD70)、TNF超家族成员8(TNFSF8)、TNF超家族成员9(TNFSF9)、TNF超家族成员10(TNFSF10)、TNF超家族成员11(TNFSF11)、TNF超家族成员12(TNFSF12)、TNF超家族成员13(TNFSF13)、TNF超家族成员13b(TNFSF13B)、TNF超家族成员14(TNFSF14)、TNF超家族成员15(TNFSF15)、TNF超家族18(TNFSF18)、外异蛋白A(ectodysplasin，EDA)、一种或多种细胞因子和病毒抗原蛋白。

实施方案7.根据实施方案6所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自白细胞介素10和白细胞介素12。

实施方案8.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述多个细胞经工程改造以表达一种或多种对靶组织具有特异性的归巢受体，并且其中所述一种或多种归巢受体在所述多个细胞中的细胞的表面处表达，或由所述多个细胞中的细胞分泌。

实施方案9.根据实施方案8所述的方法，其中所述靶组织是肺或淋巴组织。

实施方案10.根据实施方案9所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体靶向淋巴组织中的内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞或网状细胞或其组合。

实施方案11.根据实施方案8-10所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体通过选自化学接头、肽接头或聚合物的接头拴系至所述多个细胞中的细胞的表面。

实施方案12.根据实施方案11所述的方法，其中所述接头包含糖基-磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区。

实施方案13.根据实施方案8-12所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体经遗传修饰以增加所述一种或多种归巢受体在所述多个细胞中的细胞的表面上的表达。

实施方案14.根据实施方案8-13所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体包含对两种或更多种不同靶组织具有特异性的两种或更多种归巢受体。

实施方案15.根据实施方案8-14所述的方法，其中所述一种或多种归巢受体选自C-X-C趋化因子受体3型(CXCR3)、白细胞唾液酸蛋白(CD43)、CD44抗原(CD44)、C-C趋化因子受体7型(CCR7)、L-选择素(CD62L)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)或极晚期抗原4(VLA4)。

实施方案16.根据实施方案1所述的方法，其中所述多个细胞中的细胞包含病毒抗原。

实施方案17.根据实施方案16所述的方法，其中所述病毒抗原在所述多个细胞中的细胞的表面上表达。

实施方案18.根据实施方案16所述的方法，其中所述病毒抗原通过选自化学接头、肽接头或聚合物的接头拴系至所述多个细胞中的细胞的表面。

实施方案19.根据实施方案18所述的方法，其中所述接头包含糖基-磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区。

实施方案20.根据实施方案16-19所述的方法，其中所述病毒抗原是在所述多个细胞中的细胞中表达的跨膜肽。

实施方案21.根据实施方案16-20所述的方法，其中所述病毒抗原对人具有免疫原性。

实施方案22.根据实施方案16-21所述的方法，其中所述病毒抗原是来源于冠状病毒的肽。

实施方案23.根据实施方案22所述的方法，其中所述肽选自刺突蛋白、膜蛋白或源自冠状病毒的核蛋白。

实施方案24.根据实施方案23所述的方法，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)或其变体。

实施方案25.根据实施方案22-24所述的方法，其中所述多个细胞中的细胞包含编码所述肽的mRNA。

实施方案26.根据实施方案25所述的方法，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的mRNA序列。

实施方案27.根据实施方案25所述的方法，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的mRNA序列。

实施方案28.根据实施方案25所述的方法，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的mRNA序列。

实施方案29.根据实施方案25所述的方法，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的mRNA序列。

实施方案30.根据实施方案25所述的方法，其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:1具有至少100％同一性的mRNA序列。

实施方案31.根据实施方案22-25所述的方法，其中所述肽包含与SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

实施方案32.根据实施方案25-31所述的方法，其中所述mRNA的半衰期为3-5天。

实施方案33.根据实施方案25-31所述的方法，其中所述mRNA编码包含白蛋白肽的融合蛋白。

实施方案34.根据实施方案25-31所述的方法，其中所述mRNA编码包含免疫调节剂的融合蛋白。

实施方案35.根据实施方案34所述的方法，其中所述免疫调节剂是对象中免疫应答的激活剂。

实施方案36.根据实施方案34所述的方法，其中所述免疫调节剂是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或细胞因子或其组合。

实施方案37.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述病原体是选自呼吸道病毒、皮肤病毒、食源性病毒、性传播病毒或溶瘤病毒或其组合的活病毒。

实施方案38.根据实施方案37所述的方法，其中所述呼吸道病毒选自鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和冠状病毒。

实施方案39.根据实施方案38所述的方法，其中所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)或其变体。

实施方案40.根据实施方案37所述的方法，其中所述皮肤病毒选自传染性软疣、单纯疱疹病毒1和水痘带状疱疹病毒。

实施方案41.根据实施方案37所述的方法，其中所述食源性病毒选自甲型肝炎病毒、诺如病毒和轮状病毒。

实施方案42.根据实施方案37所述的方法，其中所述性传播病毒选自人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、生殖器疱疹和人免疫缺陷病毒。

实施方案43.根据实施方案37所述的方法，其中所述溶瘤病毒是人乳头瘤病毒或乙型肝炎。

实施方案44.根据任一前述实施方案所述的方法，其中(a)中的施用是腹膜内、肿瘤内、静脉内、淋巴内、肌肉内或吸入。

实施方案45.根据实施方案1所述的方法，其中所述病原体为选自以下的活病毒:

a)双链(ds)DNA病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)；

b)单链(ss)DNA病毒(+链或“正义”)DNA(例如，细小病毒)；

c)dsRNA病毒(例如，呼肠孤病毒)；

d)(+)ssRNA病毒(+单链或正义)RNA(例如，小核糖核酸病毒、披膜病毒)；

e)(-)ssRNA病毒(-单链或反义)RNA(例如，正粘病毒、弹状病毒)；

f)具有生命周期DNA中间体的ssRNA-RT病毒(+链或正义)RNA(例如，逆转录病毒)；或

g)具有生命周期中的RNA中间体的dsDNA-RT病毒DNA(例如，嗜肝DNA病毒)。

实施方案46.根据实施方案1-36所述的方法，其中所述病原体是细菌、病毒、寄生虫、真菌、自身抗体、抗体、毒物、有毒物质或其组合。

实施方案47.根据实施方案1-46所述的方法，还包括：(a)接收在4摄氏度的悬浮液中储存至少48小时的所述多个细胞，其中所述多个细胞具有减慢的或停止的生物活性；以及(b)从所述悬浮液中去除所述多个细胞，从而恢复所述多个细胞的生物活性。

用于病原体捕获的组合物

实施方案1.一种无细胞核的细胞，所述细胞包含：一种或多种细胞内细胞器，所述细胞器用于在不存在细胞核的情况下合成致病性抗原或其病原体抗原结合片段的受体。

实施方案2.根据实施方案1所述的无细胞核的细胞，其中所述一种或多种细胞内细胞器是内质网或高尔基体。

实施方案3.根据实施方案1-2中任一项所述的无细胞核的细胞，其中所述致病性抗原或其病原体抗原结合片段的受体偶联至所述无细胞核的细胞的表面。

实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的无细胞核的细胞，其中所述致病性抗原或其病原体抗原结合片段的受体包含跨膜结构域，所述跨膜结构域将所述致病性抗原或其病原体抗原结合片段的受体偶联至所述无细胞核的细胞的表面。

实施方案5.根据实施方案1-4中任一项所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞还包含免疫调节剂，所述免疫调节剂包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。

实施方案7.根据实施方案6所述的无细胞核的细胞，其中所述直径为约8μm。

实施方案8.根据实施方案1-7中任一项所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞在低温休眠至少24小时后是有活力的。

实施方案9.根据实施方案1-7中任一项所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞在低温保存至少24小时后是有活力的。

实施方案10.根据实施方案1-9中任一项所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞被低温保存、低温休眠或冻干。

实施方案11.根据实施方案1-10中任一项所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞被分离或纯化。

实施方案12.根据实施方案1-11中任一项所述的无细胞核的细胞，其中所述致病性抗原是冠状病毒的抗原。

实施方案13.根据实施方案12所述的无细胞核的细胞，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2。

实施方案14.根据实施方案1-13中任一项所述的无细胞核的细胞，其还包含阻断病原体抗原与其由宿主细胞产生的天然受体之间的结合的中和抗体。

实施方案15.根据实施方案1-14中任一项所述的无细胞核的细胞，其还包含一种或多种免疫调节剂。

实施方案16.根据实施方案15所述的无细胞核的细胞，其中所述一种或多种免疫调节剂使用包含糖基-磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区的接头拴系至所述无细胞核的细胞的表面。

实施方案17.根据实施方案15所述的无细胞核的细胞，其中所述一种或多种免疫调节剂选自粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、淋巴毒素α(LTA)、淋巴毒素β(LTB)、TNF超家族成员4(TNFSF4)、CD40配体(CD40LG)、fas配体(FASLG)、CD70分子(CD70)、TNF超家族成员8(TNFSF8)、TNF超家族成员9(TNFSF9)、TNF超家族成员10(TNFSF10)、TNF超家族成员11(TNFSF11)、TNF超家族成员12(TNFSF12)、TNF超家族成员13(TNFSF13)、TNF超家族成员13b(TNFSF13B)、TNF超家族成员14(TNFSF14)、TNF超家族成员15(TNFSF15)、TNF超家族18(TNFSF18)、外异蛋白A(ectodysplasin，EDA)、一种或多种细胞因子和病毒抗原蛋白。

实施方案18.根据实施方案1-17中任一项所述的无细胞核的细胞，其还包含一种或多种对靶组织具有特异性的归巢受体。

实施方案19.根据实施方案18所述的无细胞核的细胞，其中所述一种或多种归巢受体靶向淋巴组织中的内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞或网状细胞或其组合。

实施方案20.根据实施方案18所述的无细胞核的细胞，其中所述一种或多种归巢受体通过选自化学接头、肽接头或聚合物的接头拴系到所述多个细胞中的细胞的表面。

实施方案21.根据实施方案20所述的无细胞核的细胞，其中所述接头包含糖基-磷脂酰肌醇(GPI)或B7-1抗原(B7-1)胞质尾区。

实施方案22.根据实施方案18-21中任一项所述的无细胞核的细胞，其中所述一种或多种归巢受体选自C-X-C趋化因子受体3型(CXCR3)、白细胞唾液酸蛋白(CD43)、CD44抗原(CD44)、C-C趋化因子受体7型(CCR7)、L-选择素(CD62L)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)或极晚期抗原4(VLA4)。

实施方案23.根据实施方案1-23中任一项所述的无细胞核的细胞，其还包含病毒抗原。

实施方案24.一种药物制剂，其包含：

实施方案1-23中任一项所述的无细胞核的细胞或实施方案1-23中任一项所述的多个无细胞核的细胞；以及

药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

实施方案25.一种减少对象中的由病原体引起的感染的方法，所述方法包括：将实施方案1-23中任一项所述的无细胞核的细胞或实施方案24所述的药物制剂施用于对象，从而在细胞中捕获具有病原体抗原的病原体并阻止病原体在细胞内繁殖。

实施方案26.根据实施方案25所述的方法，其中在施用后14天或更短的时间内从所述对象清除所述病原体。

实施方案27.根据实施方案26-27中任一项所述的方法，其中所述无细胞核的细胞释放中和抗体，从而阻断病原体的病原体抗原与其由宿主细胞产生的天然受体之间的结合。

实施方案28.根据实施方案26-28中任一项所述的方法，其中所述无细胞核的细胞呈递所述病毒抗原，从而使所述对象免受所述病原体的感染。

VII.实施例

所包括的以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。

实施例1.生产用于冠状病毒的抗病毒组合物的方法

用编码减毒冠状病毒抗原的异源核酸进行慢病毒介导的干细胞(例如，间充质干细胞)转染。随后，通过实施例7中描述的方法进行干细胞的去核。使用流式细胞术验证在细胞表面表达减毒冠状病毒抗原的去核干细胞。根据已知方法分离和纯化表达减毒冠状病毒抗原的成功去核的干细胞(在本实施例中称为“细胞质”)。任选地，使用实施例4中提供的方法低温保存细胞质。上述细胞质可用作预防冠状病毒感染的疫苗。

使用与上述类似的方法生产第二种冠状病毒抗病毒组合物，但不是减毒冠状病毒抗原，而是在干细胞中表达一种针对冠状病毒的抗体。或者或另外，使用电穿孔(或本领域已知的类似方法)将针对冠状病毒的小分子装载到去核干细胞中。根据已知方法分离和纯化表达针对冠状病毒的抗病毒抗体和/或针对冠状病毒的小分子(在本实施例中称为“细胞质”)的成功去核的干细胞。任选地，使用实施例4中提供的方法低温保存细胞质。上述细胞质可用于治疗急性冠状病毒感染。

实施例2.预防对象中的冠状病毒感染

将实施例1中描述的表达减毒冠状病毒或冠状病毒蛋白的肽片段的抗病毒组合物配制用于静脉内施用。减毒冠状病毒或冠状病毒蛋白的肽片段可由包封在本文所述细胞质中的mRNA编码。在一些实施方案中，抗病毒组合物被配制用于肌内施用。在一些实施方案中，对象接受第一和第二剂量的抗病毒组合物。在一些实施方案中，第二剂量的抗病毒组合物在施用第一剂量后至少1天、2天、3天、4天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月或4个月施用。将制剂静脉内施用于对象。例如，当对象是儿童时，对人类对象的施用将进行至少5次。在一些实施方案中，当对象为2月龄、4月龄、6月龄、15-18月龄和4-6岁时，将制剂施用于对象。在该实施例中，对象从冠状病毒感染中获得免疫。

实施例3.治疗对象中的急性冠状病毒感染

将实施例1中描述的表达抗冠状病毒抗体(例如，中和抗体)或针对冠状病毒的小分子的抗病毒组合物配制用于静脉内施用。将制剂静脉内施用于感染或怀疑感染冠状病毒的对象。在一些实施方案中，施用进行多于一次。例如，施用可以每天、每两天、每周、每两周、每月、每两个月进行一段时间(例如，1年)。在该实施例中，对象中冠状病毒感染有所降低。

或者或另外，将不含有效载荷的去核干细胞(例如，间充质干细胞)配制用于静脉内施用。将制剂静脉内施用于感染或怀疑感染冠状病毒的对象。在一些实施方案中，施用进行多于一次。例如，施用可以每天、每两天、每周、每两周、每月、每两个月进行一段时间(例如，1年)。在该实施例中，细胞质在体内被冠状病毒感染并被捕获在细胞质中。缺乏细胞核的细胞质缺乏冠状病毒复制和繁殖所需的遗传物质，从而防止冠状病毒进一步感染。在该实施例中，冠状病毒感染有所降低。

实施例4.由哺乳动物细胞生产细胞质

细胞质可以由同种异体或自体供体来源的细胞产生，并且可以用于疾病治疗以及诊断。作为概念证明，确定了各种类型的哺乳动物细胞(例如，间充质干细胞、嗜中性粒细胞、成纤维细胞和自然杀伤细胞)的去核效率和回收率。从细胞培养板中取出哺乳动物细胞后，通过使用不连续的Ficoll梯度进行的密度梯度离心、高速离心将哺乳动物细胞去核。表1总结了使用悬浮方案的去核结果。在hTERT转化的和原代间充质干细胞(MSC)以及成纤维细胞和嗜中性粒细胞中，去核效率和细胞活力最高。表2总结了使用粘附方案的去核结果。间充质干细胞和巨噬细胞的去核效率均大于70％。该实验表明各种类型的哺乳动物细胞可使用本文所述的任何方法进行去核。

表1.使用悬浮方案确定哺乳动物细胞的去核效率和活力。

表2.使用贴壁方案确定哺乳动物细胞的去核效率和活力

接下来，在96小时内确定细胞质的存活。而MSC随时间增殖，细胞质不增殖。相反，活细胞质的相对倍数变化在72小时内保持相当恒定，然后在96小时下降。因此，细胞质存活3-4天。由于大多数基于细胞的治疗不是立即使用的，因此确定了低温保存后细胞质的活力。令人惊奇的是，低温保存后细胞质的活力大于低温保存后MSC的活力。去核后立即铺板的细胞质和从低温保存中回收的细胞质在24小时后显示出相似的相对细胞活力。该实验表明细胞质存活不受低温保存的影响。另外，低温休眠后细胞质的活力与低温休眠后MSC的活力相似(图6A)。低温休眠不同时间长度后回收的细胞质能够在Boyden小室测定中进行诱导迁移，类似于低温休眠后回收的MSC(图6B)。

接下来，在体外建立细胞的大规模生产，随后进行大容量密度梯度离心和去核，这导致产生了治疗性细胞质。在一个实施方案中，治疗性细胞质装载有用于疾病治疗的治疗性载物(例如，mRNA、药物、肽等)。在另一个实施方案中，制备治疗性细胞质以供立即使用(例如，用于静脉内注射(IV)、腹腔内注射(IP)、组织或体外施用)以用于诊断用途。

实施例5.细胞质具有细胞器，与细胞外基质相互作用，发挥细胞生物学功能，并递 送载物

在确定细胞质在低温保存后是否能保持活力后，进行流式细胞术分析以确定MSC来源的细胞质的细胞表面标记谱是否不同于骨髓来源的MSC。MSC来源的细胞质和骨髓来源的MSC都维持了CD45、CD90、CD44、CD146和CD166的细胞表面表达。细胞质附着、重组细胞骨架，在2D和3D培养系统中铺展在基质蛋白上，并形成隧道纳米管，其可以在相同或不同来源的细胞之间转移生物产物。细胞器染色表明高尔基体、ER、F-肌动蛋白细胞骨架、溶酶体、核内体、微管和线粒体在细胞质中保持完整。此外，细胞质显示了体外归巢潜力。细胞质容易在细胞外基质蛋白质上迁移，并(通过化学传感)定向地朝向可溶性趋化因子梯度迁移。值得注意的是，用纯化的mRNA外源性转染的细胞质产生功能性细胞内蛋白，其可以模拟正在开发用于多种临床用途和疾病状态的治疗性mRNA应用。这也证明mRNA翻译和蛋白质合成的机器在无细胞核的细胞质中正常工作，因此可用于生产具有治疗价值的生物活性分子。

用编码已知分泌性蛋白的纯化mRNA外源性转染的细胞质在条件培养基中产生功能性细胞外蛋白，表明ER/高尔基体和分泌途径在无细胞核的细胞质中正常工作。此外，用含有分泌性蛋白的细胞质条件培养基处理巨噬细胞和内皮细胞激活了这些细胞中的关键信号转导反应。这提供了一个概念证明，即细胞质可以用作新的载体来生产和递送具有治疗价值的分泌性蛋白和生物分子。细胞质可以装载各种载物，包括但不限于siRNA、shRNA、mRNA、DNA质粒、肽和化疗剂。

实施例6.工程改造的细胞质可以表达功能性细胞表面蛋白

如通过流式细胞术测定的，表达CXCR4的工程改造的MSC和表达CXCR4的工程改造的MSC来源的细胞质表达相当水平的CXCR4。为了确定工程改造的细胞质是否可以表达功能性细胞表面蛋白，允许表达CXCR4受体的MSC和MSC来源的细胞质朝向不同浓度的SDF-1α迁移。经工程改造以表达功能性CXCR4的MSC来源的细胞质可朝向SDF-1α迁移，且细胞迁移随着SDF-1α浓度的增加而增加。此外，迁移的MSC来源的细胞质的数量大于表达CXCR4的迁移的MSC的数量。

MSC来源的细胞质可以经工程改造以表达已知介导细胞粘附到发炎的脉管系统的功能性细胞粘附蛋白。MSC来源的细胞质可以经工程改造以表达已知调节巨噬细胞相互作用和治疗性细胞的吞噬作用的细胞蛋白。

实施例7-工程改造的细胞质可以在体外和体内发挥作用

不希望受理论束缚，实施例显示可以产生经工程改造以表达“载物”(例如，外源性mRNA分子)的细胞质。图7B和图7C显示MSC来源的细胞质可以经工程改造以在体外和在静脉内注射后的临床前小鼠模型中产生和分泌治疗水平的功能性抗炎细胞因子白细胞介素10(IL-10)。图7B显示用IL-10mRNA转染的细胞质可分泌高水平的IL-10。为了确定分泌的IL-10是否有活性，将血清饥饿的巨噬细胞与来自未处理的MSC、表达IL-10的MSC、未处理的细胞质和表达IL-10的细胞质的条件培养基(CM)一起孵育。在与来自表达IL-10的MSC的CM孵育后和与来自表达IL-10的细胞质的CM孵育后，在巨噬细胞中检测到磷酸化的STAT3，而在与来自未处理的MSC和未处理的细胞质的CM孵育后，在巨噬细胞中没有检测到STAT3活性(图7C)。为了确定细胞质分泌的IL-10是否能在体内检测到，C57Bl/6小鼠经眶后注射表达IL-10的MSC或MSC来源的细胞质。注射后2小时，收集血液并确定IL-10的水平。在用未处理的MSC注射的小鼠血液中检测到很少IL-10或未检测到IL-10(图7D)。如图7D所示，与用未处理的MSC注射的小鼠中的水平相比，在用表达IL-10的MSC来源的细胞质注射的小鼠中检测到更高水平的IL-10。

这些数据说明了基于基因工程改造的细胞质的细胞疗法产生和分泌临床相关的治疗性细胞因子以治疗正常和患病组织的潜力。

为了确定MSC来源的细胞质是否可以通过基底膜侵入，允许MSC或MSC来源的细胞质通过基底膜侵入10％ FBS24小时。如图8A和图8B所示，在10％ FBS的存在下，MSC来源的细胞质恰好与未处理的MSC一样有效地侵入基底膜。值得注意的是，虽然未处理的MSC在不存在化学引诱物的情况下能够侵入基底膜，但MSC处理的细胞质在不存在化学引诱物的情况下能够侵入基底膜要少得多。这些数据说明MSC来源的细胞质可通过基底膜消化和侵入。这些数据说明了基于细胞质的细胞疗法穿透和迁移通过复杂的细胞外基质屏障以将它们的载物递送到组织内的固有潜力。

如图9A和图9B所示，MSC来源的细胞质的平均直径为12μm，而MSC的平均直径为20μm。为了确定MSC来源的细胞质的生物分布，小鼠经眶后注射MSC或MSC来源的细胞质。如图9C和图9D所示，在肝脏中检测到的MSC来源的细胞质比在肝脏中检测到的MSC数量多。这些数据说明了基于细胞质的细胞疗法直接递送到循环系统以治疗多种疾病的潜力。

实施例8.用于产生细胞质的示例性方法

间充质干细胞(MSC)的去核

该方案修改自Methods in Cell Biology第14卷,1976,第87-93页,第7章Enucleation of Mammalian Cells in Suspension(Michael H.Wigler,AlfredI.Neugut,I.Bernard Weinstein)。

50％ Ficoll溶液的制备：在避光的玻璃烧杯中，通过在室温下连续磁力搅拌24小时，将数克的Ficoll(PM400,GE Healthcare 17-0300-500)溶解在等毫升数的超纯水(Invitrogen 10977-015)中。然后将混合物高压蒸汽处理30分钟。一旦混合物冷却，再次搅拌以确保均匀的稠度。在折射计(Reichert 13940000)上测量折射率，并且范围为1.4230-1.4290。将等分试样储存在-20摄氏度。

2X MEM的制备：对于每50ml量，使用10mL 10X MEM(Gibco，11430-030)、2.94mL精确的碳酸氢钠(7.5％，Gibco，25080-094)、1mL 100X Pen-Strep(Gibco 15140-122)和36mL超纯水(Invitrogen 10977-015)。然后将溶液通过0.22μm膜烧瓶(Olympus25-227)过滤并在4摄氏度下储存。

在去核前一天，将MSC以2.5M/15cm板(Olympus 25-203)接种于20mL MSC培养基[MEM 1X(Gibco 12561-056)；16.5％优级FBS(Atlanta Biologics S1150)；1％ HEPES 1M(Gibco 15630-80)；1％Anti-Anti 100X(Gibco 15240-062)；1％Glutamax 100X(Gibco35050-061)]中。接着，将细胞松弛素B(Sigma Aldrich C6762)加入到2X MEM(2μM/mL最终浓度)中。

Ficoll梯度的制备：将2X CytoB以1:1稀释度加入到50％Ficoll等分试样中，使Ficoll原液浓度为25％。接着，用适当体积的1X MEM缓冲液(以1:1稀释度将含有细胞松弛素B的2X MEM加入到超纯水中)稀释25％ Ficoll制备17％、16％、15％、12.5％ Ficoll。将稀释液在CO₂培养箱中平衡至少1小时，用松动的盖子盖住。然后将Ficoll梯度倒入13.2mL超透明管(Beckman，344059)中，并在CO₂培养箱中孵育过夜(6-18小时)。

在去核当天，将12-25M MSC(理想地20M)收集到每个管中用于去核。吸出培养基，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(GIBCO 14190-144)洗涤细胞一次。将5mL的TrypLE-Select(Gibco，12563011)加入到每个板中，并孵育至多5分钟。当90％的细胞分离时，加入5mL全MSC培养基，并将细胞收集到50ml管中(3-4板/管)。然后将试管以1,200rpm离心5分钟。将沉淀重悬于10mL PBS中。将细胞计数、沉淀并用12.5％ Ficoll再悬浮。接着，将细胞-Ficoll混合物逐滴通过40μm细胞过滤器(Falcon 352340)进入新的50mL管中。使用注射器，将3.2mL细胞悬浮液缓慢装载到预制的梯度上。用注射器在最终(顶部)层加入1mL的1X MEM缓冲液。然后将这些管装入转子桶中，平衡，并且在超速离心机(Beckman，L8M)中运行60分钟，26,000rpm，31℃，加速7，减速7。在离心结束时，出现三层：1层靠近12.5％(细胞质和碎片)的顶部，1层靠近12.5/15％界面(细胞质)，以及沉淀位于25％(细胞核)的底部。将高于15％Ficoll溶液的层收集到15ml锥形管中。然后将收集的层用超过4体积的温热无血清MSC培养基(即，3mL的Ficoll并填充至多15mL培养基)稀释。轻轻混合后，将混合物在1,200rpm下沉淀10分钟。用温热的无血清MSC培养基洗涤三次后，根据实验方案将细胞重悬于培养基中，例如，转染培养基vs.迁移培养基vs.无血清培养基vs.完全培养基。通过加入含有1:2000稀释度的

Dyecycle^TM Green(Molecular Probes V35004)或1:5000稀释度的Hoechst 33342的全MSC培养基，在12孔板中测定去核效率。向各孔中加入小体积的各层并使其在培养箱中附着/染色10分钟。通过落射荧光显微技术确定每个群体的阴性细胞质的百分比。

细胞质mRNA转染

用温热的1ml无氨基酸α-MEM完全培养基(ThermoFisher12561056；16.5％优级胎牛血清(FBS)，1％ Glutamax(Gibco 35050061)，1％HEPES(Gibco 15630080))悬浮1M细胞质。用温热的opti-MEM稀释1μg mRNA并用移液器混合至少20次。将4μl lipofectamine-3000(ThermoFisher L300015)加入到46μl温热的opti-MEM(ThermoFisher 31985062)中，并用移液器混合至少20次。mRNA与lipofectamine-3000的比例为1:4(w/v)。用移液器将mRNA和lipofectamine-3000稀释液混合至少20次，并在室温下孵育15分钟。将mRNA和lipofectamine-3000混合物加入到细胞质悬浮液中，充分混合并在37℃孵育30分钟。每5分钟摇动悬浮液以防止细胞聚集。孵育后，将细胞离心，并重悬于标准α-MEM完全培养基(16.5％优级FBS，1％抗生素-抗真菌剂，1％ Glutamax，1％ HEPES)或PBS中。

细胞质siRNA转染

用温热的1ml A/A游离α-MEM完全培养基(16.5％优级FBS，1％Glutamax，1％HEPES)悬浮1M细胞质。用温热的opti-MEM稀释2μl siRNA，并用移液器混合至少20次。将8μl的lipofectamine-3000用92μl温热的opti-MEM稀释并用移液器混合至少20次。siRNA与lipofectamine-3000的比例为1:4(v/v)。用移液器将siRNA和lipofectamine-3000稀释液混合至少20次，并在室温下孵育15分钟。将siRNA和lipofectamine-3000混合物加入到细胞质悬浮液中，充分混合并在37℃孵育20分钟。每5分钟摇动悬浮液以防止细胞聚集。孵育20分钟后，将细胞离心，并用标准α-MEM完全培养基(16.5％优级FBS，1％抗生素-抗真菌剂，1％ Glutamax，1％ HEPES)重悬。

溶瘤病毒感染的细胞质的产生

在去核前一天(通常在去核前18小时)，将2.5*10^6的hTERT-MSC接种在15cm培养皿上。接种大约2小时后，用PBS洗涤细胞一次。然后用8mL无血清opti-MEM以不同MOI(例如，0.05或0.5)的oHSV-GFP(Imanis OV3001)感染细胞。接下来，将细胞在37℃孵育2小时，期间偶尔振荡。然后丢弃病毒接种物。向每个孔中加入20mL预热的完全培养基(α-MEM，16.5％优级FBS，1％抗生素-抗真菌剂，1％ Glutamax，1％ HEPES)。将细胞在37℃下孵育直到去核。图11显示了将多肽(VSV-GFP)直接引入亲本或参比细胞(无细胞核的细胞)以及引入本文所述的去核细胞的荧光图像。图12显示了用编码GFP抗原的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)感染MSC。图12C显示了通过去核的MSC将载物(例如，GFP报道分子)至靶癌细胞的递送增加。图12D显示了免疫细胞(例如，CD8+效应T细胞)与本文所述去核MSC接触的靶癌细胞的募集增加。

细胞质中慢病毒过表达功能蛋白

将靶细胞以1-2×10⁵个细胞/孔的密度铺板于6孔板的一个孔中，或具有0.5-1M的MSC的10cm板中。第二天，将浓缩的重组慢病毒在37℃水浴中解冻，并且一旦解冻后立即从水浴中取出。然后用PBS洗涤细胞3次。加入200μL无血清培养基或2mL无血清培养基(1:1250SureENTRY)。以MOI 10:1在6孔板中感染靶细胞。第二天，去除病毒上清液，向细胞中加入适当的完全生长培养基。培养72小时后，将细胞传代培养到2×100mm培养皿中。加入适量的选择药物(即，嘌呤霉素)用于稳定的细胞系产生。选择后10-15天，挑选克隆进行扩增并筛选阳性克隆。扩增选择的阳性克隆用于去核。如上所述制备工程改造的细胞质。通过常规的生物化学方法或功能测定，例如，荧光激活细胞分选(FACS)、蛋白质印迹或Boyden小室测定来确定细胞质上的靶蛋白表达。

将肽装载到细胞质中

在完全MSC培养基[MEM 1X(Gibco 12561-056)；16.5％优级FBS(AtlantaBiologics S1150)；1％ HEPES 1M(Gibco 15630-80)；1％Anti-Anti 100X(Gibco 15240-062)；1％Glutamax 100X(Gibco35050-061)]中以1x 10⁵/ml/孔铺板于4室载玻片(LabTekII 4室载玻片，155383)。使细胞附着至少1小时或过夜。然后用PBS(Gibco14190-144)漂洗细胞。将Arg9(FAM)(SEQ ID NO:1154)(10mM,Anaspec,As-61207)在完全培养基中稀释至总浓度为1:100(100uM)。然后将细胞质孵育1至2小时，并用PBS冲洗3次。以1:5000稀释度在完全培养基中加入Hoechst 33342(Invitrogen)至少10分钟。然后用PBS洗涤细胞并通过落射荧光显微技术成像。图13显示了目的多肽的肽在与Arg9共孵育时摄取或装载量增加。

实施例9.细胞质在体内表现出更好的生物分布

将MSC培养在3D悬滴(3D MSCs)中，然后去核产生3D细胞质。从Curr Protoc StemCell Biol.2014年2月6日；28:Unit–2B.6.(Thomas J.Bartosh1 and Joni H.Ylostalo)中修改了MSC通过悬滴的3D培养方案。

通过胰蛋白酶从2D培养板中收获健康MSC，并以143万个细胞/ml重悬于新鲜的α-MEM(ThermoFisher 12561056)完全培养基(16.5％优级FBS，1％抗生素-抗真菌剂，1％Glutamax，1％ HEPES)中。将15cm板的盖子完全打开，并向板中加入20ml PBS。使用多道移液器以35μl/液滴(约50,000个细胞/液滴)在板的盖子上制备液滴。每个盖上放置约100-120个液滴。盖上盖子，并将板放回培养箱中。将液滴培养2天，然后通过细胞提升器收获并收集到15ml管中(每管约300个液滴)。将试管以1,200rpm离心5分钟。去除上清液并将管用PBS洗涤两次。然后去除所有PBS，并将7.5ml新鲜解冻的0.25％胰蛋白酶-EDTA(ThermoFisher 25200114)加入到每个管中。将试管在水浴中孵育4分钟。用1ml低残留吸头的移液器轻轻吸取液滴约10-20次，并在水浴中再孵育4分钟。再次用1ml低残留吸头的移液器轻轻吸取液滴约10-20次，直到大多数液滴解离。将7.5ml完全血清培养基(GlutaMAXSupplement(Gibco 35050061)；胎牛血清-Premium Select(Atlanta BiologicalsS11550)；HEPES(1M)(Gibco15630080)；抗生素-抗真菌剂(100X)(Gibco 15240062))加入到每个管中，并将管以1,200rpm离心10分钟。将解离的细胞用10ml完全血清培养基洗涤，并将细胞用5ml完全血清培养基重悬。使细胞通过70μm细胞过滤器，然后用5ml完全血清培养基洗涤过滤器。对细胞进行计数并用预处理的12.5％ Ficoll以大于10M/ml再悬浮。每个去核管使用30-40M细胞。随后，遵循上述去核方案。

将DiD标记的标准2D-培养的MSC(2D MSC)、3D MSC或3D细胞质分别经眶后注射到BalB/C小鼠中。注射后24小时收获指示的组织并通过FACS分析DiD标记的细胞。图10A-10C显示了从3D培养的MSC成功产生3D来源的细胞质，并且还显示了3D来源的细胞质在注射到循环中后比2D培养的细胞具有更少的肺捕获和更好的向周围器官的生物分布。预期这将极大地提高它们定位和递送载物到组织的治疗能力。

实施例10.治疗由An感染引起的疾病的方法

感染SARS-CoV-2的患者开始出现冠状病毒疾病2019(COVID-19)的症状。COVID-19的呼吸症状包括呼吸短促和/或呼吸困难。

向患者施用含有本文所述细胞质的药物制剂，该细胞质表达白细胞介素10(IL-10)激动剂或其足以治疗对象COVID-19呼吸道症状的部分。在该实施例中，细胞质还表达靶向淋巴组织的归巢受体，以使细胞质有效归巢到淋巴系统。细胞质还表达免疫逃避部分，如“不吃我”信号肽，以确保细胞质在到达淋巴系统之前不会被从对象中清除。施用后，对象的呼吸道症状在施用后减少。

实施例11.溶瘤病毒感染的细胞质的产生

在去核前一天(通常在去核前18小时)，将2.5*10^6的hTERT-MSC接种在15cm培养皿上。接种大约2小时后，用PBS洗涤细胞一次。然后用8mL无血清opti-MEM以不同MOI(例如，0.05或0.5)的oHSV-GFP(Imanis OV3001)感染细胞。接下来，将细胞在37℃孵育2小时，期间偶尔振荡。然后丢弃病毒接种物。向每个孔中加入20mL预热的完全培养基(α-MEM，16.5％优级FBS，1％抗生素-抗真菌剂，1％ Glutamax，1％ HEPES)。将细胞在37℃下孵育直到去核。图11A-11B显示了将多肽(VSV-GFP)直接引入亲本或参比细胞(无细胞核的细胞)以及引入本文所述的去核细胞的荧光图像。感染后12小时以MOI 0.05用VSV-GFP(箭头)感染的有核的亲本MSC(顶部)和MSC来源的无细胞核的细胞(底部)的落射荧光显微镜图像显示了报告肽GFP被引入MSC。GFP抗原被无细胞核的MSC清楚且强有力地表达，表明在去核细胞中的病毒复制和抗原产生。比例尺＝50μm。图11B显示了感染后12小时，以MOI 0.1用VSV-GFP(三角箭头)感染的MSC来源的无细胞核的细胞的高倍放大落射荧光图像。还使用若丹明鬼笔环肽(箭头)和细胞核染色DAPI对去核细胞进行F-肌动蛋白丝染色以说明缺乏细胞核。图11显示了细胞质可以经工程改造并用溶瘤病毒转染以表达外源性肽如抗原性肽。图11还显示了细胞质可被病毒感染用于病毒捕获目的。

实施例12.对细胞质接触的靶细胞的免疫应答的募集和激活

在去核前一天(通常在去核前18小时)，将2.5*10^6的hTERT-MSC接种在15cm培养皿上。接种大约2小时后，用PBS洗涤细胞一次。然后用8mL无血清opti-MEM以不同MOI(例如，0.05或0.5)的oHSV-GFP(Imanis OV3001)感染细胞。接下来，将细胞在37℃孵育2小时，期间偶尔振荡。然后丢弃病毒接种物。向每个孔中加入20mL预热的完全培养基(α-MEM，16.5％优级FBS，1％抗生素-抗真菌剂，1％ Glutamax，1％ HEPES)。将细胞在37℃下孵育直到去核。图12A-12BD显示了用编码GFP抗原的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)感染MSC。MSC和无细胞核的MSC的落射荧光显微图像显示了在感染后48小时以MOI 0.05用编码GFP抗原的oHSV感染。用oHSV-GFP接种后18小时，从MSC产生无细胞核的MSC。比例尺＝50μm。图12B显示了以0.05MOI用编码GFP的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV-GFP)感染后的表达lifeact-RFP的MSC或无细胞核的MSC，然后将其注射到生长在裸鼠中的已建立的U87成胶质细胞瘤肿瘤中。注射后7天拍摄图像。如强GFP信号所示，MSC和无细胞核的MSC都将oHSV递送至肿瘤细胞。值得注意的是，7天后在肿瘤中可以检测到非常少的无细胞核的MSC，而大量MSC存在于生长的肿瘤的中心(注射部位)和外缘。图12C是示出了GFP覆盖的肿瘤面积的百分比的条形图，其表示被携带oHSV-GFP病毒的MSC或无细胞核的MSC感染的肿瘤细胞的部分。图12D是示出了与PBS注射对照相比的用IL-12(佐剂)工程改造的无细胞核的MSC和oHSV工程改造的无细胞核的MSC的组合处理的已建立的成胶质细胞瘤肿瘤中存在的CD8+效应T细胞的比例增加的图。图12显示了本文所述的细胞质可以通过将免疫细胞募集到工程改造的细胞质的位点而诱导足够的免疫应答。在这种情况下，细胞质和由细胞质包封的任何载物(例如，在细胞质内捕获的病毒)将受到所招募的免疫应答的破坏。

实施例13.将肽装载到细胞质中

在完全MSC培养基[MEM 1X(Gibco 12561-056)；16.5％优级FBS(AtlantaBiologics S1150)；1％ HEPES 1M(Gibco 15630-80)；1％Anti-Anti 100X(Gibco 15240-062)；1％Glutamax 100X(Gibco35050-061)]中以每孔1x 10⁵/ml铺板于4室载玻片(LabTekII 4室载玻片，155383)。使细胞附着至少1小时或过夜。然后用PBS(Gibco14190-144)漂洗细胞。将Arg9(FAM)(SEQ ID NO:1154)(10mM,Anaspec,As-61207)在完全培养基中稀释至总浓度为1:100(100uM)。然后将细胞质孵育1至2小时，并用PBS冲洗3次。以1:5000稀释度在完全培养基中加入Hoechst 33342(Invitrogen)至少10分钟。然后用PBS洗涤细胞并通过落射荧光显微技术成像。图13A-13B显示了目的多肽的肽在与Arg9共孵育时摄取或装载量增加。如图13A所示，MSC(左)和去核的MSC(右)显示了与100μM的细胞可渗透抗原肽(Arg)9-FAM(6-羧基荧光素，FAM-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH)孵育的MSC。比例尺＝50μm。箭头指示Hoechst染色的细胞核，三角箭头指示阳性(Arg)9-FAM。图13B示出了表示在ImageJ中测量的相对荧光强度的条形图。校正的总细胞荧光＝积分密度-(所选细胞的面积×背景读数的平均荧光)。平均值±SEM；n＝10。总之，图13显示了本文所述的细胞质(例如，无细胞核的MSC)可直接装载有目标多肽。例如，可通过将抗原和Arg9(FAM)与细胞质共孵育而将抗原引入细胞质。然后这些细胞质可以作为本文所述的疫苗。[000516]虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域的技术人员显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员现将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。以下权利要求书旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。

Claims (60)

1.一种无细胞核的细胞，所述无细胞核的细胞包含：一种或多种细胞内细胞器，所述细胞器用于在不存在所述细胞核的情况下合成或分泌抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的疫苗。

2.根据权利要求1所述的无细胞核的细胞，其中所述一种或多种细胞内细胞器是内质网或高尔基体。

3.根据权利要求1所述的无细胞核的细胞，其中所述疫苗偶联至所述无细胞核的细胞的表面。

4.根据权利要求3所述的无细胞核的细胞，其中所述疫苗包含将所述疫苗偶联至所述无细胞核的细胞表面的跨膜结构域。

5.根据权利要求1所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞还包含含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的免疫调节剂。

6.根据权利要求1所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞还包含归巢受体，所述归巢受体包含：

(a)白细胞唾液酸蛋白；

(b)L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1；

(c)极晚期抗原4；

(d)(a)至(c)中任一项的一部分；或

(e)(a)至(d)的任何组合。

7.根据权利要求1所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。

8.根据权利要求7所述的无细胞核的细胞，其中所述直径为约8μm。

9.根据权利要求1所述的无细胞核的细胞，其中当活力通过以下方法测量时，所述无细胞核的细胞在低温休眠至少24小时后是有活力的：

(a)离心悬浮液中的多个所述无细胞核的细胞的等分试样以产生细胞沉淀；

(b)将所述细胞沉淀再悬浮于无血清培养基中以产生无血清细胞悬浮液；

(c)将1份台盼蓝染料和1份所述无血清细胞悬浮液混合；以及

(d)在(c)的3-5分钟内对所述多个无细胞核的细胞进行计数，其中所述多个无细胞核的细胞中的至少一些未被台盼蓝染料染色，这指示活力。

10.根据权利要求1所述的无细胞核的细胞，其中当活力通过以下方法测量时，所述无细胞核的细胞在低温保存至少24小时后是有活力的：

(a)离心悬浮液中的多个所述无细胞核的细胞的等分试样以产生细胞沉淀；

(b)将所述细胞沉淀再悬浮于无血清培养基中以产生无血清细胞悬浮液；

(c)将1份台盼蓝染料和1份无血清细胞悬浮液混合；以及

(d)在(c)的3-5分钟内对所述多个无细胞核的细胞进行计数，其中所述多个无细胞核的细胞中的至少一些未被台盼蓝染料染色，这指示活力。

11.根据权利要求1所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞被低温保存、低温休眠或冻干。

12.根据权利要求1所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞被分离或纯化。

13.一种药物制剂，其包含：

(a)权利要求1所述的无细胞核的细胞或多个权利要求1所述的无细胞核的细胞；以及

(b)药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

14.一种生产疫苗的方法，所述方法包括：

(a)从细胞中去除细胞核以产生包含一种或多种细胞内细胞器的去核细胞，所述细胞器用于合成或分泌抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的疫苗；以及

(b)将编码所述疫苗的外源性mRNA引入所述去核细胞，其中所述去核细胞在不存在所述细胞核的情况下表达所述疫苗。

15.根据权利要求14所述的方法，其中将所述去核细胞储存在4℃或低于4℃以可逆地减慢或停止去核细胞的生物活性，并且随后在(b)中引入之前解冻。

16.根据权利要求14所述的方法，其中将所述无细胞核的细胞冻干，并且随后在(b)中引入之前进行再水合。

17.根据权利要求14所述的方法，其中将所述去核细胞储存在-120℃或低于-120℃以可逆地减慢或停止去核细胞的生物活性，并且随后在(b)中引入之前解冻。

18.根据权利要求14所述的方法，其中(a)中从所述细胞中去除细胞核是在不分化所述细胞的情况下进行的。

19.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种细胞内细胞器是内质网或高尔基体。

20.根据权利要求14所述的方法，其中所述无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述直径为约8μm。

22.根据权利要求14所述的方法，还包括在(a)中去除所述细胞核之前，向所述细胞中引入具有编码免疫调节剂的核酸序列的外源性核酸分子，所述免疫调节剂包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

23.根据权利要求14所述的方法，还包括在(a)中去除所述细胞核之前向所述细胞中引入具有编码归巢受体的核酸序列的外源性核酸分子，所述归巢受体包含：

a)白细胞唾液酸蛋白；

b)L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1；

c)极晚期抗原4；

d)C-X-C趋化因子受体3型；

e)CD44抗原；

f)C-C趋化因子受体7型；

g)(a)至(f)中任一项的一部分；或

h)(a)至(g)的任何组合。

24.根据权利要求14所述的方法，还包括向所述无细胞核的细胞中引入包含编码免疫调节剂的序列的外源性mRNA分子，所述免疫调节剂包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

25.根据权利要求14所述的方法，还包括向所述无细胞核的细胞中引入包含编码归巢受体的序列的外源性mRNA分子，所述归巢受体包含：

(a)白细胞唾液酸蛋白；

(b)L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1；

(c)极晚期抗原4；

(d)C-X-C趋化因子受体3型；

(e)CD44抗原；

(f)C-C趋化因子受体7型；

(g)(a)至(f)中任一项的一部分；或

(h)(a)至(g)的任何组合。

26.一种向对象递送抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的疫苗的方法，所述方法包括：向所述对象施用包含一种或多种细胞内细胞器的无细胞核的细胞，所述细胞器用于在不存在所述细胞核的情况下合成或分泌抗SARS-CoV-2的疫苗。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种细胞内细胞器是内质网或高尔基体。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述无细胞核的细胞还包含含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的免疫调节剂。

29.根据权利要求26所述的方法，其中所述无细胞核的细胞还包含归巢受体，所述归巢受体包含：

(a)白细胞唾液酸蛋白；

(b)L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1；

(c)极晚期抗原4；

(d)(a)至(c)中任一项的一部分；或

(e)(a)至(d)的任何组合。

30.根据权利要求26所述的方法，其中所述无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述直径为约8μm。

32.根据权利要求26所述的方法，其中施用包括全身施用。

33.根据权利要求26所述的方法，其中所述无细胞核的细胞以约10³个细胞/kg体重至约10¹²个细胞/kg体重的剂量施用。

34.根据权利要求26所述的方法，其中在至少1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、1天、2天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年或4年内向所述对象施用所述无细胞核的细胞两次。

35.根据权利要求26所述的方法，其中所述对象是人。

36.根据权利要求26所述的方法，还包括施用佐剂。

37.一种试剂盒，其包含：

(a)多个基本上不含细胞核的细胞，其中所述多个基本上不含细胞核的细胞中至少一个无细胞核的细胞包含一种或多种细胞内细胞器，所述细胞器用于在不存在细胞核的情况下合成或分泌抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的疫苗；以及

(b)说明书，用于将所述多个基本上不含细胞核的细胞施用于对象。

38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述多个基本上不含细胞核的细胞被低温保存、低温休眠或冻干。

39.根据权利要求38所述的试剂盒，还包含说明书，用于在将所述多个基本上不含细胞核的细胞施用于所述对象之前恢复所述多个基本上不含细胞核的细胞的生物活性。

40.根据权利要求37所述的试剂盒，还包含说明书，用于将编码所述疫苗的外源性mRNA引入去核细胞。

41.一种无细胞核的细胞，所述无细胞核的细胞包含一种或多种细胞内细胞器，所述细胞器用于在不存在所述细胞核的情况下合成病原体抗原或其病原体抗原结合片段的受体，其中所述受体或所述受体的表达水平对于所述无细胞核的细胞是外源性的。

42.根据权利要求41所述的无细胞核的细胞，其中所述一种或多种细胞内细胞器是内质网或高尔基体。

43.根据权利要求41所述的无细胞核的细胞，其中所述病原体抗原或其病原体抗原结合片段的受体偶联至所述无细胞核的细胞的表面。

44.根据权利要求41所述的无细胞核的细胞，其中所述病原体抗原或其病原体抗原结合片段的受体在所述无细胞核的细胞的细胞膜内包含跨膜结构域。

45.根据权利要求41所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞还包含具有编码免疫调节剂或其部分的序列的外源性mRNA分子，所述免疫调节剂包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

46.根据权利要求41所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞的直径为约1微米(μm)至100μm。

47.根据权利要求46所述的无细胞核的细胞，其中所述直径为约8μm。

48.根据权利要求41所述的无细胞核的细胞，其中当活力通过以下方法测量时，所述无细胞核的细胞在低温休眠或低温保存至少24小时后是有活力的：

(a)离心悬浮液中的多个所述无细胞核的细胞的等分试样以产生细胞沉淀；

(b)将所述细胞沉淀再悬浮于无血清培养基中以产生无血清细胞悬浮液；

(c)将1份台盼蓝染料和1份无血清细胞悬浮液混合；

(d)在(c)的3-5分钟内对所述多个无细胞核的细胞进行计数，其中所述多个无细胞核的细胞中的至少一些未被台盼蓝染料染色，这指示活力。

49.根据权利要求41所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞被低温保存、低温休眠或冻干。

50.根据权利要求41所述的无细胞核的细胞，其中所述无细胞核的细胞被分离或纯化。

51.根据权利要求41所述的无细胞核的细胞，还包含阻断所述病原体抗原与其由宿主细胞产生的天然受体之间的结合的中和抗体。

52.根据权利要求51所述的无细胞核的细胞，其中所述中和抗体由所述无细胞核的细胞的一种或多种细胞内细胞器合成。

53.根据权利要求41所述的无细胞核的细胞，还包含归巢受体，所述归巢受体包含：

(a)白细胞唾液酸蛋白；

(b)L-选择素、淋巴细胞功能相关抗原1；

(c)极晚期抗原4；

(d)C-X-C趋化因子受体3型；

(e)CD44抗原；

(f)C-C趋化因子受体7型；

(g)(a)至(f)中任一项的一部分；或

(h)(a)至(g)的任何组合。

54.一种药物制剂，其包含：

(a)权利要求41-53所述的无细胞核的细胞或多个权利要求41-53所述的无细胞核的细胞；以及

(b)药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

55.一种减少对象中由病原体或感染对象过程中的病原体引起的感染的方法，所述方法包括：将权利要求1-53所述的无细胞核的细胞或权利要求54所述的药物制剂施用于对象，从而在所述细胞中捕获具有所述病原体抗原的病原体并阻止所述病原体在所述细胞内繁殖。

56.根据权利要求55所述的方法，其中在施用后少于或等于约14天所述病原体从所述对象中清除。

57.根据权利要求55所述的方法，其中所述无细胞核的细胞释放中和抗体或纳米抗体，从而阻断所述病原体的病原体抗原与其由宿主细胞产生的天然受体之间的结合。

58.根据权利要求55所述的方法，其中施用包括全身施用。

59.根据权利要求55所述的方法，其中所述无细胞核的细胞以约10³个细胞/kg体重至约10¹²个细胞/kg体重的剂量施用。

60.根据权利要求55所述的方法，其中在至少1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、1天、2天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年或4年内向所述对象施用所述无细胞核的细胞两次。

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