WO2022244801A1

WO2022244801A1 - Ｈｔｌｖ－１核酸脂質粒子ワクチン

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Publication number: WO2022244801A1
Application number: PCT/JP2022/020646
Authority: WO
Inventors: 健石井; 卓也福島; 勇悦田中; 文彦武下; 誠小泉; 貴子丹羽; 晶子野草; 直城内; 宜郷小野寺
Original assignee: 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所; 国立大学法人琉球大学; 第一三共株式会社
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2022-05-18
Publication date: 2022-11-24
Also published as: CN117320746A; JPWO2022244801A1; EP4342491A1; TW202313102A; KR20240009944A

Abstract

ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ　Ｔ－ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１：ＨＴＬＶ－１）による感染を予防及び/又は治療するためのワクチンの提供。　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原を発現させることができる核酸を封入した脂質粒子であって、脂質が一般式（Ｉａ）で表されるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩を含む前記粒子。式中、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル基を示し；Ｌ^１は、Ｃ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１７－Ｃ_１９アルケニル基を示し；Ｌ^２は、Ｃ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルキル基、又はＣ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルケニル基を示し；ｐは、３、又は４である。

Description

ＨＴＬＶ－１核酸脂質粒子ワクチン

　本発明は、ＨＴＬＶ－１　ｍＲＮＡを封入した核酸脂質粒子ワクチンに関する。

　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１（ＨＴＬＶ－１）は、がん原性が高いレトロウイルスである。世界中に１０００万人～２０００万人のＨＴＬＶ－１感染者が存在し、日本でも１００万人の感染者が存在する（非特許文献１）。ＨＴＬＶ－１感染者の３～５％は成人Ｔ細胞白血病（Ａｄｕｌｔ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＴＬ）を発症し、予後が悪い。現時点で、ＨＴＬＶ－１感染の予防ワクチン及びＡＴＬ発症予防薬は存在しない。また、ＡＴＬの満足な治療効果に寄与する標準治療も確立されていない。例えば、標準治療の一つである多剤併用の化学療法は、長期生存者が１０％未満である。

　近年、ＡＴＬ患者に対して同種造血幹細胞移植が行われるようになり、一部の患者では高い治療効果が得られるようになった。同種造血幹細胞移植の抗腫瘍効果は、大量の抗がん剤や全身への放射線照射を用いた移植前処置の効果に加え、移植後にドナーの免疫担当細胞による抗腫瘍効果（ｇｒａｆｔ　ｖｅｒｓｕｓ　ｌｅｕｋｅｍｉａ効果；ＧＶＬ効果）の寄与が考えられる（非特許文献２）。特に、ＨＴＬＶ－１複製に必須な転写活性化因子Ｔａｘに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）が増加することが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、同種造血幹細胞移植の副反応である移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ　ｖｅｒｓｕｓ　ｈｏｓｔ　ｄｉｓｅａｓｅ；ＧＶＨＤ）による死亡率が高い。

　ＴａｘはＮＦ－ｋＢの活性化能を有し、ＨＴＬＶ－１複製に必須なタンパク質である（非特許文献４）。また、Ｔａｘを介した過剰なＮＦ－ｋＢ活性化は、ＨＴＬＶ－１感染細胞やＡＴＬ細胞にも認められており、ＴａｘのＮＦ－ｋＢ活性化と感染細胞のがん化が相関することが明らかにされている（非特許文献５、非特許文献６）。また、非特許文献７では、ＴａｘのＮＦ－ｋＢ活性化に重要なアミノ酸が同定されており、それらアミノ酸に点変異を挿入したＴａｘ変異体を用いて、ＴａｘによるＮＦ－ｋＢ活性化の作用機序が解析されている（非特許文献８、非特許文献９）。しかしながら、ＴａｘやＴａｘ変異体を用いたＨＴＬＶ－１を予防し、又は治療する効果的なワクチンの例はない。

　ヒト末梢血単核細胞（ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ；ｈＰＢＭＣｓ）を移植した免疫不全マウスを用いたＨＴＬＶ－１感染実験の結果から、ＨＴＬＶ－１感染はＨＴＬＶ－１のエンベロープタンパク質であるｇｐ４６を標的とする抗ｇｐ４６抗体によって中和されることが明らかとなっている（非特許文献１０）。また、ラットを用いた垂直感染モデルにおいて、中和活性を有する抗ｇｐ４６抗体が垂直感染を予防する可能性も示唆されている。しかしながら、ｇｐ４６を用いたＨＴＬＶ－１を予防し、又は治療する効果的なワクチンの例はない。

　抗原をコードするｍＲＮＡを脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ　ｎａｎｏ－ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＬＮＰ）に封入したＬＮＰ製剤（ＬＮＰ－ｍＲＮＡ）としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（非特許文献１１）、または、インフルエンザワクチン（特許文献１）が知られている。

国際公開第２０１５／１６４６７４号パンフレット

Ｆｒｏｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　（２０１２）　３：　３８８．Ｂｌｏｏｄ　（２０１２）　１１９　（１０）：　２４０９－２４１６．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（２０１０）　７０（１５）：　６１８１－６１９２．Ｌａｎｃｅｔ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ　（２００７）　７：　２６６－２８１．Ｆｒｏｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　（２０１２）　３：　４０６．Ｖｉｒｕｓｅｓ　（２０１１）　３（６）：　７１４－７４９．Ｇｅｎｅ　Ｄｅｖ．　（１９９０）　４：　１８７５．Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　（２０１１）　１５０（６）：　６７９－６８６．Ｊ．　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　（２００６）　２８１（１９）：　１３０７５－１３０８２．Ｖｉｒｕｓｅｓ　（２０１６）　８（２）：　４１．Ｓｃｉｅｎｃｅ　（２０２１）　３７１：　１１５２．

　本発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ　Ｔ－ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１：ＨＴＬＶ－１）による感染を予防及び/又は治療するためのワクチンを提供することを目的とする。

　本発明者らは、ＨＴＬＶ－１　ｍＲＮＡを封入した核酸脂質粒子（ＬＮＰ－ｍＲＮＡ）が、成人Ｔ細胞白血病に対する治療及び発症予防に適用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。具体的には、ＨＴＬＶ－１　Ｔａｘ及びｇｐ４６を発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ－ｍＲＮＡ－ＨＴＬＶ－１を作製し、また、ＬＮＰ－ｍＲＮＡ－ＨＴＬＶ－１を投与したマウス及びサルにおいて、ＨＴＬＶ－１　Ｔａｘ及びｇｐ４６に対する抗体産生及びＣＴＬ、並びにＨＴＬＶ－１感染細胞の増殖を阻害する中和活性が誘導されることを見出した。

　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原を発現させることができる核酸を封入した脂質粒子であって、脂質が一般式（Ｉａ）で表されるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩を含む前記粒子。

式中、
Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル基を示し；
Ｌ^１は、Ｃ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１７－Ｃ_１９アルケニル基を示し；
Ｌ^２は、Ｃ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルキル基、又はＣ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルケニル基を示し；
ｐは、３、又は４である。
（２）一般式（Ｉａ）中のＲ^１及びＲ^２が、共にメチル基である、（１）に記載の粒子。
（３）一般式（Ｉａ）中のｐが、３である（１）又は（２）に記載の粒子。
（４）一般式（Ｉａ）中のＬ^１が、アセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１７－Ｃ_１９アルケニル基である、（１）～（３）のいずれかに記載の粒子。
（５）一般式（Ｉａ）中のＬ^２が、アセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１２アルキル基、又はアセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルケニル基である、（１）～（４）のいずれかに記載の粒子。
（６）一般式（Ｉａ）中のＬ^２が、アセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１２アルキル基、又はアセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１７－Ｃ_１９アルケニル基である、（１）～（４）のいずれかに記載の粒子。
（７）一般式（Ｉａ）中のＬ^１が、（Ｒ）－１１－アセチルオキシ－ｃｉｓ－８－ヘプタデセニル基、ｃｉｓ－８－ヘプタデセニル基、又は（８Ｚ，１１Ｚ）－ヘプタデカジエニル基である（１）～（６）のいずれかに記載の粒子。
（８）一般式（Ｉａ）中のＬ^２が、デシル基、ｃｉｓ－７－デセニル基、ドデシル基、又は（Ｒ）－１１－アセチルオキシ－ｃｉｓ－８－ヘプタデセニル基である、（１）～（７）のいずれかに記載の粒子。
（９）カチオン性脂質が下記の構造式：

で表される（１）に記載の粒子。
（１０）カチオン性脂質が下記の構造式：

で表される（１）に記載の粒子。
（１１）カチオン性脂質が下記の構造式：

で表される（１）に記載の粒子。
（１２）脂質が、さらに、両親媒性脂質、ステロール類及びＰＥＧ脂質を含む（９）又は（１０）に記載の粒子。
（１３）脂質が、さらに、両親媒性脂質、ステロール類及びＰＥＧ脂質を含む（１１）に記載の粒子。
（１４）両親媒性脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも１つである（１２）に記載の粒子。
（１５）両親媒性脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも１つである（１３）に記載の粒子。
（１６）ステロール類がコレステロールである（１２）又は（１４）に記載の粒子。
（１７）ステロール類がコレステロールである（１３）又は（１５）に記載の粒子。
（１８）ＰＥＧ脂質が、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコール及び／又はＮ－［メトキシ　ポリ（エチレングリコール）２０００］カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミンである（１２）、（１４）、（１６）のいずれかに記載の粒子。
（１９）ＰＥＧ脂質が、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコール及び／又はＮ－［メトキシ　ポリ（エチレングリコール）２０００］カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミンである（１３）、（１５）、（１７）のいずれかに記載の粒子。
（２０）両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が５～２５％、ステロール類が１０～５５％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～５％である（１２）～（１９）のいずれかに記載の粒子。
（２１）両親媒性脂質が１０～２５％である（２０）に記載の粒子。
（２２）両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が５～１５％、ステロール類が３５～５０％、カチオン性脂質が４０～５５％、ＰＥＧ脂質が１～３％である（１２）、（１４）、（１６）、（１８）のいずれかに記載の粒子。
（２３）両親媒性脂質が１０～１５％、ステロール類が３５～４５％、カチオン性脂質が４０～５０％、ＰＥＧ脂質が１～２．５％である（２２）に記載の粒子。
（２４）ＰＥＧ脂質が１～２％である（２３）に記載の粒子。
（２５）両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が１０～２５％、ステロール類が１０～５０％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～３％である（１３）、（１５）、（１７）、（１９）のいずれかに記載の粒子。
（２６）ステロール類が１０～４５％、カチオン性脂質が４２．５～６５％、ＰＥＧ脂質が１～２．５％である（２５）に記載の粒子。
（２７）ＰＥＧ脂質が１～２％である（２６）に記載の粒子。
（２８）核酸重量に対する総脂質重量の比率が１５～３０である（２０）～（２７）のいずれかに記載の粒子。
（２９）核酸重量に対する総脂質重量の比率が１５～２５である（２８）に記載の粒子。
（３０）核酸重量に対する総脂質重量の比率が１７．５～２２．５である（２９）に記載の粒子。

（３１）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原がオリゴマー化ドメインとの融合タンパク質である（１）～（３０）のいずれかに記載の粒子。
（３２）オリゴマー化ドメインがフィブリチンである（３１）に記載の粒子。
（３３）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原が配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる（３１）又は（３２）に記載の粒子。
（３４）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のＴａｘ抗原が、配列番号１１のアミノ酸配列に対して、Ｔ１３０Ａ、Ｌ１３１Ｓ、Ｌ３１９Ｒ及びＬ３２０Ｓからなる群から選択される変異の少なくとも１つを有し、該変異アミノ酸以外のアミノ酸配列を比較した場合、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる（１）～（３３）のいずれかに記載の粒子。
（３５）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のＴａｘ抗原が、配列番号１１のアミノ酸配列に対して、Ｔ１３０Ａ、Ｌ１３１Ｓ、Ｌ３１９Ｒ及びＬ３２０Ｓの変異を有し、該変異アミノ酸以外のアミノ酸配列を比較した場合、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる（３４）に記載の粒子。
（３６）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のＴａｘ抗原が、シグナルペプチドとの融合タンパク質である（１）～（３５）のいずれかに記載の粒子。
（３７）シグナルペプチドが配列番号１３のアミノ酸配列の１番目～１８番目のアミノ酸配列からなるペプチドである（３６）に記載の粒子。
（３８）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原を発現させることができる核酸が、キャップ構造（Ｃａｐ）、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原の翻訳領域、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）及びポリＡ尾部（ｐｏｌｙＡ）を含むｍＲＮＡである（３１）～（３７）のいずれかに記載の粒子。
（３９）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原を発現させることができる核酸の配列が、配列番号１７又は１８の配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる（３８）に記載の粒子。
（４０）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のＴａｘ抗原を発現させることができる核酸の配列が、配列番号２０の配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる（３８）に記載の粒子。

（４１）核酸が少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む（１）～（４０）のいずれかに記載の粒子。
（４２）修飾ヌクレオチドが、５位が置換したピリミジンヌクレオチド及び／又は１位が置換していてもよいシュードウリジンの少なくとも１個を含む（４１）に記載の粒子。
（４３）修飾ヌクレオチドが、５－メチルシチジン、５－メトキシウリジン、５－メチルウリジン、シュードウリジン、及び１－アルキルシュードウリジンからなる群から選ばれる少なくとも１個を含む（４１）に記載の粒子。
（４４）修飾ヌクレオチドが、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、及び１－メチルシュードウリジンからなる群から選ばれる少なくとも１個を含む（４１）に記載の粒子。
（４５）平均粒子径が３０～３００ｎｍである（１）～（４４）のいずれかに記載の粒子。

（４６）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）による感染を予防及び／又は治療するための組成物を製造するための（１）～（４５）のいずれかに記載の粒子の使用。
（４７）（１）～（４５）のいずれかに記載の粒子を含有する、組成物。
（４８）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原をｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで発現させるための（４７）に記載の組成物。
（４９）医薬として用いられる（４７）又は（４８）に記載の組成物。
（５０）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）に対する免疫反応を誘導するための（４９）に記載の組成物。
（５１）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）感染を予防及び／又は治療するための（４９）又は（５０）に記載の組成物。
（５２）ＨＴＬＶ－１感染者に対して、成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）及びＨＴＬＶ－１ぶどう膜炎（ＨＵ）からなる群から選択されるＨＴＬＶ－１に起因する疾患の発症の予防及び／又は治療するための（４９）又は（５０）の組成物。
（５３）（４７）～（５０）のいずれかに記載の組成物を細胞に導入することを含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原をｉｎ　ｖｉｔｒｏで発現させる方法。
（５４）（４７）～（５１）のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原をｉｎ　ｖｉｖｏで発現させる方法。
（５５）（４９）又は（５０）に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）に対する免疫反応を誘導する方法。
（５６）（４９）～（５２）のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）感染を予防及び／又は治療する方法。
（５７）　（４９）～（５２）のいずれかの組成物を哺乳動物に投与することを含む、成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）及びＨＴＬＶ－１ぶどう膜炎（ＨＵ）からなる群から選択されるＨＴＬＶ－１に起因する疾患の発症を予防及び／又は治療する方法。
（５８）　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のＴａｘ抗原であって、発がん性を低減又は消失させるような変異を有するＴａｘ抗原とシグナルペプチドを融合させたペプチド。
（５９）　Ｔａｘ抗原が、配列番号１１のアミノ酸配列に対して、Ｔ１３０Ａ、Ｌ１３１Ｓ、Ｌ３１９Ｒ及びＬ３２０Ｓからなる群から選択される変異の少なくとも１つを有し、該変異アミノ酸以外のアミノ酸配列を比較した場合、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる（５８）のペプチド。
（６０）　シグナルペプチドが配列番号１３のアミノ酸配列の１番目～１８番目のアミノ酸配列からなるペプチドである（５８）又は（５９）のペプチド。
（６１）　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原を発現させることができる核酸が、キャップ構造（Ｃａｐ）、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原の翻訳領域及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）からなる構成を含むｍＲＮＡである（３１）～（３７）のいずれかに記載の粒子。
（６２）　キャップ構造（Ｃａｐ）、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原の翻訳領域及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）からなる構成が、配列番号１７の１番目から１１４１番目の配列又は配列番号１８の１番目から１２２２番目の配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列である（６１）に記載の粒子。
（６３）　キャップ構造（Ｃａｐ）、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原の翻訳領域及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）からなる構成が、配列番号２０の１番目から１３１５番目の配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列である（６１）に記載の粒子。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-084942号の開示内容を包含する。

　本発明により、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）による感染を予防及び／又は治療することが可能となる。また、本発明によりＨＴＬＶ－１による感染に起因する疾患を予防及び／又は治療することが可能となる。また、本発明の粒子は、代謝安定性、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性、ｉｎ　ｖｉｖｏ活性、薬効発現の早さ、薬効の持続性、物理的安定性、薬物相互作用、安全性等の点で優れた性質を有し、上記疾患を治療又は予防するための医薬として有用である。

Ｔａｘ野生型、Ｔａｘ変異型、及び分泌型Ｔａｘ変異体によるＨＩＶ－１　ＬＴＲ転写活性（Ａ）及びＨＴＬＶ－１　ＬＴＲ転写活性（Ｂ）を示す図である。ｐＨＩＶ－１　ＬＴＲはＨＩＶ－１　ＬＴＲレポータープラスミド投与群を、ｐＨＴＬＶ－１　ＬＴＲはＨＴＬＶ－１　ＬＴＲレポータープラスミド投与群を、Ｅｍｐｔｙは陰性対照群であるｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターを示す。Ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで実施し、縦棒は平均値を示し、エラーバーはＳＤを示す。棒グラフ上の白サークルはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅの個々のデータを示す。Ｔａｘ　ＷＴ：　Ｔａｘ野生型、Ｔａｘ　Ｍｕｔ：　Ｔａｘ変異型、Ｓｅｃ－Ｔａｘ　Ｍｕｔ：　分泌型Ｔａｘ変異体。実施例１２の脂質粒子を投与したＣ３ＨマウスにおけるＴａｘ特異的なＣＴＬ誘導レベル及び血中抗Ｔａｘ抗体価を示す図である。図２ＡはＴａｘ特異的なＣＴＬ誘導レベル、図２Ｂは血中抗Ｔａｘ抗体価を示す。サル血中抗ｇｐ４６抗体価及び血中抗Ｔａｘ抗体価を示す図である。図３Ａは血中抗ｇｐ４６特異的抗体価、図３Ｂは血中抗Ｔａｘ抗体価を示す。１群４頭。０Ｗ、２Ｗ、４Ｗ、又は６Ｗはそれぞれ、投与前、初回投与後から２週後、４週後（２回目投与から２週後）、６週後（３回目投与から２週後）の各時点でのデータを示す。バーは平均値を示し、白サークルは個々のデータを示す。ｇｐ４６特異的及びＴａｘ特異的細胞性免疫応答を示す図である。１群４頭。縦棒は平均値を示し、エラーバーはＳＤを示す。棒グラフ上の白サークルは個々のデータを示す。サル血中抗ＨＴＬＶ－１中和活性を示す図である。アッセイ陰性対照は抗体処理がない結果を示し、アッセイ陽性対照は既知のＨＴＬＶ－１中和抗体で処理した結果を示す。１群４頭。＃７３６、＃７４１、＃７４３、＃７３７は陰性対照群のサル個体ＩＤを示し、＃７４５、＃７４２、＃７４０、＃７３５は実施例５と実施例６の混合製剤投与群のサル個体ＩＤを示す。矢印は合胞体形成（ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける血中抗ｇｐ４６抗体価を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｇｐ４６特異的及びＴａｘ特異的な細胞性免疫応答を示す図である。図７ＡはＩＦＮ－γ産生レベルを示し、図７ＢはＩＬ－２産生レベルを示す。実施例９から実施例１２の脂質粒子で処理したＣＨＯ－Ｓ細胞におけるｇｐ４６及びＴａｘタンパク質発現レベルを示す図である。図８Ａは、細胞溶解液中の発現レベルを示し、図８Ｂは培養上清中の発現レベルを示す。ＨＴＬＶ－Ｉ　ＳＵ　ｇｐ４６　ＩＶＴ用の鋳型プラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図である。センスプライマー（配列番号２）及びアンチセンスプライマー（配列番号３）のヌクレオチド配列を示す図である。ＳＵ　ｇｐ４６のｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）を示す図である。ＨＴＬＶ－Ｉ　ｇｐ４６－Ｆｉｂ　ＩＶＴ用の鋳型プラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５）を示す図である。ｇｐ４６－Ｆｉｂのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す図である。ＨＴＬＶ－Ｉ　ｄｇｐ６２－Ｆｉｂ　ＩＶＴ用の鋳型プラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７）を示す図である。ｄｇｐ６２－Ｆｉｂのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号８）を示す図である。ＨＴＬＶ－Ｉ　ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔ　ＩＶＴ用の鋳型プラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号９）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す図である。Ｔａｘ野生型のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す図である。Ｔａｘ変異型（Ｔ１３０Ａ／Ｌ１３１Ｓ／Ｌ３１９Ｒ／Ｌ３２０Ｓ）のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。分泌型Ｔａｘ変異体（Ｔ１３０Ａ／Ｌ１３１Ｓ／Ｌ３１９Ｒ／Ｌ３２０Ｓ）のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。ｇｐ４６のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す図である。ｇｐ４６－Ｆｉｂのアミノ酸配列（配列番号１５）を示す図である。ｄｇｐ６２－Ｆｉｂのアミノ酸配列（配列番号１６）を示す図である。ＳＵ　ｇｐ４６　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す図である。ｇｐ４６－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す図である。ｄｇｐ６２－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す図である。実施例３０～３４で処理したＣＨＯ－Ｓ細胞におけるｇｐ４６タンパク質発現レベルを示す図である。点線は、陰性コントロールであるＢｕｆｆｅｒのＯＤ値を示す。ｇｐ４６－Ｆｉｂの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ９５（配列番号２１）を示す図である。ｇｐ４６－Ｆｉｂの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ８０（配列番号２２）を示す図である。ｇｐ４６－Ｆｉｂの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ６０（配列番号２３）を示す図である。ｇｐ４６－Ｆｉｂの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ４０（配列番号２４）を示す図である。ｇｐ４６－Ｆｉｂの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ２０（配列番号２５）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ９５（配列番号２６）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ８０（配列番号２７）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ６０（配列番号２８）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ４０（配列番号２９）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ２０（配列番号３０）を示す図である。ｇｐ４６－ＦｉｂのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ９５（配列番号３１）を示す図である。ｇｐ４６－ＦｉｂのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ８０（配列番号３２）を示す図である。ｇｐ４６－ＦｉｂのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ６０（配列番号３３）を示す図である。ｇｐ４６－ＦｉｂのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ４０（配列番号３４）を示す図である。ｇｐ４６－ＦｉｂのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ２０（配列番号３５）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ９５（配列番号３６）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ８０（配列番号３７）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ６０（配列番号３８）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ４０（配列番号３９）を示す図である。ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ２０（配列番号４０）を示す図である。

　以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。

　本発明は、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原を発現させることができる核酸を封入した脂質粒子であって、脂質が一般式（Ｉａ）で表されるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩を含む前記粒子を提供する。

式中、
Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル基を示し；
Ｌ^１は、Ｃ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１７－Ｃ_１９アルケニル基を示し；
Ｌ^２は、Ｃ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルキル基、又はＣ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルケニル基を示し；
ｐは、３、又は４である。

　一般式（Ｉａ）中のＲ^１及びＲ^２は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル基を示すが、好ましくは、共にメチル基である。

　一般式（Ｉａ）中のｐは、３、又は４であるが、好ましくは、３である。

　一般式（Ｉａ）中のＬ^１は、Ｃ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１７－Ｃ_１９アルケニル基を示すが、好ましくは、アセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１７－Ｃ_１９アルケニル基である。Ｌ^１として、具体的には、（Ｒ）－１１－アセチルオキシ－ｃｉｓ－８－ヘプタデセニル基、ｃｉｓ－８－ヘプタデセニル基、又は（８Ｚ，１１Ｚ）－ヘプタデカジエニル基などを例示することができる。

　一般式（Ｉａ）中のＬ^２は、Ｃ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルキル基、又はＣ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルケニル基を示すが、好ましくは、アセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１２アルキル基、又はアセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルケニル基である。あるいはまた、一般式（Ｉａ）中のＬ^２が、アセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１２アルキル基、又はアセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１７－Ｃ_１９アルケニル基であることも好ましい。Ｌ^２として、具体的には、デシル基、ｃｉｓ－７－デセニル基、ドデシル基、又は（Ｒ）－１１－アセチルオキシ－ｃｉｓ－８－ヘプタデセニル基などを例示することができる。

　本発明の粒子を構成する成分であるカチオン性脂質として、具体的には、下記の構造式：

でそれぞれ表される二酢酸（７Ｒ，９Ｚ，２６Ｚ，２９Ｒ）－１８－（｛［３－（ジメチルアミノ）プロポキシ］カルボニル｝オキシ）ペンタトリアコンタ－９，２６－ジエン－７，２９－ジイル、炭酸３－ジメチルアミノプロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタコサ－１９，２２－ジエン－１１－イル、酢酸（７Ｒ，９Ｚ）－１８－（｛[３－（ジメチルアミノ）プロピルオキシ]カルボニル｝オキシ）オクタコサ－９－エン－７－イルを例示することができる。

　一般式（Ｉａ）で表されるカチオン性脂質は、１種類の化合物でも、２種類以上の化合物の組み合わせでもよい。

　一般式（Ｉａ）で表されるカチオン性脂質を製造する方法は、国際公報第２０１５／００５２５３号パンフレットに記載されている。

　本発明の脂質は、さらに、両親媒性脂質、ステロール類及びＰＥＧ脂質を含んでもよい。

　両親媒性脂質は、極性、非極性の溶媒に対してともに親和性を持つ脂質であり、具体的には、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、それらの組み合わせなどを例示することができる。本発明の粒子に用いる両親媒性脂質として好ましくは、ジステアロイルホスファチジルコリン及び／又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミンであり、より好ましくは、ジステアロイルホスファチジルコリンである。

　ステロール類は、ヒドロキシ基を持つステロールであり、具体的には、コレステロールなどを例示することができる。

　ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾された脂質であり、具体的には、１、２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコール及び／又はＮ－［メトキシ　ポリ（エチレングリコール）２０００］カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン、それらの組み合わせなどを例示することができるが、好ましくは１、２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコールである。ＰＥＧ脂質の平均分子量は、特に限定はないが、例えば、１０００～５０００であり、好ましくは、１５００～３０００であり、より好ましくは、１８００～２２００である。

　両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成は、特に限定されるわけではないが、例えば、モル量にて、両親媒性脂質が５～２５％、ステロール類が１０～５５％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～５％であり、両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が１０～２５％、ステロール類が１０～５５％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～５％あることが好ましく、両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が１０～２２．５％、ステロール類が１５～５５％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～５％であることがより好ましい。上記脂質組成においてＰＥＧ脂質の割合が、モル量にて１～３％であることがより好ましく、１～２％であることがさらにより好ましく、１．２～２％であることがさらにより好ましく、１．２５～２％であることがさらにより好ましく、１．３～２％であることがさらにより好ましく、１．５～２％であることが特に好ましい。また、上記脂質組成において核酸重量に対する総脂質重量の比率は特に限定されないが、１５～３０であればよく、１５～２５であることが好ましく、１５～２２．５であることがより好ましく、１７．５～２２．５であることがさらにより好ましい。

　カチオン性脂質として炭酸３－ジメチルアミノプロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタコサ－１９，２２－ジエン－１１－イル、又は二酢酸（７Ｒ，９Ｚ，２６Ｚ，２９Ｒ）－１８－（｛［３－（ジメチルアミノ）プロポキシ］カルボニル｝オキシ）ペンタトリアコンタ－９，２６－ジエン－７，２９－ジイルを用いる場合、両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成は、特に限定されるわけではないが、例えば、モル量にて、両親媒性脂質が５～２５％、ステロール類が１０～５５％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～５％であり、両親媒性脂質が１５％以下、ステロール類が２０～５５％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～５％であることが好ましく、両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が５～１５％、ステロール類が３５～５０％、カチオン性脂質が４０～５５％、ＰＥＧ脂質が１～３％であることがより好ましく、両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が１０～１５％、ステロール類が３５～４５％、カチオン性脂質が４０～５０％、ＰＥＧ脂質が１～２．５％であることがさらにより好ましく、両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が１０～１５％、ステロール類が３５～４５％、カチオン性脂質が４０～５０％、ＰＥＧ脂質が１～２％であることがさらにより好ましい。上記脂質組成においてＰＥＧ脂質はさらに１．２～２％であることがより好ましく、１．２５～２％であることがさらにより好ましく、１．３～２％であることがさらにより好ましく、１．５～２％であることがさらにより好ましい。上記脂質組成において核酸重量に対する総脂質重量の比率は特に限定されないが１５～３０であればよく、１５～２５であることが好ましく、１５～２２．５であることがより好ましく、１７．５～２２．５であることがさらにより好ましい。

　カチオン性脂質として酢酸（７Ｒ，９Ｚ）－１８－（｛[３－（ジメチルアミノ）プロピルオキシ]カルボニル｝オキシ）オクタコサ－９－エン－７－イルを用いる場合、両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成は、特に限定されるわけではないが、例えば、モル量にて、両親媒性脂質が５～２５％、ステロール類が１０～５５％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～５％であり、両親媒性脂質が１０～２５％、ステロール類が１０～５０％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～５％であることが好ましく、両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が１０～２５％、ステロール類が１０～５０％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～３％であることがより好ましく、両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が１０～２５％、ステロール類が１０～４５％、カチオン性脂質が４２．５～６５％、ＰＥＧ脂質が１～２．５％であることがさらにより好ましく、両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が１５～２２．５％、ステロール類が１５～４０％、カチオン性脂質が４５～６５％、ＰＥＧ脂質が１～２％であることがさらにより好ましく、両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が１７．５～２２．５％、ステロール類が１５～４０％、カチオン性脂質が４５～６５％、ＰＥＧ脂質が１～２％であることがさらにより好ましい。上記脂質組成においてＰＥＧ脂質はさらに１．２～２％であることがより好ましく、１．２５～２％であることがさらにより好ましく、１．３～２％であることがさらにより好ましく、１．５～２％であることがさらにより好ましい。上記脂質組成において核酸重量に対する総脂質重量の比率は特に限定されないが１５～３０であることが好ましく、１５～２５であることがより好ましく、１５～２２．５であることがさらにより好ましく、１７．５～２２．５であることがさらにより好ましい。

　本発明における具体的な脂質の組み合わせとしては、両親媒性脂質としてジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ステロール類としてコレステロール、カチオン性脂質として二酢酸（７Ｒ，９Ｚ，２６Ｚ，２９Ｒ）－１８－（｛［３－（ジメチルアミノ）プロポキシ］カルボニル｝オキシ）ペンタトリアコンタ－９，２６－ジエン－７，２９－ジイル、炭酸３－ジメチルアミノプロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタコサ－１９，２２－ジエン－１１－イル、又は酢酸（７Ｒ，９Ｚ）－１８－（｛[３－（ジメチルアミノ）プロピルオキシ]カルボニル｝オキシ）オクタコサ－９－エン－７－イル、ＰＥＧ脂質として１、２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコール又はＮ－［メトキシ　ポリ（エチレングリコール）２０００］カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミンを組み合わせて用いてよい。また、両親媒脂質としてジステアロイルホスファチジルコリン、又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ステロール類としてコレステロール、カチオン性脂質として二酢酸（７Ｒ，９Ｚ，２６Ｚ，２９Ｒ）－１８－（｛［３－（ジメチルアミノ）プロポキシ］カルボニル｝オキシ）ペンタトリアコンタ－９，２６－ジエン－７，２９－ジイル、又は酢酸（７Ｒ，９Ｚ）－１８－（｛[３－（ジメチルアミノ）プロピルオキシ]カルボニル｝オキシ）オクタコサ－９－エン－７－イル、ＰＥＧ脂質として１、２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコールを使用する脂質の組み合わせが好ましい。本発明における具体的な脂質の組み合わせとしてより好ましくは、両親媒脂質としてジステアロイルホスファチジルコリン、ステロール類としてコレステロール、カチオン性脂質として二酢酸（７Ｒ，９Ｚ，２６Ｚ，２９Ｒ）－１８－（｛［３－（ジメチルアミノ）プロポキシ］カルボニル｝オキシ）ペンタトリアコンタ－９，２６－ジエン－７，２９－ジイル、又は酢酸（７Ｒ，９Ｚ）－１８－（｛[３－（ジメチルアミノ）プロピルオキシ]カルボニル｝オキシ）オクタコサ－９－エン－７－イル、ＰＥＧ脂質として１、２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコールである。

　本発明において、脂質粒子に封入される核酸は、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原を発現させることができるものである。

　ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。脂質粒子に封入される核酸は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原をコードするものであるとよい。

　ｇｐ４６抗原は、オリゴマー化ドメインとの融合タンパク質であってもよい。オリゴマー化ドメインは、融合させたタンパク質を多量体化するタンパク質であり、例えば、Ｔ４バクテリオファージ由来のフィブリチン（fibritin)が挙げられる。また、フィブリチンの３量体化ドメインであるフォールドオン（foldon）ドメインも用いることができる。ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６とフィブリチンの融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。配列番号１５のアミノ酸配列の３１３番目～３３９番目のアミノ酸配列がフィブリチンのアミノ酸配列である。オリゴマー化ドメインは、ｇｐ４６抗原のＣ末端に位置していても、Ｎ末端に位置していてもよい。

　ＨＴＬＶ－１の野生型のＴａｘ抗原のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。脂質粒子に封入される核酸は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、好ましくは９６％、より好ましくは９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ＨＴＬＶ－１のＴａｘ抗原をコードするものであるとよい。野生型のＴａｘ抗原はＨＴＬＶ－１　ＬＴＲ転写活性を有し、発がん性を有するため、生体に対して発がん性という毒性を低減又は消失させる必要がある。例えば、発がん性を低減又は消失させるような変異を有するＴａｘ抗原を用いればよい。また、Ｔａｘが細胞外に分泌されると細胞に対する発がん性が低下するので、シグナルペプチドとの融合タンパク質であってもよい。発がん性を低減又は消失させるような変異として、Ｔ１３０Ａ、Ｌ１３１Ｓ、Ｌ３１９Ｒ及びＬ３２０Ｓが挙げられる。Ｔ１３０Ａ及びＬ１３１Ｓは、ＨＩＶ－１　ＬＴＲ及びＨＴＬＶ－１転写活性不能変異であり、Ｌ３１９Ｒ及びＬ３２０Ｓは、ＨＴＬＶ－１転写活性欠失変異である。これらの変異の少なくとも１つの変異を有していればよく、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、特に好ましくは４つの変異を有している。上記４つの変異を有する変異型のＴａｘ抗原のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。また、Ｔａｘ抗原を細胞外に分泌させるためのシグナルペプチドとして、ＩｇＥ分泌シグナルペプチドが挙げられる。シグナルぺプチドは、好ましくはＴａｘ抗原のＮ末端側に融合させる。シグナルペプチドと上記４つの変異を有する変異型Ｔａｘ抗原との融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３に示す。配列番号１３のアミノ酸配列の１番目～１８番目のアミノ酸配列がＩｇＥ分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列である。

　本発明は、上記の４つのアミノ酸変異の少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、特に好ましくは４つの変異を有するＴａｘ抗原にシグナルペプチドを融合させたＴａｘ変異型にＩｇＥ分泌シグナルを付加した分泌型Ｔａｘ変異体であるペプチドを包含する。該ペプチドは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のＴａｘ抗原であって、発がん性を低減又は消失させるような変異を有するＴａｘ抗原とシグナルペプチドを融合させたペプチドである。発がん性を低減又は消失させるような変異として、Ｔ１３０Ａ、Ｌ１３１Ｓ、Ｌ３１９Ｒ及びＬ３２０Ｓが挙げられる。すなわち、上記ペプチドとして、Ｔａｘ抗原が、配列番号１１のアミノ酸配列に対して、Ｔ１３０Ａ、Ｌ１３１Ｓ、Ｌ３１９Ｒ及びＬ３２０Ｓからなる群から選択される変異の少なくとも１つを有し、該変異アミノ酸以外のアミノ酸配列を比較した場合、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、好ましくは９６％、より好ましくは９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。また、Ｔａｘ抗原を細胞外に分泌させるためのシグナルペプチドとして、ＩｇＥ分泌シグナルペプチドが挙げられる。シグナルぺプチドは、好ましくはＴａｘ抗原のＮ末端側に融合させる。配列番号１３のアミノ酸配列の１番目～１８番目のアミノ酸配列がＩｇＥ分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列である。すなわち、上記ペプチドとして、シグナルペプチドが配列番号１３のアミノ酸配列の１番目～１８番目のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。

　本発明において、脂質粒子に封入される核酸は、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原とＴａｘ抗原がリンカーで結合されたタンパク質を発現させることができるものであってもよい。リンカーはプロテアーゼにより切断される配列を含むアミノ酸配列からなり、例えば、プロテアーゼであるフーリン（Ｆｕｒｉｎ）が認識して切断するアミノ酸配列を含むリンカーが挙げられる。プロテアーゼ切断配列としては、Ｆｕｒｉｎタンパクによって切断される配列であればよく、例えば、Ｒ－Ｘ－Ｋ／Ｒ－Ｒ（Ｒはアルギニンを、Ｋはリシンを、Ｘは任意のアミノ酸を表す）で表される配列などが挙げられる（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９２，　２６７，　１６３９６；Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９１，　２６６，　１２１２７）。

　アミノ酸配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とは、対応するアミノ酸が完全に一致するアミノ酸を同じアミノ酸として、全長配列に対するアミノ酸の一致割合を数値化したものである。本発明における配列の同一性は配列解析ソフトウェアであるＧＥＮＥＴＹＸ－ＳＶ／ＲＣ（株式会社ゼネティックス製）を用いて算出されるものであり、このアルゴリズムは、当該技術分野で通常使用されるものである。本発明の脂質粒子に封入される核酸がコードするアミノ酸は、配列番号１１～１６と一定以上の同一性を保持する限り、アミノ酸の変異（置換）、欠失、挿入及び／又は付加が起こっていても良い。

　本発明の脂質粒子に封入される核酸がコードするアミノ酸は、上述の配列同一性を保持し、配列番号１１～１６のアミノ酸配列中、数箇所（好ましくは５箇所以下、より好ましくは３、２又は１箇所）において、１箇所当たり数個（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、更に好ましくは５、４、３、２又は１個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加していても良い。

　ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原を発現させることができる核酸は、キャップ構造（Ｃａｐ）、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ｇｐ４６又はＴａｘの翻訳領域、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）及びポリＡ尾部（ｐｏｌｙＡ）を含むｍＲＮＡであるとよい。また、ｇｐ４６又はＴａｘの翻訳領域の５’側にＫＯＺＡＫ配列を有していてもよい。キャップ構造（Ｃａｐ）は、多くの真核生物のｍＲＮＡの５’末端に存在し、７－メチルグアノシン構造を有する部位である。キャップ構造としては、例えば、ｃａｐ０、ｃａｐ１、ｃａｐ２、ＡＲＣＡ（Anti-Reverse Cap Analog）を使った場合のキャップ構造などを挙げることができ、当該キャップ構造は下記の構造式で示されるとおりである。

　（式中、Ｂａｓｅは未修飾又は修飾された任意の核酸塩基を示し、ＲＮＡは任意のポリヌクレオチドを示す。）

　本発明のｍＲＮＡのキャップ構造としては、好ましくはｃａｐ０、又はｃａｐ１であり、より好ましくはｃａｐ１である。５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）の配列は、例えば、ヒトβグロビン遺伝子の５’非翻訳領域を含む配列用いることができる。例えば、ヒトβグロビン遺伝子の５’非翻訳領域の配列は、配列番号１７の配列中の塩基番号１５～６４の配列である。ｇｐ４６の翻訳領域の配列は、ｇｐ４６抗原のアミノ酸配列の全て又は一部を発現できる配列であって、開始コドン及び／又は終止コドンを含んでいても良く、例えば、配列番号１７の配列中の塩基番号７１～１００９の配列である。また、ｇｐ４６の翻訳領域の配列とフィブリチンの配列を連結させたものでもよく、例えば、配列番号１８の塩基番号７１～１０９０の配列である。ｄｇｐ６２の翻訳領域の配列はｄｇｐ６２抗原のアミノ酸配列の全てまたは一部を発現できる配列であって、開始コドン及び／又は終始コドンを含んでいてもよく、例えば、配列番号１９の配列中の塩基番号７１～１３９６の配列である。また、ｄｇｐ６２の翻訳領域の配列とフィブリチンの配列を連結させたものでもよく、例えば、配列番号１９の配列中の塩基番号７１～１４８０の配列である。Ｔａｘの翻訳領域の配列は、Ｔａｘ抗原のアミノ酸配列の全て又は一部を発現できる配列であって、開始コドン及び／又は終止コドンを含んでいても良い。例えば、Ｔ１３０Ａ、Ｌ１３１Ｓ、Ｌ３１９Ｒ及びＬ３２０Ｓ４つの変異を有している。上記４つの変異を有する変異型のＴａｘ抗原の翻訳領域の配列と、Ｔａｘ抗原を細胞外に分泌させるためのＩｇＥ分泌シグナルペプチドをコードする配列を連結させたものが挙げられ、配列番号２０の配列中の塩基番号７１～１１８３の配列である。３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）の配列は、例えば、ヒトβグロビン遺伝子の３’非翻訳領域を用いることができる。例えば、配列番号１７の配列中の塩基番号１０１０～１１４１の配列である。ポリＡ尾部（ｐｏｌｙＡ）の配列は、例えば、配列番号１７の配列中の塩基番号１１４２～１２４１の配列である。キャップ構造（Ｃａｐ）、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ｇｐ４６又はＴａｘの翻訳領域、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）及びポリＡ尾部（ｐｏｌｙＡ）の配列には、改変がなされていてもよく、ｇｐ４６抗原を発現させることができる核酸の配列は、配列番号１７の配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるとよい。また、Ｔａｘ抗原を発現させることができる核酸の配列は、配列番号２０の配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるとよい。

　ポリＡ尾部の長さは限定されないが、例えば、１０～２５０塩基長であり、好ましくは１５～１２０塩基長、さらに好ましくは１５～１１５塩基長、特に好ましくは２０～１１０塩基長である。

　本発明のｍＲＮＡは、キャップ構造（Ｃａｐ）、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ｇｐ４６又はＴａｘの翻訳領域及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む配列であり、キャップ構造（Ｃａｐ）、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原の翻訳領域及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）からなる部分が配列番号１７の１番目から１１４１番目の配列、配列番号１８の１番目から１２２２番目の配列、配列番号２０の１番目から１３１５番目の配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるｍＲＮＡであってもよい。

　脂質粒子に封入される核酸は、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原を発現させることができる核酸であれば、いかなる形態であってもよい。例えば、１本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡとＲＮＡが混合した１本鎖ポリヌクレオチド、２本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡのハイブリッドポリヌクレオチド、ＤＮＡとＲＮＡが混合した２種のポリヌクレオチドからなる２本鎖ポリヌクレオチドなどが挙げられるが、好ましくはｍＲＮＡである。

　脂質粒子に封入される核酸を構成するヌクレオチドは、天然型のものであっても、修飾ヌクレオチドであってもよいが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むとよい。

　修飾ヌクレオチドは、塩基、糖及びリン酸ジエステル結合のいずれの部分が修飾されたものであってもよい。修飾部位は１箇所でも、２箇所以上であってもよい。

　塩基の修飾の例としては、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、Ｎ４－メチル化、ウラシルの５－メチル化（チミン）、５－フルオロ化、アデニンのＮ６－メチル化、グアニンのＮ２－メチル化などを挙げることができる。

　糖の修飾の例としては、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ－メチル化を挙げることができる。

　リン酸ジエステル結合の修飾の例としては、ホスホロチオエート結合を挙げることができる。

　修飾ヌクレオチドは、塩基部分が修飾されたものが好ましく、例えば、５位が置換したピリミジンヌクレオチド、１位が置換していてもよいシュードウリジンであるとよく、具体的には、５－メチルシチジン、５－メトキシウリジン、５－メチルウリジン、シュードウリジン、１－アルキルシュードウリジンを例示することができる。また、１－アルキルシュードウリジンとしては、１－（Ｃ１－Ｃ６アルキル）シュードウリジンであってよく、好ましくは１－メチルシュードウリジン又は１－エチルシュードウリジンである。修飾ヌクレオチドとしてより好ましくは、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、及び１－メチルシュードウリジンが挙げられる。修飾ヌクレオチドとして特に好ましくは、５－メチルシチジン及び５－メチルウリジンの組み合わせ、又は５－メチルシチジン及び１－メチルシュードウリジンの組み合わせを挙げることができる。

　本発明のＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原を発現させることができる核酸は、所望の塩基配列を有するＤＮＡからｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応により製造することができる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写に必要な酵素、緩衝液、及び、ヌクレオシド－５’－トリリン酸混合物（アデノシン－５’－トリリン酸（ＡＴＰ）、グアノシン－５’－トリリン酸（ＧＴＰ）、シチジン－５’－トリリン酸（ＣＴＰ）及びウリジン－５’－トリリン酸（ＵＴＰ））は、市販されている（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴ７　Ｈｉｇｈ　Ｙｉｅｌｄ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、ｍＭＥＳＳＡＧＥ　ｍＭＡＣＨＩＮＥ　Ｔ７　Ｕｌｔｒａ　Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等）。１本鎖ＲＮＡを製造するために使用されるＤＮＡは、クローン化されたＤＮＡ、例えば、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片が用いられる。プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片は、市販されているものを用いても良く、また当該分野で一般的に知らせている方法によって製造することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ　（１９８９）、Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ，　Ａ．，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１９９５，　６（１），　３０－３６、Ｇｉｂｓｏｎ　Ｄ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００８，　３１９（５８６７），　１２１５－１２２０に記載の方法など）。

　安定性及び／又は安全性を向上させたｍＲＮＡを得るために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応において、一部又は全部の未修飾ヌクレオシド－５’－トリリン酸を修飾ヌクレオシド－５’－トリリン酸に置換することによって、ｍＲＮＡの中の一部又は全部の未修飾ヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置換することもできる（Ｋｏｒｍａｎｎ，　Ｍ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　２０１１，　２９，　１５４－１５７．）。

　安定性及び／又は安全性を向上させたｍＲＮＡを得るために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応後にキャップ化酵素を用いる方法によってｍＲＮＡの５’末端にキャップ構造（上記のＣａｐ０構造）を導入することができる。また、さらにＣａｐ０を有するｍＲＮＡに２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを作用させる方法により、Ｃａｐ０をＣａｐ１に変換することができる。キャップ化酵素及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼは市販の製品を用いることができる（例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａ　Ｃａｐｐｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍ２０８０；ｍＲＮＡ　Ｃａｐ　２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｍ０３６６，共にＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ製）。市販の製品を使用する場合は、製品に付属するプロトコールに従ってキャップ構造を有するｍＲＮＡを製造することができる。

　ｍＲＮＡの５’末端のキャップ構造は酵素を使用するものとは別の方法によっても導入することができる。例えば、ＡＲＣＡ又はＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）をｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応に加えることによってＡＲＣＡが有するキャップ類縁体の構造、又はＣｌｅａｎＣａｐに由来するＣａｐ１構造をｍＲＮＡに導入することができる。ＡＲＣＡ及びＣｌｅａｎＣａｐは、市販の製品を用いることができる（ＡＲＣＡ，Ｎ－７００３；ＣｌｅａｎＣａｐ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＡＧ，Ｎ－７１１３，共にＴｒｉＬｉｎｋ　ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）。市販の製品を使用する場合は、製品に付属するプロトコールに従ってキャップ構造を有するｍＲＮＡを製造することができる。

　本発明において、脂質粒子に封入される核酸は、脱塩、ＨＰＬＣ（逆相、ゲル濾過、イオン交換、アフィニティ）、ＰＡＧＥ、限外濾過などの方法で精製してもよい。精製処理により、不純物を除去することで、核酸を投与した生体における、炎症性サイトカインの産生が減少しうる。

　本発明の核酸封入脂質粒子は、薄膜法、逆相蒸発法、エタノール注入法、エーテル注入法、脱水―再水和法、界面活性剤透析法、水和法、凍結融解法等の方法によって製造することができる。例えば、国際公開公報第２０１５／００５２５３号に記載の方法により核酸封入脂質粒子を製造することができる。本発明の核酸封入脂質粒子は、核酸溶液と脂質溶液をマイクロ流路内で混合することによっても製造することができる。例えば、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）を使用し、付属するプロトコールに記載の方法に従って製造することができる。

　本発明の粒子は、平均粒子径が３０ｎｍ～３００ｎｍであるとよく、好ましくは３０～２００ｎｍであり、より好ましくは３０～１００ｎｍである。平均粒子径は、Ｚｅｔａ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ／Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｅｒ　ＮＩＣＯＭＰ（登録商標）　３８０ＺＬＳ（ＰＡＲＴＩＣＬＥ　ＳＩＺＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭＳ）等の機器を用い、動的光散乱法等の原理に基づいて体積平均粒子径を測定することにより得ることができる。

　本発明の粒子は、ＨＴＬＶ－１感染による疾患を予防及び／又は治療するための組成物を製造するために用いることができる。ＨＴＬＶ－１感染による疾患として、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）、ＨＴＬＶ－１関連ぶどう膜炎（ＨＵ）等が挙げられる。　ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原を発現させることができる核酸を封入した脂質粒子とＨＴＬＶ－１のＴａｘ抗原を発現させることができる核酸を封入した脂質粒子は、当該核酸を同一の脂質粒子内に製剤化しても別の脂質粒子として製剤化してもよいが、別の脂質粒子として調製することが好ましい。

　本発明の粒子を用いて、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原及びＴａｘ抗原をｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで発現させることができる。すなわち、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原を発現させることができる核酸を封入した脂質粒子とＨＴＬＶ－１のＴａｘ抗原を発現させることができる核酸を封入した脂質粒子を被験体に投与すればよい。よって、本発明は、上記粒子を含有する組成物を細胞に導入することを含む、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原及びＴａｘ抗原をｉｎ　ｖｉｔｒｏで発現させる方法を提供する。また、本発明は、上記粒子を含有する組成物を哺乳動物に投与することを含む、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原及びＴａｘ抗原をｉｎ　ｖｉｖｏで発現させる方法も提供する。ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原及びＴａｘ抗原をｉｎ　ｖｉｖｏで発現させることにより、ＨＴＬＶ－１に対する免疫反応を誘導することができる。その結果として、ＨＴＬＶ－１感染を予防及び／又は治療することができる。よって、本発明は、上記粒子を含有する組成物を哺乳動物に投与することを含む、ＨＴＬＶ－１に対する免疫反応を誘導する方法を提供する。また、本発明は、上記粒子を含有する組成物を哺乳動物に投与することを含む、ＨＴＬＶ－１感染を予防及び／又は治療する方法を提供する。本発明は、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原を発現させることができる核酸を封入した脂質粒子とＨＴＬＶ－１のＴａｘ抗原を発現させることができる核酸を封入した脂質粒子の両方を含むキットも含む。

　本発明の粒子は、医薬として、また、実験用試薬として利用できる。本発明の粒子は、通常、水、緩衝液、生理食塩水などの担体に添加され、この配合物（組成物）を、細胞に導入したり（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）、哺乳動物に投与しうる（ｉｎ　ｖｉｖｏ）。哺乳動物に投与される場合には、担体は薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）であるとよい。また、本発明の粒子は、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、ロウ、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤、懸濁剤などを基剤原料とするクリーム、ペースト、軟膏、ゲル、ローションなどの剤型に製剤化してもよい。

　本発明の粒子は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどの哺乳動物に、経口投与、あるいは、筋肉内投与、静脈内投与、直腸内投与、経皮投与、経粘膜投与、皮下投与、皮内投与などの方法により非経口投与することができる。

　本発明の粒子をヒトに投与する場合には、例えば、成人１回あたりｍＲＮＡの重量として約０．００１～１ｍｇ、好ましくは０．０１～０．２ｍｇの投与量で、１回または数回、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、点滴静脈注射、または、静脈注射するとよいが、その投与量や投与回数は、疾患の種類、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。

　実験試薬として用いる場合、本発明の粒子を、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原及びＴａｘ抗原を発現させたい細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞およびその派生細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３細胞やＥｘｐｉ２９３細胞）、ＣＨＯ細胞、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞、不死化マウス樹状細胞（ＭｕｔｕＤＣ１９４０））に導入し、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原及びＴａｘ抗原をｉｎ　ｖｉｔｒｏで発現させることができる。ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原及びＴａｘ抗原の発現は、サンプル中のＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原及びＴａｘ抗原タンパク質をウェスタンブロット法で検出したり、ＨＴＬＶ－１のｇｐ４６抗原及びＴａｘ抗原に特異的なペプチド断片を質量分析法で検出したりすることにより解析することができる。

　本発明において、「治療」とは、ウイルス又は細菌などによる感染症、又は当該感染を原因とする疾患（例えば、前癌病変や癌など）を発症した患者において、これら疾患の臨床症状の回復、寛解、緩和及び／又は悪化の遅延を意味する。

　本発明において、「予防」とは、ウイルス又は細菌などによる感染症による疾患の発症率を低減することを意味する。予防は、ウイルス又は細菌などによる感染症による疾患の進行のリスクの低下、あるいはそれら疾患の重症化の低減を含む。本発明の粒子は、防御免疫反応を誘導することから上記疾患の予防及び／又は治療に効果を示す。

　本発明の粒子は、、ＨＴＬＶ－１感染者に対し、ＨＴＬＶ－１に起因する疾患の発症予防薬及び治療薬としても使用が期待される。ＨＴＬＶ－１に起因する疾患としては、成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）、ＨＴＬＶ－１ぶどう膜炎（ＨＵ）等が挙げられる。

　以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

　実施例中、以下の略語を使用することがある。
ＳＵ　ｇｐ４６：ＨＴＬＶ－１のエンベロープタンパク質の細胞外領域（surface unit）であるｇｐ４６を表す。
ｇｐ４６－Ｆｉｂ：ｇｐ４６とＦｉｂｒｉｔｉｎのＣ末領域との融合タンパク質を表す。ｄｇｐ６２－Ｆｉｂ：ｇｐ６２から膜貫通領域及び細胞内領域を欠損させたタンパク質とＦｉｂｒｉｔｉｎのＣ末領域との融合タンパク質を表す。
ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔ：変異導入Ｔａｘタンパク質と分泌シグナルタンパク質との融合タンパク質を表す。

[実施例１]　ＳＵ　ｇｐ４６　ｍＲＮＡ－００１の調製
（１）ＳＵ　ｇｐ４６のｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡの作製
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）に用いる鋳型ＤＮＡを作製するためにＳＵ　ｇｐ４６　ＤＮＡをＰＣＲにより増幅後精製した。Ｔ７プロモーター配列、ｈｕｍａｎ　β－ｇｌｏｂｉｎの５’－ＵＴＲ配列、ＫＯＺＡＫ配列、ＳＵ　ｇｐ４６、ｈｕｍａｎ　β－ｇｌｏｂｉｎの３’－ＵＴＲ配列、ＰｏｌｙＡ配列が順に連結した配列を含むＤＮＡ断片（配列番号１）をプラスミドに導入した。当該プラスミド８ｎｇを溶解したＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（５４７．２　μＬ）に１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（８０　μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、２　ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘ（８０　μＬ　、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、２５　ｍＭ　ＭｇＳＯ_４（４８　μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、５０　μＭ　センスプライマー（４．８　μＬ、配列番号２）、１０　μＭ　アンチセンスプライマー（２４　μＬ、配列番号３）、ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１６μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）を加え、９８℃で１分インキュベーション後、９８℃、５秒、５５℃、１５秒、６８℃、９０秒を２０サイクル実施し、更に６８℃で１分インキュベートし、ＤＮＡを増幅した。反応後Ｗｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ａ９２８１）にて鋳型ＤＮＡ（配列番号４）を精製した。

（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによるＳＵ　ｇｐ４６　ｍＲＮＡ－００１の調製
実施例１－（１）で得られた３６５．１　μｇ／ｍＬ　鋳型ＤＮＡ（４．３８　μＬ）、１００　ｍＭ　ＣｌｅａｎＣａｐ　ＡＧ（８　μＬ，　ＴｒｉＬｉｎｋ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｎ－７１１３）、１００　ｍＭ　ＡＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ１３３１）、１００　ｍＭ　ＧＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ２３３１）、１００　ｍＭ　ＣＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ３３３１）、１００　ｍＭ　Ｎ１－ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏＵＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ５－０２７）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（６７．６２　μＬ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＡＭ９９３７）、Ｔ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　５×　ｂｕｆｆｅｒ（３２　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１４０Ｘ）、Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｉｘ，　Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１６　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１３７Ｘ）を混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。ＲＱ１　ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（８　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｍ６１０１）を混合し、３７℃で１５分インキュベーションした。８　Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（８０　μＬ，　Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｌ７０２６）を混合し、－３０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、５２００×ｇ、３５分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、５２００×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（５００　μＬ）に溶解後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１４４）を用いて付属のマニュアル通りに精製した。得られた溶液（７５０　μＬ）、ｒＡｐｉｄ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　０４　８９８　１４１　００１）の緩衝液（８５　μＬ）と酵素（３２　μＬ）を混合し、３７℃で３０分インキュベーション後、７５℃で２分インキュベーションした。得られた溶液をＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１４４）を用いて付属のマニュアル通りに精製することで目的とするｍＲＮＡを得た。同様の実験操作を計２回行い、得られたｍＲＮＡ溶液をまとめて、目的とするｍＲＮＡを得た。得られたｍＲＮＡは配列番号１７の配列を有する。

[実施例２]　ｇｐ４６－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡ－００２の調製
（１）ｇｐ４６－Ｆｉｂのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡの作製
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）に用いる鋳型ＤＮＡを作製するためにｇｐ４６－Ｆｉｂ　ＤＮＡをＰＣＲにより増幅後精製した。Ｔ７プロモーター配列、ｈｕｍａｎ　β－ｇｌｏｂｉｎの５’－ＵＴＲ配列、ＫＯＺＡＫ配列、ｇｐ４６－Ｆｉｂ、ｈｕｍａｎ　β－ｇｌｏｂｉｎの３’－ＵＴＲ配列、ＰｏｌｙＡ配列が順に連結した配列を含むＤＮＡ断片（配列番号５）をプラスミドに導入した。当該プラスミド８ｎｇを溶解したＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（５４７．２　μＬ）に１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（８０　μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、２　ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘ（８０　μＬ　、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、２５　ｍＭ　ＭｇＳＯ_４（４８　μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、５０　μＭ　センスプライマー（４．８　μＬ、配列番号２）、１０　μＭ　アンチセンスプライマー（２４　μＬ、配列番号３）、ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１６μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）を加え、９８℃で１分インキュベーション後、９８℃、５秒、５５℃、１５秒、６８℃、９０秒を２０サイクル実施し、更に６８℃で１分インキュベートし、ＤＮＡを増幅した。反応後Ｗｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ａ９２８１）にて鋳型ＤＮＡ（配列番号６）を精製した。

（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによるｇｐ４６－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡ－００２の調製
　実施例２－（１）で得られた３４５．３　μｇ／ｍＬ　鋳型ＤＮＡ（４．６３　μＬ）、１００　ｍＭ　ＣｌｅａｎＣａｐ　ＡＧ（８　μＬ，　ＴｒｉＬｉｎｋ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｎ－７１１３）、１００　ｍＭ　ＡＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ１３３１）、１００　ｍＭ　ＧＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ２３３１）、１００　ｍＭ　ＣＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ３３３１）、１００　ｍＭ　Ｎ１－ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏＵＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ５－０２７）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（６７．３７　μＬ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＡＭ９９３７）、Ｔ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　５×　ｂｕｆｆｅｒ（３２　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１４０Ｘ）、Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｉｘ，　Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１６　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１３７Ｘ）を混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。ＲＱ１　ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（８　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｍ６１０１）を混合し、３７℃で１５分インキュベーションした。８　Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（８０　μＬ，　Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｌ７０２６）を混合し、－３０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、５２００×ｇ、３５分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、５２００×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（５００　μＬ）に溶解後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１４４）を用いて付属のマニュアル通りに精製した。得られた溶液（７５０　μＬ）、ｒＡｐｉｄ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　０４　８９８　１４１　００１）の緩衝液（８５　μＬ）と酵素（３２　μＬ）を混合し、３７℃で３０分インキュベーション後、７５℃で２分インキュベーションした。得られた溶液をＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１４４）を用いて付属のマニュアル通りに精製することで目的とするｍＲＮＡを得た。同様の実験操作を計２回行い、得られたｍＲＮＡ溶液をまとめて、目的とするｍＲＮＡを得た。得られたｍＲＮＡは配列番号１８の配列を有する。

[実施例３]　ｄｇｐ６２－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡ－００３の調製
（１）ｄｇｐ６２－Ｆｉｂのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡの作製
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）に用いる鋳型ＤＮＡを作製するためにｄｇｐ６２－Ｆｉｂ　ＤＮＡをＰＣＲにより増幅後精製した。Ｔ７プロモーター配列、ｈｕｍａｎ　β－ｇｌｏｂｉｎの５’－ＵＴＲ配列、ＫＯＺＡＫ配列、ｄｇｐ６２－Ｆｉｂ、ｈｕｍａｎ　β－ｇｌｏｂｉｎの３’－ＵＴＲ配列、ＰｏｌｙＡ配列が順に連結した配列を含むＤＮＡ断片（配列番号７）をプラスミドに導入した。当該プラスミド８ｎｇを溶解したＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（５４７．２　μＬ）に１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（８０　μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、２　ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘ（８０　μＬ　、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、２５　ｍＭ　ＭｇＳＯ_４（４８　μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、５０　μＭ　センスプライマー（４．８　μＬ、配列番号２）、１０　μＭ　アンチセンスプライマー（２４　μＬ、配列番号３）、ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１６μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）を加え、９８℃で１分インキュベーション後、９８℃、５秒、５５℃、１５秒、６８℃、９０秒を２０サイクル実施し、更に６８℃で１分インキュベートし、ＤＮＡを増幅した。反応後Ｗｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ａ９２８１）にて鋳型ＤＮＡ（配列番号８）を精製した。

（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによるｄｇｐ６２－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡ－００３の調製
　実施例３－（１）で得られた３６６．７　μｇ／ｍＬ　鋳型ＤＮＡ（４．３６　μＬ）、１００　ｍＭ　ＣｌｅａｎＣａｐ　ＡＧ（８　μＬ，　ＴｒｉＬｉｎｋ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｎ－７１１３）、１００　ｍＭ　ＡＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ１３３１）、１００　ｍＭ　ＧＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ２３３１）、１００　ｍＭ　ＣＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ３３３１）、１００　ｍＭ　Ｎ１－ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏＵＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ５－０２７）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（６７．６４　μＬ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＡＭ９９３７）、Ｔ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　５×　ｂｕｆｆｅｒ（３２　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１４０Ｘ）、Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｉｘ，　Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１６　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１３７Ｘ）を混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。ＲＱ１　ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（８　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｍ６１０１）を混合し、３７℃で１５分インキュベーションした。８　Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（８０　μＬ，　Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｌ７０２６）を混合し、－３０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、５２００×ｇ、３５分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、５２００×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（５００　μＬ）に溶解後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１４４）を用いて付属のマニュアル通りに精製した。得られた溶液（７５０　μＬ）、ｒＡｐｉｄ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　０４　８９８　１４１　００１）の緩衝液（８５　μＬ）と酵素（３２　μＬ）を混合し、３７℃で３０分インキュベーション後、７５℃で２分インキュベーションした。得られた溶液をＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１４４）を用いて付属のマニュアル通りに精製することで目的とするｍＲＮＡを得た。同様の実験操作を計２回行い、得られたｍＲＮＡ溶液をまとめて、目的とするｍＲＮＡを得た。得られたｍＲＮＡは配列番号１９の配列を有する。

[実施例４]　ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔ　ｍＲＮＡ－００４の調製
（１）ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡの作製
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）に用いる鋳型ＤＮＡを作製するためにｓｅｃ　Ｔａｘ　ＤＮＡをＰＣＲにより増幅後精製した。Ｔ７プロモーター配列、ｈｕｍａｎ　β－ｇｌｏｂｉｎの５’－ＵＴＲ配列、ＫＯＺＡＫ配列、ｓｅｃ　Ｔａｘ、ｈｕｍａｎ　β－ｇｌｏｂｉｎの３’－ＵＴＲ配列、ＰｏｌｙＡ配列が順に連結した配列を含むＤＮＡ断片（配列番号９）をプラスミドに導入した。当該プラスミド８ｎｇを溶解したＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（５４７．２　μＬ）に１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（８０　μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、２　ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘ（８０　μＬ　、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、２５　ｍＭ　ＭｇＳＯ_４（４８　μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）、５０　μＭ　センスプライマー（４．８　μＬ、配列番号２）、１０　μＭ　アンチセンスプライマー（２４　μＬ、配列番号３）、ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１６μＬ、東洋紡（株）　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＫＯＤ－２１１）を加え、９８℃で１分インキュベーション後、９８℃、５秒、５５℃、１５秒、６８℃、９０秒を２０サイクル実施し、更に６８℃で１分インキュベートし、ＤＮＡを増幅した。反応後Ｗｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ａ９２８１）にて鋳型ＤＮＡ（配列番号１０）を精製した。

（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによるｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔ　ｍＲＮＡ－００４の調製
　実施例４－（１）で得られた４０１．１　μｇ／ｍＬ　鋳型ＤＮＡ（３．９９　μＬ）、１００　ｍＭ　ＣｌｅａｎＣａｐ　ＡＧ（８　μＬ，　ＴｒｉＬｉｎｋ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｎ－７１１３）、１００　ｍＭ　ＡＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ１３３１）、１００　ｍＭ　ＧＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ２３３１）、１００　ｍＭ　ＣＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ３３３１）、１００　ｍＭ　Ｎ１－ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏＵＴＰ（８　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ５－０２７）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（６８．０１　μＬ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＡＭ９９３７）、Ｔ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　５×　ｂｕｆｆｅｒ（３２　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１４０Ｘ）、Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｉｘ，　Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１６　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１３７Ｘ）を混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。ＲＱ１　ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（８　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｍ６１０１）を混合し、３７℃で１５分インキュベーションした。８　Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（８０　μＬ，　Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｌ７０２６）を混合し、－３０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、５２００×ｇ、３５分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、５２００×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（５００　μＬ）に溶解後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１４４）を用いて付属のマニュアル通りに精製した。得られた溶液（７５０　μＬ）、ｒＡｐｉｄ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　０４　８９８　１４１　００１）の緩衝液（８５　μＬ）と酵素（３２　μＬ）を混合し、３７℃で３０分インキュベーション後、７５℃で２分インキュベーションした。得られた溶液をＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１４４）を用いて付属のマニュアル通りに精製することで目的とするｍＲＮＡを得た。同様の実験操作を計２回行い、得られたｍＲＮＡ溶液をまとめて、目的とするｍＲＮＡを得た。得られたｍＲＮＡは配列番号２０の配列を有する。

[実施例５]　ＳＵ　ｇｐ４６　ｍＲＮＡ－００５の調製
（１）ＳＵ　ｇｐ４６のｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡの作製
　実施例１－（１）と同様の方法にて実施した。

（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによるＳＵ　ｇｐ４６　ｍＲＮＡ－００５の調製
　実施例５－（１）で得られた３３９μｇ／ｍＬ　鋳型ＤＮＡ（８９μＬ）、１００ｍＭ　ＣｌｅａｎＣａｐ　ＡＧ（１５０μＬ，ＴｒｉＬｉｎｋ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｔ－７１１３）、１００ｍＭ　ＡＴＰ（１５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ１３３１）、１００ｍＭ　ＧＴＰ（１５０μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ２３３１）、１００ｍＭ　ＣＴＰ（１５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ３３３１）、１００ｍＭ　Ｎ１-ｍｅｔｈｙｌ-ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ５’-ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（１５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ５－０２７）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（１２６１μＬ，Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　１２９１１４）、Ｔ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　５×　ｂｕｆｆｅｒ（６００μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１４０Ｘ）、Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｉｘ，Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（３００μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１３７Ｘ）を混合し、３７℃で２時間インキュベーションした。ＲＱ１　ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（３０μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｍ６１０１）を混合し、３７℃で１５分インキュベーションした。８Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（１５００μＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｌ７０２６）を混合し、－２０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、３０分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒに溶解後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍａｘｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１６２）を用いて付属のマニュアル通りに精製した。得られた溶出液（１２ｍＬ、ＵＶ換算で１２．０ｍｇ）とＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（１２０μＬ）、ｒＡｐｉｄ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　０４　８９８　１４１　００１）の緩衝液（１４００μＬ）と酵素（４８０μＬ）を混合し、３７℃で３０分インキュベーションした。７５℃で２分インキュベーションした後、８Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（７０００μＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｌ７０２６）を混合し、－２０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、３０分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（２ｍＬ）に溶解した（ＵＶ換算で９．９ｍｇ）。得られたｍＲＮＡを逆相クロマトグラフィー（Ｃｏｌｕｍｎ：ＰＬＲＰ－Ｓ，４０００Å，１０μｍ，１０ｘ２００ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ：５％アセトニトリル, ４００ｍＭ酢酸トリエチルアミン（ｐＨ７．０）、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ：２５％アセトニトリル, ４００ｍＭ酢酸トリエチルアミン（ｐＨ７．０）、Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｂ％：２７．５％～３５％（２０ｍｉｎ）、Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ：５ｍＬ／ｍｉｎ、Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：８０℃）にて分取精製した。目的の画分を回収し、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５（ＭＷＣＯ：３０ｋＤａ））により脱塩処理した（ＵＶ換算で３．４ｍｇ）。

　得られたｍＲＮＡは、配列番号１７の配列を有する。ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ＲＮＡ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃ＣＬＳ９６００１０）により分析し、目的の長さであることを確認した。

[実施例６]　ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔ　ｍＲＮＡ－００６の調製
（１）ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡの作製
　実施例４－（１）と同様の方法にて実施した。

（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによるｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔ　ｍＲＮＡ－００６の調製
　実施例６－（１）で得られた３３６μｇ／ｍＬ　鋳型ＤＮＡ（８９μＬ）、１００ｍＭ　ＣｌｅａｎＣａｐ　ＡＧ（１５０μＬ，ＴｒｉＬｉｎｋ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｔ－７１１３）、１００ｍＭ　ＡＴＰ（１５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ１３３１）、１００ｍＭ　ＧＴＰ（１５０μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ２３３１）、１００ｍＭ　ＣＴＰ（１５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ３３３１）、１００ｍＭ　Ｎ１-ｍｅｔｈｙｌ-ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ５’-ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（１５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ５－０２７）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（１２６１μＬ，Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　１２９１１４）、Ｔ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　５×　ｂｕｆｆｅｒ（６００μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１４０Ｘ）、Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｉｘ，Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（３００μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１３７Ｘ）を混合し、３７℃で２時間インキュベーションした。ＲＱ１　ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（３０μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｍ６１０１）を混合し、３７℃で１５分インキュベーションした。８Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（１５００μＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｌ７０２６）を混合し、－２０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、３０分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒに溶解後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍａｘｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１６２）を用いて付属のマニュアル通りに精製した。得られた溶出液（１２ｍＬ、ＵＶ換算で１２．６ｍｇ）とＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（１００μＬ）、ｒＡｐｉｄ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　０４　８９８　１４１　００１）の緩衝液（１４００μＬ）と酵素（５００μＬ）を混合し、３７℃で３０分インキュベーションした。７５℃で２分インキュベーションした後、８Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（７０００μＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｌ７０２６）を混合し、－２０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、３０分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（２ｍＬ）に溶解した（ＵＶ換算で１０．９ｍｇ）。得られたｍＲＮＡを逆相クロマトグラフィー（Ｃｏｌｕｍｎ：ＰＬＲＰ－Ｓ，４０００Å，１０μｍ，１０ｘ２００ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ：５％アセトニトリル, ４００ｍＭ酢酸トリエチルアミン（ｐＨ７．０）、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ：２５％アセトニトリル, ４００ｍＭ酢酸トリエチルアミン（ｐＨ７．０）、Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｂ％：２７．５％～３５％（２０ｍｉｎ）、Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ：５ｍＬ／ｍｉｎ、Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：８０℃）にて分取精製した。目的の画分を回収し、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５（ＭＷＣＯ：３０ｋＤａ））により脱塩処理した（ＵＶ換算で３．７ｍｇ）。

　得られたｍＲＮＡは、配列番号２０の配列を有する。ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ＲＮＡ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃ＣＬＳ９６００１０）により分析し、目的の長さであることを確認した。

[実施例７]　ｇｐ４６－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡ－００７の調製
（１）ｇｐ４６－Ｆｉｂのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡの作製
　実施例２－（１）と同様の方法にて実施した。

（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによるｇｐ４６－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡ－００７の調製
　実施例７－（１）で得られた３９７μｇ／ｍＬ　鋳型ＤＮＡ（６３μＬ）、１００ｍＭ　ＣｌｅａｎＣａｐ　ＡＧ（５０μＬ，ＴｒｉＬｉｎｋ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｔ－７１１３）、１００ｍＭ　ＡＴＰ（５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ１３３１）、１００ｍＭ　ＧＴＰ（５０μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ２３３１）、１００ｍＭ　ＣＴＰ（５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ３３３１）、１００ｍＭ　Ｎ１-ｍｅｔｈｙｌ-ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ５’-ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ５－０２７）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（３８７μＬ，Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　１２９１１４）、Ｔ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　５×　ｂｕｆｆｅｒ（２００μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１４０Ｘ）、Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｉｘ，Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１００μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１３７Ｘ）を混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。ＲＱ１　ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（２５μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｍ６１０１）を混合し、３７℃で１５分インキュベーションした。８Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（５００μＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｌ７０２６）を混合し、－２０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、３０分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒに溶解後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍａｘｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１６２）を用いて付属のマニュアル通りに精製した。得られた溶出液（３ｍＬ、ＵＶ換算で３．６ｍｇ）とＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（３３２μＬ）、ｒＡｐｉｄ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　０４　８９８　１４１　００１）の緩衝液（４５０μＬ）と酵素（７１８μＬ）を混合し、３７℃で３０分インキュベーションした。７５℃で２分インキュベーションした後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍａｘｉ　ｋｉｔを用いて付属のマニュアル通りに精製することで目的とするｍＲＮＡを得た（４ｍＬ、ＵＶ換算で２．８ｍｇ）。

　得られたｍＲＮＡは、配列番号１８の配列を有する。ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ＲＮＡ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃ＣＬＳ９６００１０）により分析し、目的の長さであることを確認した。

[実施例８]　ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔ　ｍＲＮＡ－００８の調製
（１）ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡの作製
　実施例４－（１）と同様の方法にて実施した。

（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによるｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔ　ｍＲＮＡ－００８の調製
　実施例８－（１）で得られた３９１μｇ／ｍＬ　鋳型ＤＮＡ（６４μＬ）、１００ｍＭ　ＣｌｅａｎＣａｐ　ＡＧ（５０μＬ，ＴｒｉＬｉｎｋ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｔ－７１１３）、１００ｍＭ　ＡＴＰ（５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ１３３１）、１００ｍＭ　ＧＴＰ（５０μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ２３３１）、１００ｍＭ　ＣＴＰ（５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ３３３１）、１００ｍＭ　Ｎ１-ｍｅｔｈｙｌ-ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ５’-ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（５０μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ５－０２７）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（３８６μＬ，Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　１２９１１４）、Ｔ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　５×　ｂｕｆｆｅｒ（２００μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１４０Ｘ）、Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｉｘ，Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１００μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ１３７Ｘ）を混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。ＲＱ１　ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（２５μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｍ６１０１）を混合し、３７℃で１５分インキュベーションした。８Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（５００μＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｌ７０２６）を混合し、－２０℃で終夜静置した。遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、３０分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、５２５０×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒに溶解後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍａｘｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７５１６２）を用いて付属のマニュアル通りに精製した。得られた溶出液（３ｍＬ、ＵＶ換算で３．５ｍｇ）とＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（３５９μＬ）、ｒＡｐｉｄ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　０４　８９８　１４１　００１）の緩衝液（４５０μＬ）と酵素（６９１μＬ）を混合し、３７℃で３０分インキュベーションした。７５℃で２分インキュベーションした後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍａｘｉ　ｋｉｔを用いて付属のマニュアル通りに精製することで目的とするｍＲＮＡを得た（４ｍＬ、ＵＶ換算で２．８ｍｇ）。

［実施例９～２４］実施例１～８記載のｍＲＮＡを用いたｍＲＮＡ封入核酸脂質粒子の調製
（１）ｍＲＮＡ封入核酸脂質粒子の調製
　ジステアロイルホスファチジルコリン（１，２－Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ：以下ＤＳＰＣと表記，ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：以下Ｃｈｏｌと表記，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．）、二酢酸（７Ｒ，９Ｚ，２６Ｚ，２９Ｒ）－１８－（｛［３－（ジメチルアミノ）プロポキシ］カルボニル｝オキシ）ペンタトリアコンタ－９，２６－ジエン－７，２９－ジイル（ＷＯ２０１５／００５２５３の実施例２３に記載の化合物）（以下ＬＰ１と表記）または酢酸（７Ｒ，９Ｚ）－１８－（｛[３－（ジメチルアミノ）プロピルオキシ]カルボニル｝オキシ）オクタコサ－９－エン－７－イル（ＷＯ２０１５／００５２５３の実施例２８に記載の化合物）（以下ＬＰ２と表記）、及びポリエチレングリコール分子量が約２０００の１、２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコール（１，２－Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－Ｇｌｙｃｅｒｏ－３－Ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ、以下ＰＥＧ－ＤＭＧと表記，ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＧＭ－０２０）を、表１の記載のモル比にて、総脂質濃度５ｍＭになるようにエタノールに溶解した。

　一方、実施例１～８で得たｍＲＮＡを、クエン酸緩衝液（２０ｍＭ　Ｃｉｔｒａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ４．０）にて希釈調製した。

　上記の脂質溶液とｍＲＮＡ溶液を、ｍＲＮＡに対する総脂質重量比が表１に記載の値となり、且つその体積比が１：３となるようにＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ　ＢｅｎｃｈＴｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）を用いてマイクロ流路内で混合し、核酸脂質粒子の粗分散液を得た。核酸脂質粒子の分散液を約２５～５０倍量の緩衝液にて１２～１８時間透析（Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｇ２，ＭＷＣＯ：１，０００ｋＤ，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）することにより、エタノール除去を行い、精製されたｍＲＮＡ封入核酸脂質粒子の分散液を得た。

　尚、ＬＰ１はＷＯ２０１５／００５２５３の実施例２３に記載の方法に従い、ＬＰ２はＷＯ２０１５／００５２５３の実施例２８に記載の方法に従い合成した。

（２）ｍＲＮＡ封入核酸脂質粒子の特性評価
　（１）で調製した核酸脂質粒子を含む分散液の特性評価を行った。それぞれの特性評価の方法について説明する。

（２－１）ｍＲＮＡの封入率
　ｍＲＮＡの封入率は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ　ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ　ＲＮＡ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付文書に準じて測定した。
　すなわち、０．０１５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００界面活性剤存在下及び非存在下において、核酸脂質粒子の分散液中のｍＲＮＡを定量し、次式により封入率を算出した。
｛（［界面活性剤存在下におけるｍＲＮＡ量］－［界面活性剤非存在下におけるｍＲＮＡ量］）／［界面活性剤存在下におけるｍＲＮＡ量］｝ｘ　１００（％）

（２－２）ｍＲＮＡと脂質の比率
　核酸脂質粒子の分散液中のｍＲＮＡ量を下記のいずれかの方法にて測定した。
　核酸脂質粒子分散液を１．０％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００にて希釈調製し、逆相クロマトグラフィーにて測定した（Ｓｙｓｔｅｍ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２６０ｓｅｒｉｅｓ，Ｃｏｌｕｍｎ：Ｂｉｏｓｈｅｌｌ　Ａ４００　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ４（１０ｃｍ×４．６ｍｍ，３．４μｍ）（ＳＵＰＥＬＣＯ），Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ：０．１Ｍ　酢酸トリエチルアミン（ｐＨ７．０），Ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ：アセトニトリル，（Ｂ％）：５－５０％（０－１５ｍｉｎ），Ｆｌｏｗ　Ｒａｔｅ：１ｍＬ／ｍｉｎ，Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：７０℃，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：２６０ｎｍ）。

　核酸脂質粒子分散液を９０％メタノールに希釈溶解し、核酸脂質粒子中のｍＲＮＡ量を紫外可視分光光度計（パーキンエルマー社製、LAMBDA（商標） 465）にて測定した。ｍＲＮＡ濃度を次式により算出した。
｛［２６０ｎｍにおける吸光度］－［３５０ｎｍにおける吸光度］｝ｘ　４０　ｘ　希釈倍率（μｇ／ｍＬ）

　核酸脂質粒子の分散液中の各脂質量を逆相クロマトグラフィーにて測定した（Ｓｙｓｔｅｍ：ＤＩＯＮＥＸ　ＵｌｔｉＭａｔｅ　３０００，Ｃｏｌｕｍｎ：ＸＳｅｌｅｃｔ　ＣＳＨ　Ｃ１８（１３０Å，３．５μｍ，３．０ｍｍ×１５０ｍｍ，）（Ｗａｔｅｒｓ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　１８６００５２６３），Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ：０．２％ギ酸，Ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ：０．２％ギ酸，メタノール，（Ｂ％）：７５－１００％（０－６ｍｉｎ），１００％（６－１５ｍｉｎ），Ｆｌｏｗ　Ｒａｔｅ：０．４５ｍＬ／ｍｉｎ，Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：５０℃，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｃｏｒｏｎａ　ＣＡＤ（Ｃｈａｒｇｅｄ　Ａｅｒｏｓｏｌ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ））。

　ｍＲＮＡに対する総脂質量の比率を次式により算出した。
　［総脂質濃度］／［ｍＲＮＡ濃度］　（ｗｔ／ｗｔ）

（２－３）平均粒子径
　核酸脂質粒子の粒子径は、Ｚｅｔａ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ／Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｅｒ　ＮＩＣＯＭＰＴＭ　３８０ＺＬＳ（ＰＡＲＴＩＣＬＥ　ＳＩＺＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭＳ）にて測定した。表中の平均粒子径は体積平均粒子径を表し、±以下は、偏差を表す。

　特性評価の結果を表２に示した。

　以上の結果より、これらの核酸脂質粒子は、ｍＲＮＡの９５％以上が脂質粒子内に封入されており、約１００ｎｍから約１４０ｎｍの平均粒子径を有していることが明らかとなった。

（試験例１）
ＬＴＲレポーターアッセイ用のプラスミド構築
　ＨＴＬＶ－１　Ｔａｘ野生型（Ｕｎｉｐｒｏｔ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０３４０９）、Ｔａｘ変異型、及びＴａｘ変異型にＩｇＥ分泌シグナルを付加した分泌型Ｔａｘ変異体をコードするＤＮＡは、委託先であるＥｕｒｏｆｉｎで合成した。それぞれのＤＮＡ断片は、ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）のＮｈｅＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入し、クローニングした。また、ＨＩＶ－１　ＬＴＲ及びＨＴＬＶ－１　ＬＴＲをコードするＤＮＡは、委託先であるＥｕｒｏｆｉｎで合成した。それぞれのＤＮＡ断片は、ｐＧＬ４．１７ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＫｐｎＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入し、クローニングした。

ＨＩＶ－１　ＬＴＲ及びＨＴＬＶ－１　ＬＴＲレポーターアッセイ
　３５０　ｎｇのＴａｘ野生型、Ｔａｘ変異型、又は分泌型Ｔａｘ変異体を発現するプラスミド、１００　ｎｇのＨＩＶ－１　ＬＴＲレポータープラスミド又はＨＴＬＶ－１　ＬＴＲレポータープラスミド、並びに５０　ｎｇのｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ効率補正用のｐＲＧ－ＲＫプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）、合計５００　ｎｇのプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１遺伝子導入試薬（Ｔａｋａｒａ）を用いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎから４８時間後に、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現量とＲｅｎｉｌｌａ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現量を測定し、ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現量／Ｒｅｎｉｌｌａ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現量の比を算出して、ＨＩＶ－１　ＬＴＲ及びＨＴＬＶ－１　ＬＴＲの転写活性を評価した。

（試験例２）
Ｃ３Ｈマウスへの実施例１２の投与
　Ｃ３Ｈ／ＨｅＪＪｃｌマウスは日本クレアから入手し馴化させた。２週間間隔で、麻酔下のマウスの消毒された下腿三頭筋へ実施例１２を、５　μｇ　ｍＲＮＡ／２０　μＬ／ｍｏｕｓｅで投与した。初回は右脚へ、２回目は左脚へ投与した。脂質粒子の濃度調整および陰性対照群には、Ｂｕｆｆｅｒを用いた。

血清と脾臓細胞の調製
　脂質粒子の初回投与から２週間後および２回目投与から１週間後に、麻酔下のマウスから採血を行った。血液は常温で１時間以上静置し、３０００　ＲＰＭで１０分間遠心して血清を分離し回収した。また、麻酔下で放血死させたマウスから脾臓を採取した。脾臓は、Ｃｅｌｌ　Ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＦＡＬＣＯＮ）のメッシュとシリンジ（ＴＥＲＵＭＯ）のガスケットを使用してすり潰し、ＲＰＭＩ　１６４０（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）でｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓｕｓｐｅｎｔｉｏｎに調整した後、遠心にて細胞を回収した。上清を廃棄し、ＤＢ　Ｐｈａｒｍ　Ｌｙｓｅ　Ｌｙｓｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）を用いて赤血球の溶結処理を行った。遠心分離後ＲＰＭＩ　１６４０で再懸濁した細胞懸濁液をｍｉｎｉ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｒａｉｎｅｒｓ（株式会社ハイテック、Ｃａｔ．ＨＴ－ＡＭＳ－１４００２）に通過させた。遠心分離後に上清を廃棄して細胞を再懸濁し、細胞濃度を測定した。遠心分離後に上清を廃棄して細胞培養液（ＲＰＭＩ　１６４０に１０％　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（非働化してフィルター通過、ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　Ｍｉｘｅｄ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）、１％　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ｇｉｂｃｏ）、１％　ＭＥＭ　Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ（ｇｉｂｃｏ）、１％　ＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｇｉｂｃｏ）、１％　ＳｔｅｍＳｕｒｅ　Ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を添加）で細胞濃度を調整した。なお、遠心は、１５００　ＲＰＭで５分間、４℃で行った。

Ｔａｘ特異的なＣＴＬ誘導レベル
　調整したマウス脾臓細胞３　ｘ　１０^６個を遠心して上清を廃棄した。１Ｘ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（ｇｉｂｃｏ）で細胞を再懸濁し、遠心して上清を廃棄する工程を２度繰り返した。その後、１Ｘ　ＰＢＳで２０倍希釈にしたＴｒｕＳｔａｉｎ　ＦｃＸ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を細胞に添加し、５分間常温で静置させた。５　μＬのＨ－２Ｄ^Ｋ　ＨＴＬＶ－１　Ｔａｘ３８－４６　Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＡＲＬＨＴＨＡＬＬ－ＰＥ（ＭＢＬ）を各サンプルに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で１５分間インキュベートした。氷上にて、最終濃度が１００倍希釈となるように調整したＡＰＣ／Ｆｉｒｅ（商標）　７５０　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）とＡｎｔｉ－ＣＤ８（Ｍｏｕｓｅ）ｍＡｂ－ＦＩＴＣ（ＭＢＬ）をサンプルへと添加し、暗所で３０分間静置した。遠心して上清を廃棄し、１Ｘ　ＰＢＳで細胞を２度洗浄した。最後に細胞を４００　μＬ　ＰＢＳで再懸濁し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ）で標識された細胞を検出し、ＦｌｏｗＪｏ（確認）で解析を行った。なお、遠心は、１５００　ＲＰＭで５分間、４℃で行った。

マウス血中抗Ｔａｘ抗体価
　Ｔａｘ（ＭＹＢｉｏｓｏｕｒｃｅ）組み換えタンパク質を固相化抗原として使用するため、９６ウェル平底プレートに添加し、４℃で一晩静置した。標準曲線希釈系列は、Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を最高濃度０．２５　μｇ／ｍＬから３倍希釈で７段階作製した。各ウェルを洗浄し、ブロッキング溶液を添加して１時間常温にて静置した。血清サンプルは、ブロッキング溶液を用いて最高濃度の１００倍希釈から４倍希釈で７段階作製した。ブロッキングしたプレートを洗浄し、希釈した試料をプレートへと添加して常温で１時間静置した。検出抗体、Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ、Ｈｕｍａｎ　ａｄｓ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）、をブロッキング溶液で３０００倍に希釈して、洗浄したウェルへと添加した。１時間後に洗浄して、ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ｓｅｒａｃａｒｅ）を添加して２～３分静置し、ＴＭＢ　Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ、Ｃａｔ．５１５００－００２１）を用いて反応を停止した。プレートリーダーで、４５０　ｎｍの吸光度から５４０　ｎｍの吸光度を引いた補正吸光度を解析に使用し、抗ｇｐ４６抗体価と抗Ｔａｘ抗体価を算出した。なお、ブロッキング溶液は、１％　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％　Ｔｗｅｅｎ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を添加した１Ｘ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（ｇｉｂｃｏ）、洗浄は０．０５％のＴｗｅｅｎを添加した１Ｘ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（（１０Ｘ）　ｇｉｂｃｏ）で３回行った。

（試験例３～試験例５）
カニクイザルへの投与
　１回／２週、計４回、サルの上腕部に実施例１３及び実施例１４の脂質粒子を投与した。初回投与は右上腕部に投与し、その後は左右交互に投与した。脂質粒子投与量は、実施例１３と実施例１４のそれぞれを２５　μｇ　ｍＲＮＡずつ等量混合し、１回あたり５０　μｇ　ｍＲＮＡ／２００　μＬ／ｂｏｄｙを投与した。

（試験例３）
サル血中抗ｇｐ４６及びＴａｘ抗体価
　組換えｇｐ４６タンパク質（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）及び組み換えＴａｘタンパク質（ＭＹ　Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を９６ウェルプレートに添加し、４℃で一晩固相化した。その後、プレートウォッシャーを用いて（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳ洗浄液で３回）洗浄し、ブロッキング溶液（１％　ＢＳＡ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳ）を添加してブロッキングした。サル血漿試料希釈系列は、ブロッキング溶液を用いて最高濃度の１００倍希釈血清から、４倍希釈で７段階作製した。サルＩｇＧ濃度の標準曲線希釈系列は、サルＩｇＧ溶液（メーカー）をブロッキング溶液で最高濃度の０．２５　μｇ／ｍＬから、３倍希釈で８段階作製した。試料希釈溶液及び標準曲線希釈溶液を添加し、室温で１時間静置後、プレートウォッシャーで洗浄した。検出抗体は、ＨＲＰ標識抗サルＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をブロッキング溶液で４０００倍希釈してプレートに添加後、室温で１時間静置した。プレートウォッシャーで洗浄した後、ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＥＲＡＣＡＲＥ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、１０分間静置した。反応停止液には、ＴＭＢ　Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＥＲＡＣＡＲＥ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。プレートリーダーを用いて波長４５０　ｎｍ（対照波長５４０　ｎｍ）の吸光度を測定し、４５０　ｎｍで測定した吸光度から５４０　ｎｍで測定した吸光度を引いた補正吸光度（Ｄｅｌｔａ）を解析に用いた。標準曲線のサルＩｇＧ濃度及びＤｅｌｔａから、Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ　Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ：４　Ｐａｒａｍｅｔｅｒを用いて検量線を作成した。検量線、測定試料の希釈倍率、及びＤｅｌｔａから試料の抗ｇｐ４６及びＴａｘ抗体濃度を算出した。

（試験例４）
サルにおけるｇｐ４６及びＴａｘ特異的細胞性免疫応答
　サル末梢血からＦｉｃｏｌｌ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて分離したＰＢＭＣをＲＰＭＩ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地（１０％　ＦＢＳ　［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ］、１％　ＰＳ　［Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　Ｍｉｘｅｄ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ］、１ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ［Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］、１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ［Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］、１×ＳｔｅｍＳｕｒｅ［富士フィルム和光純薬］、１×ＭＥＭ　Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　［Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）で２×１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、ＩＦＮ－γ　ＥＬＩＳｐｏｔ　ｐｌａｔｅ（ＭＡＢＴｅｃｈ）に１００　μＬ／ｗｅｌｌで播種した。その後、ＲＰＭＩ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地で最終濃度０．１％（ｖ／ｖ）に調製したＴａｘエピトープペプチドプール（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）又は１　μｇ／ｍＬに調製したｇｐ４６組み換えタンパク質（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を１００　μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃、５％　ＣＯ_２の条件下で４８時間培養した。抗原特異的ＩＦＮ－γ産生細胞は、Ｍｏｎｋｅｙ　ＩＦＮ－γ　ＥＬＩＳｐｏｔ^ＰＬＵＳ　ｋｉｔ　（ＨＲＰ）（ＭＡＢＴｅｃｈ）を用いて検出した。抗原特異的ＩＦＮ－γ産生細胞数は、ＥＬＩＳＰＯＴアナライザー（ＣＴＬ）を用いて測定した。

（試験例５）
サル血中抗ＨＴＬＶ－１中和活性
　Ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ　ｂａｓｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（コスモバイオ）を用いて、４回目投与から２週後に採取・調製したサル血漿から、ｔｏｔａｌ　ＩｇＧを精製した。ＨＴＬＶ－１感染細胞であるＹＴ＃１細胞株に精製ＩｇＧを添加し、次にＨＴＬＶ－１非感染細胞株であるＣＥＭ細胞をＹＴ＃１細胞比一定１：１の割合で混合し、その共培養系に患者血清を添加してから一晩培養後の合胞体形成の有無率を測定検鏡した。

（試験例６）
マウス血中ｇｐ４６特異的ｔｏｔａｌ　ＩｇＧ抗体価
　ｇｐ４６（Ｒａｙ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．）組み換えタンパク質を固相化抗原として使用するため、９６ウェル平底プレートに添加し、４℃で一晩静置した。標準曲線希釈系列は、Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を最高濃度０．２５　μｇ／ｍＬから３倍希釈で７段階作製した。各ウェルを洗浄し、ブロッキング溶液を添加して１時間常温にて静置した。血清サンプルは、ブロッキング溶液を用いて最高濃度の１００倍希釈から４倍希釈で７段階作製した。ブロッキングしたプレートを洗浄し、希釈した試料をプレートへと添加して常温で１時間静置した。検出抗体、Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ、Ｈｕｍａｎ　ａｄｓ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）、をブロッキング溶液で３０００倍に希釈して、洗浄したウェルへと添加した。１時間後に洗浄して、ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ｓｅｒａｃａｒｅ）を添加して２～３分静置し、ＴＭＢ　Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ、Ｃａｔ．５１５００－００２１）を用いて反応を停止した。プレートリーダーで、４５０　ｎｍの吸光度から５４０　ｎｍの吸光度を引いた補正吸光度を解析に使用し、抗ｇｐ４６抗体価と抗Ｔａｘ抗体価を算出した。なお、ブロッキング溶液は、１％　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％　Ｔｗｅｅｎ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を添加した１Ｘ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（ｇｉｂｃｏ）、洗浄は０．０５％のＴｗｅｅｎを添加した１Ｘ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（（１０Ｘ）ｇｉｂｃｏ）で３回行った。

（試験例７）
マウスにおけるｇｐ４６及びＴａｘ特異的細胞性免疫応答
　調整したマウス脾臓細胞１０^６個／ｗｅｌｌを９６ウェルＵ底プレート（ＦＡＬＣＯＮ）に播種し、最終濃度が１０　μｇ／ｍＬとなるように調整したｇｐ４６およびＴａｘ　ｐｏｏｌｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）で３７℃、５％ＣＯ_２で刺激をした。２４時間後に培養上清を回収し、ＩＦＮ－γ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）とＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）産生の測定をキットのプロトコールどおりに行った。

（試験例８）
タンパク質発現解析
　培養中のｍＲＮＡ濃度が３　μｇ／ｍＬとなるように、実施例９、１０、１１、１２をＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加した。添加から７２時間後に培養上清と細胞ペレットを回収した。細胞ペレットは、Ｍ－ＰＥＲ（商標）　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えてＶｏｒｔｅｘにてよく混合し、１０分間常温にて静置させた。再度、Ｖｏｒｔｅｘして混合し、遠心分離後（３０００　ＲＰＭ、４℃、１０分間）に細胞溶解液を回収した。培養上清中及び細胞溶解液中のｇｐ４６タンパク質は、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法を用いて検出した。

（試験例１の結果）
ＨＩＶ－１　ＬＴＲ及びＨＴＬＶ－１　ＬＴＲの転写活性を指標としたＴａｘ抗原デザインの選抜
　Ｔａｘ野生型、Ｔａｘ変異型、及び分泌型Ｔａｘ変異体によるＨＩＶ－１　ＬＴＲ転写活性及びＨＴＬＶ－１　ＬＴＲ転写活性を評価した（図１）。その結果、Ｔａｘ野生型と比較して、Ｔａｘ変異型はＨＩＶ－１　ＬＴＲ転写活性及びＨＴＬＶ－１　ＬＴＲ転写活性の低下が認められた。また、分泌型Ｔａｘ変異体は陰性コントロールと同等のＨＩＶ－１　ＬＴＲ転写活性及びＨＴＬＶ－１　ＬＴＲ転写活性を示した。以上の結果から、ＨＩＶ－１　ＬＴＲ転写活性及びＨＴＬＶ－１　ＬＴＲ転写活性が最も低い分泌型Ｔａｘ変異体は、がん原性が最も低いワクチン抗原候補であることが示唆された。

（試験例２の結果）
実施例１２によるＣＴＬ誘導レベル及び血中抗Ｔａｘ抗体価
　実施例１２を投与したＣ３ＨマウスにおけるＣＴＬ誘導レベルを評価した（図２）。その結果、実施例１２によって、Ｔａｘ特異的ＣＴＬ及び血中抗Ｔａｘ抗体応答が誘導された。

（試験例３の結果）
サル血中抗ｇｐ４６及びＴａｘ抗体価
　実施例１３及び実施例１４を等量混合した脂質粒子製剤によって誘導される血中抗ｇｐ４６抗体応答及び血中抗Ｔａｘ抗体応答を評価した（図３）。その結果、投与前（０Ｗ）と比較して、２回投与後（４Ｗ）及び３回投与後（６Ｗ）は、血中抗ｇｐ４６抗体価及び抗Ｔａｘ抗体価が高かった。

（試験例４の結果）
サルＰＢＭＣ中のｇｐ４６及びＴａｘ特異的なＩＦＮ－γ産生細胞レベル
　実施例１３及び実施例１４の混合製剤によって誘導される血中抗ｇｐ４６抗体応答及び血中抗Ｔａｘ抗体応答を評価した（図４）。４回目投与から７週後に採取・調製したＰＢＭＣを用いて検討した結果、実施例５及び実施例６の混合製剤群は、ｇｐ４６特異的及びＴａｘ特異的なＩＦＮ－γ産生細胞の誘導が認められた。

（試験例５の結果）
サル血中抗ＨＴＬＶ－１中和活性
　実施例１３及び実施例１４の混合製剤によって誘導される血中抗ＨＴＬＶ－１中和活性を評価した（図５）。４回目投与から２週後に採取・精製した血中ｔｏｔａｌ　ＩｇＧを用いて検討した結果、陰性対照群と比較して、脂質粒子投与群の４頭中３頭で、血中抗ＨＴＬＶ－１中和活性が認められた。

（試験例６の結果）
マウス血中抗ｇｐ４６抗体価
　実施例９、実施例１０、実施例１１又は実施例１２の脂質粒子の投与によって誘導される血中抗ｇｐ４６抗体応答を評価した（図６）。その結果、陰性対照群と比較して、実施例９群、実施例１０群、及び実施例１１群では高い血中抗ｇｐ４６抗体応答が認められた。

（試験例７の結果）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｇｐ４６特異的及びＴａｘ特異的な細胞性免疫応答
　実施例９、実施例１０、実施例１１、又は実施例１２の脂質粒子の投与によって誘導されるｇｐ４６特異的及びＩＬ－２特異的細胞性免疫をＩＦＮ－γ産生レベル及びＩＬ－２産生レベルを指標として評価した（図７）。その結果、陰性対照群と比較して、実施例９群、実施例１０群、及び実施例１１群では、高いｇｐ４６特異的な細胞性免疫応答が認められた。また、陰性対照群と比較して、実施例１２群では、高いＴａｘ特異的な細胞性免疫応答が認められた。

（試験例８の結果）
実施例９から実施例１２の脂質粒子による抗原タンパク質の発現レベル
　実施例９から実施例１２で処理したＣＨＯ－Ｓ細胞の培養上清中及び細胞溶解液中の各脂質粒子が発現する抗原タンパク質の発現レベルを評価した（図８）。その結果、各脂質粒子が発現する抗ｇｐ４６抗体が結合する抗原タンパク質の発現が認められた。なお、ｇｐ４６タンパク質は、３９　ｋＤａである。

［実施例２５～２９］　ｇｐ４６－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡの調製
（１）ｇｐ４６－Ｆｉｂのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡの作製
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）に用いる鋳型ＤＮＡを作製するためにプラスミドを構築した。Ｔ７プロモーター配列、ｈｕｍａｎ　β－ｇｌｏｂｉｎの５’－ＵＴＲ配列、ＫＯＺＡＫ配列、ｇｐ４６－Ｆｉｂの翻訳領域、ｈｕｍａｎ　β－ｇｌｏｂｉｎの３’－ＵＴＲ配列及びｐｏｌｙＡ配列が順に連結した配列を含むＤＮＡ断片（配列番号２１～２５）を導入したプラスミドを作製した（配列番号２１～２５のＤＮＡ断片を導入したプラスミドをそれぞれ用いて実施例２５～２９を実施した。）。

（２）鋳型ＤＮＡのリニアライズ化
　（１）で得られたプラスミド（３００　μｇ）を溶解したＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（２６８　μＬ）に１０×　ＮＥＢｕｆｆｅｒ　３．１、ＢｓｐＱＩ（３２　μＬ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ０７１２Ｌ）を加え、５０℃で１６時間インキュベーション後、８０℃で２０分インキュベーションした。エタノール（９００　μＬ）、３　ｍｏｌ／Ｌ　酢酸ナトリウム溶液（３０　μＬ）を混合し、－８０℃で４時間静置した。遠心分離（４℃、１５０００×ｇ、３０分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、１５０００×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　で５００　μｇ／ｍＬの溶液に調製した。

（３）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによるｇｐ４６－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡの調製
　（２）で得られた５００　μｇ／ｍＬ　鋳型ＤＮＡ（１５　μＬ）、１００　ｍＭ　ＣｌｅａｎＣａｐ　ＡＧ（１５　μＬ，　ＴｒｉＬｉｎｋ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｎ－７１１３）、１００　ｍＭ　ＡＴＰ（１５　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ１３３１）、１００　ｍＭ　ＧＴＰ（１５　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ２３３１）、１００　ｍＭ　５－Ｍｅ－ＣＴＰ（１５　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ３－０２９）、１００　ｍＭ　５－Ｍｅ－ＵＴＰ（１５　μＬ，　Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｒ５－１０４）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（１１３　μＬ）、５×ＩＶＴ　ｂｕｆｆｅｒ　（６０　μＬ，　４００　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．５，　４００　ｍＭ　ＤＴＴ，　１２０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０　ｍＭ　Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ　）、Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１５　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ４０７Ｘ）、ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１５　μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｐ２６１Ｘ）、Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（７．５　μＬ，Ｈｏｎｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＯＮ－０２５）を混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。ＲＱ１　ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（７．５　μＬ，　Ｐｒｏｍｅｇａ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｍ６１０１）を混合し、３７℃で３０分間インキュベーションした。１０　Ｍ　酢酸アンモニウム溶液（１００　μＬ，）を混合し、－２０℃で２時間静置した。遠心分離（４℃、１５０００×ｇ、３０分）後、上澄みを廃棄、７０％エタノールを加え、遠心分離（４℃、１５０００×ｇ、１０分）後、上澄みを廃棄し風乾した。得られた残渣をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒに溶解し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ　ｃａｔａｌｏｇ　＃　７４０９４８．５０）にて精製し、目的とするｍＲＮＡを得た。

　得られたｍＲＮＡは、配列番号３１～３５の配列を有し、５’末端にｃａｐ１構造をもち、シチジン及びウリジンがそれぞれ５－メチルシチジン及び５－メチルウリジンに置換されたものである。ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ＲＮＡ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　ｃａｔａｌｏｇ　＃ＣＬＳ９６００１０）により分析し、目的の長さであることを確認した。

［実施例３０～３４］　実施例２５～２９で得られたｍＲＮＡを封入した核酸脂質粒子の調製
（１）ｍＲＮＡ封入核酸脂質粒子の調製
　実施例１～８に記載のｍＲＮＡの代わりに実施例２５～２９で得られたｍＲＮＡをそれぞれ用いて実施例９～２４と同様の方法にて、表３に記載の核酸脂質粒子を調製した。

（２）ｍＲＮＡ封入核酸脂質粒子の特性評価
　実施例９～２４と同様の方法にて、核酸脂質の特性評価を実施し、結果を表４に示した。

（試験例９）
ｇｐ４６タンパク質発現解析
　培地中のｍＲＮＡ濃度が３　μｇ／ｍＬとなるように、実施例３０～３４をＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加した。また、陰性コントロールとして、実施例３５～３９の粒子の添加液量と等量のＢｕｆｆｅｒを添加した。添加から３日後に培養上清を回収した。培養上清中のｇｐ４６タンパク質は、Ｄ－ＰＢＳで１０倍に希釈した培養上清を９６　ｈａｌｆ　ｗｅｌｌプレートに固相化し、実施例１０を投与したマウスの血清を用いたＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法によって検出した。

（試験例９の結果）
実施例３０～３４のｇｐ４６発現誘導能
　実施例３０～３４で処理したＣＨＯ－Ｓ細胞の培養上清中のｇｐ４６タンパク質発現レベルを評価した。その結果、実施例３０～３４で処理したＣＨＯ－Ｓ細胞は、ｇｐ４６タンパク質を発現した（図２８）。

　本発明は、ＨＴＬＶ－１による感染の予防及び/又は治療に利用できる。

　配列番号１：ＳＵ　ｇｐ４６　ＩＶＴ用の鋳型プラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列
　配列番号２：センスプライマーのヌクレオチド配列
　配列番号３：アンチセンスプライマーのヌクレオチド配列
　配列番号４：ＳＵ　ｇｐ４６のｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列
　配列番号５：ＨＴＬＶ－Ｉ　ｇｐ４６－Ｆｉｂ　ＩＶＴ用の鋳型プラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列
　配列番号６：ｇｐ４６－Ｆｉｂのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列
　配列番号７：ＨＴＬＶ－Ｉ　ｄｇｐ６２－Ｆｉｂ　ＩＶＴ用の鋳型プラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列
　配列番号８：ｄｇｐ６２－Ｆｉｂのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列
　配列番号９：ＨＴＬＶ－Ｉ　ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔ　ＩＶＴ用の鋳型プラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列
　配列番号１０：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｉｎｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）用の鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列
　配列番号１１：Ｔａｘ野生型のアミノ酸配列
　配列番号１２：Ｔａｘ変異型（Ｔ１３０Ａ／Ｌ１３１Ｓ／Ｌ３１９Ｒ／Ｌ３２０Ｓ）のアミノ酸配列
　配列番号１３：分泌型Ｔａｘ変異体（Ｔ１３０Ａ／Ｌ１３１Ｓ／Ｌ３１９Ｒ／Ｌ３２０Ｓ）のアミノ酸配列
　配列番号１４：ｇｐ４６のアミノ酸配列
　配列番号１５：ｇｐ４６－Ｆｉｂのアミノ酸配列
　配列番号１６：ｄｇｐ６２－Ｆｉｂのアミノ酸配列
　配列番号１７：ＳＵ　ｇｐ４６　ｍＲＮＡ
　配列番号１８：ｇｐ４６－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡ
　配列番号１９：ｄｇｐ６２－Ｆｉｂ　ｍＲＮＡ
　配列番号２０：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔ　ｍＲＮＡ
　配列番号２１：ｇｐ４６－Ｆｉｂの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ９５
　配列番号２２：ｇｐ４６－Ｆｉｂの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ８０
　配列番号２３：ｇｐ４６－Ｆｉｂの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ６０
　配列番号２４：ｇｐ４６－Ｆｉｂの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ４０
　配列番号２５：ｇｐ４６－Ｆｉｂの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ２０
　配列番号２６：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ９５
　配列番号２７：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ８０
　配列番号２８：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ６０
　配列番号２９：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ４０
　配列番号３０：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔの鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列　ｐｏｌｙＡ２０
　配列番号３１：ｇｐ４６－ＦｉｂのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ９５
　配列番号３２：ｇｐ４６－ＦｉｂのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ８０
　配列番号３３：ｇｐ４６－ＦｉｂのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ６０
　配列番号３４：ｇｐ４６－ＦｉｂのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ４０
　配列番号３５：ｇｐ４６－ＦｉｂのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ２０
　配列番号３６：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ９５
　配列番号３７：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ８０
　配列番号３８：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ６０
　配列番号３９：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ４０
　配列番号４０：ｓｅｃ　Ｔａｘ　ｍｕｔａｎｔのｍＲＮＡ配列　ｐｏｌｙＡ２０
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims

　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原を発現させることができる核酸を封入した脂質粒子であって、脂質が一般式（Ｉａ）で表されるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩を含む前記粒子。

式中、
Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル基を示し；
Ｌ^１は、Ｃ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１７－Ｃ_１９アルケニル基を示し；
Ｌ^２は、Ｃ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルキル基、又はＣ_２－Ｃ_４アルカノイルオキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルケニル基を示し；
ｐは、３、又は４である。
　一般式（Ｉａ）中のＲ^１及びＲ^２が、共にメチル基である、請求項１に記載の粒子。
　一般式（Ｉａ）中のｐが、３である請求項１又は２に記載の粒子。
　一般式（Ｉａ）中のＬ^１が、アセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１７－Ｃ_１９アルケニル基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の粒子。
　一般式（Ｉａ）中のＬ^２が、アセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１２アルキル基、又はアセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１９アルケニル基である、請求項１～４のいずれか１項に記載の粒子。
　一般式（Ｉａ）中のＬ^２が、アセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１０－Ｃ_１２アルキル基、又はアセトキシ基を１若しくは複数個有していてもよいＣ_１７－Ｃ_１９アルケニル基である、請求項１～４のいずれか１項に記載の粒子。
　一般式（Ｉａ）中のＬ^１が、（Ｒ）－１１－アセチルオキシ－ｃｉｓ－８－ヘプタデセニル基、ｃｉｓ－８－ヘプタデセニル基、又は（８Ｚ，１１Ｚ）－ヘプタデカジエニル基である請求項１～６のいずれか１項に記載の粒子。
　一般式（Ｉａ）中のＬ^２が、デシル基、ｃｉｓ－７－デセニル基、ドデシル基、又は（Ｒ）－１１－アセチルオキシ－ｃｉｓ－８－ヘプタデセニル基である、請求項１～７のいずれか１項に記載の粒子。
　カチオン性脂質が下記の構造式：

で表される請求項１に記載の粒子。
　カチオン性脂質が下記の構造式：

で表される請求項１に記載の粒子。
　カチオン性脂質が下記の構造式：

で表される請求項１に記載の粒子。
　脂質が、さらに、両親媒性脂質、ステロール類及びＰＥＧ脂質を含む請求項９又は１０に記載の粒子。
　脂質が、さらに、両親媒性脂質、ステロール類及びＰＥＧ脂質を含む請求項１１に記載の粒子。
　両親媒性脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１２に記載の粒子。
　両親媒性脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１３に記載の粒子。
　ステロール類がコレステロールである請求項１２又は１４に記載の粒子。
　ステロール類がコレステロールである請求項１３又は１５に記載の粒子。
　ＰＥＧ脂質が、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコール及び／又はＮ－［メトキシ　ポリ（エチレングリコール）２０００］カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミンである請求項１２、１４、１６のいずれか１項に記載の粒子。
　ＰＥＧ脂質が、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール　メトキシポリエチレン　グリコール及び／又はＮ－［メトキシ　ポリ（エチレングリコール）２０００］カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミンである請求項１３、１５、１７のいずれか１項に記載の粒子。
　両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が５～２５％、ステロール類が１０～５５％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～５％である請求項１２～１９のいずれか１項に記載の粒子。
　両親媒性脂質が１０～２５％である請求項２０に記載の粒子。
　両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が５～１５％、ステロール類が３５～５０％、カチオン性脂質が４０～５５％、ＰＥＧ脂質が１～３％である請求項１２、１４、１６、１８のいずれか１項に記載の粒子。
　両親媒性脂質が１０～１５％、ステロール類が３５～４５％、カチオン性脂質が４０～５０％、ＰＥＧ脂質が１～２．５％である請求項２２に記載の粒子。
　ＰＥＧ脂質が１～２％である請求項２３に記載の粒子。
　両親媒性脂質、ステロール類、カチオン性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質組成が、モル量にて、両親媒性脂質が１０～２５％、ステロール類が１０～５０％、カチオン性脂質が４０～６５％、ＰＥＧ脂質が１～３％である請求項１３、１５、１７、１９のいずれか１項に記載の粒子。
　ステロール類が１０～４５％、カチオン性脂質が４２．５～６５％、ＰＥＧ脂質が１～２．５％である請求項２５に記載の粒子。
　ＰＥＧ脂質が１～２％である請求項２６に記載の粒子。
　核酸重量に対する総脂質重量の比率が１５～３０である請求項２０～２７のいずれか１項に記載の粒子。
　核酸重量に対する総脂質重量の比率が１５～２５である請求項２８に記載の粒子。
　核酸重量に対する総脂質重量の比率が１７．５～２２．５である請求項２９に記載の粒子。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原がオリゴマー化ドメインとの融合タンパク質である請求項１～３０のいずれか１項に記載の粒子。
　オリゴマー化ドメインがフィブリチンである請求項３１に記載の粒子。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原が配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項３１又は３２に記載の粒子。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のＴａｘ抗原が、配列番号１１のアミノ酸配列に対して、Ｔ１３０Ａ、Ｌ１３１Ｓ、Ｌ３１９Ｒ及びＬ３２０Ｓからなる群から選択される変異の少なくとも１つを有し、該変異アミノ酸以外のアミノ酸配列を比較した場合、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項１～３３のいずれか１項に記載の粒子。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のＴａｘ抗原が、配列番号１１のアミノ酸配列に対して、Ｔ１３０Ａ、Ｌ１３１Ｓ、Ｌ３１９Ｒ及びＬ３２０Ｓの変異を有し、該変異アミノ酸以外のアミノ酸配列を比較した場合、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項３４に記載の粒子。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のＴａｘ抗原が、シグナルペプチドとの融合タンパク質である請求項１～３５のいずれか１項に記載の粒子。
　シグナルペプチドが配列番号１３のアミノ酸配列の１番目～１８番目のアミノ酸配列からなるペプチドである請求項３６に記載の粒子。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原を発現させることができる核酸が、キャップ構造（Ｃａｐ）、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）ｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原の翻訳領域、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）及びポリＡ尾部（ｐｏｌｙＡ）を含むｍＲＮＡである請求項３１～３７のいずれか１項に記載の粒子。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原を発現させることができる核酸の配列が、配列番号１７又は１８の配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる請求項３８に記載の粒子。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のＴａｘ抗原を発現させることができる核酸の配列が、配列番号２０の配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる請求項３８に記載の粒子。
　核酸が少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む請求項１～４０のいずれか１項に記載の粒子。
　修飾ヌクレオチドが、５位が置換したピリミジンヌクレオチド及び／又は１位が置換していてもよいシュードウリジンの少なくとも１個を含む請求項４１に記載の粒子。
　修飾ヌクレオチドが、５－メチルシチジン、５－メトキシウリジン、５－メチルウリジン、シュードウリジン、及び１－アルキルシュードウリジンからなる群から選ばれる少なくとも１個を含む請求項４１に記載の粒子。
　修飾ヌクレオチドが、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、及び１－メチルシュードウリジンからなる群から選ばれる少なくとも１個を含む請求項４１に記載の粒子。
　平均粒子径が３０～３００ｎｍである請求項１～４４のいずれか１項に記載の粒子。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）による感染を予防及び／又は治療するための組成物を製造するための請求項１～４５のいずれか１項に記載の粒子の使用。
　請求項１～４５のいずれか１項に記載の粒子を含有する、組成物。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原をｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで発現させるための請求項４７に記載の組成物。
　医薬として用いられる請求項４７又は４８に記載の組成物。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）に対する免疫反応を誘導するための請求項４９に記載の組成物。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）感染を予防及び／又は治療するための請求項４９又は５０に記載の組成物。
　ＨＴＬＶ－１感染者に対して、成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）及びＨＴＬＶ－１ぶどう膜炎（ＨＵ）からなる群から選択されるＨＴＬＶ－１に起因する疾患の発症の予防及び／又は治療するための請求項４９又は５０に記載の組成物。
　請求項４７～５０のいずれか１項に記載の組成物を細胞に導入することを含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原をｉｎ　ｖｉｔｒｏで発現させる方法。
　請求項４７～５１のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）のｇｐ４６抗原又はＴａｘ抗原をｉｎ　ｖｉｖｏで発現させる方法。
　請求項４９又は５０に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）に対する免疫反応を誘導する方法。
　請求項４９～５２のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）感染を予防及び／又は治療する方法。
　請求項４９～５２のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）及びＨＴＬＶ－１ぶどう膜炎（ＨＵ）からなる群から選択されるＨＴＬＶ－１に起因する疾患の発症を予防及び／又は治療する方法。