TW202313102A - Htlv-1核酸脂質粒子疫苗 - Google Patents
Htlv-1核酸脂質粒子疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202313102A TW202313102A TW111118482A TW111118482A TW202313102A TW 202313102 A TW202313102 A TW 202313102A TW 111118482 A TW111118482 A TW 111118482A TW 111118482 A TW111118482 A TW 111118482A TW 202313102 A TW202313102 A TW 202313102A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- htlv
- particle
- lipids
- lipid
- antigen
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 195
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 title claims abstract description 176
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- -1 nucleic acid lipid Chemical class 0.000 title claims abstract description 53
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 217
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 121
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 121
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 118
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 44
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 10
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 110
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 91
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 72
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 66
- 229920001223 polyethylene glycol Chemical class 0.000 claims description 65
- 229930182558 Sterol Chemical class 0.000 claims description 54
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 claims description 54
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 claims description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 51
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 50
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 46
- 125000002091 cationic group Chemical class 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 34
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 24
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 16
- 125000003668 acetyloxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)O[*] 0.000 claims description 15
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 claims description 14
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 14
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 12
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 11
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 11
- 208000006961 tropical spastic paraparesis Diseases 0.000 claims description 11
- 206010001413 Adult T-cell lymphoma/leukaemia Diseases 0.000 claims description 10
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 10
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 claims description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 claims description 8
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 claims description 8
- JFBCSFJKETUREV-LJAQVGFWSA-N 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC JFBCSFJKETUREV-LJAQVGFWSA-N 0.000 claims description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 7
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 claims description 7
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 claims description 6
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 claims description 6
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical class O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 claims description 6
- UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 1-methylpseudouridine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 0.000 claims description 5
- UVBYMVOUBXYSFV-UHFFFAOYSA-N 1-methylpseudouridine Natural products O=C1NC(=O)N(C)C=C1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101710189104 Fibritin Proteins 0.000 claims description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 4
- ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 5-methoxyuridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(OC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 0.000 claims description 3
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- 206010028570 Myelopathy Diseases 0.000 claims 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000004423 acyloxy group Chemical group 0.000 abstract 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 91
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 49
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 48
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 47
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 47
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 39
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 30
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 29
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 15
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 14
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 13
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 11
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 11
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 10
- PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N CTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N 0.000 description 10
- PCDQPRRSZKQHHS-UHFFFAOYSA-N Cytidine 5'-triphosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 9
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 9
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 9
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 9
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 9
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 9
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 8
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 7
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 101150077194 CAP1 gene Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N acetoacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(O)=O WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 5
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 5
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 5
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 5
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 4
- 101100438378 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) fac-1 gene Proteins 0.000 description 4
- OLRONOIBERDKRE-XUTVFYLZSA-N [[(2r,3s,4r,5s)-3,4-dihydroxy-5-(1-methyl-2,4-dioxopyrimidin-5-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OLRONOIBERDKRE-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical group NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YEPAFLHOTODYGA-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyl hydrogen carbonate Chemical compound CN(C)CCCOC(O)=O YEPAFLHOTODYGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 238000011735 C3H mouse Methods 0.000 description 3
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010038751 tax Gene Products Proteins 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 101800001779 2'-O-methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 101100245221 Mus musculus Prss8 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical group 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N uridine-triphosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVVJCLFLKMGEIY-UHFFFAOYSA-N 2,3-dioctadecoxypropyl 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OCCCCCCCCCCCCCCCCCC HVVJCLFLKMGEIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AMMRPAYSYYGRKP-BGZDPUMWSA-N 5-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1-ethylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)N(CC)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 AMMRPAYSYYGRKP-BGZDPUMWSA-N 0.000 description 1
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical group C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101150014715 CAP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 229940022962 COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 206010013710 Drug interaction Diseases 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100326803 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) fac-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241001662443 Phemeranthus parviflorus Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 101710132632 Protein C4 Proteins 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710087759 Sliding-clamp-loader small subunit Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000000719 anti-leukaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 238000003682 fluorination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 1
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001114 myogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229940056211 paraffin Drugs 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M potassium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 229940099259 vaseline Drugs 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
- A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/14011—Deltaretrovirus, e.g. bovine leukeamia virus
- C12N2740/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
Abstract
用以預防及/或治療人類T細胞白血病病毒1型(Human T-cell Leukemia Virus type 1:HTLV-1)所導致的感染之疫苗的提供。
一種粒子,係封入有可使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原表現之核酸的脂質粒子,其中脂質包含通式(Ia)所表示的陽離子性脂質、或其藥學上所容許之鹽。
式中,
R
1及R
2獨立地表示C
1-C
3烷基;
L
1表示可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基(alkanoyloxy)之C
17-C
19烯基;
L
2表示可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基之C
10-C
19烷基、或可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基之C
10-C
19烯基;
p為3或4。
Description
本發明關於一種封入有HTLV-1 mRNA的核酸脂質粒子疫苗。
人類T細胞白血病病毒1型(Human T-cell leukemia virus type 1(HTLV-1))為致癌性高的轉錄病毒。於世界中存在1000萬人~2000萬人的HTLV-1感染者,在日本也存在100萬人的感染者(非專利文獻1)。HTLV-1感染者的3~5%發病成人T細胞白血病(Adult T-cell leukemia;ATL),預後差。在現時點,HTLV-1感染的預防疫苗及ATL發病預防藥並不存在。又,亦未確立對ATL之滿足的治療效果有貢獻的標準治療。例如,為標準治療之一的多劑併用的化學療法,長期存活者少於10%。
近年,開始對ATL患者進行同種造血幹細胞移植,而在一部分的患者可得到高治療效果。同種造血幹細胞移植的抗腫瘤效果,認為除了使用大量抗癌劑或對全身的放射線照射之移植前處置的效果之外,還有於移植後來自捐贈者之免疫活性細胞的抗腫瘤效果(移植體抗白血病細胞(graft versus leukemia)效果;GVL效果)的貢獻(非專利文獻2)。尤其是有報告:對HTLV-1複製所必需的轉錄活化因子Tax特異性的細胞毒性T細胞(胞毒T淋巴球(cytotoxic T lymphocyte;CTL))增加(非專利文獻3)。然而,由為同種造血幹細胞移植之副反應的移植體抗宿主病(graft versus host disease;GVHD)所致之死亡率高。
Tax具有NF-kB之活化能,為HTLV-1複製所必需的蛋白質(非專利文獻4)。又,在HTLV-1感染細胞或ATL細胞亦認為有透過Tax之過剩的NF-kB活化,已明白Tax之NF-kB活化與感染細胞的癌化有關聯(非專利文獻5、非專利文獻6)。又,非專利文獻7中,鑑定出Tax之對NF-kB活化重要的胺基酸,且使用對彼等胺基酸插入點突變而成之Tax變異體,而解析Tax所致NF-kB活化之作用機制(非專利文獻8、非專利文獻9)。然而,並沒有使用Tax或Tax變異體之預防、或治療HTLV-1的有效疫苗之例。
由使用經移植人類周邊血液單核細胞(human peripheral blood mononuclear cells;hPBMCs)的免疫不全小鼠之HTLV-1感染實驗的結果,已明白HTLV-1感染會藉由以HTLV-1之套膜蛋白質的gp46作為標的之抗gp46抗體被中和(非專利文獻10)。又,於使用大鼠之垂直感染模式中,亦暗示具有中和活性之抗gp46抗體會預防垂直感染的可能性。然而,並沒有使用gp46之預防、或治療HTLV-1的有效疫苗之例。
就將編碼抗原之mRNA封入脂質奈米粒子(lipid nano-particle;LNP)而成之LNP製劑(LNP-mRNA)而言,已知SARS-CoV-2疫苗(非專利文獻11)、或流感疫苗(專利文獻1)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2015/164674號小冊子
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Front Microbiol. (2012) 3: 388.
[非專利文獻2]Blood (2012) 119 (10): 2409-2416.
[非專利文獻3]Cancer Research (2010) 70(15): 6181-6192.
[非專利文獻4]Lancet Infect Dis (2007) 7: 266-281.
[非專利文獻5]Front Microbiol. (2012) 3: 406.
[非專利文獻6]Viruses (2011) 3(6): 714-749.
[非專利文獻7]Gene Dev. (1990) 4: 1875.
[非專利文獻8]J. Biochem. (2011) 150(6): 679-686.
[非專利文獻9]J. Biol Chem. (2006) 281(19): 13075-13082.
[非專利文獻10]Viruses (2016) 8(2): 41.
[非專利文獻11]Science (2021) 371: 1152.
[發明欲解決之課題]
本發明之目的為:提供用以預防及/或治療人類T細胞白血病病毒1型(Human T-cell Leukemia Virus type 1:HTLV-1)所導致的感染之疫苗。
[用以解決課題之手段]
本發明人等發現封入有HTLV-1 mRNA的核酸脂質粒子(LNP-mRNA)可應用於對成人T細胞白血病之治療及發病預防,以致完成本發明。具體而言發現:製作封入有表現HTLV-1 Tax及gp4之mRNA的LNP-mRNA-HTLV-1,又於投予了LNP-mRNA-HTLV-1之小鼠及猴中,誘導出對HTLV-1 Tax及gp46之抗體產生及CTL、以及抑制HTLV-1感染細胞增殖的中和活性。
本發明之要旨如以下所述。
(1)一種粒子,其係封入有可使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原表現之核酸的脂質粒子,其中脂質包含通式(Ia)所表示的陽離子性脂質、或其藥學上所容許之鹽。
式中,
R
1及R
2獨立地表示C
1-C
3烷基;
L
1表示可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基(alkanoyloxy)之C
17-C
19烯基;
L
2表示可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基之C
10-C
19烷基、或可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基之C
10-C
19烯基;
p為3或4。
(2)如(1)中記載之粒子,其中通式(Ia)中的R
1及R
2皆為甲基。
(3)如(1)或(2)中記載之粒子,其中通式(Ia)中的p為3。
(4)如(1)~(3)之任一者中記載之粒子,其中通式(Ia)中的L
1為可具有1或複數個乙醯氧基之C
17-C
19烯基。
(5)如(1)~(4)之任一者中記載之粒子,其中通式(Ia)中的L
2為可具有1或複數個乙醯氧基之C
10-C
12烷基、或可具有1或複數個乙醯氧基之C
10-C
19烯基。
(6)如(1)~(4)之任一者中記載之粒子,其中通式(Ia)中的L
2為可具有1或複數個乙醯氧基之C
10-C
12烷基、或可具有1或複數個乙醯氧基之C
17-C
19烯基。
(7)如(1)~(6)之任一者中記載之粒子,其中通式(Ia)中的L
1為(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基、順式-8-十七碳烯基、或(8Z,11Z)-十七碳二烯基。
(8)如(1)~(7)之任一者中記載之粒子,其中通式(Ia)中的L
2為癸基、順式-7-癸烯基、十二烷基、或(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基。
(9)如(1)中記載之粒子,其中陽離子性脂質由下述結構式表示:
。
(10)如(1)中記載之粒子,其中陽離子性脂質由下述結構式表示:
。
(11)如(1)中記載之粒子,其中陽離子性脂質由下述結構式表示:
。
(12)如(9)或(10)中記載之粒子,其中脂質進一步包含兩親媒性脂質、固醇類及PEG脂質。
(13)如(11)中記載之粒子,其中脂質進一步包含兩親媒性脂質、固醇類及PEG脂質。
(14)如(12)中記載之粒子,其中兩親媒性脂質為由包含二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼及二油醯基磷酯醯乙醇胺之群組所選出的至少1個。
(15)如(13)中記載之粒子,其中兩親媒性脂質為由包含二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼及二油醯基磷酯醯乙醇胺之群組所選出的至少1個。
(16)如(12)或(14)中記載之粒子,其中固醇類為膽固醇。
(17)如(13)或(15)中記載之粒子,其中固醇類為膽固醇。
(18)如(12)、(14)、(16)之任一者中記載之粒子,其中PEG脂質為1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇及/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺。
(19)如(13)、(15)、(17)之任一者中記載之粒子,其中PEG脂質為1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇及/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺。
(20)如(12)~(19)之任一者中記載之粒子,其中兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為5~25%、固醇類為10~55%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~5%。
(21)如(20)中記載之粒子,其中兩親媒性脂質為10~25%。
(22)如(12)、(14)、(16)、(18)之任一者中記載之粒子,其中兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為5~15%、固醇類為35~50%、陽離子性脂質為40~55%、PEG脂質為1~3%。
(23)如(22)中記載之粒子,其中兩親媒性脂質為10~15%、固醇類為35~45%、陽離子性脂質為40~50%、PEG脂質為1~2.5%。
(24)如(23)中記載之粒子,其中PEG脂質為1~2%。
(25)如(13)、(15)、(17)、(19)之任一者中記載之粒子,其中兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為10~25%、固醇類為10~50%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~3%。
(26)如(25)中記載之粒子,其中固醇類為10~45%、陽離子性脂質為42.5~65%、PEG脂質為1~2.5%。
(27)如(26)中記載之粒子,其中PEG脂質為1~2%。
(28)如(20)~(27)之任一者中記載之粒子,其中總脂質重量對核酸重量之比率為15~30。
(29)如(28)中記載之粒子,其中總脂質重量對核酸重量之比率為15~25。
(30)如(29)中記載之粒子,其中總脂質重量對核酸重量之比率為17.5~22.5。
(31)如(1)~(30)之任一者中記載之粒子,其中人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原為與寡聚化結構域(domain)之融合蛋白質。
(32)如(31)中記載之粒子,其中寡聚化結構域為纖維蛋白(fibritin)。
(33)如(31)或(32)中記載之粒子,其中人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原包含與序列識別號14的胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列。
(34)如(1)~(33)之任一者中記載之粒子,其中人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原,係相對於序列識別號11的胺基酸序列而具有由包含T130A、L131S、L319R及L320S之群組所選出的變異之至少1個,且比較該變異胺基酸以外的胺基酸序列之情形,包含與序列識別號11的胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列。
(35)如(34)中記載之粒子,其中人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原,係相對於序列識別號11的胺基酸序列而包含T130A、L131S、L319R及L320S之變異,且比較該變異胺基酸以外的胺基酸序列之情形,包含與序列識別號11的胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列。
(36)如(1)~(35)之任一者中記載之粒子,其中人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原為與訊息肽之融合蛋白質。
(37)如(36)中記載之粒子,其中訊息肽為包含序列識別號13之胺基酸序列的第1個~第18個之胺基酸序列之肽。
(38)如(31)~(37)之任一者中記載之粒子,其中可使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原表現之核酸為包含帽結構(Cap)、5’非轉譯區(5’-UTR)、gp46抗原或Tax抗原之轉譯區、3’非轉譯區(3’-UTR)及多腺苷酸尾部(polyA)的mRNA。
(39)如(38)中記載之粒子,其中可使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原表現之核酸之序列包含與序列識別號17或18之序列具有至少90%之同一性的核苷酸序列。
(40)如(38)中記載之粒子,其中可使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原表現之核酸之序列包含與序列識別號20之序列具有至少90%之同一性的核苷酸序列。
(41)如(1)~(40)之任一者中記載之粒子,其中核酸包含至少1個修飾核苷酸。
(42)如(41)中記載之粒子,其中修飾核苷酸包含5位經取代之嘧啶核苷酸及/或1位可取代之假尿苷的至少1個。
(43)如(41)中記載之粒子,其中修飾核苷酸包含選自包含5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿苷、及1-烷基假尿苷之群組的至少1個。
(44)如(41)中記載之粒子,其中修飾核苷酸包含選自包含5-甲基胞苷、5-甲基尿苷、及1-甲基假尿苷之群組的至少1個。
(45)如(1)~(44)之任一者中記載之粒子,其平均粒徑為30~300nm。
(46)一種如(1)~(45)之任一者中記載之粒子之用途,係用以製造用以預防及/或治療人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)所導致的感染之組成物。
(47)一種組成物,其含有如(1)~(45)之任一者中記載之粒子。
(48)如(47)中記載之組成物,其用以使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原在體內或體外表現。
(49)如(47)或(48)中記載之組成物,其作為醫藥使用。
(50)如(49)中記載之組成物,其用以誘導對人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的免疫反應。
(51)如(49)或(50)中記載之組成物,其用以預防及/或治療人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染。
(52)如(49)或(50)之組成物,其用以對於HTLV-1感染者,預防及/或治療起因於由包含成人T細胞白血病-淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相關脊髓病(HAM)及HTLV-1葡萄膜炎(HU)之群組所選出的HTLV-1之疾病的發病。
(53)一種使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原在體外表現之方法,其包含將如(47)~(50)之任一者中記載之組成物導入細胞。
(54)一種使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原在體內表現之方法,其包含對哺乳動物投予如(47)~(51)之任一者中記載之組成物。
(55)一種誘導對人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的免疫反應之方法,其包含對哺乳動物投予如(49)或(50)中記載之組成物。
(56)一種預防及/或治療人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染之方法,其包含對哺乳動物投予如(49)~(52)之任一者中記載之組成物。
(57)一種預防及/或治療起因於由包含成人T細胞白血病-淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相關脊髓病(HAM)及HTLV-1葡萄膜炎(HU)之群組所選出的HTLV-1之疾病的發病之方法,其包含對哺乳動物投予如(49)~(52)之任一者之組成物。
(58)一種肽,其為人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原,係使具有如會使致癌性減少或消失之變異的Tax抗原與訊息肽融合而成之肽。
(59)如(58)之肽,其中Tax抗原係相對於序列識別號11的胺基酸序列而具有由包含T130A、L131S、L319R及L320S之群組所選出的變異的至少1個,且比較該變異胺基酸以外的胺基酸序列之情形,包含與序列識別號11的胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列。
(60)如(58)或(59)之肽,其中訊息肽為包含序列識別號13之胺基酸序列的第1個~第18個之胺基酸序列之肽。
(61)如(31)~(37)之任一者中記載之粒子,其中可使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原表現之核酸為包含由帽結構(Cap)、5’非轉譯區(5’-UTR)、gp46抗原或Tax抗原之轉譯區及3’非轉譯區(3’-UTR)而成之構成的mRNA。
(62)如(61)中記載之粒子,其中由帽結構(Cap)、5’非轉譯區(5’-UTR)、gp46抗原或Tax抗原之轉譯區及3’非轉譯區(3’-UTR)而成之構成,係與序列識別號17的第1個至第1141個之序列或序列識別號18的第1個至第1222個之序列具有至少90%之同一性的核苷酸序列。
(63)如(61)中記載之粒子,其中由帽結構(Cap)、5’非轉譯區(5’-UTR)、gp46抗原或Tax抗原之轉譯區及3’非轉譯區(3’-UTR)而成之構成,係與序列識別號20的第1個至第1315個之序列具有至少90%之同一性的核苷酸序列。
本說明書包含為本案優先權基礎之日本國專利申請編號2021-084942號的揭示內容。
[發明之效果]
藉由本發明,而能夠預防及/或治療人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)所導致的感染。又,藉由本發明,而能夠預防及/或治療起因於HTLV-1所導致的感染之疾病。又,本發明之粒子,於代謝安定性、體外活性、體內活性、藥效表現之速度、藥效之持續性、物理安定性、藥物相互作用、安全性等之點具有優異之性質,作為用以治療或預防上述疾病之醫藥為有用的。
[用以實施發明的形態]
以下,針對本發明之實施形態更詳細地進行說明。
本發明提供一種粒子,係封入有可使HTLV-1的gp46抗原或Tax抗原表現之核酸的脂質粒子,其中脂質包含通式(Ia)所表示的陽離子性脂質、或其藥學上所容許之鹽。
式中,
R
1及R
2獨立地表示C
1-C
3烷基;
L
1表示可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基之C
17-C
19烯基;
L
2表示可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基之C
10-C
19烷基、或可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基之C
10-C
19烯基;
p為3或4。
通式(Ia)中的R
1及R
2獨立地表示C
1-C
3烷基,但較佳為皆為甲基。
通式(Ia)中的p為3或4,但較佳為3。
通式(Ia)中的L
1表示可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基之C
17-C
19烯基,但較佳為可具有1或複數個乙醯氧基之C
17-C
19烯基。作為L
1,具體而言可例示(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基、順式-8-十七碳烯基、或(8Z,11Z)-十七碳二烯基等。
通式(Ia)中的L
2表示可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基之C
10-C
19烷基、或可具有1或複數個C
2-C
4烷醯氧基之C
10-C
19烯基,但較佳為可具有1或複數個乙醯氧基之C
10-C
12烷基、或可具有1或複數個乙醯氧基之C
10-C
19烯基。或是,又亦較佳為通式(Ia)中的L
2為可具有1或複數個乙醯氧基之C
10-C
12烷基、或可具有1或複數個乙醯氧基之C
17-C
19烯基。作為L
2,具體而言可例示癸基、順式-7-癸烯基、十二烷基、或(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基等。
作為構成本發明之粒子之成分的陽離子性脂質,具體而言可例示以下述結構式:
所分別表示的二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯-7,29-二基酯、碳酸3-二甲基胺基丙酯(9Z,12Z)-二十八碳-19,22-二烯-11-基酯、乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基胺基)丙基氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯-7-基酯。
通式(Ia)所表示的陽離子性脂質可為1種類的化合物,亦可為2種類以上的化合物之組合。
製造通式(Ia)所表示的陽離子性脂質之方法,係記載於國際公報第2015/005253號小冊子中。
本發明之脂質亦可進一步包含兩親媒性脂質、固醇類及PEG脂質。
兩親媒性脂質係對極性、非極性之溶媒都具有親和性的脂質,具體而言可例示二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷酯醯乙醇胺、彼等之組合等。作為用於本發明之粒子的兩親媒性脂質,較佳為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼及/或二油醯基磷酯醯乙醇胺,更佳為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼。
固醇類為具有羥基的固醇,具體而言可例示膽固醇等。
PEG脂質為經PEG修飾之脂質,具體而言可例示1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇及/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺、彼等之組合等,但較佳為1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇。PEG脂質之平均分子量並無特別限定,但例如為1000~5000,較佳為1500~3000,更佳為1800~2200。
兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成雖未特別被限定,但例如以莫耳量計,兩親媒性脂質為5~25%、固醇類為10~55%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~5%,較佳為兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為10~25%、固醇類為10~55%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~5%,更佳為兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為10~22.5%、固醇類為15~55%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~5%。於上述脂質組成中PEG脂質之比例以莫耳量計,更佳為1~3%,進一步更佳為1~2%,進一步更佳為1.2~2%,進一步更佳為1.25~2%,進一步更佳為1.3~2%,特佳為1.5~2%。又,於上述脂質組成中總脂質重量對核酸重量之比率並不特別被限定,但若為15~30即可,較佳為15~25,更佳為15~22.5,進一步更佳為17.5~22.5。
使用碳酸3-二甲基胺基丙酯(9Z,12Z)-二十八碳-19,22-二烯-11-基酯、或二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯-7,29-二基酯作為陽離子性脂質之情形,兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成雖未特別被限定,但例如以莫耳量計,兩親媒性脂質為5~25%、固醇類為10~55%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~5%,較佳為兩親媒性脂質為15%以下、固醇類為20~55%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~5%,更佳為兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為5~15%、固醇類為35~50%、陽離子性脂質為40~55%、PEG脂質為1~3%,進一步更佳為兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為10~15%、固醇類為35~45%、陽離子性脂質為40~50%、PEG脂質為1~2.5%,進一步更佳為兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為10~15%、固醇類為35~45%、陽離子性脂質為40~50%、PEG脂質為1~2%。於上述脂質組成中PEG脂質進一步更佳為1.2~2%,進一步更佳為1.25~2%,進一步更佳為1.3~2%,進一步更佳為1.5~2%。於上述脂質組成中總脂質重量對核酸重量之比率並不特別被限定,但若為15~30即可,較佳為15~25,更佳為15~22.5,進一步更佳為17.5~22.5。
使用乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基胺基)丙基氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯-7-基酯作為陽離子性脂質之情形,兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成雖未特別被限定,但例如以莫耳量計,兩親媒性脂質為5~25%、固醇類為10~55%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~5%,較佳為兩親媒性脂質為10~25%、固醇類為10~50%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~5%,更佳為兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為10~25%、固醇類為10~50%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~3%,進一步更佳為兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為10~25%、固醇類為10~45%、陽離子性脂質為42.5~65%、PEG脂質為1~2.5%,進一步更佳為兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為15~22.5%、固醇類為15~40%、陽離子性脂質為45~65%、PEG脂質為1~2%,進一步更佳為兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為17.5~22.5%、固醇類為15~40%、陽離子性脂質為45~65%、PEG脂質為1~2%。於上述脂質組成中PEG脂質進一步更佳為1.2~2%,進一步更佳為1.25~2%,進一步更佳為1.3~2%,進一步更佳為1.5~2%。於上述脂質組成中總脂質重量對核酸重量之比率並不特別被限定,但較佳為15~30,更佳為15~25,進一步更佳為15~22.5,進一步更佳為17.5~22.5。
就本發明中之具體的脂質之組合而言,可組合作為兩親媒性脂質的二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼、或二油醯基磷酯醯乙醇胺、作為固醇類的膽固醇、作為陽離子性脂質的二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯-7,29-二基酯、碳酸3-二甲基胺基丙酯(9Z,12Z)-二十八碳-19,22-二烯-11-基酯、或乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基胺基)丙基氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯-7-基酯、作為PEG脂質的1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺而使用。又,較佳為使用作為兩親媒脂質的二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、或二油醯基磷酯醯乙醇胺、作為固醇類的膽固醇、作為陽離子性脂質的二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯-7,29-二基酯、或乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基胺基)丙基氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯-7-基酯、作為PEG脂質的1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇的脂質之組合。作為本發明中之具體的脂質之組合,更佳為作為兩親媒脂質的二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、作為固醇類的膽固醇、作為陽離子性脂質的二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯-7,29-二基酯、或乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基胺基)丙基氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯-7-基酯、作為PEG脂質的1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇。
於本發明中,被封入脂質粒子的核酸為可使HTLV-1的gp46抗原或Tax抗原表現者。
將HTLV-1的gp46抗原的胺基酸序列呈示於序列識別號14。被封入脂質粒子的核酸宜為編碼包含與序列識別號14的胺基酸序列具有至少95%、較佳為96%、更佳為97%、更佳為98%之同一性的胺基酸序列之HTLV-1的gp46抗原者。
gp46抗原可為與寡聚化結構域之融合蛋白質。寡聚化結構域係使所融合的蛋白質多聚化之蛋白質,可舉出例如源自T4噬菌體的纖維蛋白(fibritin)。又,亦可使用為纖維蛋白之3聚化結構域的折疊子(foldon)結構域。將HTLV-1的gp46與纖維蛋白之融合蛋白質的胺基酸序列呈示於序列識別號15。序列識別號15之胺基酸序列的第313個~第339個之胺基酸序列為纖維蛋白的胺基酸序列。寡聚化結構域可位於gp46抗原的C末端,可位於N末端。
將HTLV-1之野生型的Tax抗原的胺基酸序列呈示於序列識別號11。被封入脂質粒子的核酸宜為編碼包含與序列識別號11的胺基酸序列具有至少95%、較佳為96%、更佳為97%之同一性的胺基酸序列之HTLV-1的Tax抗原者。野生型的Tax抗原具有HTLV-1 LTR轉錄活性,且具有致癌性,因此有使所謂對生體致癌性之毒性減少或消失之必要。例如,若使用具有如會使致癌性減少或消失之變異的Tax抗原即可。又,若Tax被分泌於細胞外,則對細胞的致癌性降低,所以亦可為與訊息肽之融合蛋白質。作為如會使致癌性減少或消失之變異,可舉出T130A、L131S、L319R及L320S。T130A及L131S為HIV-1 LTR及HTLV-1轉錄活性失能變異,L319R及L320S為HTLV-1轉錄活性缺失變異。若具有此等變異的至少1個變異即可,較佳為具有2個,更佳為具有3個,特佳為具有4個變異。將具有上述4個變異之變異型的Tax抗原的胺基酸序列呈示於序列識別號12。又,作為用以使Tax抗原分泌於細胞外的訊息肽,可舉出IgE分泌訊息肽。訊息肽,係較佳為使其融合在Tax抗原的N末端側。將訊息肽與具有上述4個變異之變異型Tax抗原之融合蛋白質的胺基酸序列呈示於序列識別號13。序列識別號13之胺基酸序列的第1個~第18個之胺基酸序列為IgE分泌訊息肽之胺基酸序列。
本發明包含一種為分泌型Tax變異體之肽,其係對使訊息肽融合在具有上述之4個胺基酸變異的至少1個、較佳為2個、更佳為3個、特佳為4個變異之Tax抗原而成的Tax變異型,加成IgE分泌訊息而成。該肽為人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原,係使具有如會使致癌性減少或消失之變異的Tax抗原與訊息肽融合而成之肽。作為如會使致癌性減少或消失之變異,可舉出T130A、L131S、L319R及L320S。亦即,作為上述肽,可舉出Tax抗原為相對於序列識別號11之胺基酸序列而具有由包含T130A、L131S、L319R及L320S之群組所選出的變異的至少1個,且比較該變異胺基酸以外的胺基酸序列之情形,包含與序列識別號11的胺基酸序列具有至少95%、較佳為96%、更佳為97%之同一性的胺基酸序列之肽。又,作為用以使Tax抗原分泌於細胞外的訊息肽,可舉出IgE分泌訊息肽。訊息肽,係較佳為使其融合在Tax抗原的N末端側。序列識別號13之胺基酸序列的第1個~第18個之胺基酸序列為IgE分泌訊息肽之胺基酸序列。亦即,作為上述肽,可舉出訊息肽為包含序列識別號13之胺基酸序列的第1個~第18個之胺基酸序列之肽。
於本發明中,被封入脂質粒子的核酸亦可為可使HTLV-1的gp46抗原和Tax抗原以連接子(linker)結合而成之蛋白質表現者。連接子由包含藉由蛋白酶而被切割之序列的胺基酸序列構成,可舉出例如包含為蛋白酶的弗林蛋白酶(Furin)會辨識而進行切割之胺基酸序列的連接子。就蛋白酶切割序列而言,若為會藉由Furin蛋白而被切割之序列即可,可舉出例如R-X-K/R-R(R表示精胺酸,K表示離胺酸,X表示任意胺基酸)所表示的序列等(J. Biol. Chem. 1992, 267, 16396;J. Biol. Chem. 1991, 266, 12127)。
所謂胺基酸序列的同一性(identity),係以對應之胺基酸完全一致的胺基酸為相同胺基酸,而將相對於全長序列之胺基酸的一致比例進行數值化而成者。本發明中之序列的同一性係使用序列解析軟體之GENETYX-SV/RC(GENETYX CORPORATION製)所算出者,此演算法為該技術領域中所通常使用者。被封入本發明之脂質粒子的核酸所編碼的胺基酸,只要保持與序列識別號11~16一定以上的同一性,則亦可發生胺基酸之變異(取代)、缺失、插入及/或加成。
被封入本發明之脂質粒子的核酸所編碼的胺基酸,係保持上述之序列同一性,且可在序列識別號11~16之胺基酸序列中,於數處(較佳為5處以下,更佳為3、2或1處)中,每1處有數個(較佳為10個以下,更佳為7個以下,進一步較佳為5、4、3、2或1個)胺基酸取代、缺失、插入及/或加成。
可使HTLV-1的gp46抗原或Tax抗原表現之核酸宜為包含帽結構(Cap)、5’非轉譯區(5’-UTR)、gp46或Tax之轉譯區、3’非轉譯區(3’-UTR)及多腺苷酸尾部(polyA)的mRNA。又,亦可於gp46或Tax之轉譯區的5’側具有KOZAK序列。帽結構(Cap)係存在於許多真核生物之mRNA的5’末端,且具有7-甲基鳥苷結構之部位。就帽結構而言,可舉出例如使用cap0、cap1、cap2、ARCA(抗-反向帽類似物(Anti-Reverse Cap Analog))之情形的帽結構等,該帽結構係如下述結構式所示。
(式中,Base表示未修飾或經修飾之任意核酸鹼基,RNA表示任意聚核苷酸。)
就本發明之mRNA的帽結構而言,較佳為cap0、或cap1,更佳為cap1。5’非轉譯區(5’-UTR)之序列可使用例如包含人類β球蛋白基因的5’非轉譯區之序列。例如,人類β球蛋白基因的5’非轉譯區之序列為序列識別號17之序列中的鹼基編號15~64之序列。gp46之轉譯區之序列,係可表現gp46抗原的胺基酸序列全部或一部分之序列,亦可包含起始密碼子及/或終止密碼子,例如為序列識別號17之序列中的鹼基編號71~1009之序列。又,亦可為使gp46之轉譯區之序列和纖維蛋白之序列連結而成者,例如序列識別號18的鹼基編號71~1090之序列。dgp62之轉譯區之序列,係可表現dgp62抗原的胺基酸序列全部或一部分之序列,亦可包含起始密碼子及/或終止密碼子,例如為序列識別號19之序列中的鹼基編號71~1396之序列。又,亦可為使dgp62之轉譯區之序列和纖維蛋白之序列連結而成者,例如為序列識別號19之序列中的鹼基編號71~1480之序列。Tax之轉譯區之序列,係可表現Tax抗原的胺基酸序列全部或一部分之序列,亦可包含起始密碼子及/或終止密碼子。例如,具有T130A、L131S、L319R及L320S4個變異。可舉出使上述具有4個變異之變異型的Tax抗原之轉譯區之序列、和編碼用以使Tax抗原分泌於細胞外的IgE分泌訊息肽之序列連結而成者,為序列識別號20之序列中的鹼基編號71~1183之序列。3’非轉譯區(3’-UTR)之序列可使用例如人類β球蛋白基因的3’非轉譯區。例如,序列識別號17之序列中的鹼基編號1010~1141之序列。多腺苷酸尾部(polyA)之序列係例如序列識別號17之序列中的鹼基編號1142~1241之序列。於帽結構(Cap)、5’非轉譯區(5’-UTR)、gp46或Tax之轉譯區、3’非轉譯區(3’-UTR)及多腺苷酸尾部(polyA)之序列,亦可進行改變,可使gp46抗原表現之核酸之序列宜包含與序列識別號17之序列具有至少90%、較佳為95%、更佳為97%之同一性的核苷酸序列。又,可使Tax抗原表現之核酸之序列宜包含與序列識別號20之序列具有至少90%、較佳為95%、更佳為97%之同一性的核苷酸序列。
多腺苷酸尾部之長度並不特別被限定,但例如為10~250鹼基長,較佳為15~120鹼基長,進一步較佳為15~115鹼基長,特佳為20~110鹼基長。
本發明之mRNA為包含帽結構(Cap)、5’非轉譯區(5’-UTR)、gp46或Tax之轉譯區及3’非轉譯區(3’-UTR)之序列,亦可為由帽結構(Cap)、5’非轉譯區(5’-UTR)、gp46抗原或Tax抗原之轉譯區及3’非轉譯區(3’-UTR)而成之部分包含與序列識別號17的第1個至第1141個之序列、序列識別號18的第1個至第1222個之序列、序列識別號20的第1個至第1315個之序列具有至少90%、較佳為95%、更佳為97%之同一性的核苷酸序列之mRNA。
被封入脂質粒子的核酸,若為可使HTLV-1的gp46抗原或Tax抗原表現之核酸,則可為任何形態。可舉出例如單股DNA、單股RNA(例如mRNA)、DNA與RNA混合而成之單股聚核苷酸、雙股DNA、雙股RNA、DNA-RNA之混成體聚核苷酸、由DNA與RNA混合而成之2種聚核苷酸所構成的雙股聚核苷酸等,但較佳為mRNA。
構成被封入脂質粒子的核酸之核苷酸可為天然型之物,亦可為修飾核苷酸,但宜包含至少1個修飾核苷酸。
修飾核苷酸可為鹼基、糖及磷酸二酯鍵之任一部分經修飾者。修飾部位可為1處,亦可為2處以上。
就鹼基的修飾之例而言,可舉出胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、N4-甲基化、尿嘧啶的5-甲基化(胸腺嘧碇)、5-氟化、腺嘌呤的N6-甲基化、鳥糞嘌呤的N2-甲基化等。
就糖的修飾之例而言,可舉出D-核呋喃糖的2’-O-甲基化。
就磷酸二酯鍵的修飾之例而言,可舉出硫代磷酸酯鍵。
修飾核苷酸較佳為鹼基部分經修飾者,宜為例如5位經取代之嘧啶核苷酸、1位可取代之假尿苷,具體而言可例示5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿苷、1-烷基假尿苷。又,就1-烷基假尿苷而言,可為1-(C1-C6烷基)假尿苷,較佳為1-甲基假尿苷或1-乙基假尿苷。作為修飾核苷酸,可舉出更佳為5-甲基胞苷、5-甲基尿苷、及1-甲基假尿苷。作為修飾核苷酸,可舉出特佳為5-甲基胞苷及5-甲基尿苷之組合、或5-甲基胞苷及1-甲基假尿苷之組合。
本發明之可使HTLV-1的gp46抗原或Tax抗原表現之核酸,可由具有所期望之鹼基序列的DNA藉由體外轉錄反應來製造。體外轉錄所需要的酵素、緩衝液、及核苷-5’-三磷酸混合物(腺苷-5’-三磷酸(ATP)、鳥苷-5’-三磷酸(GTP)、胞苷-5’-三磷酸(CTP)及尿苷-5’-三磷酸(UTP))已為市售(AmpliScribeT7高產率轉錄套組(Epicentre)、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit(Life technologies)等)。為了製造單股RNA而使用的DNA,可使用經選殖化之DNA,例如質體DNA或DNA片段。質體DNA或DNA片段可使用市售之物,還可藉由該領域中一般所知悉的方法來製造(例如,Sambrook, J. et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual second edition (1989);Rashtchian, A., Current Opinion in Biotechnology, 1995, 6(1), 30-36;Gibson D. G. et al., Science, 2008, 319(5867), 1215-1220中記載之方法等)。
為了得到安定性及/或安全性經提升的mRNA,亦可藉由在體外轉錄反應中,將一部分或全部的未修飾核苷-5’-三磷酸以修飾核苷-5’-三磷酸取代,而將mRNA之中一部分或全部的未修飾核苷酸以修飾核苷酸取代(Kormann, M., Nature Biotechnology, 2011, 29, 154-157.)。
為了得到安定性及/或安全性經提升的mRNA,可藉由在體外轉錄反應後使用戴帽酵素(capping enzyme)的方法,而對mRNA之5’末端導入帽結構(上述之Cap0結構)。又,可進一步藉由使2’-O-甲基轉移酶對具有Cap0之mRNA作用的方法,而將Cap0變換為Cap1。戴帽酵素及2’-O-甲基轉移酶可使用市售製品(例如,Vaccinia Capping System,M2080;mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase,M0366,皆為New England Biolab製)。使用市售製品之情形,可按照附屬於製品的計畫書而製造具有帽結構之mRNA。
mRNA之5’末端的帽結構,係藉由與使用酵素者不同的方法亦可導入。例如,可藉由在體外轉錄反應中加入ARCA或CleanCap(註冊商標),而對mRNA導入ARCA所具有的帽類似物(Cap analog)之結構、或源自CleanCap之Cap1結構。ARCA及CleanCap可使用市售製品(ARCA,N-7003;CleanCap Reagent AG,N-7113,皆為TriLink BioTechnologies製)。使用市售製品之情形,可按照附屬於製品的計畫書而製造具有帽結構之mRNA。
於本發明中,被封入脂質粒子的核酸亦可利用脫鹽、HPLC(逆相、凝膠過濾、離子交換、親和性)、PAGE、超過濾等方法進行精製。藉由精製處理而將雜質去除,因此可減少投予了核酸之生體中的促發炎細胞激素(proinflammatory cytokine)的產生。
本發明之封入核酸的脂質粒子可藉由薄膜法、逆相蒸發法、乙醇注入法、醚注入法、脫水-再水合法、界面活性劑透析法、水合法、冷凍融解法等方法來製造。例如,可藉由國際公開公報第2015/005253號中記載之方法來製造封入核酸的脂質粒子。本發明之封入核酸的脂質粒子亦可藉由在微流道內混合核酸溶液與脂質溶液而製造。例如,可使用Precision Nanosystems公司的NanoAssemblr(註冊商標),且按照附屬的計畫書中記載之方法製造。
本發明之粒子宜為平均粒徑為30nm~300nm,較佳為30~200nm,更佳為30~100nm。平均粒徑可藉由使用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMP(註冊商標) 380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)等機器,根據動態光散射法等原理來測定體積平均粒徑而得到。
本發明之粒子可用於為了製造用以預防及/或治療HTLV-1感染所導致的疾病之組成物。作為HTLV-1感染所導致的疾病,可舉出成人T細胞白血病(ATL)、HTLV-1相關脊髓病(HAM)、HTLV-1相關葡萄膜炎(HU)等。封入有可使HTLV-1的gp46抗原表現之核酸的脂質粒子與封入有可使HTLV-1的Tax抗原表現之核酸的脂質粒子,係可將該核酸於同一脂質粒子內進行製劑化,亦可作為另外的脂質粒子進行製劑化,但較佳為作為另外的脂質粒子而調製。
可使用本發明之粒子而使HTLV-1的gp46抗原及Tax抗原在體內或體外表現。亦即,如將封入有可使HTLV-1的gp46抗原表現之核酸的脂質粒子與封入有可使HTLV-1的Tax抗原表現之核酸的脂質粒子對受試體進行投予即可。因此,本發明提供一種使HTLV-1的gp46抗原及Tax抗原在體外表現之方法,其包含將含有上述粒子之組成物導入細胞。又,本發明亦提供一種使HTLV-1的gp46抗原及Tax抗原在體內表現之方法,其包含對哺乳動物投予含有上述粒子之組成物。可藉由使HTLV-1的gp46抗原及Tax抗原在體內表現,而誘導對HTLV-1的免疫反應。作為其結果,可預防及/或治療HTLV-1感染。因此,本發明提供一種誘導對HTLV-1的免疫反應之方法,其包含對哺乳動物投予含有上述粒子之組成物。又,本發明提供一種預防及/或治療HTLV-1感染之方法,其包含對哺乳動物投予含有上述粒子之組成物。本發明亦包含一種套組,其包含封入有可使HTLV-1的gp46抗原表現之核酸的脂質粒子與封入有可使HTLV-1的Tax抗原表現之核酸的脂質粒子之兩者。
本發明之粒子可利用來作為醫藥,還可利用來作為實驗用試藥。本發明之粒子通常被添加於水、緩衝液、生理食鹽水等載體,且可將此摻合物(組成物) 導入細胞(體外)、或對哺乳動物投予(體內)。於對哺乳動物投予之情形,載體宜為藥學上所容許之載體(例如生理食鹽水)。又,本發明之粒子亦可製劑化為以脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、石蠟、蠟、樹脂、塑膠、乙二醇類、高級醇、甘油、水、乳化劑、懸浮劑等作為基底劑原料之乳霜、糊劑、軟膏、凝膠、乳液等劑型。
本發明之粒子可對人類、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、豬、猴、貓、犬、馬、山羊、綿羊、牛等哺乳動物經口投予、或是藉由肌肉內投予、靜脈內投予、直腸內投予、經皮投予、經黏膜投予、皮下投予、皮內投予等方法而進行非經口投予。
於將本發明之粒子對人類進行投予之情形,宜為例如成人每1次,作為mRNA之重量而以約0.001~1mg、較佳為0.01~0.2mg的投予量,進行1次或數次肌肉內注射、皮下注射、皮內注射、點滴靜脈注射、或靜脈注射,但其投予量和投予次數可按照疾病的種類、症狀、年齡、投予方法等而適當變更。
作為實驗試藥使用之情形,可將本發明之粒子導入欲使HTLV-1的gp46抗原及Tax抗原表現之細胞(例如HEK293細胞及其衍生細胞(HEK293T細胞、FreeStyle 293細胞或Expi293細胞)、CHO細胞、C2C12小鼠肌原細胞、永生化小鼠樹突細胞(MutuDC1940)),使HTLV-1的gp46抗原及Tax抗原在體外表現。HTLV-1的gp46抗原及Tax抗原之表現,可藉由以西方印漬術檢出試樣中之HTLV-1的gp46抗原及Tax抗原蛋白質、或以質譜分析法檢出對HTLV-1的gp46抗原及Tax抗原為特異性之肽片段而進行解析。
於本發明中,所謂「治療」係意指於病毒或細菌等所導致的感染症、或以該感染為原因的疾病(例如癌前病變或癌等)已發病之患者,此等疾病之臨床症狀的恢復、緩解、和緩及/或惡化的延遲。
於本發明中,所謂「預防」係意指減少病毒或細菌等所導致的感染症所致疾病的發病率。預防包含病毒或細菌等所導致的感染症所致疾病進行之風險的降低、或是彼等疾病之重症化的減少。本發明之粒子因誘導防禦免疫反應,而對上述疾病之預防及/或治療顯示效果。
本發明之粒子對於HTLV-1感染者,被期待亦作為起因於HTLV-1之疾病的發病預防藥及治療藥使用。就起因於HTLV-1之疾病而言,可舉出成人T細胞白血病-淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相關脊髓病(HAM)、HTLV-1葡萄膜炎(HU)等。
[實施例]
以下,藉由實施例而具體地說明本發明。再者,此等實施例係用以說明本發明,而非限定本發明之範圍。
實施例中,有時使用以下之縮寫。
SU gp46:表示為HTLV-1之套膜蛋白質的細胞外域(表面單元(surface unit))之gp46。
gp46-Fib:表示gp46與纖維蛋白(Fibritin)的C末端域之融合蛋白質。dgp62-Fib:表示由gp62使跨膜域及細胞內域缺損而成的蛋白質與纖維蛋白(Fibritin)的C末端域之融合蛋白質。
sec Tax變異體:表示導入變異的Tax蛋白質與分泌訊息蛋白質之融合蛋白質。
[實施例1]SU gp46 mRNA-001之調製
(1)SU gp46之體外轉錄(IVT)用模板DNA之製作
為了製作用於體外轉錄(IVT)之模板DNA,而將SU gp46 DNA藉由PCR來增幅後進行精製。將包含T7啟動子序列、人類β-球蛋白之5’-UTR序列、KOZAK序列、SU gp46、人類β-球蛋白之3’-UTR序列、PolyA序列依序連結而成之序列的DNA片段(序列識別號1)導入質體。對溶解了該質體8ng的無核酸酶水(Nuclease-free water)(547.2μL)加入KOD-Plus- Ver.2用10×緩衝液(80μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、2mM dNTP mix(80μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、25mM MgSO
4(48μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、50μM正向引子(4.8μL,序列識別號2)、10μM反向引子(24μL,序列識別號3)、KOD Plus聚合酶(16μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211),在98℃保溫1分鐘後,將98℃、5秒、55℃、15秒、68℃、90秒實施20個循環,進而在68℃保溫1分鐘,將DNA增幅。反應後以Wizard SV凝膠和PCR純化系統(PCR clean-up system)(Promega型錄# A9281)精製模板DNA(序列識別號4)。
(2)利用體外轉錄之SU gp46 mRNA-001之調製
將實施例1-(1)中所得之365.1μg/mL模板DNA(4.38μL)、100mM CleanCap AG(8μL,TriLink型錄# N-7113)、100mM ATP(8μL,Hongene型錄# R1331)、100mM GTP(8μL,Hongene型錄# R2331)、100mM CTP(8μL,Hongene型錄# R3331)、100mM N1-methylpseudoUTP(8μL,Hongene型錄# R5-027)、無核酸酶水(67.62μL,Thermo Fisher型錄# AM9937)、T7轉錄5×緩衝液(32μL,Promega型錄# P140X)、Enzyme mix,T7 RNA聚合酶(16μL,Promega型錄# P137X)混合,在37℃保溫4小時。混合RQ1無RNase之DNase(8μL,Promega型錄# M6101),在37℃保溫15分鐘。混合8M LiCl溶液(80μL,Sigma-Aldrich型錄# L7026),在-30℃靜置整夜。離心分離(4℃、5200×g、35分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、5200×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣溶解於無核酸酶水(500μL)後,使用RNeasy Midi kit(Qiagen型錄# 75144)而如附屬之手冊地進行精製。將所得之溶液(750μL)、rApid鹼性磷酸酶(Roche型錄# 04 898 141 001)之緩衝液(85μL)和酵素(32μL)混合,在37℃保溫30分鐘後,在75℃保溫2分鐘。將所得之溶液使用RNeasy Midi kit(Qiagen型錄# 75144)而如附屬之手冊地進行精製,以得到目的之mRNA。合計進行2次同樣的實驗操作,合併所得之mRNA溶液,而得到目的之mRNA。所得之mRNA具有序列識別號17之序列。
[實施例2]gp46-Fib mRNA-002之調製
(1)gp46-Fib之體外轉錄(IVT)用模板DNA之製作
為了製作用於體外轉錄(IVT)之模板DNA,而將gp46-Fib DNA藉由PCR來增幅後進行精製。將包含T7啟動子序列、人類β-球蛋白之5’-UTR序列、KOZAK序列、gp46-Fib、人類β-球蛋白之3’-UTR序列、PolyA序列依序連結而成之序列的DNA片段(序列識別號5)導入質體。對溶解了該質體8ng的無核酸酶水(547.2μL)加入KOD-Plus- Ver.2用10×緩衝液(80μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、2mM dNTP mix(80μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、25mM MgSO
4(48μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、50μM正向引子(4.8μL,序列識別號2)、10μM反向引子(24μL,序列識別號3)、KOD Plus聚合酶(16μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211),在98℃保溫1分鐘後,將98℃、5秒、55℃、15秒、68℃、90秒實施20個循環,進而在68℃保溫1分鐘,將DNA增幅。反應後以Wizard SV凝膠和PCR純化系統(Promega型錄# A9281)精製模板DNA(序列識別號6)。
(2)利用體外轉錄之gp46-Fib mRNA-002之調製
將實施例2-(1)中所得之345.3μg/mL模板DNA(4.63μL)、100mM CleanCap AG(8μL,TriLink型錄# N-7113)、100mM ATP(8μL,Hongene型錄# R1331)、100mM GTP(8μL,Hongene型錄# R2331)、100mM CTP(8μL,Hongene型錄# R3331)、100mM N1-methylpseudoUTP(8μL,Hongene型錄# R5-027)、無核酸酶水(67.37μL,Thermo Fisher型錄# AM9937)、T7轉錄5×緩衝液(32μL,Promega型錄# P140X)、Enzyme mix,T7 RNA聚合酶(16μL,Promega型錄# P137X)混合,在37℃保溫4小時。混合RQ1無RNase之DNase(8μL,Promega型錄# M6101),在37℃保溫15分鐘。混合8M LiCl溶液(80μL,Sigma-Aldrich型錄# L7026),在-30℃靜置整夜。離心分離(4℃、5200×g、35分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、5200×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣溶解於無核酸酶水(500μL)後,使用RNeasy Midi kit(Qiagen型錄# 75144)而如附屬之手冊地進行精製。將所得之溶液(750μL)、rApid鹼性磷酸酶(Roche型錄# 04 898 141 001)之緩衝液(85μL)和酵素(32μL)混合,在37℃保溫30分鐘後,在75℃保溫2分鐘。將所得之溶液使用RNeasy Midi kit(Qiagen型錄# 75144)而如附屬之手冊地進行精製,以得到目的之mRNA。合計進行2次同樣的實驗操作,合併所得之mRNA溶液,而得到目的之mRNA。所得之mRNA具有序列識別號18之序列。
[實施例3]dgp62-Fib mRNA-003之調製
(1)dgp62-Fib之體外轉錄(IVT)用模板DNA之製作
為了製作用於體外轉錄(IVT)之模板DNA,而將dgp62-Fib DNA藉由PCR來增幅後進行精製。將包含T7啟動子序列、人類β-球蛋白之5’-UTR序列、KOZAK序列、dgp62-Fib、人類β-球蛋白之3’-UTR序列、PolyA序列依序連結而成之序列的DNA片段(序列識別號7)導入質體。對溶解了該質體8ng的無核酸酶水(547.2μL)加入KOD-Plus- Ver.2用10×緩衝液(80μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、2mM dNTP mix(80μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、25mM MgSO
4(48μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、50μM正向引子(4.8μL,序列識別號2)、10μM反向引子(24μL,序列識別號3)、KOD Plus聚合酶(16μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211),在98℃保溫1分鐘後,將98℃、5秒、55℃、15秒、68℃、90秒實施20個循環,進而在68℃保溫1分鐘,將DNA增幅。反應後以Wizard SV凝膠和PCR純化系統(Promega型錄# A9281)精製模板DNA(序列識別號8)。
(2)利用體外轉錄之dgp62-Fib mRNA-003之調製
將實施例3-(1)中所得之366.7μg/mL模板DNA(4.36μL)、100mM CleanCap AG(8μL,TriLink型錄# N-7113)、100mM ATP(8μL,Hongene型錄# R1331)、100mM GTP(8μL,Hongene型錄# R2331)、100mM CTP(8μL,Hongene型錄# R3331)、100mM N1-methylpseudoUTP(8μL,Hongene型錄# R5-027)、無核酸酶水(67.64μL,Thermo Fisher型錄# AM9937)、T7轉錄5×緩衝液(32μL,Promega型錄# P140X)、Enzyme mix,T7 RNA聚合酶(16μL,Promega型錄# P137X)混合,在37℃保溫4小時。RQ1無RNase之DNase(8μL,Promega型錄# M6101)混合,在37℃保溫15分鐘。混合8M LiCl溶液(80μL,Sigma-Aldrich型錄# L7026),在-30℃靜置整夜。離心分離(4℃、5200×g、35分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、5200×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣溶解於無核酸酶水(500μL)後,使用RNeasy Midi kit(Qiagen ca talog # 75144)而如附屬之手冊地進行精製。將所得之溶液(750μL)、rApid鹼性磷酸酶(Roche型錄# 04 898 141 001)之緩衝液(85μL)和酵素(32μL)混合,在37℃保溫30分鐘後,在75℃保溫2分鐘。將所得之溶液使用RNeasy Midi kit(Qiagen型錄# 75144)而如附屬之手冊地進行精製,以得到目的之mRNA。合計進行2次同樣的實驗操作,合併所得之mRNA溶液,而得到目的之mRNA。所得之mRNA具有序列識別號19之序列。
[實施例4]sec Tax變異體 mRNA-004之調製
(1)sec Tax變異體之體外轉錄(IVT)用模板DNA之製作
為了製作用於體外轉錄(IVT)之模板DNA,而將sec Tax DNA藉由PCR來增幅後進行精製。將包含T7啟動子序列、人類β-球蛋白之5’-UTR序列、KOZAK序列、sec Tax、人類β-球蛋白之3’-UTR序列、PolyA序列依序連結而成之序列的DNA片段(序列識別號9)導入質體。對溶解了該質體8ng的無核酸酶水(547.2μL)加入KOD-Plus- Ver.2用10×緩衝液(80μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、2mM dNTP mix(80μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、25mM MgSO
4(48μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211)、50μM正向引子(4.8μL,序列識別號2)、10μM反向引子(24μL,序列識別號3)、KOD Plus聚合酶(16μL,東洋紡(股)型錄# KOD-211),在98℃保溫1分鐘後,將98℃、5秒、55℃、15秒、68℃、90秒實施20個循環,進而在68℃保溫1分鐘,將DNA增幅。反應後以Wizard SV凝膠和PCR純化系統(Promega型錄# A9281)精製模板DNA(序列識別號10)。
(2)利用體外轉錄之sec Tax變異體 mRNA-004之調製
將實施例4-(1)中所得之401.1μg/mL模板DNA(3.99μL)、100mM CleanCap AG(8μL,TriLink型錄# N-7113)、100mM ATP(8μL,Hongene型錄# R1331)、100mM GTP(8μL,Hongene型錄# R2331)、100mM CTP(8μL,Hongene型錄# R3331)、100mM N1-methylpseudoUTP(8μL,Hongene型錄# R5-027)、無核酸酶水(68.01μL,Thermo Fisher型錄# AM9937)、T7轉錄5×緩衝液(32μL,Promega型錄# P140X)、Enzyme mix,T7 RNA聚合酶(16μL,Promega型錄# P137X)混合,在37℃保溫4小時。混合RQ1無RNase之DNase(8μL,Promega型錄# M6101),在37℃保溫15分鐘。混合8M LiCl溶液(80μL,Sigma-Aldrich型錄# L7026),在-30℃靜置整夜。離心分離(4℃、5200×g、35分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、5200×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣溶解於無核酸酶水(500μL)後,使用RNeasy Midi kit(Qiagen型錄# 75144)而如附屬之手冊地進行精製。將所得之溶液(750μL)、rApid鹼性磷酸酶(Roche型錄# 04 898 141 001)之緩衝液(85μL)和酵素(32μL)混合,在37℃保溫30分鐘後,在75℃保溫2分鐘。將所得之溶液使用RNeasy Midi kit(Qiagen型錄# 75144)而如附屬之手冊地進行精製,以得到目的之mRNA。合計進行2次同樣的實驗操作,合併所得之mRNA溶液,而得到目的之mRNA。所得之mRNA具有序列識別號20之序列。
[實施例5]SU gp46 mRNA-005之調製
(1)SU gp46之體外轉錄(IVT)用模板DNA之製作
以與實施例1-(1)同樣的方法實施。
(2)利用體外轉錄之SU gp46 mRNA-005之調製
將實施例5-(1)中所得之339μg/mL模板DNA(89μL)、100mM CleanCap AG(150μL,TriLink型錄# T-7113)、100mM ATP(150μL,Hongene型錄# R1331)、100mM GTP(150μL,Hongene型錄# R2331)、100mM CTP(150μL,Hongene型錄# R3331)、100mM N1-甲基-假尿苷 5’-三磷酸(150μL,Hongene型錄# R5-027)、無核酸酶水(1261μL,Qiagen型錄# 129114)、T7轉錄5×緩衝液(600μL,Promega型錄# P140X)、Enzyme mix,T7 RNA聚合酶(300μL,Promega型錄# P137X)混合,在37℃保溫2小時。混合RQ1無RNase之DNase(30μL,Promega型錄# M6101),在37℃保溫15分鐘。混合8M LiCl溶液(1500μL,Sigma-Aldrich型錄# L7026),在-20℃靜置整夜。離心分離(4℃、5250×g、30分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、5250×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣溶解於無核酸酶水後,使用RNeasy Maxi kit(Qiagen型錄# 75162)而如附屬之手冊地進行精製。將所得之析出液(12mL,以UV換算為12.0mg)和無核酸酶水(120μL)、rApid鹼性磷酸酶(Roche型錄# 04 898 141 001)之緩衝液(1400μL)和酵素(480μL)混合,在37℃保溫30分鐘。在75℃保溫2分鐘之後,混合8M LiCl溶液(7000μL,Sigma-Aldrich型錄# L7026),在-20℃靜置整夜。離心分離(4℃、5250×g、30分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、5250×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣溶解於無核酸酶水(2mL)(以UV換算為9.9mg)。將所得之mRNA以逆相層析法(管柱:PLRP-S、4000Å、10μm、10×200mm (Agilent),緩衝液A:5%乙腈、 400mM乙酸三乙胺(pH7.0),緩衝液B:25%乙腈、400mM乙酸三乙胺(pH7.0),梯度 B%:27.5%~35%(20分鐘),流速:5mL/分鐘,溫度:80℃)分取精製。回收目的之餾分,藉由超過濾(Amicon Ultra-15(MWCO:30kDa))進行脫鹽處理(以UV換算為3.4mg)。
所得之mRNA具有序列識別號17之序列。藉由LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit(PerkinElmer型錄#CLS960010)進行分析,確認為目的之長度。
[實施例6]sec Tax變異體 mRNA-006之調製
(1)sec Tax變異體之體外轉錄(IVT)用模板DNA之製作
以與實施例4-(1)同樣的方法實施。
(2)利用體外轉錄之sec Tax變異體 mRNA-006之調製
將實施例6-(1)中所得之336μg/mL模板DNA(89μL)、100mM CleanCap AG(150μL,TriLink型錄# T-7113)、100mM ATP(150μL,Hongene型錄# R1331)、100mM GTP(150μL,Hongene型錄# R2331)、100mM CTP(150μL,Hongene型錄# R3331)、100mM N1-甲基-假尿苷 5’-三磷酸(150μL,Hongene型錄# R5-027)、無核酸酶水(1261μL,Qiagen型錄# 129114)、T7轉錄5×緩衝液(600μL,Promega型錄# P140X)、Enzyme mix,T7 RNA聚合酶(300μL,Promega型錄# P137X)混合,在37℃保溫2小時。混合RQ1無RNase之DNase(30μL,Promega型錄# M6101),在37℃保溫15分鐘。混合8M LiCl溶液(1500μL,Sigma-Aldrich型錄# L7026),在-20℃靜置整夜。離心分離(4℃、5250×g、30分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、5250×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣溶解於無核酸酶水後,使用RNeasy Maxi kit(Qiagen型錄# 75162)而如附屬之手冊地進行精製。將所得之析出液(12mL,以UV換算為12.6mg)和無核酸酶水(100μL)、rApid鹼性磷酸酶(Roche型錄# 04 898 141 001)之緩衝液(1400μL)和酵素(500μL)混合,在37℃保溫30分鐘。在75℃保溫2分鐘之後,混合8M LiCl溶液(7000μL,Sigma-Aldrich型錄# L7026),在-20℃靜置整夜。離心分離(4℃、5250×g、30分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、5250×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣溶解於無核酸酶水(2mL)(以UV換算為10.9mg)。將所得之mRNA以逆相層析法(管柱:PLRP-S、4000Å、10μm、10×200mm(Agilent),緩衝液A:5%乙腈、400mM乙酸三乙胺(pH7.0),緩衝液B:25%乙腈、400mM乙酸三乙胺(pH7.0),梯度 B%:27.5%~35%(20分鐘),流速:5mL/分鐘,溫度:80℃)分取精製。回收目的之餾分,藉由超過濾(Amicon Ultra-15(MWCO:30kDa))進行脫鹽處理(以UV換算為3.7mg)。
所得之mRNA具有序列識別號20之序列。藉由LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit(PerkinElmer型錄#CLS960010)進行分析,確認為目的之長度。
[實施例7]gp46-Fib mRNA-007之調製
(1)gp46-Fib之體外轉錄(IVT)用模板DNA之製作
以與實施例2-(1)同樣的方法實施。
(2)利用體外轉錄之gp46-Fib mRNA-007之調製
將實施例7-(1)中所得之397μg/mL模板DNA(63μL)、100mM CleanCap AG(50μL,TriLink型錄# T-7113)、100mM ATP(50μL,Hongene型錄# R1331)、100mM GTP(50μL,Hongene型錄# R2331)、100mM CTP(50μL,Hongene型錄# R3331)、100mM N1-甲基-假尿苷 5’-三磷酸(50μL,Hongene型錄# R5-027)、無核酸酶水(387μL,Qiagen型錄# 129114)、T7轉錄5×緩衝液(200μL,Promega型錄# P140X)、Enzyme mix,T7 RNA聚合酶(100μL,Promega型錄# P137X)混合,在37℃保溫4小時。混合RQ1無RNase之DNase(25μL,Promega型錄# M6101),在37℃保溫15分鐘。混合8M LiCl溶液(500μL,Sigma-Aldrich型錄# L7026),在-20℃靜置整夜。離心分離(4℃、5250×g、30分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、5250×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣溶解於無核酸酶水後,使用RNeasy Maxi kit(Qiagen型錄# 75162)而如附屬之手冊地進行精製。將所得之析出液(3mL,以UV換算為3.6mg)和無核酸酶水(332μL)、rApid鹼性磷酸酶(Roche型錄# 04 898 141 001)之緩衝液(450μL)和酵素(718μL)混合,在37℃保溫30分鐘。在75℃保溫2分鐘之後,使用RNeasy Maxi kit而如附屬之手冊地進行精製,以得到目的之mRNA(4mL,以UV換算為2.8mg)。
所得之mRNA具有序列識別號18之序列。藉由LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit(PerkinElmer型錄#CLS960010)進行分析,確認為目的之長度。
[實施例8]sec Tax變異體 mRNA-008之調製
(1)sec Tax變異體之體外轉錄(IVT)用模板DNA之製作
以與實施例4-(1)同樣的方法實施。
(2)利用體外轉錄之sec Tax變異體 mRNA-008之調製
將實施例8-(1)中所得之391μg/mL模板DNA(64μL)、100mM CleanCap AG(50μL,TriLink型錄# T-7113)、100mM ATP(50μL,Hongene型錄# R1331)、100mM GTP(50μL,Hongene型錄# R2331)、100mM CTP(50μL,Hongene型錄# R3331)、100mM N1-甲基-假尿苷 5’-三磷酸(50μL,Hongene型錄# R5-027)、無核酸酶水(386μL,Qiagen型錄# 129114)、T7轉錄5×緩衝液(200μL,Promega型錄# P140X)、Enzyme mix,T7 RNA聚合酶(100μL,Promega型錄# P137X)混合,在37℃保溫4小時。混合RQ1無RNase之DNase(25μL,Promega型錄# M6101),在37℃保溫15分鐘。混合8M LiCl溶液(500μL,Sigma-Aldrich型錄# L7026),在-20℃靜置整夜。離心分離(4℃、5250×g、30分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、5250×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣溶解於無核酸酶水後,使用RNeasy Maxi kit(Qiagen型錄# 75162)而如附屬之手冊地進行精製。將所得之析出液(3mL,以UV換算為3.5mg)和無核酸酶水(359μL)、rApid鹼性磷酸酶(Roche型錄# 04 898 141 001)之緩衝液(450μL)和酵素(691μL)混合,在37℃保溫30分鐘。在75℃保溫2分鐘之後,使用RNeasy Maxi kit而如附屬之手冊地進行精製,以得到目的之mRNA(4mL,以UV換算為2.8mg)。
所得之mRNA具有序列識別號20之序列。藉由LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit(PerkinElmer型錄#CLS960010)進行分析,確認為目的之長度。
[實施例9~24]使用實施例1~8記載之mRNA的封入mRNA的核酸脂質粒子之調製
(1)封入mRNA的核酸脂質粒子之調製
將二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine:以下標記為DSPC,NOF CORPORATION)、膽固醇(Cholesterol:以下標記為Chol,Sigma-Aldrich,Inc.)、二乙酸(7R,9Z,26Z,29R)-18-({[3-(二甲基胺基)丙氧基]羰基}氧基)三十五碳-9,26-二烯-7,29-二基酯(WO2015/005253的實施例23中記載之化合物)(以下標記為LP1)或乙酸(7R,9Z)-18-({[3-(二甲基胺基)丙基氧基]羰基}氧基)二十八碳-9-烯-7-基酯(WO2015/005253的實施例28中記載之化合物)(以下標記為LP2)、及聚乙二醇分子量為約2000的1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇,1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Methoxypolyethylene Glycol,以下標記為PEG-DMG,NOF CORPORATION,SUNBRIGHT GM-020),以表1記載之莫耳比溶解於乙醇,使總脂質濃度為5mM。
另一方面,將實施例1~8中得到的mRNA,以檸檬酸緩衝液(20mM檸檬酸鹽緩衝液,pH4.0)進行稀釋調製。
使用NanoAssemblr BenchTop(Precision Nanosystems Inc.),將上述之脂質溶液和mRNA溶液,以相對於mRNA之總脂質重量比為表1中記載之值且其體積比為1:3之方式,在微流道內混合,得到核酸脂質粒子之粗分散液。藉由將核酸脂質粒子之分散液以約25~50倍量的緩衝液透析 (Float-A-Lyzer G2,MWCO:1,000kD,Spectra/Por)12~18小時,而進行乙醇去除,得到經精製之封入mRNA的核酸脂質粒子之分散液。
此外,LP1係按照WO2015/005253的實施例23中記載之方法合成,LP2係按照WO2015/005253的實施例28中記載之方法合成。
(2)封入mRNA的核酸脂質粒子之特性評價
進行包含(1)中調製的核酸脂質粒子之分散液之特性評價。針對各個特性評價的方法進行說明。
(2-1)mRNA的封入率
mRNA的封入率係使用Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit(Invitrogen),按照附加文件來測定。
亦即,於0.015% Triton X-100界面活性劑存在下及不存在下,定量核酸脂質粒子之分散液中的mRNA,藉由下式而算出封入率。
{([於界面活性劑存在下的mRNA量]-[於界面活性劑不存在下的mRNA量])/[於界面活性劑存在下的mRNA量]}×100(%)
(2-2)mRNA與脂質之比率
以下述之任一者之方法測定核酸脂質粒子之分散液中的mRNA量。
以1.0% Triton X-100稀釋調製核酸脂質粒子分散液,以逆相層析法測定(系統:Agilent 1260系列,管柱:Bioshell A400 Protein C4(10cm×4.6mm,3.4μm)(SUPELCO),緩衝液A:0.1M乙酸三乙胺(pH7.0),緩衝液B:乙腈,(B%):5-50%(0-15分鐘),流速:1mL/分鐘,溫度:70℃,檢測:260nm)。
將核酸脂質粒子分散液稀釋溶解於90%甲醇,以紫外/可見光分光光度計(PerkinElmer公司製,LAMBDA(商標)465)測定核酸脂質粒子中的mRNA量。藉由下式而算出mRNA濃度。
{[260nm下之吸光度]-[350nm下之吸光度]}×40×稀釋倍率(μg/mL)
以逆相層析法測定核酸脂質粒子之分散液中的各脂質量(系統:DIONEX UltiMate 3000,管柱:XSelect CSH C18(130Å,3.5μm,3.0mm×150mm,) (Waters型錄# 186005263),緩衝液A:0.2%甲酸,緩衝液B:0.2%甲酸、甲醇,(B%):75-100%(0-6分鐘)、100%(6-15分鐘),流速:0.45mL/分鐘,溫度:50℃,檢測:Corona CAD(電荷氣膠偵測器,Charged Aerosol Detector))。
藉由下式而算出總脂質量對mRNA之比率。
[總脂質濃度]/[mRNA濃度](wt/wt)
(2-3)平均粒徑
核酸脂質粒子之粒徑可利用Zeta Potential/Particle Sizer NICOMPTM 380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)來測定。表中之平均粒徑表示體積平均粒徑,±以下表示偏差。
將特性評價的結果呈示於表2。
[表1]
實施例編號 | mRNA | DSPC | Chol | LP | PEG-DMG | 脂質/mRNA (wt/wt) |
實施例9 | 實施例1 | 12.5% | 41% | 45%(LP1) | 1.5% | 20 |
實施例10 | 實施例2 | 12.5% | 41% | 45%(LP1) | 1.5% | 20 |
實施例11 | 實施例3 | 12.5% | 41% | 45%(LPl) | 1.5% | 20 |
實施例12 | 實施例4 | 12.5% | 41% | 45%(LP1) | 1.5% | 20 |
實施例13 | 實施例5 | 12.5% | 41% | 45%(LP1) | 1.5% | 20 |
實施例14 | 實施例6 | 12.5% | 41% | 45%(LP1) | 1.5% | 20 |
實施例15 | 實施例7 | 17.5% | 26% | 55%(LP2) | 1.5% | 20 |
實施例16 | 實施例8 | 17.5% | 26% | 55%(LP2) | 1.5% | 20 |
實施例17 | 實施例7 | 22.5% | 21% | 55%(LP2) | 1.5% | 20 |
實施例18 | 實施例8 | 22.5% | 21% | 55%(LP2) | 1.5% | 20 |
實施例19 | 實施例7 | 17.5% | 21% | 60%(LP2) | 1.5% | 20 |
實施例20 | 實施例8 | 17.5% | 21% | 60%(LP2) | 1.5% | 20 |
實施例21 | 實施例7 | 22.5% | 16% | 60%(LP2) | 1.5% | 20 |
實施例22 | 實施例8 | 22.5% | 16% | 60%(LP2) | 1.5% | 20 |
實施例23 | 實施例7 | 12.5% | 41% | 45%(LP1) | 1.5% | 20 |
實施例24 | 實施例8 | 12.5% | 41% | 45%(LP1) | 1.5% | 20 |
[表2]
實施例編號 | 封入率 (%) | 粒徑 (nm) |
實施例9 | 97% | 126±39 |
實施例10 | 95% | 138±39 |
實施例11 | 96% | 133±49 |
實施例12 | 96% | 124±35 |
實施例13 | 97% | 111±37 |
實施例14 | 98% | 108±24 |
實施例15 | 99% | 135±41 |
實施例16 | 99% | 133±18 |
實施例17 | 97% | 138±17 |
實施例18 | 97% | 133±35 |
實施例19 | 99% | 123±48 |
實施例20 | 98% | 123±20 |
實施例21 | 96% | 127±42 |
實施例22 | 96% | 129±45 |
實施例23 | 99% | 133±49 |
實施例24 | 99% | 137±33 |
由以上結果明白了:此等核酸脂質粒子係mRNA的95%以上被封入脂質粒子內,具有約100nm至約140nm之平均粒徑。
(試驗例1)
LTR報導基因分析(reporter assay)用的質體構築
編碼HTLV-1 Tax野生型(Uniprot登記編號:P03409)、Tax變異型、及對Tax變異型加成IgE分泌訊息而成的分泌型Tax變異體之DNA,係在受託人之Eurofin合成。各自的DNA片段係插入pcDNA3.1+載體(Thermo Scientific Inc.)之NheI/NotI位點,進行選殖。又,編碼HIV-1 LTR及HTLV-1 LTR之DNA,係在受託人之Eurofin合成。各自的DNA片段係插入pGL4.17載體(Promega)之KpnI/XhoI位點,進行選殖。
HIV-1 LTR及HTLV-1 LTR報導基因分析
350 ng之表現Tax野生型、Tax變異型或分泌型Tax變異體之質體、100 ng之HIV-1 LTR報導質體或HTLV-1 LTR報導質體、以及50 ng之轉染效率校正用的pRG-RK質體(Promega)之合計500 ng的質體,對HEK293T細胞使用TransIT-LT1基因導入試藥(Takara)而進行轉染。於轉染起48小時後,使用Dual-Glo(註冊商標)螢光素酶分析系統(Promega),而測定螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase)表現量與水母螢光素酶(Renilla luciferase)表現量,算出螢火蟲螢光素酶表現量/水母螢光素酶表現量之比,而評價HIV-1 LTR及HTLV-1 LTR的轉錄活性。
(試驗例2)
對C3H小鼠之實施例12的投予
C3H/HeJJcl小鼠由日本CLEA取得並將其馴化。以2週間隔,將實施例12以5μg mRNA/20μL/小鼠對麻醉下之小鼠經消毒的小腿三頭肌進行投予。初次係對右腳進行投予,第2次係對左腳進行投予。對於脂質粒子的濃度調整及陰性對照群,係使用緩衝液。
血清與脾臟細胞之調製
於脂質粒子之初次投予起2週後及第2次投予起1週後,從麻醉下的小鼠進行採血。血液係在常溫靜置1小時以上,以3000 RPM離心10分鐘而將血清分離且回收。又,從在麻醉下放血死的小鼠採集脾臟。脾臟係使用細胞過濾器(Cell Strainer)(FALCON)的篩網和注射器(TERUMO)的墊片來磨碎,以RPMI 1640(nacalai tesque)調整為單細胞懸浮液(single cell suspention)之後,以離心回收細胞。廢棄上清液,使用DB Pharm Lyse Lysing buffer(BECTON DICKINSON)而進行紅血球的溶血處理。使離心分離後以RPMI 1640進行再懸浮之細胞懸浮液通過迷你細胞過濾器(mini Cell Strainers)(Hi-Tech股份有限公司、Cat.HT-AMS-14002)。於離心分離後廢棄上清液而將細胞再懸浮,測定細胞濃度。於離心分離後廢棄上清液而以細胞培養液(對RPMI 1640添加10%胎牛血清(去活化而通過過濾器、HyClone)、1% 青黴素-鏈黴素混合溶液(nacalai tesque)、1% 丙酮酸鈉(gibco)、1% MEM 非必需胺基酸(gibco)、1% HEPES緩衝溶液(gibco)、1% StemSure 單硫甘油溶液(FUJIFILM))調整細胞濃度。再者,離心係以1500 RPM在4℃進行5分鐘。
Tax特異性的CTL誘導水準
將經調整的小鼠脾臟細胞3×10
6個離心,廢棄上清液。反覆進行下述步驟2次:將細胞以1×杜貝克氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)(gibco)再懸浮,離心而廢棄上清液。然後,對細胞添加以1×PBS進行20倍稀釋之TruStain FcX抗體(BioLegend),使其在常溫靜置5分鐘。對各試樣添加5μL之H-2D
KHTLV-1 Tax38-46 Tetramer-ARLHTHALL-PE(MBL),以37℃、5%CO
2保溫15分鐘。於冰上,對試樣添加以最終濃度成為100倍稀釋的方式進行調整之APC/Fire(商標) 750抗小鼠CD3抗體(BioLegend)與抗-CD8(小鼠)mAb-FITC(MBL),在暗處靜置30分鐘。進行離心而廢棄上清液,以1×PBS清洗細胞2次。於最後將細胞以400μL PBS進行再懸浮,以FACSVerse(BD)檢出被標記的細胞,以FlowJo(確認)進行解析。再者,離心係以1500 RPM在4℃進行5分鐘。
小鼠血中抗Tax抗體效價
由於使用Tax(MYBiosource)重組蛋白質作為固相化抗原,因此添加於96孔平底盤,在4℃靜置一晩。標準曲線稀釋系列,係將小鼠IgG(SouthernBiotech)由最高濃度0.25μg/mL以3倍稀釋進行7階段製作。清洗各孔,添加阻斷溶液而於常溫靜置1小時。血清試樣係使用阻斷溶液,而由最高濃度的100倍稀釋以4倍稀釋進行7階段製作。清洗經阻斷之盤,對盤添加經稀釋的試料,在常溫靜置1小時。將檢出抗體、山羊抗-小鼠IgG、人類ads-HRP(SouthernBiotech)以阻斷溶液稀釋為3000倍,對經清洗之孔添加。於1小時後進行清洗,添加TMB Microwell Peroxidase Substrate System(TMB微孔過氧化酶基質系統) (seracare)而靜置2~3分鐘,使用TMB停止溶液(KPL,Cat.51500-0021)將反應停止。於解析使用以盤分析儀(plate reader)由450nm的吸光度減去540nm的吸光度之校正吸光度,算出抗gp46抗體效價與抗Tax抗體效價。再者,阻斷溶液為添加1% 牛血清白蛋白(Sigma)及0.05% Tween(BIO-RAD)的1×杜貝克氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(gibco),清洗係以添加0.05%之Tween的1×杜貝克氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水((10X) gibco)進行3次。
(試驗例3~試驗例5)
對食蟹猴之投予
1次/2週,合計4次對猴的上臂部投予實施例13及實施例14的脂質粒子。初次投予係對右上臂部進行投予,然後左右交互地進行投予。脂質粒子投予量,係將實施例13與實施例14各自各25μg mRNA等量混合,每1次投予50μg mRNA/200μL/body。
(試驗例3)
猴血中抗gp46及Tax抗體效價
將重組gp46蛋白質(RayBiotech)及重組Tax蛋白質(MY Biosource)添加於96孔盤,在4℃進行固相化一晩。然後,使用盤清洗儀(以含有0.05% Tween 20之PBS清洗液進行3次)進行清洗,添加阻斷溶液(含有1% BSA、0.05% Tween 20之 PBS)而進行阻斷。猴血漿試料稀釋系列,係使用阻斷溶液,而由最高濃度的100倍稀釋血清,以4倍稀釋進行7階段製作。猴IgG濃度之標準曲線稀釋系列,係將猴IgG溶液(製造商)以阻斷溶液由最高濃度的0.25μg/mL,以3倍稀釋進行8階段製作。添加試料稀釋溶液及標準曲線稀釋溶液,在室溫靜置1小時後,以盤清洗儀進行清洗。檢出抗體係將HRP標記抗猴IgG抗體(Sigma-Aldrich)以阻斷溶液進行4000倍稀釋而添加於盤後,在室溫靜置1小時。以盤清洗儀進行清洗之後,添加TMB Microwell Peroxidase Substrate System(SERACARE Life Sciences),靜置10分鐘。於反應停止液,係使用TMB停止溶液(SERACARE Life Sciences)。使用盤分析儀而測定波長450nm(對照波長540nm)的吸光度,將由以450nm測定的吸光度減去以540nm測定的吸光度之校正吸光度(Delta)用於解析。由標準曲線之猴IgG濃度及Delta,使用Nonlinear Regression:4 Parameter而作成檢量線。由檢量線、測定試料之稀釋倍率、及Delta算出試料的抗gp46及Tax抗體濃度。
(試驗例4)
猴中的gp46及Tax特異性細胞性免疫反應
將從猴周邊血液使用Ficoll(Cytiva)而分離之PBMC以RPMI完全培養基(10% FBS [Sigma-Aldrich]、1% PS [青黴素-鏈黴素混合溶液、Nacalai Tesque]、1mM 丙酮酸鈉[Thermo Fisher Scientific]、10mM HEPES[Thermo Fisher Scientific]、1×StemSure[FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation]、1×MEM 非必需胺基酸溶液[Thermo Fisher Scientific])調製為2×10
6個細胞/mL,以100μL/孔接種於IFN-γ ELISpot plate(MABTech)。然後,以100μL/孔添加以RPMI完全培養基調製為最終濃度0.1%(v/v)的Tax表位肽池(Eurofins)或調製為1μg/mL的gp46重組蛋白質(RayBiotech),在37℃、5% CO
2之條件下培養48小時。抗原特異性IFN-γ產生細胞,係使用猴IFN-γ ELISpot
PLUSkit(HRP)(MABTech)而檢出。抗原特異性IFN-γ產生細胞數係使用ELISPOT分析儀(CTL)進行測定。
(試驗例5)
猴血中抗HTLV-1中和活性
使用Spin column based抗體純化套組(Cosmo Bio),而從於第4次投予起2週後所採集、調製之猴血漿精製總IgG。對為HTLV-1感染細胞之YT#1細胞株添加精製IgG,接著將為HTLV-1非感染細胞株的CEM細胞以YT#1細胞比一定1:1之比例進行混合,對其共培養系添加患者血清,然後測定鏡檢一晩培養後的合胞體形成之有無率。
(試驗例6)
小鼠血中gp46特異性總IgG抗體效價
由於使用gp46(Ray Biotech Inc.)重組蛋白質作為固相化抗原,因此添加於96孔平底盤,在4℃靜置一晩。標準曲線稀釋系列係將小鼠IgG(SouthernBiotech)由最高濃度0.25μg/mL以3倍稀釋進行7階段製作。清洗各孔,添加阻斷溶液而於常溫靜置1小時。血清試樣係使用阻斷溶液,而由最高濃度的100倍稀釋以4倍稀釋進行7階段製作。清洗經阻斷之盤,對盤添加經稀釋的試料,在常溫靜置1小時。將檢出抗體、山羊抗-小鼠IgG、人類ads-HRP(SouthernBiotech)以阻斷溶液稀釋為3000倍,對經清洗之孔添加。於1小時後進行清洗,添加TMB Microwell Peroxidase Substrate System(seracare)而靜置2~3分鐘,使用TMB停止溶液(KPL,Cat.51500-0021)將反應停止。於解析使用以盤分析儀由450nm的吸光度減去540nm的吸光度之校正吸光度,算出抗gp46抗體效價與抗Tax抗體效價。再者,阻斷溶液為添加1% 牛血清白蛋白(Sigma)及0.05% Tween(BIO-RAD)的1×杜貝克氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(gibco),清洗係以添加0.05%之Tween的1×杜貝克氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水((10X)gibco)進行3次。
(試驗例7)
小鼠中的gp46及Tax特異性細胞性免疫反應
將經調整的小鼠脾臟細胞10
6個/孔接種於96孔U底盤(FALCON),以最終濃度以成為10μg/mL之方式調整的gp46及Tax pooled peptide(Tax混合肽)(Eurofins)於37℃、5%CO
2下進行刺激。於24小時後回收培養上清液,如套組之計畫書所述進行IFN-γ(R&D Systems)與IL-2(R&D Systems)產生之測定。
(試驗例8)
蛋白質表現解析
對CHO-S細胞(Thermo Fisher Scientific)添加實施例9、10、11、12,使培養中的mRNA濃度成為3μg/mL。於添加起72小時後回收培養上清液與細胞沈澱物。細胞沈澱物係加入M-PER(商標) Tissue Protein Extraction Reagent(Thermo Scientific)而以Vortex(振盪)充分混合,並靜置於常溫10分鐘。再度,進行Vortex而混合,於離心分離後(3000 RPM、4℃、10分鐘)回收細胞溶解液。培養上清液中及細胞溶解液中的gp46蛋白質,係使用西方印漬術(Western blotting)法而檢出。
(試驗例1的結果)
以HIV-1 LTR及HTLV-1 LTR的轉錄活性作為指標的Tax抗原設計之選拔
評價Tax野生型、Tax變異型、及分泌型Tax變異體所致HIV-1 LTR轉錄活性及HTLV-1 LTR轉錄活性(圖1)。其結果,與Tax野生型比較,而 Tax變異型被認為有HIV-1 LTR轉錄活性及HTLV-1 LTR轉錄活性的降低。又,分泌型Tax變異體顯示了與陰性對照同等的HIV-1 LTR轉錄活性及HTLV-1 LTR轉錄活性。由以上結果暗示: HIV-1 LTR轉錄活性及HTLV-1 LTR轉錄活性最低的分泌型Tax變異體為致癌性最低的疫苗抗原候選。
(試驗例2的結果)
實施例12所致CTL誘導水準及血中抗Tax抗體效價
評價經投予實施例12之C3H小鼠中的CTL誘導水準(圖2)。其結果,藉由實施例12,而誘導出Tax特異性CTL及血中抗Tax抗體反應。
(試驗例3的結果)
猴血中抗gp46及Tax抗體效價
評價由將實施例13及實施例14進行等量混合而成之脂質粒子製劑所誘導的血中抗gp46抗體反應及血中抗Tax抗體反應(圖3)。其結果,與投予前(0W)比較,2次投予後(4W)及3次投予後(6W)係血中抗gp46抗體效價及抗Tax抗體效價高。
(試驗例4的結果)
猴PBMC中的gp46及Tax特異性的IFN-γ產生細胞水準
評價由實施例13及實施例14之混合製劑所誘導的血中抗gp46抗體反應及血中抗Tax抗體反應(圖4)。使用於第4次投予起7週後所採集、調製之PBMC進行研討的結果,實施例5及實施例6之混合製劑群被認為有gp46特異性及Tax特異性的IFN-γ產生細胞之誘導。
(試驗例5的結果)
猴血中抗HTLV-1中和活性
評價由實施例13及實施例14之混合製劑所誘導的血中抗HTLV-1中和活性(圖5)。使用於第4次投予起2週後所採集、精製之血中總IgG進行研討的結果,與陰性對照群比較,而認為在脂質粒子投予群的4隻中3隻有血中抗HTLV-1中和活性。
(試驗例6的結果)
小鼠血中抗gp46抗體效價
評價由實施例9、實施例10、實施例11或實施例12的脂質粒子之投予所誘導的血中抗gp46抗體反應(圖6)。其結果,與陰性對照群比較,在實施例9群、實施例10群、及實施例11群,被認為有高的血中抗gp46抗體反應。
(試驗例7的結果)
C57BL/6小鼠中的gp46特異性及Tax特異性的細胞性免疫反應
以IFN-γ產生水準及IL-2產生水準作為指標,而評價由實施例9、實施例10、實施例11、或實施例12的脂質粒子之投予所誘導的gp46特異性及IL-2特異性細胞性免疫(圖7)。其結果,與陰性對照群比較,在實施例9群、實施例10群、及實施例11群,被認為有高的gp46特異性的細胞性免疫反應。又,與陰性對照群比較,在實施例12群,被認為有高的Tax特異性的細胞性免疫反應。
(試驗例8的結果)
實施例9至實施例12的脂質粒子所致抗原蛋白質的表現水準
評價以實施例9至實施例12處理之CHO-S細胞的培養上清液中及細胞溶解液中的各脂質粒子所表現之抗原蛋白質的表現水準(圖8)。其結果,認為有各脂質粒子所表現之抗gp46抗體會結合之抗原蛋白質的表現。再者,gp46蛋白質為39 kDa。
[實施例25~29]gp46-Fib mRNA之調製
(1)gp46-Fib之體外轉錄(IVT)用模板DNA之製作
為了製作用於體外轉錄(IVT)之模板DNA,而構築質體。製作導入了包含T7啟動子序列、人類β-球蛋白之5’-UTR序列、KOZAK序列、gp46-Fib之轉譯區、人類β-球蛋白之3’-UTR序列及polyA序列依序連結而成之序列的DNA片段(序列識別號21~25)之質體(分別使用導入了序列識別號21~25的DNA片段之質體來實施實施例25~29。)。
(2)模板DNA之線性化
對溶解了(1)中所得之質體(300μg)的無核酸酶水(268μL)加入10×NE緩衝液 3.1、BspQI(32μL,New England Biolabs型錄# R0712L),在50℃保溫16小時後,在80℃保溫20分鐘。將乙醇(900μL)、3 莫耳/L乙酸鈉溶液(30μL)混合,在-80℃靜置4小時。離心分離(4℃、15000×g、30分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、15000×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣以無核酸酶水調製為500μg/mL之溶液。
(3)利用體外轉錄之gp46-Fib mRNA之調製
將(2)中所得之500μg/mL模板DNA(15μL)、100mM CleanCap AG(15μL,TriLink型錄# N-7113)、100mM ATP(15μL,Hongene型錄# R1331)、100mM GTP(15μL,Hongene型錄# R2331)、100mM 5-Me-CTP(15μL,Hongene型錄# R3-029)、100mM 5-Me-UTP(15μL,Hongene型錄# R5-104)、無核酸酶水(113μL)、5×IVT緩衝液(60μL,400mM HEPES-KOH pH7.5、400mM DTT、120mM MgCl
2、10mM Spermidine)、T7 RNA聚合酶(15μL,Promega型錄# P407X)、RNase抑制劑(15μL,Promega型錄# P261X)、焦磷酸酶(7.5μL,Hongene型錄# ON-025)混合,在37℃保溫4小時。混合RQ1無RNase之DNase(7.5μL,Promega型錄# M6101),在37℃保溫30分鐘。混合10M乙酸銨溶液(100μL,),在-20℃靜置2小時。離心分離(4℃、15000×g、30分鐘)後,廢棄上澄液,加入70%乙醇,離心分離(4℃、15000×g、10分鐘)後,廢棄上澄液並風乾。將所得之殘渣溶解於無核酸酶水,以NucleoSpin(Macherey-Nagel型錄# 740948.50)精製,得到目的之mRNA。
所得之mRNA具有序列識別號31~35之序列,於5’末端有cap1結構,胞苷及尿苷分別經5-甲基胞苷及5-甲基尿苷所取代者。藉由LabChip GX Touch Standard RNA Reagent Kit(PerkinElmer型錄#CLS960010)進行分析,確認為目的之長度。
[實施例30~34]封入有實施例25~29中所得之mRNA的核酸脂質粒子之調製
(1)封入mRNA的核酸脂質粒子之調製
分別使用實施例25~29中所得之mRNA取代實施例1~8中記載之mRNA,以與實施例9~24同樣的方法調製表3中記載之核酸脂質粒子。
(2)封入mRNA的核酸脂質粒子之特性評價
以與實施例9~24同樣的方法,實施核酸脂質之特性評價,且將結果呈示於表4。
[表3]
實施例編號 | mRNA | DSPC | Chol | LP | PEG-DMG | 脂質/mRNA (wt/wt) |
實施例30 | 實施例25 | 17.5% | 21% | 60%(LP2) | 1.5% | 25 |
實施例31 | 實施例26 | 17.5% | 21% | 60%(LP2) | 1.5% | 25 |
實施例32 | 實施例27 | 17.5% | 21% | 60%(LP2) | 1.5% | 25 |
實施例33 | 實施例28 | 17.5% | 21% | 60%(LP2) | 1.5% | 25 |
實施例34 | 實施例29 | 17.5% | 21% | 60%(LP2) | 1.5% | 25 |
[表4]
實施例編號 | 封入率 (%) | 粒徑 (nm) |
實施例30 | 95% | 107±13 |
實施例31 | 96% | 130±28 |
實施例32 | 96% | 111±22 |
實施例33 | 96% | 103±16 |
實施例34 | 96% | 108±13 |
(試驗例9)
gp46蛋白質表現解析
對CHO-S細胞(Thermo Fisher Scientific)添加實施例30~34,使培養基中的mRNA濃度成為3μg/mL。又,作為陰性對照,而添加與實施例35~39的粒子之添加液量等量的緩衝液。於添加起3日後回收培養上清液。培養上清液中的gp46蛋白質,係於96 孔半區盤(96 half well plate)將以D-PBS稀釋成10倍的培養上清液固相化,藉由使用經投予實施例10之小鼠之血清的Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)法而檢出。
(試驗例9的結果)
實施例30~34之gp46表現誘導能力
評價以實施例30~34處理之CHO-S細胞的培養上清液中的gp46蛋白質表現水準。其結果,以實施例30~34處理之CHO-S細胞表現gp46蛋白質(圖28)。
[產業上利用之可能性]
本發明可利用於HTLV-1所導致的感染之預防及/或治療。
[序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1:SU gp46 IVT用模板質體DNA的核苷酸序列
序列識別號2:正向引子的核苷酸序列
序列識別號3:反向引子的核苷酸序列
序列識別號4:SU gp46之體外轉錄(IVT)用模板DNA的核苷酸序列
序列識別號5:HTLV-I gp46-Fib IVT用模板質體DNA的核苷酸序列
序列識別號6:gp46-Fib之體外轉錄(IVT)用模板DNA的核苷酸序列
序列識別號7:HTLV-I dgp62-Fib IVT用模板質體DNA的核苷酸序列
序列識別號8:dgp62-Fib之體外轉錄(IVT)用模板DNA的核苷酸序列
序列識別號9:HTLV-I sec Tax變異體 IVT用模板質體DNA的核苷酸序列
序列識別號10:sec Tax變異體之體外轉錄(IVT)用模板DNA的核苷酸序列
序列識別號11:Tax野生型的胺基酸序列
序列識別號12:Tax變異型(T130A/L131S/L319R/ L320S) 的胺基酸序列
序列識別號13:分泌型Tax變異體(T130A/L131S/ L319R/L320S)的胺基酸序列
序列識別號14:gp46的胺基酸序列
序列識別號15:gp46-Fib的胺基酸序列
序列識別號16:dgp62-Fib的胺基酸序列
序列識別號17:SU gp46 mRNA
序列識別號18:gp46-Fib mRNA
序列識別號19:dgp62-Fib mRNA
序列識別號20:sec Tax變異體 mRNA
序列識別號21:gp46-Fib之模板DNA的核苷酸序列 polyA95
序列識別號22:gp46-Fib之模板DNA的核苷酸序列 polyA80
序列識別號23:gp46-Fib之模板DNA的核苷酸序列 polyA60
序列識別號24:gp46-Fib之模板DNA的核苷酸序列 polyA40
序列識別號25:gp46-Fib之模板DNA的核苷酸序列 polyA20
序列識別號26:sec Tax變異體之模板DNA的核苷酸序列 polyA95
序列識別號27:sec Tax變異體之模板DNA的核苷酸序列 polyA80
序列識別號28:sec Tax變異體之模板DNA的核苷酸序列 polyA60
序列識別號29:sec Tax變異體之模板DNA的核苷酸序列 polyA40
序列識別號30:sec Tax變異體之模板DNA的核苷酸序列 polyA20
序列識別號31:gp46-Fib之mRNA序列 polyA95
序列識別號32:gp46-Fib之mRNA序列 polyA80
序列識別號33:gp46-Fib之mRNA序列 polyA60
序列識別號34:gp46-Fib之mRNA序列 polyA40
序列識別號35:gp46-Fib之mRNA序列 polyA20
序列識別號36:sec Tax變異體之mRNA序列 polyA95
序列識別號37:sec Tax變異體之mRNA序列 polyA80
序列識別號38:sec Tax變異體之mRNA序列 polyA60
序列識別號39:sec Tax變異體之mRNA序列 polyA40
序列識別號40:sec Tax變異體之mRNA序列 polyA20
本說明書中所引用的全部的出版物、專利及專利申請,係直接藉由引用而被編入本說明書中。
無
圖1為呈示Tax野生型、Tax變異型、及分泌型Tax變異體所致HIV-1 LTR轉錄活性(A)及HTLV-1 LTR轉錄活性(B)之圖。pHIV-1 LTR表示HIV-1 LTR報導質體(reporter plasmid)投予群,pHTLV-1 LTR表示HTLV-1 LTR報導質體投予群,Empty表示為陰性對照群之pcDNA3.1+載體。以三份(Triplicate)實施,直條表示平均值,誤差線表示SD。長條圖上的白圓圈表示三份各自的數據。Tax WT:Tax野生型、Tax Mut:Tax變異型、Sec-Tax Mut:分泌型Tax變異體。
圖2為呈示經投予實施例12之脂質粒子之C3H小鼠中的Tax特異性的CTL誘導水準及血中抗Tax抗體效價之圖。圖2A呈示Tax特異性的CTL誘導水準、圖2B呈示血中抗Tax抗體效價。
圖3為呈示猴血中抗gp46抗體效價及血中抗Tax抗體效價之圖。圖3A呈示血中抗gp46特異性抗體效價,圖3B呈示血中抗Tax抗體效價。1群4隻。0W、2W、4W、或6W分別表示在投予前、初次投予後起2週後、4週後(第2次投予起2週後)、6週後(第3次投予起2週後)之各時點的數據。線表示平均值,白圓圈表示各自的數據。
圖4為呈示gp46特異性及Tax特異性細胞性免疫反應之圖。1群4隻。直條表示平均值,誤差線表示SD。長條圖上的白圓圈表示各自的數據。
圖5為呈示猴血中抗HTLV-1中和活性之圖。分析法陰性對照呈示無抗體處理之結果,分析法陽性對照呈示以既知的HTLV-1中和抗體處理之結果。1群4隻。#736、#741、#743、#737表示陰性對照群的猴個體ID,#745、#742、#740、#735表示實施例5與實施例6之混合製劑投予群的猴個體ID。箭頭表示合胞體形成(syncytial formation)。
圖6為呈示C57BL/6小鼠中的血中抗gp46抗體效價之圖。
圖7為呈示C57BL/6小鼠中的gp46特異性及Tax特異性的細胞性免疫反應之圖。圖7A呈示IFN-γ產生水準,圖7B呈示IL-2產生水準。
圖8為呈示以實施例9至實施例12的脂質粒子處理之CHO-S細胞中的gp46及Tax蛋白質表現水準之圖。圖8A呈示細胞溶解液中的表現水準,圖8B呈示培養上清液中的表現水準。
圖9為呈示HTLV-I SU gp46 IVT用模板質體DNA的核苷酸序列(序列識別號1)之圖。
圖10為呈示正向引子(序列識別號2)及反向引子(序列識別號3)的核苷酸序列之圖。
圖11為呈示SU gp46之體外轉錄(IVT,in vitro transcription)用模板DNA的核苷酸序列(序列識別號4)之圖。
圖12為呈示HTLV-I gp46-Fib IVT用模板質體DNA的核苷酸序列(序列識別號5)之圖。
圖13為呈示gp46-Fib之體外轉錄(IVT)用模板DNA的核苷酸序列(序列識別號6)之圖。
圖14為呈示HTLV-I dgp62-Fib IVT用模板質體DNA的核苷酸序列(序列識別號7)之圖。
圖15為呈示dgp62-Fib之體外轉錄(IVT)用模板DNA的核苷酸序列(序列識別號8)之圖。
圖16為呈示HTLV-I sec Tax變異體 IVT用模板質體DNA的核苷酸序列(序列識別號9)之圖。
圖17為呈示sec Tax變異體之體外轉錄(IVT)用模板DNA的核苷酸序列(序列識別號10)之圖。
圖18為呈示Tax野生型的胺基酸序列(序列識別號11)之圖。
圖19為呈示Tax變異型(T130A/L131S/L319R/ L320S)的胺基酸序列(序列識別號12)之圖。
圖20為呈示分泌型Tax變異體(T130A/L131S/ L319R/L320S)的胺基酸序列(序列識別號13)之圖。
圖21為呈示gp46的胺基酸序列(序列識別號14)之圖。
圖22為呈示gp46-Fib的胺基酸序列(序列識別號15)之圖。
圖23為呈示dgp62-Fib的胺基酸序列(序列識別號16)之圖。
圖24為呈示SU gp46 mRNA的核苷酸序列(序列識別號17)之圖。
圖25為呈示gp46-Fib mRNA的核苷酸序列(序列識別號18)之圖。
圖26為呈示dgp62-Fib mRNA的核苷酸序列(序列識別號19)之圖。
圖27為呈示sec Tax變異體 mRNA的核苷酸序列(序列識別號20)之圖。
圖28為呈示以實施例30~34處理之CHO-S細胞中的gp46蛋白質表現水準之圖。虛線表示為陰性對照之緩衝液的OD值。
圖29為呈示gp46-Fib之模板DNA的核苷酸序列 polyA95(序列識別號21)之圖。
圖30為呈示gp46-Fib之模板DNA的核苷酸序列 polyA80(序列識別號22)之圖。
圖31為呈示gp46-Fib之模板DNA的核苷酸序列 polyA60(序列識別號23)之圖。
圖32為呈示gp46-Fib之模板DNA的核苷酸序列 polyA40(序列識別號24)之圖。
圖33為呈示gp46-Fib之模板DNA的核苷酸序列 polyA20(序列識別號25)之圖。
圖34為呈示sec Tax變異體之模板DNA的核苷酸序列 polyA95(序列識別號26)之圖。
圖35為呈示sec Tax變異體之模板DNA的核苷酸序列 polyA80(序列識別號27)之圖。
圖36為呈示sec Tax變異體之模板DNA的核苷酸序列 polyA60(序列識別號28)之圖。
圖37為呈示sec Tax變異體之模板DNA的核苷酸序列 polyA40(序列識別號29)之圖。
圖38為呈示sec Tax變異體之模板DNA的核苷酸序列 polyA20(序列識別號30)之圖。
圖39為呈示gp46-Fib之mRNA序列 polyA95(序列識別號31)之圖。
圖40為呈示gp46-Fib之mRNA序列 polyA80(序列識別號32)之圖。
圖41為呈示gp46-Fib之mRNA序列 polyA60(序列識別號33)之圖。
圖42為呈示gp46-Fib之mRNA序列 polyA40(序列識別號34)之圖。
圖43為呈示gp46-Fib之mRNA序列 polyA20(序列識別號35)之圖。
圖44為呈示sec Tax變異體之mRNA序列 polyA95(序列識別號36)之圖。
圖45為呈示sec Tax變異體之mRNA序列 polyA80(序列識別號37)之圖。
圖46為呈示sec Tax變異體之mRNA序列 polyA60(序列識別號38)之圖。
圖47為呈示sec Tax變異體之mRNA序列 polyA40(序列識別號39)之圖。
圖48為呈示sec Tax變異體之mRNA序列 polyA20(序列識別號40)之圖。
無。
Claims (57)
- 如請求項1之粒子,其中通式(Ia)中的R 1及R 2皆為甲基。
- 如請求項1或2之粒子,其中通式(Ia)中的p為3。
- 如請求項1至3中任一項之粒子,其中通式(Ia)中的L 1為可具有1或複數個乙醯氧基之C 17-C 19烯基。
- 如請求項1至4中任一項之粒子,其中通式(Ia)中的L 2為可具有1或複數個乙醯氧基之C 10-C 12烷基、或可具有1或複數個乙醯氧基之C 10-C 19烯基。
- 如請求項1至4中任一項之粒子,其中通式(Ia)中的L 2為可具有1或複數個乙醯氧基之C 10-C 12烷基、或可具有1或複數個乙醯氧基之C 17-C 19烯基。
- 如請求項1至6中任一項之粒子,其中通式(Ia)中的L 1為(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基、順式-8-十七碳烯基、或(8Z,11Z)-十七碳二烯基。
- 如請求項1至7中任一項之粒子,其中通式(Ia)中的L 2為癸基、順式-7-癸烯基、十二烷基、或(R)-11-乙醯氧基-順式-8-十七碳烯基。
- 如請求項9或10之粒子,其中脂質進一步包含兩親媒性脂質、固醇類及PEG脂質。
- 如請求項11之粒子,其中脂質進一步包含兩親媒性脂質、固醇類及PEG脂質。
- 如請求項12之粒子,其中兩親媒性脂質為由包含二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼及二油醯基磷酯醯乙醇胺之群組所選出的至少1個。
- 如請求項13之粒子,其中兩親媒性脂質為由包含二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼及二油醯基磷酯醯乙醇胺之群組所選出的至少1個。
- 如請求項12或14之粒子,其中固醇類為膽固醇。
- 如請求項13或15之粒子,其中固醇類為膽固醇。
- 如請求項12、14、16中任一項之粒子,其中PEG脂質為1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇及/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺。
- 如請求項13、15、17中任一項之粒子,其中PEG脂質為1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇及/或N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺。
- 如請求項12至19中任一項之粒子,其中兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為5~25%、固醇類為10~55%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~5%。
- 如請求項20之粒子,其中兩親媒性脂質為10~25%。
- 如請求項12、14、16、18中任一項之粒子,其中兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為5~15%、固醇類為35~50%、陽離子性脂質為40~55%、PEG脂質為1~3%。
- 如請求項22之粒子,其中兩親媒性脂質為10~15%、固醇類為35~45%、陽離子性脂質為40~50%、PEG脂質為1~2.5%。
- 如請求項23之粒子,其中PEG脂質為1~2%。
- 如請求項13、15、17、19中任一項之粒子,其中兩親媒性脂質、固醇類、陽離子性脂質、及PEG脂質之脂質組成以莫耳量計,兩親媒性脂質為10~25%、固醇類為10~50%、陽離子性脂質為40~65%、PEG脂質為1~3%。
- 如請求項25之粒子,其中固醇類為10~45%、陽離子性脂質為42.5~65%、PEG脂質為1~2.5%。
- 如請求項26之粒子,其中PEG脂質為1~2%。
- 如請求項20至27中任一項之粒子,其中總脂質重量對核酸重量之比率為15~30。
- 如請求項28之粒子,其中總脂質重量對核酸重量之比率為15~25。
- 如請求項29之粒子,其中總脂質重量對核酸重量之比率為17.5~22.5。
- 如請求項1至30中任一項之粒子,其中人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原為與寡聚化結構域(domain)之融合蛋白質。
- 如請求項31之粒子,其中寡聚化結構域為纖維蛋白(fibritin)。
- 如請求項31或32之粒子,其中人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原包含與序列識別號14的胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列。
- 如請求項1至33中任一項之粒子,其中人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原,係相對於序列識別號11的胺基酸序列而具有由包含T130A、L131S、L319R及L320S之群組所選出的變異的至少1個,且比較該變異胺基酸以外的胺基酸序列之情形,包含與序列識別號11的胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列。
- 如請求項34之粒子,其中人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原,係相對於序列識別號11的胺基酸序列而具有T130A、L131S、L319R及L320S之變異,且比較該變異胺基酸以外的胺基酸序列之情形,包含與序列識別號11的胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列。
- 如請求項1至35中任一項之粒子,其中人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原為與訊息肽之融合蛋白質。
- 如請求項36之粒子,其中訊息肽為包含序列識別號13之胺基酸序列的第1個~第18個之胺基酸序列之肽。
- 如請求項31至37中任一項之粒子,其中可使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原表現之核酸為包含帽結構(Cap)、5’非轉譯區(5’-UTR)、gp46抗原或Tax抗原之轉譯區、3’非轉譯區(3’-UTR)及多腺苷酸尾部(polyA)的mRNA。
- 如請求項38之粒子,其中可使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原表現之核酸之序列包含與序列識別號17或18之序列具有至少90%之同一性的核苷酸序列。
- 如請求項38之粒子,其中可使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax抗原表現之核酸之序列包含與序列識別號20之序列具有至少90%之同一性的核苷酸序列。
- 如請求項1至40中任一項之粒子,其中核酸包含至少1個修飾核苷酸。
- 如請求項41之粒子,其中修飾核苷酸包含5位經取代之嘧啶核苷酸及/或1位可取代之假尿苷的至少1個。
- 如請求項41之粒子,其中修飾核苷酸包含選自包含5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿苷、及1-烷基假尿苷之群組的至少1個。
- 如請求項41之粒子,其中修飾核苷酸包含選自包含5-甲基胞苷、5-甲基尿苷、及1-甲基假尿苷之群組的至少1個。
- 如請求項1至44中任一項之粒子,其平均粒徑為30~300nm。
- 一種如請求項1至45中任一項之粒子之用途,係用以製造用以預防及/或治療人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)所導致的感染之組成物。
- 一種組成物,其含有如請求項1至45中任一項之粒子。
- 如請求項47之組成物,其用以使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原在體內或體外表現。
- 如請求項47或48之組成物,其作為醫藥使用。
- 如請求項49之組成物,其用以誘導對人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的免疫反應。
- 如請求項49或50之組成物,其用以預防及/或治療人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染。
- 如請求項49或50之組成物,其用以對於HTLV-1感染者,預防及/或治療起因於由包含成人T細胞白血病-淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相關脊髓病(HAM)及HTLV-1葡萄膜炎(HU)之群組所選出的HTLV-1之疾病的發病。
- 一種使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原在體外表現之方法,其包含將如請求項47至50中任一項之組成物導入細胞。
- 一種使人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的gp46抗原或Tax抗原在體內表現之方法,其包含對哺乳動物投予如請求項47至51中任一項之組成物。
- 一種誘導對人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的免疫反應之方法,其包含對哺乳動物投予如請求項49或50之組成物。
- 一種預防及/或治療人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染之方法,其包含對哺乳動物投予如請求項49至52中任一項之組成物。
- 一種預防及/或治療起因於由包含成人T細胞白血病-淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相關脊髓病(HAM)及HTLV-1葡萄膜炎(HU)之群組所選出的HTLV-1之疾病的發病之方法,其包含對哺乳動物投予如請求項49至52中任一項之組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021084942 | 2021-05-19 | ||
JP2021-084942 | 2021-05-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202313102A true TW202313102A (zh) | 2023-04-01 |
Family
ID=84141637
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW111118482A TW202313102A (zh) | 2021-05-19 | 2022-05-18 | Htlv-1核酸脂質粒子疫苗 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4342491A1 (zh) |
JP (1) | JPWO2022244801A1 (zh) |
KR (1) | KR20240009944A (zh) |
CN (1) | CN117320746A (zh) |
TW (1) | TW202313102A (zh) |
WO (1) | WO2022244801A1 (zh) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102006051516A1 (de) * | 2006-10-31 | 2008-05-08 | Curevac Gmbh | (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins |
TW201534578A (zh) | 2013-07-08 | 2015-09-16 | Daiichi Sankyo Co Ltd | 新穎脂質 |
HRP20220070T1 (hr) | 2014-04-23 | 2022-04-01 | Modernatx, Inc. | Cjepiva nukleinske kiseline |
JP2021084942A (ja) | 2019-11-26 | 2021-06-03 | 三菱エンジニアリングプラスチックス株式会社 | ポリカーボネート樹脂組成物及び成形品 |
-
2022
- 2022-05-18 TW TW111118482A patent/TW202313102A/zh unknown
- 2022-05-18 KR KR1020237039413A patent/KR20240009944A/ko unknown
- 2022-05-18 EP EP22804712.2A patent/EP4342491A1/en active Pending
- 2022-05-18 CN CN202280035124.6A patent/CN117320746A/zh active Pending
- 2022-05-18 WO PCT/JP2022/020646 patent/WO2022244801A1/ja active Application Filing
- 2022-05-18 JP JP2023522694A patent/JPWO2022244801A1/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2022244801A1 (zh) | 2022-11-24 |
KR20240009944A (ko) | 2024-01-23 |
EP4342491A1 (en) | 2024-03-27 |
WO2022244801A1 (ja) | 2022-11-24 |
CN117320746A (zh) | 2023-12-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11547673B1 (en) | Coronavirus vaccine | |
Zhang et al. | Human airway epithelial cells sense Pseudomonas aeruginosa infection via recognition of flagellin by Toll-like receptor 5 | |
KR20210043574A (ko) | 푸소좀 조성물 및 이의 용도 | |
Taneichi et al. | Antigen chemically coupled to the surface of liposomes are cross-presented to CD8+ T cells and induce potent antitumor immunity | |
JP2024514183A (ja) | エプスタイン-バーウイルスmRNAワクチン | |
KR20220143684A (ko) | 신종 코로나바이러스 감염에 대한 mRNA 백신의 조성물 및 방법 | |
Shinya et al. | Endogenously expressed HIV-1 nef down-regulates antigen-presenting molecules, not only class I MHC but also CD1a, in immature dendritic cells | |
Khan et al. | Diet-induced obesity does not impact the generation and maintenance of primary memory CD8 T cells | |
Zheng et al. | Respiratory syncytial virus F subunit vaccine with AS02 adjuvant elicits balanced, robust humoral and cellular immunity in BALB/c mice | |
Huang et al. | Advances in development of mRNA-based therapeutics | |
EP4059515A1 (en) | Nucleic acid lipid particle vaccine encapsulating hpv mrna | |
JP2019512249A (ja) | 環状ジヌクレオチドを含むウイルス粒子を調製する方法及びがんを治療するための前記粒子の使用 | |
WO2021251453A1 (ja) | 核酸脂質粒子ワクチン | |
AU2021360796A1 (en) | PAN-RAS mRNA CANCER VACCINES | |
TW202313102A (zh) | Htlv-1核酸脂質粒子疫苗 | |
JP2024516882A (ja) | 構築物と免疫刺激性化合物の共発現 | |
JPWO2022244801A5 (zh) | ||
US20200102563A1 (en) | Exosome loaded therapeutics for treating sickle cell disease | |
EP4342490A1 (en) | Influenza virus nucleic acid lipid particle vaccine | |
TW202307211A (zh) | Hpv感染症疫苗 | |
Lin et al. | Receptor-selective IL-4 mutein modulates inflammatory vascular cell phenotypes and attenuates atherogenesis in apolipoprotein E-knockout mice | |
Milani et al. | Immunostimulatory effects of Hsp70 fragments and Hsp27 in design of novel HIV‐1 vaccine formulations | |
TW202245808A (zh) | 用於治療癌症之治療性rna | |
WO2023039252A2 (en) | Exosomal nucleic acid vaccine composition for protection against sars-cov-2 infection and disease | |
CN115477704A (zh) | 一种基于lox1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用 |