KR20230024261A - 핵산 지질 입자 백신 - Google Patents

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요시히로 가와오카
마사키 이마이
세이야 야마요시
겐 이시이
고우지 고비야마
에이코 남바
다츠야 오카
미유키 도즈카
나오 조나이
요시쿠니 오노데라
후미히코 다케시타
다카시 스즈키
다카코 니와
마코토 고이즈미
겐스케 나카무라
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다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠
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Abstract

신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신을 제공한다. 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자로서, 지질이 일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 상기 입자.
Figure pct00142

식 중, R1 및 R2 는, 독립적으로, C1 - C3 알킬기를 나타내고 ; L1 은, C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C17 - C19 알케닐기를 나타내고 ; L2 는, C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알킬기, 또는 C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알케닐기를 나타내고 ; p 는, 3 또는 4 이다.

Description

핵산 지질 입자 백신
본 발명은 SARS-CoV-2 mRNA 를 봉입 (封入) 한 핵산 지질 입자 백신에 관한 것이다.
신형 코로나 바이러스 감염증 (coronavirus disease 2019 : COVID-19) 은 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 에서 기인한 감염증으로, 호흡기에서의 급성 염증을 주체로 한 병태를 나타내고, 특히 하이리스크자에 있어서의 침습성 폐렴 및 급성 호흡 궁박 증후군 등의 하 기도에서의 염증을 주체로 하는 병태가 질병 부담으로 되어 있다 (비특허문헌 1). 인간에게 감염되어 주로 호흡기 증상을 나타내는 coronavirus (CoV) 는 6 종류 이상 알려져 있다. SARS-CoV-2 는 betacoronavirus 속으로 분류되고, 과거에 아웃브레이크를 일으킨 SARS-CoV 나 Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) 와 바이러스학적으로 유사하다.
SARS-CoV-2 의 바이러스 입자 표면에 발현하는 spike protein(S) 는, 초기 감염기서에 중요한 역할을 하고 있다. S 는, 2 개의 서브 유닛 S1 과 S2 로 구성되는 I 형 막 단백질로 3 량체를 형성한다 (약 500 kDa, 약 20 ㎚). S1 에 존재하는 receptor-binding domain (RBD) 이 숙주 세포 표면에 발현하는 angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) 와 상호 작용한다. SARS-CoV 의 S 와 비교하여, SARS-CoV-2 의 S 는, ACE2 에 대한 친화성이 10 - 20 배 높은 것 및 열역학적 안정성이 높은 것이 시사되어 있고, SARS-CoV-2 의 높은 전파성에 관여하고 있는 것이 시사되어 있다 (비특허문헌 2, 3).
SARS 환자의 회복기 혈청 중에는, 적어도 3 년 이상 RBD 에 대한 IgG 가 존속하고, 혈청을 RBD 단백질로 처리하여 항 RBD 항체를 흡착시킨 후에는, 중화 활성이 50 ％ 이하로 감약되므로, 항 RBD 항체가 주요 중화 활성을 담당하고 있는 것이 시사되고 있다 (비특허문헌 4, 5). 실제로, 분리된 항 SARS-CoV-2 RBD 모노클로날 항체는, SARS-CoV-2 에 대한 중화 활성을 갖는 것이 보고되고 있다 (비특허문헌 6, 7).
무증상이 된 후 3 주간 정도 경과한 COVID-19 환자 회복기 말초혈을 사용한 해석으로부터, SARS-CoV-2 의 감염 방어에는, 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 유도가 중요하다고 생각되고 있다 (비특허문헌 8). 구체적으로는, 10 - 20 예의 COVID-19 환자 혈액 검체를 해석한 결과, 모든 증례에서, 혈중 항 SARS-CoV-2 RBD 항체 응답 및 SARS-CoV-2 특이적 CD4+ T 세포 응답이 확인되고, 약 70 ％ 의 증례에서, SARS-CoV-2 특이적 CD8+ T 세포 응답이 확인되고 있다. 또, 혈중 항 SARS-CoV-2 RBD IgG 가와 S 특이적 CD4+ T 세포 빈도가 상관되는 (R = 0.8109) 점에서, S 에 T 세포 에피토프가 존재하고, 항체 응답의 유도에 S 특이적 CD4+ T 세포가 중요한 역할을 하고 있을 가능성이 시사되었다 (비특허문헌 8). 또한, 혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성과 혈중 항 SARS-CoV-2 S IgG 가가 상관되는 (R = 0.9279) 것이 나타나 있다 (비특허문헌 9).
COVID-19 증상이 중증화되는 「immune enhancement」 의 기서로서, cellular immunopathology 와 antibody-dependent enhancement (ADE) 가 관여하고 있을 가능성이 상정되고 있다 (비특허문헌 10). SARS 의 경우에는, 경증으로 회복한 환자와 비교하여, 치사 환자는, 혈중 사이토카인 프로파일이 T 헬퍼 (Th) 2 형 우위로 되어 있는 것이 시사되고 있다 (비특허문헌 11). 마우스 SARS-CoV 감염 모델에 있어서, S 에 대한 Th2 우위의 면역 응답은, 호산구를 주체로 한 염증 응답을 수반하는 폐의 immunopathology 를 유발하는 것이 시사되고 있다 (비특허문헌 12). 한편, ADE 에 관해서는, 뎅기열 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스 등 다른 바이러스에 관해 보고되어 있지만, SARS 환자에 있어서, SARS-CoV 에 대한 특이적 항체가 ADE 를 유발하는 보고는 없다. SARS-CoV 에 대한 백신 항원 후보에 대해, S 전체 길이가 아니라 RBD 만의 항원에서도, 폐 장애 리스크를 회피할 수 있을 가능성을 시사하는 데이터가 보고되고 있다 (비특허문헌 13). SARS-CoV-2 에 관해서도, S 에 대한 항체가 ADE 에 관여하고 있는 직접적인 임상 에비던스는 없지만, 리스크 회피를 위해서는, 적절한 세포성 면역 응답을 유도하는 것이 필요하다는 것이 지적되고 있다 (비특허문헌 14).
Viruses 12 : 372 2020 Science 367 : 1260 2020 Viruses 12 : 428 2020 Virol J 7 : 299 2010 Virology 334 : 74 2005 Nat Commun 11 : 2251 2020 Nature 583 : 290 2020 Cell 181 : 1 2020 Nat Med 26 : 1033 2020 Nat Rev Immunol 20 : 347 2020 J Immunol 181 : 5490 2008 PLoS One 7 : e35421 2012 Vaccine 25 : 2832 2007 PNAS 117 : 8218 2020
본 발명은, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 마우스에 SARS-CoV-2 의 RBD 를 코드하는 mRNA 를 봉입한 지질 입자를 투여한 결과, 혈중 SARS-CoV-2 S 단백질 IgG 의 유도가 관찰되고, 또 그 면역 응답이 Th1 형 우위가 되는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자로서, 지질이 일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 상기 입자.
[화학식 1]
Figure pct00001
식 중,
R1 및 R2 는, 독립적으로, C1 - C3 알킬기를 나타내고 ;
L1 은, C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C17 - C19 알케닐기를 나타내고 ;
L2 는, C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알킬기, 또는 C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알케닐기를 나타내고 ;
p 는, 3 또는 4 이다.
(2) 일반식 (Ia) 중의 R1 및 R2 가, 모두 메틸기인, (1) 에 기재된 입자.
(3) 일반식 (Ia) 중의 p 가 3 인 (1) 또는 (2) 에 기재된 입자.
(4) 일반식 (Ia) 중의 L1 이, 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C17 - C19 알케닐기인, (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(5) 일반식 (Ia) 중의 L2 가, 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알케닐기인, (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(6) 일반식 (Ia) 중의 L2 가, 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C17 - C19 알케닐기인, (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(7) 일반식 (Ia) 중의 L1 이, (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기, cis-8-헵타데세닐기, 또는 (8Z,11Z)-헵타데카디에닐기인 (1) ∼ (6) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(8) 일반식 (Ia) 중의 L2 가, 데실기, cis-7-데세닐기, 도데실기, 또는 (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기인, (1) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(9) 카티온성 지질이 하기의 구조식 :
[화학식 2]
Figure pct00002
으로 나타내는 (1) 에 기재된 입자.
(10) 카티온성 지질이 하기의 구조식 :
[화학식 3]
Figure pct00003
으로 나타내는 (1) 에 기재된 입자.
(11) 카티온성 지질이 하기의 구조식 :
[화학식 4]
Figure pct00004
으로 나타내는 (1) 에 기재된 입자.
(12) 지질이, 추가로, 양친매성 지질, 스테롤류 및 PEG 지질을 포함하는 (1) ∼ (11) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(13) 양친매성 지질이, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 (12) 에 기재된 입자.
(14) 스테롤류가 콜레스테롤인 (12) 또는 (13) 에 기재된 입자.
(15) PEG 지질이, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및/또는 N-[메톡시 폴리(에틸렌글리콜)2000]카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민인 (12) ∼ (14) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(16) 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 15 ％ 이하, 스테롤류가 20 ∼ 55 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 15 ∼ 30 인 (12) ∼ (15) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(17) 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 5 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 50 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 55 ％, PEG 지질이 1 ∼ 3 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 15 ∼ 25 인 (16) 에 기재된 입자.
(18) 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 50 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 17.5 ∼ 22.5 인 (17) 에 기재된 입자.
(19) 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 45 ∼ 50 ％, PEG 지질이 1.5 ∼ 2 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 17.5 ∼ 22.5 인 (18) 에 기재된 입자.
(20) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편이, 수용체 결합 도메인을 포함하는 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(21) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편 중의 수용체 결합 도메인이 서열 번호 11 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 (20) 에 기재된 입자.
(22) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편 중의 수용체 결합 도메인이 서열 번호 25, 29, 33, 37, 94 ∼ 107 중 어느 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 (20) 에 기재된 입자.
(23) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편이, 서열 번호 10 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 (20) 에 기재된 입자.
(24) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편이, 서열 번호 24, 28, 32, 36, 80 ∼ 93 중 어느 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 (20) 에 기재된 입자.
(25) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질이 서열 번호 6 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 (1) ∼ (19) 에 기재된 입자.
(26) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인이 서열 번호 11 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 (25) 에 기재된 입자.
(27) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산이, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), S 단백질의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 꼬리부 (polyA) 를 포함하는 mRNA 인 (25) 또는 (26) 에 기재된 입자.
(28) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편을 발현시킬 수 있는 핵산이, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), 리더 서열 (leader sequence), S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 꼬리부 (polyA) 를 포함하는 mRNA 인 (20) ∼ (24) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(29) S 단백질의 번역 영역의 서열이, 서열 번호 5 의 서열에 있어서의 S 단백질의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (27) 에 기재된 입자.
(30) S 단백질의 번역 영역의 서열이, 서열 번호 16 의 서열에 있어서의 S 단백질의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (27) 에 기재된 입자.
(31) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산이, 서열 번호 5 의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (27) 에 기재된 입자.
(32) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산이, 서열 번호 16 의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (27) 에 기재된 입자.
(33) S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열이, 서열 번호 9 의 서열에 있어서의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (27) 에 기재된 입자.
(34) S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열이, 서열 번호 19 의 서열에 있어서의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (27) 에 기재된 입자.
(35) S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열이, 서열 번호 21, 23, 27, 31, 35, 66 ∼ 79 중 어느 서열에 있어서의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (27) 에 기재된 입자.
(36) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편을 발현시킬 수 있는 핵산이, 서열 번호 9 의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (28) 에 기재된 입자.
(37) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편을 발현시킬 수 있는 핵산이, 서열 번호 19 의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (28) 에 기재된 입자.
(38) 핵산이 적어도 1 개의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 (1) ∼ (37) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(39) 수식 뉴클레오티드가, 5 위치가 치환된 피리미딘뉴클레오티드 및/또는 1 위치가 치환되어 있어도 되는 슈도우리딘의 적어도 1 개를 포함하는 (38) 에 기재된 입자.
(40) 수식 뉴클레오티드가, 5-메틸시티딘, 5-메톡시우리딘, 5-메틸우리딘, 슈도우리딘, 및 1-알킬슈도우리딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 포함하는 (38) 에 기재된 입자.
(41) 입자의 평균 입자경이 30 ㎚ ∼ 300 ㎚ 인 (1) ∼ (40) 중 어느 하나에 기재된 입자.
(42) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물을 제조하기 위한 (1) ∼ (41) 중 어느 하나에 기재된 입자의 사용.
(43) (1) ∼ (41) 중 어느 하나에 기재된 입자를 함유하는, 조성물.
(44) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 in vivo 또는 in vitro 에서 발현시키기 위한 (43) 에 기재된 조성물.
(45) 의약으로서 사용되는 (43) 또는 (44) 에 기재된 조성물.
(46) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 (45) 에 기재된 조성물.
(47) 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 (45) 또는 (46) 에 기재된 조성물.
(48) (43) 또는 (44) 에 기재된 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 in vitro 에서 발현시키는 방법.
(49) (43) ∼ (47) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 in vivo 에서 발현시키는 방법.
(50) (45) 또는 (46) 에 기재된 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
(51) (45) ∼ (47) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법.
(52) 포유 동물이 인간인 (49) ∼ (51) 중 어느 하나에 기재된 방법.
본 발명에 의해, SARS-CoV-2 에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하는 것이 가능해진다.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허출원, 일본 특허출원 2020-101420 및 일본 특허출원 2021-33278 의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1 은, 실시예 3 및 실시예 4 의 입자에 의한 RBD 단백질 발현 레벨. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH6.5).
도 2 는, 실시예 3 및 실시예 4 의 입자에 의해 유도된 항 RBD 항체 응답. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH6.5). 세로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 1 ∼ 5 의 심볼은 개개의 항체 레벨을 나타낸다.
도 3 은, 실시예 3 및 실시예 4 군의 혈청이 갖는 RBD-hACE2 결합 저해 활성. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH6.5). 가로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 둥근 심볼은 개개의 저해 활성 레벨을 나타낸다.
도 4 는, 실시예 3 및 실시예 4 군에 의해 유도된 RBD 특이적 세포성 면역. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH6.5). 세로 막대는 평균값을 나타내고, 에러 바는 표준 오차를 나타낸다. 전체 처리군에 있어서, DMSO 농도는 0.1 ％ (v/v) 로 조정하였다. No peptides : 무펩티드군.
도 5 는, 실시예 4, 실시예 7 또는 실시예 8 의 입자의 투여에 의해 유도된 혈중 항 RBD 항체 응답. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0). 세로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 1 ∼ 4 의 심볼은 개개의 항체 레벨을 나타낸다.
도 6 은, 실시예 8 또는 실시예 10 의 입자의 투여에 의해 유도된 혈중 항 RBD 항체 응답. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0). 세로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 1 ∼ 5 의 심볼은 개개의 항체 레벨을 나타낸다.
도 7 은, 실시예 10 의 입자의 투여에 의해 유도된 혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0). 세로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 1 ∼ 5 의 심볼은 개개의 중화 활성을 나타낸다.
도 8 은, 실시예 8 및 실시예 10 의 입자의 투여에 의해 유도된 혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0). 세로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 1 ∼ 5 의 심볼은 개개의 중화 활성을 나타낸다.
도 9 는, 실시예 8 또는 실시예 10 의 입자의 투여에 의해 유도된 혈중 항 RBD 항체 응답. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0). 세로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 10 은, 실시예 10 에 의해 유도된 RBD 특이적 세포성 면역. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0). 세로 막대는 평균값을 나타내고, 1 ∼ 7 의 심볼은 개개의 사이토카인 유도 레벨을 나타낸다. 전체 처리군에 있어서, DMSO 농도는 0.1 ％ (v/v) 로 조정하였다. No peptides : 무펩티드군.
도 11 은, SARS-CoV-2 RBD 에 대한 mRNA 백신의 계통 특이적 면역원성. (a-e, g, 및 h) 6 주령의 C57BL/6 마우스 및 BALB/c 마우스에, 2 주 간격으로 합계 2 회, mock 또는 LNP-mRNA-RBD (3 μg mRNA) 를 근육내 투여하였다. (a) 2 회째의 투여로부터 2 주일 후, ELISA 로 혈중 항 RBD 항체가를 측정하였다. (b-e) 마우스 슬와 (膝窩) 림프절로부터를 림프구를 조제하고, flow cytometry 해석을 실시하였다. (b-d) germinal center (GC) B 세포를 GL7+CD38- CD19+ 세포로서 게이팅하였다. (e) TFH 세포는 CD185+ PD-1+CD3ε+ CD4+ T 세포로서 게이팅하였다. (f) SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 오버래핑 펩티드. 16 개의 중복 펩티드를 1 풀 펩티드로 하여, 8 풀 펩티드로 나누었다. (g 및 h) 마우스 비장으로부터 비장 세포를 조제하고, 풀 펩티드로 24 시간 재처리하였다. 배양 상청 중의 IFN-γ 레벨을 ELISA 로 측정하였다. (g-h) 풀 2, 3 및 4 를 단백질 수송 저해제와 함께 6 시간 처리한 후의 사이토카인 산생 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비율을 원 그래프로 나타낸다. 3+ : IFN-γ+IL-2+TNF-α+, 2+ : IFN-γ+IL-2+, IFN-γ+TNF-α+, IL-2+TNF-α+, 1+ : IFN-γ+, IL-2+, TNF-α+. N = 4 ∼ 5. 세로 막대는 평균값, 에러 바는 표준 오차를 나타낸다. *P ＜ 0.05, Mann-Whitney 검정을 사용하였다.
도 12 는, HPLC 정제한 mRNA 를 봉입한 LNP-mRNA-RBD (mRNA-RBD(HPLC)) 의 면역원성. (a) SARS-CoV-2 비감염자의 인간 말초혈 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 를, LNP-mRNA-Full (mRNA 환산으로 0.4, 2, 및 10 μg/mL), LNP-mRNA-RBD (mRNA 환산으로 0.4, 2, 및 10 μg/mL), 또는 mRNA-RBD(HPLC) (mRNA 환산으로 0.4, 2, 및 10 μg/mL) 로 24 시간 처리하고, 배양 상청 중의 IFN-α 레벨을 ELISA 로 측정하였다. (b) C57BL/6 마우스 및 BALB/c 마우스의 골수 유래 수상 세포 (BM-DC) 를 LNP-mRNA-Full (mRNA 환산으로 0.4, 2, 및 10 μg/mL), LNP-mRNA-RBD (mRNA 환산으로 0.4, 2, 및 10 μg/mL) 또는 mRNA-RBD(HPLC) (mRNA 환산으로 0.4, 2, 및 10 μg/mL) 로 24 시간 처리하고, 배양 상청 중의 IFN-α 레벨을 ELISA 로 측정하였다. (c-i) C57BL/6 마우스를, 0 일째 및 14 일째에, mock, LNP-mRNA-RBD (3 μg mRNA) 또는 mRNA-RBD(HPLC) (3 μg mRNA) 로 근육내 투여하였다. (c) 2 회째 투여로부터 2 주일 후에, ELISA 로 혈중 항 RBD 항체가를 측정하였다. (d 및 e) 마우스로부터 슬와 림프절을 채취하였다. (d) GC B 세포를 GL7+CD38- CD19+ 세포로서 게이팅하였다. (e) TFH 세포를 CD185+ PD-1+CD3ε+CD4+ T 세포로서 게이팅하였다. (f 및 g) 마우스 비장으로부터 비장 세포를 조제하고, 풀 펩티드로 24 시간 처리하였다. 배양 상청 중의 IFN-γ 레벨은 ELISA 로 측정하였다. 펩티드 풀 3 및 4 를 단백질 수송 저해제와 함께 6 시간 처리한 후의 사이토카인 산생 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비율을 원 그래프에 나타낸다. 3+ : IFN-γ+IL-2+TNF-α+, 2+ : IFN-γ+IL-2+, IFN-γ+TNF-α+, 및 IL-2+TNF-α+, 1+ : IFN-γ+, IL-2+, 및 TNF-α+. (h, i) 도 12f, g, 도 21, 22 의 대표적인 데이터를 나타낸다. IFN-γ+IL-2+TNF-α+ 및 IFN-γ+TNF-α+CD8+T 세포를 산포점 플롯으로 나타낸다. N = 4 ∼ 5. 세로 막대는 평균값, 에러 바는 표준 오차를 나타낸다. *P ＜ 0.05, ANOVA 에 계속되는 Dunn 의 다중 비교 검정을 사용하였다.
도 13 은, HPLC 정제 mRNA 를 봉입한 LNP-mRNA-RBD 를 투여한 필리핀원숭이에 있어서의 혈중 항 RBD 항체 응답 (a) LNP-mRNA-RBD 투여, 감염, 및 샘플 채취의 스케줄. (b-c) 필리핀원숭이를, 0 일째 및 21 일째에 mock 또는 LNP-mRNA-RBD(HPLC) (100 μg) 로 근육내 면역하였다. (b) 0 일째, 7 일째, 14 일째, 21 일째, 28 일째 및 감염 후 7 일째에 있어서의 혈중 항 RBD 항체가를 ELISA 로 측정하였다. (c) 중화 항체를 중화 어세이에 의해 측정하였다. (d) 스왑 샘플 (결막, 구강, 비강, 기관, 및 직장) 중의 혈중 항 RBD IgG 가를 ELISA 로 측정하였다. 흑색 화살표는 백신 투여일, 적색 화살표는 SARS-CoV-2 감염일을 나타낸다.
도 14 는, mRNA-RBD(HPLC) 를 투여한 필리핀원숭이의 항 SARS-CoV-2 감염 방어 응답. 2 회째의 투여로부터 1 주일 후에, SARS-CoV-2 (2 × 107 PFU) 를 필리핀원숭이의 결막, 비강, 구강 및 기관에 투여하였다. (a) 스왑 샘플 중의 바이러스 RNA 및 (b) 바이러스 역가를 RT-PCR 및 세포 배양법에 의해 측정하였다. (c-d) 폐 조직 중의 바이러스 RNA 를 RT-PCR 법에 의해 측정하였다. RU : 우상옆, RM : 우중엽, RL : 우하옆, LU : 좌상옆, LM : 좌중엽, LL : 좌하옆.
도 15 는, LNP-mRNA-RBD 투여 마우스에 있어서의 혈중 항스파이크 단백질 외부 도메인 (ECD) 항체 응답. 0 일째 및 14 일째에 mock 또는 LNP-mRNA-RBD (3 μg mRNA) 를 C57BL/6 마우스 및 BALB/c 마우스에 근육내 투여하였다. 2 회째의 투여로부터 2 주일 후에, ELISA 로 혈중 항 ECD 항체가를 측정하였다. N = 4 ∼ 5. 가로 막대는 평균값, 심볼은 각 개체의 데이터를 나타낸다. *P ＜ 0.05, Mann-Whitney 검정을 사용하였다.
도 16 은, GC B 및 TFH 세포를 위한 게이팅. 마우스 슬와 림프절로부터 림프구를 조제하고, GC B 및 TFH 세포를 면역 염색 후에 flow cytometry 해석을 실시하였다. 세포는, 림프구 사이즈, 싱글렛, 라이브, T 또는 B 세포, 및 TFH 또는 GC B 세포에 대해 게이팅하였다.
도 17 은, RBD 특이적인 T 세포 응답. 마우스 비장으로부터 비장 세포를 조제하고, 스파이크 단백질 펩티드 풀, ECD 단백질, 또는 RBD 단백질로 24 시간 처리하였다. 배양 상청 중의 IFN-γ 및 IL-13 레벨을 ELISA 로 측정하였다. N = 4 ∼ 5 마리. 세로 막대는 평균값, 에러 바는 표준 오차를 나타낸다. * P < 0.05, ANOVA 및 Sidak 의 다중 비교 검정을 사용하였다.
도 18 은, RBD 특이적인 CD8 T 세포 응답. 마우스 비장으로부터 비장 세포를 조제하고, 단백질 수송 저해제와 풀 펩티드로 6 시간 처리하였다. 사이토카인 산생 CD8+ T 세포의 비율을 flow cytometry 로 해석하였다. N = 4 ∼ 5. 세로 막대는 평균값, 에러 바는 표준 오차를 나타낸다. *P ＜ 0.05, Mann-Whitney 검정을 사용하였다.
도 19 는, RBD 특이적인 CD4 T 세포 응답. 마우스 비장으로부터 비장 세포를 조제하고, 단백질 수송 저해제와 풀 펩티드로 6 시간 처리하였다. 사이토카인 산생 CD4+ T 세포의 비율을 flow cytometry 로 해석하였다. N = 4 ∼ 5. 세로 막대는 평균값, 에러 바는 표준 오차를 나타낸다. *P < 0.05, Mann-Whitney 검정을 사용하였다.
도 20 은, mRNA-RBD(HPLC) 를 투여한 마우스에 있어서의 스파이크 단백질 특이적인 면역 응답. (a) 0 일째 및 14 일째에, C57BL/6 마우스 및 BALB/c 마우스에 mock, mRNA-RBD, 또는 mRNA-RBD(HPLC) (3 μg mRNA) 를 근육내 투여하였다. 2 회째의 투여로부터 2 주일 후, 혈중 항 ECD 항체가를 ELISA 로 측정하였다. (b-e) 마우스 비장으로부터 비장 세포를 조제하고, 스파이크 단백질, ECD, 또는 RBD 풀 펩티드로 24 시간 처리하였다. N = 4. 세로 막대는 평균값, 에러 바는 표준 오차를 나타낸다. * P < 0.05, ANOVA 및 Dunn 또는 Sidak 의 다중 비교 검정을 사용하였다.
도 21 은, mRNA-RBD(HPLC) 를 투여한 C57BL/6 마우스에 있어서의 RBD 특이적인 T 세포 응답. 마우스 비장으로부터 비장 세포를 조제하고, 단백질 수송 저해제와 풀 펩티드로 6 시간 처리하였다. 사이토카인 산생 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비율을 flow cytometry 로 해석하였다. N = 4. 세로 막대는 평균값, 에러 바는 표준 오차를 나타낸다. *P ＜ 0.05, ANOVA 및 Dunn 의 다중 비교 검정을 사용하였다.
도 22 는, mRNA-RBD(HPLC) 를 투여한 BALB/c 마우스에 있어서의 RBD 특이적인 T 세포 응답. 마우스 비장으로부터 비장 세포를 조제하고, 단백질 수송 저해제와 풀 펩티드로 6 시간 처리하였다. 사이토카인 산생 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비율을 flow cytometry 로 해석하였다. N = 4. 세로 막대는 평균값, 에러 바는 표준 오차를 나타낸다, *P < 0.05, ANOVA 및 Dunn 의 다중 비교 검정을 사용하였다.
도 23 은, SARS-CoV-2 감염 전후의 체온의 변화. 2 회째의 mRNA-RBD(HPLC) 투여로부터 1 주일 후에, 필리핀원숭이의 구강, 비강, 및 기관 내에 SARS-CoV-2 (2.2 × 106 PFU) 를 투여하였다. 체온은, SARS-CoV-2 투여의 2 일 전부터 텔레메트리 송신기와 컴퓨터를 사용하여 기록하였다.
도 24 는, mRNA-RBD(HPLC) 를 투여한 필리핀원숭이의 SARS-CoV-2 감염 후의 흉부 X 선 사진 이미지.
도 25 는, 실시예 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 에 의해 유도된 혈중 항 RBD 항체 응답. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0). N = 4. 세로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 1 ∼ 4 의 심볼은 개개의 항 RBD 항체 레벨을 나타낸다.
도 26 은, 실시예 10 및 21 ∼ 30 에 의해 유도된 혈중 항 RBD 항체 응답. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0). N = 4. 세로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 1 ∼ 4 의 심볼은 개개의 항 RBD 항체 레벨을 나타낸다.
도 27 은, 실시예 8, 32a, 32b, 32c, 32d, 32f, 및 33 에 의해 유도된 혈중 항 RBD 항체 응답. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0). N = 4 ∼ 5. 세로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 1 ∼ 5 의 심볼은 개개의 항 RBD 항체 레벨을 나타낸다. ELISA 의 고상화에 사용한 RBD 항원은, 우한주 (Original) 및 B.1.351 주 (351) 에서 유래한다.
도 28 은, 실시예 10 을 투여한 BALB/c 마우스 혈청의 RBD-hACE2 결합 저해 활성. Buffer ; 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0). RBD 항원으로서, SARS-CoV-1 유래 (컨트롤), 우한주 유래 (Original), 및 Original 의 점 변이체 (K417N, E484K, N501Y, K417N/E484K/N501Y) 를 사용하였다. N = 4. 가로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 1 ∼ 4 의 심볼은 개개의 저해 활성 레벨을 나타낸다.
도 29 는, 실시예 10 을 투여한 필리핀원숭이 혈장의 항 SARS-CoV-2 중화 활성. N = 4. Pre 는 실시예 10 투여 전, Post 는 실시예 10 투여 후를 나타낸다. 세로 막대는 기하 평균값을 나타내고, 둥근 심볼은 개개의 중화 활성을 나타낸다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대해 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자로서, 지질이 일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 상기 입자를 제공한다.
[화학식 5]
Figure pct00005
식 중,
R1 및 R2 는, 독립적으로, C1 - C3 알킬기를 나타내고 ;
L1 은, C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C17 - C19 알케닐기를 나타내고 ;
L2 는, C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알킬기, 또는 C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알케닐기를 나타내고 ;
p 는, 3 또는 4 이다.
일반식 (Ia) 중의 R1 및 R2 는, 독립적으로, C1 - C3 알킬기를 나타내지만, 바람직하게는, 모두 메틸기이다.
일반식 (Ia) 중의 p 는, 3 또는 4 이지만, 바람직하게는, 3 이다.
일반식 (Ia) 중의 L1 은, C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C17 - C19 알케닐기를 나타내지만, 바람직하게는, 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C17 - C19 알케닐기이다. L1 로서, 구체적으로는, (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기, cis-8-헵타데세닐기, 또는 (8Z,11Z)-헵타데카디에닐기 등을 예시할 수 있다.
일반식 (Ia) 중의 L2 는, C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알킬기, 또는 C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알케닐기를 나타내지만, 바람직하게는, 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알케닐기이다. 혹은 또, 일반식 (Ia) 중의 L2 가, 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C17 - C19 알케닐기인 것도 바람직하다. L2 로서, 구체적으로는, 데실기, cis-7-데세닐기, 도데실기, 또는 (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 입자를 구성하는 성분인 카티온성 지질로서, 구체적으로는, 하기의 구조식 :
[화학식 6]
Figure pct00006
[화학식 7]
Figure pct00007
[화학식 8]
Figure pct00008
으로 나타내는 것을 예시할 수 있다.
약학적으로 허용되는 염이란, 의약으로서 사용할 수 있는 염을 나타낸다. 본 발명의 입자를 구성하는 성분인 카티온성 지질은, 약학상 허용되는 염이어도 되고, 그러한 염으로는, 바람직하게는 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염, 알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염 ; 암모늄염과 같은 무기염, t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기염 등의 아민염 ; 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염과 같은 할로겐 원자화 수소산염, 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염과 같은 저급 알칸술폰산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염과 같은 아릴술폰산염, 아세트산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 및 글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루탐산염, 아스파르트산염과 같은 아미노산염을 들 수 있다.
일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질은, 1 종류의 화합물이어도 되고, 2 종류 이상의 화합물의 조합이어도 된다.
일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질을 제조하는 방법은, 국제 공개 제2015/005253호 팜플렛에 기재되어 있다.
본 발명의 지질은, 추가로, 양친매성 지질, 스테롤류 및 PEG 지질을 포함해도 된다.
양친매성 지질은, 극성, 비극성의 용매에 대해 모두 친화성을 갖는 지질이고, 구체적으로는, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 그들의 조합 등을 예시할 수 있다.
스테롤류는, 하이드록시기를 갖는 스테롤이고, 구체적으로는, 콜레스테롤 등을 예시할 수 있다.
PEG 지질은, PEG 수식된 지질이고, 구체적으로는, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및/또는 N-[메톡시 폴리(에틸렌글리콜)2000]카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민, 그들의 조합 등을 예시할 수 있다.
양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 몰량으로, 양친매성 지질이 15 ％ 이하, 스테롤류가 20 ∼ 55 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이, 15 ∼ 30 인 것이 바람직하고, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 5 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 50 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 55 ％, PEG 지질이 1 ∼ 3 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이, 15 ∼ 25 인 것이 보다 바람직하고, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 50 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이, 17.5 ∼ 22.5 인 것이 더욱 바람직하고, 양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 45 ∼ 50 ％, PEG 지질이 1.5 ∼ 2 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이, 17.5 ∼ 22.5 인 것이 더욱 더 바람직하다.
본 발명에 있어서, 지질 입자에 봉입되는 핵산은, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 발현시킬 수 있는 것이다. SARS-CoV-2 의 Wuhan 주의 서열은 공개되어 있다 (NCBI ID NC_045512) (https : //www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512).
SARS-CoV-2 의 S 단백질의 단편은, S 단백질에 존재하는 수용체 결합 도메인 (receptor-binding domain ; RBD) 을 포함하면 된다.
수용체 결합 도메인에는, 분비 펩티드 (리더 서열이 코드하는 펩티드) 가 부가되어 있어도 된다. 리더 서열로는, S 단백질 시그널 서열을 예시할 수 있다.
SARS-CoV-2 의 S 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 6 에 나타낸다. 지질 입자에 봉입되는 핵산은, 서열 번호 6 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％, 바람직하게는 96 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, SARS-CoV-2 의 S 단백질을 발현할 수 있는 것이면 된다.
SARS-CoV-2 의 S 단백질에 존재하는 수용체 결합 도메인의 아미노산 서열을 서열 번호 11 에 나타낸다. SARS-CoV-2 의 S 단백질에 존재하는 수용체 결합 도메인에는, 분비 펩티드 (예를 들어, S 단백질 시그널 서열) 가 부가되어도 된다. SARS-CoV-2 의 S 단백질에 존재하는 수용체 결합 도메인에 S 단백질 시그널 서열이 부가된 것의 아미노산 서열을 서열 번호 10 에 나타낸다. 지질 입자에 봉입되는 핵산은, 서열 번호 11 또는 10 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％, 바람직하게는 96 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, SARS-CoV-2 의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인을 발현할 수 있는 것이면 된다.
본 명세서 중에 있어서, 동일성이란, 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 서열의 비교에 의해 결정되는, 2 개 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의, 서열간의 관계를 말한다. 당해 분야에 있어서, 「동일성」 은 또, 경우에 따라, 1 열의 2 개 이상의 뉴클레오티드 서열간 또는 2 개 이상의 아미노산 서열간의 일치에 의해 결정했을 때의, 핵산 분자간 또는 폴리펩티드간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 동일성은, 2 개 이상의 서열 중 작은 것과, 특정한 수리적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, 「알고리즘」) 에 의해 어드레스 지정되는 갭 얼라인먼트 (존재하는 경우) 간의 동일 일치의 퍼센트를 산출함으로써 평가할 수 있다. 구체적으로는, European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI) 가 제공하는 ClustalW2 등의 소프트를 사용함으로써 평가할 수 있지만, 당업자에 있어서 사용되는 것이면 이것에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서의 서열의 동일성은 서열 해석 소프트웨어인 GENETYX-SV/RC (주식회사 제네틱스 제조) 를 사용하여 산출되는 것이고, 이 알고리즘은, 당해 기술 분야에서 통상 사용되는 것이다. 본 발명의 지질 입자에 봉입되는 핵산이 코드하는 아미노산은, 표적으로 하는 SARS-CoV-2 의 S 단백질의 아미노산 서열 및/또는 그 단편과 일정 이상의 동일성을 유지하는 한, 아미노산의 변이 (치환), 결실, 삽입 및/또는 부가가 일어나고 있어도 된다.
본 발명의 지질 입자에 봉입되는 핵산이 코드하는 아미노산은, 상기 서술한 서열 동일성을 유지하고, 표적으로 하는 SARS-CoV-2 의 S 단백질의 아미노산 서열 및/또는 그 단편의 아미노산 서열 중, 수 지점 (바람직하게는 5 개 지점 이하, 보다 바람직하게는 3, 2 또는 1 개 지점) 에 있어서, 1 개 지점당 몇 개 (바람직하게는 10 개 이하, 보다 바람직하게는 7 개 이하, 더욱 바람직하게는 5, 4, 3, 2 또는 1 개) 의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되어 있어도 된다.
SARS-Cov-2 의 S 단백질에 존재하는 수용체 결합 도메인의 아미노산 서열에는, 결실, 치환, 부가가 이루어져 있어도 되고, 538 번째 (번호는 S 단백질의 N 말단으로부터 센 번호) 의 시스테인을 세린으로 치환한 서열 (서열 번호 25) (이하, 「C538S 형」 이라고 기재하는 경우도 있다.), RBD 의 전체 길이 서열 (R319-F541) 의 N 말단 및 C 말단에 대해 아미노산이 결실된 서열 (서열 번호 29), RBD 의 전체 길이 서열 (R319-F541) 의 N 말단 및 C 말단에 대해 아미노산이 부가된 서열 (서열 번호 33), 복수의 아미노산 잔기가 치환된 변이를 도입한 서열 (서열 번호 37) 을 예시할 수 있다. 이들 서열에는, 분비 펩티드 (예를 들어, S 단백질 시그널 서열) 가 부가되어도 되고, 서열 번호 25, 29, 33 및 37 에 S 단백질 시그널 서열이 부가된 것의 아미노산 서열을 각각 서열 번호 24, 28, 32 및 36 에 나타낸다.
SARS-CoV-2 의 S 단백질에 존재하는 수용체 결합 도메인은 변이주 유래여도 되고, 남아프리카형, 영국형, 브라질형, 캘리포니아형, 인도형, 남아프리카 C538S 형, 영국 C538S 형, 브라질 C538S 형, 캘리포니아 C538S 형, 인도 C538S 형, 조합 변이형 (1) (후술하는 실시예 33 참조), 조합 변이형 (2) (후술하는 실시예 33 참조), 조합 변이형 (3) (후술하는 실시예 33 참조), 조합 변이형 (4) (후술하는 실시예 33 참조) 의 수용체 결합 도메인의 아미노산 서열을 서열 번호 94 ∼ 107 에 나타낸다. 서열 번호 94 ∼ 107 의 아미노산 서열에 S 단백질 시그널 서열을 부가한 서열을 서열 번호 80 ∼ 93 에 나타낸다.
지질 입자에 봉입되는 핵산은, 서열 번호 25, 29, 33, 37, 94 ∼ 107 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다.) 과 적어도 95 ％, 바람직하게는 96 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, SARS-CoV-2 의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인을 발현할 수 있는 것이면 된다. 지질 입자에 봉입되는 핵산은, 서열 번호 24, 28, 32, 36, 80 ∼ 93 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함한다.) 과 적어도 95 ％, 바람직하게는 96 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, SARS-CoV-2 의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인을 발현할 수 있는 것이어도 된다.
SARS-CoV-2 의 S 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산은, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), S 단백질의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 꼬리부 (polyA) 를 포함하는 mRNA 이면 된다. 캡 구조 (Cap) 는, 많은 진핵 생물의 mRNA 의 5' 말단에 존재하고, 7-메틸구아노신 구조를 갖는 부위이다. 캡 구조로는, 예를 들어, cap0, cap1, cap2, ARCA, 또는 CleanCap (등록상표) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 cap1, 또는 CleanCap 이고, 보다 바람직하게는 CleanCap 이다. 5' 비번역 영역 (5'-UTR) 의 서열은, 예를 들어, 서열 번호 4 의 서열 중의 염기 번호 19 ∼ 88 의 서열이다. S 단백질의 번역 영역의 서열은, S 단백질의 아미노산 서열 모두 또는 일부를 발현할 수 있는 서열로서, 개시 코돈 및/또는 종지 코돈을 포함하고 있어도 되고, 예를 들어, 서열 번호 4 의 서열 중의 염기 번호 89 ∼ 3910 의 서열이다. 또, S 단백질의 번역 영역의 서열은, 서열 번호 5 의 서열에 있어서의 S 단백질의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열이어도 된다. 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 의 서열은, 예를 들어, 서열 번호 4 의 서열 중의 염기 번호 3911 ∼ 4042 의 서열이다. 폴리 A 꼬리부 (polyA) 의 서열은, 예를 들어, 서열 번호 4 의 서열 중의 염기 번호 4043 ∼ 4142 의 서열이다. 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), S 단백질의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 꼬리부 (polyA) 의 서열에는, 개변이 이루어져 있어도 되고, SARS-CoV-2 의 S 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산의 서열은, 서열 번호 5 의 서열과 적어도 90 ％, 바람직하게는 95 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 가장 바람직하게는 서열 번호 5 의 뉴클레오티드 서열로 이루어지면 된다. 핵산의 코돈은 최적화하면 된다. 코돈을 최적화함으로써, 백신으로서의 효과를 향상시켜, 부작용을 저감시킬 수 있다. 대상 생물의 코돈 사용 빈도에 맞추어 최적화할 수 있다. 코돈의 최적화는, 예를 들어, 코딩 서열에 대해 실시하면 되고, 서열 번호 16 의 서열에 있어서는, S 단백질의 번역 영역의 서열의 코돈이 최적화되어 있다. SARS-CoV-2 의 S 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산의 서열은, 서열 번호 16 의 서열과 적어도 90 ％, 바람직하게는 95 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지면 된다.
SARS-CoV-2 의 S 단백질의 단편을 발현시킬 수 있는 핵산은, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), 리더 서열 (leader sequence), S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 꼬리부 (polyA) 를 포함하는 mRNA 이면 된다. 캡 구조 (Cap) 는, 많은 진핵 생물의 mRNA 의 5' 말단에 존재하고, 7-메틸구아노신 구조를 갖는 부위이다. 캡 구조로는, 예를 들어, cap0, cap1, cap2, ARCA, 또는 CleanCap (등록상표) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 cap1, 또는 CleanCap 이고, 보다 바람직하게는 CleanCap 이다. 5' 비번역 영역 (5'-UTR) 의 서열은, 예를 들어, 서열 번호 8 의 서열 중의 염기 번호 19 ∼ 88 의 서열이다. 리더 서열 (leader sequence) 의 서열은, 예를 들어, 서열 번호 8 의 서열 중의 염기 번호 89 ∼ 127 의 서열이다. S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열은, S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 아미노산 서열 모두 또는 일부를 발현할 수 있는 서열로서, 개시 코돈 및/또는 종지 코돈을 포함하고 있어도 되고, 예를 들어, 서열 번호 8 의 서열 중의 염기 번호 128 ∼ 799 의 서열이다. 또, S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열은, 서열 번호 9 의 서열에 있어서의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열이어도 된다. 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 의 서열은, 예를 들어, 서열 번호 8 의 서열 중의 염기 번호 800 ∼ 931 의 서열이다. 폴리 A 꼬리부 (polyA) 의 서열은, 예를 들어, 서열 번호 8 의 서열 중의 염기 번호 932 ∼ 1031 의 서열이다. 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), 리더 서열 (leader sequence), S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 꼬리부 (polyA) 의 서열에는, 개변이 이루어져 있어도 되고, SARS-CoV-2 의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인을 발현시킬 수 있는 핵산의 서열은, 서열 번호 9 의 서열과 적어도 90 ％, 바람직하게는 95 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 가장 바람직하게는 서열 번호 9 의 뉴클레오티드 서열로 이루어지면 된다. 핵산의 코돈은 최적화하면 된다. 코돈을 최적화함으로써, 백신으로서의 효과를 향상시켜, 부작용을 저감시킬 수 있다. 대상 생물의 코돈 사용 빈도에 맞추어 최적화할 수 있다. 코돈의 최적화는, 예를 들어, 코딩 서열에 대해 실시하면 되고, 서열 번호 19 의 서열에 있어서는, S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열의 코돈이 최적화되어 있다. SARS-CoV-2 의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인을 발현시킬 수 있는 핵산의 서열은, 서열 번호 19 의 서열과 적어도 90 ％, 바람직하게는 95 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지면 된다. 또, S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열은, 서열 번호 21, 23, 27, 31, 35, 66 ∼ 79 중 어느 서열에 있어서의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％, 바람직하게는 95 ％, 보다 바람직하게는 97 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열이어도 된다.
서열 번호 21 은, 실시예 11 의 mRNA 의 뉴클레오티드 서열이고, 실시예 11 의 mRNA 는, 실시예 6 의 서열의 폴리 A 이외의 서열이 동일한 mRNA 이다. 실시예 6 의 서열에서는 폴리 A 가 110 개의 아데닌뉴클레오티드를 가지고 있지만, 실시예 11 의 mRNA 에서는 아데닌뉴클레오티드가 50 개이다. 본 발명의 지질 입자에 포함되는 핵산은 폴리 A 부분이 비교적 짧은 mRNA 여도 되고, 바람직하게는 30 이상, 40 이상, 보다 바람직하게는 50 이상이다. 폴리 A 의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 500 이하, 400 이하, 300 이하, 200 이하, 110 이하가 바람직하다.
서열 번호 23 은, 실시예 13 의 mRNA 의 뉴클레오티드 서열이고, 실시예 13 의 mRNA 는, 538 번째 (번호는 S 단백질의 N 말단으로부터 센 번호) 의 시스테인을 세린으로 치환한 서열을 발현할 수 있는 mRNA 이다.
서열 번호 27 은, 실시예 15 의 mRNA 의 뉴클레오티드 서열이고, 실시예 15 의 mRNA 는, RBD 의 전체 길이 서열 (R319-F541) 의 N 말단 및 C 말단에 대해 아미노산이 결실된 서열을 발현할 수 있는 mRNA 이다.
서열 번호 31 은, 실시예 17 의 mRNA 의 뉴클레오티드 서열이고, 실시예 17 의 mRNA 는, RBD 의 전체 길이 서열 (R319-F541) 의 N 말단 및 C 말단에 대해 아미노산이 부가된 서열을 발현할 수 있는 mRNA 이다.
서열 번호 35 는, 실시예 19 의 mRNA 의 뉴클레오티드 서열이고, 실시예 19 의 mRNA 는, 실시예 6 의 서열에 있어서 아미노산 잔기의 치환이 복수의 위치에서 일어난 서열을 발현할 수 있는 mRNA 이다.
서열 번호 66 ∼ 79 는, 남아프리카형, 영국형, 브라질형, 캘리포니아형, 인도형, 남아프리카 C538S 형, 영국 C538S 형, 브라질 C538S 형, 캘리포니아 C538S 형, 인도 C538S 형, 조합 변이형 (1) (후술하는 실시예 33 참조), 조합 변이형 (2) (후술하는 실시예 33 참조), 조합 변이형 (3) (후술하는 실시예 33 참조), 조합 변이형 (4) (후술하는 실시예 33 참조) 의 수용체 결합 도메인의 아미노산 서열을 발현할 수 있는 mRNA 의 뉴클레오티드 서열이다.
지질 입자에 봉입되는 핵산은, SARS-CoV-2 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 발현시킬 수 있는 핵산이면, 어떠한 형태여도 된다. 예를 들어, 1 본쇄 DNA, 1 본쇄 RNA (예를 들어, mRNA), DNA 와 RNA 가 혼합한 1 본쇄 폴리뉴클레오티드, 2 본쇄 DNA, 2 본쇄 RNA, DNA-RNA 의 하이브리드 폴리뉴클레오티드, DNA 와 RNA 가 혼합한 2 종의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 2 본쇄 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 mRNA 이다.
지질 입자에 봉입되는 핵산을 구성하는 뉴클레오티드는, 천연형의 것이어도 되고, 수식 뉴클레오티드여도 되지만, 적어도 1 개의 수식 뉴클레오티드를 포함하면 된다.
수식 뉴클레오티드는, 염기, 당 및 인산디에스테르 결합의 어느 부분이 수식된 것이어도 된다. 수식 부위는 1 개 지점이어도 되고, 2 개 지점 이상이어도 된다.
염기의 수식의 예로는, 시토신의 5-메틸화, 5-플루오로화, N4-메틸화, 우라실의 5-메틸화(티민), 5-플루오로화, 아데닌의 N6-메틸화, 구아닌의 N2-메틸화 등을 들 수 있다.
당의 수식의 예로는, D-리보푸라노오스의 2'-O-메틸화를 들 수 있다.
인산디에스테르 결합의 수식의 예로는, 포스포로티오에이트 결합을 들 수 있다.
수식 뉴클레오티드는, 염기 부분이 수식된 것이 바람직하고, 예를 들어, 5 위치가 치환된 피리미딘뉴클레오티드, 1 위치가 치환되어 있어도 되는 슈도우리딘이면 되고, 구체적으로는, 5-메틸시티딘, 5-메톡시우리딘, 5-메틸우리딘, 슈도우리딘, 1-알킬슈도우리딘을 예시할 수 있다. 또, 1-알킬슈도우리딘으로는, 1-(C1 - C6 알킬)슈도우리딘이어도 되고, 바람직하게는 1-메틸슈도우리딘 또는 1-에틸슈도우리딘이다. 염기 부분이 수식된 수식 뉴클레오티드는, 그 자체를 단독으로, 또는 복수를 조합하여 천연형의 뉴클레오티드 대신에 사용해도 된다. 염기 부분이 수식된 수식 뉴클레오티드의 조합으로는, 예를 들어, 5-메틸시티딘과 5-메틸우리딘의 조합, 5-메틸시티딘과 슈도우리딘의 조합, 또는 5-메틸시티딘과 1-메틸슈도우리딘의 조합이어도 되고, 바람직하게는, 5-메틸시티딘과 5-메틸우리딘의 조합이다.
본 발명의 SARS-CoV-2 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 발현시킬 수 있는 핵산은, 원하는 염기 서열을 갖는 DNA 로부터 in vitro 전사 반응에 의해 제조할 수 있다. in vitro 전사에 필요한 효소, 완충액, 및 뉴클레오시드-5'-트리인산 혼합물 (아데노신-5'-트리인산 (ATP), 구아노신-5'-트리인산 (GTP), 시티딘-5'-트리인산 (CTP) 및 우리딘-5'-트리인산 (UTP)) 은, 시판되고 있다 (예를 들어, AmpliScribeT7 High Yield Transcription Kit (Epicentre), mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Life technologies) 등). 1 본쇄 RNA 를 제조하기 위해서 사용되는 DNA 는, 클론화된 DNA, 예를 들어, 플라스미드 DNA 또는 DNA 단편이 사용된다. 플라스미드 DNA 또는 DNA 단편은, 시판되고 있는 것을 사용해도 되고, 또 당해 분야에서 일반적으로 알리고 있는 방법에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual second edition (1989), Rashtchian, A., Current Opinion in Biotechnology, 1995, 6(1), 30 - 36, Gibson D. G. et al., Science, 2008, 319(5867), 1215 - 1220 에 기재된 방법 등).
안정성 및/또는 안전성을 향상시킨 mRNA 를 얻기 위해서, in vitro 전사 반응에 있어서, 일부 또는 전부의 천연형 뉴클레오시드-5'-트리인산을 수식 뉴클레오시드-5'-트리인산으로 치환함으로써, mRNA 중의 일부 또는 전부의 천연형 뉴클레오티드를 수식 뉴클레오티드로 치환할 수도 있다 (Kormann, M., Nature Biotechnology, 2011, 29, 154 - 157.).
안정성 및/또는 안전성을 향상시킨 mRNA 를 얻기 위해서, in vitro 전사 반응 후에 캡화 효소를 사용하는 방법에 의해 mRNA 의 5' 말단에 캡 구조 (상기의 Cap0 구조) 를 도입할 수 있다. 또, 추가로 Cap0 을 갖는 mRNA 에 2'-O-메틸트랜스페라아제를 작용시키는 방법에 의해, Cap0 을 Cap1 로 변환할 수 있다. 캡화 효소 및 2'-O-메틸트랜스페라아제는 시판되는 제품을 사용할 수 있다 (예를 들어, Vaccinia Capping System, M2080 ; mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase, M0366, 모두 New England Biolab 제조). 시판되는 제품을 사용하는 경우에는, 제품에 부속되는 프로토콜에 따라 캡 구조를 갖는 mRNA 를 제조할 수 있다.
mRNA 의 5' 말단의 캡 구조는 효소를 사용하는 것과는 다른 방법에 의해서도 도입할 수 있다. 예를 들어, ARCA 또는 CleanCap (등록상표) 을 in vitro 전사 반응에 첨가함으로써 ARCA 가 갖는 캡 유연체 (類緣體) 의 구조, 또는 CleanCap (등록상표) 에서 유래하는 Cap1 구조를 mRNA 에 도입할 수 있다. ARCA 및 CleanCap (등록상표) 은, 시판되는 제품을 사용할 수 있다 (ARCA, N-7003 ; CleanCap Reagent AG, N-7113, 모두 TriLink BioTechnologies 제조). 시판되는 제품을 사용하는 경우에는, 제품에 부속되는 프로토콜에 따라 캡 구조를 갖는 mRNA 를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 지질 입자에 봉입되는 핵산은, 탈염, 역상 칼럼, 겔 여과, HPLC, PAGE 등의 방법으로 정제해도 된다. 정제 처리에 의해, 불순물을 제거함으로써, 핵산을 투여한 생체에 있어서의 염증성 사이토카인의 산생이 감소할 수 있다.
상기 불순물로는, 예를 들어 2 본쇄 RNA (dsRNA) 를 예시할 수 있다. 지질 입자에 봉입되는 핵산이 포함하는 dsRNA 량으로는, 질량 백분율로 바람직하게는 10 ％ 이하, 보다 바람직하게는 7.5 ％ 이하, 더욱 더 바람직하게는 5 ％ 이하, 특히 바람직하게는 3 ％ 이하이다.
본 발명의 핵산 봉입 지질 입자는, 박막법, 역상 증발법, 에탄올 주입법, 에테르 주입법, 탈수-재수화법, 계면 활성제 투석법, 수화법, 동결 융해법 등의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 제2015/005253호 팜플렛에 기재된 방법에 의해 핵산 봉입 지질 입자를 제조할 수 있다.
본 발명의 입자는, 평균 입자경이 30 ㎚ ∼ 300 ㎚ 이면 되고, 바람직하게는 30 ∼ 200 ㎚ 이고, 보다 바람직하게는 30 ∼ 150 ㎚ 이고, 더욱 더 바람직하게는 30 ∼ 100 ㎚ 이다. 평균 입자경은, Zeta Potential/Particle Sizer NICOMP (등록상표) 380ZLS (PARTICLE SIZING SYSTEMS) 등의 기기를 사용하여, 동적 광 산란법 등의 원리에 기초하여 체적 평균 입자경을 측정함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 입자는, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물을 제조하기 위해서 사용할 수 있다. SARS-CoV-2 의 주는, 특별히 한정되지 않지만, Wuhan 주가 바람직하다.
본 발명의 입자를 사용하여, SARS-CoV-2 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 in vivo 또는 in vitro 에서 발현시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은, 상기 입자를 함유하는 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 in vitro 에서 발현시키는 방법을 제공한다. 또, 본 발명은, 상기 입자를 함유하는 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 in vivo 에서 발현시키는 방법도 제공한다. SARS-CoV-2 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 in vivo 에서 발현시킴으로써, SARS-CoV-2 에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 그 결과로서, SARS-CoV-2 감염을 예방 및/또는 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 상기 입자를 함유하는 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 또, 본 발명은, 상기 입자를 함유하는 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 입자는, 의약으로서 또, 실험용 시약으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 입자는, 통상, 물, 완충액, 생리 식염수 등의 담체에 첨가되고, 이 배합물 (조성물) 을, 세포에 도입하거나 (in vitro), 포유 동물에 투여할 수 있다 (in vivo). 포유 동물에 투여되는 경우에는, 담체는 약학적으로 허용되는 담체 (예를 들어, 생리 식염수) 이면 된다. 또, 본 발명의 입자는, 지방, 지방유, 라놀린, 바셀린, 파라핀, 납, 수지, 플라스틱, 글리콜류, 고급 알코올, 글리세린, 물, 유화제, 현탁제 등을 기제 원료로 하는 크림, 페이스트, 연고, 겔, 로션 등의 제형으로 제제화해도 된다.
본 발명의 입자는, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 돼지, 원숭이, 고양이, 개, 말, 염소, 양, 소 등의 포유 동물에, 경구 투여, 혹은 근육내 투여, 정맥내 투여, 직장내 투여, 경피 투여, 경점막 투여, 피하 투여, 피내 투여 등의 방법에 의해 비경구 투여할 수 있다.
본 발명의 입자를 인간에게 투여하는 경우에는, 예를 들어, 성인 1 회당 mRNA 의 양으로서 약 0.001 ∼ 1 mg, 바람직하게는 0.01 ∼ 0.2 mg 의 투여량으로, 1 회 또는 수 차례, 근육내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 점적 정맥 주사, 또는 정맥 주사하면 되지만, 그 투여량이나 투여 횟수는, 질환의 종류, 증상, 연령, 투여 방법 등에 따라 적절히 변경할 수 있다.
실험 시약으로서 사용하는 경우, 본 발명의 입자를, SARS-CoV-2 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 발현시키고자 하는 세포 (예를 들어, HEK293 세포 및 그 파생 세포 (HEK293T 세포, FreeStyle 293 세포나 Expi293 세포), CHO 세포, C2C12 마우스 근아 세포, 불사화 마우스 수상 세포 (MutuDC1940)) 에 도입하고, SARS-CoV-2 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 in vitro 에서 발현시킬 수 있다. SARS-CoV-2 의 S 단백질 및/또는 그 단편의 발현은, 샘플 중의 SARS-CoV-2 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 웨스턴 블롯법으로 검출하거나, SARS-CoV-2 의 S 단백질 및/또는 그 단편에 특이적인 펩티드 단편을 질량 분석법으로 검출하거나 함으로써 해석할 수 있다.
본 명세서에 있어서 치료란, 바이러스 또는 세균 등에 의한 감염증, 또는 당해 감염을 원인으로 하는 질환 (예를 들어, 폐렴 등) 을 발증한 환자에 있어서, 이들 질환의 임상 증상의 회복, 관해, 완화 및/또는 악화의 지연을 의미한다.
본 명세서에 있어서, 예방이란, 바이러스 또는 세균 등에 의한 감염증에 의한 질환의 발증률을 저감시키는 것을 의미한다. 예방은, 바이러스 또는 세균 등에 의한 감염증에 의한 질환의 진행의 리스크의 저하, 혹은 그것들 질환의 중증화의 저감을 포함한다. 본 발명의 입자는, 방어 면역 반응을 유도하므로 상기 질환의 예방 및/또는 치료에 효과를 나타낸다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 또한, 이들 실시예는, 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1] SARS-CoV-2 S full mRNA-001 의 조제
(1) SARS-CoV-2 S full 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
In vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해서 SARS-CoV-2 S full DNA 를 PCR 에 의해 증폭 후 정제하였다. T7 프로모터 서열, 인간 β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, SARS-CoV-2 S full, 인간 β-globin 의 3'-UTR 서열이 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 1) 을 플라스미드에 도입하였다 (pUC57mini-S full). 당해 플라스미드 6 ng 를 용해시킨 Nuclease-free water (849.6 μL) 에 10 × Buffer for KOD-Plus- Ver.2 (120 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211), 2 mM dNTP mix (120 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211), 25 mM MgSO4 (72 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211), 50 μM 센스 프라이머 (7.2 μL, 서열 번호 2), 50 μM 안티센스 프라이머 (7.2 μL, 서열 번호 3), KOD Plus polymerase (24 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211) 를 첨가하고, 98 ℃ 에서 1 분 인큐베이션 후, 98 ℃, 5 초, 55 ℃, 15 초, 68 ℃, 4 분을 20 사이클 실시하고, 추가로 68 ℃ 에서 1 분 인큐베이트하여, S full DNA 를 증폭시켰다. 반응 후 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega catalog # A9281) 으로 주형 DNA (서열 번호 4) 를 정제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 SARS-CoV-2 S-full mRNA-001 의 조제
실시예 1-(1) 에서 얻어진 360.5 μg/mL 주형 DNA (70 μL), 100 mM CleanCap AG (50 μL, TriLink catalog # T-7113), 100 mM ATP (50 μL, Hongene catalog # R1331), 100 mM GTP (50 μL, Hongene catalog # R2331), 100 mM 5-Me-CTP (50 μL, Hongene catalog # R3-029), 100 mM 5-methyluridine triphosphate (50 μL), Nuclease-free water (380 μL, Thermo Fisher catalog # AM9937), T7 Transcription 5 × buffer (200 μL, Promega catalog # P140X), Enzyme mix, T7 RNA Polymerase (100 μL, Promega catalog # P137X) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이션하였다. RQ1 RNase-Free DNase (25 μL, Promega catalog # M6101) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 15 분 인큐베이션하였다. 8 M LiCl 용액 (500 μL, Sigma-Aldrich catalog # L7026) 을 혼합하고, -20 ℃ 에서 밤새 정치 (靜置) 시켰다. 원심 분리 (4 ℃, 4000 × g, 30 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 4000 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 바람 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water 에 용해 후, RNeasy Maxi kit (Qiagen catalog # 75162) 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제하였다. 얻어진 용출액 (5.8 mL, UV 환산으로 4906 μg) 과 Nuclease-free water (419 μL), rApid Alkaline Phosphatase (Roche catalog # 04 898 141 001) 의 완충액 (800 μL) 과 효소 (981 μL) 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이션 후, 75 ℃ 에서 3 분 인큐베이션하였다. 8 M LiCl 용액 (8000 μL) 을 혼합하고, -20 ℃ 에서 밤새 정치시켰다. 원심 분리 (4 ℃, 4000 × g, 30 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (4 ℃, 4000 × g, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 바람 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 Nuclease-free water 에 용해 후, RNeasy Maxi kit 를 사용하여 부속된 매뉴얼대로 정제함으로써 목적으로 하는 mRNA 를 얻었다.
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 5 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit (PerkinElmer catalog #CLS960010) 에 의해 분석하고, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 2] SARS-CoV-2 RBD mRNA-002 의 조제
(1) SARS-CoV-2 RBD 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
In vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해서 SARS-CoV-2 RBD DNA 를 PCR 에 의해 증폭 후 정제하였다. T7 프로모터 서열, 인간 β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, SARS-CoV-2 S 단백질의 시그널 서열, SARS-CoV-2 RBD, 인간 β-globin 의 3'-UTR 서열이 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 7) 을 플라스미드에 도입하였다 (pUC57mini-RBD). 당해 플라스미드 6 ng 를 용해시킨 Nuclease-free water (849.6 μL) 에 10 × Buffer for KOD-Plus- Ver.2 (120 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211), 2 mM dNTP mix (120 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211), 25 mM MgSO4 (72 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211), 50 μM 센스 프라이머 (7.2 μL, 서열 번호 2), 50 μM 안티센스 프라이머 (7.2 μL, 서열 번호 3), KOD Plus polymerase (24 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211) 를 첨가하고, 98 ℃ 에서 1 분 인큐베이션 후, 98 ℃, 5 초, 55 ℃, 15 초, 68 ℃, 1 분을 20 사이클 실시하고, 추가로 68 ℃ 에서 1 분 인큐베이트하여, RBD DNA 를 증폭시켰다. 반응 후 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega catalog # A9281) 으로 주형 DNA (서열 번호 8) 를 정제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 SARS-CoV-2 RBD mRNA-002 의 조제
실시예 1-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 대신에 실시예 2-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 mRNA 를 얻었다.
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 9 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit 에 의해 분석하여, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 3] 실시예 1 에 기재된 SARS-CoV-2 S full mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
(1) mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
디스테아로일포스파티딜콜린 (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine : 이하 DSPC 로 표기, NOF CORPORATION), 콜레스테롤 (Cholesterol : 이하 Chol 로 표기, Sigma-Aldrich, Inc.), 2 아세트산 (7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(디메틸아미노)프로폭시]카르보닐}옥시)펜타트리아콘타-9,26-디엔-7,29-디일 (WO2015/005253 의 실시예 23 에 기재된 화합물) (이하 LP 로 표기), 및 폴리에틸렌글리콜 분자량이 약 2000 인 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Methoxypolyethylene Glycol, 이하 PEG-DMG 로 표기, NOF CORPORATION) 을, DSPC : Chol : LP : PEG-DMG = 12.5 : 41 : 45 : 1.5 의 몰비로, 총 지질 농도 5 mM 이 되도록 에탄올에 용해시켰다.
한편, 실시예 1 에서 얻은 SARS-CoV-2 S-full mRNA-001 을, 시트르산 완충액 (20 mM Citrate Buffer, pH4.0) 으로, 52.7 μg/mL 로 조제하였다.
상기의 지질 용액과 mRNA 용액을, 그 체적비가 1 : 3 이 되도록 NanoAssemblr BenchTop (Precision Nanosystems Inc.) 을 사용하여 마이크로 유로 내에서 혼합하고, 핵산 지질 입자의 조 (粗) 분산액을 얻었다. 핵산 지질 입자의 분산액을 약 25 ∼ 50 배량의 300 mM 수크로오스, 10 mM 히스티딘 완충액 (pH6.5) 으로 12 - 18 시간 투석 (Float-A-Lyzer G2, MWCO : 1,000 kD, Spectra/Por) 함으로써, 에탄올 제거를 실시하여, 정제된 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 분산액을 얻었다.
또한, LP 는 WO2015/005253 의 실시예 23 에 기재된 방법에 따라 합성하였다.
(2) mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 특성 평가
(1) 에서 조제한 핵산 지질 입자를 포함하는 분산액의 특성 평가를 실시하였다. 각각의 특성 평가의 방법에 대해 설명한다.
(2-1) mRNA 의 봉입률
mRNA 의 봉입률은, Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit (Invitrogen) 를 사용하여, 첨부 문서에 준하여 측정하였다.
즉, 0.015 ％ Triton X-100 계면 활성제 존재하 및 비존재하에 있어서, 핵산 지질 입자의 분산액 중의 mRNA 를 정량하고, 다음 식에 의해 봉입률을 산출하였다.
{([계면 활성제 존재하에 있어서의 mRNA 량] - [계면 활성제 비존재하에 있어서의 mRNA 량])/[계면 활성제 존재하에 있어서의 mRNA 량]} x 100 (％)
(2-2) mRNA 와 지질의 비율
핵산 지질 입자의 분산액 중의 mRNA 량을 역상 크로마토그래피로 측정하였다 (System : Agilent 1100 series, Column : Bioshell A400 Protein C4 (10 ㎝ × 4.6 ㎜, 3.4 ㎛) (SUPELCO), Buffer A : 0.1 M 아세트산트리에틸아민 (pH7.0), Buffer B : 아세토니트릴, (B ％) : 5 - 50 ％ (0 - 15 분), Flow Rate : 1 mL/분, 온도 : 70 ℃, 검출 : 260 ㎚).
핵산 지질 입자의 분산액 중의 각 지질량을 역상 크로마토그래피로 측정하였다 (System : DIONEX UltiMate 3000, Column : XSelect CSH C18 (150 ㎜ × 3 ㎜, 3.5 ㎛, 130 Å) (Waters catalog # 186005263), Buffer A : 0.2 ％ 포름산, Buffer B : 0.2 ％ 포름산, 메탄올, (B ％) : 75 - 100 ％ (0 - 6 분), 100 ％ (6 - 15 min), Flow Rate : 0.45 mL/분, 온도 : 50 ℃, 검출 : Corona CAD (Charged Aerosol Detector)).
mRNA 에 대한 총 지질량의 비율을 다음 식에 의해 산출하였다.
[총 지질 농도]/[mRNA 농도] (wt/wt)
(2-3) 평균 입자경
핵산 지질 입자의 입자경은, Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS (PARTICLE SIZING SYSTEMS) 로 측정하였다. 표 중의 평균 입자경은 체적 평균 입자경을 나타내고, ± 이하는 편차를 나타낸다.
결과를 표 1 에 나타냈다.
[실시예 4] 실시예 2 에 기재된 SARS-CoV-2 RBD mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 3 과 동일한 방법으로, 실시예 2 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제, 특성 평가를 실시하였다. 결과를 표 1 에 나타냈다.
Figure pct00009
이상의 결과로부터, 이들 핵산 지질 입자는, mRNA 의 90 ％ 이상이 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 약 100 ㎚ 내지 약 130 ㎚ 의 평균 입자경을 가지고 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 5] SARS-CoV-2 S full optimized mRNA-003 의 조제
(1) SARS-CoV-2 S full optimized 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
T7 프로모터 서열, 인간 β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, SARS-CoV-2 S full optimized, 인간 β-globin 의 3'-UTR 서열이 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 12) 을 인공 합성하여, 플라스미드에 도입하였다 (S_opt2 EcoRI). 당해 플라스미드 1 ng 를 용해시킨 Nuclease-free water (69 μL) 에 5 × SuperFi Green Buffer (20 μL, ThermoFisher Scientific catalog # 12357 - 010), 2.5 mM dNTP mix (8 μL, 다카라 바이오 (주) catalog # 4030), 50 μM 센스 프라이머 2 (1 μL, 서열 번호 13), 50 μM 안티센스 프라이머 2 (1 μL, 서열 번호 14), Platinum SuperFi DNA Polymerase (1 μL, ThermoFisher Scientific catalog # 12357-010) 를 첨가하고, 98 ℃ 에서 30 초 인큐베이션 후, 98 ℃, 5 초, 60 ℃, 10 초, 72 ℃, 2 분을 20 사이클 실시하고, 추가로 72 ℃ 에서 1 분 인큐베이트하여, SARS-CoV-2 S full optimized 의 주형 DNA 를 증폭시켰다 (서열 번호 15). 당해 주형 DNA 를 제한 효소 NheI 및 HindIII 으로 절단 후, 동 제한 효소로 절단한 플라스미드에 도입하여, 주형 플라스미드를 제조하였다 (pUCKIVT1 S full optimized). 당해 플라스미드를 제한 효소 BspQI 로 절단 후, 이소프로판올 침전으로 DNA 를 정제하여, 직사슬 플라스미드 DNA 를 조제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 SARS-CoV-2 S full optimized mRNA-003 의 조제
실시예 1-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 대신에 실시예 5-(1) 에서 얻어진 직사슬 플라스미드 DNA 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 mRNA 를 얻었다.
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 16 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit 에 의해 분석하고, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 6] SARS-CoV-2 RBD optimized mRNA-004 의 조제
(1) SARS-CoV-2 RBD optimized 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
T7 프로모터 서열, 인간 β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, SARS-CoV-2 RBD optimized, 인간 β-globin 의 3'-UTR 서열이 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 17) 을 인공 합성하여, 플라스미드에 도입하였다 (S_RBD_opt2 EcoRI). 당해 플라스미드 1 ng 를 용해시킨 Nuclease-free water (69 μL) 에 5 × SuperFi Green Buffer (20 μL, ThermoFisher Scientific catalog # 12357-010), 2 mM dNTP mix (8 μL, 다카라 바이오 (주) catalog # 4030), 50 μM 센스 프라이머 2 (1 μL, 서열 번호 13), 50 μM 안티센스 프라이머 2 (1 μL, 서열 번호 14), Platinum SuperFi DNA Polymerase (1 μL, ThermoFisher Scientific catalog # 12357-010) 를 첨가하고, 98 ℃ 에서 30 초 인큐베이션 후, 98 ℃, 5 초, 60 ℃, 10 초, 72 ℃, 1 분을 20 사이클 실시하고, 추가로 72 ℃ 에서 1 분 인큐베이트하여, SARS-CoV-2 RBD optimized DNA 를 증폭시켰다 (서열 번호 18). 당해 주형 DNA 를 제한 효소 NheI 및 HindIII 으로 절단 후, 동 제한 효소로 절단한 플라스미드에 도입하여, 주형 플라스미드를 제조하였다 (pUCKIVT1-RBD optimized). 당해 플라스미드를 제한 효소 BspQI 로 절단 후, 이소프로판올 침전으로 DNA 를 정제하여, 직사슬 플라스미드 DNA 를 조제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 SARS-CoV-2 RBD optimized mRNA-004 의 조제
실시예 1-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 대신에 실시예 6-(1) 에서 얻어진 직사슬 플라스미드 DNA 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 mRNA 를 얻었다.
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 19 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit 에 의해 분석하고, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 7] 실시예 5 에 기재된 SARS-CoV-2 S full optimized mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 3 과 동일한 방법으로, 실시예 5 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제, 특성 평가를 실시하였다. 단, 300 mM 수크로오스, 10 mM 히스티딘 완충액 (pH6.5) 대신에, 300 mM 수크로오스, 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0) 을 사용하여 투석을 실시하여, mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 분산액을 얻었다.
결과를 표 2 에 나타냈다.
[실시예 8] 실시예 6 에 기재된 SARS-CoV-2 RBD optimized mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 3 과 동일한 방법으로, 실시예 6 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제, 특성 평가를 실시하였다. 단, 300 mM 수크로오스, 10 mM 히스티딘 완충액 (pH6.5) 대신에, 300 mM 수크로오스, 10 mM 히스티딘 완충액 (pH7.0) 을 사용하여 투석을 실시하여, mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 분산액을 얻었다.
결과를 표 2 에 나타냈다.
[실시예 9] SARS-CoV-2 RBD optimized mRNA-004 의 HPLC 정제
실시예 6-(2) 에 기재된 방법으로 얻어진 mRNA 를 역상 크로마토그래피 (YMC-Triart Bio C4 (YMC catalog # TB30S05-1510WT), 5 ％ 아세토니트릴, 400 mM 아세트산트리에틸아민 (pH7.0)/25 ％ 아세토니트릴, 400 mM 아세트산트리에틸아민 (pH7.0), 75 ℃) 으로 분취 정제하였다.
[실시예 10] 실시예 6 에 기재된 SARS-CoV-2 RBD optimized mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 8 과 동일한 방법으로, 실시예 9 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제, 특성 평가를 실시하였다. 결과를 표 2 에 나타냈다.
Figure pct00010
이상의 결과로부터, 이들 핵산 지질 입자는, mRNA 의 90 ％ 이상이 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 약 90 ㎚ 내지 약 130 ㎚ 의 평균 입자경을 가지고 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 11] SARS-CoV-2 RBD S2000 mRNA 의 조제
(1) SARS-CoV-2 RBD S2000 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
in vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해서 플라스미드를 구축하였다. GCTAGC (NheI 사이트), T7 프로모터 서열, 인간 β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, SARS-CoV-2 S 단백질의 시그널 서열, SARS-CoV-2 RBD 의 번역 영역, 인간 β-globin 의 3'-UTR 서열, 폴리 A 꼬리부 및 GAAGAGC (BspQI 사이트) 가 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 20) 을 도입한 플라스미드 (pUC57-S2000) 를 제조하였다. 플라스미드 (100 μg) 를 용해시킨 Nuclease-free water (860 μL, Thermo Fisher, catalog # AM9937) 에 10X NEB Buffer 3.1 (100 μL, New England Biolabs, catalog # R7203S), BspQI (40 μL, New England Biolabs, catalog #R0712) 를 첨가하고, 50 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션 후, 이소프로판올 (1400 μL) 을 첨가하고, -80 ℃ 에서 하룻밤 정치시켰다. 원심 분리 (-8 ℃, 15,000 rpm, 10 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (-8 ℃, 15,000 rpm, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 바람 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 TE-Buffer (pH8.0) 로 용해시켜, 500 μg/ml 의 용액으로 조제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 SARS-CoV-2 RBD S2000 mRNA 의 조제
실시예 1-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 대신에 실시예 11-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 mRNA 를 얻었다.
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 21 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit 에 의해 분석하고, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 12] 실시예 11 에 기재된 SARS-CoV-2 RBD S2000 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 8 과 동일한 방법으로, 실시예 11 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제, 특성 평가를 실시하였다. 단, mRNA 량은 이하의 방법으로 측정하였다.
핵산 지질 입자 분산액을 90 ％ 메탄올에 희석 용해시켜, 핵산 지질 입자 중의 mRNA 량을 자외 가시 분광 광도계 (퍼킨 엘머사 제조, LAMBDATM 465) 로 측정하였다. mRNA 농도를 다음 식에 의해 산출하였다.
{[260 ㎚ 에 있어서의 흡광도] - [350 ㎚ 에 있어서의 흡광도]} x 40 x 희석 배율 (μg/mL)
결과를 표 3 에 나타냈다. 특성 평가의 결과로부터, 본 핵산 지질 입자는, mRNA 의 95 ％ 이상이 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 약 150 ㎚ 의 평균 입자경을 가지고 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 13] SARS-CoV-2 RBD S2001 mRNA 의 조제
(1) SARS-CoV-2 RBD S2001 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
in vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해서 플라스미드를 구축하였다. GCTAGC (NheI 사이트), T7 프로모터 서열, 인간 β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, SARS-CoV-2 S 단백질의 시그널 서열, SARS-CoV-2 RBD 의 번역 영역, 인간 β-globin 의 3'-UTR 서열, 폴리 A 꼬리부 및 GAAGAGC (BspQI 사이트) 가 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 22) 을 도입한 플라스미드 (pUC57-S2001) 를 제조하였다. 플라스미드 (100 μg) 를 용해시킨 Nuclease-free water (860 μL, Thermo Fisher, catalog # AM9937) 에 10X NEB Buffer 3.1 (100 μL, New England Biolabs, catalog # R7203S), BspQI (40 μL, New England Biolabs, catalog #R0712) 를 첨가하고, 50 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션 후, 이소프로판올 (1400 μL) 을 첨가하고, -80 ℃ 에서 하룻밤 정치시켰다. 원심 분리 (-8 ℃, 15,000 rpm, 10 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (-8 ℃, 15,000 rpm, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 바람 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 TE-Buffer (pH8.0) 로 용해시켜, 500 μg/ml 의 용액으로 조제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 SARS-CoV-2 RBD S2001 mRNA 의 조제
실시예 1-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 대신에 실시예 13-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 mRNA 를 얻었다.
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 23 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit 에 의해 분석하고, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 14] 실시예 13 에 기재된 SARS-CoV-2 RBD S2001 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 12 와 동일한 방법으로, 실시예 13 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제, 특성 평가를 실시하였다. 결과를 표 3 에 나타냈다. 특성 평가의 결과로부터, 본 핵산 지질 입자는, mRNA 의 95 ％ 이상이 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 약 140 ㎚ 의 평균 입자경을 가지고 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 15] SARS-CoV-2 RBD S2002 mRNA 의 조제
(1) SARS-CoV-2 RBD S2002 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
in vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해서 플라스미드를 구축하였다. GCTAGC (NheI 사이트), T7 프로모터 서열, 인간 β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, SARS-CoV-2 S 단백질의 시그널 서열, SARS-CoV-2 RBD 의 번역 영역, 인간 β-globin 의 3'-UTR 서열, 폴리 A 꼬리부 및 GAAGAGC (BspQI 사이트) 가 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 26) 을 도입한 플라스미드 (pUC57-S2002) 를 제조하였다. 플라스미드 (100 μg) 를 용해시킨 Nuclease-free water (860 μL, Thermo Fisher, catalog # AM9937) 에 10X NEB Buffer 3.1 (100 μL, New England Biolabs, catalog # R7203S), BspQI (40 μL, New England Biolabs, catalog #R0712) 를 첨가하고, 50 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션 후, 이소프로판올 (1400 μL) 을 첨가하고, -80 ℃ 에서 하룻밤 정치시켰다. 원심 분리 (-8 ℃, 15,000 rpm, 10 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (-8 ℃, 15,000 rpm, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 바람 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 TE-Buffer (pH8.0) 로 용해시켜, 500 μg/ml 의 용액으로 조제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 SARS-CoV-2 RBD S2002 mRNA 의 조제
실시예 1-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 대신에 실시예 15-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 mRNA 를 얻었다.
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 27 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit 에 의해 분석하고, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 16] 실시예 15 에 기재된 SARS-CoV-2 RBD S2002 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 12 와 동일한 방법으로, 실시예 15 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제, 특성 평가를 실시하였다. 결과를 표 3 에 나타냈다. 특성 평가의 결과로부터, 본 핵산 지질 입자는, mRNA 의 95 ％ 이상이 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 약 140 ㎚ 의 평균 입자경을 가지고 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 17] SARS-CoV-2 RBD S2003 mRNA 의 조제
(1) SARS-CoV-2 RBD S2003 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
in vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해서 플라스미드를 구축하였다. GCTAGC (NheI 사이트), T7 프로모터 서열, 인간 β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, SARS-CoV-2 S 단백질의 시그널 서열, SARS-CoV-2 RBD 의 번역 영역, 인간 β-globin 의 3'-UTR 서열, 폴리 A 꼬리부 및 GAAGAGC (BspQI 사이트) 가 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 30) 을 도입한 플라스미드 (pCC1-S2003) 를 제조하였다. 플라스미드 (100 μg) 를 용해시킨 Nuclease-free water (860 μL, Thermo Fisher, catalog # AM9937) 에 10X NEB Buffer 3.1 (100 μL, New England Biolabs, catalog # R7203S), BspQI (40 μL, New England Biolabs, catalog #R0712) 를 첨가하고, 50 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션 후, 이소프로판올 (1400 μL) 을 첨가하고, -80 ℃ 에서 하룻밤 정치시켰다. 원심 분리 (-8 ℃, 15,000 rpm, 10 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (-8 ℃, 15,000 rpm, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 바람 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 TE-Buffer (pH8.0) 으로 용해시켜, 500 μg/ml 의 용액으로 조제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 SARS-CoV-2 RBD S2003 mRNA 의 조제
실시예 1-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 대신에 실시예 17-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 mRNA 를 얻었다.
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 31 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit에 의해 분석하고, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 18] 실시예 17 에 기재된 SARS-CoV-2 RBD S2003 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 12 와 동일한 방법으로, 실시예 17 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제, 특성 평가를 실시하였다. 결과를 표 3 에 나타냈다. 특성 평가의 결과로부터, 본 핵산 지질 입자는, mRNA 의 95 ％ 이상이 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 약 140 ㎚ 의 평균 입자경을 가지고 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 19] SARS-CoV-2 RBD S2004 mRNA 의 조제
(1) SARS-CoV-2 RBD S2004 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
in vitro transcription (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해서 플라스미드를 구축하였다. GCTAGC (NheI 사이트), T7 프로모터 서열, 인간 β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, SARS-CoV-2 S 단백질의 시그널 서열, SARS-CoV-2 RBD 의 번역 영역, 인간 β-globin 의 3'-UTR 서열, 폴리 A 꼬리부 및 GAAGAGC (BspQI 사이트) 가 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 34) 을 도입한 플라스미드 (pCC1-S2004) 를 제조하였다. 플라스미드 (100 μg) 를 용해시킨 Nuclease-free water (860 μL, Thermo Fisher, catalog # AM9937) 에 10X NEB Buffer 3.1 (100 μL, New England Biolabs, catalog # R7203S), BspQI (40 μL, New England Biolabs, catalog #R0712) 를 첨가하고, 50 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션 후, 이소프로판올 (1400 μL) 을 첨가하고, -80 ℃ 에서 하룻밤 정치시켰다. 원심 분리 (-8 ℃, 15,000 rpm, 10 분) 후, 상청을 폐기, 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 원심 분리 (-8 ℃, 15,000 rpm, 10 분) 후, 상청을 폐기하고 바람 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 TE-Buffer (pH8.0) 로 용해시켜, 500 μg/ml 의 용액으로 조제하였다.
(2) in vitro transcription 에 의한 SARS-CoV-2 RBD S2004 mRNA 의 조제
실시예 1-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 대신에 실시예 19-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 mRNA 를 얻었다.
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 35 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit 에 의해 분석하고, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
[실시예 20] 실시예 19 에 기재된 SARS-CoV-2 RBD S2004 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 12 와 동일한 방법으로, 실시예 19 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제, 특성 평가를 실시하였다. 결과를 표 3 에 나타냈다. 특성 평가의 결과로부터, 본 핵산 지질 입자는, mRNA 의 95 ％ 이상이 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 약 180 ㎚ 의 평균 입자경을 가지고 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 21 ∼ 30] 실시예 6 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
(1) mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 콜레스테롤, 2 아세트산 (7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(디메틸아미노)프로폭시]카르보닐}옥시)펜타트리아콘타-9,26-디엔-7,29-디일 (LP), 및 폴리에틸렌글리콜 분자량이 약 2000 인 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (PEG-DMG) 을, 표 4 에 기재된 몰비로, 총 지질 농도 5 mM 이 되도록 에탄올에 용해시켰다.
한편, 실시예 6 에서 얻은 mRNA 를, 시트르산 완충액 (20 mM Citrate Buffer, pH4.0) 으로 희석 조제하였다.
상기의 지질 용액과 mRNA 용액을, mRNA 에 대한 총 지질 중량비가 표 4 에 기재된 값이 되고, 또한 그 체적비가 1 : 3 이 되도록 NanoAssemblr BenchTop (Precision Nanosystems Inc.) 을 사용하여 마이크로 유로 내에서 혼합하고, 핵산 지질 입자의 조분산액을 얻었다. 핵산 지질 입자의 분산액을 약 25 ∼ 50 배량의 완충액으로 12 ∼ 18 시간 투석 (Float-A-Lyzer G2, MWCO : 1,000 kD, Spectra/Por) 함으로써, 에탄올 제거를 실시하여, 정제된 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 분산액을 얻었다.
(2) mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 특성 평가
(1) 에서 조제한 핵산 지질 입자를 포함하는 분산액의 특성 평가를 실시하였다. 각각의 특성 평가의 방법에 대해 설명한다.
(2-1) mRNA 의 봉입률
mRNA 의 봉입률은, Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit (Invitrogen) 를 사용하여, 첨부 문서에 준하여 측정하였다.
즉, 0.015 ％ Triton X-100 계면 활성제 존재하 및 비존재하에 있어서, 핵산 지질 입자의 분산액 중의 mRNA 를 정량하고, 다음 식에 의해 봉입률을 산출하였다.
{([계면 활성제 존재하에 있어서의 mRNA 량] - [계면 활성제 비존재하에 있어서의 mRNA 량])/[계면 활성제 존재하에 있어서의 mRNA 량]} x 100 (％)
(2-2) mRNA 와 지질의 비율
핵산 지질 입자의 분산액 중의 mRNA 량을 자외 가시 분광 광도계로 측정하였다. 핵산 지질 입자 분산액을 90 ％ 메탄올에 희석 용해시켜, 핵산 지질 입자 중의 mRNA 량을 자외 가시 분광 광도계 (퍼킨 엘머사 제조, LAMBDA (상표) 465) 로 측정하였다. mRNA 농도를 다음 식에 의해 산출하였다.
{[260 ㎚ 에 있어서의 흡광도] - [350 ㎚ 에 있어서의 흡광도]} x 40 x 희석 배율 (μg/mL)
핵산 지질 입자의 분산액 중의 각 지질량을 역상 크로마토그래피로 측정하였다 (System : DIONEX UltiMate 3000, Column : XSelect CSH C18 (130 Å, 3.5 ㎛, 3.0 ㎜ × 150 ㎜,) (Waters catalog # 186005263), Buffer A : 0.2 ％ 포름산, Buffer B : 0.2 ％ 포름산, 메탄올, (B ％) : 75 - 100 ％ (0 - 6 분), 100 ％ (6 - 15 분), Flow Rate : 0.45 mL/분, 온도 : 50 ℃, 검출 : Corona CAD (Charged Aerosol Detector)).
mRNA 에 대한 총 지질량의 비율을 다음 식에 의해 산출하였다.
[총 지질 농도]/[mRNA 농도] (wt/wt)
(2-3) 평균 입자경
핵산 지질 입자의 입자경은, Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS (PARTICLE SIZING SYSTEMS) 로 측정하였다. 표 중의 평균 입자경은 체적 평균 입자경을 나타내고, ± 이하는 편차를 나타낸다.
특성 평가의 결과를 표 5 에 나타냈다. 이들 핵산 지질 입자는, mRNA 의 95 ％ 이상이 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 약 90 ㎚ 내지 약 140 ㎚ 의 평균 입자경을 가지고 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 31] 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA 의 조제
표 6 에 기재된 변이를 갖는 RBD 에 대해, SARS-CoV-2 RBD mRNA 를 제조하였다. 표 7 중의 실시예 번호 뒤의 기호는 표 6 에 기재된 바와 같이, 각각의 변이형에 대응한다. 예를 들어, 실시예 32-a 란, 실시예 32 에서 얻어진, 남아프리카형의 변이를 갖는 mRNA 를 봉입한 핵산 지질 입자를 나타낸다.
(1) 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 in vitro transcription (IVT) 용의 주형 DNA 의 제조
In vitro translation (IVT) 에 사용하는 주형 DNA 를 제조하기 위해서 변이형 SARS-CoV-2 RBD DNA 를 PCR 에 의해 증폭 후 정제하였다. T7 프로모터 서열, 인간 β-globin 의 5'-UTR 서열, KOZAK 서열, SARS-CoV-2 S 단백질의 시그널 서열, 변이형 SARS-CoV-2 RBD, 인간 β-globin 의 3'-UTR 서열이 순서대로 연결된 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 38) 을 플라스미드에 도입하였다 (pUC57mini-변이형 RBD). 당해 플라스미드 10 ng 를 용해시킨 Nuclease-free water (566.4 μL) 에 10 × Buffer for KOD-Plus- Ver.2 (80 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211), 2 mM dNTP mix (80 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211), 25 mM MgSO4 (48 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211), 50 μM 센스 프라이머 (4.8 μL, 서열 번호 2), 50 μM 안티센스 프라이머 (4.8 μL, 서열 번호 3), KOD Plus polymerase (16 μL, 토요보 (주) catalog # KOD-211) 를 첨가하고, 98 ℃ 에서 15 초 인큐베이션 후, 98 ℃, 5 초, 55 ℃, 15 초, 68 ℃, 1 분을 20 사이클 실시하고, 추가로 68 ℃ 에서 1 분 인큐베이트하여, RBD DNA 를 증폭시켰다. 반응 후 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega catalog # A9281) 으로 주형 DNA (서열 번호 52) 를 정제하였다.
DNA 단편 (서열 번호 38) 대신에 서열 번호 39 ∼ 41, 43, 48 ∼ 51 의 DNA 단편을 각각 사용하여 동일한 방법에 의해, 서열 번호 53 ∼ 55, 57, 62 ∼ 65 의 주형 DNA 를 각각 얻었다.
(2) in vitro transcription 에 의한 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA 의 조제
실시예 1-(1) 에서 얻어진 주형 DNA 대신에 실시예 31-(1) 에서 얻어진 주형 DNA (서열 번호 52) 를 사용하여, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 mRNA 를 얻었다.
얻어진 mRNA 는, 서열 번호 66 의 서열을 갖는다. LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit 에 의해 분석하고, 목적으로 하는 길이인 것을 확인하였다.
주형 DNA (서열 번호 52) 대신에 서열 번호 53 ∼ 55, 57, 62 ∼ 65 의 주형 DNA 를 각각 사용하여 동일한 방법에 의해, 서열 번호 67 ∼ 69, 71, 76 ∼ 79 의 mRNA 를 각각 얻었다.
[실시예 32] 실시예 31 에 기재된 SARS-CoV-2 RBD mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 8 과 동일한 방법으로, 실시예 31 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제, 특성 평가를 실시하였다. 결과를 표 7 에 나타냈다.
특성 평가의 결과로부터, 이들 핵산 지질 입자는, mRNA 의 95 ％ 이상이 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 약 110 ㎚ 내지 약 130 ㎚ 의 평균 입자경을 가지고 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 33] 실시예 6 에 기재된 SARS-CoV-2 RBD mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제
실시예 8 과 동일한 방법으로, 실시예 6 에 기재된 mRNA 를 사용한 mRNA 봉입 핵산 지질 입자의 조제, 특성 평가를 실시하였다. 결과를 표 7 에 나타냈다.
특성 평가의 결과로부터, 본 핵산 지질 입자는, mRNA 의 95 ％ 이상이 지질 입자 내에 봉입되어 있고, 약 110 ㎚ 의 평균 입자경을 가지고 있는 것이 분명해졌다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
[시험예 1]
투여 (도 2 - 도 4)
1 ∼ 4 ％ (v/v) 의 기화 이소플루란 마취하에서, 마우스의 뒷다리 비복부에 피험 물질을 투여하였다. 3 회 투여 시험은 첫회 투여로부터 7 일 후 및 21 일 후에 추가 투여하고 (1 회째 투여시 : 오른쪽 뒷다리, 2 회째 투여시 : 왼쪽 뒷다리, 3 회째 투여시 : 오른쪽 뒷다리), 2 회 투여 시험은 첫회 투여로부터 13 일 후에 추가 투여하였다 (1 회째 투여시 : 오른쪽 뒷다리, 2 회째 투여시 : 왼쪽 뒷다리). 피험 물질은, 1 회당 3 μg mRNA/20 μL/body, 혹은 1 μg mRNA/20 μL/body 를 투여하였다 (도 2 - 도 4 에 있어서, 각각 실시예 번호_3, 실시예 번호_1 로 기재한다. 예를 들어, 도 2 - 도 4 의 실시예 3_3 의 기재는 실시예 3 의 입자를 3 μg mRNA/20 μL/body 투여한 군인 것을 의미한다). 투여액 조제의 Buffer 는, 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액, pH6.5 를 사용하였다. 시판 사포닌 아쥬반트 (Quil-A Adjuvant, Invivogen, Cat#vac-quil) 를 첨가한 S1 단백질 (Sino Biological, Cat#40591-V08H) 은, 항 RBD 항체 응답의 양성 대조군으로서 설정하였다 (S1/Quil-A 군). S1 단백질 및 Quil-A 는, 1 회당 1 μg S1 및 10 μg Quil-A/20 μL/body 를 투여하였다.
혈청과 비장 세포의 조제
피험 물질 투여시에 미정맥으로부터 얻은 혈액은, 혈청 분리제 (BD, Cat#365967) 가 들어간 튜브에 회수하고, 원심 분리 후 (15,000 rpm, 4 ℃, 5 분간, 원심기 : TOMY, MX-205) 에 혈청을 회수하였다. 3 회 투여 시험의 최종 투여로부터 14 일 후에 심장으로부터 얻은 혈액은, 튜브에 회수하고 실온에 3 시간 정치시키고, 그 후 4 ℃ 설정의 냉장고에서 22 시간 정치시킨 후, 원심 분리하여 (1700 × g, 4 ℃, 5 분간) 혈청을 회수하였다. 또, 이소플루란 마취하에서 방혈사시킨 마우스로부터 비장을 채취하고, 셀 스트레이너 (CORNING, Cat#352350) 를 사용하여 세포 현탁액을 조제 후, ACK 용액 (Lysing Buffer, BD, Cat#555899) 을 사용하여 용혈 처리를 실시하여, 비장 세포를 조제하였다.
단백질 발현 해석
배지 중의 mRNA 농도가 10 μg/mL 가 되도록, 실시예 3 또는 4 의 입자를 Expi293F 세포 (Thermo Fisher Scientific, Cat# A14527) 에 첨가하였다. 또, 음성 컨트롤로서, 실시예 4 의 입자의 첨가량과 등량의 Buffer 를 첨가하였다. 첨가로부터 3 일 후에 배양 상청과 세포 펠릿을 회수하였다. 세포 펠릿은, 1 × Protease/Phosphatase 저해제 (Thermo Fisher Scientific, Cat#78443) 를 첨가한 M-PER (Thermo Fisher Scientific, Cat#78501) 로 용해시키고, 원심 분리 후 (9100 × g, 4 ℃, 10 분간) 에 세포 용해액을 회수하였다. D-PBS 로 810 배 및 2430 배로 희석시킨 배양 상청 및 10 배 및 30 배로 희석시킨 세포 용해액을 96 half 웰 플레이트 (Coaster, Cat# 3690) 에 고상화하고, 항 RBD 항체 (Sino Biological, Cat#40592-T62) 를 사용한 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 법에 의해, 실시예 3 또는 4 의 입자에 의해 발현한 단백질을 검출하였다.
혈중 항 RBD 항체가 (도 2 - 도 4)
Ni 플레이트 (QIAGEN, Cat#35061) 에 재조합 RBD 단백질 (Sino Biological, Cat#40592-V08H) 을 블로킹 용액 (1 ％ BSA, 0.05 ％ Tween 20 함유 PBS) 으로 0.25 μg/mL 로 첨가 (50 μL/웰) 하고, 실온에서 2 시간 정치시킨 후, 세정액 (0.05 ％ Tween 20 함유 PBS) 300 μL/웰로 3 회 세정하였다. 시료 희석 계열은, 블로킹 용액을 사용하여 최고 농도의 100 배 희석 혈청으로부터, 4 배 희석으로 8 단계 제조하였다. 표준 혈청 희석 계열은, 블로킹 용액을 사용하여 최고 농도의 2 DS UNIT/mL 로부터, 3 배 희석으로 8 단계 제조하였다. 시료 희석 용액 및 표준 혈청 희석 용액을 첨가 (50 μL/웰) 하고, 실온에서 1 시간 정치 후, 세정액으로 3 회 세정하였다. 검출 항체는, HRP 표지 항마우스 IgG 항체 (Southern Biotech, Cat#1030-05) 를 블로킹 용액으로 4000 배 희석시켜 플레이트에 첨가 (50 μL/웰) 후, 실온에서 1 시간 정치시켰다. 세정액으로 3 회 세정한 후, TMB Microwell Peroxidase Substrate System (SERACARE Life Sciences, Cat#5120-0047) 을 첨가 (50 μL/웰) 하고, 10 분간 정치시켰다. 반응 정지액에는, TMB Stop Solution (SERACARE Life Sciences, Cat# 5150-0021, 50 μL/웰) 을 사용하였다. 플레이트 리더를 사용하여 파장 450 ㎚ (대조 파장 540 ㎚) 의 흡광도를 측정하고, 450 ㎚ 로 측정한 흡광도로부터 540 ㎚ 로 측정한 흡광도를 뺀 보정 흡광도 (Delta) 를 해석에 사용하였다. 표준 혈청의 항 RBD 항체 농도 및 Delta 로부터, Nonlinear Regression : 4 Parameter 를 사용하여 검량선을 작성하였다. 검량선, 측정 시료의 희석 배율, 및 Delta 로부터 시료의 항 RBD 항체 농도를 산출하였다. Delta 가 0.5 ∼ 1.5 가 된 웰의 항체 농도의 평균값을 측정 시료의 항 RBD 항체 농도로서 산출하였다. 시료 최고 농도 웰의 Delta 가 0.5 미만이 된 경우에는 20 DS UNIT/mL 를 대입하여 데이터로 하였다.
RBD-hACE2 결합 저해 활성
96 half 웰 플레이트 (Coaster, Cat# 3690) 에 10 μg/mL Streptavidin (Thermo Fisher Scientific, Cat#21125, PBS 로 용해) 을 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치시킨 후, 세정액 (0.05 ％ Tween 20 함유 PBS) 으로 3 회 세정하였다. 블로킹 용액 (1 ％ BSA, 0.05 ％ Tween 20 함유 PBS) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치시킨 후, 세정액으로 3 회 세정하였다. 그 후, 블로킹 용액으로 조제한 0.2 μg/ml 의 재조합 RBD 단백질 (Acro Biosystems, Cat#SPD-C82E9) 용액을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치시킨 후, 세정액으로 3 회 세정하였다. 블로킹 용액으로 20 배 희석시킨 마우스 혈청을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치 후, 세정액으로 3 회 세정하였다. 블로킹 용액으로 조제한 1 μg/ml 의 재조합 hACE2 단백질 (Acro Biosystems, Cat#AC2-H5257) 용액을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치시킨 후, 세정액으로 3 회 세정하였다. 검출 항체는, HRP 표지 항인간 IgG1 항체 (CYGNUS TECHNOLOGIES, Cat#IM50) 를 블로킹 용액으로 500 배 희석시켜, 플레이트에 첨가 후, 실온에서 1 시간 정치시켰다. 세정액으로 3 회 세정한 후, TMB Microwell Peroxidase Substrate System (SERACARE Life Sciences, Cat#5120-0047) 을 첨가하고, 10 분간 정치시켰다. 반응 정지액에는, TMB Stop Solution (SERACARE Life Sciences, Cat#5150-0021) 을 사용하였다. 플레이트 리더를 사용하여 파장 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여 해석하였다.
SARS-CoV-2 에피토프 펩티드 풀
SARS-CoV-2 의 S 전체 길이를 커버하도록, 253 개의 오버래핑 펩티드 (#1 ∼ #253) 를 위탁 합성하였다 (Eurofins). 1 개의 펩티드당, 200 μl 의 dimethyl sulfoxide (DMSO, Nacalai Tesque, Cat#13408-64) 로 용해시켰다. RBD 와 그 전후의 영역을 커버하도록, #1 ∼ #62, #63 ∼ #107, #108 ∼ #253 를 등량 혼합하고, 3 개의 에피토프 펩티드 풀 (순서대로 각각 Euro1, Euro2, Euro3) 을 조제하였다. 또, SARS-CoV-2 의 S 전체 길이를 커버하는 시판 에피토프 펩티드 풀 (JPT, Cat#PM-WCPV-S-1, 2 vials, N 말 영역을 커버하는 펩티드 풀은 JPT-N, C 말 영역을 커버하는 펩티드 풀은 JPT-C) 은, 1 vial 당 40 μl 의 DMSO 로 용해시켰다.
RBD 특이적 세포성 면역 응답
비장 세포를 RPMI Complete 배지 (10 ％ FBS [Sigma-Aldrich, Cat#172012-500 ML], 1 ％ PS [Penicilin-Streptomycin Mixed Solution, Nacalai Tesque, Cat#26253-84] 함유, 1 mM Sodium Pyruvate [Thermo Fisher Scientific, Cat#11360-070], 10 mM HEPES [Thermo Fisher Scientific, Cat#15630080], 1 × StemSure [후지 필름 와코 순약, Cat#195-15791], 1 × MEM Non-Essential Amino Acids Solution [Thermo Fisher Scientific, Cat#11140-050]) 으로 1 × 107 세포/mL 로 조제하고, U 바닥 96 웰 플레이트에 파종하였다. RPMI Complete 배지에서 최종 농도 0.1 ％ (v/v) 가 되도록 조제한 에피토프 펩티드 풀 Euro1 ∼ 3 용액 및 최종 농도 0.025 ％ (v/v) 가 되도록 조제한 시판 에피토프 펩티드 풀 JPT-N 및 JPT-C 를 비장 세포에 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 48 시간 배양하였다. 세포 배양 상청 중의 IFN-γ 및 IL-13 사이토카인량을 Mouse IFN-γ DuoSet ELISA (R & D Systems, Cat#DY485) 및 Mouse IL-13 Duoset ELISA (R & D systems, Cat#DY413) 를 사용하여 측정하였다. 플레이트 리더를 사용하여 파장 450 ㎚ (대조 파장 540 ㎚) 의 흡광도를 측정하고, 450 ㎚ 의 흡광도로부터 540 ㎚ 로 측정한 흡광도를 뺀 보정 흡광도 (Delta) 를 해석에 사용하였다. 표준 용액의 사이토카인 농도 및 Delta 값으로부터 Nonlinear Regression : 4 Parameter 를 사용하여 검량선을 작성하고, 검량선으로부터 측정 시료의 사이토카인 농도를 산출하였다. IL-13 농도가 0.000 미만 (< 0.000) 이 된 경우에는, 컷 오프값 0.005 를 대입하여 데이터로 하였다.
통계 해석
혈중 항 RBD 항체 응답 및 RBD-hACE2 결합 저해 활성의 비교에 대해, 3 회 투여 시험은 t 검정을 실시하고, 2 회 투여 시험은 Buffer 군을 대조로 하여 Dunnett 검정을 실시하였다. RBD 특이적 세포성 면역 응답의 비교는, S1/Quil-A 군을 대조로 하여, 각 펩티드 처리에 대해 Dunnett 검정을 실시하였다. 모든 해석에는 SAS ver.9.2 를 사용하였다.
마우스에 대한 투여 (도 5 - 도 9, 도 25 - 도 28)
1 ∼ 4 ％ (v/v) 의 기화 이소플루란 마취하에서, 2 주 간격으로 2 회 (도 5) 혹은 3 주 간격으로 2 회 (도 6 - 9, 도 25, 도 26, 및 도 28), BALB/c 마우스 (도 5 - 도 8, 도 25, 도 26, 및 도 28) 혹은 C57BL/6 마우스 (도 9) 의 뒷다리 비복부에 피검 물질을 투여하였다. 도 27 은, BALB/c 마우스의 뒷다리 비복부에 피검 물질을 1 회만 투여하였다. 피험 물질은, 1 회당 0.03, 0.3, 혹은 3 μg mRNA/20 μL/body 를 투여하였다 (예를 들어, 도 5 의 실시예 8_0.03 의 기재는 실시예 8 의 입자를 0.03 μg mRNA/20 μL/body 투여한 군인 것을 의미한다). 도 25 및 도 27 은 1 회당 2 μg mRNA/20 μL/body 를 투여하고, 도 26 및 도 28 은 1 회당 3 μg mRNA/20 μL/body 를 투여하였다. 투여액 조제의 Buffer 는, 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액, pH7.0 을 사용하였다.
원숭이에 대한 투여 (도 29)
2 주 간격으로 3 회, 필리핀원숭이의 상완 삼각근에 실시예 10 을 투여하였다. 실시예 10 은, 1 회당 50 μg mRNA/200 μL/body 를 투여하였다. 투여액 조제의 Buffer 는, 300 mM 수크로오스 함유 10 mM 히스티딘 완충액, pH7.0 을 사용하였다.
혈중 항 RBD 항체가 (도 5, 도 6, 도 9, 및 도 25 - 도 27)
Streptavidin (Thermo Fisher Scientific Inc.) 고상액을 ELISA 플레이트에 25 μL/웰 첨가하고, 4 ℃ 설정 냉장고에서 하룻밤 정치시켰다. 플레이트 워셔 (AMW-96SX, 바이오텍 주식회사) 를 사용하여 Wash Buffer 로 3 회 세정 (180 μL/웰) 하고, 1 ％ BSA/PBST 를 첨가 (150 μL/웰) 하고, 실온에서 1 시간 이상 정치시킴으로써 블로킹을 실시하였다. 플레이트 워셔를 사용하여 Wash Buffer (180 μL/웰) 로 3 회 세정 후, RBD 용액 (Original 주 RBD : Acro Biosystems, Cat#SPD-C82E9, 351 주 RBD : Sino Biological, Cat#40592-V08H85-B) 을 첨가 (25 μL/웰) 하고, 실온에서 1 시간 이상 정치시켰다. 플레이트 워셔를 사용하여 Wash Buffer (180 μL/웰) 로 3 회 세정 후, 측정 시료 단계 희석액 및 표준 혈청 단계 희석액 (도 5, 도 6, 도 9, 도 25, 도 26) 을 첨가 (25 μL/웰) 하고, 실온에서 1 시간 이상 정치시켰다. 도 27 의 표준 시료로서, Original 유래 RBD 및 B.1.351 주 유래 RBD 에 동등하게 결합하는 항 RBD 항체 (클론 #3) 의 단계 희석액을 사용하였다. 플레이트 워셔를 사용하여 Wash Buffer 로 3 회 세정 (180 μL/웰) 후, HRP 표지 항마우스 IgG 항체 (Southern Biotech, Cat#1030-05) 검출 항체 희석액을 첨가 (25 μL/웰) 후, 실온에서 1 시간 정치시켰다. 세정액으로 3 회 세정한 후, TMB Microwell Peroxidase Substrate System (SERACARE Life Sciences, Cat#5120-0047) 을 첨가 (30 μL/웰) 하고, 10 분간 정치시켰다. 반응 정지액에는, TMB Stop Solution (SERACARE Life Sciences, Cat# 5150-0021, 30 μL/웰) 을 사용하였다. 플레이트 리더를 사용하여 파장 450 ㎚ (대조 파장 540 ㎚) 의 흡광도를 측정하고, 450 ㎚ 로 측정한 흡광도로부터 540 ㎚ 로 측정한 흡광도를 뺀 보정 흡광도 (Delta) 를 해석에 사용하였다. 표준 혈청의 항 RBD 항체 농도 및 Delta 로부터, Nonlinear Regression : 4 Parameter 를 사용하여 검량선을 작성하였다. 검량선, 측정 시료의 희석 배율, 및 Delta 로부터 시료의 항 RBD 항체 농도를 산출하였다.
혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성 (도 7 및 도 8)
VeroE6 세포를 플레이트에 파종하고, 37 ± 2 ℃, 5 ± 1 ％ 의 CO2 농도 설정의 인큐베이터에서 하룻밤 배양하였다. 마우스 혈청의 희석 계열과 SARS-CoV-2 WA1/2020 주를 혼합하고, 37 ± 2 ℃, 5 ± 1 ％ 의 CO2 농도 설정의 인큐베이터 내에 2 ∼ 2.5 시간 정치시켰다. 그 후, 마우스 혈청과 SARS-CoV-2 WA1/2020 주의 혼합액을 VeroE6 세포에 첨가하고, 37 ± 2 ℃, 5 ± 1 ％ 의 CO2 농도 설정의 인큐베이터 내에서 72 ± 8 시간, 배양하였다. 그 후, CellTiter-Glo (Promega) 를 사용하여 생 세포량을 측정하고, 마우스 혈청의 항 SARS-CoV-2 중화 활성력가를 산출하였다.
RBD 특이적 세포성 면역 응답 (도 10)
비장 세포를 RPMI Complete 배지에서 1 × 107 세포/mL 로 조제하고, U 바닥 96 웰 플레이트에 파종하였다. RPMI Complete 배지에서 최종 농도 0.1 ％ (v/v) 가 되도록 조제한 RBD 의 MHC class II 에피토프 펩티드 풀을 비장 세포에 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 48 시간 배양하였다. 세포 배양 상청 중의 IFN-γ 및 IL-13 사이토카인량을 Mouse IFN-γ DuoSet ELISA 및 Mouse IL-13 Duoset ELISA 를 사용하여 측정하였다. 플레이트 리더를 사용하여 파장 450 ㎚ (대조 파장 540 ㎚) 의 흡광도를 측정하고, 450 ㎚ 의 흡광도로부터 540 ㎚ 에서 측정한 흡광도를 뺀 값을 해석에 사용하였다. 표준 용액의 사이토카인 농도 및 측정값으로부터 Nonlinear Regression : 4 Parameter 를 사용하여 검량선을 작성하고, 검량선으로부터 측정 시료의 사이토카인 농도를 산출하였다.
통계 해석
도 5 에 나타내는 혈중 항 RBD 항체 응답에 대해, 0.03 μg mRNA/body 및 0.3 μg mRNA/body 의 각 용량에 있어서의 2 군간 비교는, Wilcoxon 검정을 실시하였다. 3 μg mRNA/body 용량에 있어서의 3 군간의 비교에 대해서는, 실시예 8 을 비교 대조로 하여 Steel 검정을 실시하였다.
도 6 에 나타내는 혈중 항 RBD 항체 응답에 대해, 0.03 μg mRNA/body, 0.3 μg mRNA/body, 및 3 μg mRNA/body 의 각 용량에 있어서의 2 군간 비교는, Wilcoxon 검정을 실시하였다.
도 7 에 나타내는 혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성에 대해서는, Buffer 군을 비교 대조로 하여 Steel 검정을 실시하였다. 도 8 의 2 군간 비교에 대해서는, Wilcoxon 검정을 실시하였다.
도 9 에 나타내는 혈중 항 RBD 항체 응답에 대해, Buffer 군을 비교 대조로 하여 Steel 검정을 실시하였다.
도 10 에 나타내는 RBD 특이적 세포성 면역에 대해, Steel-Dwass 검정을 실시하였다.
모든 해석에는 SAS ver.9.2 를 사용하였다.
RBD-hACE2 결합 저해 활성 (도 28)
96 half 웰 플레이트에 항 His 태그 항체 (Wako Pure Chemical Industries, Cat# 017-23211) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치시킨 후, 세정액 (0.05 ％ Tween 20 함유 PBS) 으로 3 회 세정하였다. 블로킹 용액 (1 ％ BSA, 0.05 ％ Tween 20 함유 PBS) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치시킨 후, 세정액으로 3 회 세정하였다. 그 후, 블로킹 용액으로 조제한 0.2 μg/ml 의 재조합 RBD 단백질 (컨트롤 : Acro Biosystems, Cat# SPD-S52H6, Original : Sino Biological, Cat# 40592-V08H, K417N : Sino Biological, Cat# 40592-V08H59, E484K : ACRO Biosystems, Cat# SRD-C52H3, N501Y : Sino Biological, Cat# 40592-V08H82, K417N/E484K/N501Y : ACRO Biosystems, Cat# SPD-C52Hp) 용액을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치시킨 후, 세정액으로 3 회 세정하였다. 블로킹 용액으로 희석시킨 마우스 혈청 희석 계열을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치 후, 세정액으로 3 회 세정하였다. 블로킹 용액으로 조제한 1 μg/ml 의 재조합 hACE2 단백질 (Acro Biosystems, Cat#AC2-H5257) 용액을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치시킨 후, 세정액으로 3 회 세정하였다. 검출 항체는, HRP 표지 항인간 IgG1 항체 (CYGNUS TECHNOLOGIES, Cat#IM50) 를 블로킹 용액으로 500 배 희석시켜, 플레이트에 첨가 후, 실온에서 1 시간 정치시켰다. 세정액으로 3 회 세정한 후, TMB Microwell Peroxidase Substrate System (SERACARE Life Sciences, Cat#5120-0047) 을 첨가하고, 10 분간 정치시켰다. 반응 정지액에는, TMB Stop Solution (SERACARE Life Sciences, Cat#5150-0021) 을 사용하였다. 플레이트 리더를 사용하여 파장 450 ㎚ (대조 파장 540 ㎚) 의 흡광도를 측정하고, 450 ㎚ 에서 측정한 흡광도로부터 540 ㎚ 에서 측정한 흡광도를 뺀 보정 흡광도 (Delta) 를 해석에 사용하였다. 데이터는, 50 ％ 저해를 나타내는 마우스 희석 배율을 나타낸다 (IC50).
혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성 (도 29)
Vero-TMPRSS2 세포를 플레이트에 파종하였다. 원숭이 혈장의 희석 계열과 100TCID50 의 SARS-CoV-2 주 (D614G : HP095, B.1.1.7 계통주 : QHN001, P.1 계통주 : TY7-501, B.1.351 계통주 : TY8-612) 를 혼합하고, CO2 인큐베이터 내에 정치시켰다. 그 후, 원숭이 혈장과 SARS-CoV-2 의 혼합액을 Vero-TMPRSS2 세포에 첨가하고, CO2 인큐베이터 내에서 3 일간 배양하였다. 그 후, 세포 변성 효과 (CPE) 가 관찰되지 않게 되는 최고 희석 배율을 중화 항체가로서 산출하였다.
결과
실시예 4 의 RBD 단백질 발현 유도능
본 발명의 핵산 지질 입자 백신의 작용 기서는, 생체 내에 투여 후, 항원 유전자를 코드하는 mRNA 로부터 항원 단백질이 산생되어, 항원에 대한 특이적 면역 응답을 유도하는 것이 시사되어 있다. 본 발명의 핵산 지질 입자 백신의 약효는, 유효 성분인 mRNA 의 조직 및 세포 내로의 송달 및 mRNA 로부터의 번역이 중요한 요소가 된다고 상정된다. 이 일련의 요소를 포괄적으로 평가하는 것을 목적으로 하여, 배양 세포를 사용하여 항원 단백질의 발현 유도능을 지표로 하여 역가를 평가하였다. Expi293F 세포에 실시예 3 의 입자, 실시예 4 의 입자, 혹은 Buffer 를 첨가하고, 3 일 후의 배양 상청 중 및 세포 내에 발현한 RBD 단백질을 ELISA 법에 의해 정량하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다. 실시예 4 의 입자에 의해 발현한 RBD 단백질은 배양 상청 중 및 세포 내에 관찰되었다. 실시예 3 의 입자에 의해 발현한 S 전체 길이 단백질은 세포 내에만 관찰되었다.
혈중 항 RBD 항체 응답
실시예 3 또는 실시예 4 의 입자의 투여에 의해 유도되는 혈중 항 RBD 항체 응답을 평가하였다. 결과를 도 2 에 나타낸다. 실시예 3 의 2 회 투여군 및 3 회 투여군에 비해, 실시예 4 의 3 회 투여군은, 혈중 항 RBD 항체가가 높았다 (P = 0.0346). 또, Buffer 군에 비해, 실시예 4 의 2 회 투여군은, 혈중 항 RBD 항체가가 높았다 (실시예 4_3 ; P = 0.0019, 실시예 4_1 ; P = 0.0313).
RBD-hACE2 결합 저해 활성
실시예 3 또는 실시예 4 의 입자의 투여에 의해 유도되는 RBD-hACE2 결합 저해 활성을 평가하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다. 실시예 3 의 2 회 투여군 및 3 회 투여군에 비해, 실시예 4 의 3 회 투여군의 혈청은, RBD-hACE2 결합 저해 활성이 높았다 (P = 0.0005). 또, Buffer 군에 비해, 실시예 4 의 2 회 투여군의 혈청은, RBD-hACE2 결합 저해 활성이 높았다 (실시예 4_3 ; P < 0.0001, 실시예 4_1 ; P = 0.0006).
RBD 특이적 세포성 면역 응답
비장 세포를 조제하고, 배양 비장 세포로부터의 RBD 특이적인 세포성 면역 응답을 평가하였다. 결과를 도 4 에 나타낸다. S1/Quil-A 군에 비해, 실시예 4 군은, RBD 를 커버하는 Euro2 및 JPT-N 에피토프 펩티드 풀 처리에 대한 IFN-γ 산생 레벨이 높았다 (P < 0.001). 한편, S1/Quil-A 군에 비해, 실시예 4 군은, Euro2 및 JPT-N 에피토프 펩티드 풀 처리에 대한 IL-13 산생 레벨이 낮았다 (P < 0.005). 이 결과로부터, 본 발명의 핵산 지질 입자 백신은, Th1 형이 우위인 면역 응답을 유도하는 것을 알 수 있었다.
BALB/c 마우스에 있어서의 혈중 항 RBD 항체 응답
실시예 8 또는 실시예 4 의 입자의 투여에 의해 유도되는 혈중 항 RBD 항체 응답을 평가하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다. 0.03 μg mRNA/body 및 0.3 μg mRNA/body 의 각 용량에 있어서, 실시예 4 와 비교하여, 실시예 8 은 혈중 항 RBD 항체가가 높았다 (모두 P = 0.0286). 또, 3 μg mRNA/body 의 용량에 있어서, 실시예 4, 실시예 7, 및 실시예 8 의 혈중 항 RBD 항체가에 유의한 차는 관찰되지 않았다 (모두 P = 0.061).
실시예 10 또는 실시예 8 의 입자의 투여에 의해 유도되는 혈중 항 RBD 항체 응답을 평가하였다. 결과를 도 6 에 나타낸다. 어느 용량에 있어서도, 실시예 10 과 실시예 8 의 혈중 항 RBD 항체가에 유의한 차는 관찰되지 않았다 (0.03 μg mRNA/body : P = 0.8413, 0.3 μg mRNA/body : P = 0.0952, 3 μg mRNA/body : P = 0.6905).
혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성
실시예 10 의 입자의 투여에 의해 유도되는 혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성을 평가하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다. Buffer 군과 비교하여, 실시예 10 을 3 μg mRNA/body 를 투여한 군은 혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성이 높았다 (P = 0.0374). 또, 실시예 8 및 실시예 10 의 입자의 투여에 의해 유도되는 혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성을 비교한 결과, 유의한 차는 관찰되지 않았다 (도 8, P = 1).
C57BL/6 마우스에 있어서의 혈중 항 RBD 항체 응답
실시예 8 또는 실시예 10 의 입자의 투여에 의해 유도되는 혈중 항 RBD 항체 응답을 평가하였다. 결과를 도 9 에 나타낸다. 3 μg mRNA/body 및 10 μg mRNA/body 의 각 용량에 있어서, Buffer 군과 비교하여, 실시예 8 및 실시예 10 은 혈중 항 RBD 항체가가 높았다 (실시예 10 의 2 용량 모두 P < 0.05).
RBD 특이적 세포성 면역 응답
비장 세포를 조제하고, 배양 비장 세포로부터의 RBD 특이적인 세포성 면역 응답을 평가하였다. 결과를 도 10A 에 나타낸다. 0.1 μg/body 의 RBD 단백질에 100 μg/body 의 Alum 아쥬반트를 첨가한 군과 비교하여, 3 μg/body 의 실시예 10 을 투여한 군은 높은 IFN-γ 유도를 나타냈다 (P < 0.05). 또, 1.0 μg/body 의 RBD 단백질에 100 μg/body 의 알럼 아쥬반트를 첨가한 군과 비교하여, 0.03 μg/body 및 3 μg/body 의 실시예 10 을 투여한 군은 높은 IFN-γ 유도를 나타냈다 (모두 P < 0.05).
실시예 10 의 Th 세포 프로파일을 평가하기 위해, IFN-γ 레벨/IL-5 레벨비 및 IFN-γ 레벨/IL-13 레벨비를 해석하였다. 결과를 도 10B 에 나타낸다. Alum 아쥬반트 첨가 RBD 단백질군과 비교하여, 실시예 10 은 높은 IFN-γ 레벨/IL-13 레벨비를 나타냈다 (Alum 아쥬반트 첨가 RBD 단백질의 2 군에 대해, 실시예 10 의 3 군 모두 P < 0.05). 이 결과로부터, 본 발명의 핵산 지질 입자 백신은, Th1 형이 우위인 면역 응답을 유도하는 것을 알 수 있었다.
BALB/c 마우스에 있어서의 혈중 항 RBD 항체 응답 (도 25 - 도 27)
실시예 10, 12, 14, 16, 18, 또는 실시예 20 의 입자의 투여에 의해 유도되는 혈중 항 RBD 항체 응답을 평가하였다. 결과를 도 25 에 나타낸다. 모두 Buffer 군과 비교하여, 높은 혈중 항 RBD 항체 레벨을 나타냈다.
실시예 10 또는 실시예 21 - 30 의 입자의 투여에 의해 유도되는 혈중 항 RBD 항체 응답을 평가하였다. 결과를 도 26 에 나타낸다. 어느 입자에 있어서도, Buffer 군과 비교하여, 높은 혈중 항 RBD 항체가가 관찰되었다.
실시예 10, 32a, 32b, 32c, 32d, 32f, 또는 실시예 33 의 입자의 투여에 의해 유도되는 혈중 항 RBD 항체 응답을 평가하였다. 결과를 도 27 에 나타낸다. 실시예 32a 와 비교하여, 실시예 10, 32b, 32c, 32d, 32f, 및 실시예 33 은 높은 혈중 항 RBD 항체 레벨을 나타냈다.
RBD-hACE2 결합 저해 활성 (도 28)
실시예 10 의 입자에 의해 유도되는 RBD-hACE2 결합 저해 활성을 평가하였다. 결과를 도 28 에 나타낸다. 컨트롤 RBD 와 비교하여, Original 의 RBD, K417N, E484K, N501Y, 또는 K417N/E484K/N501Y 의 RBD 변이체와 hACE2 의 결합은, 실시예 10 군의 혈청에 의해 동일한 정도로 저해되었다.
혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성 (도 29)
실시예 10 의 입자에 의해 유도되는 혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성을 평가하였다. 결과를 도 29 에 나타낸다. D614G 주, B.1.1.7 계통주, P.1 계통주, 및 B.1.351 계통주의 Vero-TMPRSS2 세포에 대한 감염은, 실시예 10 군의 혈청에 의해 동일한 정도로 중화되었다.
[시험예 2]
SARS-CoV-2 RBD 를 코드하는 LNP-mRNA 백신 후보의 최적화
중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2) 에 의한 신형 코로나 바이러스 감염증 (COVID-19) 의 팬데믹이 발생하여, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 전체 길이를 코드하는 2 종류의 mRNA 백신이 출시되었다 (1,2). 그러나, 발열 등 부반응에 관해서 개선해야 할 점은 남아 있다.
우리는, SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 포함되는 수용체 결합 도메인 (RBD : receptor-binding domain) 을 코드하는 mRNA 를 지질 나노 입자 (LNP) 에 봉입한 mRNA 백신 후보 (LNP-mRNA-RBD) 에 대해, 면역원성을 지표로 하여 최적화를 실시하였다.
먼저, 6 ∼ 8 주령의 C57BL/6 마우스 또는 BALB/c 마우스에, 2 주 간격으로 2 회, mRNA 환산으로 3 μg 의 LNP-mRNA-RBD 를 근육내에 투여하여, 혈중 항 RBD 항체 반응을 평가하였다. 그 결과, C57BL/6 마우스와 비교하여, BALB/c 마우스는 높은 혈중 항 RBD 항체 반응을 나타냈다 (도 11a, 도 15). LNP-mRNA-RBD 에 의해 유도되는 RBD 특이적 B 세포 응답을 마우스 계통간에서 비교하기 위해, LNP-mRNA-RBD 투여 마우스의 슬와 림프절 (pLN) 에 있어서의 TFH 및 GC B 세포를 flow cytometry 에 의해 해석하였다 (도 16). 그 결과, 혈중 항 RBD 항체 응답과 상관하여, pLN 에 있어서의 TFH (CD4+CD185+PD-1+ 세포) 및 GC B 세포 (CD38-GL7+CD19+ 세포) 는, C57BL/6 마우스와 비교하여, LNP-mRNA-RBD 투여 BALB/c 마우스에서 높았다 (도 11b-e).
LNP-mRNA-RBD 에 의해 유도되는 항원 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 해석하기 위해, 스파이크 단백질의 펩티드 라이브러리를 설계하였다. 이 펩티드 라이브러리는, 10 아미노산이 중복되도록 설계된 20 아미노산의 펩티드, 128 개로 이루어진다. 이 펩티드 라이브러리를, 16 개의 펩티드를 1 개의 풀 펩티드로 하여, 합계 8 개의 풀 펩티드로 분할하였다 (도 11f). LNP-mRNA-RBD 투여 마우스로부터 조제한 비장 세포를 풀 펩티드 3 및 4 에서 처리한 결과, C57BL/6 마우스 비장 세포는 IFN-γ 산생을 유도하고, BALB/c 마우스 비장 세포는, 펩티드 풀 3 처리에서 IFN-γ 의 산생이 확인되었다 (도 11g 및 h, 도 17a 및 b). IL-13 은, C57BL/6 마우스 또는 BALB/c 마우스의 어느 비장 세포도 유도되지 않았다 (도 17c 및 d). LNP-mRNA-RBD 투여에 의해 유도되는 항원 특이적 T 세포를 해석하기 위해, 비장 세포를 풀 펩티드 2, 3, 또는 4 로 처리하고, 3 개의 사이토카인 (IL-2, IFN-γ, 및 TNF-α) 을 산생한 T 세포를 flow cytometry 로 해석하였다. 그 결과, 스파이크 항원 특이적 다기능성 CD8+ 및 CD4+ T 세포는, 풀 펩티드 3 및 4 로 처리한 BALB/c 마우스 비장 세포에 있어서 관찰되었다 (도 11h, 도 18b 및 19b). C57BL/6 마우스 비장 세포에서는, 다기능성 CD8+ T 세포 및 약한 CD4+ T 세포 응답을 나타냈다 (도 11g, 도 18a 및 19a). 이들 데이터로부터, C57BL/6 마우스와 비교하여, LNP-mRNA-RBD 를 투여한 BALB/c 마우스는 높은 B 세포 및 T 세포 응답을 유도할 가능성이 시사되었다.
핵산을 사용한 백신은, DNA 또는 RNA 가 내인성의 아쥬반트로서 작용하는 것이 보고되어 있다 (14 - 16). LNP-mRNA 백신에서는, mRNA 가 톨형 수용체 (toll-like receptor, TLR) 3, TLR7, TLR8, RIG-I, 또는 MDA5 에 의해 인식되고, 내인성 아쥬반트로서 작용하는 것이 보고되어 있다 (17). Kariko 들은, 메틸화 염기나 다른 수식 염기 (예를 들어, 슈도우리딘 등) 를, 자연 면역 활성화의 제어와 항원 단백질의 발현 효율의 개선에 사용하고 있다 (18, 19). 다른 연구에서는, LNP-mRNA 에 의해 유도되는 I 형 IFN 이, CD8+ T 세포 응답 및 항원 단백질의 발현 효율에 영향을 미치는 것이 분명해지고 있다 (20, 21, 22). SARS-CoV-2 백신에 관해서는, 스파이크의 전체 길이를 코드하고 있는 LNP-mRNA-Full 군과 비교하여, LNP-mRNA-RBD 군은 부반응의 빈도가 높았기 때문에, LNP-mRNA-Full 이 제 III 상 임상 시험에서 평가되고, 출시되었다 (13). 부반응의 빈도의 차이에 관한 이유는 불분명하지만, 우리는, LNP-mRNA 에 의한 자연 면역 부활 작용이 관여하고 있을 가능성이 있다고 생각하고 있다 (13).
LNP-mRNA 에 의한 자연 면역 부활 작용을 해석하기 위해, LNP-mRNA-RBD 를 처리한 인간 PBMC 로부터의 I 형 IFN 산생 레벨을 ELISA 로 측정하였다. 그 결과, 3 명의 정상인의 PBMC 에 있어서, LNP-mRNA-Full 과 비교하여, LNP-mRNA-RBD 는 높은 IFN-α 유도능을 나타냈다 (도 12a). 다음으로, C57BL/6 마우스 또는 BALB/c 마우스의 골수 유래 수상 세포 (BM-DCs) 를 사용하여, 동일한 실험을 실시하였다. 그 결과, BALB/c 마우스의 BM-DCs 와 비교하여, LNP-mRNA-full 또는 LNP-mRNA-RBD 로 처리한 C57BL/6 마우스의 BM-DCs 는 높은 IFN-α 산생을 나타냈다 (도 12b). LNP-mRNA 에 봉입되는 mRNA 의 제조 과정에서는, 협잡물로서의 RNA, 예를 들어 TLR3 리간드로서의 2 본쇄 RNA 등을 포함하고, 이것이 자연 면역을 활성화할 가능성이 나타나 있다 (22). 그래서, RNA 제조에서 기인하는 협잡물을 제외하기 위해, mRNA 를 HPLC 정제하고, HPLC 정제한 mRNA 를 봉입한 LNP-mRNA (mRNA-RBD(HPLC)) 를 제조하였다. 그 결과, LNP-mRNA-RBD 와 비교하여, mRNA-RBD(HPLC) 로 처리한 인간 PBMC 및 마우스 BM-DC 로부터의 I 형 IFN 산생은 현저하게 감소하였다 (도 12a 및 b).
C57BL/6 또는 BALB/c 마우스에 mRNA-RBD(HPLC) 를 투여하여, 면역원성을 평가하였다. 그 결과, mRNA-RBD(HPLC) 군은, BALB/c 마우스 및 C57BL/6 마우스의 양방에 있어서, 혈중 항 RBD IgG1 가, IgG2 가, 및 총 IgG 가를 증강시켰다 (도 12c 및 도 20a). 또, LNP-mRNA-RBD 군과 비교하여, mRNA-RBD(HPLC) 를 투여한 C57BL/6 마우스의 pLN 은, GC B 세포가 많이 유도되었다 (도 12d 및 e). 또한, LNP-mRNA-RBD 군과 비교하여, mRNA-RND(HPLC) 군에서는, RBD 특이적으로 IFN-γ 및 다른 I 형 사이토카인을 산생하는 다기능성 CD8+ 및 CD4+ T 세포가 많이 유도되었다 (도 12f-i, 및 도 20b-e, 21, 22).
비인간 영장류 (NHP) 인 필리핀원숭이 모델에 있어서, mRNA-RBD(HPLC) 백신의 SARS-CoV-2 에 대한 감염 방어 효과를 평가하였다. 본 연구에서는, 2 마리의 원숭이를 음성 대조군으로 하여, 4 마리의 원숭이에 mRNA-RBD(HPLC) 를 근육내 투여하였다. 그 결과, 음성 대조군과 비교하여, mRNA-RBD(HPLC) 군은 높은 항 RBD 항체 응답을 나타냈다 (도 13b). 또, mRNA-RBD(HPLC) 군은 혈중 항 SARS-CoV-2 중화 활성도 나타내었다 (도 13c). 또한, 음성 대조군과 비교하여, mRNA-RBD(HPLC) 군은, 결막, 비강, 구강, 기관, 직장의 점막 조직에 있어서의 높은 항 RBDIgG 응답을 나타냈다 (도 13d).
mRNA-RBD(HPLC) 군은, SARS-CoV-2 감염 후 1 일째, 스왑 중의 SARS-CoV-2 (도 14a) 와 바이러스 RNA (도 14b) 를 극적으로 저하시켰다. 또, 감염 후 7 일째에 있어서, mRNA-RBD(HPLC) 군은, 기관, 기관지, 폐의 바이러스 RNA 도 저하시켰다 (도 14c, 도 25). 또한, 음성 대조군은, SARS-CoV-2 감염 후의 발열과 폐렴을 나타냈다 (도 23, 24).
SARS-CoV-2 감염 후의 폐의 조직 해석을 실시한 결과, 음성 대조군에 있어서 림프구나 호중구의 침윤이 보이고, 폐포벽의 비후 (肥厚) 나 바이러스 항원도 확인되고, mRNA-RBD(HPLC) 군에서는 이러한 현상은 확인되지 않았다 (도 14d, 14e). 또, mRNA-RBD(HPLC) 군에서는, 기관지 수반 림프 조직 (bronchus-associated lymphoid tissue : BALT) 이 형성되어 있는 것을 확인하였다 (도 14d). 이러한 결과는, 비강 점막이나 기관 점막 등의 점막에 BLAT 의 형성을 통하여 유도된 항체가 SARS-CoV-2 에 결합함으로써 중화되고, 그 결과로서 감염 후 1 일째의 스왑 중의 바이러스 RNA 와 감염성 바이러스가 감소했을 가능성을 시사하고 있다.
재료와 방법
마우스
6 ∼ 8 주령의 C57BL/6 및 BALB/c 마우스를 일본의 CLEA 사로부터 구입하였다. 마우스는 특정한 병원체가 없는 조건하에서 사육하였다. 모든 마우스 시험은, 도쿄 대학 의과학 연구소 동물 실험 위원회의 승인을 얻었다.
필리핀원숭이
시가 의과 대학에서 태어나고, 필리핀, 베트남 및 중국을 원산으로 하는 7 ∼ 10 살의 암컷의 필리핀원숭이를 사용하였다. 모든 처치는 케타민 마취와 자일라진 마취하에서 실시되고, 고통을 최소한으로 억제하는 노력이 이루어졌다. CMK-2 (CLEA 재팬 주식회사, 도쿄, 일본) 의 푸드 펠릿을 마취로부터의 회복 후, 1 일 1 회 주고, 음료수는 자유 섭취로 하였다. 동물은, 광이 제어된 조건 (12 시간 명/12 시간 암 사이클, 오전 8 시에 점등) 하에서 케이지 내에 단두 (單頭) 수용하였다. 케타민/자일라진 마취하에서 결막 (0.05 mL × 2), 비강 (0.5 mL × 2), 구강 (0.9 mL) 및 기관 (5 mL) 에 피펫과 카테터로 SARS-CoV-2 (2 × 107 PFU/7 mL HBSS) 를 원숭이에 접종하였다. 케타민/자일라진 마취하에서, 2 개의 면봉 (에이켄 화학 주식회사, 도쿄, 일본) 을 사용하여, 결막, 비강, 구강 및 기관으로부터의 체액 샘플을 채취한 후, 0.1 ％ 소 혈청 알부민 (BSA) 과 항생 물질을 포함하는 둘베코 개변 이글 배지 (DMEM, 나칼라이 테스크, 교토, 일본) 의 1 mL 에 면봉을 침지시켰다. 기관지경 (MEV-2560 ; 마치다 내시경 주식회사, 도쿄도) 과 세포진용 브러시 (BC-203D-2006 ; 올림푸스 주식회사, 도쿄도) 를 사용하여 기관지 샘플을 채취하였다.
LNP-mRNA 백신
실시예 10 의 mRNA 봉입 핵산 지질 입자를 사용하였다.
시약
스파이크 단백질의 오버랩 20-aa 펩티드를 합성하고, Eurofins Genomics (Ebersberg, Germany) 로부터 구입하였다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (ECD) 및 RBD 는, GenScript (Piscataway, NJ, USA) 로부터 구입하였다.
바이러스
0.3 ％ 소 혈청 알부민 (BSA) 및 1 μg 의 L-1-토실아미드-2-페닐에틸클로로메틸케톤 (TPCK) 처리 트립신/mL 을 포함하는 Opti-MEM I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 중에서, 37 ℃ 에서 VeroE6 세포 중에서 SARS-CoV-2 단리주를 증식시켰다.
면역의 방법
6 ∼ 8 주령의 C57BL/6 및 BALB/c 마우스를, 0 일째 및 14 일째에, mock, LNP-mRNA-RBD (3 μg) 또는 LNP-mRNA-RBD(HPLC) (3 μg) 로 근육내 면역하였다. 2 회째의 면역화로부터 2 주일 후에, 슬와 림프절, 비장, 및 혈액을 채취하였다. 필리핀원숭이를, 0 일째 및 21 일째에, mock 또는 LNP-mRNA-RBD(HPLC) (100 μg) 로 근육내 면역하였다. 채혈은 0 일째, 7 일째, 14 일째, 21 일째, 28 일째에 실시하였다.
ELISA 법
ECD 및 RBD 특이적 항체가는 ELISA 로 측정하였다. 간단하게 설명하면, 하프 에어리어 96 웰 플레이트에 ECD (1 μg/mL) 또는 RBD (1 μg/mL) 를 중탄산 완충액 중에서 4 ℃ 에서 코팅하였다. 플레이트를 1 ％ BSA 를 포함하는 PBS 로 실온에서 60 분간 블로킹하였다. 플레이트를 PBST 로 3 회 세정하고, 희석시킨 혈장 또는 스왑 샘플을 120 분간 실온에서 인큐베이트하였다. 플레이트를 PBST 로 3 회 세정하고, HRP 표지 염소 항마우스 IgG, IgG1,IgG2a, IgG2c, 또는 마우스 항원숭이 IgG 와 실온에서 120 분간 인큐베이트하였다. PBST 로 3 회 세정한 후, TMB 기질 버퍼를 첨가하고, 실온에서 10 분간 인큐베이트하였다. 그 후, 1 N H2SO4 를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 분광 광도계를 사용하여, 450 ㎚ 및 540 또는 560 ㎚ 에 있어서의 OD 값을 측정하였다. OD450 - OD540 또는 OD450 - OD560 에서 0.2 가 되는 혈장 희석의 역수값을 항체가로 하였다.
면역화된 마우스의 비장 세포의 단세포 현탁액을, 펩티드 풀 1 ∼ 8, ECD, 및 RBD 단백질로 24 시간 자극하였다. 상청 중의 IFN-γ 및 IL-13 레벨을 ELISA (R & D) 로 측정하였다.
GC B 세포와 TFH 염색
슬와 림프절의 단세포 현탁액을, LIVE/DEAD Aqua, 항 CD279 (29F.1A12), 항 CD8a (53-6.7), 항 CD3e (145-2C11), 항 GL7 (GL7), 항 CD4 (RM4-5), 항 CD185 (L138D7), 항 CD38 (90), 및 항 CD19 (6D5) 항체로 염색하였다. 모든 항체는, BioLegend, San Diego, CA, USA 에서 구입하였다. GC B 세포 및 TFH 세포의 비율을 플로 사이토메트리로 분석하였다.
사이토카인의 세포 내 염색 어세이
비장 세포의 단세포 현탁액을, 단백질 수송 저해제 (eBioscience, San Diego, CA, USA) 와 함께 펩티드 풀 2, 3, 4 로 6 시간 자극하였다. 자극 후, 사세포를 LIVE/DEAD Aqua 로 염색하였다. 세정 후, 항 CD8a (53-6.7), 항 CD4 (RM4-5 : Invitrogen), 항 TCRβ (H57-597), 항 F4/80 (RM8), 항 TER-119 (TER-119), 항 CD11b (M1/70), 항 CD19 (6D5), 항 CD11c (N418), 항 NK-1.1 (PK136), 항 CD45R/B220 (RA3-6B2) 항체로 세포를 염색하였다. 모든 항체는, 특별히 기재가 없는 한, BioLegend 로부터 구입하였다. 고정 후, IC Fixation Buffer (eBioscience 사) 에 의한 투과성, 세포 내 사이토카인, CD3 을, 항 IFN-γ (XMG1.2), 항 IL-2 (JES6-5H4), 항 TNF-α (MP6-XT22), 항 CD3 (17A2) 항체로 염색하였다. 모든 항체는 BioLegend 로부터 구입하였다. 사이토카인 산생 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비율을 플로 사이토메트리에 의해 결정하였다.
인간 말초혈 단핵 세포의 조제 및 자극
말초혈 단핵 세포 (PBMC) 는, SARS-CoV-2 에 미감염된 3 명의 건강한 성인 볼런티어로부터 인폼드 컨센트를 얻어 입수하였다. 인간 PBMC 를 사용한 모든 실험은, 도쿄 대학 의과학 연구소의 윤리 심사 위원회의 승인을 얻었다. Ficoll Histopaque 를 사용하여 PBMC 를 조제한 후, LNP-mRNA-Full (0.4, 2, 10 μg/mL), LNP-mRNA-RBD (0.4, 2, 10 μg/mL), 또는 LNP-mRNA-RBD(HPLC) (0.4, 2, 10 μg/mL) 를 사용하여 24 시간 자극하고, 배양 상청 중의 IFN-α 레벨을 ELISA (Mabtech, 스톡홀름, 스웨덴) 를 사용하여 측정하였다.
골수 유래 수상 세포와 자극
골수 유래 수상 세포 (BM-DC) 를 마우스 GM-CSF 에서 7 일간 배양하여 분화시켰다. 세포를 LNP-mRNA-Full (0.4, 2, 10 μg/mL), LNP-mRNA-RBD (0.4, 2, 10 μg/mL), 또는 LNP-mRNA-RBD(HPLC) (0.4, 2, 10 μg/mL) 로 24 시간 자극하고, 배양 상청 중의 IFN-α 를 ELISA (Invitrogen) 를 사용하여 측정하였다.
중화 항체가
35 마이크로리터의 바이러스 (140 조직 배양 감염 용량 50) 를 35 μl 의 2 배 시리얼 희석의 혈청과 함께 실온에서 1 시간 인큐베이트하고, 그 혼합물 50 μL 를 96 웰 플레이트 중의 컨플루언트한 VeroE6/TMPRS2 세포에 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하였다. 5 ％ FCS 를 포함하는 DMEM 50 μL 를 첨가한 후, 세포를 추가로 37 ℃ 에서 3 일간 인큐베이트하였다. 바이러스 세포 병리 효과 (CPE) 를 도립 현미경하에서 관찰하고, 바이러스 중화력가를, CPE 를 완전히 방지한 최고 혈청 희석의 역수로서 결정하였다 (24).
SARS-CoV-2 에 대한 VeroE6/TMPRSS2 를 사용한 바이러스 적정
TMPRSS2 를 발현하는 컨플루언트한 Vero E6 세포주 (JCRB Cell Bank, 일본) 를 희석시킨 스왑 샘플과 10 ％ w/v 조직 호모지네이트 샘플로 1 시간 인큐베이트하였다. 세포를 HBSS 로 세정하고, 0.1 ％ BSA 를 포함하는 DMEM 으로 3 일간 인큐베이트하였다 (25). 바이러스 역가를 현미경으로 모니터하고, Reed-Muench 법을 사용하여 계산하였다.
바이러스 RNA 의 리얼타임 RT-PCR
스왑 샘플 및 조직 (20 mg) 으로부터의 바이러스 RNA 를, 각각 QIAmp 바이러스 RNA Mini kit 및 RNeasy Mini kit 를 사용하여 채취하였다. 바이러스 RNA 는, CFX-96 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 을 사용한 리얼타임 RT-PCR (2019-nCoV_N1-F, 2019-nCoV_N1-R, 2019-nCoV_N1-P, TaqMan Fast Virus 1-step Master Mix) 에 의해 측정하였다.
체온
바이러스 접종의 2 주일 전에, 2 대의 체온 데이터 로거 (iButton, Maxim Integrated, 새너제이, 캘리포니아주) 를, 케타민/자일라진 마취하에서 각 원숭이의 복막강 또는 피하 조직에 이식하고, 그 후 이소플루란을 흡입하여 체온을 모니터하였다.
X-ray
폐의 X 선 사진을 I-PACS 시스템 (코니카 미놀타) 과 PX-20BT (켄코·토키나) 에 의해 촬영하였다.
참고 문헌
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.
본 발명은 SARS-CoV-2 에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에 이용할 수 있다.
서열표 프리텍스트
＜서열 번호 1＞ (SARS-CoV-2 S full 을 포함하는 DNA 단편)
Figure pct00020
Figure pct00021
＜서열 번호 2＞ (센스 프라이머)
Figure pct00022
＜서열 번호 3＞ (안티센스 프라이머)
Figure pct00023
＜서열 번호 4＞ (SARS-CoV-2 S-full 의 주형 DNA)
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR (전사 개시점 및 염기 번호 89 ∼ 94 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 전체 길이 서열 : 염기 번호 89 ∼ 3910
3'-UTR : 염기 번호 3911 ∼ 4042
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 4043 ∼ 4142
＜서열 번호 5＞ (SARS-CoV-2 S-full mRNA-001)
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
＜서열 번호 6＞ (SARS-CoV-2 S-full 의 아미노산 서열)
Figure pct00030
RBD 서열 : 아미노산 번호 319 ∼ 541
＜서열 번호 7＞ (SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편)
Figure pct00031
＜서열 번호 8＞ (SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA)
Figure pct00032
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR (전사 개시점 및 염기 번호 89 ∼ 94 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 9＞ (SARS-CoV-2 RBD mRNA-002)
Figure pct00033
＜서열 번호 10＞ (SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함한다))
Figure pct00034
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 11＞ (SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다))
Figure pct00035
＜서열 번호 12＞ (S_opt2 EcoRI)
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
NheI 서열 : 염기 번호 1 ∼ 6
T7 프로모터 : 염기 번호 7 ∼ 24
A : 전사 개시점 : 염기 번호 25
5'-UTR (전사 개시점 및 염기 번호 89 ∼ 94 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 25 ∼ 94
Spike 단백질 전체 길이 서열 : 염기 번호 95 ∼ 3916
3'-UTR : 염기 번호 3917 ∼ 4048
EcoRI 서열 : 염기 번호 4049 ∼ 4054
＜서열 번호 13＞ (센스 프라이머 2)
Figure pct00039
NheI 서열 : 염기 번호 5 ∼ 10
＜서열 번호 14＞ (안티센스 프라이머 2)
Figure pct00040
HindIII 서열 : 염기 번호 5 ∼ 10
BspQI 서열 : 염기 번호 11 ∼ 17
＜서열 번호 15＞ (SARS-CoV-2 S full optimized 의 주형 DNA)
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
NheI 서열 : 염기 번호 5 ∼ 10
T7 프로모터 : 염기 번호 11 ∼ 28
A : 전사 개시점 : 염기 번호 29
5'-UTR (전사 개시점 및 염기 번호 89 ∼ 94 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 29 ∼ 98 Spike 단백질 전체 길이 서열 : 염기 번호 99 ∼ 3920
3'-UTR : 염기 번호 3921 ∼ 4052
polyA 서열 (A110) : 염기 번호 4053 ∼ 4162
BspQI 서열 : 염기 번호 4164 ∼ 4170
HindIII 서열 : 염기 번호 4171 ∼ 4176
＜서열 번호 16＞ (SARS-CoV-2 S full optimized mRNA-003)
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
＜서열 번호 17＞ (S_RBD_opt2 EcoRI)
Figure pct00047
NheI 서열 : 염기 번호 1 ∼ 6
T7 프로모터 : 염기 번호 7 ∼ 24
A : 전사 개시점 : 염기 번호 25
5'-UTR (전사 개시점 및 염기 번호 89 ∼ 94 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 25 ∼ 94
RBD 서열 : 염기 번호 95 ∼ 805
3'-UTR : 염기 번호 806 ∼ 937
EcoRI 서열 : 염기 번호 938 ∼ 943
＜서열 번호 18＞ (SARS-CoV-2 RBD optimized 의 주형 DNA)
Figure pct00048
NheI 서열 : 염기 번호 5 ∼ 10
T7 프로모터 : 염기 번호 11 ∼ 28
A : 전사 개시점 : 염기 번호 29
5'-UTR (전사 개시점 및 염기 번호 89 ∼ 94 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 29 ∼ 98
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 99 ∼ 137
RBD 서열 : 염기 번호 138 ∼ 809
3'-UTR : 염기 번호 810 ∼ 941
polyA 서열 (A110) : 염기 번호 942 ∼ 1051
BspQI 서열 : 염기 번호 1053 ∼ 1059
HindIII 서열 : 염기 번호 1060 ∼ 1065
＜서열 번호 19＞ (SARS-CoV-2 RBD optimized mRNA-004)
Figure pct00049
＜서열 번호 20＞ SARS-CoV-2 RBD S2000 의 주형 DNA
Figure pct00050
NheI 서열 : 염기 번호 1 ∼ 6
T7 프로모터 : 염기 번호 7 ∼ 24
A : 전사 개시점 : 염기 번호 25
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 89 ∼ 94 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 25 ∼ 94
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 95 ∼ 133
RBD 서열 : 염기 번호 134 ∼ 805
3'-UTR : 염기 번호 806 ∼ 937
polyA 서열 (A50) : 염기 번호 938 ∼ 987
BspQI 서열 : 염기 번호 989 ∼ 995
＜서열 번호 21＞ SARS-CoV-2 RBD S2000 의 mRNA 서열
Figure pct00051
＜서열 번호 22＞ SARS-CoV-2 RBD S2001 의 주형 DNA
Figure pct00052
NheI 서열 : 염기 번호 1 ∼ 6
T7 프로모터 : 염기 번호 7 ∼ 24
A : 전사 개시점 : 염기 번호 25
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 89 ∼ 94 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 25 ∼ 94
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 95 ∼ 133
RBD 서열 : 염기 번호 134 ∼ 805
3'-UTR : 염기 번호 806 ∼ 937
polyA 서열 (A50) : 염기 번호 938 ∼ 987
BspQI 서열 : 염기 번호 989 ∼ 995
＜서열 번호 23＞ SARS-CoV-2 RBD S2001 의 mRNA 서열
Figure pct00053
＜서열 번호 24＞ SARS-CoV-2 RBD S2001 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함한다.)
Figure pct00054
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 25＞ SARS-CoV-2 RBD S2001 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다.)
Figure pct00055
＜서열 번호 26＞ SARS-CoV-2 RBD S2002 의 주형 DNA
Figure pct00056
NheI 서열 : 염기 번호 1 ∼ 6
T7 프로모터 : 염기 번호 7 ∼ 24
A : 전사 개시점 : 염기 번호 25
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 89 ∼ 94 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 25 ∼ 94
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 95 ∼ 133
RBD 서열 : 염기 번호 134 ∼ 736
3'-UTR : 염기 번호 737 ∼ 868
polyA 서열 (A50) : 염기 번호 869 ∼ 918
BspQI 서열 : 염기 번호 920 ∼ 926
＜서열 번호 27＞ SARS-CoV-2 RBD S2002 의 mRNA 서열
Figure pct00057
＜서열 번호 28＞ SARS-CoV-2 RBD S2002 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함한다.)
Figure pct00058
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 213
＜서열 번호 29＞ SARS-CoV-2 RBD S2002 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다.)
Figure pct00059
＜서열 번호 30＞ SARS-CoV-2 RBD S2003 의 주형 DNA
Figure pct00060
NheI 서열 : 염기 번호 1 ∼ 6
T7 프로모터 : 염기 번호 7 ∼ 24
A : 전사 개시점 : 염기 번호 25
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 89 ∼ 94 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 25 ∼ 94
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 95 ∼ 133
RBD 서열 : 염기 번호 134 ∼ 874
3'-UTR : 염기 번호 875 ∼ 1006
polyA 서열 (A50) : 염기 번호 1007 ∼ 1056
BspQI 서열 : 염기 번호 1058 ∼ 1064
＜서열 번호 31＞ SARS-CoV-2 RBD S2003 의 mRNA 서열
Figure pct00061
＜서열 번호 32＞ SARS-CoV-2 RBD S2003 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함한다.)
Figure pct00062
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 259
＜서열 번호 33＞ SARS-CoV-2 RBD S2003 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다.)
Figure pct00063
＜서열 번호 34＞ SARS-CoV-2 RBD S2004 의 주형 DNA
Figure pct00064
NheI 서열 : 염기 번호 1 ∼ 6
T7 프로모터 : 염기 번호 7 ∼ 24
A : 전사 개시점 : 염기 번호 25
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 89 ∼ 94 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 25 ∼ 94
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 95 ∼ 133
RBD 서열 : 염기 번호 134 ∼ 805
3'-UTR : 염기 번호 806 ∼ 937
polyA 서열 (A50) : 염기 번호 938 ∼ 987
BspQI 서열 : 염기 번호 989 ∼ 995
＜서열 번호 35＞ SARS-CoV-2 RBD S2004 의 mRNA 서열
Figure pct00065
＜서열 번호 36＞ SARS-CoV-2 RBD S2004 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함한다.)
Figure pct00066
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 37＞ SARS-CoV-2 RBD S2004 의 아미노산 서열 (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다.)
Figure pct00067
＜서열 번호 38＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (남아프리카형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00068
＜서열 번호 39＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (영국형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00069
＜서열 번호 40＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (브라질형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00070
＜서열 번호 41＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (캘리포니아형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00071
＜서열 번호 42＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (인도형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00072
＜서열 번호 43＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (남아프리카 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00073
＜서열 번호 44＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (영국 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00074
＜서열 번호 45＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (브라질 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00075
＜서열 번호 46＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (캘리포니아 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00076
＜서열 번호 47＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (인도 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00077
＜서열 번호 48＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (조합 변이형 (1)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00078
＜서열 번호 49＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (조합 변이형 (2)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00079
＜서열 번호 50＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (조합 변이형 (3)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00080
＜서열 번호 51＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 를 포함하는 DNA 단편 (조합 변이형 (4)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00081
＜서열 번호 52＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (남아프리카형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00082
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 53＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (영국형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00083
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 54＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (브라질형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00084
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 55＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (캘리포니아형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00085
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 56＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (인도형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00086
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 57＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (남아프리카 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00087
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 58＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (영국 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00088
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 59＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (브라질 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00089
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 60＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (캘리포니아 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00090
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 61＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (인도 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00091
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 62＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (조합 변이형 (1)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00092
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 63＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (조합 변이형 (2)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00093
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 64＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (조합 변이형 (3)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00094
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 65 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 주형 DNA (조합 변이형 (4)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00095
T7 프로모터 : 염기 번호 1 ∼ 18
A : 전사 개시점 : 염기 번호 19
5'-UTR 서열 (전사 개시점 및 염기 번호 83 ∼ 88 의 KOZAK 서열을 포함한다) : 염기 번호 19 ∼ 88
Spike 단백질 시그널 서열 : 염기 번호 89 ∼ 127
RBD 서열 : 염기 번호 128 ∼ 799
3'-UTR : 염기 번호 800 ∼ 931
polyA 서열 (A100) : 염기 번호 932 ∼ 1031
＜서열 번호 66＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (남아프리카형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00096
＜서열 번호 67＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (영국형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00097
＜서열 번호 68＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (브라질형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00098
＜서열 번호 69＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (캘리포니아형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00099
＜서열 번호 70＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (인도형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00100
＜서열 번호 71＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (남아프리카 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00101
＜서열 번호 72＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (영국 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00102
＜서열 번호 73＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (브라질 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00103
＜서열 번호 74＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (캘리포니아 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00104
＜서열 번호 75＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (인도 C538S 형) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00105
＜서열 번호 76＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (조합 변이형 (1)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00106
＜서열 번호 77＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (조합 변이형 (2)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00107
＜서열 번호 78＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (조합 변이형 (3)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00108
＜서열 번호 79＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD mRNA (조합 변이형 (4)) (변이 코돈을 밑줄, 변이 부위를 굵은 글씨로 나타낸다.)
Figure pct00109
＜서열 번호 80＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (남아프리카형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00110
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 81＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (영국형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00111
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 82＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (브라질형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00112
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 83＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (캘리포니아형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00113
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 84＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (인도형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00114
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 85＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (남아프리카 C538S 형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00115
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 86＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (영국 C538S 형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00116
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 87＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (브라질 C538S 형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00117
＜서열 번호 88＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (캘리포니아 C538S 형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00118
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 89＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (인도 C538S 형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00119
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 90＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (조합 변이형 (1)) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00120
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 91＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (조합 변이형 (2)) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00121
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 92＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (조합 변이형 (3)) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00122
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 93＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (조합 변이형 (4)) (S 단백질 시그널 서열을 포함하는, 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00123
S 단백질 시그널 서열 : 아미노산 번호 1 ∼ 13
RBD 서열 : 아미노산 번호 14 ∼ 236
＜서열 번호 94＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (남아프리카형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00124
＜서열 번호 95＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (영국형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00125
＜서열 번호 96＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (브라질형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00126
＜서열 번호 97＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (캘리포니아형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00127
＜서열 번호 98＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (인도형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00128
＜서열 번호 99＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (남아프리카 C538S 형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00129
＜서열 번호 100＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (영국 C538S 형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00130
＜서열 번호 101＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (브라질 C538S 형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00131
＜서열 번호 102＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (캘리포니아 C538S 형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00132
＜서열 번호 103＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (인도 C538S 형) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00133
＜서열 번호 104＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (조합 변이형 (1)) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00134
＜서열 번호 105＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (조합 변이형 (2)) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00135
＜서열 번호 106＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (조합 변이형 (3)) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00136
＜서열 번호 107＞ 변이형 SARS-CoV-2 RBD 의 아미노산 서열 (조합 변이형 (4)) (S 단백질 시그널 서열을 포함하지 않는다. 변이 아미노산을 밑줄로 나타낸다.)
Figure pct00137
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED The University of Tokyo <120> Nucleic acid lipid particle vaccine in which SARA-CoV-2 mRNA is encapusulated <130> FP-298PCT <150> JP2020-101420 <151> 2020-06-11 <150> JP2021-33278 <151> 2021-03-03 <160> 107 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4042 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA insert <400> 1 gtaatacgac tcactataag gagacccaag ctacatttgc ttctgacaca actgtgttca 60 ctagcaacct caaacagaca ccgccaccat gtttgttttt cttgttttat tgccactagt 120 ctctagtcag tgtgttaatc ttacaaccag aactcaatta ccccctgcat acactaattc 180 tttcacacgt ggtgtttatt accctgacaa agttttcaga tcctcagttt tacattcaac 240 tcaggacttg ttcttacctt tcttttccaa tgttacttgg ttccatgcta tacatgtctc 300 tgggaccaat ggtactaaga ggtttgataa ccctgtccta ccatttaatg atggtgttta 360 ttttgcttcc actgagaagt ctaacataat aagaggctgg atttttggta ctactttaga 420 ttcgaagacc cagtccctac ttattgttaa taacgctact aatgttgtta ttaaagtctg 480 tgaatttcaa ttttgtaatg atccattttt gggtgtttat taccacaaaa acaacaaaag 540 ttggatggaa agtgagttca gagtttattc tagtgcgaat aattgcactt ttgaatatgt 600 ctctcagcct tttcttatgg accttgaagg aaaacagggt aatttcaaaa atcttaggga 660 atttgtgttt aagaatattg atggttattt taaaatatat tctaagcaca cgcctattaa 720 tttagtgcgt gatctccctc agggtttttc ggctttagaa ccattggtag atttgccaat 780 aggtattaac atcactaggt ttcaaacttt acttgcttta catagaagtt atttgactcc 840 tggtgattct tcttcaggtt ggacagctgg tgctgcagct tattatgtgg gttatcttca 900 acctaggact tttctattaa aatataatga aaatggaacc attacagatg ctgtagactg 960 tgcacttgac cctctctcag aaacaaagtg tacgttgaaa tccttcactg tagaaaaagg 1020 aatctatcaa acttctaact ttagagtcca accaacagaa tctattgtta gatttcctaa 1080 tattacaaac ttgtgccctt ttggtgaagt ttttaacgcc accagatttg catctgttta 1140 tgcttggaac aggaagagaa tcagcaactg tgttgctgat tattctgtcc tatataattc 1200 cgcatcattt tccactttta agtgttatgg agtgtctcct actaaattaa atgatctctg 1260 ctttactaat gtctatgcag attcatttgt aattagaggt gatgaagtca gacaaatcgc 1320 tccagggcaa actggaaaga ttgctgatta taattataaa ttaccagatg attttacagg 1380 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tattgccata cccacaaatt ttactattag tgttaccaca gaaattctac cagtgtctat 2280 gaccaagaca tcagtagatt gtacaatgta catttgtggt gattcaactg aatgcagcaa 2340 tcttttgttg caatatggca gtttttgtac acaattaaac cgtgctttaa ctggaatagc 2400 tgttgaacaa gacaaaaaca cccaagaagt ttttgcacaa gtcaaacaaa tttacaaaac 2460 accaccaatt aaagattttg gtggttttaa tttttcacaa atattaccag atccatcaaa 2520 accaagcaag aggtcattta ttgaagatct acttttcaac aaagtgacac ttgcagatgc 2580 tggcttcatc aaacaatatg gtgattgcct tggtgatatt gctgctagag acctcatttg 2640 tgcacaaaag tttaacggcc ttactgtttt gccacctttg ctcacagatg aaatgattgc 2700 tcaatacact tctgcactgt tagcgggtac aatcacttct ggttggacct ttggtgcagg 2760 tgctgcatta caaataccat ttgctatgca aatggcttat aggtttaatg gtattggagt 2820 tacacagaat gttctctatg agaaccaaaa attgattgcc aaccaattta atagtgctat 2880 tggcaaaatt caagactcac tttcttccac agcaagtgca cttggaaaac ttcaagatgt 2940 ggtcaaccaa aatgcacaag ctttaaacac gcttgttaaa caacttagct ccaattttgg 3000 tgcaatttca agtgttttaa atgatatcct ttcacgtctt gacaaagttg aggctgaagt 3060 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Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Arg Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe 210 215 220 <210> 107 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 variant RBD (Combination variant 4) <400> 107 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Ser Asn Cys Tyr Leu Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe 210 215 220

Claims (52)

  1. 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 발현시킬 수 있는 핵산을 봉입한 지질 입자로서, 지질이 일반식 (Ia) 로 나타내는 카티온성 지질, 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 상기 입자.
    Figure pct00138

    식 중,
    R1 및 R2 는, 독립적으로, C1 - C3 알킬기를 나타내고 ;
    L1 은, C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C17 - C19 알케닐기를 나타내고 ;
    L2 는, C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알킬기, 또는 C2 - C4 알카노일옥시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알케닐기를 나타내고 ;
    p 는, 3 또는 4 이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 R1 및 R2 가 모두 메틸기인, 입자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 p 가 3 인 입자.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 L1 이, 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C17 - C19 알케닐기인, 입자.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 L2 가, 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C19 알케닐기인, 입자.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 L2 가, 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C10 - C12 알킬기, 또는 아세톡시기를 1 혹은 복수개 가지고 있어도 되는 C17 - C19 알케닐기인, 입자.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 L1 이, (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기, cis-8-헵타데세닐기, 또는 (8Z,11Z)-헵타데카디에닐기인 입자.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 (Ia) 중의 L2 가, 데실기, cis-7-데세닐기, 도데실기, 또는 (R)-11-아세틸옥시-cis-8-헵타데세닐기인, 입자.
  9. 제 1 항에 있어서,
    카티온성 지질이 하기의 구조식 :
    Figure pct00139

    으로 나타내는 입자.
  10. 제 1 항에 있어서,
    카티온성 지질이 하기의 구조식 :
    Figure pct00140

    으로 나타내는 입자.
  11. 제 1 항에 있어서,
    카티온성 지질이 하기의 구조식 :
    Figure pct00141

    으로 나타내는 입자.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    지질이, 추가로, 양친매성 지질, 스테롤류 및 PEG 지질을 포함하는 입자.
  13. 제 12 항에 있어서,
    양친매성 지질이, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 입자.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    스테롤류가 콜레스테롤인 입자.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG 지질이, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및/또는 N-[메톡시 폴리(에틸렌글리콜)2000]카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민인 입자.
  16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 15 ％ 이하, 스테롤류가 20 ∼ 55 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 65 ％, PEG 지질이 1 ∼ 5 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 15 ∼ 30 인 입자.
  17. 제 16 항에 있어서,
    양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 5 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 50 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 55 ％, PEG 지질이 1 ∼ 3 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 15 ∼ 25 인 입자.
  18. 제 17 항에 있어서,
    양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 40 ∼ 50 ％, PEG 지질이 1 ∼ 2 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 17.5 ∼ 22.5 인 입자.
  19. 제 18 항에 있어서,
    양친매성 지질, 스테롤류, 카티온성 지질, 및 PEG 지질의 지질 조성이, 몰량으로, 양친매성 지질이 10 ∼ 15 ％, 스테롤류가 35 ∼ 45 ％, 카티온성 지질이 45 ∼ 50 ％, PEG 지질이 1.5 ∼ 2 ％ 이고, 핵산 중량에 대한 총 지질 중량의 비율이 17.5 ∼ 22.5 인 입자.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편이, 수용체 결합 도메인을 포함하는 입자.
  21. 제 20 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편 중의 수용체 결합 도메인이 서열 번호 11 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
  22. 제 20 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편 중의 수용체 결합 도메인이 서열 번호 25, 29, 33, 37, 94 ∼ 107 중 어느 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
  23. 제 20 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편이, 서열 번호 10 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
  24. 제 20 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편이, 서열 번호 24, 28, 32, 36, 80 ∼ 93 중 어느 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
  25. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질이 서열 번호 6 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
  26. 제 25 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인이 서열 번호 11 의 아미노산 서열과 적어도 95 ％ 의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산이, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), S 단백질의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 꼬리부 (polyA) 를 포함하는 mRNA 인 입자.
  28. 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편을 발현시킬 수 있는 핵산이, 캡 구조 (Cap), 5' 비번역 영역 (5'-UTR), 리더 서열 (leader sequence), S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역, 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리 A 꼬리부 (polyA) 를 포함하는 mRNA 인 입자.
  29. 제 27 항에 있어서,
    S 단백질의 번역 영역의 서열이, 서열 번호 5 의 서열에 있어서의 S 단백질의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 입자.
  30. 제 27 항에 있어서,
    S 단백질의 번역 영역의 서열이, 서열 번호 16 의 서열에 있어서의 S 단백질의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 입자.
  31. 제 27 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산이, 서열 번호 5 의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 입자.
  32. 제 27 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산이, 서열 번호 16 의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 입자.
  33. 제 27 항에 있어서,
    S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열이, 서열 번호 9 의 서열에 있어서의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 입자.
  34. 제 27 항에 있어서,
    S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열이, 서열 번호 19 의 서열에 있어서의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 입자.
  35. 제 27 항에 있어서,
    S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열이, 서열 번호 21, 23, 27, 31, 35, 66 ∼ 79 중 어느 서열에 있어서의 S 단백질 중의 수용체 결합 도메인의 번역 영역의 서열과 적어도 90 ％ 의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 입자.
  36. 제 28 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편을 발현시킬 수 있는 핵산이, 서열 번호 9 의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 입자.
  37. 제 28 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질의 단편을 발현시킬 수 있는 핵산이, 서열 번호 19 의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 입자.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산이 적어도 1 개의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 입자.
  39. 제 38 항에 있어서,
    수식 뉴클레오티드가, 5 위치가 치환된 피리미딘뉴클레오티드 및/또는 1 위치가 치환되어 있어도 되는 슈도우리딘의 적어도 1 개를 포함하는 입자.
  40. 제 38 항에 있어서,
    수식 뉴클레오티드가, 5-메틸시티딘, 5-메톡시우리딘, 5-메틸우리딘, 슈도우리딘, 및 1-알킬슈도우리딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 포함하는 입자.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    입자의 평균 입자경이 30 ㎚ ∼ 300 ㎚ 인 입자.
  42. 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물을 제조하기 위한 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 기재된 입자의 사용.
  43. 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 기재된 입자를 함유하는, 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 in vivo 또는 in vitro 에서 발현시키기 위한 조성물.
  45. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서,
    의약으로서 사용되는 조성물.
  46. 제 45 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물.
  47. 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서,
    신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물.
  48. 제 43 항 또는 제 44 항에 기재된 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 in vitro 에서 발현시키는 방법.
  49. 제 43 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 의 S 단백질 및/또는 그 단편을 in vivo 에서 발현시키는 방법.
  50. 제 45 항 또는 제 46 항에 기재된 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  51. 제 45 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 신형 코로나 바이러스 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 : SARS-CoV-2) 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법.
  52. 제 49 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유 동물이 인간인 방법.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202119115D0 (en) * 2021-12-30 2022-02-16 Fondo Ricerca Medica S R I Vaccine
WO2023130089A1 (en) * 2021-12-31 2023-07-06 Boost Biopharma, Inc. Recombinant polypeptides containing at least one immunogenic fragment and antibody fc region and uses thereof

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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JP2020101420A (ja) 2018-12-21 2020-07-02 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 透過度検知装置
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Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell 181 : 1 2020
J Immunol 181 : 5490 2008
Nat Commun 11 : 2251 2020
Nat Med 26 : 1033 2020
Nat Rev Immunol 20 : 347 2020
Nature 583 : 290 2020
PLoS One 7 : e35421 2012
PNAS 117 : 8218 2020
Science 367 : 1260 2020
Vaccine 25 : 2832 2007
Virol J 7 : 299 2010
Virology 334 : 74 2005
Viruses 12 : 372 2020
Viruses 12 : 428 2020

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