KR20240009944A - Htlv-1 핵산 지질 입자 백신 - Google Patents

Htlv-1 핵산 지질 입자 백신 Download PDF

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다쿠야 후쿠시마
유에츠 다나카
후미히코 다케시타
마코토 고이즈미
다카코 니와
쇼코 노구사
나오 조나이
요시쿠니 오노데라
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고쿠리츠 켄큐 카이하츠 호진 이야쿠 키반 켄코 에이요 켄큐쇼
고쿠리츠다이가쿠호진 류큐다이가쿠
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (Human T-cell Leukemia Virus type 1 : HTLV-1) 에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신의 제공.
인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자로서, 지질이 일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 상기 입자.
Figure pct00021

식 중, R1 및 R2 는, 독립적으로, C1-C3 알킬기를 나타내고 ; L1 은, C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C17-C19 알케닐기를 나타내고 ; L2 는, C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알킬기, 또는 C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알케닐기를 나타내고 ; p 는, 3, 또는 4 이다.

Description

HTLV-1 핵산 지질 입자 백신
본 발명은, HTLV-1 mRNA 를 봉입한 핵산 지질 입자 백신에 관한 것이다.
Human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) 은, 암원성이 높은 레트로바이러스이다. 전 세계에 1000 만명 ∼ 2000 만명의 HTLV-1 감염자가 존재하며, 일본에서도 100 만명의 감염자가 존재한다 (비특허문헌 1). HTLV-1 감염자의 3 ∼ 5 ％ 는 성인 T 세포 백혈병 (Adult T-cell leukemia, ATL) 을 발증하고, 예후가 나쁘다. 현 시점에서, HTLV-1 감염의 예방 백신 및 ATL 발증 예방약은 존재하지 않는다. 또, ATL 의 만족스러운 치료 효과에 기여하는 표준 치료도 확립되어 있지 않다. 예를 들어, 표준 치료 중 하나인 다제 병용의 화학 요법은, 장기 생존자가 10 ％ 미만이다.
최근, ATL 환자에 대하여 동종 조혈 줄기 세포 이식이 실시되게 되어, 일부의 환자에게서는 높은 치료 효과가 얻어지게 되었다. 동종 조혈 줄기 세포 이식의 항종양 효과는, 대량의 항암제나 전신에 대한 방사선 조사를 사용한 이식 전처치의 효과에 추가하여, 이식 후에 도너의 면역 담당 세포에 의한 항종양 효과 (graft versus leukemia 효과 ; GVL 효과) 의 기여를 생각할 수 있다 (비특허문헌 2). 특히, HTLV-1 복제에 필수적인 전사 활성화 인자 Tax 에 특이적인 세포 상해성 T 세포 (cytotoxic T lymphocyte ; CTL) 가 증가하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 3). 그러나, 동종 조혈 줄기 세포 이식의 부반응인 이식편 대 숙주병 (graft versus host disease ; GVHD) 에 의한 사망률이 높다.
Tax 는 NF-kB 의 활성화능을 갖고, HTLV-1 복제에 필수적인 단백질이다 (비특허문헌 4). 또, Tax 를 통한 과잉의 NF-kB 활성화는, HTLV-1 감염 세포나 ATL 세포에도 확인되고 있으며, Tax 의 NF-kB 활성화와 감염 세포의 암화가 상관하는 것이 밝혀져 있다 (비특허문헌 5, 비특허문헌 6). 또, 비특허문헌 7 에서는, Tax 의 NF-kB 활성화에 중요한 아미노산이 동정되어 있고, 그들 아미노산에 점 변이를 삽입한 Tax 변이체를 사용하여, Tax 에 의한 NF-kB 활성화의 작용 기전이 해석되어 있다 (비특허문헌 8, 비특허문헌 9). 그러나, Tax 나 Tax 변이체를 사용한 HTLV-1 을 예방하거나, 또는 치료하는 효과적인 백신의 예는 없다.
인간 말초혈 단핵 세포 (human peripheral blood mononuclear cells ; hPBMCs) 를 이식한 면역 부전 마우스를 사용한 HTLV-1 감염 실험의 결과로부터, HTLV-1 감염은 HTLV-1 의 엔벨로프 단백질인 gp46 을 표적으로 하는 항 gp46 항체에 의해 중화되는 것이 밝혀져 있다 (비특허문헌 10). 또, 래트를 사용한 수직감염 모델에 있어서, 중화 활성을 갖는 항 gp46 항체가 수직 감염을 예방할 가능성도 시사되어 있다. 그러나, gp46 을 사용한 HTLV-1 을 예방하거나, 또는 치료하는 효과적인 백신의 예는 없다.
항원을 코드하는 mRNA 를 지질 나노 입자 (lipid nano-particle, LNP) 에 봉입한 LNP 제제 (LNP-mRNA) 로는, SARS-CoV-2 백신 (비특허문헌 11), 또는, 인플루엔자 백신 (특허문헌 1) 이 알려져 있다.
국제공개 제2015/164674호 팸플릿
Front Microbiol. (2012) 3 : 388. Blood (2012) 119 (10) : 2409-2416. Cancer Research (2010) 70 (15) : 6181-6192. Lancet Infect Dis (2007) 7 : 266-281. Front Microbiol. (2012) 3 : 406. Viruses (2011) 3 (6) : 714-749. Gene Dev. (1990) 4 : 1875. J. Biochem. (2011) 150 (6) : 679-686. J. Biol Chem. (2006) 281 (19) : 13075-13082. Viruses (2016) 8 (2) : 41. Science (2021) 371 : 1152.
본 발명은, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (Human T-cell Leukemia Virus type 1 : HTLV-1) 에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, HTLV-1 mRNA 를 봉입한 핵산 지질 입자 (LNP-mRNA) 를, 성인 T 세포 백혈병에 대한 치료 및 발증 예방에 적용할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다. 구체적으로는, HTLV-1 Tax 및 gp46 을 발현하는 mRNA 를 봉입한 LNP-mRNA-HTLV-1 을 제조하고, 또, LNP-mRNA-HTLV-1 을 투여한 마우스 및 원숭이에 있어서, HTLV-1 Tax 및 gp46 에 대한 항체 산생 및 CTL, 그리고 HTLV-1 감염 세포의 증식을 저해하는 중화 활성이 유도되는 것을 알아냈다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자로서, 지질이 일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 상기 입자.
[화학식 1]
Figure pct00001
식 중,
R1 및 R2 는, 독립적으로, C1-C3 알킬기를 나타내고 ;
L1 은, C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C17-C19 알케닐기를 나타내고 ;
L2 는, C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알킬기, 또는 C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알케닐기를 나타내고 ;
p 는, 3, 또는 4 이다.
(2) 일반식 (Ia) 중의 R1 및 R2 가, 모두 메틸기인, (1) 에 기재된 입자.
(3) 일반식 (Ia) 중의 p 가, 3 인 (1) 또는 (2) 에 기재된 입자.
(4) 일반식 (Ia) 중의 L1 이, 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C17-C19 알케닐기인, (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(5) 일반식 (Ia) 중의 L2 가, 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알케닐기인, (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(6) 일반식 (Ia) 중의 L2 가, 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C17-C19 알케닐기인, (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(7) 일반식 (Ia) 중의 L1 이, (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기, cis-8-헵타데세닐기, 또는 (8Z,11Z)-헵타데카디에닐기인 (1) ∼ (6) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(8) 일반식 (Ia) 중의 L2 가, 데실기, cis-7-데세닐기, 도데실기, 또는 (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기인, (1) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(9) 카티온성 지질이 하기의 구조식 :
[화학식 2]
Figure pct00002
으로 나타내는 (1) 에 기재된 입자.
(10) 카티온성 지질이 하기의 구조식 :
[화학식 3]
Figure pct00003
으로 나타내는 (1) 에 기재된 입자.
(11) 카티온성 지질이 하기의 구조식 :
[화학식 4]
Figure pct00004
으로 나타내는 (1) 에 기재된 입자.
(12) 지질이, 추가로, 양 (兩) 친매성 지질, 스테롤류 및 PEG 지질을 포함하는 (9) 또는 (10) 에 기재된 입자.
(13) 지질이, 추가로, 양친매성 지질, 스테롤류 및 PEG 지질을 포함하는 (11) 에 기재된 입자.
(14) 양친매성 지질이, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 (12) 에 기재된 입자.
(15) 양친매성 지질이, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 (13) 에 기재된 입자.
(16) 스테롤류가 콜레스테롤인 (12) 또는 (14) 에 기재된 입자.
(17) 스테롤류가 콜레스테롤인 (13) 또는 (15) 에 기재된 입자.
(18) PEG 지질이, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤메톡시폴리에틸렌글리콜 및/또는 N-[메톡시폴리(에틸렌글리콜)2000]카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민인 (12), (14), (16) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(19) PEG 지질이, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤메톡시폴리에틸렌글리콜 및/또는 N-[메톡시폴리(에틸렌글리콜)2000]카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민인 (13), (15), (17) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(20) 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 5 ∼ 25 ％, 스테롤류가 10 ∼ 55 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 인 (12) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(21) 양친매성 지질이 10 ∼ 25 ％ 인 (20) 에 기재된 입자.
(22) 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 5 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 50 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 55 ％, PEG 지질이 1 ∼ 3 ％ 인 (12), (14), (16), (18) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(23) 양친매성 지질이 10 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 50 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2.5 ％ 인 (22) 에 기재된 입자.
(24) PEG 지질이 1 ∼ 2 ％ 인 (23) 에 기재된 입자.
(25) 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 25 ％, 스테롤류가 10 ∼ 50 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 3 ％ 인 (13), (15), (17), (19) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(26) 스테롤류가 10 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 42.5 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2.5 ％ 인 (25) 에 기재된 입자.
(27) PEG 지질이 1 ∼ 2 ％ 인 (26) 에 기재된 입자.
(28) 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 15 ∼ 30 인 (20) ∼ (27) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(29) 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 15 ∼ 25 인 (28) 에 기재된 입자.
(30) 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 17.5 ∼ 22.5 인 (29) 에 기재된 입자.
(31) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원이 올리고머화 도메인과의 융합 단백질인 (1) ∼ (30) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(32) 올리고머화 도메인이 피브리틴인 (31) 에 기재된 입자.
(33) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원이 서열 번호 14 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 (31) 또는 (32) 에 기재된 입자.
(34) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 Tax 항원이, 서열 번호 11 의 아미노산 서열에 대하여, T130A, L131S, L319R 및 L320S 로 이루어지는 군에서 선택되는 변이 중 적어도 1 개를 갖고, 그 변이 아미노산 이외의 아미노산 서열을 비교한 경우, 서열 번호 11 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 (1) ∼ (33) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(35) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 Tax 항원이, 서열 번호 11 의 아미노산 서열에 대하여, T130A, L131S, L319R 및 L320S 의 변이를 갖고, 그 변이 아미노산 이외의 아미노산 서열을 비교한 경우, 서열 번호 11 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 (34) 에 기재된 입자.
(36) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 Tax 항원이, 시그널 펩티드와의 융합 단백질인 (1) ∼ (35) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(37) 시그널 펩티드가 서열 번호 13 의 아미노산 서열의 1 번째 ∼ 18 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인 (36) 에 기재된 입자.
(38) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산이, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), gp46 항원 또는 Tax 항원의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 미부 (尾部) (polyA) 를 포함하는 mRNA 인 (31) ∼ (37) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(39) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원을 발현시킬 수 있는 핵산의 서열이, 서열 번호 17 또는 18 의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (38) 에 기재된 입자.
(40) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산의 서열이, 서열 번호 20 의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (38) 에 기재된 입자.
(41) 핵산이 적어도 1 개의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 (1) ∼ (40) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(42) 수식 뉴클레오티드가, 5 위치가 치환된 피리미딘 뉴클레오티드 및/또는 1 위치가 치환되어 있어도 되는 슈도우리딘 중 적어도 1 개를 포함하는 (41) 에 기재된 입자.
(43) 수식 뉴클레오티드가, 5-메틸시티딘, 5-메톡시우리딘, 5-메틸우리딘, 슈도우리딘, 및 1-알킬슈도우리딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 포함하는 (41) 에 기재된 입자.
(44) 수식 뉴클레오티드가, 5-메틸시티딘, 5-메틸우리딘, 및 1-메틸슈도우리딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 포함하는 (41) 에 기재된 입자.
(45) 평균 입자경이 30 ∼ 300 ㎚ 인 (1) ∼ (44) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(46) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물을 제조하기 위한 (1) ∼ (45) 중 어느 하나에 기재된 입자의 사용.
(47) (1) ∼ (45) 중 어느 하나에 기재된 입자를 함유하는, 조성물.
(48) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 in vivo 또는 in vitro 에서 발현시키기 위한 (47) 에 기재된 조성물.
(49) 의약으로서 사용되는 (47) 또는 (48) 에 기재된 조성물.
(50) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 (49) 에 기재된 조성물.
(51) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 (49) 또는 (50) 에 기재된 조성물.
(52) HTLV-1 감염자에 대하여, 성인 T 세포 백혈병·림프종 (ATLL), HTLV-1 관련 척수증 (HAM) 및 HTLV-1 포도막염 (HU) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 HTLV-1 에서 기인하는 질환의 발증의 예방 및/또는 치료하기 위한 (49) 또는 (50) 의 조성물.
(53) (47) ∼ (50) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 in vitro 에서 발현시키는 방법.
(54) (47) ∼ (51) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 in vivo 에서 발현시키는 방법.
(55) (49) 또는 (50) 에 기재된 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
(56) (49) ∼ (52) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법.
(57) (49) ∼ (52) 중 어느 하나의 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 성인 T 세포 백혈병·림프종 (ATLL), HTLV-1 관련 척수증 (HAM) 및 HTLV-1 포도막염 (HU) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 HTLV-1 에서 기인하는 질환의 발증을 예방 및/또는 치료하는 방법.
(58) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 Tax 항원으로서, 발암성을 저감 또는 소실시키는 변이를 갖는 Tax 항원과 시그널 펩티드를 융합시킨 펩티드.
(59) Tax 항원이, 서열 번호 11 의 아미노산 서열에 대하여, T130A, L131S, L319R 및 L320S 로 이루어지는 군에서 선택되는 변이 중 적어도 1 개를 갖고, 그 변이 아미노산 이외의 아미노산 서열을 비교한 경우, 서열 번호 11 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 (58) 의 펩티드.
(60) 시그널 펩티드가 서열 번호 13 의 아미노산 서열의 1 번째 ∼ 18 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인 (58) 또는 (59) 의 펩티드.
(61) 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산이, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), gp46 항원 또는 Tax 항원의 번역 영역 및 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 으로 이루어지는 구성을 포함하는 mRNA 인 (31) ∼ (37) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(62) 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), gp46 항원 또는 Tax 항원의 번역 영역 및 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 으로 이루어지는 구성이, 서열 번호 17 의 1 번째 내지 1141 번째의 서열 또는 서열 번호 18 의 1 번째 내지 1222 번째의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열인 (61) 에 기재된 입자.
(63) 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), gp46 항원 또는 Tax 항원의 번역 영역 및 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 으로 이루어지는 구성이, 서열 번호 20 의 1 번째 내지 1315 번째의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열인 (61) 에 기재된 입자.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본 특허출원번호 2021-084942호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명에 의해, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하는 것이 가능해진다. 또, 본 발명에 의해 HTLV-1 에 의한 감염에서 기인하는 질환을 예방 및/또는 치료하는 것이 가능해진다. 또, 본 발명의 입자는, 대사 안정성, in vitro 활성, in vivo 활성, 약효 발현의 속도, 약효의 지속성, 물리적 안정성, 약물 상호 작용, 안전성 등의 점에서 우수한 성질을 갖고, 상기 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약으로서 유용하다.
도 1 은, Tax 야생형, Tax 변이형, 및 분비형 Tax 변이체에 의한 HIV-1 LTR 전사 활성 (A) 및 HTLV-1 LTR 전사 활성 (B) 를 나타내는 도면이다. pHIV-1 LTR 은 HIV-1 LTR 리포터 플라스미드 투여군을, pHTLV-1 LTR 은 HTLV-1 LTR 리포터 플라스미드 투여군을, Empty 는 음성 대조군인 pcDNA3.1 ＋ 벡터를 나타낸다. Triplicate 로 실시하며, 세로 막대는 평균값을 나타내고, 에러 바는 SD 를 나타낸다. 막대 그래프 상의 백색 서클은 Triplicate 의 개개의 데이터를 나타낸다. Tax WT : Tax 야생형, Tax Mut : Tax 변이형, Sec-Tax Mut : 분비형 Tax 변이체.
도 2 는, 실시예 12 의 지질 입자를 투여한 C3H 마우스에 있어서의 Tax 특이적인 CTL 유도 레벨 및 혈중 항 Tax 항체가를 나타내는 도면이다. 도 2A 는 Tax 특이적인 CTL 유도 레벨, 도 2B 는 혈중 항 Tax 항체가를 나타낸다.
도 3 은, 원숭이 혈중 항 gp46 항체가 및 혈중 항 Tax 항체가를 나타내는 도면이다. 도 3A 는 혈중 항 gp46 특이적 항체가, 도 3B 는 혈중 항 Tax 항체가를 나타낸다. 1 군 4 마리. 0 W, 2 W, 4 W, 또는 6 W 는 각각, 투여 전, 초회 (初回) 투여 후로부터 2 주 후, 4 주 후 (2 회째 투여로부터 2 주 후), 6 주 후 (3 회째 투여로부터 2 주 후) 의 각 시점에서의 데이터를 나타낸다. 바는 평균값을 나타내고, 백색 서클은 개개의 데이터를 나타낸다.
도 4 는, gp46 특이적 및 Tax 특이적 세포성 면역 응답을 나타내는 도면이다. 1 군 4 마리. 세로 막대는 평균값을 나타내고, 에러 바는 SD 를 나타낸다. 막대 그래프 상의 백색 서클은 개개의 데이터를 나타낸다.
도 5 는, 원숭이 혈중 항 HTLV-1 중화 활성을 나타내는 도면이다. 어세이 음성 대조는 항체 처리가 없는 결과를 나타내고, 어세이 양성 대조는 이미 알려진 HTLV-1 중화 항체로 처리한 결과를 나타낸다. 1 군 4 마리. ＃736, ＃741, ＃743, ＃737 은 음성 대조군의 원숭이 개체 ID 를 나타내고, ＃745, ＃742, ＃740, ＃735 는 실시예 5 와 실시예 6 의 혼합 제제 투여군의 원숭이 개체 ID 를 나타낸다. 화살표는 합포체 형성 (syncytial formation) 을 나타낸다.
도 6 은, C57BL/6 마우스에 있어서의 혈중 항 gp46 항체가를 나타내는 도면이다.
도 7 은, C57BL/6 마우스에 있어서의 gp46 특이적 및 Tax 특이적인 세포성 면역 응답을 나타내는 도면이다. 도 7A 는 IFN-γ 산생 레벨을 나타내고, 도 7B 는 IL-2 산생 레벨을 나타낸다.
도 8 은, 실시예 9 내지 실시예 12 의 지질 입자로 처리한 CHO-S 세포에 있어서의 gp46 및 Tax 단백질 발현 레벨을 나타내는 도면이다. 도 8A 는, 세포 용해액 중의 발현 레벨을 나타내고, 도 8B 는 배양 상청 중의 발현 레벨을 나타낸다.
도 9 는, HTLV-I SU gp46 IVT 용의 주형 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1) 을 나타내는 도면이다.
도 10 은, 센스 프라이머 (서열 번호 2) 및 안티센스 프라이머 (서열 번호 3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 도면이다.
도 11 은, SU gp46 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 4) 을 나타내는 도면이다.
도 12 는, HTLV-I gp46-Fib IVT 용의 주형 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 5) 을 나타내는 도면이다.
도 13 은, gp46-Fib 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 6) 을 나타내는 도면이다.
도 14 는, HTLV-I dgp62-Fib IVT 용의 주형 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 7) 을 나타내는 도면이다.
도 15 는, dgp62-Fib 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 8) 을 나타내는 도면이다.
도 16 은, HTLV-I sec Tax mutant IVT 용의 주형 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 9) 을 나타내는 도면이다.
도 17 은, sec Tax mutant 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 10) 을 나타내는 도면이다.
도 18 은, Tax 야생형의 아미노산 서열 (서열 번호 11) 을 나타내는 도면이다.
도 19 는, Tax 변이형 (T130A/L131S/L319R/L320S) 의 아미노산 서열 (서열 번호 12) 을 나타내는 도면이다.
도 20 은, 분비형 Tax 변이체 (T130A/L131S/L319R/L320S) 의 아미노산 서열 (서열 번호 13) 을 나타내는 도면이다.
도 21 은, gp46 의 아미노산 서열 (서열 번호 14) 을 나타내는 도면이다.
도 22 는, gp46-Fib 의 아미노산 서열 (서열 번호 15) 을 나타내는 도면이다.
도 23 은, dgp62-Fib 의 아미노산 서열 (서열 번호 16) 을 나타내는 도면이다.
도 24 는, SU gp46 mRNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 17) 을 나타내는 도면이다.
도 25 는, gp46-Fib mRNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 18) 을 나타내는 도면이다.
도 26 은, dgp62-Fib mRNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 19) 을 나타내는 도면이다.
도 27 은, sec Tax mutant mRNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 20) 을 나타내는 도면이다.
도 28 은, 실시예 30 ∼ 34 에서 처리한 CHO-S 세포에 있어서의 gp46 단백질 발현 레벨을 나타내는 도면이다. 점선은, 음성 컨트롤인 Buffer 의 OD 값을 나타낸다.
도 29 는, gp46-Fib 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA95 (서열 번호 21) 를 나타내는 도면이다.
도 30 은, gp46-Fib 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA80 (서열 번호 22) 을 나타내는 도면이다.
도 31 은, gp46-Fib 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA60 (서열 번호 23) 을 나타내는 도면이다.
도 32 는, gp46-Fib 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA40 (서열 번호 24) 을 나타내는 도면이다.
도 33 은, gp46-Fib 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA20 (서열 번호 25) 을 나타내는 도면이다.
도 34 는, sec Tax mutant 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA95 (서열 번호 26) 를 나타내는 도면이다.
도 35 는, sec Tax mutant 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA80 (서열 번호 27) 을 나타내는 도면이다.
도 36 은, sec Tax mutant 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA60 (서열 번호 28) 을 나타내는 도면이다.
도 37 은, sec Tax mutant 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA40 (서열 번호 29) 을 나타내는 도면이다.
도 38 은, sec Tax mutant 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA20 (서열 번호 30) 을 나타내는 도면이다.
도 39 는, gp46-Fib 의 mRNA 서열 polyA95 (서열 번호 31) 를 나타내는 도면이다.
도 40 은, gp46-Fib 의 mRNA 서열 polyA80 (서열 번호 32) 을 나타내는 도면이다.
도 41 은, gp46-Fib 의 mRNA 서열 polyA60 (서열 번호 33) 을 나타내는 도면이다.
도 42 는, gp46-Fib 의 mRNA 서열 polyA40 (서열 번호 34) 을 나타내는 도면이다.
도 43 은, gp46-Fib 의 mRNA 서열 polyA20 (서열 번호 35) 을 나타내는 도면이다.
도 44 는, sec Tax mutant 의 mRNA 서열 polyA95 (서열 번호 36) 를 나타내는 도면이다.
도 45 는, sec Tax mutant 의 mRNA 서열 polyA80 (서열 번호 37) 을 나타내는 도면이다.
도 46 은, sec Tax mutant 의 mRNA 서열 polyA60 (서열 번호 38) 을 나타내는 도면이다.
도 47 은, sec Tax mutant 의 mRNA 서열 polyA40 (서열 번호 39) 을 나타내는 도면이다.
도 48 은, sec Tax mutant 의 mRNA 서열 polyA20 (서열 번호 40) 을 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대해 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은, HTLV-1 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자로서, 지질이 일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 상기 입자를 제공한다.
[화학식 5]
Figure pct00005
식 중,
R1 및 R2 는, 독립적으로, C1-C3 알킬기를 나타내고 ;
L1 은, C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C17-C19 알케닐기를 나타내고 ;
L2 는, C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알킬기, 또는 C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알케닐기를 나타내고 ;
p 는, 3, 또는 4 이다.
일반식 (Ia) 중의 R1 및 R2 는, 독립적으로, C1-C3 알킬기를 나타내지만, 바람직하게는 모두 메틸기이다.
일반식 (Ia) 중의 p 는, 3, 또는 4 이지만, 바람직하게는 3 이다.
일반식 (Ia) 중의 L1 은, C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C17-C19 알케닐기를 나타내지만, 바람직하게는, 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C17-C19 알케닐기이다. L1 로서, 구체적으로는, (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기, cis-8-헵타데세닐기, 또는 (8Z,11Z)-헵타데카디에닐기 등을 예시할 수 있다.
일반식 (Ia) 중의 L2 는, C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알킬기, 또는 C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알케닐기를 나타내지만, 바람직하게는, 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알케닐기이다. 혹은 또, 일반식 (Ia) 중의 L2 가, 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C17-C19 알케닐기인 것도 바람직하다. L2 로서, 구체적으로는, 데실기, cis-7-데세닐기, 도데실기, 또는 (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 입자를 구성하는 성분인 카티온성 지질로서, 구체적으로는, 하기의 구조식 :
[화학식 6]
Figure pct00006
[화학식 7]
Figure pct00007
[화학식 8]
Figure pct00008
으로 각각 나타내는 이아세트산(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(디메틸아미노)프로폭시
]카르보닐}옥시)펜타트리아콘타-9,26-디엔-7,29-디일, 탄산 3-디메틸아미노프로필(9Z,12Z)-옥타코사-19,22-디엔-11-일, 아세트산(7R,9Z)-18-({[3-(디메틸아미노)프로필옥시]카르보닐}옥시)옥타코사-9-엔-7-일을 예시할 수 있다.
일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질은, 1 종류의 화합물이어도 되고, 2 종류 이상의 화합물의 조합이어도 된다.
일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질을 제조하는 방법은, 국제공보 제2015/005253호 팸플릿에 기재되어 있다.
본 발명의 지질은, 추가로, 양친매성 지질, 스테롤류 및 PEG 지질을 포함해도 된다.
양친매성 지질은, 극성, 비극성의 용매에 대하여 모두 친화성을 갖는 지질이며, 구체적으로는, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 그것들의 조합 등을 예시할 수 있다. 본 발명의 입자에 사용하는 양친매성 지질로서 바람직하게는, 디스테아로일포스파티딜콜린 및/또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민이고, 보다 바람직하게는 디스테아로일포스파티딜콜린이다.
스테롤류는, 하이드록시기를 갖는 스테롤이며, 구체적으로는, 콜레스테롤 등을 예시할 수 있다.
PEG 지질은, PEG 수식된 지질이며, 구체적으로는, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤메톡시폴리에틸렌글리콜 및/또는 N-[메톡시폴리(에틸렌글리콜)2000]카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민, 그것들의 조합 등을 예시할 수 있는데, 바람직하게는 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤메톡시폴리에틸렌글리콜이다. PEG 지질의 평균 분자량은, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 1000 ∼ 5000 이고, 바람직하게는 1500 ∼ 3000 이고, 보다 바람직하게는 1800 ∼ 2200 이다.
양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 몰량으로, 양친매성 지질이 5 ∼ 25 ％, 스테롤류가 10 ∼ 55 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 이며, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 25 ％, 스테롤류가 10 ∼ 55 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 인 것이 바람직하고, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 22.5 ％, 스테롤류가 15 ∼ 55 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 인 것이 보다 바람직하다. 상기 지질 조성에 있어서 PEG 지질의 비율이, 몰량으로 1 ∼ 3 ％ 인 것이 보다 바람직하고, 1 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하고, 1.2 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하고, 1.25 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하고, 1.3 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하고, 1.5 ∼ 2 ％ 인 것이 특히 바람직하다. 또, 상기 지질 조성에 있어서 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율은 특별히 한정되지 않지만, 15 ∼ 30 이면 되며, 15 ∼ 25 인 것이 바람직하고, 15 ∼ 22.5 인 것이 보다 바람직하고, 17.5 ∼ 22.5 인 것이 보다 더 바람직하다.
카티온성 지질로서 탄산 3-디메틸아미노프로필(9Z,12Z)-옥타코사-19,22-디엔-11-일, 또는 이아세트산(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(디메틸아미노)프로폭시]카르보닐}옥시)펜타트리아콘타-9,26-디엔-7,29-디일을 사용하는 경우, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 몰량으로, 양친매성 지질이 5 ∼ 25 ％, 스테롤류가 10 ∼ 55 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 이며, 양친매성 지질이 15 ％ 이하, 스테롤류가 20 ∼ 55 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 인 것이 바람직하고, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 5 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 50 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 55 ％, PEG 지질이 1 ∼ 3 ％ 인 것이 보다 바람직하고, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 50 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2.5 ％ 인 것이 보다 더 바람직하고, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 50 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하다. 상기 지질 조성에 있어서 PEG 지질은 또한 1.2 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 바람직하고, 1.25 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하고, 1.3 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하고, 1.5 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하다. 상기 지질 조성에 있어서 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율은 특별히 한정되지 않지만 15 ∼ 30 이면 되며, 15 ∼ 25 인 것이 바람직하고, 15 ∼ 22.5 인 것이 보다 바람직하고, 17.5 ∼ 22.5 인 것이 보다 더 바람직하다.
카티온성 지질로서 아세트산(7R,9Z)-18-({[3-(디메틸아미노)프로필옥시]카르보닐}옥시)옥타코사-9-엔-7-일을 사용하는 경우, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 몰량으로, 양친매성 지질이 5 ∼ 25 ％, 스테롤류가 10 ∼ 55 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 이며, 양친매성 지질이 10 ∼ 25 ％, 스테롤류가 10 ∼ 50 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 인 것이 바람직하고, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 25 ％, 스테롤류가 10 ∼ 50 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 3 ％ 인 것이 보다 바람직하고, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 25 ％, 스테롤류가 10 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 42.5 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2.5 ％ 인 것이 보다 더 바람직하고, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 15 ∼ 22.5 ％, 스테롤류가 15 ∼ 40 ％, 카티온성 지질이 45 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하고, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 17.5 ∼ 22.5 ％, 스테롤류가 15 ∼ 40 ％, 카티온성 지질이 45 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하다. 상기 지질 조성에 있어서 PEG 지질은 또한 1.2 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 바람직하고, 1.25 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하고, 1.3 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하고, 1.5 ∼ 2 ％ 인 것이 보다 더 바람직하다. 상기 지질 조성에 있어서 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율은 특별히 한정되지 않지만 15 ∼ 30 인 것이 바람직하고, 15 ∼ 25 인 것이 보다 바람직하고, 15 ∼ 22.5 인 것이 보다 더 바람직하고, 17.5 ∼ 22.5 인 것이 보다 더 바람직하다.
본 발명에 있어서의 구체적인 지질의 조합으로는, 양친매성 지질로서 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 스테롤류로서 콜레스테롤, 카티온성 지질로서 이아세트산(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(디메틸아미노)프로폭시]카르보닐}옥시)펜타트리아콘타-9,26-디엔-7,29-디일, 탄산 3-디메틸아미노프로필(9Z,12Z)-옥타코사-19,22-디엔-11-일, 또는 아세트산(7R,9Z)-18-({[3-(디메틸아미노)프로필옥시]카르보닐}옥시)옥타코사-9-엔-7-일, PEG 지질로서 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤메톡시폴리에틸렌글리콜 또는 N-[메톡시폴리(에틸렌글리콜)2000]카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민을 조합하여 사용해도 된다. 또, 양친매성 지질로서 디스테아로일포스파티딜콜린, 또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 스테롤류로서 콜레스테롤, 카티온성 지질로서 이아세트산(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(디메틸아미노)프로폭시]카르보닐}옥시)펜타트리아콘타-9,26-디엔-7,29-디일, 또는 아세트산(7R,9Z)-18-({[3-(디메틸아미노)프로필옥시]카르보닐}옥시)옥타코사-9-엔-7-일, PEG 지질로서 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤메톡시폴리에틸렌글리콜을 사용하는 지질의 조합이 바람직하다. 본 발명에 있어서의 구체적인 지질의 조합으로서 보다 바람직하게는, 양친매성 지질로서 디스테아로일포스파티딜콜린, 스테롤류로서 콜레스테롤, 카티온성 지질로서 이아세트산(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(디메틸아미노)프로폭시]카르보닐}옥시)펜타트리아콘타-9,26-디엔-7,29-디일, 또는 아세트산(7R,9Z)-18-({[3-(디메틸아미노)프로필옥시]카르보닐}옥시)옥타코사-9-엔-7-일, PEG 지질로서 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤메톡시폴리에틸렌글리콜이다.
본 발명에 있어서, 지질 입자에 봉입되는 핵산은, HTLV-1 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 것이다.
HTLV-1 의 gp46 항원의 아미노산 서열을 서열 번호 14 에 나타낸다. 지질 입자에 봉입되는 핵산은, 서열 번호 14 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％, 바람직하게는 96 ％, 보다 바람직하게는 97 ％, 보다 바람직하게는 98 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, HTLV-1 의 gp46 항원을 코드하는 것이면 된다.
gp46 항원은, 올리고머화 도메인과의 융합 단백질이어도 된다. 올리고머화 도메인은, 융합시킨 단백질을 다량체화하는 단백질이며, 예를 들어, T4 박테리오파지 유래의 피브리틴 (fibritin) 을 들 수 있다. 또, 피브리틴의 3 량체화 도메인인 폴드온 (foldon) 도메인도 사용할 수 있다. HTLV-1 의 gp46 과 피브리틴의 융합 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 15 에 나타낸다. 서열 번호 15 의 아미노산 서열의 313 번째 ∼ 339 번째의 아미노산 서열이 피브리틴의 아미노산 서열이다. 올리고머화 도메인은, gp46 항원의 C 말단에 위치하고 있어도 되고, N 말단에 위치하고 있어도 된다.
HTLV-1 의 야생형의 Tax 항원의 아미노산 서열을 서열 번호 11 에 나타낸다. 지질 입자에 봉입되는 핵산은, 서열 번호 11 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％, 바람직하게는 96 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, HTLV-1 의 Tax 항원을 코드하는 것이면 된다. 야생형의 Tax 항원은 HTLV-1 LTR 전사 활성을 갖고, 발암성을 갖기 때문에, 생체에 대하여 발암성이라는 독성을 저감 또는 소실시킬 필요가 있다. 예를 들어, 발암성을 저감 또는 소실시키는 변이를 갖는 Tax 항원을 사용하면 된다. 또, Tax 가 세포 외로 분비되면 세포에 대한 발암성이 저하되므로, 시그널 펩티드와의 융합 단백질이어도 된다. 발암성을 저감 또는 소실시키는 변이로서, T130A, L131S, L319R 및 L320S 를 들 수 있다. T130A 및 L131S 는, HIV-1 LTR 및 HTLV-1 전사 활성 불능 변이이고, L319R 및 L320S 는, HTLV-1 전사 활성 결실 변이이다. 이들 변이 중 적어도 1 개의 변이를 갖고 있으면 되며, 바람직하게는 2 개, 보다 바람직하게는 3 개, 특히 바람직하게는 4 개의 변이를 갖고 있다. 상기 4 개의 변이를 갖는 변이형의 Tax 항원의 아미노산 서열을 서열 번호 12 에 나타낸다. 또, Tax 항원을 세포 외로 분비시키기 위한 시그널 펩티드로서, IgE 분비 시그널 펩티드를 들 수 있다. 시그널 펩티드는, 바람직하게는 Tax 항원의 N 말단측에 융합시킨다. 시그널 펩티드와 상기 4 개의 변이를 갖는 변이형 Tax 항원의 융합 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 13 에 나타낸다. 서열 번호 13 의 아미노산 서열의 1 번째 ∼ 18 번째의 아미노산 서열이 IgE 분비 시그널 펩티드의 아미노산 서열이다.
본 발명은, 상기 4 개의 아미노산 변이 중 적어도 1 개, 바람직하게는 2 개, 보다 바람직하게는 3 개, 특히 바람직하게는 4 개의 변이를 갖는 Tax 항원에 시그널 펩티드를 융합시킨 Tax 변이형에 IgE 분비 시그널을 부가한 분비형 Tax 변이체인 펩티드를 포함한다. 그 펩티드는, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 Tax 항원으로서, 발암성을 저감 또는 소실시키는 변이를 갖는 Tax 항원과 시그널 펩티드를 융합시킨 펩티드이다. 발암성을 저감 또는 소실시키는 변이로서, T130A, L131S, L319R 및 L320S 를 들 수 있다. 즉, 상기 펩티드로서, Tax 항원이, 서열 번호 11 의 아미노산 서열에 대하여, T130A, L131S, L319R 및 L320S 로 이루어지는 군에서 선택되는 변이 중 적어도 1 개를 갖고, 그 변이 아미노산 이외의 아미노산 서열을 비교한 경우, 서열 번호 11 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％, 바람직하게는 96 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 들 수 있다. 또, Tax 항원을 세포 외로 분비시키기 위한 시그널 펩티드로서, IgE 분비 시그널 펩티드를 들 수 있다. 시그널 펩티드는, 바람직하게는 Tax 항원의 N 말단측에 융합시킨다. 서열 번호 13 의 아미노산 서열의 1 번째 ∼ 18 번째의 아미노산 서열이 IgE 분비 시그널 펩티드의 아미노산 서열이다. 즉, 상기 펩티드로서, 시그널 펩티드가 서열 번호 13 의 아미노산 서열의 1 번째 ∼ 18 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 지질 입자에 봉입되는 핵산은, HTLV-1 의 gp46 항원과 Tax 항원이 링커로 결합된 단백질을 발현시킬 수 있는 것이어도 된다. 링커는 프로테아제에 의해 절단되는 서열을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지며, 예를 들어, 프로테아제인 푸린 (Furin) 이 인식하여 절단하는 아미노산 서열을 포함하는 링커를 들 수 있다. 프로테아제 절단 서열로는, Furin 단백에 의해 절단되는 서열이면 되며, 예를 들어, R-X-K/R-R (R 은 아르기닌을, K 는 리신을, X 는 임의의 아미노산을 나타낸다) 로 나타내는 서열 등을 들 수 있다 (J. Biol. Chem. 1992, 267, 16396 ; J. Biol. Chem. 1991, 266, 12127).
아미노산 서열의 동일성 (identity) 이란, 대응하는 아미노산이 완전히 일치하는 아미노산을 동일한 아미노산으로 하여, 전장 (全長) 서열에 대한 아미노산의 일치 비율을 수치화한 것이다. 본 발명에 있어서의 서열의 동일성은 서열 해석 소프트웨어인 GENETYX-SV/RC (주식회사 제네틱스 제조) 를 사용하여 산출되는 것이고, 이 알고리즘은, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 지질 입자에 봉입되는 핵산이 코드하는 아미노산은, 서열 번호 11 ∼ 16 과 일정 이상의 동일성을 유지하는 한, 아미노산의 변이 (치환), 결실, 삽입 및/또는 부가가 일어나 있어도 된다.
본 발명의 지질 입자에 봉입되는 핵산이 코드하는 아미노산은, 상기 서술한 서열 동일성을 유지하고, 서열 번호 11 ∼ 16 의 아미노산 서열 중, 수 지점 (바람직하게는 5 개 지점 이하, 보다 바람직하게는 3, 2 또는 1 개 지점) 에 있어서, 1 개 지점당 수 개 (바람직하게는 10 개 이하, 보다 바람직하게는 7 개 이하, 더욱 바람직하게는 5, 4, 3, 2 또는 1 개) 의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되어 있어도 된다.
HTLV-1 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산은, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), gp46 또는 Tax 의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 미부 (polyA) 를 포함하는 mRNA 이면 된다. 또, gp46 또는 Tax 의 번역 영역의 5' 측에 KOZAK 서열을 갖고 있어도 된다. 캡 구조 (Cap) 는, 대부분의 진핵 생물의 mRNA 의 5' 말단에 존재하고, 7-메틸구아노신 구조를 갖는 부위이다. 캡 구조로는, 예를 들어, cap0, cap1, cap2, ARCA (Anti-Reverse Cap Analog) 를 사용한 경우의 캡 구조 등을 들 수 있으며, 당해 캡 구조는 하기의 구조식으로 나타내는 바와 같다.
[화학식 9]
Figure pct00009
(식 중, Base 는 미수식 또는 수식된 임의의 핵산 염기를 나타내고, RNA 는 임의의 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.)
[화학식 10]
Figure pct00010
[화학식 11]
Figure pct00011
[화학식 12]
Figure pct00012
본 발명의 mRNA 의 캡 구조로는, 바람직하게는 cap0, 또는 cap1 이고, 보다 바람직하게는 cap1 이다. 5' 비번역 영역 (5'-UTR) 의 서열은, 예를 들어, 인간 β 글로빈 유전자의 5' 비번역 영역을 포함하는 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 β 글로빈 유전자의 5' 비번역 영역의 서열은, 서열 번호 17 의 서열 중의 염기 번호 15 ∼ 64 의 서열이다. gp46 의 번역 영역의 서열은, gp46 항원의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 발현시킬 수 있는 서열로서, 개시 코돈 및/또는 종지 (終止) 코돈을 포함하고 있어도 되며, 예를 들어, 서열 번호 17 의 서열 중의 염기 번호 71 ∼ 1009 의 서열이다. 또, gp46 의 번역 영역의 서열과 피브리틴의 서열을 연결시킨 것이어도 되며, 예를 들어, 서열 번호 18 의 염기 번호 71 ∼ 1090 의 서열이다. dgp62 의 번역 영역의 서열은 dgp62 항원의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 발현시킬 수 있는 서열로서, 개시 코돈 및/또는 종지 코돈을 포함하고 있어도 되며, 예를 들어, 서열 번호 19 의 서열 중의 염기 번호 71 ∼ 1396 의 서열이다. 또, dgp62 의 번역 영역의 서열과 피브리틴의 서열을 연결시킨 것이어도 되며, 예를 들어, 서열 번호 19 의 서열 중의 염기 번호 71 ∼ 1480 의 서열이다. Tax 의 번역 영역의 서열은, Tax 항원의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 발현시킬 수 있는 서열로서, 개시 코돈 및/또는 종지 코돈을 포함하고 있어도 된다. 예를 들어, T130A, L131S, L319R 및 L320S 4 개의 변이를 갖고 있다. 상기 4 개의 변이를 갖는 변이형의 Tax 항원의 번역 영역의 서열과, Tax 항원을 세포 외로 분비시키기 위한 IgE 분비 시그널 펩티드를 코드하는 서열을 연결시킨 것을 들 수 있고, 서열 번호 20 의 서열 중의 염기 번호 71 ∼ 1183 의 서열이다. 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 의 서열은, 예를 들어, 인간 β 글로빈 유전자의 3' 비번역 영역을 사용할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 17 의 서열 중의 염기 번호 1010 ∼ 1141 의 서열이다. 폴리 A 미부 (polyA) 의 서열은, 예를 들어, 서열 번호 17 의 서열 중의 염기 번호 1142 ∼ 1241 의 서열이다. 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), gp46 또는 Tax 의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 미부 (polyA) 의 서열에는, 개변이 이루어져 있어도 되며, gp46 항원을 발현시킬 수 있는 핵산의 서열은, 서열 번호 17 의 서열과 적어도 90 ％, 바람직하게는 95 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지면 된다. 또, Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산의 서열은, 서열 번호 20 의 서열과 적어도 90 ％, 바람직하게는 95 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지면 된다.
폴리 A 미부의 길이는 한정되지 않지만, 예를 들어, 10 ∼ 250 염기 길이이며, 바람직하게는 15 ∼ 120 염기 길이, 더욱 바람직하게는 15 ∼ 115 염기 길이, 특히 바람직하게는 20 ∼ 110 염기 길이이다.
본 발명의 mRNA 는, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), gp46 또는 Tax 의 번역 영역 및 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 을 포함하는 서열이고, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), gp46 항원 또는 Tax 항원의 번역 영역 및 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 으로 이루어지는 부분이 서열 번호 17 의 1 번째 내지 1141 번째의 서열, 서열 번호 18 의 1 번째 내지 1222 번째의 서열, 서열 번호 20 의 1 번째 내지 1315 번째의 서열과 적어도 90 ％, 바람직하게는 95 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 mRNA 여도 된다.
지질 입자에 봉입되는 핵산은, HTLV-1 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산이면, 어떠한 형태여도 된다. 예를 들어, 1 본쇄 DNA, 1 본쇄 RNA (예를 들어, mRNA), DNA 와 RNA 가 혼합된 1 본쇄 폴리뉴클레오티드, 2 본쇄 DNA, 2 본쇄 RNA, DNA-RNA 의 하이브리드 폴리뉴클레오티드, DNA 와 RNA 가 혼합된 2 종의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 2 본쇄 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 mRNA 이다.
지질 입자에 봉입되는 핵산을 구성하는 뉴클레오티드는, 천연형의 것이어도 되고, 수식 뉴클레오티드여도 되지만, 적어도 1 개의 수식 뉴클레오티드를 포함하면 된다.
수식 뉴클레오티드는, 염기, 당 및 인산디에스테르 결합의 어느 부분이 수식된 것이어도 된다. 수식 부위는 1 개 지점이어도 되고, 2 개 지점 이상이어도 된다.
염기의 수식의 예로는, 시토신의 5-메틸화, 5-플루오로화, N4-메틸화, 우라실의 5-메틸화 (티민), 5-플루오로화, 아데닌의 N6-메틸화, 구아닌의 N2-메틸화 등을 들 수 있다.
당의 수식의 예로는, D-리보푸라노오스의 2'-O-메틸화를 들 수 있다.
인산디에스테르 결합의 수식의 예로는, 포스포로티오에이트 결합을 들 수 있다.
수식 뉴클레오티드는, 염기 부분이 수식된 것이 바람직하며, 예를 들어, 5 위치가 치환된 피리미딘 뉴클레오티드, 1 위치가 치환되어 있어도 되는 슈도우리딘이면 되고, 구체적으로는, 5-메틸시티딘, 5-메톡시우리딘, 5-메틸우리딘, 슈도우리딘, 1-알킬슈도우리딘을 예시할 수 있다. 또, 1-알킬슈도우리딘으로는, 1-(C1-C6 알킬)슈도우리딘이어도 되고, 바람직하게는 1-메틸슈도우리딘 또는 1-에틸슈도우리딘이다. 수식 뉴클레오티드로서 보다 바람직하게는, 5-메틸시티딘, 5-메틸우리딘, 및 1-메틸슈도우리딘을 들 수 있다. 수식 뉴클레오티드로서 특히 바람직하게는, 5-메틸시티딘 및 5-메틸우리딘의 조합, 또는 5-메틸시티딘 및 1-메틸슈도우리딘의 조합을 들 수 있다.
본 발명의 HTLV-1 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산은, 원하는 염기 서열을 갖는 DNA 로부터 in vitro 전사 반응에 의해 제조할 수 있다. in vitro 전사에 필요한 효소, 완충액, 및 뉴클레오시드-5'-트리인산 혼합물 (아데노신-5'-트리인산 (ATP), 구아노신-5'-트리인산 (GTP), 시티딘-5'-트리인산 (CTP) 및 우리딘-5'-트리인산 (UTP)) 은, 시판되고 있다 (AmpliScribeT7 High Yield Transcription Kit (Epicentre), mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Life technologies) 등). 1 본쇄 RNA 를 제조하기 위해 사용되는 DNA 는, 클론화된 DNA, 예를 들어, 플라스미드 DNA 또는 DNA 단편이 사용된다. 플라스미드 DNA 또는 DNA 단편은, 시판되고 있는 것을 사용해도 되고, 또 당해 분야에서 일반적으로 알려져 있는 방법에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual second edition (1989), Rashtchian, A., Current Opinion in Biotechnology, 1995, 6 (1), 30-36, Gibson D. G. et al., Science, 2008, 319 (5867), 1215-1220 에 기재된 방법 등).
안정성 및/또는 안전성을 향상시킨 mRNA 를 얻기 위해, in vitro 전사 반응에 있어서, 일부 또는 전부의 미수식 뉴클레오시드-5'-트리인산을 수식 뉴클레오시드-5'-트리인산으로 치환시킴으로써, mRNA 중의 일부 또는 전부의 미수식 뉴클레오티드를 수식 뉴클레오티드로 치환시킬 수도 있다 (Kormann, M., Nature Biotechnology, 2011, 29, 154-157.).
안정성 및/또는 안전성을 향상시킨 mRNA 를 얻기 위해, in vitro 전사 반응 후에 캡화 효소를 사용하는 방법에 의해 mRNA 의 5' 말단에 캡 구조 (상기 Cap0 구조) 를 도입할 수 있다. 또, 추가로 Cap0 을 갖는 mRNA 에 2'-O-메틸트랜스페라아제를 작용시키는 방법에 의해, Cap0 을 Cap1 로 변환시킬 수 있다. 캡화 효소 및 2'-O-메틸트랜스페라아제는 시판되는 제품을 사용할 수 있다 (예를 들어, Vaccinia Capping System, M2080 ; mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase, M0366, 모두 New England Biolab 제조). 시판되는 제품을 사용하는 경우에는, 제품에 부속되는 프로토콜에 따라서 캡 구조를 갖는 mRNA 를 제조할 수 있다.
mRNA 의 5' 말단의 캡 구조는 효소를 사용하는 것과는 다른 방법에 의해서도 도입할 수 있다. 예를 들어, ARCA 또는 CleanCap (등록 상표) 을 in vitro 전사 반응에 부가함으로써 ARCA 가 갖는 캡 유연체의 구조, 또는 CleanCap 에서 유래하는 Cap1 구조를 mRNA 에 도입할 수 있다. ARCA 및 CleanCap 은, 시판되는 제품을 사용할 수 있다 (ARCA, N-7003 ; CleanCap Reagent AG, N-7113, 모두 TriLink BioTechnologies 제조). 시판되는 제품을 사용하는 경우에는, 제품에 부속되는 프로토콜에 따라서 캡 구조를 갖는 mRNA 를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 지질 입자에 봉입되는 핵산은, 탈염, HPLC (역상, 겔 여과, 이온 교환, 어피니티), PAGE, 한외 여과 등의 방법으로 정제해도 된다. 정제 처리에 의해, 불순물을 제거함으로써, 핵산을 투여한 생체에 있어서의, 염증성 사이토카인의 산생이 감소될 수 있다.
본 발명의 핵산 봉입 지질 입자는, 박막법, 역상 증발법, 에탄올 주입법, 에테르 주입법, 탈수-재수화법, 계면 활성제 투석법, 수화법, 동결 융해법 등의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 국제공개공보 제2015/005253호에 기재된 방법에 의해 핵산 봉입 지질 입자를 제조할 수 있다. 본 발명의 핵산 봉입 지질 입자는, 핵산 용액과 지질 용액을 마이크로 유로 내에서 혼합함으로써도 제조할 수 있다. 예를 들어, Precision Nanosystems 사의 NanoAssemblr (등록 상표) 을 사용하여, 부속되는 프로토콜에 기재된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
본 발명의 입자는, 평균 입자경이 30 ㎚ ∼ 300 ㎚ 이면 되며, 바람직하게는 30 ∼ 200 ㎚ 이고, 보다 바람직하게는 30 ∼ 100 ㎚ 이다. 평균 입자경은, Zeta Potential/Particle Sizer NICOMP (등록 상표) 380ZLS (PARTICLE SIZING SYSTEMS) 등의 기기를 사용해서, 동적 광 산란법 등의 원리에 기초하여 체적 평균 입자경을 측정함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 입자는, HTLV-1 감염에 의한 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물을 제조하기 위해 사용할 수 있다. HTLV-1 감염에 의한 질환으로서, 성인 T 세포 백혈병 (ATL), HTLV-1 관련 척수증 (HAM), HTLV-1 관련 포도막염 (HU) 등을 들 수 있다. HTLV-1 의 gp46 항원을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자와 HTLV-1 의 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자는, 당해 핵산을 동일한 지질 입자 내에 제제화해도 되고 다른 지질 입자로서 제제화해도 되지만, 다른 지질 입자로서 조제하는 것이 바람직하다.
본 발명의 입자를 사용하여, HTLV-1 의 gp46 항원 및 Tax 항원을 in vivo 또는 in vitro 에서 발현시킬 수 있다. 즉, HTLV-1 의 gp46 항원을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자와 HTLV-1 의 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자를 피험체에 투여하면 된다. 따라서, 본 발명은, 상기 입자를 함유하는 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는, HTLV-1 의 gp46 항원 및 Tax 항원을 in vitro 에서 발현시키는 방법을 제공한다. 또, 본 발명은, 상기 입자를 함유하는 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, HTLV-1 의 gp46 항원 및 Tax 항원을 in vivo 에서 발현시키는 방법도 제공한다. HTLV-1 의 gp46 항원 및 Tax 항원을 in vivo 에서 발현시킴으로써, HTLV-1 에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 그 결과로서, HTLV-1 감염을 예방 및/또는 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 상기 입자를 함유하는 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, HTLV-1 에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 또, 본 발명은, 상기 입자를 함유하는 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, HTLV-1 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은, HTLV-1 의 gp46 항원을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자와 HTLV-1 의 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자의 양방을 포함하는 키트도 포함한다.
본 발명의 입자는, 의약으로서, 또, 실험용 시약으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 입자는, 통상적으로, 물, 완충액, 생리 식염수 등의 담체에 첨가되고, 이 배합물 (조성물) 을, 세포에 도입하거나 (in vitro), 포유 동물에게 투여할 수 있다 (in vivo). 포유 동물에게 투여되는 경우에는, 담체는 약학적으로 허용되는 담체 (예를 들어, 생리 식염수) 이면 된다. 또, 본 발명의 입자는, 지방, 지방유, 라놀린, 바셀린, 파라핀, 납 (蠟), 수지, 플라스틱, 글리콜류, 고급 알코올, 글리세린, 물, 유화제, 현탁제 등을 기제 원료로 하는 크림, 페이스트, 연고, 겔, 로션 등의 제형으로 제제화해도 된다.
본 발명의 입자는, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 돼지, 원숭이, 고양이, 개, 말, 염소, 양, 소 등의 포유 동물에게, 경구 투여, 혹은, 근육 내 투여, 정맥 내 투여, 직장 내 투여, 경피 투여, 경점막 투여, 피하 투여, 피내 투여 등의 방법에 의해 비경구 투여할 수 있다.
본 발명의 입자를 인간에게 투여하는 경우에는, 예를 들어, 성인 1 회당 mRNA 의 중량으로서 약 0.001 ∼ 1 ㎎, 바람직하게는 0.01 ∼ 0.2 ㎎ 의 투여량으로, 1 회 또는 수 회, 근육 내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 점적 정맥 주사, 또는, 정맥 주사하면 되는데, 그 투여량이나 투여 횟수는, 질환의 종류, 증상, 연령, 투여 방법 등에 따라 적절히 변경할 수 있다.
실험 시약으로서 사용하는 경우, 본 발명의 입자를, HTLV-1 의 gp46 항원 및 Tax 항원을 발현시키고자 하는 세포 (예를 들어, HEK293 세포 및 그 파생 세포 (HEK293T 세포, FreeStyle 293 세포나 Expi293 세포), CHO 세포, C2C12 마우스 근아 세포, 불사화 마우스 수상 세포 (MutuDC1940)) 에 도입하고, HTLV-1 의 gp46 항원 및 Tax 항원을 in vitro 에서 발현시킬 수 있다. HTLV-1 의 gp46 항원 및 Tax 항원의 발현은, 샘플 중의 HTLV-1 의 gp46 항원 및 Tax 항원 단백질을 웨스턴 블롯법으로 검출하거나, HTLV-1 의 gp46 항원 및 Tax 항원에 특이적인 펩티드 단편을 질량 분석법으로 검출하거나 함으로써 해석할 수 있다.
본 발명에 있어서,「치료」란, 바이러스 또는 세균 등에 의한 감염증, 또는 당해 감염을 원인으로 하는 질환 (예를 들어, 전암병변이나 암 등) 을 발증한 환자에게 있어서, 이들 질환의 임상 증상의 회복, 관해, 완화 및/또는 악화의 지연을 의미한다.
본 발명에 있어서,「예방」이란, 바이러스 또는 세균 등에 의한 감염증에 의한 질환의 발증률을 저감시키는 것을 의미한다. 예방은, 바이러스 또는 세균 등에 의한 감염증에 의한 질환의 진행의 리스크의 저하, 혹은 그들 질환의 중증화의 저감을 포함한다. 본 발명의 입자는, 방어 면역 반응을 유도하는 점에서 상기 질환의 예방 및/또는 치료에 효과를 나타낸다.
본 발명의 입자는, HTLV-1 감염자에 대하여, HTLV-1 에서 기인하는 질환의 발증 예방약 및 치료약으로서도 사용이 기대된다. HTLV-1 에서 기인하는 질환으로는, 성인 T 세포 백혈병·림프종 (ATLL), HTLV-1 관련 척수증 (HAM), HTLV-1 포도막염 (HU) 등을 들 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 또한, 이들 실시예는, 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 중, 이하의 약어를 사용하는 경우가 있다.
SU gp46 : HTLV-1 의 엔벨로프 단백질의 세포 외 영역 (surface unit) 인 gp46 을 나타낸다.
gp46-Fib : gp46 과 Fibritin 의 C 말단 영역의 융합 단백질을 나타낸다.
dgp62-Fib : gp62 로부터 막 관통 영역 및 세포 내 영역을 결손시킨 단백질과 Fibritin 의 C 말단 영역의 융합 단백질을 나타낸다.
sec Tax mutant : 변이 도입 Tax 단백질과 분비 시그널 단백질의 융합 단백질을 나타낸다.
[실시예 1] SU gp46 mRNA-001 의 조제
(1) SU gp46 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
In vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해 SU gp46 DNA 를 PCR 에 의해 증폭 후 정제하였다. T7 프로모터 서열, human β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, SU gp46, human β-globin 의 3'-UTR 서열, PolyA 서열이 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 1) 을 플라스미드에 도입하였다. 당해 플라스미드 8 ng 을 용해시킨 Nuclease-free water (547.2 μL) 에 10 × Buffer for KOD-Plus- Ver.2 (80 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 2 mM dNTP mix (80 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 25 mM MgSO4 (48 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 50 μM 센스 프라이머 (4.8 μL, 서열 번호 2), 10 μM 안티센스 프라이머 (24 μL, 서열 번호 3), KOD Plus polymerase (16 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211) 를 첨가하고, 98 ℃ 에서 1 분 인큐베이션 후, 98 ℃, 5 초, 55 ℃, 15 초, 68 ℃, 90 초를 20 사이클 실시하고, 추가로 68 ℃ 에서 1 분 인큐베이트하여, DNA 를 증폭시켰다. 반응 후 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega catalog ＃ A9281) 으로 주형 DNA (서열 번호 4) 를 정제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 SU gp46 mRNA-001 의 조제
실시예 1-(1) 에서 얻어진 365.1 μg/mL 주형 DNA (4.38 μL), 100 mM CleanCap AG (8 μL, TriLink catalog ＃ N-7113), 100 mM ATP (8 μL, Hongene catalog ＃ R1331), 100 mM GTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R2331), 100 mM CTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R3331), 100 mM N1-methylpseudoUTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R5-027), Nuclease-free water (67.62 μL, Thermo Fisher catalog ＃ AM9937), T7 Transcription 5 × buffer (32 μL, Promega catalog ＃ P140X), Enzyme mix, T7 RNA Polymerase (16 μL, Promega catalog ＃ P137X) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이션하였다. RQ1 RNase-Free DNase (8 μL, Promega catalog ＃ M6101) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 15 분 인큐베이션하였다. 8 M LiCl 용액 (80 μL, Sigma-Aldrich catalog ＃ L7026) 을 혼합하고, -30 ℃ 에서 밤새 정치 (靜置) 하였다. 원심 분리 (4 ℃, 5200 × g, 35 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 5200 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water (500 μL) 에 용해 후, RNeasy Midi kit (Qiagen catalog ＃ 75144) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제하였다. 얻어진 용액 (750 μL), rApid Alkaline Phosphatase (Roche catalog ＃ 04 898 141 001) 의 완충액 (85 μL) 과 효소 (32 μL) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이션 후, 75 ℃ 에서 2 분 인큐베이션하였다. 얻어진 용액을 RNeasy Midi kit (Qiagen catalog ＃ 75144) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제함으로써 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다. 동일한 실험 조작을 합계 2 회 실시하고, 얻어진 mRNA 용액을 합쳐서, 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다. 얻어진 mRNA 는 서열 번호 17 의 서열을 갖는다.
[실시예 2] gp46-Fib mRNA-002 의 조제
(1) gp46-Fib 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
In vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해 gp46-Fib DNA 를 PCR 에 의해 증폭 후 정제하였다. T7 프로모터 서열, human β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, gp46-Fib, human β-globin 의 3'-UTR 서열, PolyA 서열이 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 5) 을 플라스미드에 도입하였다. 당해 플라스미드 8 ng 을 용해시킨 Nuclease-free water (547.2 μL) 에 10 × Buffer for KOD-Plus- Ver.2 (80 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 2 mM dNTP mix (80 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 25 mM MgSO4 (48 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 50 μM 센스 프라이머 (4.8 μL, 서열 번호 2), 10 μM 안티센스 프라이머 (24 μL, 서열 번호 3), KOD Plus polymerase (16 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211) 를 첨가하고, 98 ℃ 에서 1 분 인큐베이션 후, 98 ℃, 5 초, 55 ℃, 15 초, 68 ℃, 90 초를 20 사이클 실시하고, 추가로 68 ℃ 에서 1 분 인큐베이트하여, DNA 를 증폭시켰다. 반응 후 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega catalog ＃ A9281) 으로 주형 DNA (서열 번호 6) 를 정제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 gp46-Fib mRNA-002 의 조제
실시예 2-(1) 에서 얻어진 345.3 μg/mL 주형 DNA (4.63 μL), 100 mM CleanCap AG (8 μL, TriLink catalog ＃ N-7113), 100 mM ATP (8 μL, Hongene catalog ＃ R1331), 100 mM GTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R2331), 100 mM CTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R3331), 100 mM N1-methylpseudoUTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R5-027), Nuclease-free water (67.37 μL, Thermo Fisher catalog ＃ AM9937), T7 Transcription 5 × buffer (32 μL, Promega catalog ＃ P140X), Enzyme mix, T7 RNA Polymerase (16 μL, Promega catalog ＃ P137X) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이션하였다. RQ1 RNase-Free DNase (8 μL, Promega catalog ＃ M6101) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 15 분 인큐베이션하였다. 8 M LiCl 용액 (80 μL, Sigma-Aldrich catalog ＃ L7026) 을 혼합하고, -30 ℃ 에서 밤새 정치하였다. 원심 분리 (4 ℃, 5200 × g, 35 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 5200 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water (500 μL) 에 용해 후, RNeasy Midi kit (Qiagen catalog ＃ 75144) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제하였다. 얻어진 용액 (750 μL), rApid Alkaline Phosphatase (Roche catalog ＃ 04 898 141 001) 의 완충액 (85 μL) 과 효소 (32 μL) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이션 후, 75 ℃ 에서 2 분 인큐베이션하였다. 얻어진 용액을 RNeasy Midi kit (Qiagen catalog ＃ 75144) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제함으로써 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다. 동일한 실험 조작을 합계 2 회 실시하고, 얻어진 mRNA 용액을 합쳐서, 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다. 얻어진 mRNA 는 서열 번호 18 의 서열을 갖는다.
[실시예 3] dgp62-Fib mRNA-003 의 조제
(1) dgp62-Fib 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
In vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해 dgp62-Fib DNA 를 PCR 에 의해 증폭 후 정제하였다. T7 프로모터 서열, human β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, dgp62-Fib, human β-globin 의 3'-UTR 서열, PolyA 서열이 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 7) 을 플라스미드에 도입하였다. 당해 플라스미드 8 ng 을 용해시킨 Nuclease-free water (547.2 μL) 에 10 × Buffer for KOD-Plus- Ver.2 (80 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 2 mM dNTP mix (80 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 25 mM MgSO4 (48 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 50 μM 센스 프라이머 (4.8 μL, 서열 번호 2), 10 μM 안티센스 프라이머 (24 μL, 서열 번호 3), KOD Plus polymerase (16 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211) 를 첨가하고, 98 ℃ 에서 1 분 인큐베이션 후, 98 ℃, 5 초, 55 ℃, 15 초, 68 ℃, 90 초를 20 사이클 실시하고, 추가로 68 ℃ 에서 1 분 인큐베이트하여, DNA 를 증폭시켰다. 반응 후 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega catalog ＃ A9281) 으로 주형 DNA (서열 번호 8) 를 정제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 dgp62-Fib mRNA-003 의 조제
실시예 3-(1) 에서 얻어진 366.7 μg/mL 주형 DNA (4.36 μL), 100 mM CleanCap AG (8 μL, TriLink catalog ＃ N-7113), 100 mM ATP (8 μL, Hongene catalog ＃ R1331), 100 mM GTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R2331), 100 mM CTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R3331), 100 mM N1-methylpseudoUTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R5-027), Nuclease-free water (67.64 μL, Thermo Fisher catalog ＃ AM9937), T7 Transcription 5 × buffer (32 μL, Promega catalog ＃ P140X), Enzyme mix, T7 RNA Polymerase (16 μL, Promega catalog ＃ P137X) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이션하였다. RQ1 RNase-Free DNase (8 μL, Promega catalog ＃ M6101) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 15 분 인큐베이션하였다. 8 M LiCl 용액 (80 μL, Sigma-Aldrich catalog ＃ L7026) 을 혼합하고, -30 ℃ 에서 밤새 정치하였다. 원심 분리 (4 ℃, 5200 × g, 35 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 5200 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water (500 μL) 에 용해 후, RNeasy Midi kit (Qiagen catalog ＃ 75144) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제하였다. 얻어진 용액 (750 μL), rApid Alkaline Phosphatase (Roche catalog ＃ 04 898 141 001) 의 완충액 (85 μL) 과 효소 (32 μL) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이션 후, 75 ℃ 에서 2 분 인큐베이션하였다. 얻어진 용액을 RNeasy Midi kit (Qiagen catalog ＃ 75144) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제함으로써 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다. 동일한 실험 조작을 합계 2 회 실시하고, 얻어진 mRNA 용액을 합쳐서, 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다. 얻어진 mRNA 는 서열 번호 19 의 서열을 갖는다.
[실시예 4] sec Tax mutant mRNA-004 의 조제
(1) sec Tax mutant 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
In vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해 sec Tax DNA 를 PCR 에 의해 증폭 후 정제하였다. T7 프로모터 서열, human β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, sec Tax, human β-globin 의 3'-UTR 서열, PolyA 서열이 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 9) 을 플라스미드에 도입하였다. 당해 플라스미드 8 ng 을 용해시킨 Nuclease-free water (547.2 μL) 에 10 × Buffer for KOD-Plus- Ver.2 (80 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 2 mM dNTP mix (80 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 25 mM MgSO4 (48 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211), 50 μM 센스 프라이머 (4.8 μL, 서열 번호 2), 10 μM 안티센스 프라이머 (24 μL, 서열 번호 3), KOD Plus polymerase (16 μL, 토요보 (주) catalog ＃ KOD-211) 를 첨가하고, 98 ℃ 에서 1 분 인큐베이션 후, 98 ℃, 5 초, 55 ℃, 15 초, 68 ℃, 90 초를 20 사이클 실시하고, 추가로 68 ℃ 에서 1 분 인큐베이트하여, DNA 를 증폭시켰다. 반응 후 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega catalog ＃ A9281) 으로 주형 DNA (서열 번호 10) 를 정제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 sec Tax mutant mRNA-004 의 조제
실시예 4-(1) 에서 얻어진 401.1 μg/mL 주형 DNA (3.99 μL), 100 mM CleanCap AG (8 μL, TriLink catalog ＃ N-7113), 100 mM ATP (8 μL, Hongene catalog ＃ R1331), 100 mM GTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R2331), 100 mM CTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R3331), 100 mM N1-methylpseudoUTP (8 μL, Hongene catalog ＃ R5-027), Nuclease-free water (68.01 μL, Thermo Fisher catalog ＃ AM9937), T7 Transcription 5 × buffer (32 μL, Promega catalog ＃ P140X), Enzyme mix, T7 RNA Polymerase (16 μL, Promega catalog ＃ P137X) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이션하였다. RQ1 RNase-Free DNase (8 μL, Promega catalog ＃ M6101) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 15 분 인큐베이션하였다. 8 M LiCl 용액 (80 μL, Sigma-Aldrich catalog ＃ L7026) 을 혼합하고, -30 ℃ 에서 밤새 정치하였다. 원심 분리 (4 ℃, 5200 × g, 35 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 5200 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water (500 μL) 에 용해 후, RNeasy Midi kit (Qiagen catalog ＃ 75144) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제하였다. 얻어진 용액 (750 μL), rApid Alkaline Phosphatase (Roche catalog ＃ 04 898 141 001) 의 완충액 (85 μL) 과 효소 (32 μL) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이션 후, 75 ℃ 에서 2 분 인큐베이션하였다. 얻어진 용액을 RNeasy Midi kit (Qiagen catalog ＃ 75144) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제함으로써 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다. 동일한 실험 조작을 합계 2 회 실시하고, 얻어진 mRNA 용액을 합쳐서, 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다. 얻어진 mRNA 는 서열 번호 20 의 서열을 갖는다.
[실시예 5] SU gp46 mRNA-005 의 조제
(1) SU gp46 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 실시하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 SU gp46 mRNA-005 의 조제
실시예 5-(1) 에서 얻어진 339 μg/mL 주형 DNA (89 μL), 100 mM CleanCap AG (150 μL, TriLink catalog ＃ T-7113), 100 mM ATP (150 μL, Hongene catalog ＃ R1331), 100 mM GTP (150 μL, Hongene catalog ＃ R2331), 100 mM CTP (150 μL, Hongene catalog ＃ R3331), 100 mM N1-methyl-pseudouridine 5'-triphosphate (150 μL, Hongene catalog ＃ R5-027), Nuclease-free water (1261 μL, Qiagen catalog ＃ 129114), T7 Transcription 5 × buffer (600 μL, Promega catalog ＃ P140X), Enzyme mix, T7 RNA Polymerase (300 μL, Promega catalog ＃ P137X) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이션하였다. RQ1 RNase-Free DNase (30 μL, Promega catalog ＃ M6101) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 15 분 인큐베이션하였다. 8 M LiCl 용액 (1500 μL, Sigma-Aldrich catalog ＃ L7026) 을 혼합하고, -20 ℃ 에서 밤새 정치하였다. 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 30 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water 에 용해 후, RNeasy Maxi kit (Qiagen catalog ＃ 75162) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제하였다. 얻어진 용출액 (12 mL, UV 환산으로 12.0 ㎎) 과 Nuclease-free water (120 μL), rApid Alkaline Phosphatase (Roche catalog ＃ 04 898 141 001) 의 완충액 (1400 μL) 과 효소 (480 μL) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이션하였다. 75 ℃ 에서 2 분 인큐베이션한 후, 8 M LiCl 용액 (7000 μL, Sigma-Aldrich catalog ＃ L7026) 을 혼합하고, -20 ℃ 에서 밤새 정치하였다. 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 30 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water (2 mL) 에 용해시켰다 (UV 환산으로 9.9 ㎎). 얻어진 mRNA 를 역상 크로마토그래피 (Column : PLRP-S, 4000 Å, 10 ㎛, 10 × 200 ㎜ (Agilent), Buffer A : 5 ％ 아세토니트릴, 400 mM 아세트산트리에틸아민 (pH 7.0), Buffer B : 25 ％ 아세토니트릴, 400 mM 아세트산트리에틸아민 (pH 7.0), Gradient B ％ : 27.5 ％ ∼ 35 ％ (20 min), Flow rate : 5 mL/min, Temperature : 80 ℃) 로 분취 정제하였다. 목적으로 하는 획분을 회수하고, 한외 여과 (Amicon Ultra-15 (MWCO : 30 kDa)) 에 의해 탈염 처리하였다 (UV 환산으로 3.4 ㎎).
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 17 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit (PerkinElmer catalog ＃CLS960010) 에 의해 분석하여, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 6] sec Tax mutant mRNA-006 의 조제
(1) sec Tax mutant 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
실시예 4-(1) 과 동일한 방법으로 실시하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 sec Tax mutant mRNA-006 의 조제
실시예 6-(1) 에서 얻어진 336 μg/mL 주형 DNA (89 μL), 100 mM CleanCap AG (150 μL, TriLink catalog ＃ T-7113), 100 mM ATP (150 μL, Hongene catalog ＃ R1331), 100 mM GTP (150 μL, Hongene catalog ＃ R2331), 100 mM CTP (150 μL, Hongene catalog ＃ R3331), 100 mM N1-methyl-pseudouridine 5'-triphosphate (150 μL, Hongene catalog ＃ R5-027), Nuclease-free water (1261 μL, Qiagen catalog ＃ 129114), T7 Transcription 5 × buffer (600 μL, Promega catalog ＃ P140X), Enzyme mix, T7 RNA Polymerase (300 μL, Promega catalog ＃ P137X) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이션하였다. RQ1 RNase-Free DNase (30 μL, Promega catalog ＃ M6101) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 15 분 인큐베이션하였다. 8 M LiCl 용액 (1500 μL, Sigma-Aldrich catalog ＃ L7026) 을 혼합하고, -20 ℃ 에서 밤새 정치하였다. 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 30 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water 에 용해 후, RNeasy Maxi kit (Qiagen catalog ＃ 75162) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제하였다. 얻어진 용출액 (12 mL, UV 환산으로 12.6 ㎎) 과 Nuclease-free water (100 μL), rApid Alkaline Phosphatase (Roche catalog ＃ 04 898 141 001) 의 완충액 (1400 μL) 과 효소 (500 μL) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이션하였다. 75 ℃ 에서 2 분 인큐베이션한 후, 8 M LiCl 용액 (7000 μL, Sigma-Aldrich catalog ＃ L7026) 을 혼합하고, -20 ℃ 에서 밤새 정치하였다. 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 30 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water (2 mL) 에 용해시켰다 (UV 환산으로 10.9 ㎎). 얻어진 mRNA 를 역상 크로마토그래피 (Column : PLRP-S, 4000 Å, 10 ㎛, 10 × 200 ㎜ (Agilent), Buffer A : 5 ％ 아세토니트릴, 400 mM 아세트산트리에틸아민 (pH 7.0), Buffer B : 25 ％ 아세토니트릴, 400 mM 아세트산트리에틸아민 (pH 7.0), Gradient B ％ : 27.5 ％ ∼ 35 ％ (20 min), Flow rate : 5 mL/min, Temperature : 80 ℃) 로 분취 정제하였다. 목적으로 하는 획분을 회수하고, 한외 여과 (Amicon Ultra-15 (MWCO : 30 kDa)) 에 의해 탈염 처리하였다 (UV 환산으로 3.7 ㎎).
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 20 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit (PerkinElmer catalog ＃CLS960010) 에 의해 분석하여, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 7] gp46-Fib mRNA-007 의 조제
(1) gp46-Fib 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 실시하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 gp46-Fib mRNA-007 의 조제
실시예 7-(1) 에서 얻어진 397 μg/mL 주형 DNA (63 μL), 100 mM CleanCap AG (50 μL, TriLink catalog ＃ T-7113), 100 mM ATP (50 μL, Hongene catalog ＃ R1331), 100 mM GTP (50 μL, Hongene catalog ＃ R2331), 100 mM CTP (50 μL, Hongene catalog ＃ R3331), 100 mM N1-methyl-pseudouridine 5'-triphosphate (50 μL, Hongene catalog ＃ R5-027), Nuclease-free water (387 μL, Qiagen catalog ＃ 129114), T7 Transcription 5 × buffer (200 μL, Promega catalog ＃ P140X), Enzyme mix, T7 RNA Polymerase (100 μL, Promega catalog ＃ P137X) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이션하였다. RQ1 RNase-Free DNase (25 μL, Promega catalog ＃ M6101) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 15 분 인큐베이션하였다. 8 M LiCl 용액 (500 μL, Sigma-Aldrich catalog ＃ L7026) 을 혼합하고, -20 ℃ 에서 밤새 정치하였다. 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 30 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water 에 용해 후, RNeasy Maxi kit (Qiagen catalog ＃ 75162) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제하였다. 얻어진 용출액 (3 mL, UV 환산으로 3.6 ㎎) 과 Nuclease-free water (332 μL), rApid Alkaline Phosphatase (Roche catalog ＃ 04 898 141 001) 의 완충액 (450 μL) 과 효소 (718 μL) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이션하였다. 75 ℃ 에서 2 분 인큐베이션한 후, RNeasy Maxi kit 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제함으로써 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다 (4 mL, UV 환산으로 2.8 ㎎).
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 18 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit (PerkinElmer catalog ＃CLS960010) 에 의해 분석하여, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 8] sec Tax mutant mRNA-008 의 조제
(1) sec Tax mutant 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
실시예 4-(1) 과 동일한 방법으로 실시하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 sec Tax mutant mRNA-008 의 조제
실시예 8-(1) 에서 얻어진 391 μg/mL 주형 DNA (64 μL), 100 mM CleanCap AG (50 μL, TriLink catalog ＃ T-7113), 100 mM ATP (50 μL, Hongene catalog ＃ R1331), 100 mM GTP (50 μL, Hongene catalog ＃ R2331), 100 mM CTP (50 μL, Hongene catalog ＃ R3331), 100 mM N1-methyl-pseudouridine 5'-triphosphate (50 μL, Hongene catalog ＃ R5-027), Nuclease-free water (386 μL, Qiagen catalog ＃ 129114), T7 Transcription 5 × buffer (200 μL, Promega catalog ＃ P140X), Enzyme mix, T7 RNA Polymerase (100 μL, Promega catalog ＃ P137X) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이션하였다. RQ1 RNase-Free DNase (25 μL, Promega catalog ＃ M6101) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 15 분 인큐베이션하였다. 8 M LiCl 용액 (500 μL, Sigma-Aldrich catalog ＃ L7026) 을 혼합하고, -20 ℃ 에서 밤새 정치하였다. 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 30 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 5250 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water 에 용해 후, RNeasy Maxi kit (Qiagen catalog ＃ 75162) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제하였다. 얻어진 용출액 (3 mL, UV 환산으로 3.5 ㎎) 과 Nuclease-free water (359 μL), rApid Alkaline Phosphatase (Roche catalog ＃ 04 898 141 001) 의 완충액 (450 μL) 과 효소 (691 μL) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이션하였다. 75 ℃ 에서 2 분 인큐베이션한 후, RNeasy Maxi kit 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제함으로써 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다 (4 mL, UV 환산으로 2.8 ㎎).
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 20 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit (PerkinElmer catalog ＃CLS960010) 에 의해 분석하여, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 9 ∼ 24] 실시예 1 ∼ 8 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
(1) mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
디스테아로일포스파티딜콜린 (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine : 이하 DSPC 로 표기, NOF CORPORATION), 콜레스테롤 (Cholesterol : 이하 Chol 로 표기, Sigma-Aldrich, Inc.), 이아세트산(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(디메틸아미노)프로폭시]카르보닐}옥시)펜타트리아콘타-9,26-디엔-7,29-디일 (WO2015/005253 의 실시예 23 에 기재된 화합물) (이하 LP1 로 표기) 또는 아세트산(7R,9Z)-18-({[3-(디메틸아미노)프로필옥시]카르보닐}옥시)옥타코사-9-엔-7-일 (WO2015/005253 의 실시예 28 에 기재된 화합물) (이하 LP2 로 표기), 및 폴리에틸렌글리콜 분자량이 약 2000 인 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤메톡시폴리에틸렌글리콜 (1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Methoxypolyethylene Glycol, 이하 PEG-DMG 로 표기, NOF CORPORATION, SUNBRIGHT GM-020) 을, 표 1 의 기재된 몰비로, 총 지질 농도 5 mM 이 되도록 에탄올에 용해시켰다.
한편, 실시예 1 ∼ 8 에서 얻은 mRNA 를, 시트르산 완충액 (20 mM Citrate Buffer, pH 4.0) 으로 희석 조제하였다.
상기 지질 용액과 mRNA 용액을, mRNA 에 대한 총 지질 중량비가 표 1 에 기재된 값이 되고, 또한 그 체적비가 1 : 3 이 되도록 NanoAssemblr BenchTop (Precision Nanosystems Inc.) 을 사용해서 마이크로 유로 내에서 혼합하여, 핵산 지질 입자의 미정제 분산액을 얻었다. 핵산 지질 입자의 분산액을 약 25 ∼ 50 배량의 완충액으로 12 ∼ 18 시간 투석 (Float-A-Lyzer G2, MWCO : 1,000 kD, Spectra/Por) 함으로써, 에탄올 제거를 실시하여, 정제된 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 분산액을 얻었다.
또한, LP1 은 WO2015/005253 의 실시예 23 에 기재된 방법에 따라서, LP2 는 WO2015/005253 의 실시예 28 에 기재된 방법에 따라서 합성하였다.
(2) mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 특성 평가
(1) 에서 조제한 핵산 지질 입자를 포함하는 분산액의 특성 평가를 실시하였다. 각각의 특성 평가의 방법에 대해 설명한다.
(2-1) mRNA 의 봉입률
mRNA 의 봉입률은, Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit (Invitrogen) 를 사용해서, 첨부 문서에 준하여 측정하였다.
즉, 0.015 ％ Triton X-100 계면 활성제 존재하 및 비존재하에 있어서, 핵산 지질 입자의 분산액 중의 mRNA 를 정량하고, 다음 식에 의해 봉입률을 산출하였다.
{([계면 활성제 존재하에 있어서의 mRNA 량] － [계면 활성제 비존재하에 있어서의 mRNA 량])/[계면 활성제 존재하에 있어서의 mRNA 량]} × 100 (％)
(2-2) mRNA 와 지질의 비율
핵산 지질 입자의 분산액 중의 mRNA 량을 하기의 어느 방법으로 측정하였다.
핵산 지질 입자 분산액을 1.0 ％ Triton X-100 으로 희석 조제하고, 역상 크로마토그래피로 측정하였다 (System : Agilent 1260series, Column : Bioshell A400 Protein C4 (10 ㎝ × 4.6 ㎜, 3.4 ㎛) (SUPELCO), Buffer A : 0.1 M 아세트산트리에틸아민 (pH 7.0), Buffer B : 아세토니트릴, (B ％) : 5 ∼ 50 ％ (0 ∼ 15 min), Flow Rate : 1 mL/min, Temperature : 70 ℃, Detection : 260 ㎚).
핵산 지질 입자 분산액을 90 ％ 메탄올에 희석 용해시키고, 핵산 지질 입자 중의 mRNA 량을 자외 가시 분광 광도계 (퍼킨엘머사 제조, LAMBDA (상표) 465) 로 측정하였다. mRNA 농도를 다음 식에 의해 산출하였다.
{[260 ㎚ 에 있어서의 흡광도] － [350 ㎚ 에 있어서의 흡광도]} × 40 × 희석 배율 (μg/mL)
핵산 지질 입자의 분산액 중의 각 지질량을 역상 크로마토그래피로 측정하였다 (System : DIONEX UltiMate 3000, Column : XSelect CSH C18 (130 Å, 3.5 ㎛, 3.0 ㎜ × 150 ㎜) (Waters catalog ＃ 186005263), Buffer A : 0.2 ％ 포름산, Buffer B : 0.2 ％ 포름산, 메탄올, (B ％) : 75 ∼ 100 ％ (0 ∼ 6 min), 100 ％ (6 ∼ 15 min), Flow Rate : 0.45 mL/min, Temperature : 50 ℃, Detection : Corona CAD (Charged Aerosol Detector)).
mRNA 에 대한 총 지질량의 비율을 다음 식에 의해 산출하였다.
[총 지질 농도]/[mRNA 농도] (wt/wt)
(2-3) 평균 입자경
핵산 지질 입자의 입자경은, Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS (PARTICLE SIZING SYSTEMS) 로 측정하였다. 표 중의 평균 입자경은 체적 평균 입자경을 나타내고, ± 이하는, 편차를 나타낸다.
특성 평가의 결과를 표 2 에 나타냈다.
Figure pct00014
이상의 결과로부터, 이들 핵산 지질 입자는, mRNA 의 95 ％ 이상이 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 약 100 ㎚ 내지 약 140 ㎚ 의 평균 입자경을 갖고 있는 것이 분명해졌다.
(시험예 1)
LTR 리포터 어세이용의 플라스미드 구축
HTLV-1 Tax 야생형 (Uniprot Accession Number : P03409), Tax 변이형, 및 Tax 변이형에 IgE 분비 시그널을 부가한 분비형 Tax 변이체를 코드하는 DNA 는, 위탁처인 Eurofin 에서 합성하였다. 각각의 DNA 단편은, pcDNA3.1 ＋ 벡터 (Thermo Scientific Inc.) 의 NheI/NotI 사이트에 삽입하고, 클로닝하였다. 또, HIV-1 LTR 및 HTLV-1 LTR 을 코드하는 DNA 는, 위탁처인 Eurofin 에서 합성하였다. 각각의 DNA 단편은, pGL4.17 벡터 (Promega) 의 KpnI/XhoI 사이트에 삽입하고, 클로닝하였다.
HIV-1 LTR 및 HTLV-1 LTR 리포터 어세이
350 ng 의 Tax 야생형, Tax 변이형, 또는 분비형 Tax 변이체를 발현하는 플라스미드, 100 ng 의 HIV-1 LTR 리포터 플라스미드 또는 HTLV-1 LTR 리포터 플라스미드, 그리고 50 ng 의 transfection 효율 보정용의 pRG-RK 플라스미드 (Promega), 합계 500 ng 의 플라스미드를, HEK293T 세포에 TransIT-LT1 유전자 도입 시약 (Takara) 을 사용하여 transfection 하였다. Transfection 으로부터 48 시간 후, Dual-Glo (등록 상표) Luciferase Assay System (Promega) 을 사용하여, firefly luciferase 발현량과 Renilla luciferase 발현량을 측정하고, firefly luciferase 발현량/Renilla luciferase 발현량의 비를 산출하여, HIV-1 LTR 및 HTLV-1 LTR 의 전사 활성을 평가하였다.
(시험예 2)
C3H 마우스에 대한 실시예 12 의 투여
C3H/HeJJcl 마우스는 니혼 클레아로부터 입수하여 순화시켰다. 2 주일 간격으로, 마취하의 마우스의 소독된 하퇴 삼두근에 실시예 12 를, 5 μg mRNA/20 μL/mouse 로 투여하였다. 초회는 우측 다리에, 2 회째는 좌측 다리에 투여하였다. 지질 입자의 농도 조정 및 음성 대조군에는, Buffer 를 사용하였다.
혈청과 비장 세포의 조제
지질 입자의 초회 투여로부터 2 주일 후 및 2 회째 투여로부터 1 주일 후에, 마취하의 마우스로부터 채혈을 실시하였다. 혈액은 상온에서 1 시간 이상 정치하고, 3000 RPM 으로 10 분간 원심해서 혈청을 분리하여 회수하였다. 또, 마취하에서 방혈사시킨 마우스로부터 비장을 채취하였다. 비장은, Cell Strainer (FALCON) 의 메시와 시린지 (TERUMO) 의 개스킷을 사용하여 갈아으깨고, RPMI 1640 (nacalai tesque) 으로 single cell suspention 으로 조정한 후, 원심으로 세포를 회수하였다. 상청을 폐기하고, DB Pharm Lyse Lysing buffer (BECTON DICKINSON) 를 사용하여 적혈구의 용결 처리를 실시하였다. 원심 분리 후 RPMI 1640 으로 재현탁시킨 세포 현탁액을 mini Cell Strainers (주식회사 하이테크, Cat. HT-AMS-14002) 에 통과시켰다. 원심 분리 후에 상청을 폐기하고 세포를 재현탁시켜, 세포 농도를 측정하였다. 원심 분리 후에 상청을 폐기하고 세포 배양액 (RPMI 1640 에 10 ％ Fetal Bovine Serum (비동화하여 필터 통과, HyClone), 1 ％ Penicillin-Streptomycin Mixed Solution (nacalai tesque), 1 ％ Sodium Pyruvate (gibco), 1 ％ MEM Non-Essential Amino Acids (gibco), 1 ％ HEPES Buffer Solution (gibco), 1 ％ StemSure Monothioglycerol Solution (FUJIFILM) 을 첨가) 으로 세포 농도를 조정하였다. 또한, 원심은, 1500 RPM 으로 5 분간, 4 ℃ 에서 실시하였다.
Tax 특이적인 CTL 유도 레벨
조정한 마우스 비장 세포 3 × 106 개를 원심하고 상청을 폐기하였다. 1 × Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (gibco) 으로 세포를 재현탁시키고, 원심하고 상청을 폐기하는 공정을 2 번 반복하였다. 그 후, 1 × PBS 로 20 배 희석으로 한 TruStain FcX Antibody (BioLegend) 를 세포에 첨가하고, 5 분간 상온에서 정치시켰다. 5 μL 의 H-2DK HTLV-1 Tax38-46 Tetramer-ARLHTHALL-PE (MBL) 를 각 샘플에 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 에서 15 분간 인큐베이트하였다. 빙상에서, 최종 농도가 100 배 희석이 되도록 조정한 APC/Fire (상표) 750 anti-mouse CD3 Antibody (BioLegend) 와 Anti-CD8 (Mouse) ㎃b-FITC (MBL) 를 샘플에 첨가하고, 어두운 곳에서 30 분간 정치하였다. 원심하고 상청을 폐기하고, 1 × PBS 로 세포를 2 번 세정하였다. 마지막으로 세포를 400 μL PBS 로 재현탁시키고, FACSVerse (BD) 로 표지된 세포를 검출하고, FlowJo (확인) 로 해석을 실시하였다. 또한, 원심은, 1500 RPM 으로 5 분간, 4 ℃ 에서 실시하였다.
마우스 혈중 항 Tax 항체가
Tax (MYBiosource) 재조합 단백질을 고상화 항원으로서 사용하기 위해, 96 웰 평저 플레이트에 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 표준 곡선 희석 계열은, Mouse IgG (SouthernBiotech) 를 최고 농도 0.25 μg/mL 에서부터 3 배 희석으로 7 단계 제조하였다. 각 웰을 세정하고, 블로킹 용액을 첨가하여 1 시간 상온에서 정치하였다. 혈청 샘플은, 블로킹 용액을 사용하여 최고 농도인 100 배 희석에서부터 4 배 희석으로 7 단계 제조하였다. 블로킹한 플레이트를 세정하고, 희석시킨 시료를 플레이트에 첨가하여 상온에서 1 시간 정치하였다. 검출 항체, Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP (SouthernBiotech) 를 블로킹 용액으로 3000 배로 희석시켜, 세정된 웰에 첨가하였다. 1 시간 후에 세정하고, TMB Microwell Peroxidase Substrate System (seracare) 을 첨가하여 2 ∼ 3 분 정치하고, TMB Stop Solution (KPL, Cat. 51500-0021) 을 사용하여 반응을 정지시켰다. 플레이트 리더로, 450 ㎚ 의 흡광도에서 540 ㎚ 의 흡광도를 뺀 보정 흡광도를 해석에 사용하여, 항 gp46 항체가와 항 Tax 항체가를 산출하였다. 또한, 블로킹 용액은, 1 ％ Bovine Serum Albumin (Sigma) 및 0.05 ％ Tween (BIO-RAD) 을 첨가한 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (gibco), 세정은 0.05 ％ 의 Tween 을 첨가한 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ((10X) gibco) 으로 3 회 실시하였다.
(시험예 3 ∼ 시험예 5)
게잡이원숭이에 대한 투여
1 회/2 주, 합계 4 회, 원숭이의 상완부에 실시예 13 및 실시예 14 의 지질 입자를 투여하였다. 초회 투여는 우상완부에 투여하고, 그 후에는 좌우 교대로 투여하였다. 지질 입자 투여량은, 실시예 13 과 실시예 14 의 각각을 25 μg mRNA 씩 등량 혼합하고, 1 회당 50 μg mRNA/200 μL/body 를 투여하였다.
(시험예 3)
원숭이 혈중 항 gp46 및 Tax 항체가
재조합 gp46 단백질 (RayBiotech) 및 재조합 Tax 단백질 (MY Biosource) 을 96 웰 플레이트에 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 고상화하였다. 그 후, 플레이트 워셔를 사용하여 (0.05 ％ Tween 20 함유 PBS 세정액으로 3 회) 세정하고, 블로킹 용액 (1 ％ BSA, 0.05 ％ Tween 20 함유 PBS) 을 첨가하여 블로킹하였다. 원숭이 혈장 시료 희석 계열은, 블로킹 용액을 사용하여 최고 농도인 100 배 희석 혈청으로부터, 4 배 희석으로 7 단계 제조하였다. 원숭이 IgG 농도의 표준 곡선 희석 계열은, 원숭이 IgG 용액 (메이커) 을 블로킹 용액으로 최고 농도인 0.25 μg/mL 에서부터, 3 배 희석으로 8 단계 제조하였다. 시료 희석 용액 및 표준 곡선 희석 용액을 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치 후, 플레이트 워셔로 세정하였다. 검출 항체는, HRP 표지 항원숭이 IgG 항체 (Sigma-Aldrich) 를 블로킹 용액으로 4000 배 희석시켜 플레이트에 첨가 후, 실온에서 1 시간 정치하였다. 플레이트 워셔로 세정한 후, TMB Microwell Peroxidase Substrate System (SERACARE Life Sciences) 을 첨가하고, 10 분간 정치하였다. 반응 정지액에는, TMB Stop Solution (SERACARE Life Sciences) 을 사용하였다. 플레이트 리더를 사용하여 파장 450 ㎚ (대조 파장 540 ㎚) 의 흡광도를 측정하고, 450 ㎚ 에서 측정한 흡광도에서 540 ㎚ 에서 측정한 흡광도를 뺀 보정 흡광도 (Delta) 를 해석에 사용하였다. 표준 곡선의 원숭이 IgG 농도 및 Delta 로부터, Nonlinear Regression : 4 Parameter 를 사용하여 검량선을 작성하였다. 검량선, 측정 시료의 희석 배율, 및 Delta 로부터 시료의 항 gp46 및 Tax 항체 농도를 산출하였다.
(시험예 4)
원숭이에 있어서의 gp46 및 Tax 특이적 세포성 면역 응답
원숭이 말초혈로부터 Ficoll (Cytiva) 을 사용하여 분리한 PBMC 를 RPMI Complete 배지 (10 ％ FBS [Sigma-Aldrich], 1 ％ PS [Penicilin-Streptomycin Mixed Solution, Nacalai Tesque], 1 mM Sodium Pyruvate [Thermo Fisher Scientific], 10 mM HEPES [Thermo Fisher Scientific], 1 × StemSure [후지 필름 와코 순약], 1 × MEM Non-Essential Amino Acids Solution [Thermo Fisher Scientific]) 으로 2 × 106 세포/mL 로 조제하고, IFN-γ ELISpot 플레이트 (MABTech) 에 100 μL/웰로 파종하였다. 그 후, RPMI Complete 배지에서 최종 농도 0.1 ％ (v/v) 로 조제한 Tax 에피토프펩티드 풀 (Eurofins) 또는 1 μg/mL 로 조제한 gp46 재조합 단백질 (RayBiotech) 을 100 μL/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 48 시간 배양하였다. 항원 특이적 IFN-γ 산생 세포는, Monkey IFN-γ ELISpotPLUS kit (HRP) (MABTech) 를 사용하여 검출하였다. 항원 특이적 IFN-γ 산생 세포수는, ELISPOT 애널라이저 (CTL) 를 사용하여 측정하였다.
(시험예 5)
원숭이 혈중 항 HTLV-1 중화 활성
Spin column based Antibody Purification Kit (코스모바이오) 를 사용하여, 4 회째 투여로부터 2 주 후에 채취·조제한 원숭이 혈장으로부터, total IgG 를 정제하였다. HTLV-1 감염 세포인 YT＃1 세포주에 정제 IgG 를 첨가하고, 다음으로 HTLV-1 비감염 세포주인 CEM 세포를 YT＃1 세포비 일정 1 : 1 의 비율로 혼합하고, 그 공배양계에 환자 혈청을 첨가하고 나서 하룻밤 배양 후의 합포체 형성의 유무율을 측정 검경 (檢鏡) 하였다.
(시험예 6)
마우스 혈중 gp46 특이적 total IgG 항체가
gp46 (Ray Biotech Inc.) 재조합 단백질을 고상화 항원으로서 사용하기 위해, 96 웰 평저 플레이트에 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 표준 곡선 희석 계열은, Mouse IgG (SouthernBiotech) 를 최고 농도 0.25 μg/mL 에서부터 3 배 희석으로 7 단계 제조하였다. 각 웰을 세정하고, 블로킹 용액을 첨가하여 1 시간 상온에서 정치하였다. 혈청 샘플은, 블로킹 용액을 사용하여 최고 농도인 100 배 희석에서부터 4 배 희석으로 7 단계 제조하였다. 블로킹한 플레이트를 세정하고, 희석시킨 시료를 플레이트에 첨가하여 상온에서 1 시간 정치하였다. 검출 항체, Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP (SouthernBiotech) 를 블로킹 용액으로 3000 배로 희석시켜, 세정된 웰에 첨가하였다. 1 시간 후에 세정하고, TMB Microwell Peroxidase Substrate System (seracare) 을 첨가하여 2 ∼ 3 분 정치하고, TMB Stop Solution (KPL, Cat. 51500-0021) 을 사용하여 반응을 정지시켰다. 플레이트 리더로, 450 ㎚ 의 흡광도에서 540 ㎚ 의 흡광도를 뺀 보정 흡광도를 해석에 사용하여, 항 gp46 항체가와 항 Tax 항체가를 산출하였다. 또한, 블로킹 용액은, 1 ％ Bovine Serum Albumin (Sigma) 및 0.05 ％ Tween (BIO-RAD) 을 첨가한 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (gibco), 세정은 0.05 ％ 의 Tween 을 첨가한 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ((10X) gibco) 으로 3 회 실시하였다.
(시험예 7)
마우스에 있어서의 gp46 및 Tax 특이적 세포성 면역 응답
조정한 마우스 비장 세포 106 개/웰을 96 웰 U 바닥 플레이트 (FALCON) 에 파종하고, 최종 농도가 10 μg/mL 가 되도록 조정한 gp46 및 Tax pooled 펩티드 (Eurofins) 로 37 ℃, 5 ％ CO2 에서 자극을 하였다. 24 시간 후에 배양 상청을 회수하고, IFN-γ (R ＆ D Systems) 와 IL-2 (R ＆ D Systems) 산생의 측정을 키트의 프로토콜대로 실시하였다.
(시험예 8)
단백질 발현 해석
배양 중의 mRNA 농도가 3 μg/mL 가 되도록, 실시예 9, 10, 11, 12 를 CHO-S 세포 (Thermo Fisher Scientific) 에 첨가하였다. 첨가로부터 72 시간 후에 배양 상청과 세포 펠릿을 회수하였다. 세포 펠릿은, M-PER (상표) Tissue Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific) 를 첨가하여 Vortex 로 잘 혼합하고, 10 분간 상온에서 정치시켰다. 다시 Vortex 하여 혼합하고, 원심 분리 후 (3000 RPM, 4 ℃, 10 분간) 에 세포 용해액을 회수하였다. 배양 상청 중 및 세포 용해액 중의 gp46 단백질은, Western blotting 법을 사용하여 검출하였다.
(시험예 1 의 결과)
HIV-1 LTR 및 HTLV-1 LTR 의 전사 활성을 지표로 한 Tax 항원 디자인의 선발
Tax 야생형, Tax 변이형, 및 분비형 Tax 변이체에 의한 HIV-1 LTR 전사 활성 및 HTLV-1 LTR 전사 활성을 평가하였다 (도 1). 그 결과, Tax 야생형과 비교하여, Tax 변이형은 HIV-1 LTR 전사 활성 및 HTLV-1 LTR 전사 활성의 저하가 확인되었다. 또, 분비형 Tax 변이체는 음성 컨트롤과 동등한 HIV-1 LTR 전사 활성 및 HTLV-1 LTR 전사 활성을 나타냈다. 이상의 결과로부터, HIV-1 LTR 전사 활성 및 HTLV-1 LTR 전사 활성이 가장 낮은 분비형 Tax 변이체는, 암원성이 가장 낮은 백신 항원 후보인 것이 시사되었다.
(시험예 2 의 결과)
실시예 12 에 의한 CTL 유도 레벨 및 혈중 항 Tax 항체가
실시예 12 를 투여한 C3H 마우스에 있어서의 CTL 유도 레벨을 평가하였다 (도 2). 그 결과, 실시예 12 에 의해, Tax 특이적 CTL 및 혈중 항 Tax 항체 응답이 유도되었다.
(시험예 3 의 결과)
원숭이 혈중 항 gp46 및 Tax 항체가
실시예 13 및 실시예 14 를 등량 혼합한 지질 입자 제제에 의해 유도되는 혈중 항 gp46 항체 응답 및 혈중 항 Tax 항체 응답을 평가하였다 (도 3). 그 결과, 투여 전 (0 W) 과 비교하여, 2 회 투여 후 (4 W) 및 3 회 투여 후 (6 W) 에는, 혈중 항 gp46 항체가 및 항 Tax 항체가가 높았다.
(시험예 4 의 결과)
원숭이 PBMC 중의 gp46 및 Tax 특이적인 IFN-γ 산생 세포 레벨
실시예 13 및 실시예 14 의 혼합 제제에 의해 유도되는 혈중 항 gp46 항체 응답 및 혈중 항 Tax 항체 응답을 평가하였다 (도 4). 4 회째 투여로부터 7 주 후에 채취·조제한 PBMC 를 사용하여 검토한 결과, 실시예 5 및 실시예 6 의 혼합 제제군은, gp46 특이적 및 Tax 특이적인 IFN-γ 산생 세포의 유도가 확인되었다.
(시험예 5 의 결과)
원숭이 혈중 항 HTLV-1 중화 활성
실시예 13 및 실시예 14 의 혼합 제제에 의해 유도되는 혈중 항 HTLV-1 중화 활성을 평가하였다 (도 5). 4 회째 투여로부터 2 주 후에 채취·정제한 혈중 total IgG 를 사용하여 검토한 결과, 음성 대조군과 비교하여, 지질 입자 투여군의 4 마리 중 3 마리에서, 혈중 항 HTLV-1 중화 활성이 확인되었다.
(시험예 6 의 결과)
마우스 혈중 항 gp46 항체가
실시예 9, 실시예 10, 실시예 11 또는 실시예 12 의 지질 입자의 투여에 의해 유도되는 혈중 항 gp46 항체 응답을 평가하였다 (도 6). 그 결과, 음성 대조군과 비교하여, 실시예 9 군, 실시예 10 군, 및 실시예 11 군에서는 높은 혈중 항 gp46 항체 응답이 확인되었다.
(시험예 7 의 결과)
C57BL/6 마우스에 있어서의 gp46 특이적 및 Tax 특이적인 세포성 면역 응답
실시예 9, 실시예 10, 실시예 11, 또는 실시예 12 의 지질 입자의 투여에 의해 유도되는 gp46 특이적 및 IL-2 특이적 세포성 면역을 IFN-γ 산생 레벨 및 IL-2 산생 레벨을 지표로 하여 평가하였다 (도 7). 그 결과, 음성 대조군과 비교하여, 실시예 9 군, 실시예 10 군, 및 실시예 11 군에서는, 높은 gp46 특이적인 세포성 면역 응답이 확인되었다. 또, 음성 대조군과 비교하여, 실시예 12 군에서는, 높은 Tax 특이적인 세포성 면역 응답이 확인되었다.
(시험예 8 의 결과)
실시예 9 내지 실시예 12 의 지질 입자에 의한 항원 단백질의 발현 레벨
실시예 9 내지 실시예 12 에서 처리한 CHO-S 세포의 배양 상청 중 및 세포 용해액 중의 각 지질 입자가 발현하는 항원 단백질의 발현 레벨을 평가하였다 (도 8). 그 결과, 각 지질 입자가 발현하는 항 gp46 항체가 결합하는 항원 단백질의 발현이 확인되었다. 또한, gp46 단백질은, 39 kDa 이다.
[실시예 25 ∼ 29] gp46-Fib mRNA 의 조제
(1) gp46-Fib 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
in vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해 플라스미드를 구축하였다. T7 프로모터 서열, human β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, gp46-Fib 의 번역 영역, human β-globin 의 3'-UTR 서열 및 polyA 서열이 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 21 ∼ 25) 을 도입한 플라스미드를 제조하였다 (서열 번호 21 ∼ 25 의 DNA 단편을 도입한 플라스미드를 각각 사용하여 실시예 25 ∼ 29 를 실시하였다).
(2) 주형 DNA 의 리니어라이즈화
(1) 에서 얻어진 플라스미드 (300 μg) 를 용해시킨 Nuclease-free water (268 μL) 에 10 × NEBuffer 3.1, BspQI (32 μL, New England Biolabs catalog ＃ R0712L) 를 첨가하고, 50 ℃ 에서 16 시간 인큐베이션 후, 80 ℃ 에서 20 분 인큐베이션하였다. 에탄올 (900 μL), 3 mol/L 아세트산나트륨 용액 (30 μL) 을 혼합하고, -80 ℃ 에서 4 시간 정치하였다. 원심 분리 (4 ℃, 15000 × g, 30 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 15000 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water 로 500 μg/mL 의 용액으로 조제하였다.
(3) in vitro transcription 에 의한 gp46-Fib mRNA 의 조제
(2) 에서 얻어진 500 μg/mL 주형 DNA (15 μL), 100 mM CleanCap AG (15 μL, TriLink catalog ＃ N-7113), 100 mM ATP (15 μL, Hongene catalog ＃ R1331), 100 mM GTP (15 μL, Hongene catalog ＃ R2331), 100 mM 5-Me-CTP (15 μL, Hongene catalog ＃ R3-029), 100 mM 5-Me-UTP (15 μL, Hongene catalog ＃ R5-104), Nuclease-free water (113 μL), 5 × IVT buffer (60 μL, 400 mM HEPES-KOH pH 7.5, 400 mM DTT, 120 mM MgCl2, 10 mM Spermidine), T7 RNA Polymerase (15 μL, Promega catalog ＃ P407X), RNase Inhibitor (15 μL, Promega catalog ＃ P261X), Pyrophosphatase (7.5 μL, Hongene catalog ＃ ON-025) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이션하였다. RQ1 RNase-Free DNase (7.5 μL, Promega catalog ＃ M6101) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. 10 M 아세트산암모늄 용액 (100 μL) 을 혼합하고, -20 ℃ 에서 2 시간 정치하였다. 원심 분리 (4 ℃, 15000 × g, 30 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 15000 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 풍건시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water 에 용해시키고, NucleoSpin (Macherey-Nagel catalog ＃ 740948.50) 으로 정제하여, 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다.
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 31 ∼ 35 의 서열을 갖고, 5' 말단에 cap1 구조를 갖고, 시티딘 및 우리딘이 각각 5-메틸시티딘 및 5-메틸우리딘으로 치환된 것이다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit (PerkinElmer catalog ＃CLS960010) 에 의해 분석하여, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 30 ∼ 34] 실시예 25 ∼ 29 에서 얻어진 mRNA 를 봉입한 핵산 지질 입자의 조제
(1) mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 1 ∼ 8 에 기재된 mRNA 대신에 실시예 25 ∼ 29 에서 얻어진 mRNA 를 각각 사용하여 실시예 9 ∼ 24 와 동일한 방법으로, 표 3 에 기재된 핵산 지질 입자를 조제하였다.
(2) mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 특성 평가
실시예 9 ∼ 24 와 동일한 방법으로, 핵산 지질의 특성 평가를 실시하고, 결과를 표 4 에 나타냈다.
Figure pct00016
(시험예 9)
gp46 단백질 발현 해석
배지 중의 mRNA 농도가 3 μg/mL 가 되도록, 실시예 30 ∼ 34 를 CHO-S 세포 (Thermo Fisher Scientific) 에 첨가하였다. 또, 음성 컨트롤로서, 실시예 35 ∼ 39 의 입자의 첨가액량과 등량의 Buffer 를 첨가하였다. 첨가로부터 3 일 후에 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청 중의 gp46 단백질은, D-PBS 로 10 배로 희석시킨 배양 상청을 96 half 웰 플레이트에 고상화하고, 실시예 10 을 투여한 마우스의 혈청을 사용한 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 법에 의해 검출하였다.
(시험예 9 의 결과)
실시예 30 ∼ 34 의 gp46 발현 유도능
실시예 30 ∼ 34 에서 처리한 CHO-S 세포의 배양 상청 중의 gp46 단백질 발현 레벨을 평가하였다. 그 결과, 실시예 30 ∼ 34 에서 처리한 CHO-S 세포는, gp46 단백질을 발현하였다 (도 28).
본 발명은, HTLV-1 에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에 이용할 수 있다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1 : SU gp46 IVT 용의 주형 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 2 : 센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 3 : 안티센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 4 : SU gp46 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 5 : HTLV-I gp46-Fib IVT 용의 주형 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 6 : gp46-Fib 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 7 : HTLV-I dgp62-Fib IVT 용의 주형 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 8 : dgp62-Fib 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 9 : HTLV-I sec Tax mutant IVT 용의 주형 플라스미드 DNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 10 : sec Tax mutant 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 11 : Tax 야생형의 아미노산 서열
서열 번호 12 : Tax 변이형 (T130A/L131S/L319R/L320S) 의 아미노산 서열
서열 번호 13 : 분비형 Tax 변이체 (T130A/L131S/L319R/L320S) 의 아미노산 서열
서열 번호 14 : gp46 의 아미노산 서열
서열 번호 15 : gp46-Fib 의 아미노산 서열
서열 번호 16 : dgp62-Fib 의 아미노산 서열
서열 번호 17 : SU gp46 mRNA
서열 번호 18 : gp46-Fib mRNA
서열 번호 19 : dgp62-Fib mRNA
서열 번호 20 : sec Tax mutant mRNA
서열 번호 21 : gp46-Fib 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA95
서열 번호 22 : gp46-Fib 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA80
서열 번호 23 : gp46-Fib 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA60
서열 번호 24 : gp46-Fib 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA40
서열 번호 25 : gp46-Fib 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA20
서열 번호 26 : sec Tax mutant 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA95
서열 번호 27 : sec Tax mutant 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA80
서열 번호 28 : sec Tax mutant 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA60
서열 번호 29 : sec Tax mutant 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA40
서열 번호 30 : sec Tax mutant 의 주형 DNA 의 뉴클레오티드 서열 polyA20
서열 번호 31 : gp46-Fib 의 mRNA 서열 polyA95
서열 번호 32 : gp46-Fib 의 mRNA 서열 polyA80
서열 번호 33 : gp46-Fib 의 mRNA 서열 polyA60
서열 번호 34 : gp46-Fib 의 mRNA 서열 polyA40
서열 번호 35 : gp46-Fib 의 mRNA 서열 polyA20
서열 번호 36 : sec Tax mutant 의 mRNA 서열 polyA95
서열 번호 37 : sec Tax mutant 의 mRNA 서열 polyA80
서열 번호 38 : sec Tax mutant 의 mRNA 서열 polyA60
서열 번호 39 : sec Tax mutant 의 mRNA 서열 polyA40
서열 번호 40 : sec Tax mutant 의 mRNA 서열 polyA20
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition University of the Ryukyus Daiichi Sankyo Company, Limited <120> HTLV-1 nucleic acid lipid particle vaccine <130> PH-9394-PCT <150> JP 2021-084942 <151> 2021-05-19 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1277 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Template plasmid DNA for HTLV-I SU gp46 IVT <400> 1 gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60 tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgggc aagttcctgg ccacactgat 120 cctgttcttc cagttctgcc ccctgatctt cggcgactac agccccagct gctgcaccct 180 gacaatcggc gtgagcagct accacagcaa gccctgcaac cccgcccagc ccgtgtgcag 240 ctggaccctg gacctgctgg ccctgagcgc cgaccaggcc ctgcagcccc cctgccccaa 300 cctggtgagc tacagcagct accacgccac ctacagcctg tacctgttcc cccactggac 360 caagaagccc aacagaaacg gcggaggcta ctacagcgcc agctacagcg acccctgcag 420 cctgaagtgc ccctacctgg gctgccagag ctggacatgc ccctacacag gcgccgtgag 480 cagcccctac tggaagttcc agcacgacgt gaacttcacc caagaggtga gccggctgaa 540 catcaacctg cacttcagca agtgcggctt cccattcagc ctgctggtgg acgcccccgg 600 ctacgacccc atctggttcc tgaacaccga gcccagccag ctgcccccaa cagccccacc 660 cctgctgccc cacagcaacc tggaccacat cctggaaccc agcatcccct ggaagagcaa 720 gctgctgaca ctggtgcagc tgaccctgca gagcaccaac tacacctgca tcgtgtgcat 780 cgaccgggcc agcctgagca catggcacgt gctgtacagc cccaacgtga gcgtgcccag 840 cagcagcagc acacccctgc tgtaccccag cctggcactg cccgcccccc acctgacact 900 gcccttcaac tggacccact gcttcgaccc ccagatccag gccatcgtga gcagcccatg 960 ccacaacagc ctgatcctgc ccccattcag cctgagcccc gtgcccacac tgggcagcag 1020 aagcagaaga tgagctcgct ttcttgctgt ccaatttcta ttaaaggttc ctttgttccc 1080 taagtccaac tactaaactg ggggatatta tgaagggcct tgagcatctg gattctgcct 1140 aataaaaaac atttattttc attgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaagag cactagt 1277 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sense primer <400> 2 taatacgact cactataagg agac 24 <210> 3 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> antisense primer <400> 3 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt gcaatgaaaa taaatgtttt 120 ttattaggc 129 <210> 4 <211> 1258 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Template plasmid DNA for SU gp46 in vitro transcription (IVT) <400> 4 taatacgact cactataagg agacccaagc tacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac 60 tagcaacctc aaacagacac cgccaccatg ggcaagttcc tggccacact gatcctgttc 120 ttccagttct gccccctgat cttcggcgac tacagcccca gctgctgcac cctgacaatc 180 ggcgtgagca gctaccacag caagccctgc aaccccgccc agcccgtgtg cagctggacc 240 ctggacctgc tggccctgag cgccgaccag gccctgcagc ccccctgccc caacctggtg 300 agctacagca gctaccacgc cacctacagc ctgtacctgt tcccccactg gaccaagaag 360 cccaacagaa acggcggagg ctactacagc gccagctaca gcgacccctg cagcctgaag 420 tgcccctacc tgggctgcca gagctggaca tgcccctaca caggcgccgt gagcagcccc 480 tactggaagt tccagcacga cgtgaacttc acccaagagg tgagccggct gaacatcaac 540 ctgcacttca gcaagtgcgg cttcccattc agcctgctgg tggacgcccc cggctacgac 600 cccatctggt tcctgaacac cgagcccagc cagctgcccc caacagcccc acccctgctg 660 ccccacagca acctggacca catcctggaa cccagcatcc cctggaagag caagctgctg 720 acactggtgc agctgaccct gcagagcacc aactacacct gcatcgtgtg catcgaccgg 780 gccagcctga gcacatggca cgtgctgtac agccccaacg tgagcgtgcc cagcagcagc 840 agcacacccc tgctgtaccc cagcctggca ctgcccgccc cccacctgac actgcccttc 900 aactggaccc actgcttcga cccccagatc caggccatcg tgagcagccc atgccacaac 960 agcctgatcc tgcccccatt cagcctgagc cccgtgccca cactgggcag cagaagcaga 1020 agatgagctc gctttcttgc tgtccaattt ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc 1080 aactactaaa ctgggggata ttatgaaggg ccttgagcat ctggattctg cctaataaaa 1140 aacatttatt ttcattgcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1258 <210> 5 <211> 1358 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Template plasmid DNA for HTLV-I gp46-Fib IVT <400> 5 gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60 tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgggc aagttcctgg ccacactgat 120 cctgttcttc cagttctgcc ccctgatctt cggcgactac agccccagct gctgcaccct 180 gacaatcggc gtgagcagct accacagcaa gccctgcaac cccgcccagc ccgtgtgcag 240 ctggaccctg gacctgctgg ccctgagcgc cgaccaggcc ctgcagcccc cctgccccaa 300 cctggtgagc tacagcagct accacgccac ctacagcctg tacctgttcc cccactggac 360 caagaagccc aacagaaacg gcggaggcta ctacagcgcc agctacagcg acccctgcag 420 cctgaagtgc ccctacctgg gctgccagag ctggacatgc ccctacacag gcgccgtgag 480 cagcccctac tggaagttcc agcacgacgt gaacttcacc caagaggtga gccggctgaa 540 catcaacctg cacttcagca agtgcggctt cccattcagc ctgctggtgg acgcccccgg 600 ctacgacccc atctggttcc tgaacaccga gcccagccag ctgcccccaa cagccccacc 660 cctgctgccc cacagcaacc tggaccacat cctggaaccc agcatcccct ggaagagcaa 720 gctgctgaca ctggtgcagc tgaccctgca gagcaccaac tacacctgca tcgtgtgcat 780 cgaccgggcc agcctgagca catggcacgt gctgtacagc cccaacgtga gcgtgcccag 840 cagcagcagc acacccctgc tgtaccccag cctggcactg cccgcccccc acctgacact 900 gcccttcaac tggacccact gcttcgaccc ccagatccag gccatcgtga gcagcccatg 960 ccacaacagc ctgatcctgc ccccattcag cctgagcccc gtgcccacac tcggcagcgg 1020 cagcggcagc ggctacatcc ccgaggcccc cagagacggc caggcctacg tcagaaagga 1080 cggcgaatgg gtgctgctga gcaccttcct gtgagctcgc tttcttgctg tccaatttct 1140 attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc 1200 ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga gcactagt 1358 <210> 6 <211> 1339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Template plasmid DNA for gp46-Fib in vitro transcription (IVT) <400> 6 taatacgact cactataagg agacccaagc tacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac 60 tagcaacctc aaacagacac cgccaccatg ggcaagttcc tggccacact gatcctgttc 120 ttccagttct gccccctgat cttcggcgac tacagcccca gctgctgcac cctgacaatc 180 ggcgtgagca gctaccacag caagccctgc aaccccgccc agcccgtgtg cagctggacc 240 ctggacctgc tggccctgag cgccgaccag gccctgcagc ccccctgccc caacctggtg 300 agctacagca gctaccacgc cacctacagc ctgtacctgt tcccccactg gaccaagaag 360 cccaacagaa acggcggagg ctactacagc gccagctaca gcgacccctg cagcctgaag 420 tgcccctacc tgggctgcca gagctggaca tgcccctaca caggcgccgt gagcagcccc 480 tactggaagt tccagcacga cgtgaacttc acccaagagg tgagccggct gaacatcaac 540 ctgcacttca gcaagtgcgg cttcccattc agcctgctgg tggacgcccc cggctacgac 600 cccatctggt tcctgaacac cgagcccagc cagctgcccc caacagcccc acccctgctg 660 ccccacagca acctggacca catcctggaa cccagcatcc cctggaagag caagctgctg 720 acactggtgc agctgaccct gcagagcacc aactacacct gcatcgtgtg catcgaccgg 780 gccagcctga gcacatggca cgtgctgtac agccccaacg tgagcgtgcc cagcagcagc 840 agcacacccc tgctgtaccc cagcctggca ctgcccgccc cccacctgac actgcccttc 900 aactggaccc actgcttcga cccccagatc caggccatcg tgagcagccc atgccacaac 960 agcctgatcc tgcccccatt cagcctgagc cccgtgccca cactcggcag cggcagcggc 1020 agcggctaca tccccgaggc ccccagagac ggccaggcct acgtcagaaa ggacggcgaa 1080 tgggtgctgc tgagcacctt cctgtgagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag 1140 gttcctttgt tccctaagtc caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca 1200 tctggattct gcctaataaa aaacatttat tttcattgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1339 <210> 7 <211> 1748 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Template plasmid DNA for HTLV-I dgb62-FIb IVT <400> 7 gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60 tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgggc aagttcctgg ccacactgat 120 cctgttcttc cagttctgcc ccctgatctt cggcgactac agccccagct gctgcaccct 180 gacaatcggc gtgagcagct accacagcaa gccctgcaac cccgcccagc ccgtgtgcag 240 ctggaccctg gacctgctgg ccctgagcgc cgaccaggcc ctgcagcccc cctgccccaa 300 cctggtgagc tacagcagct accacgccac ctacagcctg tacctgttcc cccactggac 360 caagaagccc aacagaaacg gcggaggcta ctacagcgcc agctacagcg acccctgcag 420 cctgaagtgc ccctacctgg gctgccagag ctggacatgc ccctacacag gcgccgtgag 480 cagcccctac tggaagttcc agcacgacgt gaacttcacc caagaggtga gccggctgaa 540 catcaacctg cacttcagca agtgcggctt cccattcagc ctgctggtgg acgcccccgg 600 ctacgacccc atctggttcc tgaacaccga gcccagccag ctgcccccaa cagccccacc 660 cctgctgccc cacagcaacc tggaccacat cctggaaccc agcatcccct ggaagagcaa 720 gctgctgaca ctggtgcagc tgaccctgca gagcaccaac tacacctgca tcgtgtgcat 780 cgaccgggcc agcctgagca catggcacgt gctgtacagc cccaacgtga gcgtgcccag 840 cagcagcagc acacccctgc tgtaccccag cctggcactg cccgcccccc acctgacact 900 gcccttcaac tggacccact gcttcgaccc ccagatccag gccatcgtga gcagcccatg 960 ccacaacagc ctgatcctgc ccccattcag cctgagcccc gtgcccacac tcggcagcgg 1020 aagcggaagc gcagtgcccg tggccgtgtg gctggtgagc gccctggcca tgggagccgg 1080 cgtggcaggc ggaatcacag gcagcatgag cctggccagc ggcaagagcc tgctgcacga 1140 ggtggacaag gacatcagcc agctgaccca ggccatcgtg aagaaccaca agaacctgct 1200 gaagatcgcc cagtacgccg cccagaacag aagaggactg gacctgctgt tctgggagca 1260 aggcggactg tgcaaagccc tccaagagca gtgcagattc cccaacatca ccaacagcca 1320 cgtgcccatc ctgcaagagc ggcccccact ggaaaacaga gtgctgacag gatggggcct 1380 gaactgggac ctgggactga gccagtgggc cagagaggcc ggctacatcc ccgaggcccc 1440 cagagacgga caggcctacg tcagaaagga cggcgaatgg gtgctgctga gcaccttcct 1500 gtgagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa 1560 ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa 1620 catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 1740 gcactagt 1748 <210> 8 <211> 1729 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Template plasmid DNA for dgb62-FIb in vitro transcription (IVT) <400> 8 taatacgact cactataagg agacccaagc tacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac 60 tagcaacctc aaacagacac cgccaccatg ggcaagttcc tggccacact gatcctgttc 120 ttccagttct gccccctgat cttcggcgac tacagcccca gctgctgcac cctgacaatc 180 ggcgtgagca gctaccacag caagccctgc aaccccgccc agcccgtgtg cagctggacc 240 ctggacctgc tggccctgag cgccgaccag gccctgcagc ccccctgccc caacctggtg 300 agctacagca gctaccacgc cacctacagc ctgtacctgt tcccccactg gaccaagaag 360 cccaacagaa acggcggagg ctactacagc gccagctaca gcgacccctg cagcctgaag 420 tgcccctacc tgggctgcca gagctggaca tgcccctaca caggcgccgt gagcagcccc 480 tactggaagt tccagcacga cgtgaacttc acccaagagg tgagccggct gaacatcaac 540 ctgcacttca gcaagtgcgg cttcccattc agcctgctgg tggacgcccc cggctacgac 600 cccatctggt tcctgaacac cgagcccagc cagctgcccc caacagcccc acccctgctg 660 ccccacagca acctggacca catcctggaa cccagcatcc cctggaagag caagctgctg 720 acactggtgc agctgaccct gcagagcacc aactacacct gcatcgtgtg catcgaccgg 780 gccagcctga gcacatggca cgtgctgtac agccccaacg tgagcgtgcc cagcagcagc 840 agcacacccc tgctgtaccc cagcctggca ctgcccgccc cccacctgac actgcccttc 900 aactggaccc actgcttcga cccccagatc caggccatcg tgagcagccc atgccacaac 960 agcctgatcc tgcccccatt cagcctgagc cccgtgccca cactcggcag cggaagcgga 1020 agcgcagtgc ccgtggccgt gtggctggtg agcgccctgg ccatgggagc cggcgtggca 1080 ggcggaatca caggcagcat gagcctggcc agcggcaaga gcctgctgca cgaggtggac 1140 aaggacatca gccagctgac ccaggccatc gtgaagaacc acaagaacct gctgaagatc 1200 gcccagtacg ccgcccagaa cagaagagga ctggacctgc tgttctggga gcaaggcgga 1260 ctgtgcaaag ccctccaaga gcagtgcaga ttccccaaca tcaccaacag ccacgtgccc 1320 atcctgcaag agcggccccc actggaaaac agagtgctga caggatgggg cctgaactgg 1380 gacctgggac tgagccagtg ggccagagag gccggctaca tccccgaggc ccccagagac 1440 ggacaggcct acgtcagaaa ggacggcgaa tgggtgctgc tgagcacctt cctgtgagct 1500 cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc caactactaa 1560 actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa aaacatttat 1620 tttcattgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1729 <210> 9 <211> 1451 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Template plasmid DNA for HTLV-I sec Tax mutant IVT <400> 9 gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60 tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatggac tggacctgga tcctgttcct 120 ggtggccgcc gccacaagag tgcacagcgc acacttccca ggcttcggcc agagcctgct 180 gttcggctac cccgtgtacg tgttcggcga ctgcgtgcaa ggcgactggt gccccatcag 240 cggcggcctg tgcagcgcca gactgcacag acacgccctg ctggccacat gccccgagca 300 ccagatcacc tgggacccca tcgacggcag agtgatcgga agcgccctgc agttcctgat 360 ccccagactg cccagcttcc ccacacagag aaccagcaag accctgaagg tgctgacccc 420 ccccatcaca cacaccacac ccaacatccc cccaagcttc ctgcaggcca tgcggaagta 480 cagccccttc agaaacggct acatggaacc cacactgggc cagcacctgc ccgccagcag 540 cttccccgac cccggactga ggccccagaa cctgtacaca ctgtggggcg gcagcgtcgt 600 gtgcatgtac ctgtaccagc tgagcccacc aatcacatgg cccctgctgc cccacgtgat 660 cttctgccac cccggacagc tgggcgcctt cctgaccaac gtgccctaca agcggatcga 720 ggaactgctg tacaagatca gcctgaccac aggcgccctg atcatcctgc ccgaggactg 780 cctgcccacc acactgttcc agcccgccag agcccccgtg acactgaccg cctggcagaa 840 cggcctgctg ccattccaca gcaccctgac aacacccggc ctgatctgga ccttcaccga 900 cggcacaccc atgatcagcg gcccctgccc caaggacggc cagcccagcc tggtgctgca 960 gagcagcagc ttcatcttcc acaagttcca gaccaaggcc taccacccca gcttcctgct 1020 gagccacgga ctgatccagt acagcagctt ccacagcctg cacctgctgt tcgaagagta 1080 cacaaacatc cccatcagcc ggagcttcaa cgagaaagag gccgacgaca acgaccacga 1140 gccccagatc agccccggcg gactggaacc ccccagcgag aagcacttcc gggaaaccga 1200 agtgtgagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc 1260 caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa 1320 aaacatttat tttcattgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 agagcactag t 1451 <210> 10 <211> 1432 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Template plasmid DNA for sec Tax mutant in vitro transcription (IVT) <400> 10 taatacgact cactataagg agacccaagc tacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac 60 tagcaacctc aaacagacac cgccaccatg gactggacct ggatcctgtt cctggtggcc 120 gccgccacaa gagtgcacag cgcacacttc ccaggcttcg gccagagcct gctgttcggc 180 taccccgtgt acgtgttcgg cgactgcgtg caaggcgact ggtgccccat cagcggcggc 240 ctgtgcagcg ccagactgca cagacacgcc ctgctggcca catgccccga gcaccagatc 300 acctgggacc ccatcgacgg cagagtgatc ggaagcgccc tgcagttcct gatccccaga 360 ctgcccagct tccccacaca gagaaccagc aagaccctga aggtgctgac cccccccatc 420 acacacacca cacccaacat ccccccaagc ttcctgcagg ccatgcggaa gtacagcccc 480 ttcagaaacg gctacatgga acccacactg ggccagcacc tgcccgccag cagcttcccc 540 gaccccggac tgaggcccca gaacctgtac acactgtggg gcggcagcgt cgtgtgcatg 600 tacctgtacc agctgagccc accaatcaca tggcccctgc tgccccacgt gatcttctgc 660 caccccggac agctgggcgc cttcctgacc aacgtgccct acaagcggat cgaggaactg 720 ctgtacaaga tcagcctgac cacaggcgcc ctgatcatcc tgcccgagga ctgcctgccc 780 accacactgt tccagcccgc cagagccccc gtgacactga ccgcctggca gaacggcctg 840 ctgccattcc acagcaccct gacaacaccc ggcctgatct ggaccttcac cgacggcaca 900 cccatgatca gcggcccctg ccccaaggac ggccagccca gcctggtgct gcagagcagc 960 agcttcatct tccacaagtt ccagaccaag gcctaccacc ccagcttcct gctgagccac 1020 ggactgatcc agtacagcag cttccacagc ctgcacctgc tgttcgaaga gtacacaaac 1080 atccccatca gccggagctt caacgagaaa gaggccgacg acaacgacca cgagccccag 1140 atcagccccg gcggactgga accccccagc gagaagcact tccgggaaac cgaagtgtga 1200 gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 1260 taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 1320 tattttcatt gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1432 <210> 11 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Tax wild-type amino acid sequence <400> 11 Met Ala His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Phe Gly Tyr Pro 1 5 10 15 Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Gly Asp Trp Cys Pro Ile Ser 20 25 30 Gly Gly Leu Cys Ser Ala Arg Leu His Arg His Ala Leu Leu Ala Thr 35 40 45 Cys Pro Glu His Gln Ile Thr Trp Asp Pro Ile Asp Gly Arg Val Ile 50 55 60 Gly Ser Ala Leu Gln Phe Leu Ile Pro Arg Leu Pro Ser Phe Pro Thr 65 70 75 80 Gln Arg Thr Ser Lys Thr Leu Lys Val Leu Thr Pro Pro Ile Thr His 85 90 95 Thr Thr Pro Asn Ile Pro Pro Ser Phe Leu Gln Ala Met Arg Lys Tyr 100 105 110 Ser Pro Phe Arg Asn Gly Tyr Met Glu Pro Thr Leu Gly Gln His Leu 115 120 125 Pro Thr Leu Ser Phe Pro Asp Pro Gly Leu 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for sec Tax mutant polyA20 <400> 30 gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60 tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatggac tggacctgga tcctgttcct 120 ggtggccgcc gccacaagag tgcacagcgc acacttccca ggcttcggcc agagcctgct 180 gttcggctac cccgtgtacg tgttcggcga ctgcgtgcaa ggcgactggt gccccatcag 240 cggcggcctg tgcagcgcca gactgcacag acacgccctg ctggccacat gccccgagca 300 ccagatcacc tgggacccca tcgacggcag agtgatcgga agcgccctgc agttcctgat 360 ccccagactg cccagcttcc ccacacagag aaccagcaag accctgaagg tgctgacccc 420 ccccatcaca cacaccacac ccaacatccc cccaagcttc ctgcaggcca tgcggaagta 480 cagccccttc agaaacggct acatggaacc cacactgggc cagcacctgc ccgccagcag 540 cttccccgac cccggactga ggccccagaa cctgtacaca ctgtggggcg gcagcgtcgt 600 gtgcatgtac ctgtaccagc tgagcccacc aatcacatgg cccctgctgc cccacgtgat 660 cttctgccac cccggacagc tgggcgcctt cctgaccaac gtgccctaca agcggatcga 720 ggaactgctg tacaagatca gcctgaccac aggcgccctg atcatcctgc ccgaggactg 780 cctgcccacc acactgttcc agcccgccag agcccccgtg acactgaccg 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cccgugacac ugaccgccug gcagaacggc cugcugccau uccacagcac 840 ccugacaaca cccggccuga ucuggaccuu caccgacggc acacccauga ucagcggccc 900 cugccccaag gacggccagc ccagccuggu gcugcagagc agcagcuuca ucuuccacaa 960 guuccagacc aaggccuacc accccagcuu ccugcugagc cacggacuga uccaguacag 1020 cagcuuccac agccugcacc ugcuguucga agaguacaca aacaucccca ucagccggag 1080 cuucaacgag aaagaggccg acgacaacga ccacgagccc cagaucagcc ccggcggacu 1140 ggaacccccc agcgagaagc acuuccggga aaccgaagug ugagcucgcu uucuugcugu 1200 ccaauuucua uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug ggggauauua 1260 ugaagggccu ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc auugcaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1355 <210> 40 <211> 1335 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> mRNA sequence for sec Tax mutant polyA20 <400> 40 aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60 caccgccacc auggacugga ccuggauccu guuccuggug gccgccgcca caagagugca 120 cagcgcacac uucccaggcu ucggccagag ccugcuguuc ggcuaccccg uguacguguu 180 cggcgacugc 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ugcuguucga agaguacaca aacaucccca ucagccggag 1080 cuucaacgag aaagaggccg acgacaacga ccacgagccc cagaucagcc ccggcggacu 1140 ggaacccccc agcgagaagc acuuccggga aaccgaagug ugagcucgcu uucuugcugu 1200 ccaauuucua uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug ggggauauua 1260 ugaagggccu ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc auugcaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaa 1335

Claims (57)

  1. 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자로서, 지질이 일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 상기 입자.
    Figure pct00017

    식 중,
    R1 및 R2 는, 독립적으로, C1-C3 알킬기를 나타내고 ;
    L1 은, C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C17-C19 알케닐기를 나타내고 ;
    L2 는, C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알킬기, 또는 C2-C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알케닐기를 나타내고 ;
    p 는, 3, 또는 4 이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 R1 및 R2 가, 모두 메틸기인, 입자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 p 가, 3 인 입자.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 L1 이, 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C17-C19 알케닐기인, 입자.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 L2 가, 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C19 알케닐기인, 입자.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 L2 가, 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C10-C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수 개 갖고 있어도 되는 C17-C19 알케닐기인, 입자.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 L1 이, (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기, cis-8-헵타데세닐기, 또는 (8Z,11Z)-헵타데카디에닐기인 입자.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 L2 가, 데실기, cis-7-데세닐기, 도데실기, 또는 (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기인, 입자.
  9. 제 1 항에 있어서,
    카티온성 지질이 하기의 구조식 :
    Figure pct00018

    으로 나타내는 입자.
  10. 제 1 항에 있어서,
    카티온성 지질이 하기의 구조식 :
    Figure pct00019

    으로 나타내는 입자.
  11. 제 1 항에 있어서,
    카티온성 지질이 하기의 구조식 :
    Figure pct00020

    으로 나타내는 입자.
  12. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    지질이, 추가로, 양친매성 지질, 스테롤류 및 PEG 지질을 포함하는 입자.
  13. 제 11 항에 있어서,
    지질이, 추가로, 양친매성 지질, 스테롤류 및 PEG 지질을 포함하는 입자.
  14. 제 12 항에 있어서,
    양친매성 지질이, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 입자.
  15. 제 13 항에 있어서,
    양친매성 지질이, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 입자.
  16. 제 12 항 또는 제 14 항에 있어서,
    스테롤류가 콜레스테롤인 입자.
  17. 제 13 항 또는 제 15 항에 있어서,
    스테롤류가 콜레스테롤인 입자.
  18. 제 12 항, 제 14 항, 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG 지질이, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤메톡시폴리에틸렌글리콜 및/또는 N-[메톡시폴리(에틸렌글리콜)2000]카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민인 입자.
  19. 제 13 항, 제 15 항, 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG 지질이, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤메톡시폴리에틸렌글리콜 및/또는 N-[메톡시폴리(에틸렌글리콜)2000]카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민인입자.
  20. 제 12 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 5 ∼ 25 ％, 스테롤류가 10 ∼ 55 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 인 입자.
  21. 제 20 항에 있어서,
    양친매성 지질이 10 ∼ 25 ％ 인 입자.
  22. 제 12 항, 제 14 항, 제 16 항, 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 5 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 50 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 55 ％, PEG 지질이 1 ∼ 3 ％ 인 입자.
  23. 제 22 항에 있어서,
    양친매성 지질이 10 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 50 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2.5 ％ 인 입자.
  24. 제 23 항에 있어서,
    PEG 지질이 1 ∼ 2 ％ 인 입자.
  25. 제 13 항, 제 15 항, 제 17 항, 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 25 ％, 스테롤류가 10 ∼ 50 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 3 ％ 인 입자.
  26. 제 25 항에 있어서,
    스테롤류가 10 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 42.5 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2.5 ％ 인 입자.
  27. 제 26 항에 있어서,
    PEG 지질이 1 ∼ 2 ％ 인 입자.
  28. 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 15 ∼ 30 인 입자.
  29. 제 28 항에 있어서,
    핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 15 ∼ 25 인 입자.
  30. 제 29 항에 있어서,
    핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 17.5 ∼ 22.5 인 입자.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원이 올리고머화 도메인과의 융합 단백질인 입자.
  32. 제 31 항에 있어서,
    올리고머화 도메인이 피브리틴인 입자.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서,
    인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원이 서열 번호 14 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 Tax 항원이, 서열 번호 11 의 아미노산 서열에 대하여, T130A, L131S, L319R 및 L320S 로 이루어지는 군에서 선택되는 변이 중 적어도 1 개를 갖고, 그 변이 아미노산 이외의 아미노산 서열을 비교한 경우, 서열 번호 11 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
  35. 제 34 항에 있어서,
    인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 Tax 항원이, 서열 번호 11 의 아미노산 서열에 대하여, T130A, L131S, L319R 및 L320S 의 변이를 갖고, 그 변이 아미노산 이외의 아미노산 서열을 비교한 경우, 서열 번호 11 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 Tax 항원이, 시그널 펩티드와의 융합 단백질인 입자.
  37. 제 36 항에 있어서,
    시그널 펩티드가 서열 번호 13 의 아미노산 서열의 1 번째 ∼ 18 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인 입자.
  38. 제 31 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산이, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), gp46 항원 또는 Tax 항원의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 미부 (polyA) 를 포함하는 mRNA 인 입자.
  39. 제 38 항에 있어서,
    인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원을 발현시킬 수 있는 핵산의 서열이, 서열 번호 17 또는 18 의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 입자.
  40. 제 38 항에 있어서,
    인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 Tax 항원을 발현시킬 수 있는 핵산의 서열이, 서열 번호 20 의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 입자.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산이 적어도 1 개의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 입자.
  42. 제 41 항에 있어서,
    수식 뉴클레오티드가, 5 위치가 치환된 피리미딘 뉴클레오티드 및/또는 1 위치가 치환되어 있어도 되는 슈도우리딘 중 적어도 1 개를 포함하는 입자.
  43. 제 41 항에 있어서,
    수식 뉴클레오티드가, 5-메틸시티딘, 5-메톡시우리딘, 5-메틸우리딘, 슈도우리딘, 및 1-알킬슈도우리딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 포함하는 입자.
  44. 제 41 항에 있어서,
    수식 뉴클레오티드가, 5-메틸시티딘, 5-메틸우리딘, 및 1-메틸슈도우리딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 포함하는 입자.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    평균 입자경이 30 ∼ 300 ㎚ 인 입자.
  46. 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물을 제조하기 위한 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 기재된 입자의 사용.
  47. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 기재된 입자를 함유하는, 조성물.
  48. 제 47 항에 있어서,
    인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 in vivo 또는 in vitro 에서 발현시키기 위한 조성물.
  49. 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서,
    의약으로서 사용되는 조성물.
  50. 제 49 항에 있어서,
    인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물.
  51. 제 49 항 또는 제 50 항에 있어서,
    인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물.
  52. 제 49 항 또는 제 50 항에 있어서,
    HTLV-1 감염자에 대하여, 성인 T 세포 백혈병·림프종 (ATLL), HTLV-1 관련 척수증 (HAM) 및 HTLV-1 포도막염 (HU) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 HTLV-1 에서 기인하는 질환의 발증의 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물.
  53. 제 47 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 in vitro 에서 발현시키는 방법.
  54. 제 47 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 의 gp46 항원 또는 Tax 항원을 in vivo 에서 발현시키는 방법.
  55. 제 49 항 또는 제 50 항에 기재된 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  56. 제 49 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1 형 (HTLV-1) 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법.
  57. 제 49 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 성인 T 세포 백혈병·림프종 (ATLL), HTLV-1 관련 척수증 (HAM) 및 HTLV-1 포도막염 (HU) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 HTLV-1 에서 기인하는 질환의 발증을 예방 및/또는 치료하는 방법.
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