CN117320746A - Htlv-1核酸脂质颗粒疫苗 - Google Patents

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CN117320746A CN202280035124.6A CN202280035124A CN117320746A CN 117320746 A CN117320746 A CN 117320746A CN 202280035124 A CN202280035124 A CN 202280035124A CN 117320746 A CN117320746 A CN 117320746A
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石井健
福岛卓也
田中勇悦
武下文彦
小泉诚
丹羽贵子
野草晶子
城内直
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University of the Ryukyus NUC
Daiichi Sankyo Co Ltd
National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition
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University of the Ryukyus NUC
Daiichi Sankyo Co Ltd
National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition
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Abstract

本发明提供用于预防和/或治疗人类T细胞白血病病毒1型(Human T‑cell Leukemia Virus type 1，HTLV‑1)引起的感染的疫苗。一种脂质颗粒，其包封能够表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV‑1)的gp46抗原或Tax抗原的核酸，其中，脂质包括由通式(Ia)表示的阳离子性脂质或其药学上可接受的盐：[化1]式中，R1和R2独立地表示C1‑C3烷基；L1表示可以具有1个或更多个C2‑C4烷酰氧基的C17‑C19烯基；L2表示可以具有1个或更多个C2‑C4烷酰氧基的C10‑C19烷基，或者可以具有1个或更多个C2‑C4烷酰氧基的C10‑C19烯基；p为3或4。

Description

HTLV-1核酸脂质颗粒疫苗
技术领域
本发明涉及包封HTLV-1mRNA的核酸脂质颗粒疫苗。
背景技术
人类T细胞白血病病毒1型(Human T-cell Leukemia Virus type 1，HTLV-1)是致癌性高的反转录病毒。全世界有1000万～2000万的HTLV-1感染者，日本也有100万感染者(非专利文献1)。有3％～5％的HTLV-1感染者出现成人T细胞白血病(Adult T-cellleukemia，ATL)，预后差。当前，还没有预防HTLV-1感染的疫苗和预防ATL发病的药物。另外，有助于满意的ATL治疗效果的标准治疗也尚未建立。例如，标准治疗之一的多种药物并用的化学疗法中，长期生存者不到10％。
近年来，对于ATL患者开始进行异基因造血干细胞移植，在部分患者中取得了较高的治疗效果。关于异基因造血干细胞移植的抗肿瘤效果，除了大量的抗癌剂和全身照射放射线的移植前处理的作用以外，移植后供体的免疫活性细胞产生的抗肿瘤效应(移植物抗白血病效应，GVL效应)也有所帮助(非专利文献2)。特别是有报告称，对HTLV-1复制所必需的转录激活因子Tax具有特异性的细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)会增加(非专利文献3)。但是，异基因造血干细胞移植的副反应即移植物抗宿主病(graft versushost disease，GVHD)的死亡率高。
Tax具有NF-kB激活能力，是HTLV-1复制所必需的蛋白质(非专利文献4)。另外，在HTLV-1感染细胞和ATL细胞中也确认到Tax介导的NF-kB过度激活，表明Tax的NF-kB激活与感染细胞的癌变有关(非专利文献5、非专利文献6)。另外，非专利文献7鉴定出了Tax对NF-kB激活重要的氨基酸，使用在这些氨基酸中插入点突变的Tax突变体，分析了Tax对NF-kB激活的作用机制(非专利文献8、非专利文献9)。但是，并没有对使用Tax和Tax突变体的HTLV-1进行预防或治疗的有效疫苗的示例。
使用移植了人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclearcells，hPBMC)的免疫缺陷小鼠进行HTLV-1感染实验，结果表明，HTLV-1感染会被靶向HTLV-1的包膜蛋白gp46的抗gp46抗体中和(非专利文献10)。另外，也暗示出在使用大鼠的垂直感染模型中，具有中和活性的抗gp46抗体有可能预防垂直感染。但是，并没有对使用gp46的HTLV-1进行预防或治疗的有效疫苗的示例。
作为将编码抗原的mRNA包封在脂质纳米颗粒(lipid nano-particle，LNP)中的LNP制剂(LNP-mRNA)，已知有SARS-CoV-2疫苗(非专利文献11)，或者流感疫苗(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公布第2015/164674号小册子
非专利文献
非专利文献1：Front Microbiol.(2012)3:388.
非专利文献2：Blood(2012)119(10):2409-2416.
非专利文献3：Cancer Research(2010)70(15):6181-6192.
非专利文献4：Lancet Infect Dis(2007)7:266-281.
非专利文献5：Front Microbiol.(2012)3:406.
非专利文献6：Viruses(2011)3(6):714-749.
非专利文献7：Gene Dev.(1990)4:1875.
非专利文献8：J.Biochem.(2011)150(6):679-686.
非专利文献9：J.Biol Chem.(2006)281(19):13075-13082.
非专利文献10：Viruses(2016)8(2):41.
非专利文献11：Science(2021)371:1152.
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供用于预防和/或治疗人类T细胞白血病病毒1型(Human T-cell Leukemia Virus type 1，HTLV-1)引起的感染的疫苗。
用于解决课题的技术方案
本发明人发现，包封HTLV-1mRNA的核酸脂质颗粒(LNP-mRNA)能够应用于对成人T细胞白血病的治疗和发病预防，直至完成了本发明。具体地，制作包封了表达HTLV-1Tax和gp46的mRNA的LNP-mRNA-HTLV-1，另外，在施用了LNP-mRNA-HTLV-1的小鼠和猴中，发现了有针对HTLV-1Tax和gp46的抗体产生，以及抑制HTLV-1感染细胞增殖的中和活性得到诱导。
本发明的要旨如下。
(1)一种脂质颗粒，其包封能够表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原的核酸，其中，脂质包括由通式(Ia)表示的阳离子性脂质或其药学上可接受的盐：
[化1]
式中，
R1和R2独立地表示C1-C3烷基；
L1表示可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C17-C19烯基；
L2表示可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烷基，或者可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烯基；
p为3或4。
(2)根据(1)所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的R1和R2共同为甲基。
(3)根据(1)或(2)所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的p为3。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的L1为可以具有1个或更多个乙酰氧基的C17-C19烯基。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的L2为可以具有1个或更多个乙酰氧基的C10-C12烷基，或者可以具有1个或更多个乙酰氧基的C10-C19烯基。
(6)根据(1)～(4)中任一项所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的L2为可以具有1个或更多个乙酰氧基的C10-C12烷基，或者可以具有1个或更多个乙酰氧基的C17-C19烯基。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的L1为(R)-11-乙酰氧基-顺式-8-十七烯基、顺式-8-十七烯基，或(8Z,11Z)-十七碳二烯基。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的L2为癸基、顺式-7-癸烯基、十二烷基，或(R)-11-乙酰氧基-顺式-8-十七烯基。
(9)根据(1)所述的颗粒，其中，阳离子性脂质由以下结构式表示：
[化2]
(10)根据(1)所述的颗粒，其中，阳离子性脂质由以下结构式表示：
[化3]
(11)根据(1)所述的颗粒，其中，阳离子性脂质由以下结构式表示：
[化4]
(12)根据(9)或(10)所述的颗粒，其中，脂质还包括两亲性脂质、固醇类和PEG脂质。
(13)根据(11)所述的颗粒，其中，脂质还包括两亲性脂质、固醇类和PEG脂质。
(14)根据(12)所述的颗粒，其中，两亲性脂质为选自于由以下物质组成的组的至少一种：二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱，以及二油酰磷脂酰乙醇胺。
(15)根据(13)所述的颗粒，其中，两亲性脂质为选自于由以下物质组成的组的至少一种：二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱，以及二油酰磷脂酰乙醇胺。
(16)根据(12)或(14)所述的颗粒，其中，固醇类为胆固醇。
(17)根据(13)或(15)所述的颗粒，其中，固醇类为胆固醇。
(18)根据(12)、(14)、(16)中任一项所述的颗粒，其中，PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇和/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺。
(19)根据(13)、(15)、(17)中任一项所述的颗粒，其中，PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇和/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺。
(20)根据(12)～(19)中任一项所述的颗粒，其中，关于两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质和PEG脂质的脂质组成，按照摩尔量计算，两亲性脂质为5％～25％，固醇类为10％～55％，阳离子性脂质为40％～65％，PEG脂质为1％～5％。
(21)根据(20)所述的颗粒，其中，两亲性脂质为10％～25％。
(22)根据权利要求(12)、(14)、(16)、(18)中任一项所述的颗粒，其中，关于两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质和PEG脂质的脂质组成，按照摩尔量计算，两亲性脂质为5％～15％，固醇类为35％～50％，阳离子性脂质为40％～55％，PEG脂质为1％～3％。
(23)根据(22)所述的颗粒，其中，两亲性脂质为10％～15％，固醇类为35％～45％，阳离子性脂质为40％～50％，PEG脂质为1％～2.5％。
(24)根据(23)所述的颗粒，其中，PEG脂质为1％～2％。
(25)根据权利要求(13)、(15)、(17)、(19)中任一项所述的颗粒，其中，关于两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质和PEG脂质的脂质组成，按照摩尔量计算，两亲性脂质为10％～25％，固醇类为10％～50％，阳离子性脂质为40％～65％，PEG脂质为1％～3％。
(26)根据(25)所述的颗粒，其中，固醇类为10％～45％，阳离子性脂质为42.5％～65％，PEG脂质为1％～2.5％。
(27)根据(26)所述的颗粒，其中，PEG脂质为1％～2％。
(28)根据(20)～(27)中任一项所述的颗粒，其中，总脂质重量相对于核酸重量的比率为15～30。
(29)根据(28)所述的颗粒，其中，总脂质重量相对于核酸重量的比率为15～25。
(30)根据(29)所述的颗粒，其中，总脂质重量相对于核酸重量的比率为17.5～22.5。
(31)根据(1)～(30)中任一项所述的颗粒，其中，人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原为与寡聚化结构域的融合蛋白。
(32)根据(31)所述的颗粒，其中，寡聚化结构域为fibritin。
(33)根据(31)或(32)所述的颗粒，其中，人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原由与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列构成。
(34)根据(1)～(33)中任一项所述的颗粒，其中，人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原相对于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有选自于由T130A、L131S、L319R和L320S组成的组中的至少一种突变，并由对该突变氨基酸以外的氨基酸序列进行对比时，与SEQID NO:11的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列构成。
(35)根据(34)所述的颗粒，其中，人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原相对于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有T130A、L131S、L319R和L320S突变，并由对该突变氨基酸以外的氨基酸序列进行对比时，与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列构成。
(36)根据(1)～(35)中任一项所述的颗粒，其中，人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原为与信号肽的融合蛋白。
(37)根据(36)所述的颗粒，其信号肽为由SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第1位～第18位的氨基酸序列构成的肽。
(38)根据(31)～(37)中任一项所述的颗粒，其中，能够表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原的核酸为包含帽子结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)gp46抗原或Tax抗原的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾(polyA)的mRNA。
(39)根据(38)所述的颗粒，其中，能够表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原的核酸的序列由与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的序列具有至少90％一致性的核苷酸序列构成。
(40)根据(38)所述的颗粒，其中，能够表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原的核酸的序列由与SEQ ID NO:20的序列具有至少90％一致性的核苷酸序列构成。
(41)根据(1)～(40)中任一项所述的颗粒，其中，核酸包含至少1个修饰核苷酸。
(42)根据(41)所述的颗粒，其中，修饰核苷酸包含第5位取代的嘧啶核苷酸和/或第1位可以取代的假尿嘧啶核苷中的至少1个。
(43)根据(41)所述的颗粒，其中，修饰核苷酸包含选自于由以下物质组成的组的至少1个：5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿嘧啶核苷，以及1-烷基假尿嘧啶核苷。
(44)根据(41)所述的颗粒，其中，修饰核苷酸包含选自于由以下物质组成的组的至少1个：5-甲基胞苷、5-甲基尿苷，以及1-甲基假尿嘧啶核苷。
(45)根据(1)～(44)中任一项所述的颗粒，其平均粒径为30～300nm。
(46)(1)～(45)中任一项所述的颗粒在制造用于预防和/或治疗由人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)引起的感染的组合物中的用途。
(47)一种组合物，其含有(1)～(45)中任一项所述的颗粒。
(48)根据(47)所示的组合物，其用于在体内或体外表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原。
(49)根据(47)或(48)所述的组合物，其用作药物。
(50)根据(49)所述的组合物，其用于诱导针对人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的免疫反应。
(51)根据(49)或(50)所述的组合物，其用于预防和/或治疗人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染。
(52)根据(49)或(50)所述的组合物，其用于预防和/或治疗选自于由以下疾病组成的组的由HTLV-1引发的疾病的发病：成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相关性脊髓病(HAM)，以及HTLV-1葡萄膜炎(HU)。
(53)在体外表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原的方法，包括：将(47)～(50)中任一项所述的组合物导入到细胞中。
(54)在体内表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原的方法，包括：对哺乳动物施用(47)～(51)中任一项所述的组合物。
(55)针对人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的免疫反应的诱导方法，包括：对哺乳动物施用(49)或(50)所述的组合物。
(56)人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染的预防和/或治疗方法，包括：对哺乳动物施用(49)～(52)中任一项所述的组合物。
(57)由HTLV-1引发的疾病的发病的预防和/或治疗方法，所述疾病选自于由以下疾病组成的组：成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相关性脊髓病(HAM)，以及HTLV-1葡萄膜炎(HU)；所述方法包括：对哺乳动物施用(49)～(52)中任一项所述的组合物。
(58)一种肽，其由具有使致癌性降低或消失的突变的Tax抗原与信号肽融合而成，所述Tax抗原为人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原。
(59)根据(58)所述的肽，其中，Tax抗原由以下氨基酸序列构成：相对于SEQ IDNO:11的氨基酸序列，具有选自于由T130A、L131S、L319R和L320S组成的组中的至少一种突变，对该突变氨基酸以外的氨基酸序列进行对比时，与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％一致性。
(60)根据(58)或(59)所述的肽，其中，信号肽为由SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第1位～第18位的氨基酸序列构成的肽。
(61)根据(31)～(37)中任一项所述的颗粒，其中，能够表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原的核酸为包含由帽子结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、gp46抗原或Tax抗原的翻译区和3’非翻译区(3’-UTR)组成的构成的mRNA。
(62)根据(61)所述的颗粒，其中，由帽子结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、gp46抗原或Tax抗原的翻译区和3’非翻译区(3’-UTR)组成的构成为与SEQ ID NO:17的第1位至第1141位的序列或SEQ ID NO:18的第1位至第1222位的序列具有至少90％一致性的核苷酸序列。
(63)根据(61)所述的颗粒，其中，由帽子结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、gp46抗原或Tax抗原的翻译区和3’非翻译区(3’-UTR)组成的构成为与SEQ ID NO:20的第1位至第1315位的序列具有至少90％一致性的核苷酸序列。
本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2021-084942号的公开内容。
发明效果
根据本发明，能够预防和/或治疗人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)引起的感染。另外，根据本发明，能够预防和/或治疗HTLV-1引起的感染所引发的疾病。另外，本发明的颗粒在代谢稳定性、体外活性、体内活性、药效显现快、药效持续性、物理稳定性、药物相互作用、安全性等方面具有优异性质，可有效用作用于治疗或预防上述疾病的药物。
附图说明
图1是表示Tax野生型、Tax突变型以及分泌型Tax突变体的HIV-1 LTR转录活性(A)和HTLV-1 LTR转录活性(B)的图。pHIV-1 LTR表示HIV-1 LTR报告质粒施用组；pHTLV-1 LTR表示HTLV-1 LTR报告质粒施用组；“空白”表示阴性对照组pcDNA3.1+载体。重复三次实施，竖棒表示平均值，误差棒表示SD。条线图上的白色圆圈表示三次重复中的每一次的数据。Tax WT是Tax野生型；Tax Mut是Tax突变型；Sec-Tax Mut是分泌型Tax突变体。
图2是表示施用了实施例12的脂质颗粒的C3H小鼠中的Tax特异性CTL诱导水平和血液中抗Tax抗体滴度的图。图2A表示Tax特异性CTL诱导水平；图2B表示血液中抗Tax抗体滴度。
图3是表示猴血液中抗gp46抗体滴度和血液中抗Tax抗体滴度的图。图3A表示血液中抗gp46特异性抗体滴度；图3B表示血液中抗Tax抗体滴度。1组4只。0W、2W、4W或6W分别表示施用前、自初次施用后起2周后、4周后(自第2次施用起2周后)、6周后(自第3次施用起2周后)的各时间的数据。棒表示平均值，白色圆圈表示各个数据。
图4是表示gp46特异性和Tax特异性细胞性免疫应答的图。1组4只。竖棒表示平均值，误差棒表示SD。条线图上的白色圆圈表示各个数据。
图5是表示猴血液中抗HTLV-1中和活性的图。测定阴性对照表示没有抗体处理的结果；测定阳性对照表示通过已知的HTLV-1中和抗体进行了处理的结果。1组4只。#736、#741、#743、#737表示阴性对照组的猴个体ID；#745、#742、#740、#735表示实施例5和实施例6的混合制剂施用组的猴个体ID。箭头表示合胞体形成(syncytial formation)。
图6是表示C57BL/6小鼠中的血液中抗gp46抗体滴度的图。
图7是表示C57BL/6小鼠中的gp46特异性和Tax特异性细胞性免疫应答的图。图7A表示IFN-γ产生水平；图7B表示IL-2产生水平。
图8是表示通过实施例9至实施例12的脂质颗粒处理的CHO-S细胞中的gp46和Tax蛋白表达水平的图。图8A表示细胞溶解液中的表达水平；图8B表示培养上清液中的表达水平。
图9是表示HTLV-I SU gp46 IVT用的模板质粒DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的图。
图10是表示正义引物(SEQ ID NO:2)和反义引物(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列的图。
图11是表示SU gp46的体外转录(IVT)用的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的图。
图12是表示HTLV-I gp46-Fib IVT用的模板质粒DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)的图。
图13是表示gp46-Fib的体外转录(IVT)用的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的图。
图14是表示HTLV-I dgp62-Fib IVT用的模板质粒DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)的图。
图15是表示dgp62-Fib的体外转录(IVT)用的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)的图。
图16是表示HTLV-I sec Tax突变体IVT用的模板质粒DNA的核苷酸序列(SEQ IDNO:9)的图。
图17是表示sec Tax突变体的体外转录(IVT)用的模板DNA的核苷酸序列(SEQ IDNO:10)的图。
图18是表示Tax野生型的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)的图。
图19是表示Tax突变型(T130A/L131S/L319R/L320S)的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)的图。
图20是表示分泌型Tax突变体(T130A/L131S/L319R/L320S)的氨基酸序列(SEQ IDNO:13)的图。
图21是表示gp46的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)的图。
图22是表示gp46-Fib的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)的图。
图23是表示dgp62-Fib的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)的图。
图24是表示SU gp46 mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:17)的图。
图25是表示gp46-Fib mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:18)的图。
图26是表示dgp62-Fib mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:19)的图。
图27是表示sec Tax突变体mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:20)的图。
图28是表示实施例30～34中处理的CHO-S细胞中的gp46蛋白表达水平的图。点线表示阴性对照缓冲液的OD值。
图29是表示gp46-Fib polyA95的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)的图。
图30是表示gp46-Fib polyA80的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:22)的图。
图31是表示gp46-Fib polyA60的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:23)的图。
图32是表示gp46-Fib polyA40的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:24)的图。
图33是表示gp46-Fib polyA20的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)的图。
图34是表示sec Tax突变体polyA95的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:26)的图。
图35是表示sec Tax突变体polyA80的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:27)的图。
图36是表示sec Tax突变体polyA60的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:28)的图。
图37是表示sec Tax突变体polyA40的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:29)的图。
图38是表示sec Tax突变体polyA20的模板DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:30)的图。
图39是表示gp46-Fib polyA95的mRNA序列(SEQ ID NO:31)的图。
图40是表示gp46-Fib polyA80的mRNA序列(SEQ ID NO:32)的图。
图41是表示gp46-Fib polyA60的mRNA序列(SEQ ID NO:33)的图。
图42是表示gp46-Fib polyA40的mRNA序列(SEQ ID NO:34)的图。
图43是表示gp46-Fib polyA20的mRNA序列(SEQ ID NO:35)的图。
图44是表示sec Tax突变体polyA95的mRNA序列(SEQ ID NO:36)的图。
图45是表示sec Tax突变体polyA80的mRNA序列(SEQ ID NO:37)的图。
图46是表示sec Tax突变体polyA60的mRNA序列(SEQ ID NO:38)的图。
图47是表示sec Tax突变体polyA40的mRNA序列(SEQ ID NO:39)的图。
图48是表示sec Tax突变体polyA20的mRNA序列(SEQ ID NO:40)的图。
具体实施方式
下面对本发明的实施方式进行更加详细的说明。
本发明提供一种脂质颗粒，其包封能够表达HTLV-1的gp46抗原或Tax抗原的核酸，其中，脂质包括由通式(Ia)表示的阳离子性脂质或其药学上可接受的盐。
[化5]
式中，
R1和R2独立地表示C1-C3烷基；
L1表示可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C17-C19烯基；
L2表示可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烷基，或者可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烯基；
p为3或4。
通式(Ia)中的R1和R2独立地表示C1-C3烷基，优选共同为甲基。
通式(Ia)中的p为3或4，优选为3。
通式(Ia)中的L1为可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C17-C19烯基，优选为可以具有1个或更多个乙酰氧基的C17-C19烯基。作为L1，具体可以举出(R)-11-乙酰氧基-顺式-8-十七烯基、顺式-8-十七烯基，或(8Z,11Z)-十七碳二烯基等。
通式(Ia)中的L2表示可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烷基，或者可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烯基；优选为可以具有1个或更多个乙酰氧基的C10-C12烷基，或者可以具有1个或更多个乙酰氧基的C10-C19烯基。或者，通式(Ia)中的L2还优选为可以具有1个或更多个乙酰氧基的C10-C12烷基，或者可以具有1个或更多个乙酰氧基的C17-C19烯基。作为L2，具体可以举出癸基、顺式-7-癸烯基、十二烷基，或(R)-11-乙酰氧基-顺式-8-十七烯基等。
作为构成本发明的颗粒的成分阳离子性脂质，具体可以举出分别由以下结构式表示的二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯基-7,29-二基、碳酸3-二甲基氨基丙基(9Z,12Z)-二十八碳-19,22-二烯基-11-基、乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯基-7-基。
[化6]
[化7]
[化8]
由通式(Ia)表示的阳离子性脂质可以为1种化合物，也可以为2种以上的化合物的组合。
由通式(Ia)表示的阳离子性脂质的制造方法，记载在国际公布第2015/005253号单行本中。
本发明的脂质还可以包括两亲性脂质、固醇类和PEG脂质。
两亲性脂质是对极性、非极性的溶剂都具有亲和性的脂质，具体可以举出二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺，以及它们的组合等。作为本发明的颗粒中使用的两亲性脂质，优选为二硬脂酰磷脂酰胆碱和/或二油酰磷脂酰乙醇胺，更优选为二硬脂酰磷脂酰胆碱。
固醇类是具有羟基的固醇，具体可以举出胆固醇等。
PEG脂质是经过PEG修饰的脂质，具体可以举出1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇和/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺，以及它们的组合等；优选为1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇。PEG脂质的平均分子量没有特别限制，例如为1000～5000，优选为1500～3000，更优选为1800～2200。
两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成没有特别限制，例如，以摩尔量计算，两亲性脂质为5％～25％，固醇类为10％～55％，阳离子性脂质为40％～65％，PEG脂质为1％～5％。两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成以摩尔量计算，优选为：两亲性脂质10％～25％、固醇类10％～55％、阳离子性脂质40％～65％、PEG脂质1％～5％。两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成以摩尔量计算，更优选为：两亲性脂质10％～22.5％、固醇类15％～55％、阳离子性脂质40％～65％、PEG脂质1％～5％。按照摩尔量计算，上述脂质组成中PEG脂质的比例优选为1％～3％，更优选为1％～2％，进一步优选为1.2％～2％，更进一步优选为1.25％～2％，再进一步优选为1.3％～2％，特别优选为1.5％～2％。另外，上述脂质组成中总脂质重量相对于核酸重量的比率没有特别限制，可以为15～30，优选为15～25，更优选为15～22.5，进一步优选为17.5～22.5。
在使用碳酸3-二甲基氨基丙基(9Z,12Z)-二十八碳-19,22-二烯基-11-基，或二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯基-7,29-二基作为阳离子性脂质的情况下，两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成没有特别限制，例如，以摩尔量计算，两亲性脂质为5％～25％，固醇类为10％～55％，阳离子性脂质为40％～65％，PEG脂质为1％～5％；优选地，两亲性脂质为15％以下，固醇类为20％～55％，阳离子性脂质为40％～65％，PEG脂质为1％～5％。两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成以摩尔量计算，更优选为：两亲性脂质5％～15％、固醇类35％～50％、阳离子性脂质40％～55％、PEG脂质1％～3％。两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成以摩尔量计算，进一步优选为：两亲性脂质10％～15％、固醇类35％～45％、阳离子性脂质40％～50％、PEG脂质1％～2.5％。两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成以摩尔量计算，更进一步优选为：两亲性脂质10％～15％、固醇类35％～45％、阳离子性脂质40％～50％、PEG脂质1％～2％。上述脂质组成中PEG脂质更优选为1.2％～2％，进一步优选为1.25％～2％，更进一步优选为1.3％～2％，再进一步优选为1.5％～2％。上述脂质组成中总脂质重量相对于核酸重量的比率没有特别限制，可以为15～30，优选为15～25，更优选为15～22.5，进一步优选为17.5～22.5。
在使用乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯基-7-基作为阳离子性脂质的情况下，两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成没有特别限制，例如，以摩尔量计算，两亲性脂质为5％～25％，固醇类为10％～55％，阳离子性脂质为40％～65％，PEG脂质为1％～5％；优选地，两亲性脂质为10％～25％，固醇类为10％～50％，阳离子性脂质为40％～65％，PEG脂质为1％～5％。两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成以摩尔量计算，更优选为：两亲性脂质10％～25％、固醇类10％～50％、阳离子性脂质40％～65％、PEG脂质1％～3％。两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成以摩尔量计算，进一步优选为：两亲性脂质10％～25％、固醇类10％～45％、阳离子性脂质42.5％～65％、PEG脂质1％～2.5％。两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成以摩尔量计算，更进一步优选为：两亲性脂质15％～22.5％、固醇类15％～40％、阳离子性脂质45％～65％、PEG脂质1％～2％。两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质以及PEG脂质的脂质组成以摩尔量计算，再进一步优选为：两亲性脂质17.5％～22.5％、固醇类15％～40％、阳离子性脂质45％～65％、PEG脂质1％～2％。上述脂质组成中PEG脂质更优选为1.2％～2％，进一步优选为1.25％～2％，更进一步优选为1.3％～2％，再进一步优选为1.5％～2％。上述脂质组成中总脂质重量相对于核酸重量的比率没有特别限制，优选为15～30，更优选为15～25，进一步优选为15～22.5，更进一步优选为17.5～22.5。
作为本发明中的具体的脂质组合，可以组合使用：作为两亲性脂质的二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱，或者二油酰磷脂酰乙醇胺；作为固醇类的胆固醇；作为阳离子性脂质的二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯基-7,29-二基、碳酸3-二甲基氨基丙基(9Z,12Z)-二十八碳-19,22-二烯基-11-基，或者乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯基-7-基；作为PEG脂质的1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇，或者N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺。另外，优选使用以下脂质的组合：作为两亲性脂质的二硬脂酰磷脂酰胆碱，或者二油酰磷脂酰乙醇胺；作为固醇类的胆固醇；作为阳离子性脂质的二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯基-7,29-二基，或者乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯基-7-基；作为PEG脂质的1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇。作为本发明中的具体的脂质组合，更优选为：作为两亲性脂质的二硬脂酰磷脂酰胆碱；作为固醇类的胆固醇；作为阳离子性脂质的二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯基-7,29-二基，或者乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯基-7-基；作为PEG脂质的1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇。
本发明中，脂质颗粒中包封的核酸能够表达HTLV-1的gp46抗原或Tax抗原。
HTLV-1的gp46抗原的氨基酸序列示于SEQ ID NO:14。脂质颗粒中包封的核酸可以是由与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少95％、优选96％、更优选97％、进一步优选98％的一致性的氨基酸序列构成，且编码HTLV-1的gp46抗原的核酸。
gp46抗原也可以是与寡聚化结构域的融合蛋白。寡聚化结构域是将融合的蛋白质多聚体化的蛋白质，例如可举出T4噬菌体来源的fibritin。另外，也能够使用fibritin的三聚体化结构域即foldon结构域。HTLV-1的gp46和fibritin的融合蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:15。SEQ ID NO:15的氨基酸序列的第313位～第339位的氨基酸序列是fibritin的氨基酸序列。寡聚化结构域既可以位于gp46抗原的C末端，也可以位于N末端。
HTLV-1的野生型的Tax抗原的氨基酸序列示于SEQ ID NO:11。脂质颗粒中包封的核酸可以是由与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％、优选96％、更优选97％的一致性的氨基酸序列构成，且编码HTLV-1的Tax抗原的核酸。野生型的Tax抗原具有HTLV-1 LTR转录活性，由于具有致癌性，因此需要降低或消除其对生物体的致癌性毒性。例如，可以使用具有使致癌性降低或消失的突变的Tax抗原。另外，如果Tax在细胞外分泌，则对细胞的致癌性会降低，因此也可以是与信号肽的融合蛋白。作为使致癌性降低或消失的突变，可举出T130A、L131S、L319R和L320S。T130A和L131S是HIV-1 LTR和HTLV-1转录活性失活突变；L319R和L320S是HTLV-1转录活性缺失突变。可以具有这些突变中的至少一种突变，优选具有2种突变，更优选具有3种突变，特别优选具有4种突变。具有上述4种突变的突变型的Tax抗原的氨基酸序列示于SEQ ID NO:12。另外，作为用于使Tax抗原在细胞外分泌的信号肽，可举出IgE分泌信号肽。信号肽优选与Tax抗原的N末端侧融合。信号肽和具有上述4种突变的突变型Tax抗原的融合蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:13。SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第1位～第18位的氨基酸序列是IgE分泌信号肽的氨基酸序列。
本发明包含作为分泌型Tax突变体的肽，其中，分泌型Tax突变体是在具有上述4种氨基酸突变中的至少1种、优选2种、更优选3种、特别优选4种突变的Tax抗原与信号肽融合而形成的Tax突变型添加IgE分泌信号而形成的。该肽由具有使致癌性降低或消失的突变的Tax抗原与信号肽融合而成，Tax抗原为人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原。作为使致癌性降低或消失的突变，可举出T130A、L131S、L319R和L320S。即，作为上述的肽，可举出以下的肽：Tax抗原相对于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有选自于由T130A、L131S、L319R和L320S组成的组中的至少一种突变，并由对该突变氨基酸以外的氨基酸序列进行对比时，与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％、优选96％、更优选97％的一致性的氨基酸序列构成。另外，作为用于使Tax抗原在细胞外分泌的信号肽，可举出IgE分泌信号肽。信号肽优选与Tax抗原的N末端侧融合。SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第1位～第18位的氨基酸序列是IgE分泌信号肽的氨基酸序列。即，作为上述的肽，可举出信号肽由SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第1位～第18位的氨基酸序列构成的肽。
本发明中，脂质颗粒中包封的核酸也可以是能够表达HTLV-1的gp46抗原和Tax抗原通过接头结合而成的蛋白质的核酸。接头由包含会被蛋白酶切割的序列的氨基酸序列构成，例如可举出包含弗林蛋白酶(Furin)识别并切割的氨基酸序列的接头。作为蛋白酶切割序列，只要是能被Furin蛋白切割的序列即可，例如可举出由R-X-K/R-R(R表示精氨酸，K表示赖氨酸，X表示任意氨基酸)表示的序列等(J.Biol.Chem.1992,267,16396；J.Biol.Chem.1991,266,12127)。
氨基酸序列的一致性(identity)是指将对应的氨基酸完全一致的氨基酸作为相同的氨基酸，将氨基酸相对于全长序列的一致比例数值化的结果。本发明中的序列一致性是用序列分析软件GENETYX-SV/RC(株式会社GENETYX制)计算得出的，该算法在该技术领域中广泛使用。本发明的脂质颗粒中包封的核酸所编码的氨基酸只要与SEQ ID NO:11～SEQID NO:16保持一定值以上的一致性，则也可以进行氨基酸的突变(取代)、缺失、插入和/或添加。
本发明的脂质颗粒中包封的核酸所编码的氨基酸保持上述序列一致性，在SEQ IDNO:11～SEQ ID NO:16的氨基酸序列中的几处(优选5处以下，更优选3、2或1处)中，每处的数个(优选10个以下，更优选7个以下，进一步优选5、4、3、2或1个)氨基酸可以进行取代、缺失、插入和/或添加。
能够表达HTLV-1的gp46抗原或Tax抗原的核酸可以为包含帽子结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、gp46或Tax的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾部(polyA)的mRNA。另外，gp46或Tax的翻译区的5’侧也可以具有KOZAK序列。帽子结构(Cap)是存在于多数真核生物的mRNA的5’末端，具有7-甲基鸟苷结构的位点。作为帽子结构，例如可以举出使用cap0、cap1、cap2、ARCA(Anti-Reverse Cap Analog，抗反向帽类似物)时的帽子结构等，该帽子结构由以下结构式表示。
[化9]
(式中，Base表示未修饰或经过修饰的任意核酸碱基，RNA表示任意的多聚核苷酸。)
[化10]
[化11]
[化12]
作为本发明的mRNA的帽子结构，优选为cap0或cap1，更优选为cap1。5’非翻译区(5’-UTR)的序列例如可以使用包含人β珠蛋白基因的5’非翻译区的序列。例如，人β珠蛋白基因的5’非翻译区的序列为SEQ ID NO:17的序列中的碱基编号15～64的序列。gp46的翻译区的序列是能够表达gp46抗原的氨基酸序列的全部或部分的序列，也可以包含起始密码子和/或终止密码子，例如为SEQ ID NO:17的序列中的碱基编号71～1009的序列。另外，也可以是使gp46的翻译区的序列与fibritin的序列连接的序列，例如为SEQ ID NO:18的碱基编号71～1090的序列。dgp62的翻译区的序列是能够表达dgp62抗原的氨基酸序列的全部或部分的序列，也可以包含起始密码子和/或终止密码子，例如为SEQ ID NO:19的序列中的碱基编号71～1396的序列。另外，也可以是使dgp62的翻译区的序列与fibritin的序列连接的序列，例如为SEQ ID NO:19的序列中的碱基编号71～1480的序列。Tax的翻译区的序列是能够表达Tax抗原的氨基酸序列的全部或部分的序列，也可以包含起始密码子和/或终止密码子。例如，具有T130A、L131S、L319R和L320S4四种突变。可举出使具有上述4种突变的突变型Tax抗原的翻译区的序列与编码用于使Tax抗原在细胞外分泌的IgE分泌信号肽的序列连接的序列，是SEQ ID NO:20的序列中的碱基编号71～1183的序列。3’非翻译区(3’-UTR)的序列例如可以使用人β珠蛋白基因的3’非翻译区。例如为SEQ ID NO:17的序列中的碱基编号1010～1141的序列。多聚A尾部(polyA)的序列例如为SEQ ID NO:17的序列中的碱基编号1142～1241的序列。在帽子结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、gp46或Tax的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾部(polyA)的序列可以进行修饰；能够表达gp46抗原的核酸的序列可以由与SEQ ID NO:17的序列具有至少90％、优选95％、更优选97％的一致性的核苷酸序列构成。另外，能够表达Tax抗原的核酸的序列可以由与SEQ ID NO:20的序列具有至少90％、优选95％、更优选97％的一致性的核苷酸序列构成。
多聚A尾部的长度没有限制，例如为10～250碱基长度，优选为15～120碱基长度，更优选为15～115碱基长度，特别优选为20～110碱基长度。
本发明的mRNA是包含帽子结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、gp46或Tax的翻译区和3’非翻译区(3’-UTR)的序列，也可以是由帽子结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、gp46抗原或Tax抗原的翻译区和3’非翻译区(3’-UTR)构成的部分与SEQ ID NO:17的第1位至第1141位序列、SEQ ID NO:18的第1位至第1222位的序列、SEQ ID NO:20的第1位至第1315位的序列具有至少90％、优选95％、更优选97％的一致性的核苷酸序列构成的mRNA。
脂质颗粒中包封的核酸如果是能够表达HTLV-1的gp46抗原或Tax抗原的核酸，则可以为任何形态。例如，可举出单链DNA、单链RNA(例如mRNA)、DNA与RNA混合而成的单链多聚核苷酸、双链DNA、双链RNA、DNA-RNA的混合多聚核苷酸、由DNA与RNA混合而成的2种多聚核苷酸构成的双链多聚核苷酸等，优选为mRNA。
构成脂质颗粒中包封的核酸的核苷酸既可以是天然型，也可以是修饰核苷酸，可以包含至少1个修饰核苷酸。
修饰核苷酸也可以是碱基、糖和磷酸二酯键的任一部分经过修饰的核苷酸。修饰位点可以是1处，也可以是2处以上。
作为碱基的修饰示例，可以举出：胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、N4-甲基化；尿嘧啶的5-甲基化(胸腺嘧啶)；5-氟化；腺嘌呤的N6-甲基化；鸟嘌呤的N2-甲基化等。
作为糖的修饰示例，可以举出D-呋喃核糖的2’-O-甲基化。
作为磷酸二酯键的修饰示例，可以举出硫代磷酸酯键。
修饰核苷酸优选为碱基部分经过修饰的核苷酸，例如可以为第5位取代的嘧啶核苷酸、第1位可以取代的假尿嘧啶核苷，具体可以举出5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿嘧啶核苷、1-烷基假尿嘧啶核苷。另外，作为1-烷基假尿嘧啶核苷，可以为1-(C1-C6烷基)假尿嘧啶核苷，优选为1-甲基假尿嘧啶核苷或1-乙基假尿嘧啶核苷。作为修饰核苷酸，更优选地可举出：5-甲基胞苷、5-甲基尿苷，以及1-甲基假尿嘧啶核苷。作为修饰核苷酸，特别优选地可举出：5-甲基胞苷和5-甲基尿苷的组合，或者5-甲基胞苷和1-甲基假尿嘧啶核苷的组合。
本发明的能够表达HTLV-1的gp46抗原或Tax抗原的核酸可以通过体外转录反应根据具有期望的碱基序列的DNA制造。体外转录所必需的酶、缓冲液，以及核苷-5’-三磷酸混合物[腺苷-5’-三磷酸(ATP)、鸟苷-5’-三磷酸(GTP)、胞苷-5’-三磷酸(CTP)，以及尿苷-5’-三磷酸(UTP)]在市场上有售[AmpliScribeT7 High Yield Transcription Kit(Epicentre)、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit(Life technologies)等]。用于制造单链DNA的DNA使用克隆化的DNA，例如质粒DNA或DNA片段。质粒DNA或DNA片段也可以使用市售品，还可以通过本领域普遍公知的方法进行制造[例如Sambrook,J.et al.,MolecularCloning a Laboratory Manual second edition(1989)、Rashtchian,A.,CurrentOpinion in Biotechnology,1995,6(1),30-36、Gibson D.G.et al.,Science,2008,319(5867),1215-1220记载的方法等]。
为了获得稳定性和/或安全性得到提高的mRNA，也可以在体外转录反应中，将部分或全部的未修饰核苷-5’-三磷酸取代为修饰核苷-5’-三磷酸，由此将mRNA中的部分或全部的未修饰核苷酸取代为修饰核苷酸(Kormann,M.,Nature Biotechnology,2011,29,154-157.)。
为了获得稳定性和/或安全性得到提高的mRNA，可以通过在体外转录反应后使用加帽酶的方法在mRNA的5’末端导入帽子结构(上述的Cap0结构)。另外，还可以通过使2’-O-甲基转移酶作用于具有Cap0的mRNA的方法，将Cap0转换为Cap1。加帽酶和2’-O-甲基转移酶可以使用市售产品(例如Vaccinia Capping System，M2080；mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase，M0366，皆为New England Biolab制)。使用市售产品时，可以按照产品附属的操作说明制造具有帽子结构的mRNA。
mRNA的5’末端的帽子结构也可以通过与使用酶的方法不同的方法进行导入。例如，可以在体外转录反应中加入ARCA或CleanCap(注册商标)，由此将ARCA所具有的帽类似物的结构，或者来自CleanCap的Cap1结构导入到mRNA。ARCA和CleanCap可以使用市售产品(ARCA，N-7003；CleanCap Reagent AG，N-7113，皆为TriLink BioTechnologies制)。使用市售产品时，可以按照产品附属的操作说明制造具有帽子结构的mRNA。
本发明中，脂质颗粒中包封的核酸也可以通过脱盐、HPLC(反相、凝胶过滤、离子交换、亲和)、PAGE、超滤等方法进行纯化。通过纯化处理除去杂质，由此可以减少施用了核酸的生物体内的炎性细胞因子的产生。
本发明的核酸包封脂质颗粒可以通过薄膜法、反相蒸发法、乙醇注入法、乙醚注入法、脱水-再水合法、表面活性剂透析法、水合法、冷冻融解法等方法进行制造。例如，可以通过国际公开公布第2015/005253号记载的方法制造核酸包封脂质颗粒。本发明的核酸包封脂质颗粒也可以通过在微流控通道内将核酸溶液与脂质溶液混合来制造。例如，可以使用Precision Nanosystems公司的NanoAssemblr(注册商标)，按照附属的操作说明记载的方法进行制造。
本发明的颗粒的平均粒径为30nm～300nm，优选为30～200nm，更优选为30～100nm。平均粒径可以使用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMP(注册商标)380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)等仪器，根据动态光散射法等的原理测定体积平均粒径而得到。
本发明的颗粒能够用于制造用于预防和/或治疗由HTLV-1感染引发的疾病的组合物。作为由HTLV-1感染引发的疾病，可举出成人T细胞白血病(ATL)、HTLV-1相关性脊髓病(HAM)、HTLV-1相关性葡萄膜炎(HU)等。包封了能够表达HTLV-1的gp46抗原的核酸的脂质颗粒，和包封了能够使表达HTLV-1的Tax抗原的核酸的脂质颗粒，既可以将该核酸在同一脂质颗粒内制剂化，也可以作为不同的脂质颗粒制剂化，优选制备成不同的脂质颗粒。
使用本发明的颗粒，能够在体内或体外表达HTLV-1的gp46抗原和Tax抗原。即，可以对受试对象施用包封了能够表达HTLV-1的gp46抗原的核酸的脂质颗粒，以及包封了能够表达HTLV-1的Tax抗原的核酸的脂质颗粒。因此，本发明提供在体外表达HTLV-1的gp46抗原和Tax抗原的方法，包括：将含有上述颗粒的组合物导入到细胞中。另外，本发明也提供在体内表达HTLV-1的gp46抗原和Tax抗原的方法，包括：对哺乳动物施用含有上述颗粒的组合物。在体内表达HTLV-1的gp46抗原和Tax抗原能够诱导针对HTLV-1的免疫反应。结果，能够预防和/或治疗HTLV-1感染。因此，本发明提供针对HTLV-1的免疫反应的诱导方法，包括：对哺乳动物施用含有上述颗粒的组合物。另外，本发明也提供预防和/或治疗HTLV-1感染的方法，包括：对哺乳动物施用含有上述颗粒的组合物。本发明也包括含有包封了能够表达HTLV-1的gp46抗原的核酸的脂质颗粒，以及包封了能够表达HTLV-1的Tax抗原的核酸的脂质颗粒两方的试剂盒。
本发明的颗粒能够用作药物，以及实验用试剂。本发明的颗粒通常添加到水、缓冲液、生理盐水等载体中，可以将该配合物(组合物)导入到细胞中(体外)，或者对哺乳动物施用(体内)。在对哺乳动物施用时，载体可以为药学上可接受的载体(例如生理盐水)。另外，本发明的颗粒也可以制成以脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、石蜡、蜡、树脂、塑料、乙二醇类、高级醇、甘油、水、乳化剂、悬浮剂等为主剂原料的霜、糊、软膏、凝胶、乳液等剂型。
本发明的颗粒可以对人、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猪、猴、猫、狗、马、山羊、绵羊、牛等哺乳动物进行口服，或者通过肌内施用、静脉内施用、直肠内施用、经皮施用、经粘膜施用、皮下施用、皮内施用等方法进行非口服。
在对人施用本发明的颗粒时，例如，按照mRNA的重量计算，成年人每次的施用量约为0.001～1mg，优选为0.01～0.2mg；可以进行1次或数次肌内注射、皮下注射、皮内注射、点滴静脉注射或静脉注射；其施用量和施用次数可以根据疾病的种类、症状、年龄、施用方法等适宜改变。
在用作实验试剂时，可以将本发明的颗粒导入到意图表达HTLV-1的gp46抗原和Tax抗原的细胞[例如，HEK293细胞及其衍生细胞(HEK293T细胞、FreeStyle 293细胞和Expi293细胞)、CHO细胞、C2C12小鼠成肌细胞、永生化小鼠树突细胞(MutuDC1940)]中，在体外表达HTLV-1的gp46抗原和Tax抗原。对于HTLV-1的gp46抗原和Tax抗原的表达，可以通过以下方式进行分析：通过蛋白质印迹法检测样本中的HTLV-1的gp46抗原和Tax抗原蛋白；或者，通过质量分析法检测对HTLV-1的gp46抗原和Tax抗原有特异性的肽片段。
本发明中，“治疗”是指在病毒或细菌等引发的感染性疾病，或该感染性疾病引发的疾病(例如癌前病变和癌等)发病的患者中，对这些疾病的临床症状进行的恢复、缓解、缓和和/或延迟恶化。
本发明中，“预防”是指降低病毒或细菌等引发的感染性疾病所导致的疾病的发病率。预防包括降低病毒或细菌等引发的感染性疾病所导致的疾病的发展风险，或者降低这些疾病的重症化。本发明的颗粒可以诱导防御免疫反应，从而在上述疾病的预防和/或治疗中体现效果。
本发明的颗粒对于HTLV-1感染者，也可以期待用作由HTLV-1引发的疾病的发病的预防药物和治疗药物。作为由HTLV-1引发的疾病，可举出成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相关性脊髓病(HAM)、HTLV-1葡萄膜炎(HU)等。
[实施例]
下面通过本发明的实施例进行具体说明。需要说明的是，这些实施例仅用于对本发明进行说明，不用于限定本发明的范围。
实施例中，有时会使用以下简称。
SU gp46：表示HTLV-1的包膜蛋白的胞外区(表面单元，surface unit)gp46。
gp46-Fib：表示gp46和Fibritin的C末端结构域的融合蛋白。dgp62-Fib：表示使跨膜区和胞内区从gp62缺失的蛋白质和Fibritin的C末端结构域的融合蛋白。
sec Tax突变体：表示突变导入Tax蛋白和分泌信号蛋白的融合蛋白。
[实施例1]SU gp46 mRNA-001的制备
(1)SU gp46的体外转录(IVT)用的模板DNA的制作
为了制作用于体外转录(IVT)的模板DNA，通过PCR将SU gp46 DNA扩增后纯化。将包含T7启动子序列、人β-珠蛋白的5’-UTR序列、KOZAK序列、SU gp46、人β-珠蛋白的3’-UTR序列、PolyA序列依次连接而成的序列的DNA片段(SEQ ID NO:1)导入到质粒中。在溶解有8ng该质粒的无核酸酶水(547.2μL)中加入用于KOD-Plus-Ver.2的10×缓冲液(80μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、2mM dNTP混合溶液(80μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、25mM MgSO4(48μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、50μM正义引物(4.8μL，SEQ ID NO:2)、10μM反义引物(24μL，SEQ ID NO:3)、KOD Plus聚合酶(16μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)，在98℃孵育1分钟后，实施20个循环的“在98℃孵育5秒；在55℃孵育15秒；在68℃孵育90秒”，再在68℃孵育1分钟，扩增DNA。反应后通过Wizard SV凝胶及PCR纯化系统(Promega，目录#A9281)对模板DNA(SEQ ID NO:4)进行纯化。
(2)通过体外转录制备SU gp46 mRNA-001
将实施例1-(1)中得到的365.1μg/mL模板DNA(4.38μL)、100mM CleanCap AG(8μL，TriLink，目录#N-7113)、100mM ATP(8μL，Hongene，目录#R1331)、100mM GTP(8μL，Hongene，目录#R2331)、100mM CTP(8μL，Hongene，目录#R3331)、100mM N1-甲基假-UTP(8μL，Hongene，目录#R5-027)、无核酸酶水(67.62μL，Thermo Fisher，目录#AM9937)、T7转录5×缓冲液(32μL，Promega，目录#P140X)、酶混合液，T7 RNA聚合酶(16μL，Promega，目录#P137X)混合，在37℃孵育4小时。将RQ1无RNA酶的DNA酶(8μL，Promega，目录#M6101)混合，在37℃孵育15分钟。将8M LiCl溶液(80μL，Sigma-Aldrich，目录#L7026)混合，在-30℃静置过夜。离心分离(4℃，5200×g，35分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，5200×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣溶解在无核酸酶水(500μL)中后，使用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen，目录#75144)，按照附属的操作手册进行纯化。将得到的溶液(750μL)、rApid碱性磷酸酶(Roche，目录#04 898 141 001)的缓冲液(85μL)与酶(32μL)混合，在37℃孵育30分钟后，在75℃孵育2分钟。使用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen，目录#75144)，按照附属的操作手册将得到的溶液纯化，得到目标mRNA。将同样的实验操作累计进行2次，收集得到的mRNA溶液，得到目标mRNA。得到的mRNA具有SEQ ID NO:17的序列。
[实施例2]gp46-Fib mRNA-002的制备
(1)gp46-Fib的体外转录(IVT)用的模板DNA的制作
为了制作用于体外转录(IVT)的模板DNA，通过PCR将gp46-Fib DNA扩增后纯化。将包含T7启动子序列、人β-珠蛋白的5’-UTR序列、KOZAK序列、gp46-Fib、人β-珠蛋白的3’-UTR序列、PolyA序列依次连接而成的序列的DNA片段(SEQ ID NO:5)导入到质粒中。在溶解有8ng该质粒的无核酸酶水(547.2μL)中加入用于KOD-Plus-Ver.2的10×缓冲液(80μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、2mM dNTP混合溶液(80μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、25mM MgSO4(48μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、50μM正义引物(4.8μL，SEQ ID NO:2)、10μM反义引物(24μL，SEQ ID NO:3)、KOD Plus聚合酶(16μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)，在98℃孵育1分钟后，实施20个循环的“在98℃孵育5秒；在55℃孵育15秒；在68℃孵育90秒”，再在68℃孵育1分钟，扩增DNA。反应后通过Wizard SV凝胶及PCR纯化系统(Promega，目录#A9281)对模板DNA (SEQ ID NO:6)进行纯化。
(2)通过体外转录制备gp46-Fib mRNA-002
将实施例2-(1)中得到的345.3μg/mL模板DNA(4.63μL)、100mM CleanCap AG(8μL，TriLink，目录#N-7113)、100mM ATP(8μL，Hongene，目录#R1331)、100mM GTP(8μL，Hongene，目录#R2331)、100mM CTP(8μL，Hongene，目录#R3331)、100mM N1-甲基假-UTP(8μL，Hongene，目录#R5-027)、无核酸酶水(67.37μL，Thermo Fisher，目录#AM9937)、T7转录5×缓冲液(32μL，Promega，目录#P140X)、酶混合液，T7 RNA聚合酶(16μL，Promega，目录#P137X)混合，在37℃孵育4小时。将RQ1无RNA酶的DNA酶(8μL，Promega，目录#M6101)混合，在37℃孵育15分钟。将8M LiCl溶液(80μL，Sigma-Aldrich，目录#L7026)混合，在-30℃静置过夜。离心分离(4℃，5200×g，35分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，5200×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣溶解在无核酸酶水(500μL)中后，使用RNeasy Midi kit试剂盒(Qiagen，目录#75144)，按照附属的操作手册进行纯化。将得到的溶液(750μL)、rApid碱性磷酸酶(Roche，目录#04 898 141 001)的缓冲液(85μL)与酶(32μL)混合，在37℃孵育30分钟后，在75℃孵育2分钟。使用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen，目录#75144)，按照附属的操作手册将得到的溶液纯化，得到目标mRNA。将同样的实验操作累计进行2次，收集得到的mRNA溶液，得到目标mRNA。得到的mRNA具有SEQ ID NO:18的序列。
[实施例3]dgp62-Fib mRNA-003的制备
(1)dgp62-Fib的体外转录(IVT)用的模板DNA的制作
为了制作用于体外转录(IVT)的模板DNA，通过PCR将dgp62-Fib DNA扩增后纯化。将包含T7启动子序列、人β-珠蛋白的5’-UTR序列、KOZAK序列、dgp62-Fib、人β-珠蛋白的3’-UTR序列、PolyA序列依次连接而成的序列的DNA片段(SEQ ID NO:7)导入到质粒中。在溶解有8ng该质粒的无核酸酶水(547.2μL)中加入用于KOD-Plus-Ver.2的10×缓冲液(80μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、2mM dNTP混合溶液(80μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、25mM MgSO4(48μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、50μM正义引物(4.8μL，SEQ IDNO:2)、10μM反义引物(24μL，SEQ ID NO:3)、KOD Plus聚合酶(16μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)，在98℃孵育1分钟后，实施20个循环的“在98℃孵育5秒；在55℃孵育15秒；在68℃孵育90秒”，再在68℃孵育1分钟，扩增DNA。反应后通过Wizard SV凝胶及PCR纯化系统(Promega，目录#A9281)对模板DNA(SEQ ID NO:8)进行纯化。
(2)通过体外转录制备dgp62-Fib mRNA-003
将实施例3-(1)中得到的366.7μg/mL模板DNA(4.36μL)、100mM CleanCap AG(8μL，TriLink，目录#N-7113)、100mM ATP(8μL，Hongene，目录#R1331)、100mM GTP(8μL，Hongene，目录#R2331)、100mM CTP(8μL，Hongene，目录#R3331)、100mM N1-甲基假-UTP(8μL，Hongene，目录#R5-027)、无核酸酶水(67.64μL，Thermo Fisher，目录#AM9937)、T7转录5×缓冲液(32μL，Promega，目录#P140X)、酶混合液，T7 RNA聚合酶(16μL，Promega，目录#P137X)混合，在37℃孵育4小时。将RQ1无RNA酶的DNA酶(8μL，Promega，目录#M6101)混合，在37℃孵育15分钟。将8M LiCl溶液(80μL，Sigma-Aldrich，目录#L7026)混合，在-30℃静置过夜。离心分离(4℃，5200×g，35分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，5200×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣溶解在无核酸酶水(500μL)中后，使用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen，目录#75144)，按照附属的操作手册进行纯化。将得到的溶液(750μL)、rApid碱性磷酸酶(Roche，目录#04 898 141 001)的缓冲液(85μL)与酶(32μL)混合，在37℃孵育30分钟后，在75℃孵育2分钟。使用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen，目录#75144)，按照附属的操作手册将得到的溶液纯化，得到目标mRNA。将同样的实验操作累计进行2次，收集得到的mRNA溶液，得到目标mRNA。得到的mRNA具有SEQ ID NO:19的序列。
[实施例4]sec Tax突变体mRNA-004的制备
(1)sec Tax突变体的体外转录(IVT)用的模板DNA的制作
为了制作用于体外转录(IVT)的模板DNA，通过PCR将sec Tax DNA扩增后纯化。将包含T7启动子序列、人β-珠蛋白的5’-UTR序列、KOZAK序列、sec Tax、人β-珠蛋白的3’-UTR序列、PolyA序列依次连接而成的序列的DNA片段(SEQ ID NO:9)导入到质粒中。在溶解有8ng该质粒的无核酸酶水(547.2μL)中加入用于KOD-Plus-Ver.2的10×缓冲液(80μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、2mM dNTP混合溶液(80μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、25mM MgSO4(48μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)、50μM正义引物(4.8μL，SEQ ID NO:2)、10μM反义引物(24μL，SEQ ID NO:3)、KOD Plus聚合酶(16μL，东洋纺株式会社，目录#KOD-211)，在98℃孵育1分钟后，实施20个循环的“在98℃孵育5秒；在55℃孵育15秒；在68℃孵育90秒”，再在68℃孵育1分钟，扩增DNA。反应后通过Wizard SV凝胶及PCR纯化系统(Promega，目录#A9281)对模板DNA(SEQ ID NO:10)进行纯化。
(2)通过体外转录制备sec Tax突变体mRNA-004
将实施例4-(1)中得到的401.1μg/mL模板DNA(3.99μL)、100mM CleanCap AG(8μL，TriLink，目录#N-7113)、100mM ATP(8μL，Hongene，目录#R1331)、100mM GTP(8μL，Hongene，目录#R2331)、100mM CTP(8μL，Hongene，目录#R3331)、100mM N1-甲基假-UTP(8μL，Hongene，目录#R5-027)、无核酸酶水(68.01μL，Thermo Fisher，目录#AM9937)、T7转录5×缓冲液(32μL，Promega，目录#P140X)、酶混合液，T7 RNA聚合酶(16μL，Promega，目录#P137X)混合，在37℃孵育4小时。将RQ1无RNA酶的DNA酶(8μL，Promega，目录#M6101)混合，在37℃孵育15分钟。将8M LiCl溶液(80μL，Sigma-Aldrich，目录#L7026)混合，在-30℃静置过夜。离心分离(4℃，5200×g，35分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，5200×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣溶解在无核酸酶水(500μL)中后，使用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen，目录#75144)，按照附属的操作手册进行纯化。将得到的溶液(750μL)、rApid碱性磷酸酶(Roche，目录#04 898 141 001)的缓冲液(85μL)与酶(32μL)混合，在37℃孵育30分钟后，在75℃孵育2分钟。使用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen，目录#75144)，按照附属的操作手册将得到的溶液纯化，得到目标mRNA。将同样的实验操作累计进行2次，收集得到的mRNA溶液，得到目标mRNA。得到的mRNA具有SEQ ID NO:20的序列。
[实施例5]SU gp46 mRNA-005的制备
(1)SU gp46的体外转录(IVT)用的模板DNA的制作
通过与实施例1-(1)相同的方法进行实施。
(2)通过体外转录制备SU gp46 mRNA-005
将实施例5-(1)中得到的339μg/mL模板DNA(89μL)、100mM CleanCap AG(150μL，TriLink，目录#T-7113)、100mM ATP(150μL，Hongene，目录#R1331)、100mM GTP(150μL，Hongene，目录#R2331)、100mM CTP(150μL，Hongene，目录#R3331)、100mM N1-甲基-假尿嘧啶核苷5’-三磷酸(150μL，Hongene，目录#R5-027)、无核酸酶水(1261μL，Qiagen#129114)、T7转录5×缓冲液(600μL，Promega，目录#P140X)、酶混合液，T7 RNA聚合酶(300μL，Promega，目录#P137X)混合，在37℃孵育2小时。将RQ1无RNA酶的DNA酶(30μL，Promega，目录#M6101)混合，在37℃孵育15分钟。将8M LiCl溶液(1500μL，Sigma-Aldrich，目录#L7026)混合，在-20℃静置过夜。离心分离(4℃，5250×g，30分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，5250×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣溶解在无核酸酶水中后，使用RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen，目录#75162)，按照附属的操作手册进行纯化。将得到的洗脱液(12mL，UV换算为12.0mg)和无核酸酶水(120μL)、rApid碱性磷酸酶(Roche，目录#04 898 141 001)的缓冲液(1400μL)和酶(480μL)混合，在37℃孵育30分钟。在75℃孵育2分钟后，将8M LiCl溶液(7000μL，Sigma-Aldrich，目录#L7026)混合，在-20℃静置过夜。离心分离(4℃，5250×g，30分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，5250×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣溶解在无核酸酶水(2mL)中(UV换算为9.9mg)。将得到的mRNA通过反相色谱法[柱：PLRP-S、10μm、10×200mm(Agilent)；缓冲液A：5％乙腈、400mM乙酸三乙胺(pH7.0)；缓冲液B：25％乙腈、400mM乙酸三乙胺(pH7.0)；梯度B％：27.5％～35％(20min)；流量：5mL/min；温度：80℃]分离纯化。将目标组分回收，通过超滤[Amicon Ultra-15(MWCO：30kDa)]进行脱盐处理(UV换算为3.4mg)。
得到的mRNA具有SEQ ID NO:17的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNAReagent Kit(PerkinElmer，目录#CLS960010)进行分析，确认为目标的长度。
[实施例6]sec Tax突变体mRNA-006的制备
(1)sec Tax突变体的体外转录(IVT)用的模板DNA的制作
通过与实施例4-(1)相同的方法进行实施。
(2)通过体外转录制备sec Tax突变体mRNA-006
将实施例6-(1)中得到的336μg/mL模板DNA(89μL)、100mM CleanCap AG(150μL，TriLink，目录#T-7113)、100mM ATP(150μL，Hongene，目录#R1331)、100mM GTP(150μL，Hongene，目录#R2331)、100mM CTP(150μL，Hongene，目录#R3331)、100mM N1-甲基-假尿嘧啶核苷5’-三磷酸(150μL，Hongene，目录#R5-027)、无核酸酶水(1261μL，Qiagen#129114)、T7转录5×缓冲液(600μL，Promega，目录#P140X)、酶混合液，T7 RNA聚合酶(300μL，Promega，目录#P137X)混合，在37℃孵育2小时。将RQ1无RNA酶的DNA酶(30μL，Promega，目录#M6101)混合，在37℃孵育15分钟。将8M LiCl溶液(1500μL，Sigma-Aldrich，目录#L7026)混合，在-20℃静置过夜。离心分离(4℃，5250×g，30分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，5250×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣溶解在无核酸酶水中后，使用RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen，目录#75162)，按照附属的操作手册进行纯化。将得到的洗脱液(12mL，UV换算为12.6mg)和无核酸酶水(100μL)、rApid碱性磷酸酶(Roche，目录#04 898 141 001)的缓冲液(1400μL)和酶(500μL)混合，在37℃孵育30分钟。在75℃孵育2分钟后，将8M LiCl溶液(7000μL，Sigma-Aldrich，目录#L7026)混合，在-20℃静置过夜。离心分离(4℃，5250×g，30分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，5250×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣溶解在无核酸酶水(2mL)中(UV换算为10.9mg)。将得到的mRNA通过反相色谱法[柱：PLRP-S、10μm、10×200mm(Agilent)；缓冲液A：5％乙腈、400mM乙酸三乙胺(pH7.0)；缓冲液B：25％乙腈、400mM乙酸三乙胺(pH7.0)；梯度B％：27.5％～35％(20min)；流量：5mL/min；温度：80℃]分离纯化。将目标组分回收，通过超滤[Amicon Ultra-15(MWCO：30kDa)]进行脱盐处理(UV换算为3.7mg)。
得到的mRNA具有SEQ ID NO:20的序列。通过LabChip GX Touch StandardRNAReagent Kit(PerkinElmer，目录#CLS960010)进行分析，确认为目标的长度。
[实施例7]gp46-Fib mRNA-007的制备
(1)gp46-Fib的体外转录(IVT)用的模板DNA的制作
通过与实施例2-(1)相同的方法进行实施。
(2)通过体外转录制备gp46-Fib mRNA-007
将实施例7-(1)中得到的397μg/mL模板DNA(63μL)、100mM CleanCap AG(50μL，TriLink，目录#T-7113)、100mM ATP(50μL，Hongene，目录#R1331)、100mM GTP(50μL，Hongene，目录#R2331)、100mM CTP(50μL，Hongene，目录#R3331)、100mM N1-甲基-假尿嘧啶核苷5’-三磷酸(50μL，Hongene，目录#R5-027)、无核酸酶水(387μL，Qiagen#129114)、T7转录5×缓冲液(200μL，Promega，目录#P140X)、酶混合液，T7 RNA聚合酶(100μL，Promega，目录#P137X)混合，在37℃孵育4小时。将RQ1无RNA酶的DNA酶(25μL，Promega，目录#M6101)混合，在37℃孵育15分钟。将8M LiCl溶液(500μL，Sigma-Aldrich，目录#L7026)混合，在-20℃静置过夜。离心分离(4℃，5250×g，30分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，5250×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣溶解在无核酸酶水中后，使用RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen，目录#75162)，按照附属的操作手册进行纯化。将得到的洗脱液(3mL，UV换算为3.6mg)和无核酸酶水(332μL)、rApid碱性磷酸酶(Roche，目录#04898 141 001)的缓冲液(450μL)和酶(718μL)混合，在37℃孵育30分钟。在75℃孵育2分钟后，使用RNeasy Maxi试剂盒，按照附属的操作手册进行纯化，得到目标mRNA(4mL，UV换算为2.8mg)。
得到的mRNA具有SEQ ID NO:18的序列。通过LabChip GX Touch StandardRNAReagent Kit(PerkinElmer，目录#CLS960010)进行分析，确认为目标的长度。
[实施例8]sec Tax突变体mRNA-008的制备
(1)sec Tax突变体的体外转录(IVT)用的模板DNA的制作
通过与实施例4-(1)相同的方法进行实施。
(2)通过体外转录制备sec Tax突变体mRNA-008
将实施例8-(1)中得到的391μg/mL模板DNA(64μL)、100mM CleanCap AG(50μL，TriLink，目录#T-7113)、100mM ATP(50μL，Hongene，目录#R1331)、100mM GTP(50μL，Hongene，目录#R2331)、100mM CTP(50μL，Hongene，目录#R3331)、100mM N1-甲基-假尿嘧啶核苷5’-三磷酸(50μL，Hongene，目录#R5-027)、无核酸酶水(386μL，Qiagen#129114)、T7转录5×缓冲液(200μL，Promega，目录#P140X)、酶混合液，T7 RNA聚合酶(100μL，Promega，目录#P137X)混合，在37℃孵育4小时。将RQ1无RNA酶的DNA酶(25μL，Promega，目录#M6101)混合，在37℃孵育15分钟。将8M LiCl溶液(500μL，Sigma-Aldrich，目录#L7026)混合，在-20℃静置过夜。离心分离(4℃，5250×g，30分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，5250×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣溶解在无核酸酶水中后，使用RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen，目录#75162)，按照附属的操作手册进行纯化。将得到的洗脱液(3mL，UV换算为3.5mg)和无核酸酶水(359μL)、rApid碱性磷酸酶(Roche，目录#04898 141 001)的缓冲液(450μL)和酶(691μL)混合，在37℃孵育30分钟。在75℃孵育2分钟后，使用RNeasy Maxi试剂盒，按照附属的操作手册进行纯化，得到目标mRNA(4mL，UV换算为2.8mg)。
得到的mRNA具有SEQ ID NO:20的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNAReagent Kit(PerkinElmer，目录#CLS960010)进行分析，确认为目标的长度。
[实施例9～24]使用实施例1～8记载的mRNA制备mRNA包封核酸脂质颗粒
(1)mRNA包封核酸脂质颗粒的制备
将二硬脂酰磷脂酰胆碱(1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱，以下记作DSPC，日本油脂株式会社)、胆固醇(Cholesterol，以下记作Chol，Sigma-Aldrich，Inc.)、二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯基-7,29-二基(WO2015/005253的实施例23记载的化合物)(以下记作LP1)或乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯基-7-基(WO2015/005253的实施例28记载的化合物)(以下记作LP2)，以及聚乙二醇分子量约为2000的1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-MethoxypolyethyleneGlycol，以下记作PEG-DMG，日本油脂株式会社，SUNBRIGHT GM-020)，按照表1记载的摩尔比，溶解在乙醇中，使总脂质浓度变为5mM。
另一方面，将实施例1～8中得到的mRNA通过柠檬酸缓冲液(20mM CitrateBuffer，pH4.0)稀释制备。
使用NanoAssemblr BenchTop(Precision Nanosystems Inc.)，将上述脂质溶液和mRNA溶液在微流控通道内混合，使总脂质重量相对于mRNA的比变为表1记载的值，且其体积比变为1:3，从而得到核酸脂质颗粒的粗分散液。通过大约25～50倍量的缓冲液将核酸脂质颗粒的分散液透析12～18小时(Float-A-Lyzer G2，MWCO：1,000kD，Spectra/Por)，由此除去乙醇，得到经过纯化的mRNA包封核酸脂质颗粒的分散液。
另外，LP1按照WO2015/005253的实施例23记载的方法合成；LP2按照WO2015/005253的实施例28记载的方法合成。
(2)mRNA包封核酸脂质颗粒的特性评估
对包含(1)中制备的核酸脂质颗粒的分散液的特性进行评估。下面对各个特性评估的方法进行说明。
(2-1)mRNA的包封率
mRNA的包封率使用Quant-iT RiboGreen RNAAssay试剂盒(Invitrogen)，按照附属文件进行测定。
即，在0.015％ Triton X-100表面活性剂的存在下和不存在下，对核酸脂质颗粒的分散液中的mRNA进行定量，通过下式计算包封率。
{([表面活性剂存在下的mRNA量]-[表面活性剂不存在下的mRNA量])/[表面活性剂存在下的mRNA量]}×100(％)
(2-2)mRNA与脂质的比率
核酸脂质颗粒的分散液中的mRNA量通过以下任一方法测定。
用1.0％ Triton X-100将核酸脂质颗粒的分散液稀释制备，通过反相色谱法进行测定[系统：Agilent 1260series；柱：Bioshell A400蛋白质C4(10cm×4.6mm，3.4μm)(SUPELCO)；缓冲液A：0.1M乙酸三乙胺(pH7.0)；缓冲液B：乙腈；(B％)：5％-50％(0-15min)；流量：1mL/min；温度：70℃；检测：260nm]。
将核酸脂质颗粒分散液稀释溶解在90％甲醇中，通过紫外可见分光光度计[珀金埃尔默生命科学公司生产，LAMBDA(商标)465]测定核酸脂质颗粒中的mRNA量。通过下式计算mRNA浓度。
{[260nm处的吸光度]-[350nm处的吸光度]}×40×稀释倍率(μg/mL)
通过反相色谱法测定核酸脂质颗粒的分散液中的各脂质量[系统：DIONEXUltiMate 3000；柱：XSelect CSH C18(3.5μm，3.0mm×150mm，)(Waters，目录#186005263)；缓冲液A：0.2％甲酸；缓冲液B：0.2％甲酸、甲醇；(B％)：75％-100％(0-6min)、100％(6-15min)；流量：0.45mL/min；温度：50℃；检测：Corona CAD(电雾式检测器)]。
通过下式计算总脂质量相对于mRNA的比率。
[总脂质浓度]/[mRNA浓度](wt/wt)
(2-3)平均粒径
核酸脂质颗粒的粒径使用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)进行测定。表中的平均粒径表示体积平均粒径，±以下表示偏差。
将特性评估的结果示于表2。
[表1]
[表2]
以上结果表明，这些核酸脂质颗粒中，mRNA的95％以上包封在脂质颗粒内，具有大约100nm至大约140nm的平均粒径。
(试验例1)
LTR报告分析用的质粒的构建
编码HTLV-1Tax野生型(Uniprot登记号：P03409)、Tax突变型以及在Tax突变型中添加IgE分泌信号而成的分泌性Tax突变体的DNA，在受托方Eurofin进行合成。各DNA片段插入到pcDNA3.1+载体(Thermo Scientific Inc.)的NheI/NotI位点，进行克隆。另外，编码HIV-1LTR和HTLV-1 LTR的DNA在受托方Eurofin进行合成。各DNA片段插入到pGL4.17载体(Promega)的KpnI/XhoI位点，进行克隆。
HIV-1 LTR和HTLV-1 LTR报告分析
使用TransIT-LT1基因导入试剂(日本宝生物株式会社)，将350ng的表达Tax野生型、Tax突变型或分泌型Tax突变体的质粒、100ng的HIV-1 LTR报告质粒或HTLV-1 LTR报告质粒，以及50ng的转染效率校正用的pRG-RK质粒(Promega)，即共计500ng的质粒转染到HEK293T细胞中。自转染起48小时后，使用Dual-Glo(注册商标)萤光素酶检测系统(Promega)测定萤火虫萤光素酶表达量和海肾萤光素酶表达量，计算萤火虫萤光素酶表达量/海肾萤光素酶表达量之比，评估HIV-1 LTR和HTLV-1 LTR的转录活性。
(试验例2)
对C3H小鼠施用实施例12
C3H/HeJJcl小鼠是从日本CLEA公司获得并驯化的。每隔2周，对麻醉下的小鼠的经过消毒的小腿三头肌以5μg mRNA/20μL/小鼠的量施用实施例12。第一次对右腿施用，第二次对左腿施用。脂质颗粒的浓度调整和阴性对照组使用缓冲液。
血清和脾细胞的制备
自脂质颗粒初次施用起2周后，以及自第二次施用起1周后，对麻醉下的小鼠进行采血。将血液在常温静置1小时以上，以3000RPM离心10分钟，将血清分离回收。另外，在麻醉下对小鼠放血使其死亡，从其体内采集脾脏。使用细胞筛网(FALCON)的网眼和注射器(TERUMO)的垫圈将脾脏研碎，用RPMI 1640(nacalai tesque)调整成单细胞悬液后，通过离心回收细胞。将上清液废弃，使用DB Pharm Lyse裂解缓冲液(BECTON DICKINSON)对红细胞进行溶血处理。使离心分离后使用RPMI 1640进行再悬浮的细胞悬浮液通过微型细胞筛网(株式会社HIGH-TECH，Cat.HT-AMS-14002)。离心分离后将上清液废弃，将细胞再悬浮，测定细胞浓度。离心分离后将上清液废弃，通过细胞培养液[在RPMI 1640中加入胎牛血清(灭活并通过过滤器，HyClone)、1％青霉素-链霉素混合溶液(nacalai tesque)、1％丙酮酸钠(gibco)、1％MEM非必需氨基酸(gibco)、1％HEPES缓冲溶液(gibco)、1％StemSure单硫代甘油溶液(FUJIFILM)]调整细胞浓度。需要说明的是，离心在4℃以1500RPM进行5分钟。
Tax特异性CTL诱导水平
将3×106个经过调整的小鼠脾细胞离心，将上清液废弃。通过1×杜氏PBS缓冲液(gibco)将细胞再悬浮，离心并将上清液废弃，该步骤重复2次。之后，将用1×PBS稀释了20倍的TruStain FcX抗体(BioLegend)加入到细胞中，在常温静置5分钟。在各样本中加入5μL的H-2DK HTLV-1Tax38-46 Tetramer-ARLHTHALL-PE(MBL)，在37℃、5％ CO2孵育15分钟。在冰上，向样本添加最终浓度调整为100倍稀释的APC/Fire(商标)750抗小鼠CD3抗体(BioLegend)和抗CD8(小鼠)mAb-FITC(MBL)，在暗处静置30分钟。离心并废弃上清液，用1×PBS将细胞洗涤2次。最后用400μL PBS将细胞再悬浮，检测用FACSVerse(BD)标记的细胞，通过FlowJo(确认)进行分析。需要说明的是，离心在4℃以1500RPM进行5分钟。
小鼠血液中抗Tax抗体滴度
由于Tax(MYBiosource)重组蛋白要用作固定化抗原，因此将其添加在96孔平底孔板上，在4℃静置过夜。关于标准曲线稀释系列，将小鼠IgG(SouthernBiotech)从最高浓度0.25μg/mL通过3倍稀释制作7个阶段。将各孔洗涤，添加封闭溶液，在常温静置1小时。关于血清样本，使用封闭溶液从最高浓度的100倍稀释通过4倍稀释制作7个阶段。将封闭的孔板洗涤，向孔板添加稀释的样品，在常温静置1小时。用封闭溶液将检测抗体、山羊抗小鼠IgG、人ads-HRP(SouthernBiotech)稀释到3000倍，添加到洗涤后的孔中。1小时后进行洗涤，添加TMB微孔过氧化物酶底物系统(seracare)并静置2～3分钟，使用TMB终止液(KPL，Cat.51500-0021)使反应停止。通过读板仪，将450nm吸光度减去540nm吸光度的校正吸光度用于分析，计算出抗gp46抗体滴度和抗Tax抗体滴度。需要说明的是，封闭溶液为添加了1％牛血清白蛋白(Sigma)和0.05％ Tween(BIO-RAD)的1×杜氏PBS缓冲液(gibco)，洗涤使用添加了0.05％ Tween的1×杜氏PBS缓冲液[(10X)gibco]进行3次。
(试验例3～试验例5)
对食蟹猴的施用
以每2周1次、共计4次的频率，对猴的上臂部施用实施例13和实施例14的脂质颗粒。初次施用是对右上臂部施用，之后左右交替施用。关于脂质颗粒施用量，将实施例13和实施例14各等量混合25μg mRNA，每次施用50μg mRNA/200μL/只。
(试验例3)
猴血液中抗gp46和Tax抗体滴度
将重组gp46蛋白(RayBiotech)和重组Tax蛋白(MY Biosource)添加到96孔板，在4℃固定过夜。之后，使用孔板清洗机进行洗涤(用含0.05％ Tween 20的PBS洗涤液洗涤3次)，添加封闭溶液(1％ BSA、含0.05％ Tween 20的PBS)进行封闭。关于猴血浆样品稀释系列，使用封闭溶液从最高浓度的100倍稀释血清通过4倍稀释制作7个阶段。关于猴IgG浓度的标准曲线稀释系列，使用封闭溶液将猴IgG溶液(厂商)从最高浓度0.25μg/mL通过3倍稀释制作8个阶段。添加样品稀释溶液和标准曲线稀释溶液，在室温静置1小时后，用孔板清洗机进行洗涤。关于检测抗体，用封闭溶液将HRP标记抗猴IgG抗体(Sigma-Aldrich)稀释4000倍并添加到孔板中，之后在室温静置1小时。用孔板清洗机洗涤后，添加TMB微孔过氧化物酶底物系统(SERACARE Life Sciences)，静置10分钟。反应终止液使用TMB终止液(SERACARELife Sciences)。使用读板仪测定波长450nm(对照波长540nm)的吸光度，将在450nm处测定的吸光度减去在540nm处测定的吸光度的校正吸光度(Delta)用于分析。根据标准曲线的猴IgG浓度和Δ，使用四参数非线性回归绘制校准曲线。根据校准曲线、测定样品的稀释倍率，以及Δ计算出样品的抗gp46和Tax抗体浓度。
(试验例4)
猴中的gp46和Tax特异性细胞性免疫应答
使用RPMI完全培养基[10％ FBS(Sigma-Aldrich)、1％ PS(青霉素-链霉素混合溶液，Nacalai Tesque)、1mM丙酮酸钠(赛默飞世尔科技)、10mM HEPES(赛默飞世尔科技)、1×StemSure(富士胶片和光纯药工业株式会社)、1×MEM非必需氨基酸溶液(赛默飞世尔科技)]，将使用Ficoll(Cytiva)从猴外周血分离出的PBMC制备成2×106细胞/mL，以100μL/孔的量接种到IFN-γELISpot孔板(MABTech)。之后，以100μL/孔的量添加用RPMI完全培养基制备成最终浓度0.1％(v/v)的Tax表位肽池(Eurofins)或制备成1μg/mL的gp46重组蛋白(RayBiotech)，在37℃、5％ CO2的条件下培养48小时。抗原特异性IFN-γ产生细胞使用猴IFN-γELISpotPLUS试剂盒(HRP)(MABTech)进行检测。抗原特异性IFN-γ产生细胞使用ELISPOT分析仪(CTL)进行测定。
(试验例5)
猴血液中抗HTLV-1中和活性
使用基于离心柱的抗体纯化试剂盒(Cosmo Bio)，从自第4次施用起2周后采集制备的猴血浆中纯化出总IgG。向HTLV-1感染细胞YT#1细胞株中加入纯化IgG，然后将HTLV-1非感染细胞株CEM细胞按照与YT#1的细胞固定比1:1的比例混合，在其共培养系统中加入患者血清后培养过夜，然后测定并用显微镜观察合胞体形成的存在率。
(试验例6)
小鼠血液中gp46特异性总IgG抗体滴度
由于gp46(Ray Biotech Inc.)重组蛋白要用作固定化抗原，因此将其添加在96孔平底孔板上，在4℃静置过夜。关于标准曲线稀释系列，将小鼠IgG(SouthernBiotech)从最高浓度0.25μg/mL通过3倍稀释制作7个阶段。将各孔洗涤，添加封闭溶液，在常温静置1小时。关于血清样本，使用封闭溶液从最高浓度的100倍稀释通过4倍稀释制作7个阶段。将封闭的孔板洗涤，向孔板添加稀释的样品，在常温静置1小时。用封闭溶液将检测抗体、山羊抗小鼠IgG、人ads-HRP(SouthernBiotech)稀释到3000倍，添加到洗涤后的孔中。1小时后进行洗涤，添加TMB微孔过氧化物酶底物系统(seracare)并静置2～3分钟，使用TMB终止液(KPL，Cat.51500-0021)使反应停止。通过读板仪，将450nm吸光度减去540nm吸光度的校正吸光度用于分析，计算出抗gp46抗体滴度和抗Tax抗体滴度。需要说明的是，封闭溶液为添加了1％牛血清白蛋白(Sigma)和0.05％ Tween(BIO-RAD)的1×杜氏PBS缓冲液(gibco)，洗涤使用添加了0.05％ Tween的1×杜氏PBS缓冲液[(10X)gibco]进行3次。
(试验例7)
小鼠中的gp46和Tax特异性细胞性免疫应答
以106个/孔的量将调整后的小鼠脾细胞接种到96孔U底孔板(FALCON)，通过最终浓度调整为10μg/mL的gp46和Tax肽池(Eurofins)在37℃、5％ CO2进行刺激。在24小时后回收培养上清液，按照试剂盒的操作说明测定IFN-γ(R&D Systems)和IL-2(R&D Systems)的产生。
(试验例8)
蛋白质表达分析
将实施例9、10、11、12加入到CHO-S细胞(赛默飞世尔科技)中，使培养中的mRNA浓度变为3μg/mL。自添加起72小时后回收培养上清液和细胞团块。加入M-PER(商标)组织蛋白提取试剂(Thermo Scientific)，用Vortex与细胞团块充分混合，在常温静置10分钟。再次用Vortex进行混合，离心分离后(3000RPM、4℃、10分钟)回收细胞溶解液。培养上清液和细胞溶解液中的gp46蛋白使用蛋白质印迹法检测。
(试验例1的结果)
以HIV-1 LTR和HTLV-1 LTR的转录活性为指标的Tax抗原设计的选择
对Tax野生型、Tax突变型以及分泌型Tax突变体的HIV-1 LTR转录活性和HTLV-1LTR转录活性进行了评估(图1)。结果确认到，与Tax野生型相比，Tax突变型的HIV-1 LTR转录活性和HTLV-1 LTR转录活性降低。另外，分泌型Tax突变体体现出了与阴性对照同等的HIV-1 LTR转录活性和HTLV-1 LTR转录活性。以上结果表明，HIV-1 LTR转录活性和HTLV-1LTR转录活性最低的分泌型Tax突变体是致癌性最低的疫苗抗原候选。
(试验例2的结果)
实施例12的CTL诱导水平和血液中抗Tax抗体滴度
对施用了实施例12的C3H小鼠中的CTL诱导水平进行了评估(图2)。结果，实施例12使Tax特异性CTL和血液中抗Tax抗体应答得到了诱导。
(试验例3的结果)
猴血液中抗gp46和Tax抗体滴度
对等量混合了实施例13和实施例14的脂质颗粒制剂所诱导的血液中抗gp46抗体应答和血液中抗Tax抗体应答进行了评估(图3)。结果，与施用前(0W)相比，2次施用后(4W)和3次施用后(6W)的血液中抗gp46抗体滴度和抗Tax抗体滴度高。
(试验例4的结果)
猴PBMC中的gp46和Tax特异性IFN-γ产生细胞水平
对实施例13和实施例14的混合制剂所诱导的血液中抗gp46抗体应答和血液中抗Tax抗体应答进行了评估(图4)。使用自第4次施用起7周后采集制备的PBMC进行了研究，结果在实施例5和实施例6的混合制剂组中确认到了gp46特异性和Tax特异性IFN-γ产生细胞的诱导。
(试验例5的结果)
猴血液中抗HTLV-1中和活性
对实施例13和实施例14的混合制剂所诱导的血液中抗HTLV-1中和活性进行了评估(图5)。使用自第4次施用起2周后采集纯化的血液中总IgG进行了研究，结果与阴性对照组相比，在脂质颗粒施用组的4只中的3只确认到了血液中抗HTLV-1中和活性。
(试验例6的结果)
小鼠血液中抗gp46抗体滴度
对实施例9、实施例10、实施例11或实施例12的脂质颗粒的施用所诱导的血液中抗gp46抗体应答进行了评估(图6)。结果与阴性对照组相比，在实施例9组、实施例10组和实施例11组确认到了较高的血液中抗gp46抗体应答。
(试验例7的结果)
C57BL/6小鼠中的gp46特异性和Tax特异性细胞性免疫应答
将IFN-γ产生水平和IL-2产生水平作为指标，对实施例9、实施例10、实施例11或实施例12的脂质颗粒的施用所诱导的gp46特异性和IL-2特异性细胞性免疫进行了评估(图7)。结果与阴性对照组相比，在实施例9组、实施例10组和实施例11组确认到了较高的gp46特异性细胞性免疫应答。另外，与阴性对照组相比，在实施例12组确认到了较高的Tax特异性细胞性免疫应答。
(试验例8的结果)
实施例9至实施例12的脂质颗粒的抗原蛋白的表达水平
对实施例9至实施例12中处理的CHO-S细胞的培养上清液中和细胞溶解液中的各脂质颗粒所表达的抗原蛋白的表达水平进行了评估(图8)。结果确认到了各脂质颗粒所表达的抗gp46抗体结合的抗原蛋白的表达。需要说明的是，gp46蛋白为39kDa。
[实施例25～29]gp46-Fib mRNA的制备
(1)gp46-Fib的体外转录(IVT)用的模板DNA的制作
为了制作用于体外转录(IVT)的模板DNA，构建了质粒。制作导入了包含T7启动子序列、人β-珠蛋白的5’-UTR序列、KOZAK序列、gp46-Fib的翻译区、人β-珠蛋白的3’-UTR序列和PolyA序列依次连接而成的序列的DNA片段(SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:25)的质粒(分别使用导入了SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:25的DNA片段的质粒实施了实施例25～29)。
(2)模板DNA的线性化
在溶解了(1)中得到的质粒(300μg)的无核酸酶水(268μL)中加入10×NEBuffer3.1、BspQI(32μL、New England Biolabs，目录#R0712L)，在50℃孵育16小时后，在80℃孵育20分钟。将乙醇(900μL)、3mol/L乙酸钠溶液(30μL)混合，在-80℃静置4小时。离心分离(4℃，15000×g，30分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，15000×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣用无核酸酶水制备成500μg/mL的溶液。
(3)通过体外转录制备gp46-Fib mRNA
将(2)中得到的500μg/mL模板DNA(15μL)、100mM CleanCap AG(15μL，TriLink，目录#N-7113)、100mM ATP(15μL，Hongene，目录#R1331)、100mM GTP(15μL，Hongene，目录#R2331)、100mM 5-Me-CTP(15μL，Hongene，目录#R3-029)、100mM 5-Me-UTP(15μL，Hongene，目录#R5-104)、无核酸酶水(113μL)、5×IVT缓冲液(60μL，400mM HEPES-KOH pH7.5、400mMDTT、120mM MgCl2、10mM亚精胺)、T7 RNA聚合酶(15μL，Promega，目录#P407X)、RNA酶抑制剂(15μL，Promega，目录#P261X)、焦磷酸酶(7.5μL，Hongene，目录#ON-025)混合，在37℃孵育4小时。将RQ1无RNA酶的DNA酶(7.5μL，Promega，目录#M6101)混合，在37℃孵育30分钟。将10M乙酸铵溶液(100μL)混合，在-20℃静置2小时。离心分离(4℃，15000×g，30分钟)后，将上层清液废弃，加入70％乙醇，离心分离(4℃，15000×g，10分钟)后，将上层清液废弃，进行风干。将得到的残渣溶解在无核酸酶水中，使用NucleoSpin(Macherey-Nagel，目录#740948.50)进行纯化，得到目标mRNA。
得到的mRNA具有SEQ ID NO:31～SEQ ID NO:35的序列，5’末端具有cap1结构，胞苷和尿苷分别被取代为5-甲基胞苷和5-甲基尿苷。通过LabChip GX Touch Standard RNAReagent Kit(PerkinElmer，目录#CLS960010)进行分析，确认为目标的长度。
[实施例30～34]包封实施例25～29中得到的mRNA的核酸脂质颗粒的制备
(1)mRNA包封核酸脂质颗粒的制备
分别使用实施例25～29中得到的mRNA代替实施例1～8中记载的mRNA，按照与实施例9～24相同的方法，制备了表3记载的核酸脂质颗粒。
(2)mRNA包封核酸脂质颗粒的特性评估
通过与实施例9～24相同的方法实施核酸脂质的特性评估，将结果示于表4。
[表3]
[表4]
(试验例9)
gp46蛋白表达分析
将实施例30～34加入到CHO-S细胞(赛默飞世尔科技)中，使培养基中的mRNA浓度变为3μg/mL。另外，作为阴性对照，加入与实施例35～39的颗粒的添加液量等量的缓冲液。自添加起3天后回收培养上清液。关于培养上清液中的gp46蛋白，将用D-PBS稀释到10倍的培养上清液固定在96孔半区微孔板，通过使用施用了实施例10的小鼠的血清的酶联免疫吸附(ELISA)法进行检测。
(试验例9的结果)
实施例30～34的gp46表达诱导能力
对实施例30～34中处理的CHO-S细胞的培养上清液中的gp46蛋白表达水平进行了评估。结果，实施例30～34中处理的CHO-S细胞表达了gp46蛋白(图28)。
工业实用性
本发明能够用于预防或治疗由HTLV-1引起的感染。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1：SU gp46 IVT用的模板质粒DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:2：正义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:3：反义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:4：SU gp46的体外转录(IVT)用的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:5：HTLV-I gp46-Fib IVT用的模板质粒DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:6：gp46-Fib的体外转录(IVT)用的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:7：HTLV-I dgp62-Fib IVT用的模板质粒DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:8：dgp62-Fib的体外转录(IVT)用的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:9：HTLV-I sec Tax突变体IVT用的模板质粒DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:10：sec Tax突变体的体外转录(IVT)用的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:11：Tax野生型的氨基酸序列
SEQ ID NO:12：Tax突变型(T130A/L131S/L319R/L320S)的氨基酸序列
SEQ ID NO:13：分泌型Tax突变体(T130A/L131S/L319R/L320S)的氨基酸序列
SEQ ID NO:14：gp46的氨基酸序列
SEQ ID NO:15：gp46-Fib的氨基酸序列
SEQ ID NO:16：dgp62-Fib的氨基酸序列
SEQ ID NO:17：SU gp46 mRNA
SEQ ID NO:18：gp46-Fib mRNA
SEQ ID NO:19：dgp62-Fib mRNA
SEQ ID NO:20：sec Tax突变体mRNA
SEQ ID NO:21：gp46-Fib polyA95的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:22：gp46-Fib polyA80的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:23：gp46-Fib polyA60的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:24：gp46-Fib polyA40的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:25：gp46-Fib polyA20的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:26：sec Tax突变体polyA95的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:27：sec Tax突变体polyA80的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:28：sec Tax突变体polyA60的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:29：sec Tax突变体polyA40的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:30：sec Tax突变体polyA20的模板DNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:31：gp46-Fib polyA95的mRNA序列
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SEQ ID NO:38：sec Tax突变体polyA60的mRNA序列
SEQ ID NO:39：sec Tax突变体polyA40的mRNA序列
SEQ ID NO:40：sec Tax突变体polyA20的mRNA序列本说明书中引用的全部的发行物、专利及专利申请直接通过引用而并入说明书中。
序列表
<110> 国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所
国立大学法人琉球大学
第一三共株式会社
<120> HTLV-1核酸脂质颗粒疫苗
<130> PH-9394-PCT
<150> JP 2021-084942
<151> 2021-05-19
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1277
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 用于HTLV-I SU gp46 IVT的模板质粒DNA
<400> 1
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgggc aagttcctgg ccacactgat 120
cctgttcttc cagttctgcc ccctgatctt cggcgactac agccccagct gctgcaccct 180
gacaatcggc gtgagcagct accacagcaa gccctgcaac cccgcccagc ccgtgtgcag 240
ctggaccctg gacctgctgg ccctgagcgc cgaccaggcc ctgcagcccc cctgccccaa 300
cctggtgagc tacagcagct accacgccac ctacagcctg tacctgttcc cccactggac 360
caagaagccc aacagaaacg gcggaggcta ctacagcgcc agctacagcg acccctgcag 420
cctgaagtgc ccctacctgg gctgccagag ctggacatgc ccctacacag gcgccgtgag 480
cagcccctac tggaagttcc agcacgacgt gaacttcacc caagaggtga gccggctgaa 540
catcaacctg cacttcagca agtgcggctt cccattcagc ctgctggtgg acgcccccgg 600
ctacgacccc atctggttcc tgaacaccga gcccagccag ctgcccccaa cagccccacc 660
cctgctgccc cacagcaacc tggaccacat cctggaaccc agcatcccct ggaagagcaa 720
gctgctgaca ctggtgcagc tgaccctgca gagcaccaac tacacctgca tcgtgtgcat 780
cgaccgggcc agcctgagca catggcacgt gctgtacagc cccaacgtga gcgtgcccag 840
cagcagcagc acacccctgc tgtaccccag cctggcactg cccgcccccc acctgacact 900
gcccttcaac tggacccact gcttcgaccc ccagatccag gccatcgtga gcagcccatg 960
ccacaacagc ctgatcctgc ccccattcag cctgagcccc gtgcccacac tgggcagcag 1020
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
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<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> 正义引物
<400> 2
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<210> 3
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 反义引物
<400> 3
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt gcaatgaaaa taaatgtttt 120
ttattaggc 129
<210> 4
<211> 1258
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 用于SU gp46体外转录(IVT)的模板质粒DNA
<400> 4
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cctgctgccc cacagcaacc tggaccacat cctggaaccc agcatcccct ggaagagcaa 720
gctgctgaca ctggtgcagc tgaccctgca gagcaccaac tacacctgca tcgtgtgcat 780
cgaccgggcc agcctgagca catggcacgt gctgtacagc cccaacgtga gcgtgcccag 840
cagcagcagc acacccctgc tgtaccccag cctggcactg cccgcccccc acctgacact 900
gcccttcaac tggacccact gcttcgaccc ccagatccag gccatcgtga gcagcccatg 960
ccacaacagc ctgatcctgc ccccattcag cctgagcccc gtgcccacac tcggcagcgg 1020
cagcggcagc ggctacatcc ccgaggcccc cagagacggc caggcctacg tcagaaagga 1080
cggcgaatgg gtgctgctga gcaccttcct gtgagctcgc tttcttgctg tccaatttct 1140
attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc 1200
ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga gcactagt 1358
<210> 6
<211> 1339
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 用于gp46-Fib体外转录(IVT)的模板质粒DNA
<400> 6
taatacgact cactataagg agacccaagc tacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac 60
tagcaacctc aaacagacac cgccaccatg ggcaagttcc tggccacact gatcctgttc 120
ttccagttct gccccctgat cttcggcgac tacagcccca gctgctgcac cctgacaatc 180
ggcgtgagca gctaccacag caagccctgc aaccccgccc agcccgtgtg cagctggacc 240
ctggacctgc tggccctgag cgccgaccag gccctgcagc ccccctgccc caacctggtg 300
agctacagca gctaccacgc cacctacagc ctgtacctgt tcccccactg gaccaagaag 360
cccaacagaa acggcggagg ctactacagc gccagctaca gcgacccctg cagcctgaag 420
tgcccctacc tgggctgcca gagctggaca tgcccctaca caggcgccgt gagcagcccc 480
tactggaagt tccagcacga cgtgaacttc acccaagagg tgagccggct gaacatcaac 540
ctgcacttca gcaagtgcgg cttcccattc agcctgctgg tggacgcccc cggctacgac 600
cccatctggt tcctgaacac cgagcccagc cagctgcccc caacagcccc acccctgctg 660
ccccacagca acctggacca catcctggaa cccagcatcc cctggaagag caagctgctg 720
acactggtgc agctgaccct gcagagcacc aactacacct gcatcgtgtg catcgaccgg 780
gccagcctga gcacatggca cgtgctgtac agccccaacg tgagcgtgcc cagcagcagc 840
agcacacccc tgctgtaccc cagcctggca ctgcccgccc cccacctgac actgcccttc 900
aactggaccc actgcttcga cccccagatc caggccatcg tgagcagccc atgccacaac 960
agcctgatcc tgcccccatt cagcctgagc cccgtgccca cactcggcag cggcagcggc 1020
agcggctaca tccccgaggc ccccagagac ggccaggcct acgtcagaaa ggacggcgaa 1080
tgggtgctgc tgagcacctt cctgtgagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag 1140
gttcctttgt tccctaagtc caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca 1200
tctggattct gcctaataaa aaacatttat tttcattgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1339
<210> 7
<211> 1748
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 用于HTLV-I dgb62-FIb IVT的模板质粒DNA
<400> 7
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgggc aagttcctgg ccacactgat 120
cctgttcttc cagttctgcc ccctgatctt cggcgactac agccccagct gctgcaccct 180
gacaatcggc gtgagcagct accacagcaa gccctgcaac cccgcccagc ccgtgtgcag 240
ctggaccctg gacctgctgg ccctgagcgc cgaccaggcc ctgcagcccc cctgccccaa 300
cctggtgagc tacagcagct accacgccac ctacagcctg tacctgttcc cccactggac 360
caagaagccc aacagaaacg gcggaggcta ctacagcgcc agctacagcg acccctgcag 420
cctgaagtgc ccctacctgg gctgccagag ctggacatgc ccctacacag gcgccgtgag 480
cagcccctac tggaagttcc agcacgacgt gaacttcacc caagaggtga gccggctgaa 540
catcaacctg cacttcagca agtgcggctt cccattcagc ctgctggtgg acgcccccgg 600
ctacgacccc atctggttcc tgaacaccga gcccagccag ctgcccccaa cagccccacc 660
cctgctgccc cacagcaacc tggaccacat cctggaaccc agcatcccct ggaagagcaa 720
gctgctgaca ctggtgcagc tgaccctgca gagcaccaac tacacctgca tcgtgtgcat 780
cgaccgggcc agcctgagca catggcacgt gctgtacagc cccaacgtga gcgtgcccag 840
cagcagcagc acacccctgc tgtaccccag cctggcactg cccgcccccc acctgacact 900
gcccttcaac tggacccact gcttcgaccc ccagatccag gccatcgtga gcagcccatg 960
ccacaacagc ctgatcctgc ccccattcag cctgagcccc gtgcccacac tcggcagcgg 1020
aagcggaagc gcagtgcccg tggccgtgtg gctggtgagc gccctggcca tgggagccgg 1080
cgtggcaggc ggaatcacag gcagcatgag cctggccagc ggcaagagcc tgctgcacga 1140
ggtggacaag gacatcagcc agctgaccca ggccatcgtg aagaaccaca agaacctgct 1200
gaagatcgcc cagtacgccg cccagaacag aagaggactg gacctgctgt tctgggagca 1260
aggcggactg tgcaaagccc tccaagagca gtgcagattc cccaacatca ccaacagcca 1320
cgtgcccatc ctgcaagagc ggcccccact ggaaaacaga gtgctgacag gatggggcct 1380
gaactgggac ctgggactga gccagtgggc cagagaggcc ggctacatcc ccgaggcccc 1440
cagagacgga caggcctacg tcagaaagga cggcgaatgg gtgctgctga gcaccttcct 1500
gtgagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa 1560
ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa 1620
catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 1740
gcactagt 1748
<210> 8
<211> 1729
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 用于dgb62-FIb体外转录(IVT)的模板质粒DNA
<400> 8
taatacgact cactataagg agacccaagc tacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac 60
tagcaacctc aaacagacac cgccaccatg ggcaagttcc tggccacact gatcctgttc 120
ttccagttct gccccctgat cttcggcgac tacagcccca gctgctgcac cctgacaatc 180
ggcgtgagca gctaccacag caagccctgc aaccccgccc agcccgtgtg cagctggacc 240
ctggacctgc tggccctgag cgccgaccag gccctgcagc ccccctgccc caacctggtg 300
agctacagca gctaccacgc cacctacagc ctgtacctgt tcccccactg gaccaagaag 360
cccaacagaa acggcggagg ctactacagc gccagctaca gcgacccctg cagcctgaag 420
tgcccctacc tgggctgcca gagctggaca tgcccctaca caggcgccgt gagcagcccc 480
tactggaagt tccagcacga cgtgaacttc acccaagagg tgagccggct gaacatcaac 540
ctgcacttca gcaagtgcgg cttcccattc agcctgctgg tggacgcccc cggctacgac 600
cccatctggt tcctgaacac cgagcccagc cagctgcccc caacagcccc acccctgctg 660
ccccacagca acctggacca catcctggaa cccagcatcc cctggaagag caagctgctg 720
acactggtgc agctgaccct gcagagcacc aactacacct gcatcgtgtg catcgaccgg 780
gccagcctga gcacatggca cgtgctgtac agccccaacg tgagcgtgcc cagcagcagc 840
agcacacccc tgctgtaccc cagcctggca ctgcccgccc cccacctgac actgcccttc 900
aactggaccc actgcttcga cccccagatc caggccatcg tgagcagccc atgccacaac 960
agcctgatcc tgcccccatt cagcctgagc cccgtgccca cactcggcag cggaagcgga 1020
agcgcagtgc ccgtggccgt gtggctggtg agcgccctgg ccatgggagc cggcgtggca 1080
ggcggaatca caggcagcat gagcctggcc agcggcaaga gcctgctgca cgaggtggac 1140
aaggacatca gccagctgac ccaggccatc gtgaagaacc acaagaacct gctgaagatc 1200
gcccagtacg ccgcccagaa cagaagagga ctggacctgc tgttctggga gcaaggcgga 1260
ctgtgcaaag ccctccaaga gcagtgcaga ttccccaaca tcaccaacag ccacgtgccc 1320
atcctgcaag agcggccccc actggaaaac agagtgctga caggatgggg cctgaactgg 1380
gacctgggac tgagccagtg ggccagagag gccggctaca tccccgaggc ccccagagac 1440
ggacaggcct acgtcagaaa ggacggcgaa tgggtgctgc tgagcacctt cctgtgagct 1500
cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc caactactaa 1560
actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa aaacatttat 1620
tttcattgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1729
<210> 9
<211> 1451
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 用于HTLV-I sec Tax突变体IVT的模板质粒DNA
<400> 9
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatggac tggacctgga tcctgttcct 120
ggtggccgcc gccacaagag tgcacagcgc acacttccca ggcttcggcc agagcctgct 180
gttcggctac cccgtgtacg tgttcggcga ctgcgtgcaa ggcgactggt gccccatcag 240
cggcggcctg tgcagcgcca gactgcacag acacgccctg ctggccacat gccccgagca 300
ccagatcacc tgggacccca tcgacggcag agtgatcgga agcgccctgc agttcctgat 360
ccccagactg cccagcttcc ccacacagag aaccagcaag accctgaagg tgctgacccc 420
ccccatcaca cacaccacac ccaacatccc cccaagcttc ctgcaggcca tgcggaagta 480
cagccccttc agaaacggct acatggaacc cacactgggc cagcacctgc ccgccagcag 540
cttccccgac cccggactga ggccccagaa cctgtacaca ctgtggggcg gcagcgtcgt 600
gtgcatgtac ctgtaccagc tgagcccacc aatcacatgg cccctgctgc cccacgtgat 660
cttctgccac cccggacagc tgggcgcctt cctgaccaac gtgccctaca agcggatcga 720
ggaactgctg tacaagatca gcctgaccac aggcgccctg atcatcctgc ccgaggactg 780
cctgcccacc acactgttcc agcccgccag agcccccgtg acactgaccg cctggcagaa 840
cggcctgctg ccattccaca gcaccctgac aacacccggc ctgatctgga ccttcaccga 900
cggcacaccc atgatcagcg gcccctgccc caaggacggc cagcccagcc tggtgctgca 960
gagcagcagc ttcatcttcc acaagttcca gaccaaggcc taccacccca gcttcctgct 1020
gagccacgga ctgatccagt acagcagctt ccacagcctg cacctgctgt tcgaagagta 1080
cacaaacatc cccatcagcc ggagcttcaa cgagaaagag gccgacgaca acgaccacga 1140
gccccagatc agccccggcg gactggaacc ccccagcgag aagcacttcc gggaaaccga 1200
agtgtgagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc 1260
caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa 1320
aaacatttat tttcattgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440
agagcactag t 1451
<210> 10
<211> 1432
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 用于sec Tax突变体体外转录(IVT)的模板质粒DNA
<400> 10
taatacgact cactataagg agacccaagc tacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac 60
tagcaacctc aaacagacac cgccaccatg gactggacct ggatcctgtt cctggtggcc 120
gccgccacaa gagtgcacag cgcacacttc ccaggcttcg gccagagcct gctgttcggc 180
taccccgtgt acgtgttcgg cgactgcgtg caaggcgact ggtgccccat cagcggcggc 240
ctgtgcagcg ccagactgca cagacacgcc ctgctggcca catgccccga gcaccagatc 300
acctgggacc ccatcgacgg cagagtgatc ggaagcgccc tgcagttcct gatccccaga 360
ctgcccagct tccccacaca gagaaccagc aagaccctga aggtgctgac cccccccatc 420
acacacacca cacccaacat ccccccaagc ttcctgcagg ccatgcggaa gtacagcccc 480
ttcagaaacg gctacatgga acccacactg ggccagcacc tgcccgccag cagcttcccc 540
gaccccggac tgaggcccca gaacctgtac acactgtggg gcggcagcgt cgtgtgcatg 600
tacctgtacc agctgagccc accaatcaca tggcccctgc tgccccacgt gatcttctgc 660
caccccggac agctgggcgc cttcctgacc aacgtgccct acaagcggat cgaggaactg 720
ctgtacaaga tcagcctgac cacaggcgcc ctgatcatcc tgcccgagga ctgcctgccc 780
accacactgt tccagcccgc cagagccccc gtgacactga ccgcctggca gaacggcctg 840
ctgccattcc acagcaccct gacaacaccc ggcctgatct ggaccttcac cgacggcaca 900
cccatgatca gcggcccctg ccccaaggac ggccagccca gcctggtgct gcagagcagc 960
agcttcatct tccacaagtt ccagaccaag gcctaccacc ccagcttcct gctgagccac 1020
ggactgatcc agtacagcag cttccacagc ctgcacctgc tgttcgaaga gtacacaaac 1080
atccccatca gccggagctt caacgagaaa gaggccgacg acaacgacca cgagccccag 1140
atcagccccg gcggactgga accccccagc gagaagcact tccgggaaac cgaagtgtga 1200
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 1260
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 1320
tattttcatt gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1432
<210> 11
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> Tax野生型的氨基酸序列
<400> 11
Met Ala His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Phe Gly Tyr Pro
1 5 10 15
Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Gly Asp Trp Cys Pro Ile Ser
20 25 30
Gly Gly Leu Cys Ser Ala Arg Leu His Arg His Ala Leu Leu Ala Thr
35 40 45
Cys Pro Glu His Gln Ile Thr Trp Asp Pro Ile Asp Gly Arg Val Ile
50 55 60
Gly Ser Ala Leu Gln Phe Leu Ile Pro Arg Leu Pro Ser Phe Pro Thr
65 70 75 80
Gln Arg Thr Ser Lys Thr Leu Lys Val Leu Thr Pro Pro Ile Thr His
85 90 95
Thr Thr Pro Asn Ile Pro Pro Ser Phe Leu Gln Ala Met Arg Lys Tyr
100 105 110
Ser Pro Phe Arg Asn Gly Tyr Met Glu Pro Thr Leu Gly Gln His Leu
115 120 125
Pro Thr Leu Ser Phe Pro Asp Pro Gly Leu Arg Pro Gln Asn Leu Tyr
130 135 140
Thr Leu Trp Gly Gly Ser Val Val Cys Met Tyr Leu Tyr Gln Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Ile Thr Trp Pro Leu Leu Pro His Val Ile Phe Cys His Pro
165 170 175
Gly Gln Leu Gly Ala Phe Leu Thr Asn Val Pro Tyr Lys Arg Ile Glu
180 185 190
Glu Leu Leu Tyr Lys Ile Ser Leu Thr Thr Gly Ala Leu Ile Ile Leu
195 200 205
Pro Glu Asp Cys Leu Pro Thr Thr Leu Phe Gln Pro Ala Arg Ala Pro
210 215 220
Val Thr Leu Thr Ala Trp Gln Asn Gly Leu Leu Pro Phe His Ser Thr
225 230 235 240
Leu Thr Thr Pro Gly Leu Ile Trp Thr Phe Thr Asp Gly Thr Pro Met
245 250 255
Ile Ser Gly Pro Cys Pro Lys Asp Gly Gln Pro Ser Leu Val Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Ser Phe Ile Phe His Lys Phe Gln Thr Lys Ala Tyr His Pro
275 280 285
Ser Phe Leu Leu Ser His Gly Leu Ile Gln Tyr Ser Ser Phe His Ser
290 295 300
Leu His Leu Leu Phe Glu Glu Tyr Thr Asn Ile Pro Ile Ser Leu Leu
305 310 315 320
Phe Asn Glu Lys Glu Ala Asp Asp Asn Asp His Glu Pro Gln Ile Ser
325 330 335
Pro Gly Gly Leu Glu Pro Pro Ser Glu Lys His Phe Arg Glu Thr Glu
340 345 350
Val
<210> 12
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> Tax突变体(T130A/L131S/L319R/L320S)的氨基酸序列
<400> 12
Met Ala His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Phe Gly Tyr Pro
1 5 10 15
Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Gly Asp Trp Cys Pro Ile Ser
20 25 30
Gly Gly Leu Cys Ser Ala Arg Leu His Arg His Ala Leu Leu Ala Thr
35 40 45
Cys Pro Glu His Gln Ile Thr Trp Asp Pro Ile Asp Gly Arg Val Ile
50 55 60
Gly Ser Ala Leu Gln Phe Leu Ile Pro Arg Leu Pro Ser Phe Pro Thr
65 70 75 80
Gln Arg Thr Ser Lys Thr Leu Lys Val Leu Thr Pro Pro Ile Thr His
85 90 95
Thr Thr Pro Asn Ile Pro Pro Ser Phe Leu Gln Ala Met Arg Lys Tyr
100 105 110
Ser Pro Phe Arg Asn Gly Tyr Met Glu Pro Thr Leu Gly Gln His Leu
115 120 125
Pro Ala Ser Ser Phe Pro Asp Pro Gly Leu Arg Pro Gln Asn Leu Tyr
130 135 140
Thr Leu Trp Gly Gly Ser Val Val Cys Met Tyr Leu Tyr Gln Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Ile Thr Trp Pro Leu Leu Pro His Val Ile Phe Cys His Pro
165 170 175
Gly Gln Leu Gly Ala Phe Leu Thr Asn Val Pro Tyr Lys Arg Ile Glu
180 185 190
Glu Leu Leu Tyr Lys Ile Ser Leu Thr Thr Gly Ala Leu Ile Ile Leu
195 200 205
Pro Glu Asp Cys Leu Pro Thr Thr Leu Phe Gln Pro Ala Arg Ala Pro
210 215 220
Val Thr Leu Thr Ala Trp Gln Asn Gly Leu Leu Pro Phe His Ser Thr
225 230 235 240
Leu Thr Thr Pro Gly Leu Ile Trp Thr Phe Thr Asp Gly Thr Pro Met
245 250 255
Ile Ser Gly Pro Cys Pro Lys Asp Gly Gln Pro Ser Leu Val Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Ser Phe Ile Phe His Lys Phe Gln Thr Lys Ala Tyr His Pro
275 280 285
Ser Phe Leu Leu Ser His Gly Leu Ile Gln Tyr Ser Ser Phe His Ser
290 295 300
Leu His Leu Leu Phe Glu Glu Tyr Thr Asn Ile Pro Ile Ser Arg Ser
305 310 315 320
Phe Asn Glu Lys Glu Ala Asp Asp Asn Asp His Glu Pro Gln Ile Ser
325 330 335
Pro Gly Gly Leu Glu Pro Pro Ser Glu Lys His Phe Arg Glu Thr Glu
340 345 350
Val
<210> 13
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 分泌型Tax突变体(T130A/L131S/L319R/L320S)的氨基酸序列
<400> 13
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ala His Phe Pro Gly Phe Gly Gln Ser Leu Leu Phe Gly Tyr
20 25 30
Pro Val Tyr Val Phe Gly Asp Cys Val Gln Gly Asp Trp Cys Pro Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Leu Cys Ser Ala Arg Leu His Arg His Ala Leu Leu Ala
50 55 60
Thr Cys Pro Glu His Gln Ile Thr Trp Asp Pro Ile Asp Gly Arg Val
65 70 75 80
Ile Gly Ser Ala Leu Gln Phe Leu Ile Pro Arg Leu Pro Ser Phe Pro
85 90 95
Thr Gln Arg Thr Ser Lys Thr Leu Lys Val Leu Thr Pro Pro Ile Thr
100 105 110
His Thr Thr Pro Asn Ile Pro Pro Ser Phe Leu Gln Ala Met Arg Lys
115 120 125
Tyr Ser Pro Phe Arg Asn Gly Tyr Met Glu Pro Thr Leu Gly Gln His
130 135 140
Leu Pro Ala Ser Ser Phe Pro Asp Pro Gly Leu Arg Pro Gln Asn Leu
145 150 155 160
Tyr Thr Leu Trp Gly Gly Ser Val Val Cys Met Tyr Leu Tyr Gln Leu
165 170 175
Ser Pro Pro Ile Thr Trp Pro Leu Leu Pro His Val Ile Phe Cys His
180 185 190
Pro Gly Gln Leu Gly Ala Phe Leu Thr Asn Val Pro Tyr Lys Arg Ile
195 200 205
Glu Glu Leu Leu Tyr Lys Ile Ser Leu Thr Thr Gly Ala Leu Ile Ile
210 215 220
Leu Pro Glu Asp Cys Leu Pro Thr Thr Leu Phe Gln Pro Ala Arg Ala
225 230 235 240
Pro Val Thr Leu Thr Ala Trp Gln Asn Gly Leu Leu Pro Phe His Ser
245 250 255
Thr Leu Thr Thr Pro Gly Leu Ile Trp Thr Phe Thr Asp Gly Thr Pro
260 265 270
Met Ile Ser Gly Pro Cys Pro Lys Asp Gly Gln Pro Ser Leu Val Leu
275 280 285
Gln Ser Ser Ser Phe Ile Phe His Lys Phe Gln Thr Lys Ala Tyr His
290 295 300
Pro Ser Phe Leu Leu Ser His Gly Leu Ile Gln Tyr Ser Ser Phe His
305 310 315 320
Ser Leu His Leu Leu Phe Glu Glu Tyr Thr Asn Ile Pro Ile Ser Arg
325 330 335
Ser Phe Asn Glu Lys Glu Ala Asp Asp Asn Asp His Glu Pro Gln Ile
340 345 350
Ser Pro Gly Gly Leu Glu Pro Pro Ser Glu Lys His Phe Arg Glu Thr
355 360 365
Glu Val
370
<210> 14
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46的氨基酸序列
<400> 14
Met Gly Lys Phe Leu Ala Thr Leu Ile Leu Phe Phe Gln Phe Cys Pro
1 5 10 15
Leu Ile Phe Gly Asp Tyr Ser Pro Ser Cys Cys Thr Leu Thr Ile Gly
20 25 30
Val Ser Ser Tyr His Ser Lys Pro Cys Asn Pro Ala Gln Pro Val Cys
35 40 45
Ser Trp Thr Leu Asp Leu Leu Ala Leu Ser Ala Asp Gln Ala Leu Gln
50 55 60
Pro Pro Cys Pro Asn Leu Val Ser Tyr Ser Ser Tyr His Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Ser Leu Tyr Leu Phe Pro His Trp Thr Lys Lys Pro Asn Arg Asn Gly
85 90 95
Gly Gly Tyr Tyr Ser Ala Ser Tyr Ser Asp Pro Cys Ser Leu Lys Cys
100 105 110
Pro Tyr Leu Gly Cys Gln Ser Trp Thr Cys Pro Tyr Thr Gly Ala Val
115 120 125
Ser Ser Pro Tyr Trp Lys Phe Gln His Asp Val Asn Phe Thr Gln Glu
130 135 140
Val Ser Arg Leu Asn Ile Asn Leu His Phe Ser Lys Cys Gly Phe Pro
145 150 155 160
Phe Ser Leu Leu Val Asp Ala Pro Gly Tyr Asp Pro Ile Trp Phe Leu
165 170 175
Asn Thr Glu Pro Ser Gln Leu Pro Pro Thr Ala Pro Pro Leu Leu Pro
180 185 190
His Ser Asn Leu Asp His Ile Leu Glu Pro Ser Ile Pro Trp Lys Ser
195 200 205
Lys Leu Leu Thr Leu Val Gln Leu Thr Leu Gln Ser Thr Asn Tyr Thr
210 215 220
Cys Ile Val Cys Ile Asp Arg Ala Ser Leu Ser Thr Trp His Val Leu
225 230 235 240
Tyr Ser Pro Asn Val Ser Val Pro Ser Ser Ser Ser Thr Pro Leu Leu
245 250 255
Tyr Pro Ser Leu Ala Leu Pro Ala Pro His Leu Thr Leu Pro Phe Asn
260 265 270
Trp Thr His Cys Phe Asp Pro Gln Ile Gln Ala Ile Val Ser Ser Pro
275 280 285
Cys His Asn Ser Leu Ile Leu Pro Pro Phe Ser Leu Ser Pro Val Pro
290 295 300
Thr Leu Gly Ser Arg Ser Arg Arg
305 310
<210> 15
<211> 339
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib的氨基酸序列
<400> 15
Met Gly Lys Phe Leu Ala Thr Leu Ile Leu Phe Phe Gln Phe Cys Pro
1 5 10 15
Leu Ile Phe Gly Asp Tyr Ser Pro Ser Cys Cys Thr Leu Thr Ile Gly
20 25 30
Val Ser Ser Tyr His Ser Lys Pro Cys Asn Pro Ala Gln Pro Val Cys
35 40 45
Ser Trp Thr Leu Asp Leu Leu Ala Leu Ser Ala Asp Gln Ala Leu Gln
50 55 60
Pro Pro Cys Pro Asn Leu Val Ser Tyr Ser Ser Tyr His Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Ser Leu Tyr Leu Phe Pro His Trp Thr Lys Lys Pro Asn Arg Asn Gly
85 90 95
Gly Gly Tyr Tyr Ser Ala Ser Tyr Ser Asp Pro Cys Ser Leu Lys Cys
100 105 110
Pro Tyr Leu Gly Cys Gln Ser Trp Thr Cys Pro Tyr Thr Gly Ala Val
115 120 125
Ser Ser Pro Tyr Trp Lys Phe Gln His Asp Val Asn Phe Thr Gln Glu
130 135 140
Val Ser Arg Leu Asn Ile Asn Leu His Phe Ser Lys Cys Gly Phe Pro
145 150 155 160
Phe Ser Leu Leu Val Asp Ala Pro Gly Tyr Asp Pro Ile Trp Phe Leu
165 170 175
Asn Thr Glu Pro Ser Gln Leu Pro Pro Thr Ala Pro Pro Leu Leu Pro
180 185 190
His Ser Asn Leu Asp His Ile Leu Glu Pro Ser Ile Pro Trp Lys Ser
195 200 205
Lys Leu Leu Thr Leu Val Gln Leu Thr Leu Gln Ser Thr Asn Tyr Thr
210 215 220
Cys Ile Val Cys Ile Asp Arg Ala Ser Leu Ser Thr Trp His Val Leu
225 230 235 240
Tyr Ser Pro Asn Val Ser Val Pro Ser Ser Ser Ser Thr Pro Leu Leu
245 250 255
Tyr Pro Ser Leu Ala Leu Pro Ala Pro His Leu Thr Leu Pro Phe Asn
260 265 270
Trp Thr His Cys Phe Asp Pro Gln Ile Gln Ala Ile Val Ser Ser Pro
275 280 285
Cys His Asn Ser Leu Ile Leu Pro Pro Phe Ser Leu Ser Pro Val Pro
290 295 300
Thr Leu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg
305 310 315 320
Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser
325 330 335
Thr Phe Leu
<210> 16
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> dgp62的氨基酸序列
<400> 16
Met Gly Lys Phe Leu Ala Thr Leu Ile Leu Phe Phe Gln Phe Cys Pro
1 5 10 15
Leu Ile Phe Gly Asp Tyr Ser Pro Ser Cys Cys Thr Leu Thr Ile Gly
20 25 30
Val Ser Ser Tyr His Ser Lys Pro Cys Asn Pro Ala Gln Pro Val Cys
35 40 45
Ser Trp Thr Leu Asp Leu Leu Ala Leu Ser Ala Asp Gln Ala Leu Gln
50 55 60
Pro Pro Cys Pro Asn Leu Val Ser Tyr Ser Ser Tyr His Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Ser Leu Tyr Leu Phe Pro His Trp Thr Lys Lys Pro Asn Arg Asn Gly
85 90 95
Gly Gly Tyr Tyr Ser Ala Ser Tyr Ser Asp Pro Cys Ser Leu Lys Cys
100 105 110
Pro Tyr Leu Gly Cys Gln Ser Trp Thr Cys Pro Tyr Thr Gly Ala Val
115 120 125
Ser Ser Pro Tyr Trp Lys Phe Gln His Asp Val Asn Phe Thr Gln Glu
130 135 140
Val Ser Arg Leu Asn Ile Asn Leu His Phe Ser Lys Cys Gly Phe Pro
145 150 155 160
Phe Ser Leu Leu Val Asp Ala Pro Gly Tyr Asp Pro Ile Trp Phe Leu
165 170 175
Asn Thr Glu Pro Ser Gln Leu Pro Pro Thr Ala Pro Pro Leu Leu Pro
180 185 190
His Ser Asn Leu Asp His Ile Leu Glu Pro Ser Ile Pro Trp Lys Ser
195 200 205
Lys Leu Leu Thr Leu Val Gln Leu Thr Leu Gln Ser Thr Asn Tyr Thr
210 215 220
Cys Ile Val Cys Ile Asp Arg Ala Ser Leu Ser Thr Trp His Val Leu
225 230 235 240
Tyr Ser Pro Asn Val Ser Val Pro Ser Ser Ser Ser Thr Pro Leu Leu
245 250 255
Tyr Pro Ser Leu Ala Leu Pro Ala Pro His Leu Thr Leu Pro Phe Asn
260 265 270
Trp Thr His Cys Phe Asp Pro Gln Ile Gln Ala Ile Val Ser Ser Pro
275 280 285
Cys His Asn Ser Leu Ile Leu Pro Pro Phe Ser Leu Ser Pro Val Pro
290 295 300
Thr Leu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ala Val Pro Val Ala Val Trp Leu
305 310 315 320
Val Ser Ala Leu Ala Met Gly Ala Gly Val Ala Gly Gly Ile Thr Gly
325 330 335
Ser Met Ser Leu Ala Ser Gly Lys Ser Leu Leu His Glu Val Asp Lys
340 345 350
Asp Ile Ser Gln Leu Thr Gln Ala Ile Val Lys Asn His Lys Asn Leu
355 360 365
Leu Lys Ile Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu
370 375 380
Leu Phe Trp Glu Gln Gly Gly Leu Cys Lys Ala Leu Gln Glu Gln Cys
385 390 395 400
Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Ser His Val Pro Ile Leu Gln Glu Arg
405 410 415
Pro Pro Leu Glu Asn Arg Val Leu Thr Gly Trp Gly Leu Asn Trp Asp
420 425 430
Leu Gly Leu Ser Gln Trp Ala Arg Glu Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala
435 440 445
Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu
450 455 460
Leu Ser Thr Phe Leu
465
<210> 17
<211> 1241
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> SU gp46 mRNA
<400> 17
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc augggcaagu uccuggccac acugauccug uucuuccagu ucugcccccu 120
gaucuucggc gacuacagcc ccagcugcug cacccugaca aucggcguga gcagcuacca 180
cagcaagccc ugcaaccccg cccagcccgu gugcagcugg acccuggacc ugcuggcccu 240
gagcgccgac caggcccugc agccccccug ccccaaccug gugagcuaca gcagcuacca 300
cgccaccuac agccuguacc uguuccccca cuggaccaag aagcccaaca gaaacggcgg 360
aggcuacuac agcgccagcu acagcgaccc cugcagccug aagugccccu accugggcug 420
ccagagcugg acaugccccu acacaggcgc cgugagcagc cccuacugga aguuccagca 480
cgacgugaac uucacccaag aggugagccg gcugaacauc aaccugcacu ucagcaagug 540
cggcuuccca uucagccugc ugguggacgc ccccggcuac gaccccaucu gguuccugaa 600
caccgagccc agccagcugc ccccaacagc cccaccccug cugccccaca gcaaccugga 660
ccacauccug gaacccagca uccccuggaa gagcaagcug cugacacugg ugcagcugac 720
ccugcagagc accaacuaca ccugcaucgu gugcaucgac cgggccagcc ugagcacaug 780
gcacgugcug uacagcccca acgugagcgu gcccagcagc agcagcacac cccugcugua 840
ccccagccug gcacugcccg ccccccaccu gacacugccc uucaacugga cccacugcuu 900
cgacccccag auccaggcca ucgugagcag cccaugccac aacagccuga uccugccccc 960
auucagccug agccccgugc ccacacuggg cagcagaagc agaagaugag cucgcuuucu 1020
ugcuguccaa uuucuauuaa agguuccuuu guucccuaag uccaacuacu aaacuggggg 1080
auauuaugaa gggccuugag caucuggauu cugccuaaua aaaaacauuu auuuucauug 1140
caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1241
<210> 18
<211> 1322
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib mRNA
<400> 18
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc augggcaagu uccuggccac acugauccug uucuuccagu ucugcccccu 120
gaucuucggc gacuacagcc ccagcugcug cacccugaca aucggcguga gcagcuacca 180
cagcaagccc ugcaaccccg cccagcccgu gugcagcugg acccuggacc ugcuggcccu 240
gagcgccgac caggcccugc agccccccug ccccaaccug gugagcuaca gcagcuacca 300
cgccaccuac agccuguacc uguuccccca cuggaccaag aagcccaaca gaaacggcgg 360
aggcuacuac agcgccagcu acagcgaccc cugcagccug aagugccccu accugggcug 420
ccagagcugg acaugccccu acacaggcgc cgugagcagc cccuacugga aguuccagca 480
cgacgugaac uucacccaag aggugagccg gcugaacauc aaccugcacu ucagcaagug 540
cggcuuccca uucagccugc ugguggacgc ccccggcuac gaccccaucu gguuccugaa 600
caccgagccc agccagcugc ccccaacagc cccaccccug cugccccaca gcaaccugga 660
ccacauccug gaacccagca uccccuggaa gagcaagcug cugacacugg ugcagcugac 720
ccugcagagc accaacuaca ccugcaucgu gugcaucgac cgggccagcc ugagcacaug 780
gcacgugcug uacagcccca acgugagcgu gcccagcagc agcagcacac cccugcugua 840
ccccagccug gcacugcccg ccccccaccu gacacugccc uucaacugga cccacugcuu 900
cgacccccag auccaggcca ucgugagcag cccaugccac aacagccuga uccugccccc 960
auucagccug agccccgugc ccacacucgg cagcggcagc ggcagcggcu acauccccga 1020
ggcccccaga gacggccagg ccuacgucag aaaggacggc gaaugggugc ugcugagcac 1080
cuuccuguga gcucgcuuuc uugcugucca auuucuauua aagguuccuu uguucccuaa 1140
guccaacuac uaaacugggg gauauuauga agggccuuga gcaucuggau ucugccuaau 1200
aaaaaacauu uauuuucauu gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aa 1322
<210> 19
<211> 1712
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> dgp62-Fib mRNA
<400> 19
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc augggcaagu uccuggccac acugauccug uucuuccagu ucugcccccu 120
gaucuucggc gacuacagcc ccagcugcug cacccugaca aucggcguga gcagcuacca 180
cagcaagccc ugcaaccccg cccagcccgu gugcagcugg acccuggacc ugcuggcccu 240
gagcgccgac caggcccugc agccccccug ccccaaccug gugagcuaca gcagcuacca 300
cgccaccuac agccuguacc uguuccccca cuggaccaag aagcccaaca gaaacggcgg 360
aggcuacuac agcgccagcu acagcgaccc cugcagccug aagugccccu accugggcug 420
ccagagcugg acaugccccu acacaggcgc cgugagcagc cccuacugga aguuccagca 480
cgacgugaac uucacccaag aggugagccg gcugaacauc aaccugcacu ucagcaagug 540
cggcuuccca uucagccugc ugguggacgc ccccggcuac gaccccaucu gguuccugaa 600
caccgagccc agccagcugc ccccaacagc cccaccccug cugccccaca gcaaccugga 660
ccacauccug gaacccagca uccccuggaa gagcaagcug cugacacugg ugcagcugac 720
ccugcagagc accaacuaca ccugcaucgu gugcaucgac cgggccagcc ugagcacaug 780
gcacgugcug uacagcccca acgugagcgu gcccagcagc agcagcacac cccugcugua 840
ccccagccug gcacugcccg ccccccaccu gacacugccc uucaacugga cccacugcuu 900
cgacccccag auccaggcca ucgugagcag cccaugccac aacagccuga uccugccccc 960
auucagccug agccccgugc ccacacucgg cagcggaagc ggaagcgcag ugcccguggc 1020
cguguggcug gugagcgccc uggccauggg agccggcgug gcaggcggaa ucacaggcag 1080
caugagccug gccagcggca agagccugcu gcacgaggug gacaaggaca ucagccagcu 1140
gacccaggcc aucgugaaga accacaagaa ccugcugaag aucgcccagu acgccgccca 1200
gaacagaaga ggacuggacc ugcuguucug ggagcaaggc ggacugugca aagcccucca 1260
agagcagugc agauucccca acaucaccaa cagccacgug cccauccugc aagagcggcc 1320
cccacuggaa aacagagugc ugacaggaug gggccugaac ugggaccugg gacugagcca 1380
gugggccaga gaggccggcu acauccccga ggcccccaga gacggacagg ccuacgucag 1440
aaaggacggc gaaugggugc ugcugagcac cuuccuguga gcucgcuuuc uugcugucca 1500
auuucuauua aagguuccuu uguucccuaa guccaacuac uaaacugggg gauauuauga 1560
agggccuuga gcaucuggau ucugccuaau aaaaaacauu uauuuucauu gcaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1712
<210> 20
<211> 1415
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> sec Tax突变体mRNA
<400> 20
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auggacugga ccuggauccu guuccuggug gccgccgcca caagagugca 120
cagcgcacac uucccaggcu ucggccagag ccugcuguuc ggcuaccccg uguacguguu 180
cggcgacugc gugcaaggcg acuggugccc caucagcggc ggccugugca gcgccagacu 240
gcacagacac gcccugcugg ccacaugccc cgagcaccag aucaccuggg accccaucga 300
cggcagagug aucggaagcg cccugcaguu ccugaucccc agacugccca gcuuccccac 360
acagagaacc agcaagaccc ugaaggugcu gacccccccc aucacacaca ccacacccaa 420
caucccccca agcuuccugc aggccaugcg gaaguacagc cccuucagaa acggcuacau 480
ggaacccaca cugggccagc accugcccgc cagcagcuuc cccgaccccg gacugaggcc 540
ccagaaccug uacacacugu ggggcggcag cgucgugugc auguaccugu accagcugag 600
cccaccaauc acauggcccc ugcugcccca cgugaucuuc ugccaccccg gacagcuggg 660
cgccuuccug accaacgugc ccuacaagcg gaucgaggaa cugcuguaca agaucagccu 720
gaccacaggc gcccugauca uccugcccga ggacugccug cccaccacac uguuccagcc 780
cgccagagcc cccgugacac ugaccgccug gcagaacggc cugcugccau uccacagcac 840
ccugacaaca cccggccuga ucuggaccuu caccgacggc acacccauga ucagcggccc 900
cugccccaag gacggccagc ccagccuggu gcugcagagc agcagcuuca ucuuccacaa 960
guuccagacc aaggccuacc accccagcuu ccugcugagc cacggacuga uccaguacag 1020
cagcuuccac agccugcacc ugcuguucga agaguacaca aacaucccca ucagccggag 1080
cuucaacgag aaagaggccg acgacaacga ccacgagccc cagaucagcc ccggcggacu 1140
ggaacccccc agcgagaagc acuuccggga aaccgaagug ugagcucgcu uucuugcugu 1200
ccaauuucua uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug ggggauauua 1260
ugaagggccu ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc auugcaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1415
<210> 21
<211> 1349
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib polyA95的模板DNA的核苷酸序列
<400> 21
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgggc aagttcctgg ccacactgat 120
cctgttcttc cagttctgcc ccctgatctt cggcgactac agccccagct gctgcaccct 180
gacaatcggc gtgagcagct accacagcaa gccctgcaac cccgcccagc ccgtgtgcag 240
ctggaccctg gacctgctgg ccctgagcgc cgaccaggcc ctgcagcccc cctgccccaa 300
cctggtgagc tacagcagct accacgccac ctacagcctg tacctgttcc cccactggac 360
caagaagccc aacagaaacg gcggaggcta ctacagcgcc agctacagcg acccctgcag 420
cctgaagtgc ccctacctgg gctgccagag ctggacatgc ccctacacag gcgccgtgag 480
cagcccctac tggaagttcc agcacgacgt gaacttcacc caagaggtga gccggctgaa 540
catcaacctg cacttcagca agtgcggctt cccattcagc ctgctggtgg acgcccccgg 600
ctacgacccc atctggttcc tgaacaccga gcccagccag ctgcccccaa cagccccacc 660
cctgctgccc cacagcaacc tggaccacat cctggaaccc agcatcccct ggaagagcaa 720
gctgctgaca ctggtgcagc tgaccctgca gagcaccaac tacacctgca tcgtgtgcat 780
cgaccgggcc agcctgagca catggcacgt gctgtacagc cccaacgtga gcgtgcccag 840
cagcagcagc acacccctgc tgtaccccag cctggcactg cccgcccccc acctgacact 900
gcccttcaac tggacccact gcttcgaccc ccagatccag gccatcgtga gcagcccatg 960
ccacaacagc ctgatcctgc ccccattcag cctgagcccc gtgcccacac tcggcagcgg 1020
cagcggcagc ggctacatcc ccgaggcccc cagagacggc caggcctacg tcagaaagga 1080
cggcgaatgg gtgctgctga gcaccttcct gtgagctcgc tttcttgctg tccaatttct 1140
attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc 1200
ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa acgaagagc 1349
<210> 22
<211> 1334
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib polyA80的模板DNA的核苷酸序列
<400> 22
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgggc aagttcctgg ccacactgat 120
cctgttcttc cagttctgcc ccctgatctt cggcgactac agccccagct gctgcaccct 180
gacaatcggc gtgagcagct accacagcaa gccctgcaac cccgcccagc ccgtgtgcag 240
ctggaccctg gacctgctgg ccctgagcgc cgaccaggcc ctgcagcccc cctgccccaa 300
cctggtgagc tacagcagct accacgccac ctacagcctg tacctgttcc cccactggac 360
caagaagccc aacagaaacg gcggaggcta ctacagcgcc agctacagcg acccctgcag 420
cctgaagtgc ccctacctgg gctgccagag ctggacatgc ccctacacag gcgccgtgag 480
cagcccctac tggaagttcc agcacgacgt gaacttcacc caagaggtga gccggctgaa 540
catcaacctg cacttcagca agtgcggctt cccattcagc ctgctggtgg acgcccccgg 600
ctacgacccc atctggttcc tgaacaccga gcccagccag ctgcccccaa cagccccacc 660
cctgctgccc cacagcaacc tggaccacat cctggaaccc agcatcccct ggaagagcaa 720
gctgctgaca ctggtgcagc tgaccctgca gagcaccaac tacacctgca tcgtgtgcat 780
cgaccgggcc agcctgagca catggcacgt gctgtacagc cccaacgtga gcgtgcccag 840
cagcagcagc acacccctgc tgtaccccag cctggcactg cccgcccccc acctgacact 900
gcccttcaac tggacccact gcttcgaccc ccagatccag gccatcgtga gcagcccatg 960
ccacaacagc ctgatcctgc ccccattcag cctgagcccc gtgcccacac tcggcagcgg 1020
cagcggcagc ggctacatcc ccgaggcccc cagagacggc caggcctacg tcagaaagga 1080
cggcgaatgg gtgctgctga gcaccttcct gtgagctcgc tttcttgctg tccaatttct 1140
attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc 1200
ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaacgaa gagc 1334
<210> 23
<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib polyA60的模板DNA的核苷酸序列
<400> 23
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgggc aagttcctgg ccacactgat 120
cctgttcttc cagttctgcc ccctgatctt cggcgactac agccccagct gctgcaccct 180
gacaatcggc gtgagcagct accacagcaa gccctgcaac cccgcccagc ccgtgtgcag 240
ctggaccctg gacctgctgg ccctgagcgc cgaccaggcc ctgcagcccc cctgccccaa 300
cctggtgagc tacagcagct accacgccac ctacagcctg tacctgttcc cccactggac 360
caagaagccc aacagaaacg gcggaggcta ctacagcgcc agctacagcg acccctgcag 420
cctgaagtgc ccctacctgg gctgccagag ctggacatgc ccctacacag gcgccgtgag 480
cagcccctac tggaagttcc agcacgacgt gaacttcacc caagaggtga gccggctgaa 540
catcaacctg cacttcagca agtgcggctt cccattcagc ctgctggtgg acgcccccgg 600
ctacgacccc atctggttcc tgaacaccga gcccagccag ctgcccccaa cagccccacc 660
cctgctgccc cacagcaacc tggaccacat cctggaaccc agcatcccct ggaagagcaa 720
gctgctgaca ctggtgcagc tgaccctgca gagcaccaac tacacctgca tcgtgtgcat 780
cgaccgggcc agcctgagca catggcacgt gctgtacagc cccaacgtga gcgtgcccag 840
cagcagcagc acacccctgc tgtaccccag cctggcactg cccgcccccc acctgacact 900
gcccttcaac tggacccact gcttcgaccc ccagatccag gccatcgtga gcagcccatg 960
ccacaacagc ctgatcctgc ccccattcag cctgagcccc gtgcccacac tcggcagcgg 1020
cagcggcagc ggctacatcc ccgaggcccc cagagacggc caggcctacg tcagaaagga 1080
cggcgaatgg gtgctgctga gcaccttcct gtgagctcgc tttcttgctg tccaatttct 1140
attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc 1200
ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaacgaa gagc 1314
<210> 24
<211> 1294
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib polyA40的模板DNA的核苷酸序列
<400> 24
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgggc aagttcctgg ccacactgat 120
cctgttcttc cagttctgcc ccctgatctt cggcgactac agccccagct gctgcaccct 180
gacaatcggc gtgagcagct accacagcaa gccctgcaac cccgcccagc ccgtgtgcag 240
ctggaccctg gacctgctgg ccctgagcgc cgaccaggcc ctgcagcccc cctgccccaa 300
cctggtgagc tacagcagct accacgccac ctacagcctg tacctgttcc cccactggac 360
caagaagccc aacagaaacg gcggaggcta ctacagcgcc agctacagcg acccctgcag 420
cctgaagtgc ccctacctgg gctgccagag ctggacatgc ccctacacag gcgccgtgag 480
cagcccctac tggaagttcc agcacgacgt gaacttcacc caagaggtga gccggctgaa 540
catcaacctg cacttcagca agtgcggctt cccattcagc ctgctggtgg acgcccccgg 600
ctacgacccc atctggttcc tgaacaccga gcccagccag ctgcccccaa cagccccacc 660
cctgctgccc cacagcaacc tggaccacat cctggaaccc agcatcccct ggaagagcaa 720
gctgctgaca ctggtgcagc tgaccctgca gagcaccaac tacacctgca tcgtgtgcat 780
cgaccgggcc agcctgagca catggcacgt gctgtacagc cccaacgtga gcgtgcccag 840
cagcagcagc acacccctgc tgtaccccag cctggcactg cccgcccccc acctgacact 900
gcccttcaac tggacccact gcttcgaccc ccagatccag gccatcgtga gcagcccatg 960
ccacaacagc ctgatcctgc ccccattcag cctgagcccc gtgcccacac tcggcagcgg 1020
cagcggcagc ggctacatcc ccgaggcccc cagagacggc caggcctacg tcagaaagga 1080
cggcgaatgg gtgctgctga gcaccttcct gtgagctcgc tttcttgctg tccaatttct 1140
attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc 1200
ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaacgaa gagc 1294
<210> 25
<211> 1274
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib polyA20的模板DNA的核苷酸序列
<400> 25
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgggc aagttcctgg ccacactgat 120
cctgttcttc cagttctgcc ccctgatctt cggcgactac agccccagct gctgcaccct 180
gacaatcggc gtgagcagct accacagcaa gccctgcaac cccgcccagc ccgtgtgcag 240
ctggaccctg gacctgctgg ccctgagcgc cgaccaggcc ctgcagcccc cctgccccaa 300
cctggtgagc tacagcagct accacgccac ctacagcctg tacctgttcc cccactggac 360
caagaagccc aacagaaacg gcggaggcta ctacagcgcc agctacagcg acccctgcag 420
cctgaagtgc ccctacctgg gctgccagag ctggacatgc ccctacacag gcgccgtgag 480
cagcccctac tggaagttcc agcacgacgt gaacttcacc caagaggtga gccggctgaa 540
catcaacctg cacttcagca agtgcggctt cccattcagc ctgctggtgg acgcccccgg 600
ctacgacccc atctggttcc tgaacaccga gcccagccag ctgcccccaa cagccccacc 660
cctgctgccc cacagcaacc tggaccacat cctggaaccc agcatcccct ggaagagcaa 720
gctgctgaca ctggtgcagc tgaccctgca gagcaccaac tacacctgca tcgtgtgcat 780
cgaccgggcc agcctgagca catggcacgt gctgtacagc cccaacgtga gcgtgcccag 840
cagcagcagc acacccctgc tgtaccccag cctggcactg cccgcccccc acctgacact 900
gcccttcaac tggacccact gcttcgaccc ccagatccag gccatcgtga gcagcccatg 960
ccacaacagc ctgatcctgc ccccattcag cctgagcccc gtgcccacac tcggcagcgg 1020
cagcggcagc ggctacatcc ccgaggcccc cagagacggc caggcctacg tcagaaagga 1080
cggcgaatgg gtgctgctga gcaccttcct gtgagctcgc tttcttgctg tccaatttct 1140
attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc 1200
ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaacgaa gagc 1274
<210> 26
<211> 1442
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> sec Tax突变体polyA95的模板DNA的核苷酸序列
<400> 26
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatggac tggacctgga tcctgttcct 120
ggtggccgcc gccacaagag tgcacagcgc acacttccca ggcttcggcc agagcctgct 180
gttcggctac cccgtgtacg tgttcggcga ctgcgtgcaa ggcgactggt gccccatcag 240
cggcggcctg tgcagcgcca gactgcacag acacgccctg ctggccacat gccccgagca 300
ccagatcacc tgggacccca tcgacggcag agtgatcgga agcgccctgc agttcctgat 360
ccccagactg cccagcttcc ccacacagag aaccagcaag accctgaagg tgctgacccc 420
ccccatcaca cacaccacac ccaacatccc cccaagcttc ctgcaggcca tgcggaagta 480
cagccccttc agaaacggct acatggaacc cacactgggc cagcacctgc ccgccagcag 540
cttccccgac cccggactga ggccccagaa cctgtacaca ctgtggggcg gcagcgtcgt 600
gtgcatgtac ctgtaccagc tgagcccacc aatcacatgg cccctgctgc cccacgtgat 660
cttctgccac cccggacagc tgggcgcctt cctgaccaac gtgccctaca agcggatcga 720
ggaactgctg tacaagatca gcctgaccac aggcgccctg atcatcctgc ccgaggactg 780
cctgcccacc acactgttcc agcccgccag agcccccgtg acactgaccg cctggcagaa 840
cggcctgctg ccattccaca gcaccctgac aacacccggc ctgatctgga ccttcaccga 900
cggcacaccc atgatcagcg gcccctgccc caaggacggc cagcccagcc tggtgctgca 960
gagcagcagc ttcatcttcc acaagttcca gaccaaggcc taccacccca gcttcctgct 1020
gagccacgga ctgatccagt acagcagctt ccacagcctg cacctgctgt tcgaagagta 1080
cacaaacatc cccatcagcc ggagcttcaa cgagaaagag gccgacgaca acgaccacga 1140
gccccagatc agccccggcg gactggaacc ccccagcgag aagcacttcc gggaaaccga 1200
agtgtgagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc 1260
caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa 1320
aaacatttat tttcattgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacgaaga 1440
gc 1442
<210> 27
<211> 1427
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> sec Tax突变体polyA80的模板DNA的核苷酸序列
<400> 27
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatggac tggacctgga tcctgttcct 120
ggtggccgcc gccacaagag tgcacagcgc acacttccca ggcttcggcc agagcctgct 180
gttcggctac cccgtgtacg tgttcggcga ctgcgtgcaa ggcgactggt gccccatcag 240
cggcggcctg tgcagcgcca gactgcacag acacgccctg ctggccacat gccccgagca 300
ccagatcacc tgggacccca tcgacggcag agtgatcgga agcgccctgc agttcctgat 360
ccccagactg cccagcttcc ccacacagag aaccagcaag accctgaagg tgctgacccc 420
ccccatcaca cacaccacac ccaacatccc cccaagcttc ctgcaggcca tgcggaagta 480
cagccccttc agaaacggct acatggaacc cacactgggc cagcacctgc ccgccagcag 540
cttccccgac cccggactga ggccccagaa cctgtacaca ctgtggggcg gcagcgtcgt 600
gtgcatgtac ctgtaccagc tgagcccacc aatcacatgg cccctgctgc cccacgtgat 660
cttctgccac cccggacagc tgggcgcctt cctgaccaac gtgccctaca agcggatcga 720
ggaactgctg tacaagatca gcctgaccac aggcgccctg atcatcctgc ccgaggactg 780
cctgcccacc acactgttcc agcccgccag agcccccgtg acactgaccg cctggcagaa 840
cggcctgctg ccattccaca gcaccctgac aacacccggc ctgatctgga ccttcaccga 900
cggcacaccc atgatcagcg gcccctgccc caaggacggc cagcccagcc tggtgctgca 960
gagcagcagc ttcatcttcc acaagttcca gaccaaggcc taccacccca gcttcctgct 1020
gagccacgga ctgatccagt acagcagctt ccacagcctg cacctgctgt tcgaagagta 1080
cacaaacatc cccatcagcc ggagcttcaa cgagaaagag gccgacgaca acgaccacga 1140
gccccagatc agccccggcg gactggaacc ccccagcgag aagcacttcc gggaaaccga 1200
agtgtgagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc 1260
caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa 1320
aaacatttat tttcattgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac gaagagc 1427
<210> 28
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> sec Tax突变体polyA60的模板DNA的核苷酸序列
<400> 28
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatggac tggacctgga tcctgttcct 120
ggtggccgcc gccacaagag tgcacagcgc acacttccca ggcttcggcc agagcctgct 180
gttcggctac cccgtgtacg tgttcggcga ctgcgtgcaa ggcgactggt gccccatcag 240
cggcggcctg tgcagcgcca gactgcacag acacgccctg ctggccacat gccccgagca 300
ccagatcacc tgggacccca tcgacggcag agtgatcgga agcgccctgc agttcctgat 360
ccccagactg cccagcttcc ccacacagag aaccagcaag accctgaagg tgctgacccc 420
ccccatcaca cacaccacac ccaacatccc cccaagcttc ctgcaggcca tgcggaagta 480
cagccccttc agaaacggct acatggaacc cacactgggc cagcacctgc ccgccagcag 540
cttccccgac cccggactga ggccccagaa cctgtacaca ctgtggggcg gcagcgtcgt 600
gtgcatgtac ctgtaccagc tgagcccacc aatcacatgg cccctgctgc cccacgtgat 660
cttctgccac cccggacagc tgggcgcctt cctgaccaac gtgccctaca agcggatcga 720
ggaactgctg tacaagatca gcctgaccac aggcgccctg atcatcctgc ccgaggactg 780
cctgcccacc acactgttcc agcccgccag agcccccgtg acactgaccg cctggcagaa 840
cggcctgctg ccattccaca gcaccctgac aacacccggc ctgatctgga ccttcaccga 900
cggcacaccc atgatcagcg gcccctgccc caaggacggc cagcccagcc tggtgctgca 960
gagcagcagc ttcatcttcc acaagttcca gaccaaggcc taccacccca gcttcctgct 1020
gagccacgga ctgatccagt acagcagctt ccacagcctg cacctgctgt tcgaagagta 1080
cacaaacatc cccatcagcc ggagcttcaa cgagaaagag gccgacgaca acgaccacga 1140
gccccagatc agccccggcg gactggaacc ccccagcgag aagcacttcc gggaaaccga 1200
agtgtgagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc 1260
caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa 1320
aaacatttat tttcattgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaac gaagagc 1407
<210> 29
<211> 1387
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> sec Tax突变体polyA40的模板DNA的核苷酸序列
<400> 29
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatggac tggacctgga tcctgttcct 120
ggtggccgcc gccacaagag tgcacagcgc acacttccca ggcttcggcc agagcctgct 180
gttcggctac cccgtgtacg tgttcggcga ctgcgtgcaa ggcgactggt gccccatcag 240
cggcggcctg tgcagcgcca gactgcacag acacgccctg ctggccacat gccccgagca 300
ccagatcacc tgggacccca tcgacggcag agtgatcgga agcgccctgc agttcctgat 360
ccccagactg cccagcttcc ccacacagag aaccagcaag accctgaagg tgctgacccc 420
ccccatcaca cacaccacac ccaacatccc cccaagcttc ctgcaggcca tgcggaagta 480
cagccccttc agaaacggct acatggaacc cacactgggc cagcacctgc ccgccagcag 540
cttccccgac cccggactga ggccccagaa cctgtacaca ctgtggggcg gcagcgtcgt 600
gtgcatgtac ctgtaccagc tgagcccacc aatcacatgg cccctgctgc cccacgtgat 660
cttctgccac cccggacagc tgggcgcctt cctgaccaac gtgccctaca agcggatcga 720
ggaactgctg tacaagatca gcctgaccac aggcgccctg atcatcctgc ccgaggactg 780
cctgcccacc acactgttcc agcccgccag agcccccgtg acactgaccg cctggcagaa 840
cggcctgctg ccattccaca gcaccctgac aacacccggc ctgatctgga ccttcaccga 900
cggcacaccc atgatcagcg gcccctgccc caaggacggc cagcccagcc tggtgctgca 960
gagcagcagc ttcatcttcc acaagttcca gaccaaggcc taccacccca gcttcctgct 1020
gagccacgga ctgatccagt acagcagctt ccacagcctg cacctgctgt tcgaagagta 1080
cacaaacatc cccatcagcc ggagcttcaa cgagaaagag gccgacgaca acgaccacga 1140
gccccagatc agccccggcg gactggaacc ccccagcgag aagcacttcc gggaaaccga 1200
agtgtgagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc 1260
caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa 1320
aaacatttat tttcattgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac 1380
gaagagc 1387
<210> 30
<211> 1367
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> sec Tax突变体polyA20的模板DNA的核苷酸序列
<400> 30
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatggac tggacctgga tcctgttcct 120
ggtggccgcc gccacaagag tgcacagcgc acacttccca ggcttcggcc agagcctgct 180
gttcggctac cccgtgtacg tgttcggcga ctgcgtgcaa ggcgactggt gccccatcag 240
cggcggcctg tgcagcgcca gactgcacag acacgccctg ctggccacat gccccgagca 300
ccagatcacc tgggacccca tcgacggcag agtgatcgga agcgccctgc agttcctgat 360
ccccagactg cccagcttcc ccacacagag aaccagcaag accctgaagg tgctgacccc 420
ccccatcaca cacaccacac ccaacatccc cccaagcttc ctgcaggcca tgcggaagta 480
cagccccttc agaaacggct acatggaacc cacactgggc cagcacctgc ccgccagcag 540
cttccccgac cccggactga ggccccagaa cctgtacaca ctgtggggcg gcagcgtcgt 600
gtgcatgtac ctgtaccagc tgagcccacc aatcacatgg cccctgctgc cccacgtgat 660
cttctgccac cccggacagc tgggcgcctt cctgaccaac gtgccctaca agcggatcga 720
ggaactgctg tacaagatca gcctgaccac aggcgccctg atcatcctgc ccgaggactg 780
cctgcccacc acactgttcc agcccgccag agcccccgtg acactgaccg cctggcagaa 840
cggcctgctg ccattccaca gcaccctgac aacacccggc ctgatctgga ccttcaccga 900
cggcacaccc atgatcagcg gcccctgccc caaggacggc cagcccagcc tggtgctgca 960
gagcagcagc ttcatcttcc acaagttcca gaccaaggcc taccacccca gcttcctgct 1020
gagccacgga ctgatccagt acagcagctt ccacagcctg cacctgctgt tcgaagagta 1080
cacaaacatc cccatcagcc ggagcttcaa cgagaaagag gccgacgaca acgaccacga 1140
gccccagatc agccccggcg gactggaacc ccccagcgag aagcacttcc gggaaaccga 1200
agtgtgagct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc 1260
caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa 1320
aaacatttat tttcattgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaac gaagagc 1367
<210> 31
<211> 1317
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib polyA95的mRNA序列
<400> 31
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc augggcaagu uccuggccac acugauccug uucuuccagu ucugcccccu 120
gaucuucggc gacuacagcc ccagcugcug cacccugaca aucggcguga gcagcuacca 180
cagcaagccc ugcaaccccg cccagcccgu gugcagcugg acccuggacc ugcuggcccu 240
gagcgccgac caggcccugc agccccccug ccccaaccug gugagcuaca gcagcuacca 300
cgccaccuac agccuguacc uguuccccca cuggaccaag aagcccaaca gaaacggcgg 360
aggcuacuac agcgccagcu acagcgaccc cugcagccug aagugccccu accugggcug 420
ccagagcugg acaugccccu acacaggcgc cgugagcagc cccuacugga aguuccagca 480
cgacgugaac uucacccaag aggugagccg gcugaacauc aaccugcacu ucagcaagug 540
cggcuuccca uucagccugc ugguggacgc ccccggcuac gaccccaucu gguuccugaa 600
caccgagccc agccagcugc ccccaacagc cccaccccug cugccccaca gcaaccugga 660
ccacauccug gaacccagca uccccuggaa gagcaagcug cugacacugg ugcagcugac 720
ccugcagagc accaacuaca ccugcaucgu gugcaucgac cgggccagcc ugagcacaug 780
gcacgugcug uacagcccca acgugagcgu gcccagcagc agcagcacac cccugcugua 840
ccccagccug gcacugcccg ccccccaccu gacacugccc uucaacugga cccacugcuu 900
cgacccccag auccaggcca ucgugagcag cccaugccac aacagccuga uccugccccc 960
auucagccug agccccgugc ccacacucgg cagcggcagc ggcagcggcu acauccccga 1020
ggcccccaga gacggccagg ccuacgucag aaaggacggc gaaugggugc ugcugagcac 1080
cuuccuguga gcucgcuuuc uugcugucca auuucuauua aagguuccuu uguucccuaa 1140
guccaacuac uaaacugggg gauauuauga agggccuuga gcaucuggau ucugccuaau 1200
aaaaaacauu uauuuucauu gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1317
<210> 32
<211> 1302
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib polyA80的mRNA序列
<400> 32
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc augggcaagu uccuggccac acugauccug uucuuccagu ucugcccccu 120
gaucuucggc gacuacagcc ccagcugcug cacccugaca aucggcguga gcagcuacca 180
cagcaagccc ugcaaccccg cccagcccgu gugcagcugg acccuggacc ugcuggcccu 240
gagcgccgac caggcccugc agccccccug ccccaaccug gugagcuaca gcagcuacca 300
cgccaccuac agccuguacc uguuccccca cuggaccaag aagcccaaca gaaacggcgg 360
aggcuacuac agcgccagcu acagcgaccc cugcagccug aagugccccu accugggcug 420
ccagagcugg acaugccccu acacaggcgc cgugagcagc cccuacugga aguuccagca 480
cgacgugaac uucacccaag aggugagccg gcugaacauc aaccugcacu ucagcaagug 540
cggcuuccca uucagccugc ugguggacgc ccccggcuac gaccccaucu gguuccugaa 600
caccgagccc agccagcugc ccccaacagc cccaccccug cugccccaca gcaaccugga 660
ccacauccug gaacccagca uccccuggaa gagcaagcug cugacacugg ugcagcugac 720
ccugcagagc accaacuaca ccugcaucgu gugcaucgac cgggccagcc ugagcacaug 780
gcacgugcug uacagcccca acgugagcgu gcccagcagc agcagcacac cccugcugua 840
ccccagccug gcacugcccg ccccccaccu gacacugccc uucaacugga cccacugcuu 900
cgacccccag auccaggcca ucgugagcag cccaugccac aacagccuga uccugccccc 960
auucagccug agccccgugc ccacacucgg cagcggcagc ggcagcggcu acauccccga 1020
ggcccccaga gacggccagg ccuacgucag aaaggacggc gaaugggugc ugcugagcac 1080
cuuccuguga gcucgcuuuc uugcugucca auuucuauua aagguuccuu uguucccuaa 1140
guccaacuac uaaacugggg gauauuauga agggccuuga gcaucuggau ucugccuaau 1200
aaaaaacauu uauuuucauu gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1302
<210> 33
<211> 1282
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib polyA60的mRNA序列
<400> 33
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc augggcaagu uccuggccac acugauccug uucuuccagu ucugcccccu 120
gaucuucggc gacuacagcc ccagcugcug cacccugaca aucggcguga gcagcuacca 180
cagcaagccc ugcaaccccg cccagcccgu gugcagcugg acccuggacc ugcuggcccu 240
gagcgccgac caggcccugc agccccccug ccccaaccug gugagcuaca gcagcuacca 300
cgccaccuac agccuguacc uguuccccca cuggaccaag aagcccaaca gaaacggcgg 360
aggcuacuac agcgccagcu acagcgaccc cugcagccug aagugccccu accugggcug 420
ccagagcugg acaugccccu acacaggcgc cgugagcagc cccuacugga aguuccagca 480
cgacgugaac uucacccaag aggugagccg gcugaacauc aaccugcacu ucagcaagug 540
cggcuuccca uucagccugc ugguggacgc ccccggcuac gaccccaucu gguuccugaa 600
caccgagccc agccagcugc ccccaacagc cccaccccug cugccccaca gcaaccugga 660
ccacauccug gaacccagca uccccuggaa gagcaagcug cugacacugg ugcagcugac 720
ccugcagagc accaacuaca ccugcaucgu gugcaucgac cgggccagcc ugagcacaug 780
gcacgugcug uacagcccca acgugagcgu gcccagcagc agcagcacac cccugcugua 840
ccccagccug gcacugcccg ccccccaccu gacacugccc uucaacugga cccacugcuu 900
cgacccccag auccaggcca ucgugagcag cccaugccac aacagccuga uccugccccc 960
auucagccug agccccgugc ccacacucgg cagcggcagc ggcagcggcu acauccccga 1020
ggcccccaga gacggccagg ccuacgucag aaaggacggc gaaugggugc ugcugagcac 1080
cuuccuguga gcucgcuuuc uugcugucca auuucuauua aagguuccuu uguucccuaa 1140
guccaacuac uaaacugggg gauauuauga agggccuuga gcaucuggau ucugccuaau 1200
aaaaaacauu uauuuucauu gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1282
<210> 34
<211> 1262
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib polyA95的mRNA序列
<400> 34
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc augggcaagu uccuggccac acugauccug uucuuccagu ucugcccccu 120
gaucuucggc gacuacagcc ccagcugcug cacccugaca aucggcguga gcagcuacca 180
cagcaagccc ugcaaccccg cccagcccgu gugcagcugg acccuggacc ugcuggcccu 240
gagcgccgac caggcccugc agccccccug ccccaaccug gugagcuaca gcagcuacca 300
cgccaccuac agccuguacc uguuccccca cuggaccaag aagcccaaca gaaacggcgg 360
aggcuacuac agcgccagcu acagcgaccc cugcagccug aagugccccu accugggcug 420
ccagagcugg acaugccccu acacaggcgc cgugagcagc cccuacugga aguuccagca 480
cgacgugaac uucacccaag aggugagccg gcugaacauc aaccugcacu ucagcaagug 540
cggcuuccca uucagccugc ugguggacgc ccccggcuac gaccccaucu gguuccugaa 600
caccgagccc agccagcugc ccccaacagc cccaccccug cugccccaca gcaaccugga 660
ccacauccug gaacccagca uccccuggaa gagcaagcug cugacacugg ugcagcugac 720
ccugcagagc accaacuaca ccugcaucgu gugcaucgac cgggccagcc ugagcacaug 780
gcacgugcug uacagcccca acgugagcgu gcccagcagc agcagcacac cccugcugua 840
ccccagccug gcacugcccg ccccccaccu gacacugccc uucaacugga cccacugcuu 900
cgacccccag auccaggcca ucgugagcag cccaugccac aacagccuga uccugccccc 960
auucagccug agccccgugc ccacacucgg cagcggcagc ggcagcggcu acauccccga 1020
ggcccccaga gacggccagg ccuacgucag aaaggacggc gaaugggugc ugcugagcac 1080
cuuccuguga gcucgcuuuc uugcugucca auuucuauua aagguuccuu uguucccuaa 1140
guccaacuac uaaacugggg gauauuauga agggccuuga gcaucuggau ucugccuaau 1200
aaaaaacauu uauuuucauu gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aa 1262
<210> 35
<211> 1242
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> gp46-Fib polyA20的mRNA序列
<400> 35
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc augggcaagu uccuggccac acugauccug uucuuccagu ucugcccccu 120
gaucuucggc gacuacagcc ccagcugcug cacccugaca aucggcguga gcagcuacca 180
cagcaagccc ugcaaccccg cccagcccgu gugcagcugg acccuggacc ugcuggcccu 240
gagcgccgac caggcccugc agccccccug ccccaaccug gugagcuaca gcagcuacca 300
cgccaccuac agccuguacc uguuccccca cuggaccaag aagcccaaca gaaacggcgg 360
aggcuacuac agcgccagcu acagcgaccc cugcagccug aagugccccu accugggcug 420
ccagagcugg acaugccccu acacaggcgc cgugagcagc cccuacugga aguuccagca 480
cgacgugaac uucacccaag aggugagccg gcugaacauc aaccugcacu ucagcaagug 540
cggcuuccca uucagccugc ugguggacgc ccccggcuac gaccccaucu gguuccugaa 600
caccgagccc agccagcugc ccccaacagc cccaccccug cugccccaca gcaaccugga 660
ccacauccug gaacccagca uccccuggaa gagcaagcug cugacacugg ugcagcugac 720
ccugcagagc accaacuaca ccugcaucgu gugcaucgac cgggccagcc ugagcacaug 780
gcacgugcug uacagcccca acgugagcgu gcccagcagc agcagcacac cccugcugua 840
ccccagccug gcacugcccg ccccccaccu gacacugccc uucaacugga cccacugcuu 900
cgacccccag auccaggcca ucgugagcag cccaugccac aacagccuga uccugccccc 960
auucagccug agccccgugc ccacacucgg cagcggcagc ggcagcggcu acauccccga 1020
ggcccccaga gacggccagg ccuacgucag aaaggacggc gaaugggugc ugcugagcac 1080
cuuccuguga gcucgcuuuc uugcugucca auuucuauua aagguuccuu uguucccuaa 1140
guccaacuac uaaacugggg gauauuauga agggccuuga gcaucuggau ucugccuaau 1200
aaaaaacauu uauuuucauu gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1242
<210> 36
<211> 1410
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> sec Tax突变体polyA95的mRNA序列
<400> 36
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auggacugga ccuggauccu guuccuggug gccgccgcca caagagugca 120
cagcgcacac uucccaggcu ucggccagag ccugcuguuc ggcuaccccg uguacguguu 180
cggcgacugc gugcaaggcg acuggugccc caucagcggc ggccugugca gcgccagacu 240
gcacagacac gcccugcugg ccacaugccc cgagcaccag aucaccuggg accccaucga 300
cggcagagug aucggaagcg cccugcaguu ccugaucccc agacugccca gcuuccccac 360
acagagaacc agcaagaccc ugaaggugcu gacccccccc aucacacaca ccacacccaa 420
caucccccca agcuuccugc aggccaugcg gaaguacagc cccuucagaa acggcuacau 480
ggaacccaca cugggccagc accugcccgc cagcagcuuc cccgaccccg gacugaggcc 540
ccagaaccug uacacacugu ggggcggcag cgucgugugc auguaccugu accagcugag 600
cccaccaauc acauggcccc ugcugcccca cgugaucuuc ugccaccccg gacagcuggg 660
cgccuuccug accaacgugc ccuacaagcg gaucgaggaa cugcuguaca agaucagccu 720
gaccacaggc gcccugauca uccugcccga ggacugccug cccaccacac uguuccagcc 780
cgccagagcc cccgugacac ugaccgccug gcagaacggc cugcugccau uccacagcac 840
ccugacaaca cccggccuga ucuggaccuu caccgacggc acacccauga ucagcggccc 900
cugccccaag gacggccagc ccagccuggu gcugcagagc agcagcuuca ucuuccacaa 960
guuccagacc aaggccuacc accccagcuu ccugcugagc cacggacuga uccaguacag 1020
cagcuuccac agccugcacc ugcuguucga agaguacaca aacaucccca ucagccggag 1080
cuucaacgag aaagaggccg acgacaacga ccacgagccc cagaucagcc ccggcggacu 1140
ggaacccccc agcgagaagc acuuccggga aaccgaagug ugagcucgcu uucuugcugu 1200
ccaauuucua uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug ggggauauua 1260
ugaagggccu ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc auugcaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1410
<210> 37
<211> 1395
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> sec Tax突变体polyA80的mRNA序列
<400> 37
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auggacugga ccuggauccu guuccuggug gccgccgcca caagagugca 120
cagcgcacac uucccaggcu ucggccagag ccugcuguuc ggcuaccccg uguacguguu 180
cggcgacugc gugcaaggcg acuggugccc caucagcggc ggccugugca gcgccagacu 240
gcacagacac gcccugcugg ccacaugccc cgagcaccag aucaccuggg accccaucga 300
cggcagagug aucggaagcg cccugcaguu ccugaucccc agacugccca gcuuccccac 360
acagagaacc agcaagaccc ugaaggugcu gacccccccc aucacacaca ccacacccaa 420
caucccccca agcuuccugc aggccaugcg gaaguacagc cccuucagaa acggcuacau 480
ggaacccaca cugggccagc accugcccgc cagcagcuuc cccgaccccg gacugaggcc 540
ccagaaccug uacacacugu ggggcggcag cgucgugugc auguaccugu accagcugag 600
cccaccaauc acauggcccc ugcugcccca cgugaucuuc ugccaccccg gacagcuggg 660
cgccuuccug accaacgugc ccuacaagcg gaucgaggaa cugcuguaca agaucagccu 720
gaccacaggc gcccugauca uccugcccga ggacugccug cccaccacac uguuccagcc 780
cgccagagcc cccgugacac ugaccgccug gcagaacggc cugcugccau uccacagcac 840
ccugacaaca cccggccuga ucuggaccuu caccgacggc acacccauga ucagcggccc 900
cugccccaag gacggccagc ccagccuggu gcugcagagc agcagcuuca ucuuccacaa 960
guuccagacc aaggccuacc accccagcuu ccugcugagc cacggacuga uccaguacag 1020
cagcuuccac agccugcacc ugcuguucga agaguacaca aacaucccca ucagccggag 1080
cuucaacgag aaagaggccg acgacaacga ccacgagccc cagaucagcc ccggcggacu 1140
ggaacccccc agcgagaagc acuuccggga aaccgaagug ugagcucgcu uucuugcugu 1200
ccaauuucua uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug ggggauauua 1260
ugaagggccu ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc auugcaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaa 1395
<210> 38
<211> 1375
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> sec Tax突变体polyA60的mRNA序列
<400> 38
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auggacugga ccuggauccu guuccuggug gccgccgcca caagagugca 120
cagcgcacac uucccaggcu ucggccagag ccugcuguuc ggcuaccccg uguacguguu 180
cggcgacugc gugcaaggcg acuggugccc caucagcggc ggccugugca gcgccagacu 240
gcacagacac gcccugcugg ccacaugccc cgagcaccag aucaccuggg accccaucga 300
cggcagagug aucggaagcg cccugcaguu ccugaucccc agacugccca gcuuccccac 360
acagagaacc agcaagaccc ugaaggugcu gacccccccc aucacacaca ccacacccaa 420
caucccccca agcuuccugc aggccaugcg gaaguacagc cccuucagaa acggcuacau 480
ggaacccaca cugggccagc accugcccgc cagcagcuuc cccgaccccg gacugaggcc 540
ccagaaccug uacacacugu ggggcggcag cgucgugugc auguaccugu accagcugag 600
cccaccaauc acauggcccc ugcugcccca cgugaucuuc ugccaccccg gacagcuggg 660
cgccuuccug accaacgugc ccuacaagcg gaucgaggaa cugcuguaca agaucagccu 720
gaccacaggc gcccugauca uccugcccga ggacugccug cccaccacac uguuccagcc 780
cgccagagcc cccgugacac ugaccgccug gcagaacggc cugcugccau uccacagcac 840
ccugacaaca cccggccuga ucuggaccuu caccgacggc acacccauga ucagcggccc 900
cugccccaag gacggccagc ccagccuggu gcugcagagc agcagcuuca ucuuccacaa 960
guuccagacc aaggccuacc accccagcuu ccugcugagc cacggacuga uccaguacag 1020
cagcuuccac agccugcacc ugcuguucga agaguacaca aacaucccca ucagccggag 1080
cuucaacgag aaagaggccg acgacaacga ccacgagccc cagaucagcc ccggcggacu 1140
ggaacccccc agcgagaagc acuuccggga aaccgaagug ugagcucgcu uucuugcugu 1200
ccaauuucua uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug ggggauauua 1260
ugaagggccu ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc auugcaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1375
<210> 39
<211> 1355
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> sec Tax突变体polyA40的mRNA序列
<400> 39
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auggacugga ccuggauccu guuccuggug gccgccgcca caagagugca 120
cagcgcacac uucccaggcu ucggccagag ccugcuguuc ggcuaccccg uguacguguu 180
cggcgacugc gugcaaggcg acuggugccc caucagcggc ggccugugca gcgccagacu 240
gcacagacac gcccugcugg ccacaugccc cgagcaccag aucaccuggg accccaucga 300
cggcagagug aucggaagcg cccugcaguu ccugaucccc agacugccca gcuuccccac 360
acagagaacc agcaagaccc ugaaggugcu gacccccccc aucacacaca ccacacccaa 420
caucccccca agcuuccugc aggccaugcg gaaguacagc cccuucagaa acggcuacau 480
ggaacccaca cugggccagc accugcccgc cagcagcuuc cccgaccccg gacugaggcc 540
ccagaaccug uacacacugu ggggcggcag cgucgugugc auguaccugu accagcugag 600
cccaccaauc acauggcccc ugcugcccca cgugaucuuc ugccaccccg gacagcuggg 660
cgccuuccug accaacgugc ccuacaagcg gaucgaggaa cugcuguaca agaucagccu 720
gaccacaggc gcccugauca uccugcccga ggacugccug cccaccacac uguuccagcc 780
cgccagagcc cccgugacac ugaccgccug gcagaacggc cugcugccau uccacagcac 840
ccugacaaca cccggccuga ucuggaccuu caccgacggc acacccauga ucagcggccc 900
cugccccaag gacggccagc ccagccuggu gcugcagagc agcagcuuca ucuuccacaa 960
guuccagacc aaggccuacc accccagcuu ccugcugagc cacggacuga uccaguacag 1020
cagcuuccac agccugcacc ugcuguucga agaguacaca aacaucccca ucagccggag 1080
cuucaacgag aaagaggccg acgacaacga ccacgagccc cagaucagcc ccggcggacu 1140
ggaacccccc agcgagaagc acuuccggga aaccgaagug ugagcucgcu uucuugcugu 1200
ccaauuucua uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug ggggauauua 1260
ugaagggccu ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc auugcaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1355
<210> 40
<211> 1335
<212> RNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> sec Tax突变体polyA20的mRNA序列
<400> 40
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auggacugga ccuggauccu guuccuggug gccgccgcca caagagugca 120
cagcgcacac uucccaggcu ucggccagag ccugcuguuc ggcuaccccg uguacguguu 180
cggcgacugc gugcaaggcg acuggugccc caucagcggc ggccugugca gcgccagacu 240
gcacagacac gcccugcugg ccacaugccc cgagcaccag aucaccuggg accccaucga 300
cggcagagug aucggaagcg cccugcaguu ccugaucccc agacugccca gcuuccccac 360
acagagaacc agcaagaccc ugaaggugcu gacccccccc aucacacaca ccacacccaa 420
caucccccca agcuuccugc aggccaugcg gaaguacagc cccuucagaa acggcuacau 480
ggaacccaca cugggccagc accugcccgc cagcagcuuc cccgaccccg gacugaggcc 540
ccagaaccug uacacacugu ggggcggcag cgucgugugc auguaccugu accagcugag 600
cccaccaauc acauggcccc ugcugcccca cgugaucuuc ugccaccccg gacagcuggg 660
cgccuuccug accaacgugc ccuacaagcg gaucgaggaa cugcuguaca agaucagccu 720
gaccacaggc gcccugauca uccugcccga ggacugccug cccaccacac uguuccagcc 780
cgccagagcc cccgugacac ugaccgccug gcagaacggc cugcugccau uccacagcac 840
ccugacaaca cccggccuga ucuggaccuu caccgacggc acacccauga ucagcggccc 900
cugccccaag gacggccagc ccagccuggu gcugcagagc agcagcuuca ucuuccacaa 960
guuccagacc aaggccuacc accccagcuu ccugcugagc cacggacuga uccaguacag 1020
cagcuuccac agccugcacc ugcuguucga agaguacaca aacaucccca ucagccggag 1080
cuucaacgag aaagaggccg acgacaacga ccacgagccc cagaucagcc ccggcggacu 1140
ggaacccccc agcgagaagc acuuccggga aaccgaagug ugagcucgcu uucuugcugu 1200
ccaauuucua uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug ggggauauua 1260
ugaagggccu ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc auugcaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaa 1335

Claims (57)

1.一种脂质颗粒，其包封能够表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原的核酸，其中，脂质包括由通式(Ia)表示的阳离子性脂质或其药学上可接受的盐：
[化1]
式中，
R1和R2独立地表示C1-C3烷基；
L1表示可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C17-C19烯基；
L2表示可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烷基，或者可以具有1个或更多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烯基；
p为3或4。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的R1和R2共同为甲基。
3.根据权利要求1或2所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的p为3。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的L1为可以具有1个或更多个乙酰氧基的C17-C19烯基。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的L2为可以具有1个或更多个乙酰氧基的C10-C12烷基，或者可以具有1个或更多个乙酰氧基的C10-C19烯基。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的L2为可以具有1个或更多个乙酰氧基的C10-C12烷基，或者可以具有1个或更多个乙酰氧基的C17-C19烯基。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的L1为(R)-11-乙酰氧基-顺式-8-十七烯基、顺式-8-十七烯基，或(8Z,11Z)-十七碳二烯基。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的颗粒，其中，通式(Ia)中的L2为癸基、顺式-7-癸烯基、十二烷基，或(R)-11-乙酰氧基-顺式-8-十七烯基。
9.根据权利要求1所述的颗粒，其中，阳离子性脂质由以下结构式表示：
[化2]
10.根据权利要求1所述的颗粒，其中，阳离子性脂质由以下结构式表示：
[化3]
11.根据权利要求1所述的颗粒，其中，阳离子性脂质由以下结构式表示：
[化4]
12.根据权利要求9或10所述的颗粒，其中，脂质还包括两亲性脂质、固醇类和PEG脂质。
13.根据权利要求11所述的颗粒，其中，脂质还包括两亲性脂质、固醇类和PEG脂质。
14.根据权利要求12所述的颗粒，其中，两亲性脂质为选自于由以下物质组成的组的至少一种：二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱，以及二油酰磷脂酰乙醇胺。
15.根据权利要求13所述的颗粒，其中，两亲性脂质为选自于由以下物质组成的组的至少一种：二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱，以及二油酰磷脂酰乙醇胺。
16.根据权利要求12或14所述的颗粒，其中，固醇类为胆固醇。
17.根据权利要求13或15所述的颗粒，其中，固醇类为胆固醇。
18.根据权利要求12、14和16中任一项所述的颗粒，其中，PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇和/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺。
19.根据权利要求13、15和17中任一项所述的颗粒，其中，PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇和/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺。
20.根据权利要求12～19中任一项所述的颗粒，其中，关于两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质和PEG脂质的脂质组成，按照摩尔量计算，两亲性脂质为5％～25％，固醇类为10％～55％，阳离子性脂质为40％～65％，PEG脂质为1％～5％。
21.根据权利要求20所述的颗粒，其中，两亲性脂质为10％～25％。
22.根据权利要求12、14、16和18中任一项所述的颗粒，其中，关于两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质和PEG脂质的脂质组成，按照摩尔量计算，两亲性脂质为5％～15％，固醇类为35％～50％，阳离子性脂质为40％～55％，PEG脂质为1％～3％。
23.根据权利要求22所述的颗粒，其中，两亲性脂质为10％～15％，固醇类为35％～45％，阳离子性脂质为40％～50％，PEG脂质为1％～2.5％。
24.根据权利要求23所述的颗粒，其中，PEG脂质为1％～2％。
25.根据权利要求13、15、17和19中任一项所述的颗粒，其中，关于两亲性脂质、固醇类、阳离子性脂质和PEG脂质的脂质组成，按照摩尔量计算，两亲性脂质为10％～25％，固醇类为10％～50％，阳离子性脂质为40％～65％，PEG脂质为1％～3％。
26.根据权利要求25所述的颗粒，其中，固醇类为10％～45％，阳离子性脂质为42.5％～65％，PEG脂质为1％～2.5％。
27.根据权利要求26所述的颗粒，其中，PEG脂质为1％～2％。
28.根据权利要求20～27中任一项所述的颗粒，其中，总脂质重量相对于核酸重量的比率为15～30。
29.根据权利要求28所述的颗粒，其中，总脂质重量相对于核酸重量的比率为15～25。
30.根据权利要求29所述的颗粒，其中，总脂质重量相对于核酸重量的比率为17.5～22.5。
31.根据权利要求1～30中任一项所述的颗粒，其中，人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原为与寡聚化结构域的融合蛋白。
32.根据权利要求31所述的颗粒，其中，寡聚化结构域为fibritin。
33.根据权利要求31或32所述的颗粒，其中，人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原由与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列构成。
34.根据权利要求1～33中任一项所述的颗粒，其中，人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原相对于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有选自于由T130A、L131S、L319R和L320S组成的组中的至少一种突变，并由对该突变氨基酸以外的氨基酸序列进行对比时，与SEQID NO:11的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列构成。
35.根据权利要求34所述的颗粒，其中，人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原相对于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有T130A、L131S、L319R和L320S突变，并由对该突变氨基酸以外的氨基酸序列进行对比时，与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列构成。
36.根据权利要求1～35中任一项所述的颗粒，其中，人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原为与信号肽的融合蛋白。
37.根据权利要求36所述的颗粒，其信号肽为由SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第1位～第18位的氨基酸序列构成的肽。
38.根据权利要求31～37中任一项所述的颗粒，其中，能够表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原的核酸为包含帽子结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、gp46抗原或Tax抗原的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾部(polyA)的mRNA。
39.根据权利要求38所述的颗粒，其中，能够表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原的核酸的序列由与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的序列具有至少90％一致性的核苷酸序列构成。
40.根据权利要求38所述的颗粒，其中，能够表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原的核酸的序列由与SEQ ID NO:20的序列具有至少90％一致性的核苷酸序列构成。
41.根据权利要求1～40中任一项所述的颗粒，其中，核酸包含至少1个修饰核苷酸。
42.根据权利要求41所述的颗粒，其中，修饰核苷酸包含第5位取代的嘧啶核苷酸和/或第1位可以取代的假尿嘧啶核苷中的至少1个。
43.根据权利要求41所述的颗粒，其中，修饰核苷酸包含选自于由以下物质组成的组的至少1个：5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿嘧啶核苷，以及1-烷基假尿嘧啶核苷。
44.根据权利要求41所述的颗粒，其中，修饰核苷酸包含选自于由以下物质组成的组的至少1个：5-甲基胞苷、5-甲基尿苷，以及1-甲基假尿嘧啶核苷。
45.根据权利要求1～44中任一项所述的颗粒，其平均粒径为30～300nm。
46.权利要求1～45中任一项所述的颗粒在制造用于预防和/或治疗由人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)引起的感染的组合物中的用途。
47.一种组合物，其含有权利要求1～45中任一项所述的颗粒。
48.根据权利要求47所示的组合物，其用于在体内或体外表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原。
49.根据权利要求47或48所述的组合物，其用作药物。
50.根据权利要求49所述的组合物，其用于诱导针对人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的免疫反应。
51.根据权利要求49或50所述的组合物，其用于预防和/或治疗人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染。
52.根据权利要求49或50所述的组合物，其用于预防和/或治疗选自于由以下疾病组成的组的由HTLV-1引发的疾病的发病：成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相关性脊髓病(HAM)，以及HTLV-1葡萄膜炎(HU)。
53.在体外表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原的方法，包括：将权利要求47～50中任一项所述的组合物导入到细胞中。
54.在体内表达人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原的方法，包括：对哺乳动物施用权利要求47～51中任一项所述的组合物。
55.针对人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的免疫反应的诱导方法，包括：对哺乳动物施用权利要求49或50所述的组合物。
56.人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染的预防和/或治疗方法，包括：对哺乳动物施用权利要求49～52中任一项所述的组合物。
57.由HTLV-1引发的疾病的发病的预防和/或治疗方法，所述疾病选自于由以下疾病组成的组：成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相关性脊髓病(HAM)，以及HTLV-1葡萄膜炎(HU)；所述方法包括：对哺乳动物施用权利要求49～52中任一项所述的组合物。
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