CN115605221A - 核酸脂质粒子疫苗 - Google Patents

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冈竜也
户塚幸
城内直
小野寺宜乡
武下文彦
铃木贵
丹羽贵子
小泉诚
中村健介
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Abstract

本文提供用于预防和/或治疗新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS‑CoV‑2)引起的感染的疫苗。脂质粒子，其包封了能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS‑CoV‑2)的S蛋白和/或其片段的核酸，其中脂质包含由通式(Ia)表示的阳离子脂质、或其药学上容许的盐。式中，R1和R2独立地表示C1‑C3烷基；L1表示任选具有1个或多个C2‑C4烷酰氧基的C17‑C19烯基；L2表示任选具有1个或多个C2‑C4烷酰氧基的C10‑C19烷基、或任选具有1个或多个C2‑C4烷酰氧基的C10‑C19烯基；p是3或4。
Figure DDA0003943873560000011

Description

核酸脂质粒子疫苗
技术领域
本发明涉及包封了SARS-CoV-2 mRNA的核酸脂质粒子疫苗。
背景技术
新型冠状病毒传染病(冠状病毒病2019：COVID-19)是起因于新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的传染病，呈现以呼吸器官的急性炎症为主的病理状态，尤其是在高危人群中以侵袭性肺炎和急性呼吸窘迫综合征等下呼吸道的炎症为主的病理状态成为疾病负担(非专利文献1)。已知6种以上感染人主要呈现呼吸器官症状的冠状病毒(CoV)。SARS-CoV-2分类为β冠状病毒属，在病毒学上与过去曾引起暴发的SARS-CoV和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)类似。
表达于SARS-CoV-2的病毒粒子表面的刺突蛋白(spike protein，S)在初期感染机制中起重要作用。S以由两个亚基S1和S2构成的I型膜蛋白形成3聚体(约500kDa、约20nm)。S1中存在的受体结合结构域(receptor-binding domain，RBD)与宿主细胞表面表达的血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)相互作用。据提示，与SARS-CoV的S比较，SARS-CoV-2的S对ACE2的亲和性是10-20倍高并且热力学稳定性高，提示其涉及SARS-CoV-2的高传播性(非专利文献2、3)。
在SARS患者的恢复期血清中，对RBD的IgG持续存在至少3年以上，用RBD蛋白处理血清、吸附抗RBD抗体后，由于中和活性减低至50％以下，提示抗RBD抗体承担主要中和活性(非专利文献4、5)。实际上，报告了分离的抗SARS-CoV-2 RBD单克隆抗体对SARS-CoV-2具有中和活性(非专利文献6、7)。
根据应用成为无症状后经3周左右的COVID-19患者恢复期外周血的分析，在SARS-CoV-2的感染防御中，特异性CD4+和CD8+ T细胞的诱导被认为是重要的(非专利文献8)。具体地，分析10-20例COVID-19患者血液样本的结果是，在全部病例中，确认了血中抗SARS-CoV-2 RBD抗体应答和SARS-CoV-2特异性CD4+ T细胞应答，在约70％的病例中，确认了SARS-CoV-2特异性CD8+ T细胞应答。此外，由于血中抗SARS-CoV-2 RBD IgG效价与S特异性CD4+ T细胞频率相关(R＝0.8109)，提示S中存在T细胞表位，S特异性CD4+ T细胞在抗体应答的诱导中可发挥重要作用(非专利文献8)。进一步，显示血中抗SARS-CoV-2中和活性与血中抗SARS-CoV-2 S IgG效价相关(R＝0.9279)(非专利文献9)。
作为COVID-19症状重症化的“免疫增强”机制，假设涉及细胞免疫病理学和抗体依赖性增强(ADE)的可能性(非专利文献10)。在SARS的情形中，与轻症恢复的患者比较，提示致死患者的血中细胞因子谱成为T辅助(Th)2型优势(非专利文献11)。在小鼠SARS-CoV感染模型中，提示对S的Th2优势的免疫应答诱发了伴随以嗜酸性粒细胞为主体的炎症应答的肺的免疫病理学(非专利文献12)。另一方面，关于ADE，关于登革热病毒、呼吸器合胞病毒等其它病毒进行了报告，但在SARS患者中，尚无对SARS-CoV的特异性抗体诱发ADE的报告。关于对SARS-CoV的疫苗抗原候选物，报告了提示即使不是S全长的仅RBD的抗原、也可以避免肺损伤风险的可能性的数据(非专利文献13)。关于SARS-CoV-2，也没有对于S的抗体涉及ADE的直接临床证据，指出为了避免风险，需要诱导适当的细胞免疫应答(非专利文献14)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Viruses 12：372 2020
非专利文献2：Science 367：1260 2020
非专利文献3：Viruses 12：428 2020
非专利文献4：Virol J 7：299 2010
非专利文献5：Virology 334：74 2005
非专利文献6：Nat Commun 11：2251 2020
非专利文献7：Nature 583：290 2020
非专利文献8：Cell 181：1 2020
非专利文献9：Nat Med 26：1033 2020
非专利文献10：Nat Rev Immunol 20：347 2020
非专利文献11：J Immunol 181：5490 2008
非专利文献12：PLoS One 7：e35421 2012
非专利文献13：Vaccine 25：2832 2007
非专利文献14：PNAS 117：8218 2020
发明概述
发明要解决的课题
本发明的目的是提供用于预防和/或治疗新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)引起的感染的疫苗。
用于解决课题的手段
本发明人向小鼠施用包封了编码SARS-CoV-2的RBD的mRNA的脂质粒子时，观察到血中SARS-CoV-2 S蛋白IgG的诱导，此外发现该免疫应答成为Th1型优势，从而完成本发明。
本发明的主旨如下。
(1)脂质粒子，其包封了能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白和/或其片段的核酸，该脂质包含由通式(Ia)表示的阳离子脂质、或其药学上容许的盐，
[化学式1]
Figure BDA0003943873540000031
式中，
R1和R2独立地表示C1-C3烷基；
L1表示任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C17-C19烯基；
L2表示任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烷基、或任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烯基；
p是3或4。
(2)(1)中记载的粒子，其中，通式(Ia)中的R1和R2都是甲基。
(3)(1)或(2)中记载的粒子，其中，通式(Ia)中的p是3。
(4)(1)～(3)的任一项中记载的粒子，其中，通式(Ia)中的L1是任选具有1个或多个乙酰氧基的C17-C19烯基。
(5)(1)～(4)的任一项中记载的粒子，其中，通式(Ia)中的L2是任选具有1个或多个乙酰氧基的C10-C12烷基、或任选具有1个或多个乙酰氧基的C10-C19烯基。
(6)(1)～(4)的任一项中记载的粒子，其中，通式(Ia)中的L2是任选具有1个或多个乙酰氧基的C10-C12烷基、或任选具有1个或多个乙酰氧基的C17-C19烯基。
(7)(1)～(6)的任一项中记载的粒子，其中，通式(Ia)中的L1是(R)-11-乙酰基氧基-顺式-8-十七碳烯基、顺式-8-十七碳烯基、或(8Z，11Z)-十七碳二烯基。
(8)(1)～(7)的任一项中记载的粒子，其中，通式(Ia)中的L2是癸基、顺式-7-癸烯基、十二烷基、或(R)-11-乙酰基氧基-顺式-8-十七碳烯基。
(9)(1)中记载的粒子，其中，阳离子脂质由下述的结构式表示：
[化学式2]
Figure BDA0003943873540000041
(10)(1)中记载的粒子，其中，阳离子脂质由下述的结构式表示：
[化学式3]
Figure BDA0003943873540000042
(11)(1)中记载的粒子，其中，阳离子脂质由下述的结构式表示：
[化学式4]
Figure BDA0003943873540000051
(12)(1)～(11)的任一项中记载的粒子，其中，脂质进一步包含两亲性脂质、甾醇类和PEG脂质。
(13)(12)记载的粒子，其中，两亲性脂质是选自二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰乙醇胺的至少1个。
(14)(12)或(13)中记载的粒子，其中，甾醇类是胆固醇。
(15)(12)～(14)的任一项中记载的粒子，其中，PEG脂质是1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基聚乙二醇和/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]氨基甲酰基]-1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺。
(16)(12)～(15)的任一项中记载的粒子，其中，两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成是以摩尔量计，两亲性脂质为15％以下、甾醇类为20～55％、阳离子脂质为40～65％、PEG脂质为1～5％，相对于核酸重量的总脂质重量的比率是15～30。
(17)(16)记载的粒子，其中，两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成是以摩尔量计，两亲性脂质为5～15％、甾醇类为35～50％、阳离子脂质为40～55％、PEG脂质为1～3％，相对于核酸重量的总脂质重量的比率是15～25。
(18)(17)记载的粒子，其中，两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成是以摩尔量计，两亲性脂质为10～15％、甾醇类为35～45％、阳离子脂质为40～50％、PEG脂质为1～2％，相对于核酸重量的总脂质重量的比率是17.5～22.5。
(19)(18)记载的粒子，其中，两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成是以摩尔量计，两亲性脂质为10～15％、甾醇类为35～45％、阳离子脂质为45～50％、PEG脂质为1.5～2％，相对于核酸重量的总脂质重量的比率是17.5～22.5。
(20)(1)～(19)的任一项中记载的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段包含受体结合结构域。
(21)(20)中记载的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段中的受体结合结构域由与序列编号11的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
(22)(20)中记载的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段中的受体结合结构域由与序列编号25、29、33、37、94～107的任一种的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
(23)(20)中记载的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段由与序列编号10的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
(24)(20)中记载的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段由与序列编号24、28、32、36、80～93的任一种的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
(25)(1)～(19)记载的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白由与序列编号6的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
(26)(25)记载的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白中的受体结合结构域由与序列编号11的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
(27)(25)或(26)中记载的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的核酸是包含帽结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、S蛋白的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾部(polyA)的mRNA。
(28)(20)～(24)的任一项中记载的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段的核酸是包含帽结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、前导序列(1eader sequence)、S蛋白中的受体结合结构域的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾部(polyA)的mRNA。
(29)(27)记载的粒子，其中，S蛋白的翻译区的序列由与序列编号5的序列中S蛋白的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列组成。
(30)(27)记载的粒子，其中，S蛋白的翻译区的序列由与序列编号16的序列中S蛋白的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列组成。
(31)(27)记载的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的核酸由序列编号5的核苷酸序列组成。
(32)(27)记载的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的核酸由序列编号16的核苷酸序列组成。
(33)(27)记载的粒子，其中，S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列由与序列编号9的序列中S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列组成。
(34)(27)记载的粒子，其中，S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列由与序列编号19的序列中S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列组成。
(35)(27)记载的粒子，其中，S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列由与序列编号21、23、27、31、35、66～79的任一种的序列中S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列组成。
(36)(28)记载的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段的核酸由序列编号9的核苷酸序列组成。
(37)(28)记载的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段的核酸由序列编号19的核苷酸序列组成。
(38)(1)～(37)的任一项中记载的粒子，其中，核酸包含至少1个修饰核苷酸。
(39)(38)记载的粒子，其中，修饰核苷酸包含5位被取代的嘧啶核苷酸和/或1位被任选取代的假尿苷的至少1个。
(40)(38)记载的粒子，其中，修饰核苷酸包含选自5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿苷、和1-烷基假尿苷的至少1个。
(41)(1)～(40)的任一项中记载的粒子，其中，粒子的平均粒径是30nm～300nm。
(42)(1)～(41)的任一项中记载的粒子在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)引起的感染的组合物中的应用。
(43)组合物，其包含(1)～(41)的任一项中记载的粒子。
(44)(43)记载的组合物，其用于在体内或体外表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白和/或其片段。
(45)(43)或(44)记载的组合物，其用作药物。
(46)(45)记载的组合物，其用于诱导针对新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的免疫反应。
(47)(45)或(46)记载的组合物，其用于预防和/或治疗新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)感染。
(48)在体外表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白和/或其片段的方法，其包括将(43)或(44)中记载的组合物导入细胞。
(49)在体内表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白和/或其片段的方法，其包括向哺乳动物施用(43)～(47)的任一项中记载的组合物。
(50)诱导针对新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的免疫反应的方法，其包括向哺乳动物施用(45)或(46)中记载的组合物。
(51)预防和/或治疗新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)感染的方法，其包括向哺乳动物施用(45)～(47)的任一项中记载的组合物。
(52)(49)～(51)的任一项中记载的方法，其中，哺乳动物是人。
发明效果
根据本发明，可预防和/或治疗SARS-CoV-2引起的感染。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请特愿2020-101420和特愿2021-33278的说明书和/或附图记载的内容。
附图简述
[图1]通过实施例3和实施例4的粒子的RBD蛋白表达水平。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH6.5)。
[图2]通过实施例3和实施例4的粒子诱导的抗RBD抗体应答。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH6.5)。竖条表示几何平均值，1～5的符号表示各个抗体水平。
[图3]实施例3和实施例4组的血清具有的RBD-hACE2结合抑制活性。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH6.5)。横条表示几何平均值，圆形符号表示各个抑制活性水平。
[图4]通过实施例3和实施例4组诱导的RBD特异性细胞免疫。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH6.5)。竖条表示平均值，误差条表示标准误差。在全部处理组中，DMSO浓度调整为0.1％(v/v)。无肽：无肽组。
[图5]通过实施例4、实施例7或实施例8的粒子的施用诱导的血中抗RBD抗体应答。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)。竖条表示几何平均值，1～4的符号表示各个抗体水平。
[图6]通过实施例8或实施例10的粒子的施用诱导的血中抗RBD抗体应答。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)。竖条表示几何平均值，1～5的符号表示各个抗体水平。
[图7]通过实施例10的粒子的施用诱导的血中抗SARS-CoV-2中和活性。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)。竖条表示几何平均值，1～5的符号表示各个中和活性。
[图8]通过实施例8和实施例10的粒子的施用诱导的血中抗SARS-CoV-2中和活性。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)。竖条表示几何平均值，1～5的符号表示各个中和活性。
[图9]通过实施例8或实施例10的粒子的施用诱导的血中抗RBD抗体应答。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)。竖条表示几何平均值，误差条表示标准偏差。
[图10]通过实施例10诱导的RBD特异性细胞免疫。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)。竖条表示平均值，1～7的符号表示各个细胞因子诱导水平。在全部处理组中，DMSO浓度调整为0.1％(v/v)。无肽：无肽组。
[图11]mRNA疫苗对SARS-CoV-2 RBD的系统特异性免疫原性。
(a-e、g、和h)向6周龄的C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠，以2周间隔肌肉内施用模拟物(mock)或LNP-mRNA-RBD(3μg mRNA)2次。(a)从第2次施用起2周后，用ELISA测定血中抗RBD抗体效价。(b-e)从小鼠胭窝淋巴结配制淋巴细胞，进行流式细胞术分析。(b-d)生发中心(GC)B细胞门控为GL7+CD38-CD19+细胞。(e)TFH细胞门控为CD185+PD-1+CD3ε+CD4+T细胞。(f)SARS-CoV-2刺突蛋白的重叠肽。以16个重复肽为1个池肽，分为8个池肽。(g和h)从小鼠脾配制脾细胞，以池肽再处理24小时。用ELISA测定培养上清中的IFN-γ水平。(g-h)以圆形图显示将池2、3和4与蛋白输送抑制剂共同处理6小时后的细胞因子产生CD8+和CD4+T细胞的比例。3+：IFN-γ+IL-2+TNF-α+、2+：IFN-γ+IL-2+、IFN-γ+TNF-α+、IL-2+TNF-α+、1+：IFN-γ+、IL-2+、TNF-α+。N＝4～5。竖条表示平均值，误差条表示标准误差。*P＜0.05，应用Mann-Whitney检验。
[图12]包封了HPLC纯化的mRNA的LNP-mRNA-RBD(mRNA-RBD(HPLC))的免疫原性。(a)将SARS-CoV-2非感染者的人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell、PBMC)用LNP-mRNA-Full(以mRNA换算0.4、2、和10μg/mL)、LNP-mRNA-RBD(以mRNA换算0.4、2、和10μg/mL)、或mRNA-RBD(HPLC)(以mRNA换算0.4、2、和10μg/mL)处理24小时，用ELISA测定培养上清中的IFN-α水平。(b)将C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠的骨髓衍生树突细胞(BM-DC)用LNP-mRNA-Full(以mRNA换算0.4、2、和10μg/mL)、LNP-mRNA-RBD(以mRNA换算0.4、2、和10μg/mL)或mRNA-RBD(HPLC)(以mRNA换算0.4、2、和10μg/mL)处理24小时，用ELISA测定培养上清中的IFN-α水平。(c-i)在第0天和第14天用模拟物、LNP-mRNA-RBD(3μg mRNA)或mRNA-RBD(HPLC)(3μg mRNA)对C57BL/6小鼠肌肉内施用。(c)从从第2次施用起2周后，用ELISA测定血中抗RBD抗体效价。(d和e)从小鼠采集胭窝淋巴结。(d)GC B细胞门控为GL7+CD38-CD19+细胞。(e)TFH细胞门控为CD185+PD-1+CD3ε+CD4+T细胞。(f和g)从小鼠脾配制脾细胞，用池肽处理24小时。用ELISA测定培养上清中的IFN-γ水平。以圆形图显示将肽池3和4与蛋白输送抑制剂共同处理6小时后的细胞因子产生CD8+和CD4+T细胞的比例。3+：IFN-γ+IL-2+TNF-α+、2+：iFN-γ+iL-2+、IFN-γ+TNF-α+、和IL-2+TNF-α+、1+：IFN-γ+、IL-2+、和TNF-α+。(h、i)显示图12f、g、图21、22的代表性数据。IFN-γ+IL-2+TNF-α+和IFN-γ+TNF-α+CD8+T细胞以散点图显示。N＝4～5。竖条表示平均值，误差条表示标准误差。＊P＜0.05，应用ANOVA、随后Dunn的多重比较检验。
[图13]施用包封了HPLC纯化mRNA的LNP-mRNA-RBD的食蟹猴中的血中抗RBD抗体应答。(a)LNP-mRNA-RBD施用、感染、和样品采集的时间表。(b-c)在第0天和第21天用模拟物或LNP-mRNA-RBD(HPLC)(100μg)对食蟹猴肌肉内免疫。(b)用ELISA测定第0天、第7天、第14天、第21天、第28天和感染后第7天的血中抗RBD抗体效价。(c)通过中和试验测定中和抗体。(d)用ELISA测定拭子样品(结膜、口腔、鼻腔、气管、和直肠)中的血中抗RBD IgG效价。黑箭头表示疫苗施用日，红箭头表示SARS-CoV-2感染日。
[图14]施用mRNA-RBD(HPLC)的食蟹猴的抗SARS-CoV-2感染防御应答。从第2次施用起1周后，向食蟹猴的结膜、鼻腔、口腔和气管施用SARS-CoV-2(2×107PFU)。通过RT-PCR和细胞培养法测定(a)拭子样品中的病毒RNA和(b)病毒滴度。(c-d)通过RT-PCR法测定肺组织中的病毒RNA。RU：右上叶、RM：右中叶、RL：右下叶、LU：左上叶、LM：左中叶、LL：左下叶。
[图15]LNP-mRNA-RBD施用小鼠中的血中抗刺突蛋白外部结构域(ECD)抗体应答。在第0天和第14天向C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠肌肉内施用模拟物或LNP-mRNA-RBD(3μgmRNA)。从第2次施用起2周后，用ELISA测定血中抗ECD抗体效价。N＝4～5。横条表示平均值，符号表示各个体的数据。*P＜0.05，应用Mann-Whitney检验。
[图16]用于GC B和TFH细胞的门控。从小鼠胭窝淋巴结配制淋巴细胞，将GC B和TFH细胞免疫染色后进行流式细胞术分析。对于细胞，关于淋巴细胞大小、单峰(singlet)、活细胞(live)、T或B细胞、和TFH或GC B细胞进行门控。
[图17]RBD特异性T细胞应答。从小鼠脾配制脾细胞，用刺突蛋白肽池、ECD蛋白、或RBD蛋白处理24小时。用ELISA测定培养上清中的IFN-γ和IL-13水平。N＝4～5只。竖条表示平均值，误差条表示标准误差。*P＜0.05，应用ANOVA和Sidak的多重比较检验。
[图18]RBD特异性CD8 T细胞应答。从小鼠脾配制脾细胞，用蛋白输送抑制剂和池肽处理6小时。用流式细胞术分析细胞因子产生CD8+T细胞的比例。N＝4～5。竖条表示平均值，误差条表示标准误差。*P＜0.05，应用Mann-Whitney检验。
[图19]RBD特异性CD4 T细胞应答。从小鼠脾配制脾细胞，用蛋白输送抑制剂和池肽处理6小时。用流式细胞术分析细胞因子产生CD4+T细胞的比例。N＝4～5。竖条表示平均值，误差条表示标准误差。*P＜0.05，应用Mann-Whitney检验。
[图20]施用mRNA-RBD(HPLC)的小鼠中的刺突蛋白特异性免疫应答。(a)在第0天和第14天向C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠肌肉内施用模拟物、mRNA-RBD、或mRNA-RBD(HPLC)(3μgmRNA)。从第2次施用起2周后，用ELISA测定血中抗ECD抗体效价。(b-e)从小鼠脾配制脾细胞，用刺突蛋白、ECD、或RBD池肽处理24小时。N＝4。竖条表示平均值，误差条表示标准误差。*P＜0.05，应用ANOVA和Dunn或Sidak的多重比较检验。
[图21]施用mRNA-RBD(HPLC)的C57BL/6小鼠中的RBD特异性T细胞应答。从小鼠脾配制脾细胞，用蛋白输送抑制剂和池肽处理6小时。用流式细胞术分析细胞因子产生CD8+和CD4+T细胞的比例。N＝4。竖条表示平均值，误差条表示标准误差。*P＜0.05，应用ANOVA和Dunn的多重比较检验。
[图22]施用mRNA-RBD(HPLC)的BALB/c小鼠中的RBD特异性T细胞应答。从小鼠脾配制脾细胞，用蛋白输送抑制剂和池肽处理6小时。用流式细胞术分析细胞因子产生CD8+和CD4+T细胞的比例。N＝4。竖条表示平均值，误差条表示标准误差。*P＜0.05，应用ANOVA和Dunn的多重比较检验。
[图23]SARS-CoV-2感染前后的体温变化。从第2次mRNA-RBD(HPLC)施用起1周后，向食蟹猴的口腔、鼻腔、和气管内施用SARS-CoV-2(2.2×106PFU)。从SARS-CoV-2施用2日前起，应用遥测发射器和计算机记录体温。
[图24]施用mRNA-RBD(HPLC)的食蟹猴的SARS-CoV-2感染后的胸部X线照相图。
[图25]通过实施例10、12、14、16、18、和20诱导的血中抗RBD抗体应答。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)。N＝4。竖条表示几何平均值，1～4的符号表示各个抗RBD抗体水平。
[图26]通过实施例10和21～30诱导的血中抗RBD抗体应答。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)。N＝4。竖条表示几何平均值，1～4的符号表示各个抗RBD抗体水平。
[图27]通过实施例8、32a、32b、32c、32d、32f、和33诱导的血中抗RBD抗体应答。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)。N＝4～5。竖条表示几何平均值，1～5的符号表示各个抗RBD抗体水平。ELISA的固相化中应用的RBD抗原来自武汉株(原始)和B.1.351株(351)。
[图28]施用实施例10的BALB/c小鼠血清的RBD-hACE2结合抑制活性。缓冲液：含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)。作为RBD抗原，应用SARS-CoV-1来源(对照)、武汉株来源(原始)、和原始的点突变体(K417N、E484K、N501Y、K417N/E484K/N501Y)。N＝4。横条表示几何平均值，1～4的符号表示各个抑制活性水平。
[图29]施用实施例10的食蟹猴血浆的抗SARS-CoV-2中和活性。N＝4。Pre表示实施例10施用前，Post表示实施例10施用后。竖条表示几何平均值，圆形符号表示各个中和活性。
用于实施发明的方式
以下，关于本发明的实施方式更详细地说明。
本发明提供包封了能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白和/或其片段的核酸的脂质粒子，脂质包含由通式(Ia)表示的阳离子脂质、或其药学上容许的盐。
[化学式5]
Figure BDA0003943873540000141
式中，
R1和R2独立地表示C1-C3烷基；
L1表示任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C17-C19烯基；
L2表示任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烷基、或任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烯基；
p是3或4。
通式(Ia)中的R1和R2独立地表示C1-C3烷基，优选都是甲基。
通式(Ia)中的p是3或4，优选3。
通式(Ia)中的L1表示任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C17-C19烯基，优选任选具有1个或多个乙酰氧基的C17-C19烯基。作为L1，具体地，可以示例(R)-11-乙酰基氧基-顺式-8-十七碳烯基、顺式-8-十七碳烯基、或(8Z，11Z)-十七碳二烯基等。
通式(Ia)中的L2表示任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烷基、或任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烯基，优选任选具有1个或多个乙酰氧基的C10-C12烷基、或任选具有1个或多个乙酰氧基的C10-C19烯基。或此外，通式(Ia)中的L2也优选任选具有1个或多个乙酰氧基的C10-C12烷基、或任选具有1个或多个乙酰氧基的C17-C19烯基。作为L2，具体地，可以示例癸基、顺式-7-癸烯基、十二烷基、或(R)-11-乙酰基氧基-顺式-8-十七碳烯基等。
作为构成本发明的粒子的成分的阳离子脂质，具体地，可以示例由下述的结构式表示的那种：
[化学式6]
Figure BDA0003943873540000151
[化学式7]
Figure BDA0003943873540000152
[化学式8]
Figure BDA0003943873540000153
药学上容许的盐表示可以作为药物使用的盐。作为构成本发明的粒子的成分的阳离子脂质可以是药学上容许的盐，作为这样的盐，优选可以列举：如钠盐、钾盐、锂盐的碱金属盐，如钙盐、镁盐的碱土类金属盐，铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等金属盐；如铵盐的无机盐，如叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N，N’-二苄基乙二胺盐，氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐的有机盐等胺盐；如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐的卤化氢酸盐，硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐的低级烷磺酸盐，如苯磺酸盐；对甲苯磺酸盐的芳基磺酸盐，乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；和如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐的氨基酸盐。
由通式(Ia)表示的阳离子脂质可以是1种化合物，也可以是2种以上化合物的组合。
制备由通式(Ia)表示的阳离子脂质的方法在国际公开第2015/005253号小册子中记载。
本发明的脂质可以进一步包含两亲性脂质、甾醇类和PEG脂质。
两亲性脂质是对极性、非极性溶剂具有共同亲和性的脂质，具体地，可以示例二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、它们的组合等。
甾醇类是具有羟基的甾醇，具体地，可以示例胆固醇等。
PEG脂质是PEG修饰的脂质，具体地，可以示例1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基聚乙二醇和/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]氨基甲酰基]-1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺、它们的组合等。
两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成没有特别限定，以摩尔量计，优选两亲性脂质为15％以下、甾醇类为20～55％、阳离子脂质为40～65％、PEG脂质为1～5％、相对于核酸重量的总脂质重量的比率是15～30，更优选两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成是以摩尔量计，两亲性脂质为5～15％、甾醇类为35～50％、阳离子脂质为40～55％、PEG脂质为1～3％、相对于核酸重量的总脂质重量的比率是15～25，进一步优选两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成是以摩尔量计，两亲性脂质为10～15％、甾醇类为35～45％、阳离子脂质为40～50％、PEG脂质为1～2％、相对于核酸重量的总脂质重量的比率是17.5～22.5，进一步更优选两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成是以摩尔量计，两亲性脂质为10～15％、甾醇类为35～45％、阳离子脂质为45～50％、PEG脂质为1.5～2％、相对于核酸重量的总脂质重量的比率是17.5～22.5。
在本发明中，脂质粒子中包封的核酸能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白和/或其片段。SARS-CoV-2的Wuhan株的序列已被公开(NCBI IDNC_045512)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512)。
SARS-CoV-2的S蛋白的片段可以包含S蛋白中存在的受体结合结构域(receptor-binding domain；RBD)。
受体结合结构域中可以添加分泌肽(编码前导序列的肽)。作为前导序列，可以示例S蛋白信号序列。
SARS-CoV-2的S蛋白的氨基酸序列示于序列编号6。脂质粒子中包封的核酸可以由与序列编号6的氨基酸序列具有至少95％、优选96％、更优选97％的同一性的氨基酸序列组成，能够表达SARS-CoV-2的S蛋白。
SARS-CoV-2的S蛋白中存在的受体结合结构域的氨基酸序列示于序列编号11。SARS-CoV-2的S蛋白中存在的受体结合结构域中可以添加分泌肽(例如，S蛋白信号序列)。向SARS-CoV-2的S蛋白中存在的受体结合结构域添加了S蛋白信号序列的那种的氨基酸序列示于序列编号10。脂质粒子中包封的核酸可以由与序列编号11或10的氨基酸序列具有至少95％、优选96％、更优选97％的同一性的氨基酸序列组成，能够表达SARS-CoV-2的S蛋白中的受体结合结构域。
在本说明书中，同一性指如本领域中公知地、通过序列的比较确定的、2个以上的核苷酸序列或氨基酸序列的序列间的关系。在本领域中，“同一性”还意味着相应于情形、通过一列的2个以上的核苷酸序列间或2个以上的氨基酸序列间的一致性确定时的、核酸分子间或多肽间的序列相关性的程度。同一性可以通过算出2个以上的序列中小的那个、与通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)解决的指定空位比对(存在的情形)间的相同一致性的百分比而评价。具体地，可以通过使用欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所(EMBL-EBI)提供的ClustalW2等软件评价，但只要是本领域技术人员使用的那种则不限于此。
本发明中的序列的同一性是应用作为序列分析软件的GENETYX-SV/RC(株式会社Genetics制)算出的，该算法是本技术领域中通常使用的。本发明的脂质粒子中包封的核酸编码的氨基酸只要与作为靶标的SARS-CoV-2的S蛋白的氨基酸序列和/或其片段保持规定以上的同一性，也可以发生氨基酸的突变(取代)、缺失、插入和/或添加。
本发明的脂质粒子中包封的核酸编码的氨基酸保持上述的序列同一性，在作为靶标的SARS-CoV-2的S蛋白的氨基酸序列和/或其片段的氨基酸序列中，在几个位置(优选5个位置以下、更优选3、2或1个位置)中，每1个位置可以取代、缺失、插入和/或添加数个(优选10个以下、更优选7个以下、进一步优选5、4、3、2或1个)氨基酸。
在SARS-Cov-2的S蛋白中存在的受体结合结构域的氨基酸序列中，可以进行缺失、取代、添加，可以示例将第538个(编号是从S蛋白的N末端计数的编号)的半胱氨酸取代为丝氨酸的序列(序列编号25)(以下，有时也称为“C538S型”。)、关于RBD的全长序列(R319-F541)的N末端和C末端缺失了氨基酸的序列(序列编号29)、关于RBD的全长序列(R319-F541)的N末端和C末端添加了氨基酸的序列(序列编号33)、导入了多个氨基酸残基被取代的突变的序列(序列编号37)。在这些序列中，可以添加分泌肽(例如，S蛋白信号序列)，向序列编号25、29、33和37添加S蛋白信号序列的那种的氨基酸序列分别示于序列编号24、28、32和36。
SARS-CoV-2的S蛋白中存在的受体结合结构域可以来自突变株，南非型、英国型、巴西型、加利福尼亚型、印度型、南非C538S型、英国C538S型、巴西C538S型、加利福尼亚C538S型、印度C538S型、组合突变型(1)(参考后述的实施例33)、组合突变型(2)(参考后述的实施例33)、组合突变型(3)(参考后述的实施例33)、组合突变型(4)(参考后述的实施例33)的受体结合结构域的氨基酸序列示于序列编号94～107。向序列编号94～107的氨基酸序列添加S蛋白信号序列的序列示于序列编号80～93。
脂质粒子中包封的核酸可以由与序列编号25、29、33、37、94～107的氨基酸序列(不含S蛋白信号序列。)具有至少95％、优选96％、更优选97％的同一性的氨基酸序列组成，能够表达SARS-CoV-2的S蛋白中的受体结合结构域。脂质粒子中包封的核酸可以由与序列编号24、28、32、36、80～93的氨基酸序列(包含S蛋白信号序列。)具有至少95％、优选96％、更优选97％的同一性的氨基酸序列组成，能够表达SARS-CoV-2的S蛋白中的受体结合结构域。
能够表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸可以是包含帽结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、S蛋白的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾部(polyA)的mRNA。帽结构(Cap)在许多真核生物的mRNA的5’末端存在，是具有7-甲基鸟苷结构的部位。作为帽结构，可以列举例如cap0、cap1、cap2、ARCA、或CleanCap(注册商标)等，优选cap1、或CleanCap，更优选CleanCap。5’非翻译区(5’-UTR)的序列例如序列编号4的序列中的碱基编号19～88的序列。S蛋白的翻译区的序列是能够表达S蛋白的氨基酸序列的全部或一部分的序列，可以包含起始密码子和/或终止密码子，例如，序列编号4的序列中的碱基编号89～3910的序列。此外，S蛋白的翻译区的序列可以是与序列编号5的序列中S蛋白的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列。3’非翻译区(3’-UTR)的序列是例如序列编号4的序列中的碱基编号3911～4042的序列。多聚A尾部(polyA)的序列是例如序列编号4的序列中的碱基编号4043～4142的序列。帽结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、S蛋白的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾部(polyA)的序列中可以进行改变，能够表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸的序列可以由与序列编号5的序列具有至少90％、优选95％、更优选97％的同一性的核苷酸序列、最优选序列编号5的核苷酸序列组成。核酸的密码子可以进行优化。通过优化密码子，可提高作为疫苗的效果，减低副作用。可以配合对象生物的密码子使用频率进行优化。密码子的优化可以例如关于编码序列进行，在序列编号16的序列中，S蛋白的翻译区的序列的密码子被优化。能够表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸的序列可以由与序列编号16的序列具有至少90％、优选95％、更优选97％的同一性的核苷酸序列组成。
能够表达SARS-CoV-2的S蛋白的片段的核酸可以是包含帽结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、前导序列(leader sequence)、S蛋白中的受体结合结构域的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾部(polyA)的mRNA。帽结构(Cap)在许多真核生物的mRNA的5’末端存在，是具有7-甲基鸟苷结构的部位。作为帽结构，可以列举例如cap0、cap1、cap2、ARCA、或CleanCap(注册商标)等，优选cap1、或CleanCap，更优选CleanCap。5’非翻译区(5’-UTR)的序列是例如序列编号8的序列中的碱基编号19～88的序列。前导序列(leader sequence)的序列是例如序列编号8的序列中的碱基编号89～127的序列。S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列是能够表达S蛋白中的受体结合结构域的氨基酸序列的全部或一部分的序列，可以包含起始密码子和/或终止密码子，例如，序列编号8的序列中的碱基编号128～799的序列。此外，S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列可以是与序列编号9的序列中S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列。3’非翻译区(3’-UTR)的序列是例如序列编号8的序列中的碱基编号800～931的序列。多聚A尾部(polyA)的序列是例如序列编号8的序列中的碱基编号932～1031的序列。帽结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、前导序列(leader sequence)、S蛋白中的受体结合结构域的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾部(polyA)的序列中可以进行改变，能够表达SARS-CoV-2的S蛋白中的受体结合结构域的核酸的序列可以由与序列编号9的序列具有至少90％、优选95％、更优选97％的同一性的核苷酸序列、最优选序列编号9的核苷酸序列组成。核酸的密码子可以进行优化。通过优化密码子，可提高作为疫苗的效果，减低副作用。可以配合对象生物的密码子使用频率进行优化。密码子的优化可以例如关于编码序列进行，在序列编号19的序列中，S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列的密码子被优化。能够表达SARS-CoV-2的S蛋白中的受体结合结构域的核酸的序列可以由与序列编号19的序列具有至少90％、优选95％、更优选97％的同一性的核苷酸序列组成。此外，S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列可以是与序列编号21、23、27、31、35、66～79的任一种的序列中S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列具有至少90％、优选95％、更优选97％的同一性的核苷酸序列。
序列编号21是实施例11的mRNA的核苷酸序列，实施例11的mRNA是与实施例6的序列的多聚A以外的序列相同的mRNA。在实施例6的序列中多聚A具有110个腺嘌呤核苷酸，在实施例11的mRNA中腺嘌呤核苷酸是50个。本发明的脂质粒子中包含的核酸可以是多聚A部分比较短的mRNA，优选30以上、40以上、更优选50以上。多聚A的上限没有特别限定，优选500以下、400以下、300以下、200以下、110以下。
序列编号23是实施例13的mRNA的核苷酸序列，实施例13的mRNA是能够表达第538个(编号是从S蛋白的N末端计数的编号)的半胱氨酸取代为丝氨酸的序列的mRNA。
序列编号27是实施例15的mRNA的核苷酸序列，实施例15的mRNA是能够表达关于RBD的全长序列(R319-F541)的N末端和C末端缺失了氨基酸的序列的mRNA。
序列编号31是实施例17的mRNA的核苷酸序列，实施例17的mRNA是能够表达关于RBD的全长序列(R319-F541)的N末端和C末端添加了氨基酸的序列的mRNA。
序列编号35是实施例19的mRNA的核苷酸序列，实施例19的mRNA是能够表达实施例6的序列中在多个位置产生氨基酸残基的取代的序列的mRNA。
序列编号66～79是能够表达南非型、英国型、巴西型、加利福尼亚型、印度型、南非C538S型、英国C538S型、巴西C538S型、加利福尼亚C538S型、印度C538S型、组合突变型、(1)(参考后述的实施例33)、组合突变型(2)(参考后述的实施例33)、组合突变型(3)(参考后述的实施例33)、组合突变型(4)(参考后述的实施例33)的受体结合结构域的氨基酸序列的mRNA的核苷酸序列。
脂质粒子中包封的核酸只要是能够表达SARS-CoV-2的S蛋白和/或其片段的核酸则可以是任何形式。例如，列举单链DNA、单链RNA(例如，mRNA)、DNA与RNA混合的单链多核苷酸、双链DNA、双链RNA、DNA-RNA的杂交多核苷酸、由DNA和RNA混合的2种多核苷酸组成的双链多核苷酸等，优选mRNA。
构成脂质粒子中包封的核酸的核苷酸可以是天然型，也可以是修饰核苷酸，可以包含至少1个修饰核苷酸。
修饰核苷酸可以是碱基、糖和磷酸二酯键的任一部分被修饰的那种。修饰部位可以是1个位置，也可以是2个位置以上。
作为碱基的修饰的实例，可以列举胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、N4-甲基化、尿嘧啶的5-甲基化(胸腺嘧啶)、5-氟化、腺嘌呤的N6-甲基化、鸟嘌呤的N2-甲基化等。
作为糖的修饰的实例，可以列举D-呋喃核糖的2′-O-甲基化。
作为磷酸二酯键的修饰的实例，可以列举硫代磷酸酯键。
修饰核苷酸优选碱基部分被修饰的那种，例如，可以是5位被取代的嘧啶核苷酸、1位被任选取代的假尿苷，具体地，可以示例5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿苷、1-烷基假尿苷。此外，作为1-烷基假尿苷，可以是1-(C1-C6烷基)假尿苷，优选1-甲基假尿苷或1-乙基假尿苷。碱基部分被修饰的修饰核苷酸可以其自身单独、或组合多个代替天然型的核苷酸使用。作为碱基部分被修饰的修饰核苷酸的组合，例如，可以是5-甲基胞苷与5-甲基尿苷的组合、5-甲基胞苷与假尿苷的组合、或5-甲基胞苷与1-甲基假尿苷的组合，优选5-甲基胞苷与5-甲基尿苷的组合。
能够表达本发明的SARS-CoV-2的S蛋白和/或其片段的核酸可以从具有期望的碱基序列的DNA通过体外转录反应制备。体外转录中必要的酶、缓冲液、和核苷-5’-三磷酸混合物(腺苷-5’-三磷酸(ATP)、鸟苷-5’-三磷酸(GTP)、胞苷-5’-三磷酸(CTP)和尿苷-5’-三磷酸(UTP))是市售的(例如，AmpliScribeT7 High Yield Transcription Kit(Epicentre)、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit(Life thechnologies)等)。为了制备单链RNA使用的DNA是克隆化DNA，例如，应用质粒DNA或DNA片段。质粒DNA或DNA片段可以应用市售的那种，此外可以通过本领域中通常已知的方法制备(例如，Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning a Laboratory Manual second edition(1989)、Rashtchian，A.，Current Opinion in Biotechnology，1995，6(1)，30-36、Gibson D.G.et al.，Science，2008，319(5867)，1215-1220中记载的方法等)。
为了得到提高了稳定性和/或安全性的mRNA，在体外转录反应中，通过将一部分或全部天然型核苷-5’-三磷酸取代为修饰核苷-5’-三磷酸，也可以将mRNA的中的一部分或全部天然型核苷酸取代为修饰核苷酸(Kormann，M.，Nature Biotechnology，2011，29，154-157.)。
为了得到提高了稳定性和/或安全性的mRNA，在体外转录反应后通过应用加帽酶的方法，可以向mRNA的5’末端导入帽结构(上述Cap0结构)。此外，通过使2’-O-甲基转移酶作用于进一步具有Cap0的mRNA的方法，可以将Cap0转换为Cap1。加帽酶和2’-O-甲基转移酶可以应用市售制品(例如，Vaccinia Capping System，M2080；mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase，M0366，都是New England Biolab制)。在使用市售制品的情形中，可以按照制品所附的方案制备具有帽结构的mRNA。
mRNA的5’末端的帽结构也可以通过与使用酶不同的方法导入。例如，通过在体外转录反应中加入ARCA或CleanCap(注册商标)，可以将具有ARCA的帽类似物的结构、或来自CleanCap(注册商标)的Cap1结构导入mRNA。ARCA和CleanCap(注册商标)可以应用市售制品(ARCA，N-7003；CleanCap Reagent AG，N-7113，都是TriLink BioTechnologies制)。在使用市售制品的情形中，可以按照制品所附的方案制备具有帽结构的mRNA。
在本发明中，脂质粒子中包封的核酸可以用脱盐、反相柱、凝胶过滤、HPLC、PAGE等方法纯化。通过经纯化处理除去杂质，在施用核酸的生物体中，可减少炎症性细胞因子的产生。
作为上述杂质，可以示例例如双链RNA(dsRNA)。作为脂质粒子中包封的核酸包含的dsRNA量，以质量百分率优选10％以下、更优选7.5％以下、进一步更优选5％以下、尤其优选3％以下。
本发明的核酸包封脂质粒子可以通过薄膜法、反相蒸发法、乙醇注射法、乙醚注射法、脱水-再水合法、表面活性剂透析法、水合法、冻融法等方法制备。例如，可以通过国际公开第2015/005253号小册子中记载的方法制备核酸包封脂质粒子。
本发明的粒子的平均粒径可以是30nm～300nm，优选30～200nm，更优选30～150nm，进一步更优选30～100nm。平均粒径可以通过应用Zeta Potential/Particle SizerNICOMP(注册商标)380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)等仪器、基于动态光散射法等原理测定体积平均粒径得到。
本发明的粒子可以为了制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)引起的感染的组合物而应用。SARS-CoV-2的株没有特别限定，优选Wuhan株。
应用本发明的粒子，可以在体内或体外表达SARS-CoV-2的S蛋白和/或其片段。因此，本发明提供在体外表达SARS-CoV-2的S蛋白和/或其片段的方法，其包括将含有上述粒子的组合物导入细胞。此外，本发明还提供在体内表达SARS-CoV-2的S蛋白和/或其片段的方法，其包括向哺乳动物施用含有上述粒子的组合物。通过在体内表达SARS-CoV-2的S蛋白和/或其片段，可以诱导对SARS-CoV-2的免疫反应。作为其结果，可以预防和/或治疗SARS-CoV-2感染。因此，本发明提供诱导对SARS-CoV-2的免疫反应的方法，其包括向哺乳动物施用含有上述粒子的组合物。此外，本发明提供预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的方法，其包括向哺乳动物施用含有上述粒子的组合物。
本发明的粒子可以作为药物、此外作为实验用试剂利用。本发明的粒子通常向水、缓冲液、生理盐水等载体添加，可将该混合物(组合物)导入细胞(体外)、或向哺乳动物施用(体内)。在向哺乳动物施用的情形中，载体可以是药学上容许的载体(例如，生理盐水)。此外，本发明的粒子可以配制为以脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、石蜡、蜡、树脂、塑料、二醇类、高级醇、甘油、水、乳化剂、悬浮剂等为基质材料的乳膏、糊剂、软膏、凝胶、洗剂等剂型。
本发明的粒子可以通过经口施用、或肌肉内施用、静脉内施用、直肠内施用、经皮施用、经粘膜施用、皮下施用、皮内施用等方法向人、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猪、猴、猫、狗、马、山羊、绵羊、牛等哺乳动物非经口施用。
在向人施用本发明的粒子的情形中，例如，可以以作为成人每1次mRNA的量约0.001～1mg、优选0.01～0.2mg的施用量肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、点滴静脉注射、或静脉注射1次或多次，其施用量及施用次数可根据疾病的种类、症状、年龄、施用方法等适当变更。
在用作实验试剂的情形中，可以将本发明的粒子导入欲表达SARS-CoV-2的S蛋白和/或其片段的细胞(例如，HEK293细胞及其衍生细胞(HEK293T细胞、FreeStyle 293细胞和Expi293细胞)、CHO细胞、C2C12小鼠成肌细胞、永生化小鼠树突细胞(MutuDC1940))，在体外表达SARS-CoV-2的S蛋白和/或其片段。SARS-CoV-2的S蛋白和/或其片段的表达可以通过用蛋白印迹法检测样品中的SARS-CoV-2的S蛋白和/或其片段、或用质谱法检测对SARS-CoV-2的S蛋白和/或其片段特异性的肽片段而分析。
本说明书中的治疗意味着，在发生病毒或细菌等引起的传染病、或以该感染为原因的疾病(例如，肺炎等)的患者中，这些疾病的临床症状的恢复、缓解、减轻和/或恶化的延迟。
在本说明书中，预防意味着减少病毒或细菌等引起的传染病所致的疾病的发病率。预防包括病毒或细菌等引起的传染病所致的疾病的进展风险的降低、或这些疾病的重症化的减少。本发明的粒子由于诱导防御免疫反应在上述疾病的预防和/或治疗中显示效果。
实施例
以下，通过实施例具体说明本发明。另外，这些实施例用于说明本发明，不限定本发明的范围。
[实施例1]SARS-CoV-2 S全长(SARS-CoV-2 S full)mRNA-001的配制(1)SARS- CoV-2 S全长的体外转录(IVT)用模板DNA的制备
为了制备体外转录(IVT)中应用的模板DNA，将SARS-CoV-2 S全长DNA通过PCR扩增后纯化。将包含T7启动子序列、人β-珠蛋白的5’-UTR序列、KOZAK序列、SARS-CoV-2 S全长、人β-珠蛋白的3’-UTR序列按顺序连接的序列的DNA片段(序列编号1)导入质粒(pUC57mini-S全长)。向溶解6ng该质粒的无核酸酶水(849.6μL)加入10×Buffer for KOD-Plus-Ver.2(120μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)、2mM dNTP mix(120μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)、25mM MgSO4(72μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)、50μM正义引物(7.2μL、序列编号2)、50μM反义引物(7.2μL、序列编号3)、KOD Plus polymerase(24μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)，在98℃温育1分钟后，将98℃、5秒、55℃、15秒、68℃、4分钟实施20个循环，进一步在68℃温育1分钟，扩增S全长DNA。反应后用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega目录号A9281)纯化模板DNA(序列编号4)。
(2)通过体外转录的SARS-CoV-2 S-full mRNA-001的配制
混合实施例1-(1)中得到的360.5μg/mL模板DNA(70μL)、100mM CleanCap AG(50μL，TriLink目录号T-7113)、100mM ATP(50μL，Hongene目录号R1331)、100mM GTP(50μL，Hongene目录号R2331)、100mM 5-Me-CTP(50μL，Hongene目录号R3-029)、100mM 5-甲基尿苷三磷酸(50μL)、无核酸酶水(380μL，Thermo Fisher目录号AM9937)、T7 Transcription 5×缓冲液(200μL，Promega目录号P140X)、Enzyme mix，T7 RNAPolymerase(100μL，Promega目录号P137X)，在37℃温育4小时。混合RQ1 RNase-Free DNase(25μL，Promega目录号M6101)，在37℃温育15分钟。混合8M LiCl溶液(500μL，Sigma-Aldrich目录号L7026)，在-20℃静置过夜。离心分离(4℃、4000×g、30分钟)后，弃去上清，加入70％乙醇，离心分离(4℃、4000×g、10分钟)后，弃去上清并风干。将得到的残渣溶解于无核酸酶水后，应用RNeasy Maxi kit(Qiagen目录号75162)按照所附的手册纯化。混合得到的洗脱液(5.8mL、以UV换算4906μg)和无核酸酶水(419μL)、rApid Alkaline Phosphatase(Roche目录号04 898 141 001)的缓冲液(800μL)和酶(981μL)，在37℃温育30分钟后，在75℃温育3分钟。混合8M LiCl溶液(8000μL)，在-20℃静置过夜。离心分离(4℃、4000×g、30分钟)后，弃去上清，加入70％乙醇，离心分离(4℃、4000×g、10分钟)后，弃去上清并风干。将得到的残渣溶解于无核酸酶水后，通过应用RNeasy Maxi kit按照所附的手册纯化，得到作为目标的mRNA。
得到的mRNA具有序列编号5的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNA试剂盒(PerkinElmer目录号CLS960010)分析，确认为目标长度。
[实施例2]SARS-CoV-2 RBD mRNA-002的配制
(1)SARS-CoV-2 RBD的体外转录(IVT)用模板DNA的制度
为了制备体外转录(IVT)中应用的模板DNA，将SARS-CoV-2 RBD DNA通过PCR扩增后纯化。将包含T7启动子序列、人β-珠蛋白的5’-UTR序列、KOZAK序列、SARS-CoV-2 S蛋白的信号序列、SARS-CoV-2 RBD、人β-珠蛋白的3’-UTR序列按顺序连接的序列的DNA片段(序列编号7)导入质粒(pUC57mini-RBD)。向溶解6ng该质粒的无核酸酶水(849.6μL)加入10×Buffer for KOD-Plus-Ver.2(120μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)、2mM dNTP mix(120μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)、25mM MgSO4(72μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)、50μM正义引物(7.2μL、序列编号2)、50μM反义引物(7.2μL、序列编号3)、KOD Plus polymerase(24μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)，在98℃温育1分钟后，将98℃、5秒、55℃、15秒、68℃、1分钟实施20个循环，进一步在68℃温育1分钟，扩增RBD DNA。反应后用Wizard SV Gel and PCRClean-Up System(Promega目录号A9281)纯化模板DNA(序列编号8)。
(2)通过体外转录的SARS-CoV-2 RBD mRNA-002的配制
应用实施例2-(1)中得到的模板DNA替代实施例1-(1)中得到的模板DNA，用与实施例1-(2)同样的方法得到mRNA。
得到的mRNA具有序列编号9的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNA试剂盒分析，确认为目标长度。
[实施例3]应用实施例1记载的SARS-CoV-2 S全长mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子 的配制
(1)mRNA包封核酸脂质粒子的配制
将二硬脂酰磷脂酰胆碱(1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱：以下表述为DSPC，NOF CORPORATION)、胆固醇(Cholesterol：以下表述为Chol，Sigma-Aldrich，Inc.)、二乙酸(7R，9Z，26Z，29R)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)三十五-9，26-二烯-7，29-二基(WO2015/005253的实施例23中记载的化合物)(以下表述为LP)、和聚乙二醇分子量为约2000的1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇、以下表述为PEG-DMG，NOF CORPORATION)以DSPC∶Chol∶LP∶PEG-DMG＝12.5∶41∶45∶1.5的摩尔比溶解于乙醇，使得成为总脂质浓度5mM。
另一方面，将实施例1中得到的SARS-CoV-2 S-full mRNA-001用柠檬酸缓冲液(20mM Citrate缓冲液，pH4.0)配制为52.7μg/mL。
将上述脂质溶液和mRNA溶液应用NanoAssemblr BenchTop(PrecisionNanosystems Inc.)在微流路内混合使其体积比为1：3，得到核酸脂质粒子的粗分散液。通过将核酸脂质粒子的分散液用约25～50倍量的300mM蔗糖，10mM组氨酸缓冲液(pH6.5)透析12-18小时(Float-A-Lyzer G2，MWCO：1,000kD，Spectra/Por)，进行乙醇除去，得到纯化mRNA包封核酸脂质粒子的分散液。
另外，按照WO2015/005253的实施例23中记载的方法合成LP。
(2)mRNA包封核酸脂质粒子的特性评价
进行包含(1)中配制的核酸脂质粒子的分散液的特性评价。关于各自的特性评价的方法进行说明。
(2-1)mRNA的包封率
应用Quant-iT RiboGreen RNA测定试剂盒(Invitrogen)基于所附说明书测定mRNA的包封率。
即，在0.015％Triton X-100表面活性剂存在下和非存在下，定量核酸脂质粒子的分散液中的mRNA，通过下式算出包封率。
{([表面活性剂存在下的mRNA量]-[表面活性剂非存在下的mRNA量])/[表面活性剂存在下的mRNA量]}x100(％)
(2-2)mRNA与脂质的比率
用反相色谱测定核酸脂质粒子的分散液中的mRNA量(系统：Agilent 1100series，柱：Bioshell A400 Protein C4(10cm×4.6mm，3.4μm)(SUPELCO)，缓冲液A：0.1M乙酸三乙胺(pH7.0)，缓冲液B：乙腈，(B％)：5-50％(0-15min)，流速：1mL/min，温度：70℃，检测：260nm)。
用反相色谱测定核酸脂质粒子的分散液中的各脂质量(系统：DIONEX UltiMate3000，柱：XSelect CSH C18(150mm×3mm，3.5μm，
Figure BDA0003943873540000282
)(Waters目录号186005263)，缓冲液A：0.2％甲酸，缓冲液B：0.2％甲酸，甲醇，(B％)：75-100％(0-6min)，100％(6-15min)，流速：0.45mL/min，温度：50℃，检测：Corona CAD(Charged Aerosol Detector))。
通过下式算出针对mRNA的总脂质量的比率。
[总脂质浓度]/[mRNA浓度](wt/wt)
(2-3)平均粒径
核酸脂质粒子的粒径用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)测定。表中的平均粒径表示体积平均粒径，±以下表示偏差。
结果示于表1。
[实施例4]应用实施例2记载的SARS-CoV-2 RBD mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的 配制
用与实施例3同样的方法，实施应用实施例2记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制、特性评价。结果示于表1。
(表1)
Figure BDA0003943873540000281
根据以上结果知晓，对于这些核酸脂质粒子，mRNA的90％以上在脂质粒子内包封，具有约100nm至约130nm的平均粒径。
[实施例5]SARS-CoV-2 S全长优化mRNA-003的配制
(1)SARS-CoV-2 S全长优化的体外转录(IVT)用模板DNA的制备
人工合成包含T7启动子序列、人β-珠蛋白的5’-UTR序列、KOZAK序列、SARS-CoV-2S全长优化、人β-珠蛋白的3’-UTR序列按顺序连接的序列的DNA片段(序列编号12)，导入质粒(S_opt2 EcoRI)。向溶解1ng该质粒的无核酸酶水(69μL)加入5×SuperFi Green缓冲液(20μL、ThermoFisher Scientific目录号12357-010)、2.5mM dNTP mix(8μL、Takara bio(株)目录号4030)、50μM正义引物2(1μL、序列编号13)、50μM反义引物2(1μL、序列编号14)、Platinum SuperFi DNA Polymerase(1μL、ThermoFisher Scientific目录号12357-010)，在98℃温育30秒后，将98℃、5秒、60℃、10秒、72℃、2分钟实施20个循环，进一步在72℃温育1分钟，扩增SARS-CoV-2 S全长优化的模板DNA(序列编号15)。用限制酶NheI和HindIII切割该模板DNA后，导入用相同的限制酶切割的质粒，制备模板质粒(pUCKIVT1 S全长优化)。用限制酶BspQI切割该质粒后，用异丙醇沉淀纯化DNA，配制直链质粒DNA。
(2)通过体外转录的SARS-CoV-2 S全长优化mRNA-003的配制
应用实施例5-(1)中得到的直链质粒DNA替代实施例1-(])中得到的模板DNA，用与实施例1-(2)同样的方法得到mRNA。
得到的mRNA具有序列编号16的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNA试剂盒分析，确认为目标长度。
[实施例6]SARS-CoV-2 RBD优化mRNA-004的配制
(1)SARS-CoV-2 RBD优化的体外转录(IVT)用模板DNA的制备
人工合成包含T7启动子序列、人β-珠蛋白的5’-UTR序列、KOZAK序列、SARS-CoV-2RBD优化、人β-珠蛋白的3’-UTR序列按顺序连接的序列的DNA片段(序列编号17)，导入质粒(S_RBD_opt2 EcoRI)。向溶解1ng该质粒的无核酸酶水(69μL)加入5×SuperFi Green缓冲液(20μL、ThermoFisher Scientific目录号12357-010)、2mM dNTP mix(8μL、Takara bio(株)目录号4030)、50μM正义引物2(1μL、序列编号13)、50μM反义引物2(1μL、序列编号14)、Platinum SuperFi DNA Polymerase(1μL、ThermoFisher Scientific目录号12357-010)，在98℃温育30秒后，将98℃、5秒、60℃、10秒、72℃、1分钟实施20个循环，进一步在72℃温育1分钟，扩增SARS-CoV-2 RBD优化DNA(序列编号18)。用限制酶NheI和HindIII切割该模板DNA后，导入用相同的限制酶切割的质粒，制备模板质粒(pUCKIVT1-RBD优化)。用限制酶BspQI切割该质粒后，用异丙醇沉淀纯化DNA，配制直链质粒DNA。
(2)通过体外转录的SARS-CoV-2 RBD优化mRNA-004的配制
应用实施例6-(1)中得到的直链质粒DNA替代实施例1-(1)中得到的模板DNA，用与实施例1-(2)同样的方法得到mRNA。
得到的mRNA具有序列编号19的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNA试剂盒分析，确认为目标长度。
[实施例7]应用实施例5记载的SARS-CoV-2 S全长优化mRNA的mRNA包封核酸脂质 粒子的配制
用与实施例3同样的方法，实施应用实施例5记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制、特性评价。但是，替代300mM蔗糖、10mM组氨酸缓冲液(pH6.5)，应用300mM蔗糖、10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)进行透析，得到mRNA包封核酸脂质粒子的分散液。
结果示于表2。
[实施例8]应用实施例6记载的SARS-CoV-2 RBD优化mRNA的mRNA包封核酸脂质粒 子的配制
用与实施例3同样的方法，实施应用实施例6记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制、特性评价。但是，替代300mM蔗糖、10mM组氨酸缓冲液(pH6.5)，应用300mM蔗糖、10mM组氨酸缓冲液(pH7.0)进行透析，得到mRNA包封核酸脂质粒子的分散液。
结果示于表2。
[实施例9]SARS-CoV-2 RBD优化mRNA-004的HPLC纯化
用反相色谱(YMC-Triart Bio C4(YMC目录号TB30S05-1510WT)、5％乙腈，400mM乙酸三乙胺(pH7.0)/25％乙腈，400mM乙酸三乙胺(pH7.0)、75℃)分离纯化用实施例6-(2)中记载的方法得到的mRNA。
[实施例10]应用实施例6记载的SARS-CoV-2 RBD优化mRNA的mRNA包封核酸脂质粒 子的配制
用与实施例8同样的方法，实施应用实施例9记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制、特性评价。结果示于表2。
(表2)
Figure BDA0003943873540000311
根据以上结果知晓，对于这些核酸脂质粒子，mRNA的90％以上在脂质粒子内包封，具有约90nm至约130nm的平均粒径。
[实施例11]SARS-CoV-2 RBD S2000 mRNA的配制
(1)SARS-CoV-2 RBD S2000的体外转录(IVT)用模板DNA的制备
为了制备体外转录(IVT)中应用的模板DNA构建质粒。制备导入了包含GCTAGC(NheI位点)、T7启动子序列、人β-珠蛋白的5′-UTR序列、KOZAK序列、SARS-CoV-2 S蛋白的信号序列、SARS-CoV-2 RBD的翻译区、人β-珠蛋白的3’-UTR序列、多聚A尾部和GAAGAGC(BspQI位点)按顺序连接的序列的DNA片段(序列编号20)的质粒(pUC57-S2000)。向溶解质粒(100μg)的无核酸酶水(860μL，Thermo Fisher，目录号AM9937)加入10X NEB缓冲液3.1(100μL，New England Biolabs，目录号R7203S)、BspQI(40μL，New England Biolabs，目录号R0712)，在50℃温育1小时后，加入异丙醇(1400μL)，在-80℃静置过夜。离心分离(-8℃，15,000rpm，10分钟)后，弃去上清，加入70％乙醇，离心分离(-8℃，15,000rpm，10分钟)后，弃去上清并风干。将得到的残渣溶解于TE-缓冲液(pH8.0)，配制为500μg/mL的溶液。
(2)通过体外转录的SARS-CoV-2 RBD S2000 mRNA的配制
应用实施例11-(1)中得到的模板DNA替代实施例1-(1)中得到的模板DNA，用与实施例1-(2)同样的方法得到mRNA。
得到的mRNA具有序列编号21的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNA试剂盒分析，确认为目标长度。
[实施例12]应用实施例11记载的SARS-CoV-2 RBD S2000 mRNA的mRNA包封核酸脂 质粒子的配制
用与实施例8同样的方法，实施应用实施例11记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制、特性评价。但是，mRNA量用以下方法测定。
在90％甲醇中稀释溶解核酸脂质粒子分散液，用紫外可视分光光度计(PerkinElmer公司制、LAMBDATM465)测定核酸脂质粒子中的mRNA量。通过下式算出mRNA浓度。
{[260nm的吸光度]-[350nm的吸光度]}x40x稀释倍率(μg/mL)
结果示于表3。根据特性评价的结果知晓，对于本核酸脂质粒子，mRNA的95％以上在脂质粒子内包封，具有约150nm的平均粒径。
[实施例13]SARS-CoV-2 RBD S2001mRNA的配制
(1)SARS-CoV-2 RBD S2001的体外转录(IVT)用模板DNA的制备
为了制备体外转录(IVT)中应用的模板DNA构建质粒。制备导入了包含GCTAGC(NheI位点)、T7启动子序列、人β-珠蛋白的5′-UTR序列、KOZAK序列、SARS-CoV-2 S蛋白的信号序列、SARS-CoV-2 RBD的翻译区、人β-珠蛋白的3’-UTR序列、多聚A尾部和GAAGAGC(BspQI位点)按顺序连接的序列的DNA片段(序列编号22)的质粒(pUC57-S2001)。向溶解质粒(100μg)的无核酸酶水(860μL，Thermo Fisher，目录号AM9937)加入10X NEB缓冲液3.1(100μL，New England Biolabs，目录号R7203S)、BspQI(40μL，New England Biolabs，目录号R0712)，在50℃温育1小时后，加入异丙醇(1400μL)，在-80℃静置过夜。离心分离(-8℃，15,000rpm，10分钟)后，弃去上清，加入70％乙醇，离心分离(-8℃，15,000rpm，10分钟)后，弃去上清并风干。将得到的残渣溶解于TE-缓冲液(pH8.0)，配制为500μg/mL的溶液。
(2)通过体外转录的SARS-CoV-2 RBD S2001mRNA的配制
应用实施例13-(1)中得到的模板DNA替代实施例1-(1)中得到的模板DNA，用与实施例1-(2)同样的方法得到mRNA。
得到的mRNA具有序列编号23的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNA试剂盒分析，确认为目标长度。
[实施例14]应用实施例13记载的SARS-CoV-2 RBD S2001 mRNA的mRNA包封核酸脂 质粒子的配制
用与实施例12同样的方法，实施应用实施例13记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制、特性评价。结果示于表3。根据特性评价的结果知晓，对于本核酸脂质粒子，mRNA的95％以上在脂质粒子内包封，具有约140nm的平均粒径。
[实施例15]SARS-CoV-2 RBD S2002 mRNA的配制
(1)SARS-CoV-2 RBD S2002的体外转录(IVT)用模板DNA的制备
为了制备体外转录(IVT)中应用的模板DNA构建质粒。制备导入了包含GCTAGC(NheI位点)、T7启动子序列、人β-珠蛋白的5′-UTR序列、KOZAK序列、SARS-CoV-2 S蛋白的信号序列、SARS-CoV-2 RBD的翻译区、人β-珠蛋白的3’-UTR序列、多聚A尾部和GAAGAGC(BspQI位点)按顺序连接的序列的DNA片段(序列编号26)的质粒(pUC57-S2002)。向溶解质粒(100μg)的无核酸酶水(860μL，Thermo Fisher，目录号AM9937)加入10X NEB缓冲液3.1(100μL，New England Biolabs，目录号R7203S)、BspQI(40μL，New England Biolabs，目录号R0712)，在50℃温育1小时后，加入异丙醇(1400μL)，在-80℃静置过夜。离心分离(-8℃，15,000rpm，10分钟)后，弃去上清，加入70％乙醇，离心分离(-8℃，15,000rpm，10分钟)后，弃去上清并风干。将得到的残渣溶解于TE-缓冲液(pH8.0)，配制为500μg/mL的溶液。
(2)通过体外转录的SARS-CoV-2 RBD S2002 mRNA的配制
应用实施例15-(1)中得到的模板DNA替代实施例1-(1)中得到的模板DNA，用与实施例1-(2)同样的方法得到mRNA。
得到的mRNA具有序列编号27的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNA试剂盒分析，确认为目标长度。
[实施例16]应用实施例15记载的SARS-CoV-2 RBD S2002 mRNA的mRNA包封核酸脂 质粒子的配制
用与实施例12同样的方法，实施应用实施例15记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制、特性评价。结果示于表3。根据特性评价的结果知晓，对于本核酸脂质粒子，mRNA的95％以上在脂质粒子内包封，具有约140nm的平均粒径。
[实施例17]SARS-CoV-2 RBD S2003 mRNA的配制
(1)SARS-CoV-2 RBD S2003的体外转录(IVT)用模板DNA的制备
为了制备体外转录(IVT)中应用的模板DNA构建质粒。制备导入了包含GCTAGC(NheI位点)、T7启动子序列、人β-珠蛋白的5′-UTR序列、KOZAK序列、SARS-CoV-2 S蛋白的信号序列、SARS-CoV-2 RBD的翻译区、人β-珠蛋白的3’-UTR序列、多聚A尾部和GAAGAGC(BspQI位点)按顺序连接的序列的DNA片段(序列编号30)的质粒(pCC1-S2003)。向溶解质粒(100μg)的无核酸酶水(860μL，Thermo Fisher，目录号AM9937)加入10X NEB缓冲液3.1(100μL，New England Biolabs，目录号R7203S)、BspQI(40μL，New England Biolabs，目录号R0712)，在50℃温育1小时后，加入异丙醇(1400μL)，在-80℃静置过夜。离心分离(-8℃，15,000rpm，10分钟)后，弃去上清，加入70％乙醇，离心分离(-8℃，15,000rpm，10分钟)后，弃去上清并风干。将得到的残渣溶解于TE-缓冲液(pH8.0)，配制为500μg/mL的溶液。
(2)通过体外转录的SARS-CoV-2 RBD S2003 mRNA的配制
应用实施例17-(1)中得到的模板DNA替代实施例1-(1)中得到的模板DNA，用与实施例1-(2)同样的方法得到mRNA。
得到的mRNA具有序列编号31的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNA试剂盒分析，确认为目标长度。
[实施例18]应用实施例17记载的SARS-CoV-2 RBD S2003 mRNA的mRNA包封核酸脂 质粒子的配制
用与实施例12同样的方法，实施应用实施例17记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制、特性评价。结果示于表3。根据特性评价的结果知晓，对于本核酸脂质粒子，mRNA的95％以上在脂质粒子内包封，具有约140nm的平均粒径。
[实施例19]SARS-CoV-2 RBD S2004 mRNA的配制
(1)SARS-CoV-2 RBD S2004的体外转录(IVT)用模板DNA的制备
为了制备体外转录(IVT)中应用的模板DNA构建质粒。制备导入了包含GCTAGC(NheI位点)、T7启动子序列、人β-珠蛋白的5′-UTR序列、KOZAK序列、SARS-CoV-2 S蛋白的信号序列、SARS-CoV-2 RBD的翻译区、人β-珠蛋白的3’-UTR序列、多聚A尾部和GAAGAGC(BspQI位点)按顺序连接的序列的DNA片段(序列编号34)的质粒(pCC1-S2004)。向溶解质粒(100μg)的无核酸酶水(860μL，Thermo Fisher，目录号AM9937)加入10X NEB缓冲液3.1(100μL，New England Biolabs，目录号R7203S)、BspQI(40μL，New England Biolabs，目录号R0712)，在50℃温育1小时后，加入异丙醇(1400μL)，在-80℃静置过夜。离心分离(-8℃，15,000rpm，10分钟)后，弃去上清，加入70％乙醇，离心分离(-8℃，15,000rpm，10分钟)后，弃去上清并风干。将得到的残渣溶解于TE-缓冲液(pH8.0)，配制为500μg/mL的溶液。
(2)通过体外转录的SARS-CoV-2 RBD S2004 mRNA的配制
应用实施例19-(1)中得到的模板DNA替代实施例1-(1)中得到的模板DNA，用与实施例1-(2)同样的方法得到mRNA。
得到的mRNA具有序列编号35的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNA试剂盒分析，确认为目标长度。
[实施例20]应用实施例19记载的SARS-CoV-2 RBD S2004 mRNA的mRNA包封核酸脂 质粒子的配制
用与实施例12同样的方法，实施应用实施例19记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制、特性评价。结果示于表3。根据特性评价的结果知晓，对于本核酸脂质粒子，mRNA的95％以上在脂质粒子内包封，具有约180nm的平均粒径。
[实施例21～30]应用实施例6记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制
(1)mRNA包封核酸脂质粒子的配制
将二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、二乙酸(7R，9Z，26Z，29R)-18-({[3-(二甲基氨基)丙氧基]羰基}氧基)三十五-9，26-二烯-7，29-二基(LP)、和聚乙二醇分子量是约2000的1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)以表4中记载的摩尔比溶解于乙醇，使得成为总脂质浓度5mM。
另一方面，用柠檬酸缓冲液(20mM柠檬酸缓冲液，pH4.0)稀释配制实施例6中得到的mRNA。
应用NanoAssemblr BenchTop(Precision Nanosystems Inc.)在微流路内混合上述脂质溶液和mRNA溶液，使得针对mRNA的总脂质重量比成为表4中记载的值，并且其体积比成为1∶3，得到核酸脂质粒子的粗分散液。通过用约25～50倍量的缓冲液透析核酸脂质粒子的分散液12～18小时(Float-A-Lyzer G2，MWCO：1,000kD，Spectra/Por)，进行乙醇除去，得到纯化mRNA包封核酸脂质粒子的分散液。
(2)mRNA包封核酸脂质粒子的特性评价
进行包含(1)中配制的核酸脂质粒子的分散液的特性评价。关于各自的特性评价的方法进行说明。
(2-1)mRNA的包封率
应用Quant-iT RiboGreen RNA测定试剂盒(Invitrogen)基于所附说明书测定mRNA的包封率。
即，在0.015％Triton X-100表面活性剂存在下和非存在下，定量核酸脂质粒子的分散液中的mRNA，通过下式算出包封率。
{([表面活性剂存在下的mRNA量]-[表面活性剂非存在下的mRNA量])/[表面活性剂存在下的mRNA量]}x100(％)
(2-2)mRNA与脂质的比率
用紫外可视分光光度计测定核酸脂质粒子的分散液中的mRNA量。在90％甲醇中稀释溶解核酸脂质粒子分散液，用紫外可视分光光度计(PerkinElmer公司制、LAMBDA(商标)465)测定核酸脂质粒子中的mRNA量。通过下式算出mRNA浓度。
{[260nm的吸光度]-[350nm的吸光度]}x40x稀释倍率(μg/mL)
用反相色谱测定核酸脂质粒子的分散液中的各脂质量(System：DIONEX UltiMate3000，Column：XSelect CSH C18(
Figure BDA0003943873540000361
3.5μm，3.0mm×150mm，)(Waters目录号186005263)，缓冲液A：0.2％甲酸，缓冲液B：0.2％甲酸，甲醇，(B％)：75-100％(0-6min)，100％(6-15min)，流速：0.45mL/min，温度：50℃，检测：Corona CAD(Charged AerosolDetector))。
通过下式算出针对mRNA的总脂质量的比率。
[总脂质浓度]/[mRNA浓度](wt/wt)
(2-3)平均粒径
核酸脂质粒子的粒径用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)测定。表中的平均粒径表示体积平均粒径，±以下表示偏差。
特性评价的结果示于表5。知晓对于这些核酸脂质粒子，mRNA的95％以上在脂质粒子内包封，具有约90nm至约140nm的平均粒径。
[实施例31]突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA的配制
关于具有表6中记载的突变的RBD，制备SARS-CoV-2 RBD mRNA。表7中的实施例编号后的符号如表6中记载的与各自的突变型对应。例如，实施例32-a表示实施例32中得到的、包封了具有南非型突变的mRNA的核酸脂质粒子。
(1)突变型SARS-CoV-2 RBD的体外转录(IVT)用模板DNA的制备
为了制备体外翻译(IVT)中应用的模板DNA，将突变型SARS-CoV-2 RBD DNA通过PCR扩增后纯化。将包含T7启动子序列、人β-珠蛋白的5’-UTR序列、KOZAK序列、SARS-CoV-2S蛋白的信号序列、突变型SARS-CoV-2 RBD、人β-珠蛋白的3’-UTR序列按顺序连接的序列的DNA片段(序列编号38)导入质粒(pUC57mini-突变型RBD)。向溶解10ng该质粒的无核酸酶水(566.4μL)加入10×Buffer for KOD-Plus-Ver.2(80μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)、2mMdNTP mix(80μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)、25mM MgSO4(48μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)、50μM正义引物(4.8μL、序列编号2)、50μM反义引物(4.8μL、序列编号3)、KOD Pluspolymerase(16μL、东洋纺(株)目录号KOD-211)，在98℃温育15秒后，将98℃、5秒、55℃、15秒、68℃、1分钟实施20个循环，进一步在68℃温育1分钟，扩增RBD DNA。反应后用Wizard SVGel and PCR Clean-Up System(Promega目录号A9281)纯化模板DNA(序列编号52)。
分别应用序列编号39～41、43、48～51的DNA片段替代DNA片段(序列编号38)，通过同样的方法，分别得到序列编号53～55、57、62～65的模板DNA。
(2)通过体外转录的突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA的配制
应用实施例31-(1)中得到的模板DNA(序列编号52)替代实施例1-(1)中得到的模板DNA，用与实施例1-(2)同样的方法得到mRNA。
得到的mRNA具有序列编号66的序列。通过LabChip GX Touch Standard RNA试剂盒分析，确认为目标长度。
分别应用序列编号53～55、57、62～65的模板DNA替代模板DNA(序列编号52)，通过同样的方法，分别得到序列编号67～69、71、76～79的mRNA。
[实施例32]应用实施例31记载的SARS-CoV-2 RBD mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子 的配制
用与实施例8同样的方法，实施应用实施例31记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制、特性评价。结果示于表7。
根据特性评价的结果知晓，对于这些核酸脂质粒子，mRNA的95％以上在脂质粒子内包封，具有约110nm至约130nm的平均粒径。
[实施例33]应用实施例6记载的SARS-CoV-2 RBD mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子 的配制
用与实施例8同样的方法，实施应用实施例6记载的mRNA的mRNA包封核酸脂质粒子的配制、特性评价。结果示于表7。
根据特性评价的结果知晓，对于本核酸脂质粒子，mRNA的95％以上在脂质粒子内包封，具有约110nm的平均粒径。
[表3]
Figure BDA0003943873540000381
[表4]
Figure BDA0003943873540000382
[表5]
Figure BDA0003943873540000391
[表6]
突变型名称 突变部位 序列符号
南非型 K417N，E484K，N501Y a
英国型 N501Y b
巴西型 K417T，E484K，N501Y c
加利福尼亚型 L452R d
印度型 L452R，E484Q e
南非C538S型 K417N，E484K，N501Y，C538S f
英国C538S型 N501Y，C538S g
巴西C538S型 K417T，E484K，N501Y，C538S h
加利福尼亚C538S型 L452R，C538S i
印度C538S型 L452R，E484Q，C538S j
组合突变型(1) N439K，L452R，A475V，V483A k
组合突变型(2) S477R，F490L l
组合突变型(3) K417N，S477R，E484K，N501Y m
组合突变型(4) F486S，F490L n
[表7]
Figure BDA0003943873540000401
[试验例1]
施用(图2-图4)
在1～4％(v/v)的气化异氟烷麻醉下，向小鼠的后肢小腿部施用被验物质。3次施用试验在初次施用起7天后和21天后追加施用(第1次施用时：右后肢、第2次施用时：左后肢、第3次施用时：右后肢)，2次施用试验在初次施用起13天后追加施用(第1次施用时：右后肢、第2次施用时：左后肢)。以每1次3μg mRNA/20μL/机体、或1μg mRNA/20μL/机体施用被验物质(在图2-图4中，分别记载为实施例编号3、实施例编号1。例如，图2-图4的实施例3_3的记载意味着以3μg mRNA/20μL/机体施用实施例3的粒子的组)。配制施用液的缓冲液应用含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液、pH6.5。添加了市售皂苷佐剂(Quil-A Adjuvant、Invivogen、目录号vac-quil)的S1蛋白(Sino Biological、目录号40591-V08H)设定为抗RBD抗体应答的阳性对照组(S1/Quil-A群)。以每1次1μg S1和10μg Quil-A/20μL/机体施用S1蛋白和Quil-A。
血清和脾细胞的配制
被验物质施用时从尾静脉得到的血液在加入血清分离剂(BD、目录号365967)的管中回收，离心分离后(15,000rpm、4℃、5分钟、离心机：TOMY、MX-205)回收血清。3次施用试验的最终施用起14天后从心脏得到的血液在管中回收在室温静置3小时，其后用设定为4℃的冰箱静置22小时后，离心分离(1700×g、4℃、5分钟)回收血清。此外，从在异氟烷麻醉下放血致死的小鼠采集脾，应用细胞滤网(CORNING、目录号352350)配制细胞悬浮液后，应用ACK溶液(Lysing缓冲液、BD、目录号555899)进行溶血处理，配制脾细胞。
蛋白表达分析
向Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific、目录号A14527)添加实施例3或4的粒子，使得培养基中的mRNA浓度成为10μg/mL。此外，作为阴性对照，添加与实施例4的粒子的添加量等量的缓冲液。从添加起3天后回收培养上清和细胞团块。细胞团块用添加了1×蛋白酶/磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific、目录号78443)的M-PER(ThermoFisher Scientific、目录号78501)溶解，离心分离后(9100×g、4℃、10分钟)回收细胞裂解液。将用D-PBS稀释为810倍和2430倍的培养上清和稀释为10倍和30倍的细胞裂解液在96半孔板(Coaster、目录号3690)中固定，应用抗RBD抗体(Sino Biological、目录号40592-T62)通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法，检测通过实施例3或4的粒子表达的蛋白。
血中抗RBD抗体效价(图2-图4)
用封闭溶液(含有1％BSA、0.05％Tween 20的PBS)以0.25μg/mL向Ni板(QIAGEN、目录号35061)添加(50μL/孔)重组RBD蛋白(Sino Biological、目录号40592-V08H)，在室温静置2小时后，用洗涤液(含有0.05％Tween 20的PBS)以300μL/孔洗涤3次。应用封闭溶液从最高浓度的100倍稀释血清以4倍稀释制备8阶段的样本稀释系列。应用封闭溶液从最高浓度的2DS单位/mL以3倍稀释制备8阶段的标准血清稀释系列。添加样本稀释溶液和标准血清稀释溶液(50μL/孔)，在室温静置1小时后，用洗涤液洗涤3次。检测抗体在将HRP标记抗小鼠IgG抗体(Southern Biotech、目录号1030-05)用封闭溶液4000倍稀释、向板添加(50μL/孔)后，在室温静置1小时。用洗涤液洗涤3次后，添加(50μL/孔)TMB Microwell PeroxidaseSubstrate System(SERACARE Life Sciences、目录号5120-0047)，静置10分钟。反应终止液应用TMB终止液(SERACARE Life Sciences、目录号5150-0021、50μL/孔)。应用读板器测定波长450nm(对照波长540nm)的吸光度，将从在450nm测定的吸光度减去在540nm测定的吸光度的校正吸光度(Delta)在分析中应用。应用非线性回归：4参数从标准血清的抗RBD抗体浓度和Delta制成校准曲线。从校准曲线、测定样本的稀释倍率、和Delta算出样本的抗RBD抗体浓度。将Delta成为0.5～1.5的孔的抗体浓度的平均值作为测定样本的抗RBD抗体浓度算出。在样本最高浓度孔的Delta不足0.5的情形中，以20DS单位/mL代入作为数据。
RBD-hACE2结合抑制活性
向96半孔板(Coaster、目录号3690)添加10μg/mL链霉亲和素(Thermo FisherScientific、目录号21125、用PBS溶解)，在4℃静置过夜后，用洗涤液(含有0.05％Tween 20的PBS)洗涤3次。添加封闭溶液(含有1％BSA、0.05％Tween 20的PBS)，在室温静置1小时后，用洗涤液洗涤3次。其后，向板添加用封闭溶液配制的0.2μg/mL的重组RBD蛋白(AcroBiosystems、目录号SPD-C82E9)溶液，在室温静置1小时后，用洗涤液洗涤3次。向板添加用封闭溶液稀释20倍的小鼠血清，在室温静置1小时后，用洗涤液洗涤3次。向板添加用封闭溶液配制的1μg/mL的重组hACE2蛋白(Acro Biosystems、目录号AC2-H5257)溶液，在室温静置1小时后，用洗涤液洗涤3次。作为检测抗体，将HRP标记抗人IgG1抗体(CYGNUSTECHNOLOGIES、目录号IM50)用封闭溶液稀释500倍，向板添加后，在室温静置1小时。用洗涤液洗涤3次后，添加TMB Microwell Peroxidase Substrate System(SERACARE LifeSciences、目录号5120-0047)，静置10分钟。反应终止液应用TMB终止液(SERACARE LifeSciences、目录号5150-0021)。应用读板器测定分析波长450nm的吸光度。
SARS-CoV-2表位肽池
定制合成253个重叠肽(#1～#253)(Eurofins)使得覆盖SARS-CoV-2的S全长。每1个肽用200μL的二甲基亚砜(DMSO、Nacalai Tesque、目录号13408-64)溶解。等量混合#1～#62、#63～#107、#108～#253使得覆盖RBD及其前后的区，配制3个表位肽池(按顺序分别是Euro1、Euro2、Euro3)。此外，覆盖SARS-CoV-2的S全长的市售表位肽池(JPT、目录号PM-WCPV-S-1、2个小瓶、覆盖N末端区的肽池是JPT-N、覆盖C末端区的肽池是JPT-C)用每1小瓶40μL的DMSO溶解。
RBD特异性细胞免疫应答
将脾细胞用RPMI完全培养基(10％FBS[Sigma-Aldrich、目录号172012-500ML]、含有1％PS[青霉素-链霉素混合液、Nacalai Tesque、目录号26253-84]、1mM丙酮酸钠[ThermoFisher Scientific、目录号11360-070]、10mM HEPES[Thermo Fisher Scientific、目录号15630080]、1×StemSure[富士胶片和光纯药、目录号195-15791]、1×MEM非必需氨基酸溶液[Thermo Fisher Scientific、目录号11140-050])配制为1×107个细胞/mL，在U底96孔板中接种。向脾细胞添加用RPMI完全培养基配制为最终浓度0.1％(v/v)的表位肽池Euro1～3溶液和配制为最终浓度0.025％(v/v)的市售表位肽池JPT-N和JPT-C，在37℃、5％CO2的条件下培养48小时。应用小鼠IFN-γDuoSet ELISA(R&D Systems、目录号DY485)和小鼠IL-13Duoset ELISA(R&D systems、目录号DY413)测定细胞培养上清中的IFN-γ和IL-13细胞因子量。应用读板器测定波长450nm(对照波长540nm)的吸光度，将从在450nm测定的吸光度减去在540nm测定的吸光度的校正吸光度(Delta)在分析中应用。应用非线性回归：4参数从标准溶液的细胞因子浓度和Delta值制成校准曲线，根据校准曲线算出测定样本的细胞因子浓度。在IL-13浓度不足0.000(＜0.000)的情形中，将截止值0.005代入作为数据。
统计分析
关于血中抗RBD抗体应答和RBD-hACE2结合抑制活性的比较，3次施用试验实施t检验，2次施用试验以缓冲液组作为对照实施Dunnett检验。RBD特异性细胞免疫应答的比较以S1/Quil-A组作为对照，关于各肽处理实施Dunnett检验。全部分析中使用SAS ver.9.2。
向小鼠施用(图5-图9、图25-图28)
在1～4％(v/v)的气化异氟烷麻醉下，以2周间隔2次(图5)或以3周间隔2次(图6-9、图25、图26、和图28)、向BALB/c小鼠(图5-图8、图25、图26、和图28)或C57BL/6小鼠(图9)的后肢小腿部施用被测物。图27是向BALB/c小鼠的后肢小腿部仅施用1次被测物。被验物质每1次施用0.03、0.3、或3μg mRNA/20μL/机体(例如，图5的实施例80.03的记载意味着以0.03μg mRNA/20μL/机体施用实施例8的粒子的组)。图25和图27是每1次施用2μg mRNA/20μL/机体，图26和图28是每1次施用3μg mRNA/20μL/机体。配制施用液的缓冲液应用含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液、pH7.0。
向猴施用(图29)
以2周间隔3次、向食蟹猴的上臂三角肌施用实施例10。实施例10是每1次施用50μgmRNA/200μL/机体。配制施用液的缓冲液应用含有300mM蔗糖的10mM组氨酸缓冲液、pH7.0。
血中抗RBD抗体效价(图5、图6、图9、和图25-图27)
向ELISA板添加25μL/孔链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific Inc.)固相液，用设定为4℃的冰箱静置过夜。应用洗板机(AMW-96SX、Biotech株式会社)用洗涤缓冲液洗涤3次(180μL/孔)，添加1％BSA/PBST(150μL/孔)，通过在室温静置1小时以上进行封闭。应用洗板机用洗涤缓冲液(180μL/孔)洗涤3次后，添加RBD溶液(原始株RBD：AcroBiosystems、目录号SPD-C82E9、351株RBD：Sino Biological、目录号40592-V08H85-B)(25μL/孔)，在室温静置1小时以上。应用洗板机用洗涤缓冲液(180μL/孔)洗涤3次后，添加测定样本梯度稀释液和标准血清梯度稀释液(图5、图6、图9、图25、图26)(25μL/孔)，在室温静置1小时以上。作为图27的标准样本，应用与原始来源RBD和B.1.351株来源RBD同等地结合的抗RBD抗体(克隆编号3)的梯度稀释液。应用洗板机用洗涤缓冲液洗涤3次(180μL/孔)后，添加HRP标记抗小鼠IgG抗体(Southern Biotech、目录号1030-05)检测抗体稀释液(25μL/孔)后，在室温静置1小时。用洗涤液洗涤3次后，添加TMB Microwell Peroxidase SubstrateSystem(SERACARE Life Sciences、目录号5120-0047)(30μL/孔)，静置10分钟。反应终止液应用TMB终止液(SERACARE Life Sciences、目录号5150-0021、30μL/孔)。应用读板器测定波长450nm(对照波长540nm)的吸光度，将从在450nm测定的吸光度减去在540nm测定的吸光度的校正吸光度(Delta)在分析中应用。应用非线性回归：4参数从标准血清的抗RBD抗体浓度和Delta制成校准曲线。从校准曲线、测定样本的稀释倍率和Delta算出样本的抗RBD抗体浓度。
血中抗SARS-CoV-2中和活性(图7和图8)
在板中接种VeroE6细胞，用设定为37±2℃、5±1％的CO2浓度的培养箱培养过夜。混合小鼠血清的稀释系列和SARS-CoV-2WA1/2020株，在设定为37±2℃、5±1％的CO2浓度的培养箱内静置2～2.5小时。其后，向VeroE6细胞添加小鼠血清和SARS-CoV-2WA1/2020株的混合液，在设定为37±2℃、5±1％的CO2浓度的培养箱内培养72±8小时。其后，应用CellTiter-Glo(Promega)测定活细胞量，算出小鼠血清的抗SARS-CoV-2中和活性滴度。
RBD特异细胞免疫应答图(图10)
将脾细胞用RPMI完全培养基配制为1×107个细胞/mL，在U底96孔板中接种。向脾细胞添加用RPMI完全培养基配制为最终浓度0.1％(v/v)的RBD的MHC II类表位肽池，在37℃、5％CO2的条件下培养48小时。应用小鼠IFN-γDuoSet ELISA和小鼠IL-13Duoset ELISA测定细胞培养上清中的IFN-γ和IL-13细胞因子量。应用读板器测定波长450nm(对照波长540nm)的吸光度，将从450nm的吸光度减去在540nm测定的吸光度的值在分析中应用。应用非线性回归：4参数从标准溶液的细胞因子浓度和测定值制成校准曲线，从校准曲线算出测定样本的细胞因子浓度。
统计分析
关于图5所示血中抗RBD抗体应答，0.03μg mRNA/机体和0.3μg mRNA/机体的各用量的2组间比较实施Wilcoxon检验。关于3μg mRNA/机体用量的3组间的比较，以实施例8作为比较对照实施Steel检验。
关于图6所示血中抗RBD抗体应答，0.03μg mRNA/机体、0.3μg mRNA/机体、和3μgmRNA/机体的各用量的2组间比较实施Wilcoxon检验。
关于图7所示血中抗SARS-CoV-2中和活性，以缓冲液组作为比较对照实施Steel检验。关于图8的2组间比较，实施Wilcoxon检验。
关于图9所示血中抗RBD抗体应答，以缓冲液组作为比较对照实施Steel检验。
关于图10所示RBD特异性细胞免疫，实施Steel-Dwass检验。
全部分析中使用SAS ver.9.2。
RBD-hACE2结合抑制活性(图28)
向96半孔板添加抗His标签抗体(Wako Pure Chemical Industries、目录号017-23211)，在4℃静置过夜后，用洗涤液(含有0.05％Tween 20的PBS)洗涤3次。添加封闭溶液(含有1％BSA、0.05％Tween 20的PBS)，在室温静置1小时后，用洗涤液洗涤3次。其后，向板添加用封闭溶液配制的0.2μg/mL的重组RBD蛋白(对照：Acro Biosystems、目录号SPD-S52H6、原始：Sino Biological、目录号40592-V08H、K417N：Sino Biological、目录号40592-V08H59、E484K：ACRO Biosystems、目录号SRD-C52H3、N501Y：Sino Biological、目录号40592-V08H82、K417N/E484K/N501Y：ACRO Biosystems、目录号SPD-C52Hp)溶液，在室温静置1小时后，用洗涤液洗涤3次。向板添加用封闭溶液稀释的小鼠血清稀释系列，在室温静置1小时后，用洗涤液洗涤3次。向板添加用封闭溶液配制的1μg/mL的重组hACE2蛋白(AcroBiosystems、目录号AC2-H5257)溶液，在室温静置1小时后，用洗涤液洗涤3次。作为检测抗体，将HR标记抗人IgG1抗体(CYGNUS TECHNOLOGIES、目录号IM50)用封闭溶液稀释500倍，向板添加后，在室温静置1小时。用洗涤液洗涤3次后，添加TMB Microwell PeroxidaseSubstrate System(SERACARE Life Sciences、目录号5120-0047)，静置10分钟。反应终止液应用TMB终止液(SERACARE Life Sciences、目录号5150-0021)。应用读板器测定波长450nm(对照波长540nm)的吸光度，将从在450nm测定的吸光度减去在540nm测定的吸光度的校正吸光度(Delta)在分析中应用。数据表示显示50％抑制的小鼠稀释倍率(IC50)。
血中抗SARS-CoV-2中和活性(图29)
向板接种Vero-TMPRSS2细胞。混合猴血浆的稀释系列和100TCID50的SARS-CoV-2株(D614G：HP095、B.1.1.7系统株：QHN001、P.1系统株：TY7-501、B.1.351系统株：TY8-612)，在CO2培养箱内静置。其后，向Vero-TMPRSS2细胞添加猴血浆和SARS-CoV-2的混合液，在CO2培养箱内培养3天。其后，将未见细胞变性效果(CPE)的最高稀释倍率作为中和抗体效价算出。
结果
实施例4的RBD蛋白表达诱导能力
本发明的核酸脂质粒子疫苗的作用机制提示，向生物体内施用后，从编码抗原基因的mRNA产生抗原蛋白，诱导针对抗原的特异性免疫应答。推测对于本发明的核酸脂质粒子疫苗的药效，作为有效成分的mRNA向组织和细胞内的递送和从mRNA的翻译是重要的要素。以综合评价该一系列要素为目的，应用培养细胞以抗原蛋白的表达诱导能力为指标评价滴度。向Expi293F细胞添加实施例3的粒子、实施例4的粒子、或缓冲液，通过ELISA法定量3天后的培养上清中和细胞内表达的RBD蛋白。结果示于图1。通过实施例4的粒子表达的RBD蛋白在培养上清中和细胞内见到。通过实施例3的粒子表达的S全长蛋白仅在细胞内见到。
血中抗RBD抗体应答
评价通过实施例3或实施例4的粒子的施用诱导的血中抗RBD抗体应答。结果示于图2。与实施例3的2次施用组和3次施用组相比，实施例4的3次施用组的血中抗RBD抗体效价高(P＝0.0346)。此外，与缓冲液组相比，实施例4的2次施用组的血中抗RBD抗体效价高(实施例4_3；P＝0.0019、实施例4_1；P＝0.0313)。
RBD-hACE2结合抑制活性
评价通过实施例3或实施例4的粒子的施用诱导的RBD-hACE2结合抑制活性。结果示于图3。与实施例3的2次施用组和3次施用组相比，实施例4的3次施用组的血清的RBD-hACE2结合抑制活性高(P＝0.0005)。此外，与缓冲液组相比，实施例4的2次施用组的血清的RBD-hACE2结合抑制活性高(实施例4_3；P＜0.0001、实施例4_1；P＝0.0006)。
RBD特异性细胞免疫应答
配制脾细胞，评价来自培养脾细胞的RBD特异性细胞免疫应答。结果示于图4。与S1/Quil-A组相比，实施例4组相对于覆盖RBD的Euro2和JPT-N表位肽池处理的IFN-γ产生水平高(P＜0.001)。另一方面，与S1/Quil-A群组相比，实施例4组相对于Euro2和JPT-N表位肽池处理的IL-13产生水平低(P＜0.005)。根据该结果得知，本发明的核酸脂质粒子疫苗诱导Th1型为优势的免疫应答。
BALB/c小鼠中的血中抗RBD抗体应答
评价通过实施例8或实施例4的粒子的施用诱导的血中抗RBD抗体应答。结果示于图5。在0.03μg mRNA/机体和0.3μg mRNA/机体的各用量中，与实施例4比较，实施例8的血中抗RBD抗体效价高(都是P＝0.0286)。此外，在3μg mRNA/机体的用量中，实施例4、实施例7、和实施例8的血中抗RBD抗体效价中未见显著差异(都是P＝0.061)。
评价通过实施例10或实施例8的粒子的施用诱导的血中抗RBD抗体应答。结果示于图6。在任一用量中，在实施例10和实施例8的血中抗RBD抗体效价中都未见显著差异(0.03μg mRNA/机体：P＝0.8413、0.3μg mRNA/机体：P＝0.0952、3μg mRNA/机体：P＝0.6905)。
血中抗SARS-CoV-2中和活性
评价通过实施例10的粒子的施用诱导的血中抗SARS-CoV-2中和活性。结果示于图7。与缓冲液组比较，施用3μg mRNA/机体实施例10的组的血中抗SARS-CoV-2中和活性高(P＝0.0374)。此外，比较通过实施例8和实施例10的粒子的施用诱导的血中抗SARS-CoV-2中和活性的结果，未见显著差异(图8、P＝1)。
C57BL/6小鼠中的血中抗RBD抗体应答
评价通过实施例8或实施例10的粒子的施用诱导的血中抗RBD抗体应答。结果示于图9。在3μg mRNA/机体和10μg mRNA/机体的各用量中，与缓冲液组比较，实施例8和实施例10的血中抗RBD抗体效价高(实施例10的2个用量都是P＜0.05)。
RBD特异性细胞免疫应答
配制脾细胞，评价来自培养脾细胞的RBD特异性细胞免疫应答。结果示于图10A。与向0.1μg/机体的RBD蛋白添加100μg/机体的明矾佐剂的组比较，施用3μg/机体的实施例10的组显示高IFN-γ诱导(P＜0.05)。此外，与向0.1μg/机体的RBD蛋白添加100μg/机体的明矾佐剂的组比较，施用0.03μg/机体和3μg/机体的实施例10的组显示高IFN-γ诱导(都是P＜0.05)。
为了评价实施例10的Th细胞谱，分析IFN-γ水平/IL-5水平比和IFN-γ水平/IL-13水平比。结果示于图10B。与添加明矾佐剂的RBD蛋白组比较，实施例10显示高IFN-γ水平/IL-13水平比(相对于添加明矾佐剂的RBD蛋白的2组，实施例10的3组都是P＜0.05)。根据该结果得知，本发明的核酸脂质粒子疫苗诱导Th1型为优势的免疫应答。
BALB/c小鼠中的血中抗RBD抗体应答(图25-图27)
评价通过实施例10、12、14、16、18、或实施例20的粒子的施用诱导的血中抗RBD抗体应答。结果示于图25。都与缓冲液组比较显示高的血中抗RBD抗体水平。
评价通过实施例10或实施例21-30的粒子的施用诱导的血中抗RBD抗体应答。结果示于图26。在任一粒子中，都见到与缓冲液组比较高的血中抗RBD抗体效价。
评价通过实施例10、32a、32b、32c、32d、32f、或实施例33的粒子的施用诱导的血中抗RBD抗体应答。结果示于图27。与实施例32a比较，实施例10、32b、32c、32d、32f、和实施例33显示高的血中抗RBD抗体水平。
RBD-hACE2结合抑制活性(图28)
评价通过实施例10的粒子诱导的RBD-hACE2结合抑制活性。结果示于图28。与对照RBD比较，原始的RBD、K417N、E484K、N501Y、或K417N/E484K/N501Y的RBD突变体与hACE2的结合被实施例10组的血清相同程度地抑制。
血中抗SARS-CoV-2中和活性(图29)
评价通过实施例10的粒子诱导的血中抗SARS-CoV-2中和活性。结果示于图29。D614G株、B.1.1.7系统株、P1系统株、和B.1.351系统株对Vero-TMPRSS2细胞的感染被实施例10组的血清相同程度地中和。
[试验例2]
编码SARS-CoV-2 RBD的LNP-mRNA疫苗候选物的优化
发生重症急性呼吸器官综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒传染病(COVID-19)的大流行，编码SARS-CoV-2刺突蛋白的全长的2种mRNA疫苗已上市(1，2)。但是，关于发热等副反应残留应改善的方面。
关于将编码SARS-CoV-2刺突蛋白中包含的受体结合结构域(RBD：受体结合结构域)的mRNA包封在脂质纳米粒子(LNP)中的mRNA疫苗候选物(LNP-mRNA-RBD)，我们以免疫原性为指标进行优化。
首先，向6～8周龄的C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠，以2周间隔2次肌肉内施用以mRNA换算3μg的LNP-mRNA-RBD，评价血中抗RBD抗体反应。其结果，与C57BL/6小鼠比较，BALB/c小鼠显示高的血中抗RBD抗体反应(图11a、图15)。为了在小鼠系统间比较通过LNP-mRNA-RBD诱导的RBD特异性B细胞应答，通过流式细胞术分析LNP-mRNA-RBD施用小鼠的胭窝淋巴结(pLN)中的TFH和GC B细胞(图16)。其结果，与血中抗RBD抗体应答相关，对于pLN中的TFH(CD4+CD185+PD-1+细胞)和GC B细胞(CD38-GL7+CD19+细胞)，与C57BL/6小鼠比较，LNP-mRNA-RBD施用BALB/c小鼠中更高(图11b-e)。
为了分析通过LNP-mRNA-RBD诱导的抗原特异性CD8+和CD4+T细胞，设计刺突蛋白的肽文库。该肽文库由128个设计为10个氨基酸重复的20个氨基酸的肽组成。将该肽文库以16个肽为1个池肽分为总计8个池肽(图11f)。用池肽3和4处理从LNP-mRNA-RBD施用小鼠配制的脾细胞时，C57BL/6小鼠脾细胞诱导IFN-γ产生，BALB/c小鼠脾细胞用肽池3处理确认产生IFN-γ(图11g和h、图17a和b)。IL-13不诱导C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠的任一的脾细胞(图17c和d)。为了分析通过LNP-mRNA-RBD施用诱导的抗原特异性T细胞，用池肽2、3或4处理脾细胞，用流式细胞术分析产生3个细胞因子(IL-2、IFN-γ、和TNF-α)的T细胞。其结果，刺突抗原特异性多功能性CD8+和CD4+T细胞在用池肽3和4处理的BALB/c小鼠脾细胞中见到(图11h、图18b和19b)。在C57BL/6小鼠脾细胞中，显示多功能性CD8+T细胞和弱的CD4+T细胞应答(图11g、图18a和19a)。根据这些数据提示，与C57BL/6小鼠比较，施用了LNP-mRNA-RBD的BALB/c小鼠可诱导高的B细胞和T细胞应答。
报告了对于应用核酸的疫苗，DNA或RNA作为内源性佐剂起作用(14-16)。报告了在LNP-mRNA疫苗中，mRNA被toll样受体(toll-like receptor、TLR)3、TLR7、TLR8、RIG-I、或MDA5识别，作为内源性佐剂起作用(17)。Kariko等人在自然免疫活化的控制和抗原蛋白的表达效率的改善中使用甲基化碱基和其它修饰碱基(例如，假尿苷等)(18，19)。在其它研究中，知晓通过LNP-mRNA诱导的I型IFN影响CD8+T细胞应答和抗原蛋白的表达效率(20，21，22)。与SARS-CoV-2疫苗有关，由于与编码刺突的全长的LNP-mRNA-Full组比较，LNP-mRNA-RBD组的副反应的频率更高，LNP-mRNA-Full已用第III期临床试验评价、上市(13)。与副反应的频率的差异有关的理由不明，我们认为可能涉及通过LNP-mRNA的自然免疫活化作用(13)。
为了分析通过LNP-mRNA的自然免疫活化作用，用ELISA测定来自处理LNP-mRNA-RBD的人PBMC的I型IFN产生水平。其结果，在3个健康人的PBMC中，与LNP-mRNA-Full比较，LNP-mRNA-RBD显示高的IFN-α诱导能力(图12a)。然后，应用C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠的骨髓衍生树突细胞(BM-DCs)，进行同样的实验。其结果，与BALB/c小鼠的BM-DCs比较，用LNP-mRNA-full或LNP-mRNA-RBD处理的C57BL/6小鼠的BM-DCs显示高的IFN-α产生(图12b)。在LNP-mRNA中包封的mRNA的制备过程中，包含作为污染物的RNA、例如作为TLR3配体的双链RNA等，显示这可活化自然免疫(22)。因而，为了除去起因于RNA制备的污染物，将mRNA HPLC纯化，制备包封了HPLC纯化的mRNA的LNP-mRNA(mRNA-RBD(HPLC))。其结果，与LNP-mRNA-RBD比较，来自用mRNA-RBD(HPLC)处理的人PBMC和小鼠BM-DC的I型IFN产生显著减少(图12a和b)。
向C57BL/6或BALB/c小鼠施用mRNA-RBD(HPLC)，评价免疫原性。其结果，对于mRNA-RBD(HPLC)组，在BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠两者中，增强血中抗RBD IgG1效价、IgG2效价、和总IgG效价(图12c和图20a)。此外，与LNP-mRNA-RBD组比较，施用mRNA-RBD(HPLC)的C57BL/6小鼠的pLN的GC B细胞被多数诱导(图12d和e)。进一步，与LNP-mRNA-RBD组比较，在mRNA-RND(HPLC)组中，RBD特异性产生IFN-γ和其它I型细胞因子的多功能性CD8+和CD4+T细胞被多数诱导(图12f-i、和图20b-e、21、22)。
在作为非人灵长类(NHP)的食蟹猴模型中，评价mRNA-RBD(HPLC)疫苗对SARS-CoV-2的感染防御效果。在本研究中，将2只猴作为阴性对照组，向4只猴肌肉内施用mRNA-RBD(HPLC)。其结果，与阴性对照组比较，mRNA-RBD(HPLC)组显示高的抗RBD抗体应答(图13b)。此外，mRNA-RBD(HPLC)组也显示血中抗SARS-CoV-2中和活性(图13c)。进一步，与阴性对照组比较，mRNA-RBD(HPLC)组显示结膜、鼻腔、口腔、气管、直肠的粘膜组织中高的抗RBDIgG应答(图13d)。
mRNA-RBD(HPLC)组在SARS-Co-2感染后第1天，急剧降低拭子中的SARS-CoV-2(图14a)和病毒RNA(图14b)。此外，在感染后第7天，mRNA-RBD(HPLC)组的气管、支气管、肺的病毒RNA也降低(图14c、图25)。进一步，阴性对照组显示SARS-CoV-2感染后的发热和肺炎(图23、24)。
进行SARS-CoV-2感染后的肺的组织分析时，阴性对照组中见到淋巴细胞和中性粒细胞的浸润，还确认了肺胞壁的肥厚和病毒抗原，mRNA-RBD(HPLC)组中未确认这些现象(图14d、14e)。此外，在mRNA-RBD(HPLC)组中，确认形成了支气管相关淋巴组织(bronchus-associated lymphoid tissue：BALT)(图14d)。这些结果提示，鼻腔粘膜和气管粘膜等粘膜中经由BLAT的形成诱导的抗体通过与SARS-CoV-2结合而中和，作为其结果，可减少感染后第1天的拭子中的病毒RNA和感染性病毒。
材料和方法
小鼠
从日本的CLEA公司购入6～8周龄的C57BL/6和BALB/c小鼠。小鼠在无特定病原体的条件下养育。所有的小鼠试验得到东京大学医学研究所动物实验委员会的认可。
食蟹猴
使用出生于滋贺医科大学、原产于菲律宾、越南和中国的7～10岁雌性食蟹猴。所有的处置在氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉下进行，努力将疼痛降至最低。在从麻醉恢复后1日1次给予CMK-2(CLEAJapan株式会社、东京、日本)的食物团块，自由摄取饮水。动物在光受控的条件(12小时明/12小时暗循环、上午8点开灯)下单独容纳在笼内。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下，用移液器和导管向结膜(0.05mL×2)、鼻孔(0.5mL×2)、口腔(0.9mL)和气管(5mL)，向猴接种SARS-CoV-2(2×107pFU/7mL HBSS)。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下，使用2条棉签(荣研化学株式会社、东京、日本)，采集来自结膜、鼻腔、口腔和气管的体液样品后，将棉签浸入包含0.1％牛血清白蛋白(BSA)和抗生素的1mL Dulbecco修饰Eagle培养基(DMEM、NacalaiTesque、京都、日本)。应用支气管镜(MEV-2560；町田内视镜株式会社、东京都)和细胞诊断用刷(BC-203D-2006；Olympus株式会社、东京都)采集支气管样品。
LNP-mRNA疫苗
使用实施例10的mRNA包封核酸脂质粒子。
试剂
将刺突蛋白的重叠20-aa肽合成、从Eurofins Genomics(Ebersberg，Germany)购入。SARS-CoV-2刺突蛋白(ECD)和RBD从GenScript(Piscataway，NJ，USA)购入。
病毒
在包含0.3％牛血清白蛋白(BSA)和1μg的L-1-甲苯磺酰氨基-2-苯乙基氯甲基酮(TPCK)处理胰蛋白酶/mL的Opti-MEM I(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，在37℃VeroE6细胞中使SARS-CoV-2分离株增殖。
免疫的方法
在第0天和第14天，用模拟物、LNP-mRNA-RBD(3μg)或LNP-mRNA-RBD(HPLC)(3μg)肌肉内免疫6～8周龄的C57BL/6和BALB/c小鼠。从第2次免疫化起2周后，采集胭窝淋巴结、脾和血液。在第0天和第21天，用模拟物或LNP-mRNA-RBD(HPLC)(100μg)肌肉内免疫食蟹猴。采血在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天进行。
ELISA法
用ELISA测定ECD和RBD特异性抗体效价。简言之，在碳酸氢盐缓冲液中在4℃用ECD(1μg/mL)或RBD(1μg/mL)包被半面积96孔板。用包含1％BSA的PBS在室温封闭板60分钟。用PBST洗涤板3次，在室温温育稀释的血浆或拭子样品120分钟。用PBST洗涤板3次，与HRP标记山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2c、或小鼠抗猴IgG在室温温育120分钟。用PBST洗涤3次后，加入TMB底物缓冲液，在室温温育10分钟。其后，添加1N H2SO4停止反应。应用分光光度计，测定450nm和540或560nm的OD值。将OD450-OD540或OD450-OD560成为0.2的血浆稀释的倒数值作为抗体效价。
用肽池1～8、ECD、和RBD蛋白刺激免疫化小鼠的脾细胞的单细胞悬浮液24小时。用ELISA(R&D)测定上清中的IFN-γ和IL-13水平。
GC B细胞和TFH染色
用LIVE/DEAD Aqua、抗CD279(29F.1A12)、抗CD8a(53-6.7)、抗CD3e(145-2C11)、抗GL7(GL7)、抗CD4(RM4-5)、抗CD185(L138D7)、抗CD38(90)、和抗CD19(6D5)抗体对胭窝淋巴结的单细胞悬浮液染色。所有抗体从BioLegend，San Diego，CA，USA购入。用流式细胞仪分析GC B细胞和TFH细胞的比例。
细胞因子的细胞内染色试验
将脾细胞的单细胞悬浮液与蛋白输送抑制剂(eBioscience，San Diego，CA，USA)共同用肽池2、3、4刺激6小时。刺激后，用LIVE/DEAD Aqua对死细胞染色。洗涤后，用抗CD8a(53-6.7)、抗CD4(RM4-5：Invitrogen)、抗TCRβ(H57-597)、抗F4/80(RM8)、抗TER-119(TER-119)、抗CD11b(M1/70)、抗CD19(6D5)、抗CD11c(N418)、抗NK-1.1(PK136)、抗CD45R/B220(RA3-6B2)抗体对细胞染色。除非另有记载，所有抗体从BioLegend购入。固定后，用抗IFN-γ(XMG1.2)、抗IL-2(JES6-5H4)、抗TNF-α(MP6-XT22)、抗CD3(17A2)抗体对通过IC固定缓冲液(eBioscience公司)的透过性、细胞内细胞因子、CD3染色。所有抗体从BioLegend购入。通过流式细胞仪确定产生细胞因子的CD8+和CD4+T细胞的比例。
人外周血单核细胞的配制和刺激
外周血单核细胞(PBMC)是得到来自未感染SARS-CoV-2的3名健康成年志愿者的知情同意获得的。应用人PBMC的所有实验得到东京大学医学研究所的伦理审查委员会的认可。应用Ficoll Histopaque配制PBMC后，应用LNP-mRNA-Full(0.4、2、10μg/mL)、LNP-mRNA-RBD(0.4、2、10μg/mL)、或LNP-mRNA-RBD(HPLC)(0.4、2、10μg/mL)刺激24小时，应用ELISA(Mabtech、Stockholm，Sweden)测定培养上清中的IFN-α水平。
骨髓衍生树突细胞和刺激
将骨髓衍生树突细胞(BM-DC)用小鼠GM-CSF培养7天使其分化。用LNP-mRNA-Full(0.4、2、10μg/mL)、LNP-mRNA-RBD(0.4、2、10μg/mL)、或LNP-mRNA-RBD(HPLC)(0.4、2、10μg/mL)刺激细胞24小时，应用ELISA(Invitrogen)测定培养上清中的IFN-α。
中和抗体效价
将35微升的病毒(140组织培养感染用量50)与35μL的2倍系列稀释的血清共同在室温温育1小时，将其混合物50μL添加于96孔板中的汇合VeroE6/TMPRS2细胞，在37℃温育1小时。添加包含5％FCS的50μL DMEM后，进一步在37℃温育细胞3天。在倒置显微镜下观察病毒细胞病理效果(CPE)，将病毒中和滴度确定为完全防止CPE的最高血清稀释的倒数(24)。
对SARS-CoV-2应用VeroE6/TMPRSS2的病毒滴定
将表达TMPRSS2的汇合Vero E6细胞株(JCRB Cell Bank、日本)用稀释的拭子样品和10％w/v组织匀浆样品温育1小时。用HBSS洗涤细胞，用包含0.1％BSA的DMEM温育3天(25)。用显微镜监测病毒滴度，应用Reed-Muench法计算。
病毒RNA的实时RT-PCR
分别应用QIAmp病毒RNA Mini试剂盒和RNeasy Mini试剂盒采集来自拭子样品和组织(20mg)的病毒RNA。应用CFX-96(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)通过实时RT-PCR(2019-nCoV_N1-F，2019-nCoV_N1-R，2019-nCoV_N1-P，TaqMan Fast Virus 1-step Master Mix)测定病毒RNA。
体温
病毒接种2周前，在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下，将两台体温数据记录器(iButton、Maxim Integrated、圣何塞、加利福尼亚州)移植到各猴的腹腔或皮下组织，其后吸入异氟烷并监测体温。
X线
通过I-PACS系统(Komika Minolta)和PX-20BT(Kenko Tokina)拍摄肺的X线片。
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本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请原样作为参考引入本说明书。
产业上的可利用性
本发明可以在SARS-CoV-2引起的感染的预防和/或治疗中使用。
序列表自由文本
<序列编号1>(包含SARS-CoV-2 S全长的DNA片段)
Figure BDA0003943873540000581
Figure BDA0003943873540000591
Figure BDA0003943873540000601
Figure BDA0003943873540000611
<序列编号2>(正义引物)
GTAATACGACTCACTATAA
<序列编号3>(反义引物)
Figure BDA0003943873540000612
<序列编号4>(SARS-CoV-2 S-full的模板DNA)
Figure BDA0003943873540000613
Figure BDA0003943873540000621
Figure BDA0003943873540000631
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR(包含转录起始点和碱基编号89～94的KOZAK配列)：碱基编号19～88
Spike蛋白全长序列：碱基编号89～3910
3’-UTR：碱基编号3911～4042
polyA序列(A100)：碱基编号4043～4142
<序列编号5>(SARS-CoV-2 S-full mRNA-001)
Figure BDA0003943873540000632
Figure BDA0003943873540000641
Figure BDA0003943873540000651
<序列编号6>(SARS-CoV-2 S-full的氨基酸序列)
Figure BDA0003943873540000652
Figure BDA0003943873540000661
RBD序列：氨基酸编号319～541
<序列编号7>(包含的SARS-CoV-2 RBD DNA片段)
Figure BDA0003943873540000662
Figure BDA0003943873540000671
<序列编号8>(SARS-CoV-2 RBD的模板DNA)
Figure BDA0003943873540000672
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR(包含转录起始点和碱基编号89～94的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号9>(SARS-CoV-2 RBD mRNA-002)
Figure BDA0003943873540000681
<序列编号10>(SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(包含S蛋白信号序列))
Figure BDA0003943873540000682
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号11>(SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(不包含S蛋白信号序列))
Figure BDA0003943873540000691
<序列编号12>(S_opt2 EcoRI)
Figure BDA0003943873540000692
Figure BDA0003943873540000701
Figure BDA0003943873540000711
NheI序列：碱基编号1～6
T7启动子：碱基编号7～24
A：转录起始点：碱基编号25
5’-UTR(包含转录起始点和碱基编号89～94的KOZAK序列)：碱基编号25～94
Spike蛋白全长序列：碱基编号95～3916
3’-UTR：碱基编号3917～4048
EcoRI序列：碱基编号4049～4054
<序列编号13>(正义引物2)
TGATGCTAGCGTAATACGACTCACTATAAG
NheI序列：碱基编号5～10
<序列编号14>(反义引物2)
Figure BDA0003943873540000712
HindIII序列：碱基编号5～10
BspQI序列：碱基编号11～17
<序列编号15>(SARS-CoV-2 S全长优化的模板DNA)
Figure BDA0003943873540000713
Figure BDA0003943873540000721
Figure BDA0003943873540000731
Figure BDA0003943873540000741
NheI序列：碱基编号5～10
T7启动子：碱基编号11～28
A：转录起始点：碱基编号29
5’-UTR(包含转录起始点和碱基编号89～94的KOZAK序列)：碱基编号29～98Spike蛋白全长序列：碱基编号99～3920
3’-UTR：碱基编号3921～4052
polyA序列(A110)：碱基编号4053～4162
BspQI序列：碱基编号4164～4170
HindIII序列：碱基编号4171～4176
<序列编号16>(SARS-CoV-2 S全长优化的mRNA-003)
Figure BDA0003943873540000742
Figure BDA0003943873540000751
Figure BDA0003943873540000761
<序列编号17>(S_RBD_opt2 EcoRI)
Figure BDA0003943873540000762
Figure BDA0003943873540000771
NheI序列：碱基编号1～6
T7启动子：碱基编号7～24
A：转录起始点：碱基编号25
5’-UTR(包含转录起始点和碱基编号89～94的KOZAK序列)：碱基编号25～94
RBD序列：碱基编号95～805
3’-UTR：碱基编号806～937
EcoRI序列：碱基编号938～943
<序列编号18>(SARS-CoV-2 RBD优化的模板DNA)
Figure BDA0003943873540000772
Figure BDA0003943873540000781
NheI序列：碱基编号5～10
T7启动子：碱基编号11～28
A：转录起始点：碱基编号29
5’-UTR(包含转录起始点和碱基编号89～94的KOZAK序列)：碱基编号29～98
Spike蛋白信号序列：碱基编号99～137
RBD序列：碱基编号138～809
3’-UTR：碱基编号810～941
polyA序列(A110)：碱基编号942～1051
BspQI序列：碱基编号1053～1059
HindIII序列：碱基编号1060～1065
<序列编号19>(SARS-CoV-2 RBD优化的mRNA-004)
Figure BDA0003943873540000782
Figure BDA0003943873540000791
<序列编号20>SARS-CoV-2 RBD S2000的模板DNA
Figure BDA0003943873540000792
NheI序列：碱基编号1～6
T7启动子：碱基编号7～24
A：转录起始点：碱基编号25
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号89～94的KOZAK序列)：碱基编号25～94
Spike蛋白信号序列：碱基编号95～133
RBD序列：碱基编号134～805
3’-UTR：碱基编号806～937
polyA序列(A50)：碱基编号938～987
BspQI序列：碱基编号989～995
<序列编号21>SARS-CoV-2 RBD S2000的mRNA序列
Figure BDA0003943873540000801
<序列编号22>SARS-CoV-2 RBD S2001的模板DNA
Figure BDA0003943873540000802
Figure BDA0003943873540000811
NheI序列：碱基编号1～6
T7启动子：碱基编号7～24
A：转录起始点：碱基编号25
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号89～94的KOZAK序列)：碱基编号25～94
Spike蛋白信号序列：碱基编号95～133
RBD序列：碱基编号134～805
3’-UTR：碱基编号806～937
polyA序列(A50)：碱基编号938～987
BspQI序列：碱基编号989～995
<序列编号23>SARS-CoV-2 RBD S2001的mRNA序列
Figure BDA0003943873540000812
Figure BDA0003943873540000821
<序列编号24>SARS-CoV-2 RBD S2001的氨基酸序列(包含S蛋白信号序列)
Figure BDA0003943873540000822
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号25>SARS-CoV-2 RBD S2001的氨基酸序列(不包含S蛋白信号序列)
Figure BDA0003943873540000823
<序列编号26>SARS-CoV-2 RBD S2002的模板DNA
Figure BDA0003943873540000824
Figure BDA0003943873540000831
NheI序列：碱基编号1～6
T7启动子：碱基编号7～24
A：转录起始点：碱基编号25
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号89～94的KOZAK序列)：碱基编号25～94
Spike蛋白信号序列：碱基编号95～133
RBD序列：碱基编号134～736
3’-UTR：碱基编号737～868
polyA序列(A50)：碱基编号869～918
BspQI序列：碱基编号920～926
<序列编号27>SARS-CoV-2 RBD S2002的mRNA序列
Figure BDA0003943873540000832
Figure BDA0003943873540000841
<序列编号28>SARS-CoV-2 RBD S2002的氨基酸序列(包含S蛋白信号序列)
Figure BDA0003943873540000842
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～213
<序列编号29>SARS-CoV-2 RBD S2002的氨基酸序列(不包含S蛋白信号序列)
Figure BDA0003943873540000843
<序列编号30>SARS-CoV-2 RBD S2003的模板DNA
Figure BDA0003943873540000844
Figure BDA0003943873540000851
NheI序列：碱基编号1～6
T7启动子：碱基编号7～24
A：转录起始点：碱基编号25
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号89～94的KOZAK序列)：碱基编号25～94
Spike蛋白信号序列：碱基编号95～133
RBD序列：碱基编号134～874
3’-UTR：碱基编号875～1006
polyA序列(A50)：碱基编号1007～1056
BspQI序列：碱基编号1058～1064
<序列编号31>SARS-CoV-2 RBD S2003的mRNA序列
Figure BDA0003943873540000852
Figure BDA0003943873540000861
<序列编号32>SARS-CoV-2 RBD S2003的氨基酸序列(包含S蛋白信号序列)
Figure BDA0003943873540000862
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～259
<序列编号33>SARS-CoV-2 RBD S2003的氨基酸序列(不包含S蛋白信号序列)
Figure BDA0003943873540000863
<序列编号34>SARS-CoV-2 RBD S2004的模板DNA
Figure BDA0003943873540000864
Figure BDA0003943873540000871
NheI序列：碱基编号1～6
T7启动子：碱基编号7～24
A：转录起始点：碱基编号25
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号89～94的KOZAK序列)：碱基编号25～94
Spike蛋白信号序列：碱基编号95～133
RBD序列：碱基编号134～805
3’-UTR：碱基编号806～937
polyA序列(A50)：碱基编号938～987
BspQI序列：碱基编号989～995
<序列编号35>SARS-CoV-2 RBD S2004的mRNA序列
Figure BDA0003943873540000872
Figure BDA0003943873540000881
<序列编号36>SARS-CoV-2 RBD S2004的氨基酸序列(包含S蛋白信号序列)
Figure BDA0003943873540000882
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号37>SARS-CoV-2 RBD S2004的氨基酸序列(不包含S蛋白信号序列)
Figure BDA0003943873540000883
<序列编号38>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(南非型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000884
Figure BDA0003943873540000891
<序列编号39>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(英国型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000892
<序列编号40>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(巴西型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000901
<序列编号41>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(加利福尼亚型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000902
Figure BDA0003943873540000911
<序列编号42>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(印度型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000912
<序列编号43>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(南非C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000913
Figure BDA0003943873540000921
<序列编号44>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(英国C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000922
<序列编号45>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(巴西C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000923
Figure BDA0003943873540000931
<序列编号46>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(加利福尼亚C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000932
<序列编号47>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(印度C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000941
<序列编号48>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(组合突变型(1))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000942
Figure BDA0003943873540000951
<序列编号49>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(组合突变型(2))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000952
<序列编号50>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(组合突变型(3))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000953
Figure BDA0003943873540000961
<序列编号51>包含突变型SARS-CoV-2 RBD的DNA片段(组合突变型(4))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000962
<序列编号52>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(南非型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000963
Figure BDA0003943873540000971
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列包含的)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号53>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(英国型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000972
Figure BDA0003943873540000981
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号54>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(巴西型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000982
Figure BDA0003943873540000991
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号55>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(加利福尼亚型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540000992
Figure BDA0003943873540001001
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号56>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(印度型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001002
Figure BDA0003943873540001011
T7肩动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号57>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(南非C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001012
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号58>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(英国C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001021
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号59>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(巴西C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001031
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号60>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(加利福尼亚C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001041
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号61>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(印度C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001051
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号62>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(组合突变型(1))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001052
Figure BDA0003943873540001061
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号63>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(组合突变型(2))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001062
Figure BDA0003943873540001071
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号64>突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(组合突变型(3))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001072
Figure BDA0003943873540001081
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号65突变型SARS-CoV-2 RBD的模板DNA(组合突变型(4))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001082
Figure BDA0003943873540001091
T7启动子：碱基编号1～18
A：转录起始点：碱基编号19
5’-UTR序列(包含转录起始点和碱基编号83～88的KOZAK序列)：碱基编号19～88
Spike蛋白信号序列：碱基编号89～127
RBD序列：碱基编号128～799
3’-UTR：碱基编号800～931
polyA序列(A100)：碱基编号932～1031
<序列编号66>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(南非型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001092
<序列编号67>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(英国型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001101
<序列编号68>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(巴西型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001102
Figure BDA0003943873540001111
<序列编号69>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(加利福尼亚型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001112
<序列编号70>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(印度型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001113
Figure BDA0003943873540001121
<序列编号71>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(南非C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001122
Figure BDA0003943873540001131
<序列编号72>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(英国C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001132
<序列编号73>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(巴西C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001133
Figure BDA0003943873540001141
<序列编号74>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(加利福尼亚C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001142
<序列编号75>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(印度C538S型)(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001143
Figure BDA0003943873540001151
<序列编号76>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(组合突变型(1))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001152
Figure BDA0003943873540001161
<序列编号77>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(组合突变型(2))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001162
<序列编号78>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(组合突变型(3))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001163
Figure BDA0003943873540001171
<序列编号79>突变型SARS-CoV-2 RBD mRNA(组合突变型(4))(突变密码子用下划线显示、突变部位用粗体显示)
Figure BDA0003943873540001172
<序列编号80>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(南非型)(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001181
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号81>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(英国型)(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001182
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号82>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(巴西型)(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001183
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号83>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(加利福尼亚型)(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001184
Figure BDA0003943873540001191
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号84>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(印度型)(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001192
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号85>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(南非C538S型)(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001193
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号86>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(英国C538S型)(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001194
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号87>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(巴西C538S型)(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001201
<序列编号88>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(加利福尼亚C538S型)(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001202
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号89>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(印度C538S型)(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001203
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号90>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(组合突变型(1))(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001211
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号91>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(组合突变型(2))(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001212
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号92>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(组合突变型(3))(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001213
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号93>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(组合突变型(4))(包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001221
S蛋白信号序列：氨基酸编号1～13
RBD序列：氨基酸编号14～236
<序列编号94>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(南非型)(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001222
<序列编号95>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(英国型)(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001223
<序列编号96>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(巴西型)(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001224
<序列编号97>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(加利福尼亚型)(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001231
<序列编号98>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(印度型)(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001232
<序列编号99>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(南非C538S型)(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001233
<序列编号100>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(英国C538S型)(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001234
<序列编号101>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(巴西C538S型)(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001241
<序列编号102>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(加利福尼亚C538S型)(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001242
<序列编号103>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(印度C538S型)(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001243
<序列编号104>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(组合突变型(1))(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001244
<序列编号105>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(组合突变型(2))(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001251
<序列编号106>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(组合突变型(3))(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001252
<序列编号107>突变型SARS-CoV-2 RBD的氨基酸序列(组合突变型(4))(不包含S蛋白信号序列、突变氨基酸用下划线显示)
Figure BDA0003943873540001253
序列表
<110> 第一三共株式会社
国立大学法人东京大学
<120> 包封了SARS-CoV-2 mRNA的核酸脂质粒子疫苗
<130> FP-298PCT
<150> JP2020-101420
<151> 2020-06-11
<150> JP2021-33278
<151> 2021-03-03
<160> 107
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4042
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 1
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gtttgttttt cttgttttat tgccactagt 120
ctctagtcag tgtgttaatc ttacaaccag aactcaatta ccccctgcat acactaattc 180
tttcacacgt ggtgtttatt accctgacaa agttttcaga tcctcagttt tacattcaac 240
tcaggacttg ttcttacctt tcttttccaa tgttacttgg ttccatgcta tacatgtctc 300
tgggaccaat ggtactaaga ggtttgataa ccctgtccta ccatttaatg atggtgttta 360
ttttgcttcc actgagaagt ctaacataat aagaggctgg atttttggta ctactttaga 420
ttcgaagacc cagtccctac ttattgttaa taacgctact aatgttgtta ttaaagtctg 480
tgaatttcaa ttttgtaatg atccattttt gggtgtttat taccacaaaa acaacaaaag 540
ttggatggaa agtgagttca gagtttattc tagtgcgaat aattgcactt ttgaatatgt 600
ctctcagcct tttcttatgg accttgaagg aaaacagggt aatttcaaaa atcttaggga 660
atttgtgttt aagaatattg atggttattt taaaatatat tctaagcaca cgcctattaa 720
tttagtgcgt gatctccctc agggtttttc ggctttagaa ccattggtag atttgccaat 780
aggtattaac atcactaggt ttcaaacttt acttgcttta catagaagtt atttgactcc 840
tggtgattct tcttcaggtt ggacagctgg tgctgcagct tattatgtgg gttatcttca 900
acctaggact tttctattaa aatataatga aaatggaacc attacagatg ctgtagactg 960
tgcacttgac cctctctcag aaacaaagtg tacgttgaaa tccttcactg tagaaaaagg 1020
aatctatcaa acttctaact ttagagtcca accaacagaa tctattgtta gatttcctaa 1080
tattacaaac ttgtgccctt ttggtgaagt ttttaacgcc accagatttg catctgttta 1140
tgcttggaac aggaagagaa tcagcaactg tgttgctgat tattctgtcc tatataattc 1200
cgcatcattt tccactttta agtgttatgg agtgtctcct actaaattaa atgatctctg 1260
ctttactaat gtctatgcag attcatttgt aattagaggt gatgaagtca gacaaatcgc 1320
tccagggcaa actggaaaga ttgctgatta taattataaa ttaccagatg attttacagg 1380
ctgcgttata gcttggaatt ctaacaatct tgattctaag gttggtggta attataatta 1440
cctgtataga ttgtttagga agtctaatct caaacctttt gagagagata tttcaactga 1500
aatctatcag gccggtagca caccttgtaa tggtgttgaa ggttttaatt gttactttcc 1560
tttacaatca tatggtttcc aacccactaa tggtgttggt taccaaccat acagagtagt 1620
agtactttct tttgaacttc tacatgcacc agcaactgtt tgtggaccta aaaagtctac 1680
taatttggtt aaaaacaaat gtgtcaattt caacttcaat ggtttaacag gcacaggtgt 1740
tcttactgag tctaacaaaa agtttctgcc tttccaacaa tttggcagag acattgctga 1800
cactactgat gctgtccgtg atccacagac acttgagatt cttgacatta caccatgttc 1860
ttttggtggt gtcagtgtta taacaccagg aacaaatact tctaaccagg ttgctgttct 1920
ttatcaggat gttaactgca cagaagtccc tgttgctatt catgcagatc aacttactcc 1980
tacttggcgt gtttattcta caggttctaa tgtttttcaa acacgtgcag gctgtttaat 2040
aggggctgaa catgtcaaca actcatatga gtgtgacata cccattggtg caggtatatg 2100
cgctagttat cagactcaga ctaattctcc tcggcgggca cgtagtgtag ctagtcaatc 2160
catcattgcc tacactatgt cacttggtgc agaaaattca gttgcttact ctaataactc 2220
tattgccata cccacaaatt ttactattag tgttaccaca gaaattctac cagtgtctat 2280
gaccaagaca tcagtagatt gtacaatgta catttgtggt gattcaactg aatgcagcaa 2340
tcttttgttg caatatggca gtttttgtac acaattaaac cgtgctttaa ctggaatagc 2400
tgttgaacaa gacaaaaaca cccaagaagt ttttgcacaa gtcaaacaaa tttacaaaac 2460
accaccaatt aaagattttg gtggttttaa tttttcacaa atattaccag atccatcaaa 2520
accaagcaag aggtcattta ttgaagatct acttttcaac aaagtgacac ttgcagatgc 2580
tggcttcatc aaacaatatg gtgattgcct tggtgatatt gctgctagag acctcatttg 2640
tgcacaaaag tttaacggcc ttactgtttt gccacctttg ctcacagatg aaatgattgc 2700
tcaatacact tctgcactgt tagcgggtac aatcacttct ggttggacct ttggtgcagg 2760
tgctgcatta caaataccat ttgctatgca aatggcttat aggtttaatg gtattggagt 2820
tacacagaat gttctctatg agaaccaaaa attgattgcc aaccaattta atagtgctat 2880
tggcaaaatt caagactcac tttcttccac agcaagtgca cttggaaaac ttcaagatgt 2940
ggtcaaccaa aatgcacaag ctttaaacac gcttgttaaa caacttagct ccaattttgg 3000
tgcaatttca agtgttttaa atgatatcct ttcacgtctt gacaaagttg aggctgaagt 3060
gcaaattgat aggttgatca caggcagact tcaaagtttg cagacatatg tgactcaaca 3120
attaattaga gctgcagaaa tcagagcttc tgctaatctt gctgctacta aaatgtcaga 3180
gtgtgtactt ggacaatcaa aaagagttga tttttgtgga aagggctatc atcttatgtc 3240
cttccctcag tcagcacctc atggtgtagt cttcttgcat gtgacttatg tccctgcaca 3300
agaaaagaac ttcacaactg ctcctgccat ttgtcatgat ggaaaagcac actttcctcg 3360
tgaaggtgtc tttgtttcaa atggcacaca ctggtttgta acacaaagga atttttatga 3420
accacaaatc attactacag acaacacatt tgtgtctggt aactgtgatg ttgtaatagg 3480
aattgtcaac aacacagttt atgatccttt gcaacctgaa ttagactcat tcaaggagga 3540
gttagataaa tattttaaga atcatacatc accagatgtt gatttaggtg acatctctgg 3600
cattaatgct tcagttgtaa acattcaaaa agaaattgac cgcctcaatg aggttgccaa 3660
gaatttaaat gaatctctca tcgatctcca agaacttgga aagtatgagc agtatataaa 3720
atggccatgg tacatttggc taggttttat agctggcttg attgccatag taatggtgac 3780
aattatgctt tgctgtatga ccagttgctg tagttgtctc aagggctgtt gttcttgtgg 3840
atcctgctgc aaatttgatg aagacgactc tgagccagtg ctcaaaggag tcaaattaca 3900
ttacacatga gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa 3960
gtccaactac taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat 4020
aaaaaacatt tattttcatt gc 4042
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 2
gtaatacgac tcactataa 19
<210> 3
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 3
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt gcaatgaaaa taaatgtttt 120
ttattaggc 129
<210> 4
<211> 4142
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 模板DNA
<400> 4
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gtttgttttt cttgttttat tgccactagt 120
ctctagtcag tgtgttaatc ttacaaccag aactcaatta ccccctgcat acactaattc 180
tttcacacgt ggtgtttatt accctgacaa agttttcaga tcctcagttt tacattcaac 240
tcaggacttg ttcttacctt tcttttccaa tgttacttgg ttccatgcta tacatgtctc 300
tgggaccaat ggtactaaga ggtttgataa ccctgtccta ccatttaatg atggtgttta 360
ttttgcttcc actgagaagt ctaacataat aagaggctgg atttttggta ctactttaga 420
ttcgaagacc cagtccctac ttattgttaa taacgctact aatgttgtta ttaaagtctg 480
tgaatttcaa ttttgtaatg atccattttt gggtgtttat taccacaaaa acaacaaaag 540
ttggatggaa agtgagttca gagtttattc tagtgcgaat aattgcactt ttgaatatgt 600
ctctcagcct tttcttatgg accttgaagg aaaacagggt aatttcaaaa atcttaggga 660
atttgtgttt aagaatattg atggttattt taaaatatat tctaagcaca cgcctattaa 720
tttagtgcgt gatctccctc agggtttttc ggctttagaa ccattggtag atttgccaat 780
aggtattaac atcactaggt ttcaaacttt acttgcttta catagaagtt atttgactcc 840
tggtgattct tcttcaggtt ggacagctgg tgctgcagct tattatgtgg gttatcttca 900
acctaggact tttctattaa aatataatga aaatggaacc attacagatg ctgtagactg 960
tgcacttgac cctctctcag aaacaaagtg tacgttgaaa tccttcactg tagaaaaagg 1020
aatctatcaa acttctaact ttagagtcca accaacagaa tctattgtta gatttcctaa 1080
tattacaaac ttgtgccctt ttggtgaagt ttttaacgcc accagatttg catctgttta 1140
tgcttggaac aggaagagaa tcagcaactg tgttgctgat tattctgtcc tatataattc 1200
cgcatcattt tccactttta agtgttatgg agtgtctcct actaaattaa atgatctctg 1260
ctttactaat gtctatgcag attcatttgt aattagaggt gatgaagtca gacaaatcgc 1320
tccagggcaa actggaaaga ttgctgatta taattataaa ttaccagatg attttacagg 1380
ctgcgttata gcttggaatt ctaacaatct tgattctaag gttggtggta attataatta 1440
cctgtataga ttgtttagga agtctaatct caaacctttt gagagagata tttcaactga 1500
aatctatcag gccggtagca caccttgtaa tggtgttgaa ggttttaatt gttactttcc 1560
tttacaatca tatggtttcc aacccactaa tggtgttggt taccaaccat acagagtagt 1620
agtactttct tttgaacttc tacatgcacc agcaactgtt tgtggaccta aaaagtctac 1680
taatttggtt aaaaacaaat gtgtcaattt caacttcaat ggtttaacag gcacaggtgt 1740
tcttactgag tctaacaaaa agtttctgcc tttccaacaa tttggcagag acattgctga 1800
cactactgat gctgtccgtg atccacagac acttgagatt cttgacatta caccatgttc 1860
ttttggtggt gtcagtgtta taacaccagg aacaaatact tctaaccagg ttgctgttct 1920
ttatcaggat gttaactgca cagaagtccc tgttgctatt catgcagatc aacttactcc 1980
tacttggcgt gtttattcta caggttctaa tgtttttcaa acacgtgcag gctgtttaat 2040
aggggctgaa catgtcaaca actcatatga gtgtgacata cccattggtg caggtatatg 2100
cgctagttat cagactcaga ctaattctcc tcggcgggca cgtagtgtag ctagtcaatc 2160
catcattgcc tacactatgt cacttggtgc agaaaattca gttgcttact ctaataactc 2220
tattgccata cccacaaatt ttactattag tgttaccaca gaaattctac cagtgtctat 2280
gaccaagaca tcagtagatt gtacaatgta catttgtggt gattcaactg aatgcagcaa 2340
tcttttgttg caatatggca gtttttgtac acaattaaac cgtgctttaa ctggaatagc 2400
tgttgaacaa gacaaaaaca cccaagaagt ttttgcacaa gtcaaacaaa tttacaaaac 2460
accaccaatt aaagattttg gtggttttaa tttttcacaa atattaccag atccatcaaa 2520
accaagcaag aggtcattta ttgaagatct acttttcaac aaagtgacac ttgcagatgc 2580
tggcttcatc aaacaatatg gtgattgcct tggtgatatt gctgctagag acctcatttg 2640
tgcacaaaag tttaacggcc ttactgtttt gccacctttg ctcacagatg aaatgattgc 2700
tcaatacact tctgcactgt tagcgggtac aatcacttct ggttggacct ttggtgcagg 2760
tgctgcatta caaataccat ttgctatgca aatggcttat aggtttaatg gtattggagt 2820
tacacagaat gttctctatg agaaccaaaa attgattgcc aaccaattta atagtgctat 2880
tggcaaaatt caagactcac tttcttccac agcaagtgca cttggaaaac ttcaagatgt 2940
ggtcaaccaa aatgcacaag ctttaaacac gcttgttaaa caacttagct ccaattttgg 3000
tgcaatttca agtgttttaa atgatatcct ttcacgtctt gacaaagttg aggctgaagt 3060
gcaaattgat aggttgatca caggcagact tcaaagtttg cagacatatg tgactcaaca 3120
attaattaga gctgcagaaa tcagagcttc tgctaatctt gctgctacta aaatgtcaga 3180
gtgtgtactt ggacaatcaa aaagagttga tttttgtgga aagggctatc atcttatgtc 3240
cttccctcag tcagcacctc atggtgtagt cttcttgcat gtgacttatg tccctgcaca 3300
agaaaagaac ttcacaactg ctcctgccat ttgtcatgat ggaaaagcac actttcctcg 3360
tgaaggtgtc tttgtttcaa atggcacaca ctggtttgta acacaaagga atttttatga 3420
accacaaatc attactacag acaacacatt tgtgtctggt aactgtgatg ttgtaatagg 3480
aattgtcaac aacacagttt atgatccttt gcaacctgaa ttagactcat tcaaggagga 3540
gttagataaa tattttaaga atcatacatc accagatgtt gatttaggtg acatctctgg 3600
cattaatgct tcagttgtaa acattcaaaa agaaattgac cgcctcaatg aggttgccaa 3660
gaatttaaat gaatctctca tcgatctcca agaacttgga aagtatgagc agtatataaa 3720
atggccatgg tacatttggc taggttttat agctggcttg attgccatag taatggtgac 3780
aattatgctt tgctgtatga ccagttgctg tagttgtctc aagggctgtt gttcttgtgg 3840
atcctgctgc aaatttgatg aagacgactc tgagccagtg ctcaaaggag tcaaattaca 3900
ttacacatga gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa 3960
gtccaactac taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat 4020
aaaaaacatt tattttcatt gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140
aa 4142
<210> 5
<211> 4142
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-Cov-2 S全长mRNA-001
<400> 5
guaauacgac ucacuauaag gagacccaag cuacauuugc uucugacaca acuguguuca 60
cuagcaaccu caaacagaca ccgccaccau guuuguuuuu cuuguuuuau ugccacuagu 120
cucuagucag uguguuaauc uuacaaccag aacucaauua cccccugcau acacuaauuc 180
uuucacacgu gguguuuauu acccugacaa aguuuucaga uccucaguuu uacauucaac 240
ucaggacuug uucuuaccuu ucuuuuccaa uguuacuugg uuccaugcua uacaugucuc 300
ugggaccaau gguacuaaga gguuugauaa cccuguccua ccauuuaaug augguguuua 360
uuuugcuucc acugagaagu cuaacauaau aagaggcugg auuuuuggua cuacuuuaga 420
uucgaagacc cagucccuac uuauuguuaa uaacgcuacu aauguuguua uuaaagucug 480
ugaauuucaa uuuuguaaug auccauuuuu ggguguuuau uaccacaaaa acaacaaaag 540
uuggauggaa agugaguuca gaguuuauuc uagugcgaau aauugcacuu uugaauaugu 600
cucucagccu uuucuuaugg accuugaagg aaaacagggu aauuucaaaa aucuuaggga 660
auuuguguuu aagaauauug augguuauuu uaaaauauau ucuaagcaca cgccuauuaa 720
uuuagugcgu gaucucccuc aggguuuuuc ggcuuuagaa ccauugguag auuugccaau 780
agguauuaac aucacuaggu uucaaacuuu acuugcuuua cauagaaguu auuugacucc 840
uggugauucu ucuucagguu ggacagcugg ugcugcagcu uauuaugugg guuaucuuca 900
accuaggacu uuucuauuaa aauauaauga aaauggaacc auuacagaug cuguagacug 960
ugcacuugac ccucucucag aaacaaagug uacguugaaa uccuucacug uagaaaaagg 1020
aaucuaucaa acuucuaacu uuagagucca accaacagaa ucuauuguua gauuuccuaa 1080
uauuacaaac uugugcccuu uuggugaagu uuuuaacgcc accagauuug caucuguuua 1140
ugcuuggaac aggaagagaa ucagcaacug uguugcugau uauucugucc uauauaauuc 1200
cgcaucauuu uccacuuuua aguguuaugg agugucuccu acuaaauuaa augaucucug 1260
cuuuacuaau gucuaugcag auucauuugu aauuagaggu gaugaaguca gacaaaucgc 1320
uccagggcaa acuggaaaga uugcugauua uaauuauaaa uuaccagaug auuuuacagg 1380
cugcguuaua gcuuggaauu cuaacaaucu ugauucuaag guugguggua auuauaauua 1440
ccuguauaga uuguuuagga agucuaaucu caaaccuuuu gagagagaua uuucaacuga 1500
aaucuaucag gccgguagca caccuuguaa ugguguugaa gguuuuaauu guuacuuucc 1560
uuuacaauca uaugguuucc aacccacuaa ugguguuggu uaccaaccau acagaguagu 1620
aguacuuucu uuugaacuuc uacaugcacc agcaacuguu uguggaccua aaaagucuac 1680
uaauuugguu aaaaacaaau gugucaauuu caacuucaau gguuuaacag gcacaggugu 1740
ucuuacugag ucuaacaaaa aguuucugcc uuuccaacaa uuuggcagag acauugcuga 1800
cacuacugau gcuguccgug auccacagac acuugagauu cuugacauua caccauguuc 1860
uuuugguggu gucaguguua uaacaccagg aacaaauacu ucuaaccagg uugcuguucu 1920
uuaucaggau guuaacugca cagaaguccc uguugcuauu caugcagauc aacuuacucc 1980
uacuuggcgu guuuauucua cagguucuaa uguuuuucaa acacgugcag gcuguuuaau 2040
aggggcugaa caugucaaca acucauauga gugugacaua cccauuggug cagguauaug 2100
cgcuaguuau cagacucaga cuaauucucc ucggcgggca cguaguguag cuagucaauc 2160
caucauugcc uacacuaugu cacuuggugc agaaaauuca guugcuuacu cuaauaacuc 2220
uauugccaua cccacaaauu uuacuauuag uguuaccaca gaaauucuac cagugucuau 2280
gaccaagaca ucaguagauu guacaaugua cauuuguggu gauucaacug aaugcagcaa 2340
ucuuuuguug caauauggca guuuuuguac acaauuaaac cgugcuuuaa cuggaauagc 2400
uguugaacaa gacaaaaaca cccaagaagu uuuugcacaa gucaaacaaa uuuacaaaac 2460
accaccaauu aaagauuuug gugguuuuaa uuuuucacaa auauuaccag auccaucaaa 2520
accaagcaag aggucauuua uugaagaucu acuuuucaac aaagugacac uugcagaugc 2580
uggcuucauc aaacaauaug gugauugccu uggugauauu gcugcuagag accucauuug 2640
ugcacaaaag uuuaacggcc uuacuguuuu gccaccuuug cucacagaug aaaugauugc 2700
ucaauacacu ucugcacugu uagcggguac aaucacuucu gguuggaccu uuggugcagg 2760
ugcugcauua caaauaccau uugcuaugca aauggcuuau agguuuaaug guauuggagu 2820
uacacagaau guucucuaug agaaccaaaa auugauugcc aaccaauuua auagugcuau 2880
uggcaaaauu caagacucac uuucuuccac agcaagugca cuuggaaaac uucaagaugu 2940
ggucaaccaa aaugcacaag cuuuaaacac gcuuguuaaa caacuuagcu ccaauuuugg 3000
ugcaauuuca aguguuuuaa augauauccu uucacgucuu gacaaaguug aggcugaagu 3060
gcaaauugau agguugauca caggcagacu ucaaaguuug cagacauaug ugacucaaca 3120
auuaauuaga gcugcagaaa ucagagcuuc ugcuaaucuu gcugcuacua aaaugucaga 3180
guguguacuu ggacaaucaa aaagaguuga uuuuugugga aagggcuauc aucuuauguc 3240
cuucccucag ucagcaccuc augguguagu cuucuugcau gugacuuaug ucccugcaca 3300
agaaaagaac uucacaacug cuccugccau uugucaugau ggaaaagcac acuuuccucg 3360
ugaagguguc uuuguuucaa auggcacaca cugguuugua acacaaagga auuuuuauga 3420
accacaaauc auuacuacag acaacacauu ugugucuggu aacugugaug uuguaauagg 3480
aauugucaac aacacaguuu augauccuuu gcaaccugaa uuagacucau ucaaggagga 3540
guuagauaaa uauuuuaaga aucauacauc accagauguu gauuuaggug acaucucugg 3600
cauuaaugcu ucaguuguaa acauucaaaa agaaauugac cgccucaaug agguugccaa 3660
gaauuuaaau gaaucucuca ucgaucucca agaacuugga aaguaugagc aguauauaaa 3720
auggccaugg uacauuuggc uagguuuuau agcuggcuug auugccauag uaauggugac 3780
aauuaugcuu ugcuguauga ccaguugcug uaguugucuc aagggcuguu guucuugugg 3840
auccugcugc aaauuugaug aagacgacuc ugagccagug cucaaaggag ucaaauuaca 3900
uuacacauga gcucgcuuuc uugcugucca auuucuauua aagguuccuu uguucccuaa 3960
guccaacuac uaaacugggg gauauuauga agggccuuga gcaucuggau ucugccuaau 4020
aaaaaacauu uauuuucauu gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140
aa 4142
<210> 6
<211> 1273
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 6
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 7
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 7
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gtttgttttt cttgttttat tgccactagt 120
ctctagtaga gtccaaccaa cagaatctat tgttagattt cctaatatta caaacttgtg 180
cccttttggt gaagttttta acgccaccag atttgcatct gtttatgctt ggaacaggaa 240
gagaatcagc aactgtgttg ctgattattc tgtcctatat aattccgcat cattttccac 300
ttttaagtgt tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat ctctgcttta ctaatgtcta 360
tgcagattca tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa atcgctccag ggcaaactgg 420
aaagattgct gattataatt ataaattacc agatgatttt acaggctgcg ttatagcttg 480
gaattctaac aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat aattacctgt atagattgtt 540
taggaagtct aatctcaaac cttttgagag agatatttca actgaaatct atcaggccgg 600
tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac tttcctttac aatcatatgg 660
tttccaaccc actaatggtg ttggttacca accatacaga gtagtagtac tttcttttga 720
acttctacat gcaccagcaa ctgtttgtgg acctaaaaag tctactaatt tggttaaaaa 780
caaatgtgtc aatttctgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 840
gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 900
ctgcctaata aaaaacattt attttcattg c 931
<210> 8
<211> 1031
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 模板DNA
<400> 8
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gtttgttttt cttgttttat tgccactagt 120
ctctagtaga gtccaaccaa cagaatctat tgttagattt cctaatatta caaacttgtg 180
cccttttggt gaagttttta acgccaccag atttgcatct gtttatgctt ggaacaggaa 240
gagaatcagc aactgtgttg ctgattattc tgtcctatat aattccgcat cattttccac 300
ttttaagtgt tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat ctctgcttta ctaatgtcta 360
tgcagattca tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa atcgctccag ggcaaactgg 420
aaagattgct gattataatt ataaattacc agatgatttt acaggctgcg ttatagcttg 480
gaattctaac aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat aattacctgt atagattgtt 540
taggaagtct aatctcaaac cttttgagag agatatttca actgaaatct atcaggccgg 600
tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac tttcctttac aatcatatgg 660
tttccaaccc actaatggtg ttggttacca accatacaga gtagtagtac tttcttttga 720
acttctacat gcaccagcaa ctgtttgtgg acctaaaaag tctactaatt tggttaaaaa 780
caaatgtgtc aatttctgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 840
gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 900
ctgcctaata aaaaacattt attttcattg caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa a 1031
<210> 9
<211> 1013
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD mRNA-002
<400> 9
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auguuuguuu uucuuguuuu auugccacua gucucuagua gaguccaacc 120
aacagaaucu auuguuagau uuccuaauau uacaaacuug ugcccuuuug gugaaguuuu 180
uaacgccacc agauuugcau cuguuuaugc uuggaacagg aagagaauca gcaacugugu 240
ugcugauuau ucuguccuau auaauuccgc aucauuuucc acuuuuaagu guuauggagu 300
gucuccuacu aaauuaaaug aucucugcuu uacuaauguc uaugcagauu cauuuguaau 360
uagaggugau gaagucagac aaaucgcucc agggcaaacu ggaaagauug cugauuauaa 420
uuauaaauua ccagaugauu uuacaggcug cguuauagcu uggaauucua acaaucuuga 480
uucuaagguu ggugguaauu auaauuaccu guauagauug uuuaggaagu cuaaucucaa 540
accuuuugag agagauauuu caacugaaau cuaucaggcc gguagcacac cuuguaaugg 600
uguugaaggu uuuaauuguu acuuuccuuu acaaucauau gguuuccaac ccacuaaugg 660
uguugguuac caaccauaca gaguaguagu acuuucuuuu gaacuucuac augcaccagc 720
aacuguuugu ggaccuaaaa agucuacuaa uuugguuaaa aacaaaugug ucaauuucug 780
agcucgcuuu cuugcugucc aauuucuauu aaagguuccu uuguucccua aguccaacua 840
cuaaacuggg ggauauuaug aagggccuug agcaucugga uucugccuaa uaaaaaacau 900
uuauuuucau ugcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1013
<210> 10
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2 RBD
<400> 10
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
225 230 235
<210> 11
<211> 223
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
<400> 11
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 12
<211> 4054
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 12
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgttc gtgttcctgg tgctgctgcc 120
cctggtgagc agccagtgcg tgaacctgac caccagaaca cagctgcccc cagcctacac 180
caacagcttc accagaggcg tgtactaccc cgacaaggtg ttcagaagca gcgtgctgca 240
cagcacccag gacctgttcc tgcccttctt cagcaacgtg acctggttcc acgccatcca 300
cgtgagcggc accaacggca ccaagagatt cgacaacccc gtgctgccct tcaacgacgg 360
ggtgtacttc gccagcaccg agaagtccaa catcatcaga ggctggatct tcggcaccac 420
actggacagc aagacccaga gcctgctgat cgtgaacaac gccaccaacg tggtcatcaa 480
agtgtgcgag ttccagttct gcaacgaccc cttcctgggc gtctactacc acaagaacaa 540
caagagctgg atggaaagcg agttccgggt gtacagcagc gccaacaact gcaccttcga 600
gtacgtgagc cagcccttcc tgatggacct ggaaggcaag cagggcaact tcaagaacct 660
gcgcgagttc gtgttcaaga acatcgacgg ctacttcaag atctacagca agcacacccc 720
catcaacctc gtgcgggacc tgccccaggg cttcagcgcc ctggaacccc tggtggacct 780
gcccatcggc atcaacatca cccggttcca gacactgctg gccctgcaca gaagctacct 840
gacacccggc gacagcagca gcggatggac agccggcgcc gccgcctact acgtgggcta 900
cctgcagccc agaaccttcc tgctgaagta caacgagaac ggcaccatca ccgacgccgt 960
ggactgcgcc ctggaccccc tgagcgagac aaagtgcacc ctgaagtcct tcaccgtgga 1020
aaagggcatc taccagacca gcaacttccg ggtgcagccc accgaaagca tcgtgcggtt 1080
ccccaacatc accaacctgt gccccttcgg cgaggtgttc aacgccacca gattcgccag 1140
cgtgtacgcc tggaaccgga agcggatcag caactgcgtg gccgactaca gcgtgctgta 1200
caacagcgcc agcttcagca ccttcaagtg ctacggcgtg agccccacca agctgaacga 1260
cctgtgcttc acaaacgtgt acgccgacag cttcgtgatc cggggagacg aagtgcggca 1320
gatcgccccc ggacagacag gcaagatcgc cgactacaac tacaagctgc ccgacgactt 1380
caccggctgc gtgatcgcct ggaacagcaa caacctggac agcaaagtcg gcggcaacta 1440
caactacctg taccggctgt tccggaagtc caacctgaag cccttcgagc gggacatcag 1500
caccgagatc taccaggccg gcagcacccc ctgcaacggc gtggaaggct tcaactgcta 1560
cttcccactg cagagctacg gcttccagcc cacaaacggc gtgggctacc agccctacag 1620
agtggtggtg ctgagcttcg aactgctgca cgcccccgcc acagtgtgcg gccccaagaa 1680
aagcaccaac ctcgtgaaga acaaatgcgt gaacttcaac ttcaacggcc tgaccggcac 1740
cggcgtgctg acagagagca acaagaagtt cctgccattc cagcagttcg gccgggacat 1800
cgccgacacc acagacgccg tcagagaccc ccagacactg gaaatcctgg acatcacccc 1860
ctgcagcttc ggcggagtga gcgtgatcac ccccggcacc aacaccagca accaggtggc 1920
agtgctgtac caggacgtga actgcaccga agtgcccgtg gccatccacg ccgaccagct 1980
gacacccaca tggcgggtgt acagcaccgg cagcaacgtg ttccagacca gagccggctg 2040
cctgatcgga gccgagcacg tgaacaacag ctacgagtgc gacatcccca tcggcgccgg 2100
catctgcgcc agctaccaga cacagacaaa cagccccaga cgggccagaa gcgtggccag 2160
ccagagcatc atcgcctaca caatgagcct gggcgccgag aacagcgtgg cctacagcaa 2220
caacagcatc gccatcccca ccaacttcac catcagcgtg accacagaga tcctgcccgt 2280
gagcatgacc aagaccagcg tggactgcac catgtacatc tgcggcgaca gcaccgagtg 2340
cagcaacctg ctgctgcagt acggcagctt ctgcacccag ctgaacagag ccctgacagg 2400
gatcgccgtg gaacaggaca agaacaccca agaggtgttc gcccaagtga agcagatcta 2460
caagaccccc cccatcaagg acttcggcgg cttcaacttc agccagatcc tgcccgaccc 2520
cagcaagccc agcaagcgga gcttcatcga ggacctgctg ttcaacaaag tgacactggc 2580
cgacgccggc ttcatcaagc agtacggcga ctgcctgggc gacatcgccg ccagggacct 2640
gatctgcgcc cagaagttca acggactgac agtgctgccc cccctgctga ccgacgagat 2700
gatcgcccag tacacaagcg ccctgctggc cggcacaatc acaagcggct ggacattcgg 2760
agccggcgcc gccctgcaga tccccttcgc catgcagatg gcctaccggt tcaacggcat 2820
cggagtgacc cagaacgtgc tgtacgagaa ccagaagctg atcgccaacc agttcaacag 2880
cgccatcggc aagatccagg acagcctgag cagcacagca agcgccctgg gaaagctgca 2940
ggacgtggtc aaccagaacg cccaggcact gaacaccctg gtcaagcagc tgagcagcaa 3000
cttcggcgcc atcagcagcg tgctgaacga catcctgagc agactggaca aggtggaagc 3060
cgaggtgcag atcgacagac tgatcaccgg aaggctgcag agcctgcaga cctacgtcac 3120
ccagcagctg atcagagccg ccgagatcag agccagcgcc aacctggccg ccaccaagat 3180
gagcgagtgc gtgctgggcc agagcaagag agtggacttc tgcggcaagg gctaccacct 3240
gatgagcttc ccccagagcg ccccccacgg cgtggtgttc ctgcacgtga catacgtgcc 3300
cgcccaagag aagaacttca ccaccgcccc agccatctgc cacgacggca aagcccactt 3360
ccccagagaa ggcgtgttcg tgagcaacgg cacccactgg ttcgtgaccc agcggaactt 3420
ctacgagccc cagatcatca ccaccgacaa caccttcgtg agcggcaact gcgacgtcgt 3480
gatcggcatc gtgaacaaca ccgtgtacga ccccctgcag cccgagctgg acagcttcaa 3540
agaggaactg gacaagtact tcaagaacca cacaagcccc gacgtggacc tgggcgacat 3600
cagcggaatc aacgccagcg tcgtgaacat ccagaaagag atcgaccggc tgaacgaggt 3660
ggccaagaac ctgaacgaga gcctgatcga cctgcaagaa ctggggaagt acgagcagta 3720
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ctgcggcagc tgctgcaagt tcgacgagga cgacagcgag cccgtgctga agggcgtgaa 3900
actgcactac acatgagctc gctttcttgc tgtccaattt ctattaaagg ttcctttgtt 3960
ccctaagtcc aactactaaa ctgggggata ttatgaaggg ccttgagcat ctggattctg 4020
cctaataaaa aacatttatt ttcattgcga attc 4054
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 13
tgatgctagc gtaatacgac tcactataag 30
<210> 14
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 14
gccaaagctt gctcttcgtt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
ttttttttgc aatgaaaata aatgtttttt 150
<210> 15
<211> 4180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 模板DNA
<400> 15
tgatgctagc gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca 60
actgtgttca ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc 120
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tccacgtgag cggcaccaac ggcaccaaga gattcgacaa ccccgtgctg cccttcaacg 360
acggggtgta cttcgccagc accgagaagt ccaacatcat cagaggctgg atcttcggca 420
ccacactgga cagcaagacc cagagcctgc tgatcgtgaa caacgccacc aacgtggtca 480
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tgtacaacag cgccagcttc agcaccttca agtgctacgg cgtgagcccc accaagctga 1260
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actacaacta cctgtaccgg ctgttccgga agtccaacct gaagcccttc gagcgggaca 1500
tcagcaccga gatctaccag gccggcagca ccccctgcaa cggcgtggaa ggcttcaact 1560
gctacttccc actgcagagc tacggcttcc agcccacaaa cggcgtgggc taccagccct 1620
acagagtggt ggtgctgagc ttcgaactgc tgcacgcccc cgccacagtg tgcggcccca 1680
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ccggcatctg cgccagctac cagacacaga caaacagccc cagacgggcc agaagcgtgg 2160
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gcaacaacag catcgccatc cccaccaact tcaccatcag cgtgaccaca gagatcctgc 2280
ccgtgagcat gaccaagacc agcgtggact gcaccatgta catctgcggc gacagcaccg 2340
agtgcagcaa cctgctgctg cagtacggca gcttctgcac ccagctgaac agagccctga 2400
cagggatcgc cgtggaacag gacaagaaca cccaagaggt gttcgcccaa gtgaagcaga 2460
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tggccgacgc cggcttcatc aagcagtacg gcgactgcct gggcgacatc gccgccaggg 2640
acctgatctg cgcccagaag ttcaacggac tgacagtgct gccccccctg ctgaccgacg 2700
agatgatcgc ccagtacaca agcgccctgc tggccggcac aatcacaagc ggctggacat 2760
tcggagccgg cgccgccctg cagatcccct tcgccatgca gatggcctac cggttcaacg 2820
gcatcggagt gacccagaac gtgctgtacg agaaccagaa gctgatcgcc aaccagttca 2880
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tcgtgatcgg catcgtgaac aacaccgtgt acgaccccct gcagcccgag ctggacagct 3540
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acatcagcgg aatcaacgcc agcgtcgtga acatccagaa agagatcgac cggctgaacg 3660
aggtggccaa gaacctgaac gagagcctga tcgacctgca agaactgggg aagtacgagc 3720
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gcagctgcgg cagctgctgc aagttcgacg aggacgacag cgagcccgtg ctgaagggcg 3900
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tgttccctaa gtccaactac taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat 4020
tctgcctaat aaaaaacatt tattttcatt gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacgaagagc aagctttggc 4180
<210> 16
<211> 4134
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 S全长优化的mRNA-003
<400> 16
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auguucgugu uccuggugcu gcugccccug gugagcagcc agugcgugaa 120
ccugaccacc agaacacagc ugcccccagc cuacaccaac agcuucacca gaggcgugua 180
cuaccccgac aagguguuca gaagcagcgu gcugcacagc acccaggacc uguuccugcc 240
cuucuucagc aacgugaccu gguuccacgc cauccacgug agcggcacca acggcaccaa 300
gagauucgac aaccccgugc ugcccuucaa cgacggggug uacuucgcca gcaccgagaa 360
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ggaccuggaa ggcaagcagg gcaacuucaa gaaccugcgc gaguucgugu ucaagaacau 660
cgacggcuac uucaagaucu acagcaagca cacccccauc aaccucgugc gggaccugcc 720
ccagggcuuc agcgcccugg aaccccuggu ggaccugccc aucggcauca acaucacccg 780
guuccagaca cugcuggccc ugcacagaag cuaccugaca cccggcgaca gcagcagcgg 840
auggacagcc ggcgccgccg ccuacuacgu gggcuaccug cagcccagaa ccuuccugcu 900
gaaguacaac gagaacggca ccaucaccga cgccguggac ugcgcccugg acccccugag 960
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gaucagcaac ugcguggccg acuacagcgu gcuguacaac agcgccagcu ucagcaccuu 1200
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caccggcagc aacguguucc agaccagagc cggcugccug aucggagccg agcacgugaa 2040
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gacaaacagc cccagacggg ccagaagcgu ggccagccag agcaucaucg ccuacacaau 2160
gagccugggc gccgagaaca gcguggccua cagcaacaac agcaucgcca uccccaccaa 2220
cuucaccauc agcgugacca cagagauccu gcccgugagc augaccaaga ccagcgugga 2280
cugcaccaug uacaucugcg gcgacagcac cgagugcagc aaccugcugc ugcaguacgg 2340
cagcuucugc acccagcuga acagagcccu gacagggauc gccguggaac aggacaagaa 2400
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cggcggcuuc aacuucagcc agauccugcc cgaccccagc aagcccagca agcggagcuu 2520
caucgaggac cugcuguuca acaaagugac acuggccgac gccggcuuca ucaagcagua 2580
cggcgacugc cugggcgaca ucgccgccag ggaccugauc ugcgcccaga aguucaacgg 2640
acugacagug cugccccccc ugcugaccga cgagaugauc gcccaguaca caagcgcccu 2700
gcuggccggc acaaucacaa gcggcuggac auucggagcc ggcgccgccc ugcagauccc 2760
cuucgccaug cagauggccu accgguucaa cggcaucgga gugacccaga acgugcugua 2820
cgagaaccag aagcugaucg ccaaccaguu caacagcgcc aucggcaaga uccaggacag 2880
ccugagcagc acagcaagcg cccugggaaa gcugcaggac guggucaacc agaacgccca 2940
ggcacugaac acccugguca agcagcugag cagcaacuuc ggcgccauca gcagcgugcu 3000
gaacgacauc cugagcagac uggacaaggu ggaagccgag gugcagaucg acagacugau 3060
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gaucagagcc agcgccaacc uggccgccac caagaugagc gagugcgugc ugggccagag 3180
caagagagug gacuucugcg gcaagggcua ccaccugaug agcuuccccc agagcgcccc 3240
ccacggcgug guguuccugc acgugacaua cgugcccgcc caagagaaga acuucaccac 3300
cgccccagcc aucugccacg acggcaaagc ccacuucccc agagaaggcg uguucgugag 3360
caacggcacc cacugguucg ugacccagcg gaacuucuac gagccccaga ucaucaccac 3420
cgacaacacc uucgugagcg gcaacugcga cgucgugauc ggcaucguga acaacaccgu 3480
guacgacccc cugcagcccg agcuggacag cuucaaagag gaacuggaca aguacuucaa 3540
gaaccacaca agccccgacg uggaccuggg cgacaucagc ggaaucaacg ccagcgucgu 3600
gaacauccag aaagagaucg accggcugaa cgagguggcc aagaaccuga acgagagccu 3660
gaucgaccug caagaacugg ggaaguacga gcaguacauc aaguggcccu gguacaucug 3720
gcugggcuuc aucgccggac ugaucgccau cgugaugguc acaaucaugc ugugcugcau 3780
gaccagcugc ugcagcugcc ugaagggcug cugcagcugc ggcagcugcu gcaaguucga 3840
cgaggacgac agcgagcccg ugcugaaggg cgugaaacug cacuacacau gagcucgcuu 3900
ucuugcuguc caauuucuau uaaagguucc uuuguucccu aaguccaacu acuaaacugg 3960
gggauauuau gaagggccuu gagcaucugg auucugccua auaaaaaaca uuuauuuuca 4020
uugcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 4134
<210> 17
<211> 943
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 17
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgttc gtgttcctgg tgctgctgcc 120
cctggtgagc agcagagtgc agcccaccga gagcatcgtg cggttcccca acatcaccaa 180
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<210> 18
<211> 1069
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 模板DNA
<400> 18
tgatgctagc gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca 60
actgtgttca ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc 120
tgcccctggt gagcagcaga gtgcagccca ccgagagcat cgtgcggttc cccaacatca 180
ccaacctgtg ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag attcgccagc gtgtacgcct 240
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agagctacgg cttccagccc acaaacggcg tgggctacca gccctacaga gtggtggtgc 720
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aggttccttt gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag 900
catctggatt ctgcctaata aaaaacattt attttcattg caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa acgaagagca agctttggc 1069
<210> 19
<211> 1023
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD优化的mRNA-004
<400> 19
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auguucgugu uccuggugcu gcugccccug gugagcagca gagugcagcc 120
caccgagagc aucgugcggu uccccaacau caccaaccug ugccccuucg gcgagguguu 180
caacgccacc agauucgcca gcguguacgc cuggaaccgg aagcggauca gcaacugcgu 240
ggccgacuac agcgugcugu acaacagcgc cagcuucagc accuucaagu gcuacggcgu 300
gagccccacc aagcugaacg accugugcuu caccaacgug uacgccgaca gcuucgugau 360
cagaggcgac gaagugcggc agaucgcccc cggacagaca ggcaagaucg ccgacuacaa 420
cuacaagcug cccgacgacu ucaccggcug cgugaucgcc uggaacagca acaaccugga 480
cagcaaaguc ggcggcaacu acaacuaccu guaccggcug uuccggaagu ccaaccugaa 540
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agcucgcuuu cuugcugucc aauuucuauu aaagguuccu uuguucccua aguccaacua 840
cuaaacuggg ggauauuaug aagggccuug agcaucugga uucugccuaa uaaaaaacau 900
uuauuuucau ugcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaa 1023
<210> 20
<211> 995
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 模板DNA
<400> 20
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgttc gtgttcctgg tgctgctgcc 120
cctggtgagc agcagagtgc agcccaccga gagcatcgtg cggttcccca acatcaccaa 180
cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc caccagattc gccagcgtgt acgcctggaa 240
ccggaagcgg atcagcaact gcgtggccga ctacagcgtg ctgtacaaca gcgccagctt 300
cagcaccttc aagtgctacg gcgtgagccc caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa 360
cgtgtacgcc gacagcttcg tgatcagagg cgacgaagtg cggcagatcg cccccggaca 420
gacaggcaag atcgccgact acaactacaa gctgcccgac gacttcaccg gctgcgtgat 480
cgcctggaac agcaacaacc tggacagcaa agtcggcggc aactacaact acctgtaccg 540
gctgttccgg aaaagcaacc tgaagccctt cgagcgggac atcagcaccg agatctacca 600
ggccggcagc accccctgca acggcgtgga aggcttcaac tgctacttcc cactgcagag 660
ctacggcttc cagcccacaa acggcgtggg ctaccagccc tacagagtgg tggtgctgag 720
cttcgagctg ctgcacgccc ccgccacagt gtgcggcccc aagaaaagca ccaacctggt 780
caagaacaaa tgcgtgaact tctgagctcg ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt 840
tcctttgttc cctaagtcca actactaaac tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc 900
tggattctgc ctaataaaaa acatttattt tcattgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacga agagc 995
<210> 21
<211> 963
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD S2000 mRNA
<400> 21
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
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caccgagagc aucgugcggu uccccaacau caccaaccug ugccccuucg gcgagguguu 180
caacgccacc agauucgcca gcguguacgc cuggaaccgg aagcggauca gcaacugcgu 240
ggccgacuac agcgugcugu acaacagcgc cagcuucagc accuucaagu gcuacggcgu 300
gagccccacc aagcugaacg accugugcuu caccaacgug uacgccgaca gcuucgugau 360
cagaggcgac gaagugcggc agaucgcccc cggacagaca ggcaagaucg ccgacuacaa 420
cuacaagcug cccgacgacu ucaccggcug cgugaucgcc uggaacagca acaaccugga 480
cagcaaaguc ggcggcaacu acaacuaccu guaccggcug uuccggaaaa gcaaccugaa 540
gcccuucgag cgggacauca gcaccgagau cuaccaggcc ggcagcaccc ccugcaacgg 600
cguggaaggc uucaacugcu acuucccacu gcagagcuac ggcuuccagc ccacaaacgg 660
cgugggcuac cagcccuaca gagugguggu gcugagcuuc gagcugcugc acgcccccgc 720
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agcucgcuuu cuugcugucc aauuucuauu aaagguuccu uuguucccua aguccaacua 840
cuaaacuggg ggauauuaug aagggccuug agcaucugga uucugccuaa uaaaaaacau 900
uuauuuucau ugcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaa 963
<210> 22
<211> 995
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 模板DNA
<400> 22
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgttc gtgttcctgg tgctgctgcc 120
cctggtgagc agcagagtgc agcccaccga gagcatcgtg cggttcccca acatcaccaa 180
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ctacggcttc cagcccacaa acggcgtggg ctaccagccc tacagagtgg tggtgctgag 720
cttcgagctg ctgcacgccc ccgccacagt gtgcggcccc aagaaaagca ccaacctggt 780
caagaacaag agcgtgaact tctgagctcg ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt 840
tcctttgttc cctaagtcca actactaaac tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc 900
tggattctgc ctaataaaaa acatttattt tcattgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacga agagc 995
<210> 23
<211> 963
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD S2001 mRNA
<400> 23
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auguucgugu uccuggugcu gcugccccug gugagcagca gagugcagcc 120
caccgagagc aucgugcggu uccccaacau caccaaccug ugccccuucg gcgagguguu 180
caacgccacc agauucgcca gcguguacgc cuggaaccgg aagcggauca gcaacugcgu 240
ggccgacuac agcgugcugu acaacagcgc cagcuucagc accuucaagu gcuacggcgu 300
gagccccacc aagcugaacg accugugcuu caccaacgug uacgccgaca gcuucgugau 360
cagaggcgac gaagugcggc agaucgcccc cggacagaca ggcaagaucg ccgacuacaa 420
cuacaagcug cccgacgacu ucaccggcug cgugaucgcc uggaacagca acaaccugga 480
cagcaaaguc ggcggcaacu acaacuaccu guaccggcug uuccggaaaa gcaaccugaa 540
gcccuucgag cgggacauca gcaccgagau cuaccaggcc ggcagcaccc ccugcaacgg 600
cguggaaggc uucaacugcu acuucccacu gcagagcuac ggcuuccagc ccacaaacgg 660
cgugggcuac cagcccuaca gagugguggu gcugagcuuc gagcugcugc acgcccccgc 720
cacagugugc ggccccaaga aaagcaccaa ccuggucaag aacaagagcg ugaacuucug 780
agcucgcuuu cuugcugucc aauuucuauu aaagguuccu uuguucccua aguccaacua 840
cuaaacuggg ggauauuaug aagggccuug agcaucugga uucugccuaa uaaaaaacau 900
uuauuuucau ugcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaa 963
<210> 24
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2 RBD S2001
<400> 24
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
225 230 235
<210> 25
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD S2001
<400> 25
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
210 215 220
<210> 26
<211> 926
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 模板DNA
<400> 26
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgttc gtgttcctgg tgctgctgcc 120
cctggtgagc agcttcccca acatcaccaa cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc 180
cacaagattc gccagcgtgt acgcctggaa ccggaagcgg atcagcaact gcgtggccga 240
ctacagcgtg ctgtacaaca gcgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgagccc 300
caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatcagagg 360
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ctaccagccc tacagagtgg tggtgctgag cttcgagctg ctgcacgccc ccgccacagt 720
gtgcggaccc aaatgagctc gctttcttgc tgtccaattt ctattaaagg ttcctttgtt 780
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cctaataaaa aacatttatt ttcattgcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaacg aagagc 926
<210> 27
<211> 894
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD S2002 mRNA
<400> 27
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
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cagcuucagc accuucaagu gcuacggcgu gagccccacc aagcugaacg accugugcuu 300
caccaacgug uacgccgaca gcuucgugau cagaggcgac gaagugcggc agaucgcccc 360
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guaccggcug uuccggaaaa gcaaccugaa gcccuucgag cgggacauca gcaccgagau 540
cuaccaggcc ggcagcaccc ccugcaacgg cguggaaggc uucaacugcu acuucccacu 600
gcagagcuac ggcuuccagc ccacaaacgg cgugggcuac cagcccuaca gagugguggu 660
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ucuugcuguc caauuucuau uaaagguucc uuuguucccu aaguccaacu acuaaacugg 780
gggauauuau gaagggccuu gagcaucugg auucugccua auaaaaaaca uuuauuuuca 840
uugcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 894
<210> 28
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2 RBD S2002
<400> 28
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Phe Pro Asn
1 5 10 15
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
20 25 30
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
35 40 45
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
50 55 60
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
85 90 95
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
100 105 110
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
115 120 125
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
130 135 140
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
145 150 155 160
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
165 170 175
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
180 185 190
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
195 200 205
Val Cys Gly Pro Lys
210
<210> 29
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD S2002
<400> 29
Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala
1 5 10 15
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
20 25 30
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
35 40 45
Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe
50 55 60
Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg
65 70 75 80
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys
85 90 95
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
100 105 110
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
115 120 125
Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile
130 135 140
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys
145 150 155 160
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly
165 170 175
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala
180 185 190
Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
195 200
<210> 30
<211> 1064
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 模板DNA
<400> 30
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgttc gtgttcctgg tgctgctgcc 120
cctggtgagc agcgagaagg gcatctacca gaccagcaac ttcagagtgc agcccaccga 180
gagcatcgtg cggttcccca acatcaccaa cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc 240
caccagattc gccagcgtgt acgcctggaa ccggaagcgg atcagcaact gcgtggccga 300
ctacagcgtg ctgtacaaca gcgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgagccc 360
caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatcagagg 420
cgacgaagtg cggcagatcg cccccggaca gacaggcaag atcgccgact acaactacaa 480
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ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaacgaa gagc 1064
<210> 31
<211> 1032
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD S2003 mRNA
<400> 31
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auguucgugu uccuggugcu gcugccccug gugagcagcg agaagggcau 120
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guaccggcug uuccggaaaa gcaaccugaa gcccuucgag cgggacauca gcaccgagau 600
cuaccaggcc ggcagcaccc ccugcaacgg cguggaaggc uucaacugcu acuucccacu 660
gcagagcuac ggcuuccagc ccacaaacgg cgugggcuac cagcccuaca gagugguggu 720
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ccuggucaag aacaagagcg ugaacuucaa cuucaacggc cugaccggca ccggcguguu 840
gacagaauga gcucgcuuuc uugcugucca auuucuauua aagguuccuu uguucccuaa 900
guccaacuac uaaacugggg gauauuauga agggccuuga gcaucuggau ucugccuaau 960
aaaaaacauu uauuuucauu gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aa 1032
<210> 32
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2 RBD S2003
<400> 32
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Glu Lys Gly
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val
20 25 30
Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
35 40 45
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
50 55 60
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
65 70 75 80
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
85 90 95
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
100 105 110
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
115 120 125
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
130 135 140
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
145 150 155 160
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
165 170 175
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
180 185 190
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
195 200 205
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
210 215 220
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys
225 230 235 240
Asn Lys Ser Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val
245 250 255
Leu Thr Glu
<210> 33
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD S2003
<400> 33
Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu
1 5 10 15
Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu
20 25 30
Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys
35 40 45
Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala
50 55 60
Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn
65 70 75 80
Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly
85 90 95
Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp
100 105 110
Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp
115 120 125
Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu
130 135 140
Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile
145 150 155 160
Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu
165 170 175
Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr
180 185 190
Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu
195 200 205
Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn
210 215 220
Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly
225 230 235 240
Thr Gly Val Leu Thr Glu
245
<210> 34
<211> 995
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 模板DNA
<400> 34
gctagcgtaa tacgactcac tataaggaga cccaagctac atttgcttct gacacaactg 60
tgttcactag caacctcaaa cagacaccgc caccatgttc gtgttcctgg tgctgctgcc 120
cctggtgagc agcagagtgc agcccaccga gagcatcgtg cggttcccca acatcaccaa 180
cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc caccagattc gccagcgtgt acgcctggaa 240
ccggaagcgg atcaacaact gcgtggccga ctacagcgtg ctgtacaaca gcaccagctt 300
cagcaccttc aagtgctacg gcgtgagccc caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa 360
cgtgtacgcc gacagcttcg tgatcagagg cgacgaagtg cggcagatcg cccccggaca 420
gacaggcaag atcgccgact acaactacaa gctgcccgac gacttcaccg gctgcgtgat 480
cgcctggaac agcaacaccc tggacagcaa agtcggcggc aactacacct acctgtaccg 540
gctgttcaga aagagcaacc tgaagccctt cgagcgggac atcagcaccg agatctacca 600
ggccggcagc accccctgca acggcgtgga aggcttcaac tgctacttcc cactgcagag 660
ctacggcttc cagcccacaa acggcgtggg ctaccagccc tacagagtgg tggtgctgag 720
cttcgagctg ctgcacgccc ccgccacagt gtgcggcccc aagaaaagca ccaacctggt 780
caagaacaag agcgtgaact tctgagctcg ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt 840
tcctttgttc cctaagtcca actactaaac tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc 900
tggattctgc ctaataaaaa acatttattt tcattgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacga agagc 995
<210> 35
<211> 963
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD S2004 mRNA
<400> 35
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
caccgccacc auguucgugu uccuggugcu gcugccccug gugagcagca gagugcagcc 120
caccgagagc aucgugcggu uccccaacau caccaaccug ugccccuucg gcgagguguu 180
caacgccacc agauucgcca gcguguacgc cuggaaccgg aagcggauca acaacugcgu 240
ggccgacuac agcgugcugu acaacagcac cagcuucagc accuucaagu gcuacggcgu 300
gagccccacc aagcugaacg accugugcuu caccaacgug uacgccgaca gcuucgugau 360
cagaggcgac gaagugcggc agaucgcccc cggacagaca ggcaagaucg ccgacuacaa 420
cuacaagcug cccgacgacu ucaccggcug cgugaucgcc uggaacagca acacccugga 480
cagcaaaguc ggcggcaacu acaccuaccu guaccggcug uucagaaaga gcaaccugaa 540
gcccuucgag cgggacauca gcaccgagau cuaccaggcc ggcagcaccc ccugcaacgg 600
cguggaaggc uucaacugcu acuucccacu gcagagcuac ggcuuccagc ccacaaacgg 660
cgugggcuac cagcccuaca gagugguggu gcugagcuuc gagcugcugc acgcccccgc 720
cacagugugc ggccccaaga aaagcaccaa ccuggucaag aacaagagcg ugaacuucug 780
agcucgcuuu cuugcugucc aauuucuauu aaagguuccu uuguucccua aguccaacua 840
cuaaacuggg ggauauuaug aagggccuug agcaucugga uucugccuaa uaaaaaacau 900
uuauuuucau ugcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaa 963
<210> 36
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2 RBD S2004
<400> 36
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Asn Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Thr Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Thr Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
225 230 235
<210> 37
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD S2004
<400> 37
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Asn Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Thr Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Thr Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
210 215 220
<210> 38
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 38
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc tgcccctggt 120
gagcagcaga gtgcagccca ccgagagcat cgtgcggttc cccaacatca ccaacctgtg 180
ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag attcgccagc gtgtacgcct ggaaccggaa 240
gcggatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300
cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360
cgccgacagc ttcgtgatca gaggcgacga agtgcggcag atcgcccccg gacagacagg 420
caacatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480
gaacagcaac aacctggaca gcaaagtcgg cggcaactac aactacctgt accggctgtt 540
ccggaagtcc aacctgaagc ccttcgagcg ggacatcagc accgagatct accaggccgg 600
cagcaccccc tgcaacggcg tgaaaggctt caactgctac ttcccactgc agagctacgg 660
cttccagccc acatacggcg tgggctacca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga 720
gctgctgcac gcccccgcca cagtgtgcgg ccccaagaaa agcaccaacc tggtcaagaa 780
caaatgcgtg aacttctgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 840
gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 900
ctgcctaata aaaaacattt attttcattg c 931
<210> 39
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 39
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc tgcccctggt 120
gagcagcaga gtgcagccca ccgagagcat cgtgcggttc cccaacatca ccaacctgtg 180
ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag attcgccagc gtgtacgcct ggaaccggaa 240
gcggatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300
cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360
cgccgacagc ttcgtgatca gaggcgacga agtgcggcag atcgcccccg gacagacagg 420
caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480
gaacagcaac aacctggaca gcaaagtcgg cggcaactac aactacctgt accggctgtt 540
ccggaagtcc aacctgaagc ccttcgagcg ggacatcagc accgagatct accaggccgg 600
cagcaccccc tgcaacggcg tggaaggctt caactgctac ttcccactgc agagctacgg 660
cttccagccc acatacggcg tgggctacca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga 720
gctgctgcac gcccccgcca cagtgtgcgg ccccaagaaa agcaccaacc tggtcaagaa 780
caaatgcgtg aacttctgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 840
gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 900
ctgcctaata aaaaacattt attttcattg c 931
<210> 40
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 40
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc tgcccctggt 120
gagcagcaga gtgcagccca ccgagagcat cgtgcggttc cccaacatca ccaacctgtg 180
ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag attcgccagc gtgtacgcct ggaaccggaa 240
gcggatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300
cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360
cgccgacagc ttcgtgatca gaggcgacga agtgcggcag atcgcccccg gacagacagg 420
cacgatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480
gaacagcaac aacctggaca gcaaagtcgg cggcaactac aactacctgt accggctgtt 540
ccggaagtcc aacctgaagc ccttcgagcg ggacatcagc accgagatct accaggccgg 600
cagcaccccc tgcaacggcg tgaaaggctt caactgctac ttcccactgc agagctacgg 660
cttccagccc acatacggcg tgggctacca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga 720
gctgctgcac gcccccgcca cagtgtgcgg ccccaagaaa agcaccaacc tggtcaagaa 780
caaatgcgtg aacttctgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 840
gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 900
ctgcctaata aaaaacattt attttcattg c 931
<210> 41
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 41
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc tgcccctggt 120
gagcagcaga gtgcagccca ccgagagcat cgtgcggttc cccaacatca ccaacctgtg 180
ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag attcgccagc gtgtacgcct ggaaccggaa 240
gcggatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300
cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360
cgccgacagc ttcgtgatca gaggcgacga agtgcggcag atcgcccccg gacagacagg 420
caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480
gaacagcaac aacctggaca gcaaagtcgg cggcaactac aactaccggt accggctgtt 540
ccggaagtcc aacctgaagc ccttcgagcg ggacatcagc accgagatct accaggccgg 600
cagcaccccc tgcaacggcg tggaaggctt caactgctac ttcccactgc agagctacgg 660
cttccagccc acaaacggcg tgggctacca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga 720
gctgctgcac gcccccgcca cagtgtgcgg ccccaagaaa agcaccaacc tggtcaagaa 780
caaatgcgtg aacttctgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 840
gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 900
ctgcctaata aaaaacattt attttcattg c 931
<210> 42
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 42
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc tgcccctggt 120
gagcagcaga gtgcagccca ccgagagcat cgtgcggttc cccaacatca ccaacctgtg 180
ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag attcgccagc gtgtacgcct ggaaccggaa 240
gcggatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300
cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360
cgccgacagc ttcgtgatca gaggcgacga agtgcggcag atcgcccccg gacagacagg 420
caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480
gaacagcaac aacctggaca gcaaagtcgg cggcaactac aactaccggt accggctgtt 540
ccggaagtcc aacctgaagc ccttcgagcg ggacatcagc accgagatct accaggccgg 600
cagcaccccc tgcaacggcg tgcaaggctt caactgctac ttcccactgc agagctacgg 660
cttccagccc acaaacggcg tgggctacca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga 720
gctgctgcac gcccccgcca cagtgtgcgg ccccaagaaa agcaccaacc tggtcaagaa 780
caaatgcgtg aacttctgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 840
gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 900
ctgcctaata aaaaacattt attttcattg c 931
<210> 43
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 43
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc tgcccctggt 120
gagcagcaga gtgcagccca ccgagagcat cgtgcggttc cccaacatca ccaacctgtg 180
ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag attcgccagc gtgtacgcct ggaaccggaa 240
gcggatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300
cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360
cgccgacagc ttcgtgatca gaggcgacga agtgcggcag atcgcccccg gacagacagg 420
caacatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480
gaacagcaac aacctggaca gcaaagtcgg cggcaactac aactacctgt accggctgtt 540
ccggaagtcc aacctgaagc ccttcgagcg ggacatcagc accgagatct accaggccgg 600
cagcaccccc tgcaacggcg tgaaaggctt caactgctac ttcccactgc agagctacgg 660
cttccagccc acatacggcg tgggctacca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga 720
gctgctgcac gcccccgcca cagtgtgcgg ccccaagaaa agcaccaacc tggtcaagaa 780
caaaagcgtg aacttctgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 840
gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 900
ctgcctaata aaaaacattt attttcattg c 931
<210> 44
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 44
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc tgcccctggt 120
gagcagcaga gtgcagccca ccgagagcat cgtgcggttc cccaacatca ccaacctgtg 180
ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag attcgccagc gtgtacgcct ggaaccggaa 240
gcggatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300
cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360
cgccgacagc ttcgtgatca gaggcgacga agtgcggcag atcgcccccg gacagacagg 420
caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480
gaacagcaac aacctggaca gcaaagtcgg cggcaactac aactacctgt accggctgtt 540
ccggaagtcc aacctgaagc ccttcgagcg ggacatcagc accgagatct accaggccgg 600
cagcaccccc tgcaacggcg tggaaggctt caactgctac ttcccactgc agagctacgg 660
cttccagccc acatacggcg tgggctacca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga 720
gctgctgcac gcccccgcca cagtgtgcgg ccccaagaaa agcaccaacc tggtcaagaa 780
caaaagcgtg aacttctgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 840
gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 900
ctgcctaata aaaaacattt attttcattg c 931
<210> 45
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 45
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc tgcccctggt 120
gagcagcaga gtgcagccca ccgagagcat cgtgcggttc cccaacatca ccaacctgtg 180
ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag attcgccagc gtgtacgcct ggaaccggaa 240
gcggatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300
cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360
cgccgacagc ttcgtgatca gaggcgacga agtgcggcag atcgcccccg gacagacagg 420
cacgatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480
gaacagcaac aacctggaca gcaaagtcgg cggcaactac aactacctgt accggctgtt 540
ccggaagtcc aacctgaagc ccttcgagcg ggacatcagc accgagatct accaggccgg 600
cagcaccccc tgcaacggcg tgaaaggctt caactgctac ttcccactgc agagctacgg 660
cttccagccc acatacggcg tgggctacca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga 720
gctgctgcac gcccccgcca cagtgtgcgg ccccaagaaa agcaccaacc tggtcaagaa 780
caaaagcgtg aacttctgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 840
gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 900
ctgcctaata aaaaacattt attttcattg c 931
<210> 46
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 46
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc tgcccctggt 120
gagcagcaga gtgcagccca ccgagagcat cgtgcggttc cccaacatca ccaacctgtg 180
ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag attcgccagc gtgtacgcct ggaaccggaa 240
gcggatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300
cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360
cgccgacagc ttcgtgatca gaggcgacga agtgcggcag atcgcccccg gacagacagg 420
caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480
gaacagcaac aacctggaca gcaaagtcgg cggcaactac aactaccggt accggctgtt 540
ccggaagtcc aacctgaagc ccttcgagcg ggacatcagc accgagatct accaggccgg 600
cagcaccccc tgcaacggcg tggaaggctt caactgctac ttcccactgc agagctacgg 660
cttccagccc acaaacggcg tgggctacca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga 720
gctgctgcac gcccccgcca cagtgtgcgg ccccaagaaa agcaccaacc tggtcaagaa 780
caaaagcgtg aacttctgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt 840
gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt 900
ctgcctaata aaaaacattt attttcattg c 931
<210> 47
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA插入
<400> 47
gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60
ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gttcgtgttc ctggtgctgc tgcccctggt 120
gagcagcaga gtgcagccca ccgagagcat cgtgcggttc cccaacatca ccaacctgtg 180
ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag attcgccagc gtgtacgcct ggaaccggaa 240
gcggatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300
cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360
cgccgacagc ttcgtgatca gaggcgacga agtgcggcag atcgcccccg gacagacagg 420
caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480
gaacagcaac aacctggaca gcaaagtcgg cggcaactac aactaccggt accggctgtt 540
ccggaagtcc aacctgaagc ccttcgagcg ggacatcagc accgagatct accaggccgg 600
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cttccagccc acaaacggcg tgggctacca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga 720
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 1013
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD mRNA (南非 C538S变体)
<400> 71
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
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<211> 1013
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> SARS-CoV-2变体RBD mRNA (UK C538S变体)
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD mRNA (巴西C538S变体)
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aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
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cacagugugc ggccccaaga aaagcaccaa ccuggucaag aacaaaagcg ugaacuucug 780
agcucgcuuu cuugcugucc aauuucuauu aaagguuccu uuguucccua aguccaacua 840
cuaaacuggg ggauauuaug aagggccuug agcaucugga uucugccuaa uaaaaaacau 900
uuauuuucau ugcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1013
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcucgcuuu cuugcugucc aauuucuauu aaagguuccu uuguucccua aguccaacua 840
cuaaacuggg ggauauuaug aagggccuug agcaucugga uucugccuaa uaaaaaacau 900
uuauuuucau ugcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
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<211> 1013
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> RNA
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<212> RNA
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<223> SARS-CoV-2变体RBD mRNA (组合变体2)
<400> 77
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ggccgacuac agcgugcugu acaacagcgc cagcuucagc accuucaagu gcuacggcgu 300
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cagaggcgac gaagugcggc agaucgcccc cggacagaca ggcaagaucg ccgacuacaa 420
cuacaagcug cccgacgacu ucaccggcug cgugaucgcc uggaacagca acaaccugga 480
cagcaaaguc ggcggcaacu acaacuaccu guaccggcug uuccggaagu ccaaccugaa 540
gcccuucgag cgggacauca gcaccgagau cuaccaggcc ggcagaaccc ccugcaacgg 600
cguggaaggc uucaacugcu accucccacu gcagagcuac ggcuuccagc ccacaaacgg 660
cgugggcuac cagcccuaca gagugguggu gcugagcuuc gagcugcugc acgcccccgc 720
cacagugugc ggccccaaga aaagcaccaa ccuggucaag aacaaaugcg ugaacuucug 780
agcucgcuuu cuugcugucc aauuucuauu aaagguuccu uuguucccua aguccaacua 840
cuaaacuggg ggauauuaug aagggccuug agcaucugga uucugccuaa uaaaaaacau 900
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<210> 78
<211> 1013
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD mRNA (组合变体3)
<400> 78
aggagaccca agcuacauuu gcuucugaca caacuguguu cacuagcaac cucaaacaga 60
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caacgccacc agauucgcca gcguguacgc cuggaaccgg aagcggauca gcaacugcgu 240
ggccgacuac agcgugcugu acaacagcgc cagcuucagc accuucaagu gcuacggcgu 300
gagccccacc aagcugaacg accugugcuu caccaacgug uacgccgaca gcuucgugau 360
cagaggcgac gaagugcggc agaucgcccc cggacagaca ggcaacaucg ccgacuacaa 420
cuacaagcug cccgacgacu ucaccggcug cgugaucgcc uggaacagca acaaccugga 480
cagcaaaguc ggcggcaacu acaacuaccu guaccggcug uuccggaagu ccaaccugaa 540
gcccuucgag cgggacauca gcaccgagau cuaccaggcc ggcagaaccc ccugcaacgg 600
cgugaaaggc uucaacugcu acuucccacu gcagagcuac ggcuuccagc ccacauacgg 660
cgugggcuac cagcccuaca gagugguggu gcugagcuuc gagcugcugc acgcccccgc 720
cacagugugc ggccccaaga aaagcaccaa ccuggucaag aacaaaugcg ugaacuucug 780
agcucgcuuu cuugcugucc aauuucuauu aaagguuccu uuguucccua aguccaacua 840
cuaaacuggg ggauauuaug aagggccuug agcaucugga uucugccuaa uaaaaaacau 900
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<210> 79
<211> 1013
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD mRNA (组合变体4)
<400> 79
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caacgccacc agauucgcca gcguguacgc cuggaaccgg aagcggauca gcaacugcgu 240
ggccgacuac agcgugcugu acaacagcgc cagcuucagc accuucaagu gcuacggcgu 300
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cagaggcgac gaagugcggc agaucgcccc cggacagaca ggcaagaucg ccgacuacaa 420
cuacaagcug cccgacgacu ucaccggcug cgugaucgcc uggaacagca acaaccugga 480
cagcaaaguc ggcggcaacu acaacuaccu guaccggcug uuccggaagu ccaaccugaa 540
gcccuucgag cgggacauca gcaccgagau cuaccaggcc ggcagcaccc ccugcaacgg 600
cguggaaggc agcaacugcu accucccacu gcagagcuac ggcuuccagc ccacaaacgg 660
cgugggcuac cagcccuaca gagugguggu gcugagcuuc gagcugcugc acgcccccgc 720
cacagugugc ggccccaaga aaagcaccaa ccuggucaag aacaaaugcg ugaacuucug 780
agcucgcuuu cuugcugucc aauuucuauu aaagguuccu uuguucccua aguccaacua 840
cuaaacuggg ggauauuaug aagggccuug agcaucugga uucugccuaa uaaaaaacau 900
uuauuuucau ugcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1013
<210> 80
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD (南非变体)
<400> 80
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD
(巴西变体)
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<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD
(加利福尼亚变体)
<400> 83
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD
(印度变体)
<400> 84
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225 230 235
<210> 85
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD (南非C538S变体)
<400> 85
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<210> 86
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD (UK C538S变体)
<400> 86
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
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225 230 235
<210> 87
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD
(巴西C538S变体)
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50 55 60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Thr
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
225 230 235
<210> 88
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD
(加利福尼亚 C538S变体)
<400> 88
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
225 230 235
<210> 89
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD
(印度 C538S变体)
<400> 89
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
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35 40 45
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
225 230 235
<210> 90
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD
(组合变体1)
<400> 90
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50 55 60
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210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
225 230 235
<210> 91
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD
(组合变体2)
<400> 91
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210 215 220
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225 230 235
<210> 92
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD
(组合变体3)
<400> 92
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
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100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Arg Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
225 230 235
<210> 93
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 添加S蛋白信号序列的SARS-CoV-2变体RBD
(组合变体4)
<400> 93
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
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165 170 175
Gly Val Glu Gly Ser Asn Cys Tyr Leu Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
225 230 235
<210> 94
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (南非变体)
<400> 94
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 95
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (UK变体)
<400> 95
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
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Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
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Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 96
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (巴西变体)
<400> 96
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
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50 55 60
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195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 97
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (加利福尼亚变体)
<400> 97
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
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Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
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Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 98
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (印度变体)
<400> 98
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
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Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
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Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
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Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
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100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Gln Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 99
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (南非 C538S变体)
<400> 99
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
210 215 220
<210> 100
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (UK C538S变体)
<400> 100
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
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65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
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100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
210 215 220
<210> 101
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (巴西C538S变体)
<400> 101
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
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165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
210 215 220
<210> 102
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (加利福尼亚 C538S变体)
<400> 102
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
210 215 220
<210> 103
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (印度 C538S变体)
<400> 103
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Gln Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
210 215 220
<210> 104
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (组合变体1)
<400> 104
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Lys Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Val Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Ala Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 105
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (组合变体2)
<400> 105
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Arg Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Leu Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 106
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (组合变体3)
<400> 106
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Arg Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 107
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2变体RBD (组合变体4)
<400> 107
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Ser Asn Cys Tyr Leu Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220

Claims (52)

1.脂质粒子，其包封了能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白和/或其片段的核酸，其中脂质包含由通式(Ia)表示的阳离子脂质、或其药学上容许的盐，
[化学式1]
Figure FDA0003943873530000011
式中，
R1和R2独立地表示C1-C3烷基；
L1表示任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C17-C19烯基；
L2表示任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烷基、或任选具有1个或多个C2-C4烷酰氧基的C10-C19烯基；
p是3或4。
2.权利要求1中所述的粒子，其中，通式(Ia)中的R1和R2都是甲基。
3.权利要求1或2中所述的粒子，其中，通式(Ia)中的p是3。
4.权利要求1～3的任一项中所述的粒子，其中，通式(Ia)中的L1是任选具有1个或多个乙酰氧基的C17-C19烯基。
5.权利要求1～4的任一项中所述的粒子，其中，通式(Ia)中的L2是任选具有1个或多个乙酰氧基的C10-C12烷基、或任选具有1个或多个乙酰氧基的C10-C19烯基。
6.权利要求1～4的任一项中所述的粒子，其中，通式(Ia)中的L2是任选具有1个或多个乙酰氧基的C10-C12烷基、或任选具有1个或多个乙酰氧基的C17-C19烯基。
7.权利要求1～6的任一项中所述的粒子，其中，通式(Ia)中的L1是(R)-11-乙酰基氧基-顺式-8-十七碳烯基、顺式-8-十七碳烯基、或(8Z，11Z)-十七碳二烯基。
8.权利要求1～7的任一项中所述的粒子，其中，通式(Ia)中的L2是癸基、顺式-7-癸烯基、十二烷基、或(R)-11-乙酰基氧基-顺式-8-十七碳烯基。
9.权利要求1中所述的粒子，其中，阳离子脂质由下述的结构式表示：
[化学式2]
Figure FDA0003943873530000021
10.权利要求1中所述的粒子，其中，阳离子脂质由下述的结构式表示：
[化学式3]
Figure FDA0003943873530000022
11.权利要求1中所述的粒子，其中，阳离子脂质由下述的结构式表示：
[化学式4]
Figure FDA0003943873530000023
12.权利要求1～11的任一项中所述的粒子，其中，脂质进一步包含两亲性脂质、甾醇类和PEG脂质。
13.权利要求12所述的粒子，其中，两亲性脂质是选自二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰乙醇胺的至少1个。
14.权利要求12或13中所述的粒子，其中，甾醇类是胆固醇。
15.权利要求12～14的任一项中所述的粒子，其中，PEG脂质是1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基聚乙二醇和/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]氨基甲酰基]-1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺。
16.权利要求12～15的任一项中所述的粒子，其中，两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成是以摩尔量计，两亲性脂质为15％以下、甾醇类为20～55％、阳离子脂质为40～65％、PEG脂质为1～5％，相对于核酸重量的总脂质重量的比率是15～30。
17.权利要求16所述的粒子，其中，两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成是以摩尔量计，两亲性脂质为5～15％、甾醇类为35～50％、阳离子脂质为40～55％、PEG脂质为1～3％，相对于核酸重量的总脂质重量的比率是15～25。
18.权利要求17所述的粒子，其中，两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成是以摩尔量计，两亲性脂质为10～15％、甾醇类为35～45％、阳离子脂质为40～50％、PEG脂质为1～2％，相对于核酸重量的总脂质重量的比率是17.5～22.5。
19.权利要求18所述的粒子，其中，两亲性脂质、甾醇类、阳离子脂质、和PEG脂质的脂质组成是以摩尔量计，两亲性脂质为10～15％、甾醇类为35～45％、阳离子脂质为45～50％、PEG脂质为1.5～2％，相对于核酸重量的总脂质重量的比率是17.5～22.5。
20.权利要求1～19的任一项中所述的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段包含受体结合结构域。
21.权利要求20中所述的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段中的受体结合结构域由与序列编号11的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
22.权利要求20中所述的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段中的受体结合结构域由与序列编号25、29、33、37、94～107的任一种的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
23.权利要求20中所述的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段由与序列编号10的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
24.权利要求20中所述的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段由与序列编号24、28、32、36、80～93的任一种的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
25.权利要求1～19所述的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白由与序列编号6的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
26.权利要求25所述的粒子，其中，新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白中的受体结合结构域由与序列编号11的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列组成。
27.权利要求25或26中所述的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的核酸是包含帽结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、S蛋白的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾部(polyA)的mRNA。
28.权利要求20～24的任一项中所述的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段的核酸是包含帽结构(Cap)、5’非翻译区(5’-UTR)、前导序列(leader sequence)、S蛋白中的受体结合结构域的翻译区、3’非翻译区(3’-UTR)和多聚A尾部(polyA)的mRNA。
29.权利要求27所述的粒子，其中，S蛋白的翻译区的序列由与序列编号5的序列中S蛋白的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列组成。
30.权利要求27所述的粒子，其中，S蛋白的翻译区的序列由与序列编号16的序列中S蛋白的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列组成。
31.权利要求27所述的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的核酸由序列编号5的核苷酸序列组成。
32.权利要求27所述的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的核酸由序列编号16的核苷酸序列组成。
33.权利要求27所述的粒子，其中，S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列由与序列编号9的序列中S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列组成。
34.权利要求27所述的粒子，其中，S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列由与序列编号19的序列中S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列组成。
35.权利要求27所述的粒子，其中，S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列由与序列编号21、23、27、31、35、66～79的任一序列中S蛋白中的受体结合结构域的翻译区的序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列组成。
36.权利要求28所述的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段的核酸由序列编号9的核苷酸序列组成。
37.权利要求28所述的粒子，其中，能够表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白的片段的核酸由序列编号19的核苷酸序列组成。
38.权利要求1～37的任一项中所述的粒子，其中，核酸包含至少1个的修饰核苷酸。
39.权利要求38所述的粒子，其中，修饰核苷酸包含5位被取代的嘧啶核苷酸和/或1位被任选取代的假尿苷的至少1个。
40.权利要求38所述的粒子，其中，修饰核苷酸包含选自5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿苷、和1-烷基假尿苷的至少1个。
41.权利要求1～40的任一项中所述的粒子，其中，粒子的平均粒径是30nm～300nm。
42.权利要求1～41的任一项中所述的粒子在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)引起的感染的组合物中的应用。
43.组合物，其包含权利要求1～41的任一项中所述的粒子。
44.权利要求43所述的组合物，其用于在体内或体外表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白和/或其片段。
45.权利要求43或44所述的组合物，其用作药物。
46.权利要求45所述的组合物，其用于诱导针对新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的免疫反应。
47.权利要求45或46所述的组合物，其用于预防和/或治疗新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)感染。
48.在体外表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白和/或其片段的方法，其包括将权利要求43或44中所述的组合物导入细胞。
49.在体内表达新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的S蛋白和/或其片段的方法，其包括向哺乳动物施用权利要求43～47的任一项中所述的组合物。
50.诱导针对新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)的免疫反应的方法，其包括向哺乳动物施用权利要求45或46中所述的组合物。
51.预防和/或治疗新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2：SARS-CoV-2)感染的方法，其包括向哺乳动物施用权利要求45～47的任一项中所述的组合物。
52.权利要求49～51的任一项中所述的方法，其中，哺乳动物是人。
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