JP5897024B2 - 組成物および方法 - Google Patents

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Description

本発明は概してＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）用のワクチンおよび診断組成物に関する。より詳細には、主題発明は、ＨＣＶエンベロープ２（Ε２）糖蛋白質を含む組成物を提供する。本組成物は、とりわけＨＣＶ感染症の治療、予防、診断、および予後において有効である。
主題明細書の参照文献の書誌詳細もまた、明細書の末尾に記載されている。
本明細書におけるいかなる先行技術に対する参照も、この先行技術が任意の国における共通の一般知識の一部分をなすものであることの承認または任意の形式の提案と見なされるものではなく、またそう解釈すべきでもない。
世界保健機構によると、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している人は世界中で約１．７億〜２億人にも及ぶ。政府がＨＣＶの感染したニードルおよび体液を介した伝染の仕組みに対する認識を高めるために予防プログラムの施行に努めたにもかかわらず、ＨＣＶ感染症の発病率は増加の一途をたどっている。それらの約８０％はＨＣＶに感染し、ウイルス保菌者として存続している。オーストラリアでは、毎年新たに約１万６千例のＨＣＶ感染症が報告されており、その新規の感染症は、注射薬の使用者の間で最もよく見られる。ＨＣＶは血液媒介性ウイルス感染症のなかで最も一般的であり、ＨＣＶによる死亡または罹患率は母集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）においてかなりの比率を占める。
ＨＣＶは、肝臓および或る種の免疫細胞に感染することが知られている。結果として、ＨＣＶは他の形式の肝炎に比べて繊維増多、肝硬変、脂肪症および肝細胞癌（肝癌）などの重篤な肝臓疾患につながる頻度が高い。ＨＣＶは、肝移植レシピエントにおける癌の原因の首位に上がっている。感染症の急性相は、準臨床的性質の感染症であることから多くの場合は認識されず、慢性的な病態に進行する人が８０％にも及ぶと一般に考えられている。慢性感染症は、免疫系がウイルスに対して滅菌免疫応答を生じるのに失敗したことに起因する。主なＨＣＶ遺伝子型は６とおり（１〜６）あり、様々な亜型（ａ、ｂ、ｃなど）も存在している。現在、ＨＣＶ用のワクチンは存在せず、ＨＣＶ感染症に有用な処置は抗ウイルス薬しかない。抗ウイルス薬設計の背後にある一般観念は、無効にするか阻害し得る重要なウイルス蛋白質または蛋白質の一部分を同定することである。中程度または重篤な線維症を患う患者に最良の標準処置としては、αインターフェロンとリバビリンの併用が挙げられる。αインターフェロンとリバビリンの併用療法の抗ウイルス効果によって単回投与の後でさえも血中のＨＣＶレベルが急激に減少するが、ＨＣＶに対する従来型αインターフェロン治療には、いくつかの欠点があった。例えば、（ｉ）数週間または数か月間の処置後にαインターフェロン治療を中断した場合、ウイルス量が急速に再確保されてしまうこと、（ｉｉ）αインターフェロン／リバビリンを用いた治療には、インフルエンザ様症状、赤血球数または白血球数の減少、骨髄細胞の抑制、神経精神医学的影響（特にうつ病）、および貧血を含めた重篤な副作用が付随すること、（ｉｉｉ）αインターフェロンは吸収されて身体から排出されるのが迅速であるため、治療の効果を得るには患者が投薬レジメンを頻繁に順守する必要があること、および（ｉｖ）そのような治療は費用が高くつくことである。治療の効力は遺伝子型に応じて異なり、ウイルス排除が達成される患者は遺伝子型が１または４の患者の約半数にすぎない。
上述した欠点のいくつかは、特に上記項目（ｉｉｉ）を指しており、αインターフェロンに「ＰＥＧ化」を施してポリエチレングリコール分子をインターフェロンに付着することによって対処されてきた。ペグ化されたインターフェロンをリバビリンと共に投与すると、インターフェロンの半減期が増長し、投薬の頻度が少なくて済むという効果が得られ、結果として患者のコンプライアンスが改善される。ただし、そのような処置が功を奏したのは、処置を受けた患者のうちの５０％未満にすぎないことが判明した。ＨＣＶの慢性患者の数が増加していることを前提とした場合、予防および治療の両方に対応するワクチン開発のニーズが存在する。
全てのワクチンに必須の要素は、ウイルス中和抗体の誘導である。ＨＣＶの場合、ＨＣＶ糖蛋白質Ε２が、ウイルス中和抗体応答の主な標的となる。中和抗体は、ＨＣＶ感染症の動物モデルおよびヒトにおけるＨＣＶの除去（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）に重要であることが立証されてきた（Ａｎｇｕｓ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０１１，Ｖａｎｗｏｌｌｅｇｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｐｅｓｔｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＨＣＶは極めて変異しやすいウイルスであるため、ＨＣＶによる感染症を予防するワクチンが、ＨＣＶの多様な遺伝型および亜型を認識できる中和抗体を誘発することが望ましい。
ＨＣＶの主な細胞レセプタはＣＤ８１（Ｐｉｌｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８）である。ＣＤ８１は、ＨＣＶのあらゆる株が肝細胞に侵入する際に必要とされる（Ｋｏｕｔｓｏｕｄａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＭｃＫｅａｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂａｒｔｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｉｌｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ウイルス粒子とＣＤ８１との相互作用を妨げる能力を有する抗体は、中和能を有し得る（Ｍａｎｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ワクチンの研究において、Ε２−ＣＤ８１阻害抗体の力価の高さは、ＨＣＶに対する防御性と相関していた（Ｙｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００５） （Ｓｔａｍａｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
一方、チンパンジーにおいてΕ２−ＣＤ８１阻害抗体はＨＣＶに対する防御の増強に相関していたが、有望な中和機序はこれだけに限られない。他のウイルス系においては、融合ループ（Ｓｕｌｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｔｉａｓｎｙ ｅｔ ａｌ．，２００６）、およびコレセプタ相互作用（Ｂｌｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｌｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）にダイレクトされた抗体を介して中和が行われ得る。なお、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒａｌ）粒子表面上のエピトープの架橋性は、主要な中和形態であると言われてきた（Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
ＨＣＶ糖蛋白質Ε２には、アミノ酸残基３８４−６６１にまたがる離散的なレセプタ結合ドメイン（ＲＢＤ）が含まれる。ＲＢＤは残留物６６１を越えてΕ２の外部ドメインのＣ末端境界まで延在し得る。Ε２ ＲＢＤの非相同発現の結果として、ＣＤ８１を結合する能力を保持する可溶蛋白質が分泌される。ＲＢＤ内には、高度変異部１、高度変異部２（ＨＶＲ２）および遺伝子型間可変領域（ｉｇＶＲ）と呼ばれる３つの可変領域がある。これらの３つの可変領域は、糖蛋白質のコアドメインの外側にあり、Ε２のＣＤ８１結合部位の形成には直接に関与しない（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＲＢＤから３つの可変部を削除すると、結果として、立体配座依存性の抗体に認識され且つＣＤ８１結合の野生型（ＷＴ）レベルを保持する、可溶形態の糖蛋白質が発現する。この最小化された型Ε２コアドメインは、Δ１２３ Ε２６６１と呼ばれる。
ＨＣＶ感染症の治療または予防について現行の治療および実験的治療の欠点を考えた場合、ＨＣＶ感染症の治療および予防において効果的な免疫応答を生じることが可能で、しかもＨＣＶ感染症を検出し且つ抗ＨＣＶ治療のモニタリングにおける使用に対応した診断薬を生成することも可能な組成物を提供する必要に迫られているが、このニーズへの対応はまだ為されていない。
本明細書全体にわたって、文脈上別途要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、明示された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を包含することを意味するが、他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を一切除外するものではない。
本明細書において単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈から特に明示されない限り、複数形の態様を包含する。ゆえに、例えば、「１種の組成物（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」と云った場合は１種の組成物だけでなく２種以上の組成物が包含され、「１種の薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」と云った場合は１種の薬剤だけでなく２種以上の薬剤が包含され、「本発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」と云った場合は発明の１つおよび複数の態様が包含されるといったようになる。
本発明は、ＨＣＶ Ε２糖蛋白質（ＨＣＶ Ε２）中のＨＣＶ Ε２実質的に単量体を枯渇化させた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ２（Ε２）糖蛋白質を含む組成物を提供する。本明細書において、語句「Ε２実質的に単量体を枯渇化させた」または「実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２」は、含率が３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または１％未満（重量基準）のΕ２単量体を含む、組成物を指す。
一部の実施形態において、単量体型におけるＨＣＶ Ε２の比率は、重量基準で１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満である。
実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２糖蛋白質は、組み換え手段または合成手段によって生成される糖蛋白質から誘導され得る。
特定の実施形態において、組成物は、含率が１％未満または０．１％未満の単量体ＨＣＶ Ε２を有する単量体ＨＣＶ Ε２を実質的に含まない。
関連する態様において、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２組成物は三量体ＨＣＶ Ε２が富化されており、含率が７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（重量基準）超の三量体ＨＣＶ Ε２糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。
別の態様において、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２組成物は二量体ＨＣＶ Ε２が富化されており、含率が７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（重量基準）超の二量体ＨＣＶ Ε２糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。
更なる態様において、単量体を枯渇化させた組成物は三量体または高次型ＨＣＶ Ε２が富化されており、含率が７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（重量基準）超の三量体および高次型ＨＣＶ Ε２糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。
一部の実施形態において、Ε２糖蛋白質は実質的にＨＣＶ Ε２三量体である。関連する実施形態において、Ε２糖蛋白質は実質的にＨＣＶ Ε２三量体および高次型である。更なる実施形態において、Ε２糖蛋白質は実質的に高次型ＨＣＶ Ε２である。
実質的に三量体ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量基準）超のΕ２三量体を有する組成物の調製物を含む。
実質的に三量体および高次型ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量基準）超のΕ２三量体および高次型を有する組成物の調製物を含む。
実質的に高次型ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量基準）超の高次型Ε２を有する組成物の調製物を含む。
一部の実施形態において、Ε２糖蛋白質は実質的にＨＣＶ Ε２二量体である。
実質的に二量体ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量基準）超のΕ２二量体を有する組成物の調製物を含む。
一部の実施形態において、Ε２糖蛋白質は実質的にＨＣＶ Ε２二量体およびΕ２三量体である。
一部の実施形態において、本明細書に記載されている実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を含む組成物は、ＨＣＶ感染症の治療および／または予防における使用に対応している。
本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を含む有効量の組成物を被検対象または患者に投与するステップを含む、被検対象または患者における免疫応答を誘発するための方法も更に提供する。
本発明はまた、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を含む組成物を被検対象に投与するステップを含む、被験対象をＣ型肝炎ウイルス感染症に対して免疫化するための方法も提供する。
実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を含む組成物、特に、被験対象をＣ型肝炎ウイルス感染症に対して免疫化するためのワクチン組成物もまた、本発明によって企図されている。
関連する実施形態において本発明はまた、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を含む組成物を被検対象に投与するステップを含む、被検対象におけるＣ型肝炎感染症を治療するための方法も提供する。
これらの実施形態によれば、組成物は一般的に、Ε２特異抗体の生成を含む免疫応答を誘発するのに十分な条件下で投与される。本発明の組成物は、単回投与または単回塗布として投与してもよい。代替方法として、組成物に反復投与または反復塗布を含めてもよく、例えば組成物を２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の回数投与できる。
更なる実施形態において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を免疫学的に有効量だけ被験対象に注射するステップと、生成された抗体を単離し精製するステップと、を含む、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２に対する精製抗体を生成するための方法を提供する。
別の実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２組成物は、薬学的にもしくは生理的に許容可能な担体、または希釈液を更に含有する。
更なる実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させた組成物は、アジュバントを更に含む。１つの例示的な実施形態において、アジュバントはサポニンを主成分とするアジュバントである。関連する態様において、アジュバントはサポニンを主成分とし、コレステロールおよびステロールを更に含む。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバントはその実例である。
別の実施形態において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２に対して産生されるか反応する精製抗体を提供する。
一部の実施形態において、生成される抗体は、例えば宿主細胞侵入またはウイルス出芽などのＨＣＶライフサイクルの重要部分を少なくとも部分的に中和する抗体を包含する。
本発明は、ＨＣＶ感染症の治療もしくは予防における、またはそのための薬剤の製造における、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２の使用に更に関する。
本発明はまた、ＨＣＶ感染症の診断もしくはモニタリング、または抗ＨＣＶ治療プロトコールのモニタリングにおける、あるいはそのための診断薬（抗体など）の製造における、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２の使用にも供する。
他の態様においては、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を使用して抗体、抗原結合性フラグメント、リガンド、ペプチド、有機分子または無機分子などの結合分子を同定するための、スクリーニング法が提供されている。
別の態様において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２糖蛋白質を含む、キットまたは固体基質または半固体基質を提供する。本発明のキットまたは基質は、診断、予後、治療的、または予防的用途、更にはＨＣＶ Ε２結合分子もしくはＨＣＶレセプタ結合分子の設計および／またはスクリーニングの用途での使用に対応するように企図されている。キットおよび基質はまた、ＨＣＶ感染症に対する治療プロトコールの効能をモニターするのにも有効である。
上述の要約は本発明の全ての実施形態の網羅的な詳説ではなく、またいかなる形であれそう見なすべきでもない。
Ｈ７７ｃ ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓの分取サイズ排除クロマトグラフィを示したグラフ図である。上部および下側パネルのそれぞれにおける、濃縮ＷＴ、およびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の分取グレードＴＳＫＧ３０００ＳＷサイズ排除プロファイルである。試料を１×ＰＢＳ中で２ｍＬ／ｍｉｎの流速にて１００分間ラン（ｒｕｎ）させた。数回の分析を通じて６０〜１６０分間２ｍｌの画分を収集し、更なる分析に備えて、対応する画分を数回の分析でプールした。ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓの両方から分離した単量体および二量体のピークを示す。精製されたウシ血清アルブミンおよび卵白アルブミン蛋白質を０．５μｇ／ｍＬにてサイズ標準（ｓｉｚｅ−ｓｔａｎｄａｒｄｓ）マーカーとして提供した。 Ｈ７７ｃ ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓの異なる単離形態を示したデータのグラフ図である。プールされた画分の分析用ＴＳＫＧ３０００ＳＷサイズ排除プロファイルは、分取サイズ排除クロマトグラフィプロファイルから独立した高次分子量型（推定三量体）、単量体および二量体のピークを表している。全ての試料を無希釈（ｎｅａｔ）の１×ＰＢＳ中で０．２５ｍＬ／ｍｉｎにて６０分間ラン（ｒｕｎ）させて、単量体、二量体および三量体のピークの分離を行った。ウシ血清アルブミンおよび卵白アルブミン蛋白質を０．５ｍｇ／ｍＬにてサイズ標準（ｓｉｚｅ−ｓｔａｎｄａｒｄｓ）マーカーとして提供した。 Ｃｏｎ１ ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓの異なる単離形態を示したデータのグラフ図である。プールされた画分の分析用ＴＳＫＧ３０００ＳＷサイズ排除プロファイルは、分取サイズ排除クロマトグラフィプロファイルから独立した高次分子量型（推定三量体）、単量体および二量体のピークを表している。ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓオリゴマー（Ａ）、およびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓオリゴマー（Ｂ）の図である。全ての試料を無希釈（ｎｅａｔ）の１×ＰＢＳ中で０．２５ｍＬ／ｍｉｎにて６０分間ラン（ｒｕｎ）させて、単量体、二量体および三量体のピークの分離を行った。 ＪＦＨ１ ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓのいくつかの単離形態を示したデータのグラフ図である。プールされた画分の分析用ＴＳＫＧ３０００ＳＷサイズ排除プロファイルは、分取サイズ排除クロマトグラフィプロファイルから独立した高次分子量型（推定三量体）、単量体および二量体のピークを表している。ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓオリゴマー（Ａ）、およびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓオリゴマー（Ｂ）の図である。全ての試料を無希釈（ｎｅａｔ）の１×ＰＢＳ中で０．２５ｍＬ／ｍｉｎにて６０分間ラン（ｒｕｎ）させて、単量体、二量体および三量体のピークの分離を行った。 個々および複数の可変領域配列が欠失した精製Ε２６６１蛋白質の発現プロファイルに関する記述である。ＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬカラムおよびＨＰＬＣシステムを使用して実行された、Ｈ７７ｃ遺伝子型１ａ由来の各Ε２６６１−ｈｉｓ可変領域欠失突然変異体の分析用サイズ排除クロマトグラフィプロファイルである。図に示すように、精製ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および卵白アルブミンのいくつかの型は、標準サイズマーカー（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ）として提供された。 Ｈ７７ｃ ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓのいくつかの型の特性を示す。非還元条件下および還元（＋β−メルカプトエタノール）条件下で、２５〜２００ｋＤａのサイズ標準を使用して、分取サイズ排除クロマトグラフィからプールされた画分の定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ画分１３〜３１の図である。分析用サイズ排除プロファイルから独立した高次分子量型（推定三量体）、単量体および二量体のピークを表す画分は、アスタリスク（＊）で示されている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から推定された単量体、二量体、および三量体化学種の分子量の計算値は、図の下にある表に示すとおりである。 Ｈ７７ｃ ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓのいくつかの型の特性を示す。非還元条件下および還元（＋β−メルカプトエタノール）条件下で、２５〜２００ｋＤａのサイズ標準を使用して、分取サイズ排除クロマトグラフィからプールされた画分の定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓ画分１５〜３３の図である。分析用サイズ排除プロファイルから独立した高次分子量型（推定三量体）、単量体および二量体のピークを表す画分は、アスタリスク（＊）で示されている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から推定された単量体、二量体、および三量体化学種の分子量の計算値は、図の下にある表に示すとおりである。 Ｃｏｎ１ ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓのいくつかの型の特性に関する記述である。非還元条件下および還元（＋β−メルカプトエタノール）条件下で、２５〜２００ｋＤａのサイズ標準を使用して、分取サイズ排除クロマトグラフィからプールされた画分の定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ画分１３〜３１（Ａ）およびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓ画分１６〜３４（Ｂ）の図である。分析用サイズ排除プロファイルから独立した高次分子量型（推定三量体）、単量体および二量体のピークを表す画分は、アスタリスク（＊）で示されている。各ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の下側には、単量体、二量体、および高分子量（ＨＭｒ）化学種（推定の三量体）に対応する画分について、還元および非還元両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥで計算された分子量がリストされている。 様々なオリゴマー形態のＪＦＨ１ ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓの特性に関する記述である。非還元条件下および還元（＋β−メルカプトエタノール）条件下で、２５〜２００ｋＤａのサイズ標準を使用して、分取サイズ排除クロマトグラフィからプールされた画分の定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ画分１５〜３２（Ａ）およびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓ画分１８〜３６（Ｂ）の図である。分析用サイズ排除プロファイルから独立した高次分子量型（推定三量体）、単量体および二量体のピークを表す画分は、アスタリスク（＊）で示されている。各ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の下側には、単量体、二量体、および高分子量（ＨＭｒ）化学種（推定の三量体）に対応する画分について、還元および非還元両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥで計算された分子量がリストされている。 Ｈ７７ｃ分離株由来のＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓのいくつかの型のバイオセンサー曲線を示すグラフ図である。連続２倍希釈（ｓｅｒｉａｌ ｔｗｏ−ｆｏｌｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）での異なる蛋白質のバイオセンサー曲線は、０．１μｇ／ｍＬで開始されている。上側パネルＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ画分、および下側パネルΔＨＶＲ１＋２＋３Ε２６６１画分はそれぞれ、分析用サイズ排除クロマトグラフィで定量された三量体、二量体、および単量体のピークである。縦バンドは、注入の「開始」および「停止」の位置を示す。化学量１：１のＲｍａｘ値を示すと共に、結合化学量２：１のＲｍａｘ値を角括弧内に示す。 Ｈ７７ｃ（遺伝型１ａ）、Ｃｏｎ１（遺伝型１ｂ）およびＪＦＨ１（遺伝型２ａ）ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓ三量体、二量体および単量体蛋白質がＣＤ８１ ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１の大細胞外ループに結合するアフィニティの比較を示したグラフ図である。モル（Ｍ）単位の平均ＫＤ値は、二量体および三量体蛋白質の「１：１」のラングミュア結合モデル、ならびに単量体蛋白質の「二状態」（立体配座変化）モデルを使用して得られた。ｎ＝１としたときの３つの別個の実験の平均および標準誤差を示す（ただし、Ｃｏｎ１およびＪＦＨ１を除く）。ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のそれぞれについて得られたＫＤ値（ｐ＜０．０５）における有意な差異は、アスタリスク（＊）で示されている。 ３０μｇまたは１００μｇ用量の単量体［Ａ（ｇｐ１−１からｇｐ１−４）ならびにＢ（ｇｐ２−１からｇｐ２−４）］ Ε２−ｈｉｓ組成物に対して生成されるモルモット免疫血清の滴定曲線を、相同Ｈ７７ｃ Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原と対照して示したデータのグラフ図である。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバントのみ（抗原なし）に対して誘発されたモルモット血清の反応性を、各図表中の線図ｇｐ７−１からｇｐ７−４で示す。 ３０μｇまたは１００μｇ用量の二量体［Ｃ（ｇｐ３−１からｇｐ３−４）およびＤ（ｇｐ４−１からｇｐ４−４）］ Ε２−ｈｉｓ組成物に対して生成されるモルモット免疫血清の滴定曲線を、相同Ｈ７７ｃ Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原と対照して示したデータのグラフ図である。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバントのみ（抗原なし）に対して誘発されたモルモット血清の反応性を、各図表中の線図ｇｐ７−１からｇｐ７−４で示す。 ３０μｇまたは１００μｇ用量の混合物［Ｅ（ｇｐ５−１からｇｐ５−４）およびＦ（ｇｐ６−１からｇｐ６−４）］ Ε２−ｈｉｓ組成物に対して生成されるモルモット免疫血清の滴定曲線を、相同Ｈ７７ｃ Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原と対照して示したデータのグラフ図である。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバントのみ（抗原なし）に対して誘発されたモルモット血清の反応性を、各図表中の線図ｇｐ７−１からｇｐ７−４で示す。 相同免疫化（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）Ｈ７７ｃ Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対するモルモット血清の抗体平均力価を示したグラフ図である。１００μｇの混合群における抗体平均力価は、３０μｇの混合群を約０．５ｌｏｇ上回り、二量体群を１ｌｏｇ上回り、単量体群を２ｌｏｇ上回った。 ＷＴ型およびΔ１２３型Ε２６６１−ｈｉｓの混合物に対する免疫血清の反応性を示す、直接結合（ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）酵素免疫法によるデータのグラフ図である。抗体価は用量依存的であり、３０μｇの場合よりも１００μｇの場合の方が抗体価が高いと考えられる。平均力価の高い抗体を誘発した混合および二量体型Ε２６６１を投与されている動物を、単量体蛋白質でワクチン接種された動物と比較した。 固相酵素アッセイにおいて、Ｈ７７ｃ（遺伝子型１ａ）およびＪＦＨ１（遺伝子型２ａ）ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質がＣＤ８１（ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１）の大細胞外ループの組み換え型に結合するのを阻害する免疫血清の能力を例示したグラフ図である。Ε２−ＣＤ８１阻害抗体の平均力価は、単量体Ε２６６１−ｈｉｓでワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も低かった。Ｈ７７ｃ Ε２−ＣＤ８１阻害抗体の平均力価は、二量体型でワクチン接種された動物によって誘発されたものの方が、単量体型でワクチン接種された動物と比べて高かった。Ｈ７７ｃ Ε２−ＣＤ８１阻害抗体の平均力価は、三量体化学種を含有する混合物でワクチン接種された動物から採取された免疫血清によって誘発されたものが最も高かった。加えて、ワクチン用量を３０μｇに減らした場合でも、全ての動物において応答が観測された。このことは、三量体化学種のΕ２６６１−ｈｉｓを含有する調製物の方が、二量体Ε２６６１−ｈｉｓ単独よりも効能に優れていることを示唆している。阻害率が８０％に達した１００μｇ混合物群において全ての動物とのＪＦＨ１ Ε２−ＣＤ８１の相互作用の阻害が８０％に達したのは、Ε２６６１−ｈｉｓの二量体または混合物３０μｇまたは１００μｇを投与されている動物から採取された血清のみであった。 モルモット血清がＨ７７ｃ ＨＣＶｐｐの相同中和（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を媒介する能力を示したデータのグラフ図である。ＨＣＶｐｐの中和を媒介する能力は投与および抗原依存的でもあった。単量体（ＡおよびＢ）を参照のこと。 モルモット血清がＨ７７ｃ ＨＣＶｐｐの相同中和（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を媒介する能力を示したデータのグラフ図である。ＨＣＶｐｐの中和を媒介する能力は投与および抗原依存的でもあった。二量体（ＣおよびＤ）を参照のこと。 モルモット血清がＨ７７ｃ ＨＣＶｐｐの相同中和（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を媒介する能力を示したデータのグラフ図である。ＨＣＶｐｐの中和を媒介する能力は投与および抗原依存的でもあった。混合物（ＥおよびＦ）を参照のこと。 モルモット血清がＨ７７ｃ ＨＣＶｐｐの相同中和（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を媒介する能力を示したデータのグラフ図である。ＨＣＶｐｐの中和を媒介する能力は投与および抗原依存的でもあった。３０μｇ単量体を投与されている被験対象がＨＣＶｐｐを中和する能力に乏しいことを示す曲線に類似する、抗原なしの対照群（Ｇ）である。Ε２に対する中和モノクローナル抗体を使用する陽性対照もまたＧ（ｍａｂ２４）に示す。 Ｈ７７ｃ ＨＣＶｐｐに対するモルモット血清の５０％中和平均力価のグラフ図である。１００μｇの抗原混合物を投与されている被験対象が誘発した中和平均力価は、１００μｇの単量体、３０μｇの二量体、または１００μｇの二量体について観測された値の約１０倍であった。２５および７５パーセンタイル（ボックス）、平均（線分）、ならびに平均値の標準誤差を示す。 免疫血清が単量体（ＡおよびＢ）に対するＪ６−ＪＦＨ１ ＨＣＶｃｃの交差中和を媒介する能力を例示したグラフ図である。１００μｇの抗原混合物を投与されている被験対象は、血清希釈率１／４０にて侵入阻害率が９０％に達したことから、交差中和を媒介する能力が強力であることが判明した。 免疫血清が二量体（ＣおよびＤ）に対するＪ６−ＪＦＨ１ ＨＣＶｃｃの交差中和を媒介する能力を例示したグラフ図である。１００μｇの抗原混合物を投与されている被験対象は、血清希釈率１／４０にて侵入阻害率が９０％に達したことから、交差中和を媒介する能力が強力であることが判明した。 免疫血清が混合された調製物（ＥおよびＦ）に対するＪ６−ＪＦＨ１ ＨＣＶｃｃの交差中和を媒介する能力を例示したグラフ図である。１００μｇの抗原混合物を投与されている被験対象は、血清希釈率１／４０にて侵入阻害率が９０％に達したことから、交差中和を媒介する能力が強力であることが判明した。 免疫血清が単量体（ＡおよびＢ）、二量体（ＣおよびＤ）、混合された調製物（ＥおよびＦ）に対するＪ６−ＪＦＨ１ ＨＣＶｃｃの交差中和を媒介する能力を例示したグラフ図に関連して、同様にラン（ｒｕｎ）された、Ε２に対する中和モノクローナル抗体および抗原なしの対照である（ＧおよびＨ）。１００μｇの抗原混合物を投与されている被験対象は、血清希釈率１／４０にて侵入阻害率が９０％に達したことから、交差中和を媒介する能力が強力であることが判明した。 Ｊ６−ＪＦＨ１ ＨＣＶｃｃに対するワクチン群の中和平均力価のグラフ図である。１００μｇ混合群について観測された５０％中和平均力価は、３０μｇおよび１００μｇ単量体群よりもおよそ２ｌｏｇ高く、二量体群および３０μｇ混合群よりも１ｌｏｇ高かった。 ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の典型的なゲル濾過クロマトグラムを示したものである。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｐｇ２６／６０分取ゲル濾過カラム上で蛋白質をラン（ｒｕｎ）させ、指示されているようにピーク１〜４を収集した。クロマトグラムの上部に、分子量標準の溶出時間を示す。 Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の典型的なゲル濾過クロマトグラムを示したものである。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｐｇ２６／６０分取ゲル濾過カラム上で蛋白質をラン（ｒｕｎ）させ、指示されているようにピーク１〜４を収集した。クロマトグラムの上部に、分子量標準の溶出時間を示す。 ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４を表すプール済み画分の分析用ゲル濾過プロファイルを示したものである。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＰＣ３．２／３０カラム上でラン（ｒｕｎ）した個々のゲル濾過物をオーバレイし、それらの相対的な溶出を示す。サイズマーカーが示されている。 Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４を表すプール済み画分の分析用ゲル濾過プロファイルを示したものである。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＰＣ３．２／３０カラム上でラン（ｒｕｎ）した個々のゲル濾過物をオーバレイし、それらの相対的な溶出を示す。サイズマーカーが示されている。 ピーク１〜４の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示したものである。３μｇの各Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質を１０μｌの４ｘ還元試料バッファに添加した。試料を７０℃で３分間加熱して、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｎｕ ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せた。５００μｌのＮｕＰＡＧＥ酸化防止剤をゲルタンクの中心成分（ｃｅｎｔｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）に添加してから、２００Ｖでラン（ｒｕｎ）させた。左側に、ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓスタンダードの移行を示す。 ピーク１〜４の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示したものである。３μｇの各Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質を１０μｌの４ｘ非還元試料バッファに添加した。試料を７０℃で３分間加熱して、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｎｕ ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せた。左側に、ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓスタンダードの移行を示す。 ピーク１〜４のウエスタンブロット分析を示したものである。Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４（０．５μｇ）を４Ｘ還元試料バッファに添加した。図２３に示すように、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。その後、Ε２６６１−ｈｉｓ改変体を１時間の湿潤転写（ｗｅｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ）によってＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク含有のＰＢＳで一晩ブロックした。一次抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体を１％スキムミルク含有の０．０５％ＴＢＳに１：１０００の希釈率で添加した。３回洗浄した後、ヒツジ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１％スキムミルク含有の０．０５％ＴＢＳに１：２０００の希釈率で添加した。３回洗浄した後、メーカーの指示書に従いブロットをＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔで現像し、５２０ｎｍでスキャンした。左側に、ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓスタンダードの移行を示す。 ピーク１〜４のウエスタンブロット分析を示したものである。Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４（０．５μｇ）を４Ｘ還元試料バッファに添加した。図２３に示すように、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。その後、Ε２６６１−ｈｉｓ改変体を１時間の湿潤転写（ｗｅｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ）によってＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク含有のＰＢＳで一晩ブロックした。一次抗ＨＣＶ Ε２抗体を１％スキムミルク含有の０．０５％ＴＢＳに１：１０００の希釈率で添加した。３回洗浄した後、ヒツジ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１％スキムミルク含有の０．０５％ＴＢＳに１：２０００の希釈率で添加した。３回洗浄した後、メーカーの指示書に従いブロットをＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔで現像し、５２０ｎｍでスキャンした。左側に、ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓスタンダードの移行を示す。 ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清が、相同免疫化（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ）抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆し、続いてピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方２μｇ／ｍｌで被覆した。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清が、相同免疫化（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ）抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆し、続いてピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方２μｇ／ｍｌで被覆した。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清が、非分画遺伝型１ａ Ｈ７７ｃ ＷＴ抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用された非分画Ｈ７７ｃ ＷＴ（Ａ）抗原２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清が、Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用されたΔ１２３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ抗原２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清の、相同（Ｈ７７ｃ、Ａ）と非相同（ＪＦＨ１、Ｂ）Ε２６６１との間の結合によってＣＤ８１への結合が生じるのを阻害する能力を示したグラフ図である。免疫血清の連続希釈液を非分画Ｈ７７ｃまたはＪＦＨ１ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質１００ｎｇに添加してからＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１で被覆されたエンザイムイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε２６６１−ｈｉｓを抗ｈｉｓ抗体で検出してから、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼと共役した免疫グロブリンおよびＴＭＢ基質で検出した。Ε２６６１−ｈｉｓとＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１との間の結合の５０％を阻害するのに必要な抗体希釈率を、各動物について算出した。 ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清の、相同（Ｈ７７ｃ、Ａ）と非相同（ＪＦＨ１、Ｂ）Ε２６６１との間の結合によってＣＤ８１への結合が生じるのを阻害する能力を示したグラフ図である。免疫血清の連続希釈液を非分画Ｈ７７ｃまたはＪＦＨ１ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質１００ｎｇに添加してからＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１で被覆されたエンザイムイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε２６６１−ｈｉｓを抗ｈｉｓ抗体で検出してから、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼと共役した免疫グロブリンおよびＴＭＢ基質で検出した。Ε２６６１−ｈｉｓとＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１との間の結合の５０％を阻害するのに必要な抗体希釈率を、各動物について算出した。 Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清の、相同（Ｈ７７ｃ、Ａ）および非相同（ＪＦＨ１、Ｂ）Ε２６６１間の結合によってＣＤ８１への結合が生じるのを阻害する能力を示したグラフ図である。免疫血清の連続希釈液を非分画Ｈ７７ｃまたはＪＦＨ１ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質１００ｎｇに添加してからＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１で被覆されたエンザイムイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε２６６１−ｈｉｓを抗ｈｉｓ抗体で検出してから、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼと共役した免疫グロブリンおよびＴＭＢ基質で検出した。Ε２６６１とＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１間の結合の５０％を阻害するのに必要な抗体希釈率を、各動物について算出した。 Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清の、相同（Ｈ７７ｃ、Ａ）および非相同（ＪＦＨ１、Ｂ）Ε２６６１間の結合によってＣＤ８１への結合が生じるのを阻害する能力を示したグラフ図である。免疫血清の連続希釈液を非分画Ｈ７７ｃまたはＪＦＨ１ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質１００ｎｇに添加してからＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１で被覆されたエンザイムイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε２６６１−ｈｉｓを抗ｈｉｓ抗体で検出してから、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼと共役した免疫グロブリンおよびＴＭＢ基質で検出した。Ε２６６１とＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１間の結合の５０％を阻害するのに必要な抗体希釈率を、各動物について算出した。 Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓモルモット血清が肝臓細胞培養物の相同ＨＣＶへの感染を予防する能力を示したグラフ図である。Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットによって誘発された免疫血清について、相同Ｈ７７ｃ Ε１Ε２糖蛋白質（Ｈ７７ｃ ＨＣＶｐｐ）含有の疑似型レトロウイルス粒子を中和する能力を調べた。加熱により不活性化された免疫血清をＤＭＦ１０で連続希釈し、等量のＨ７７ｃ ＨＣＶｐｐを用い３７℃で１時間インキュベートした後、前日に３×１０４細胞／ウェルで播種しておいたＨｕｈ７．５細胞に添加した。４時間後に、ウイルス／血清の混合物を除去して、培地で置き換えた。３日後に、ルミノメータで、細胞溶菌液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス感染症の５０％阻害に必要とされる免疫血清の希釈率として算出されたＩＣ５０力価（Ａ）である。 Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓモルモット血清が肝臓細胞培養物の相同ＨＣＶへの感染を予防する能力を示したグラフ図である。Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットによって誘発された免疫血清について、相同Ｈ７７ｃ Ε１Ε２糖蛋白質（Ｈ７７ｃ ＨＣＶｐｐ）含有の疑似型レトロウイルス粒子を中和する能力を調べた。加熱により不活性化された免疫血清をＤＭＦ１０で連続希釈し、等量のＨ７７ｃ ＨＣＶｐｐを用い３７℃で１時間インキュベートした後、前日に３×１０４細胞／ウェルで播種しておいたＨｕｈ７．５細胞に添加した。４時間後に、ウイルス／血清の混合物を除去して、培地で置き換えた。３日後に、ルミノメータで、細胞溶菌液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス感染症の８０％阻害に必要とされる血清の希釈率として算出されたＩＣ８０力価（Ｂ）である。 Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓモルモット血清が肝臓細胞培養物の非相同株のＨＣＶへの感染を予防する能力を示したグラフ図である。Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットが誘発した免疫血清について、Ｊ６／ＪＦＨ１キメラ細胞培養（ＨＣＶｃｃ）遺伝子型２ａウイルスを中和する能力を調べた。加熱により不活性化された免疫血清をＤＭＦ１０＋ＮＥＡＡで連続希釈し、当量の３．１６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＨＣＶｃｃと３７℃で２０分間混合した。前日に８×１０３細胞／ウェルで播種して３７℃で５時間インキュベートしておいたＨｕｈ７．５細胞に、血清／ウイルスの混合物を塗布した。血清／ウイルスの混合物を除去し、ＰＢＳで４回洗浄して、ＤＭＦ１０＋ＮＥＡＡに添加して４０時間インキュベートした。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ基質およびルミノメータを使用して、組織培養液に存在するルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス複製の５０％阻害に必要とされる免疫血清の希釈率として算出されたＩＣ５０力価（Ａ）である。 Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓモルモット血清が肝臓細胞培養物の非相同株のＨＣＶへの感染を予防する能力を示したグラフ図である。Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットが誘発した免疫血清について、Ｊ６／ＪＦＨ１キメラ細胞培養（ＨＣＶｃｃ）遺伝子型２ａウイルスを中和する能力を調べた。加熱により不活性化された免疫血清をＤＭＦ１０＋ＮＥＡＡで連続希釈し、当量の３．１６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＨＣＶｃｃと３７℃で２０分間混合した。前日に８×１０３細胞／ウェルで播種して３７℃で５時間インキュベートしておいたＨｕｈ７．５細胞に、血清／ウイルスの混合物を塗布した。血清／ウイルスの混合物を除去し、ＰＢＳで４回洗浄して、ＤＭＦ１０＋ＮＥＡＡに添加して４０時間インキュベートした。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ基質およびルミノメータを使用して、組織培養液に存在するルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス複製の８０％阻害に必要とされる血清の希釈率として算出されたＩＣ８０力価（Ｂ）である。 エンザイムイムノアッセイにおいて、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清が非分画Ｈ７７ｃ ＷＴ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用された非分画Ｈ７７ｃ ＷＴ（Ａ）またはΔ１２３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ抗原２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 エンザイムイムノアッセイにおいて、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清が非分画Ｈ７７ｃ ＷＴ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用された非分画Ｈ７７ｃ ＷＴ（Ａ）またはΔ１２３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ抗原２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 エンザイムイムノアッセイにおいて、Ｈ７７ｃ ＷＴピーク１〜４のΕ２６６１−ｈｉｓ蛋白質または非分画Ε２６６１−ｈｉｓ混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清が、非相同ＪＦＨ１ ＷＴ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用された非分画ＪＦＨ１ ＷＴ（Ａ）またはΔ１２３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ抗原２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 エンザイムイムノアッセイにおいて、Ｈ７７ｃ ＷＴピーク１〜４のΕ２６６１−ｈｉｓ蛋白質または非分画Ε２６６１−ｈｉｓ混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清が、非相同ＪＦＨ１ ＷＴ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用された非分画ＪＦＨ１ ＷＴ（Ａ）またはΔ１２３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ抗原２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 野生型Ε２６６１−ｈｉｓモルモット血清が肝臓細胞培養物の相同ＨＣＶ感染を予防する能力を示したグラフ図である。ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４蛋白質または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットによって誘発された免疫血清について、相同Ｈ７７ｃ Ε１Ε２糖蛋白質（Ｈ７７ｃ ＨＣＶｐｐ）含有の疑似型レトロウイルス粒子を中和する能力を調べた。加熱により不活性化された免疫血清をＤＭＦ１０で連続希釈し、等量のＨ７７ｃ ＨＣＶｐｐを用い３７℃で１時間インキュベートした後、前日に３×１０４細胞／ウェルで播種しておいたＨｕｈ７．５細胞に添加した。４時間後に、ウイルス／血清の混合物を除去して、培地で置き換えた。３日後に、ルミノメータで、細胞溶菌液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス感染症の５０％阻害に必要とされる免疫血清の希釈率として算出されたＩＣ５０力価（Ａ）である。 野生型Ε２６６１−ｈｉｓモルモット血清が肝臓細胞培養物の相同ＨＣＶ感染を予防する能力を示したグラフ図である。ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４蛋白質または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットによって誘発された免疫血清について、相同Ｈ７７ｃ Ε１Ε２糖蛋白質（Ｈ７７ｃ ＨＣＶｐｐ）含有の疑似型レトロウイルス粒子を中和する能力を調べた。加熱により不活性化された免疫血清をＤＭＦ１０で連続希釈し、等量のＨ７７ｃ ＨＣＶｐｐを用い３７℃で１時間インキュベートした後、前日に３×１０４細胞／ウェルで播種しておいたＨｕｈ７．５細胞に添加した。４時間後に、ウイルス／血清の混合物を除去して、培地で置き換えた。３日後に、ルミノメータで、細胞溶菌液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス感染症の８０％阻害に必要とされる血清の希釈率として算出されたＩＣ８０力価（Ｂ）である。 ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清が肝臓細胞培養物の非相同株のＨＣＶへの感染を予防する能力を示したグラフ図である。ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４蛋白質または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットが誘発した免疫血清について、Ｊ６／ＪＦＨ１Ｊキメラ細胞培養（ＨＣＶｃｃ）遺伝型２ａウイルスを中和する能力を調べた。加熱により不活性化された免疫血清をＤＭＦ１０＋ＮＥＡＡで連続希釈し、当量の３．１６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＨＣＶｃｃと３７℃で２０分間混合した。前日に８×１０３細胞／ウェルで播種して３７℃で５時間インキュベートしておいたＨｕｈ７．５細胞に、血清／ウイルスの混合物を塗布した。血清／ウイルスの混合物を除去し、ＰＢＳで４回洗浄して、ＤＭＦ１０＋ＮＥＡＡに添加して４０時間インキュベートした。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ基質およびルミノメータを使用して、組織培養液に存在するルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス複製の５０％阻害に必要とされる免疫血清の希釈率として算出されたＩＣ５０力価（Ａ）である。 ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清が肝臓細胞培養物の非相同株のＨＣＶへの感染を予防する能力を示したグラフ図である。ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４蛋白質または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットが誘発した免疫血清について、Ｊ６／ＪＦＨ１Ｊキメラ細胞培養（ＨＣＶｃｃ）遺伝型２ａウイルスを中和する能力を調べた。加熱により不活性化された免疫血清をＤＭＦ１０＋ＮＥＡＡで連続希釈し、当量の３．１６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＨＣＶｃｃと３７℃で２０分間混合した。前日に８×１０３細胞／ウェルで播種して３７℃で５時間インキュベートしておいたＨｕｈ７．５細胞に、血清／ウイルスの混合物を塗布した。血清／ウイルスの混合物を除去し、ＰＢＳで４回洗浄して、ＤＭＦ１０＋ＮＥＡＡに添加して４０時間インキュベートした。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ基質およびルミノメータを使用して、組織培養液に存在するルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルス複製の８０％阻害に必要とされる血清の希釈率として算出されたＩＣ８０力価（Ｂ）である。 非相同Ｃｏｎ１（遺伝型１ｂ）野生型およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対するＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清の反応性を示したグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用された非分画Ｃｏｎ１ ＷＴ（Ａ）またはΔ１２３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ混合物２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 非相同Ｃｏｎ１（遺伝型１ｂ）野生型およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対するＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清の反応性を示したグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用された非分画Ｃｏｎ１ ＷＴ（Ａ）またはΔ１２３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ混合物２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 エンザイムイムノアッセイにおいてΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清が、非相同Ｃｏｎ１（遺伝型１ｂ）ＷＴ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用された非分画Ｃｏｎ１ ＷＴ（Ａ）またはΔ１２３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ混合物２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 エンザイムイムノアッセイにおいてΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清が、非相同Ｃｏｎ１（遺伝型１ｂ）ＷＴ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用された非分画Ｃｏｎ１ ＷＴ（Ａ）またはΔ１２３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ混合物２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 エンザイムイムノアッセイにおいてΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清が非相同ＪＦＨ１（遺伝型２ａ）ＷＴ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用された非分画ＪＦＨ１ ＷＴ（Ａ）またはΔ１２３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ混合物２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。 エンザイムイムノアッセイにおいてΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清が非相同ＪＦＨ１（遺伝型２ａ）ＷＴ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対して呈した反応性のグラフ図である。マイクロプレートをＧＮＡレクチン（０．５μｇ／ｍｌ）で被覆した後、被覆用に二者択一的に使用された非分画ＪＦＨ１ ＷＴ（Ａ）またはΔ１２３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ混合物２μｇ／ｍｌである。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。
表１は、ワクチン接種を受けたモルモット群（１〜７）、ならびに実施例３に記載されているのと同じものを投与されている各群における抗原種、抗原量、アジュバントおよび被験対象数の一覧である。
主題発明は、薬剤に対する特定のスクリーニング法、特定の薬剤処方、および各種医療方法論に限定されるものではなく、それゆえ多様であり得る。
別途に定義されている場合を除き、本明細書に使用されている全ての技術用語および科学用語は、本発明が帰属する当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等な材料および方法はどのようなものも、本発明の実施または試験に使用し得る。開業医は、当該技術の定義および用語、ならびに当業者に公知の他の方法について、特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９（ｓｕｐｒａ），Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５−１９９７（具体的には１、５および６章）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８６；Ｊｏｋｌｉｋ ｅｄ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８８；Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１；Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ，１９９６を参照されたい。
本発明は、ＨＣＶ Ε２糖蛋白質におけるＨＣＶ Ε２実質的に単量体を枯渇化させた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ２（Ε２）糖蛋白質を含む組成物を提供する。本明細書において、語句「Ε２実質的に単量体を枯渇化させた」または「実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２」は、含率が３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満または１％未満（重量基準）のΕ２単量体を含む、組成物を指す。
用語「ＨＣＶ Ε２糖蛋白質」、「Ε２糖蛋白質」、「Ε２二量体」、「Ε２三量体」または「Ε２」、「Ε２単量体」、「ＨＣＶ Ε２」、およびこれらに類するものは、任意の遺伝子型またはＨＣＶの分離株に由来するΕ２糖蛋白質を包含する。この用語は、例えば、立体配座エピトープおよび／または他のエピトープを認識する１つ以上の抗体によってレセプタ結合を媒介するか中和抗体の結合を媒介する部分、またはΕ１Ε２二量体形成を媒介する部分を含む、全長Ε２糖蛋白質の一部を含めた非天然の改変体を更に包含する。
一部の実施形態において、単量体型におけるＨＣＶ Ε２の比率は、重量基準で１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満である。
実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２糖蛋白質は、組み換え手段または合成手段によって生成される糖蛋白質であり得る。
特定の実施形態において、組成物は、含率が１％未満または０．１％未満の単量体ＨＣＶ Ε２を有する単量体ＨＣＶ Ε２を実質的に含まない。
更なる態様において、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２組成物は三量体および高次型ＨＣＶ Ε２が富化されており、含率が７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（重量基準）超の三量体および高次型ＨＣＶ Ε２糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。
本明細書において、語句「高次型」のＨＣＶ Ε２糖蛋白質は、４つまたはそれ以上のΕ２蛋白質亜単位を有するΕ２蛋白質の型を指す。そのような形態は、四量体（４）、五量体（５）、六量体（６）、七量体（７）、八量体（８）、九量体（９）、十量体（１０）、十一量体（１１）、十二量体（１２）、十三量体（１３）、十四量体（１４）、十五量体（１５）、十六量体（１６）、十七量体（１７）、十八量体（１８）、十九量体（１９）、二十量体（２０）、二十一量体、二十二量体、二十三量体などとして知られている。
関連する態様において、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２組成物は三量体ＨＣＶ Ε２が富化されており、含率が７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（重量基準）超の三量体ＨＣＶ Ε２糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。
別の態様において、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２組成物は二量体ＨＣＶ Ε２が富化されており、含率が７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（重量基準）超の二量体ＨＣＶ Ε２糖蛋白質を有する組成物の調製物を含む。
別の態様において、組成物は実質的にＨＣＶ Ε２三量体を含む。更なる態様において、組成物は実質的にＨＣＶ Ε２三量体および高次型を含む。他の更なる態様において、組成物は実質的に高次型ＨＣＶ Ε２を含む。
実質的に三量体ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量基準）超のΕ２三量体を有する組成物の調製物を含む。
実質的に三量体および高次型ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量基準）超のΕ２三量体および高次型を有する組成物の調製物を含む。
実質的に高次型ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量基準）超の高次型Ε２を有する組成物の調製物を含む。
調製物中のΕ２単量体、二量体および三量体、ならびに高次型の各々の重量％または比率を定量するための方法は記述されているか、または当業者に公知である。
一実施形態において、Ε２糖蛋白質は実質的にＨＣＶ Ε２三量体または高次型である。
三量体および高次型ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量基準）超のΕ２三量体および高次型を有する組成物の調製物を含む。
一部の実施形態において、Ε２糖蛋白質は実質的にＨＣＶ Ε２三量体である。
実質的に三量体ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量基準）超のΕ２三量体を有する組成物の調製物を含む。
一部の実施形態において、Ε２糖蛋白質は実質的にＨＣＶ Ε２二量体である。
実質的に二量体ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量基準）超のΕ２二量体を有する組成物の調製物を含む。
一部の実施形態において、Ε２糖蛋白質は実質的にＨＣＶ Ε２二量体およびΕ２三量体である。実質的に二量体および三量体型ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％（重量基準）超のΕ２二量体および三量体を有する組成物の調製物を含み、および／または含率が３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満または１％未満（重量基準）のΕ２単量体を有する組成物の調製物を含む。
一部の実施形態において、本発明の組成物は、ＨＣＶ Ε２糖蛋白質の混合物から単量体を除去するか、二量体および／または三量体のΕ２、および／または高次型を富化することによって得ることができる。一部の実施形態においては、単量体が枯渇化され、および／または二量体および／または三量体および／または高次型が富化されている。
別の実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２組成物は、薬学的にもしくは生理的に許容可能な担体、または希釈液を更に含有する。
更なる実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させた組成物は、アジュバントを更に含む。免疫原を１種以上のアジュバントとの混合物として投与すれば、その免疫原に対する被験対象の応答を増強し得る。免疫アジュバントは典型的に、次の１つ以上の方法で作用する：（１）免疫修飾、（２）拡張提示（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）、（３）ＣＴＬ産生、（４）標的化、および／または（５）デポ生成（ｄｅｐｏｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）。例示的なアジュバントとしては、粒状または非粒状アジュバント、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）、アルミニウム塩、乳剤、ＩＳＣＯＭＳ、ＬＰＳ誘導体（例えばＭＰＬ）およびその誘導体（例えば３Ｄ）、ミコバクテリウム誘導蛋白質（例えばムラミルジペプチドまたはムラミルトリペプチド）、キラヤ・サボンソウ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来の特定のサポニン（例えばＱＳ２１およびＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）サポニン）、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント、ならびにペプチド（例えばサイモシンα１）が挙げられる。アジュバントに関する詳細な説明は、Ｃｏｘ ａｎｄ Ｃｏｕｌｔｅｒ，”Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，Ｅｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．Ｋ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９２，ａｎｄ ｉｎ Ｃｏｘ ａｎｄ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｖａｃｃｉｎｅ １５（３）：２４８−２５６，１９９７に見出され得る。
医薬組成物は、従来の医薬配合技術に従って好都合に調製される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９０を参照のこと。これらの組成物は、いずれか１種の活性物質のほか、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、バッファ、安定剤、または当該技術分野において周知の他の材料も含み得る。そのような材料は、無毒性でなければならず、且つ活性成分の効能を妨げるものであってはならない。担体は静脈内、経口または非経口など、投与に望ましい調製物の型に応じて、取り得る型が広範な種類に及ぶ。
ＨＣＶ Ε２糖蛋白質の例示的な型の１つは、遺伝子型のＨ７７ １ａ（Ε２６６１）のアミノ酸３８４−６６１または別のＨＣＶ遺伝子型からの対応部分を含む、Ε２糖蛋白質のレセプタ結合部分である。
一部の実施形態において、ＨＣＶ Ε２糖蛋白質はＨＣＶの天然改変体に実質的に類似するアミノ酸配列または構造を含む。例えば、Ε２蛋白質は、当該技術分野において公知の１種以上の分離株のアミノ酸配列（例えばＪＦＨ−１、Ｃｏｎ１、Ｈ７７ｃもしくはΕＤ４３分離株）に実質的に類似する場合もあれば、遺伝子型１〜６の１つによって発現した１種以上のΕ２糖蛋白質、またはこれらのフラグメントに実質的に類似する場合もある。
他の実施形態において、ＨＣＶ Ε２糖蛋白質は、宿主細胞レセプタを結合する天然ＨＣＶ Ε２糖蛋白質の改変体であり、および／または中和エピトープもしくは立体配座エピトープによって認識される１つ以上のエピトープを含む。改変体の型の１つは、天然株もしくはその器内培養（ｉｎｃｕｌｔｕｒｅ）の改変体の切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型またはフラグメントである。例示的なフラグメントは、レセプタ結合ドメインを包含する。他の修飾ＨＣＶ Ε２糖蛋白質は、変異体、類縁体、または誘導体を包含する。
一部の実施形態においては、代替または補完として、ＨＣＶ Ε２糖蛋白質は１つ以上の可変領域に欠失突然変異などの変異を含む。例示的な突然変異は、内容全体が参照により本願明細書に援用されている国際公開第２００８／０２２４０１号パンフレットに開示されている。本明細書において断言しているように、３つの可変領域が含まれるか欠失しているΕ２糖蛋白質は、レセプタ結合二量体および／または三量体を形成して、許容される宿主細胞へのウイルス侵入を阻害し得る。
一実施形態において、Ε２蛋白質はΕ２６６１Δ１２３である（本明細書においてΔＨＶＲ１２３は、Δ１２３、Ｄ１２３、ΔＨＶＲ１＋２＋３、Ｄ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ、Ｄ１２３ Ε２６６１、Δ１２３ Ε２６６１およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓとも呼ばれている）。一部の実施形態において、Ε２６６１Δ１２３ Ε２はＨＣＶ Ｈ７７ｃのアミノ酸３８４〜６６１を含み、このアミノ酸において可変領域１および２、ならびにｉｇＶＲ（３）は短リンカーモチーフ（ΔＨＶＲ１２３）で置換される。本発明の他の実施形態は、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２またはｉｇＶＲの任意の組み合わせが欠失しているか短リンカーで置換されたＨＣＶ Ε２蛋白質を含む。これらはΔ１；Δ１，２（Δｌ２）；Δ２；Δ２，３（Δ２３）；Δ３；およびΔ１，３（Δ１３）と略記することもできる。
本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を含む有効量の組成物を被検対象または患者に投与するステップを含む、被検対象または患者における免疫応答を誘発するための方法も更に提供する。実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を含む組成物、特に、被験対象をＣ型肝炎ウイルス感染症に対して免疫化するためのワクチン組成物もまた、本発明によって企図されている。
本明細書において「ワクチン」という用語は、被験対象における免疫応答を誘導する少なくとも１種の免疫学的に活性な成分のほか、必須ではないが、前記活性成分の免疫学的活性を増強する１種以上の追加成分（例えばアジュバント）も含み得る、医薬組成物を指す。加えて、ワクチンは医薬組成物に典型的な更なる成分を含んでいてもよい。ワクチンの免疫学的に活性な成分は、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２組成物を含む。用語「ワクチン」および「ワクチン組成物」は、本発明において交換可能に使用されている。
本発明において企図されている「被験対象」はヒトまたは動物であり、実験室または当該技術分野において受け入れられている試験動物または媒介動物を包含する。「患者」は、治療または予防を要するヒト被験対象を包含する。
一部の実施形態においては、実質的に二量体もしくは実質的に三量体ＨＣＶ Ε２、または二量体および三量体ＨＣＶ Ε２糖蛋白質の混合物、または三量体および高次型ＨＣＶ Ε２の混合物、または二量体、三量体および高次型ＨＣＶ Ε２の混合物、または高次型ＨＣＶ Ε２を含む、被験対象をＨＣＶ感染症に対して免疫化するための組成物、特にワクチン組成物が企図されている。
別の態様において本発明は、ＨＣＶ Ε２糖蛋白質を含む組成物を、ヒトまたはヒト以外の動物被験対象において抗体応答および／または細胞性免疫応答の生成における使用に対応できるよう、実質的に二量体型もしくは三量体型、および／または高次型にて提供する。
真核細胞によって発現される組み換えＨＣＶ Ε２糖蛋白質は、単量体、二量体、三量体、および高次型の混合物として存在するのが一般的である。ＨＣＶ Ε２は、真核細胞または原核細胞において発現し得る。真核生物細胞は、当該技術分野において公知の哺乳動物、植物、酵母、および昆虫の細胞を包含する。組み換え蛋白質は、宿主細胞内で蛋白質を発現させるのに十分な一時期にわたって、またはより好ましくは、宿主細胞が成長する培養培地内に蛋白質を分泌させるのに十分な一時期にわたって、宿主細胞を培養することによって生成される。
「組み換え宿主細胞」「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養」、および単細胞の実体として培養される原核微生物または真核細胞系を意味する他のそのような用語は交換可能に使用されており、組み換えベクターもしくは他の転写ＤＮＡのレシピエントとして使用することが可能であるかまたはそのように使用されてきた細胞を指し、トランスフェクションされた原細胞の後代を包含する。
好適な哺乳類の細胞系は、限定はされないが、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、２９３Ｆ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）およびＣＥＭＸ１７４を包含し、例えば、ＡＴＣＣから入手可能である。他の宿主細胞としては、限定されるものではないが、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、またはＳｆ９細胞などの昆虫細胞が挙げられる。
合成ＤＮＡは、好適なプロモータおよび他の適切な転写調節要素を含む発現ベクターへの分子クローニングによって再結合的に発現し、原核生物または真核生物の宿主細胞に転写され、組み換え蛋白質を生成し得る。そのような操作の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８によって記載されている。
例えば、酵母における発現の構造物は、好ましくは、関連する転写配列および翻訳調節配列が作動可能に連結された合成遺伝子（例えば、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３またはＰＧＫなどのプロモータ、およびＳ・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ１ターミネータなどの終結配列）を含む。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）からなる群から選択され得る。また、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９０も参照されたい。当該技術分野において公知であるように、核酸分子は酵母における発現のために最適化されたコドンであってもよい（Ｓｈａｒｐ ａｎｄ Ｃｏｗｅ，Ｙｅａｓｔ，７：６５７−６７８，１９９１を参照のこと）。任意の所定の細胞種に適切なベクターおよび制御要素は、当業者が本明細書の教示および当該技術分野において公知の発現ベクターの情報を鑑み選択できる。
宿主細胞系におけるクローニングおよび発現に利用可能なベクターは、当該技術分野において周知であり、哺乳類の細胞系におけるクローニングおよび発現用のベクター、または酵母（真菌）細胞、細菌細胞系おけるクローニングおよび発現用のベクター、ファージおけるクローニングおよび発現用のベクター、ならびに昆虫の細胞系におけるクローニングおよび発現用のベクターを含むが、これらに限定されるものではない。発現蛋白質は、標準蛋白質の精製方法を使用して回収してもよい。
翻訳調節要素は、Ｍ．Ｋｏｚａｋ（ｅ．ｇ．，Ｋｏｚａｋ，Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ，７（８）：５６３−７４，１９９６；Ｋｏｚａｋ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．，７６（９）：８１５−２１，１９９４；Ｋｏｚａｋ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１０８（２）：２２９−２４１，１９８９；Ｋｏｚａｋ ａｎｄ Ｓｈａｔｋｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，６０：３６０−３７５，１９７９）によって論評されてきた。
組み換え糖蛋白質は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９（ｓｕｐｒａ）、特に１３節、１６節および１７節；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４、特に１０章および１６章；およびＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５−１９９７（ｓｕｐｒａ）、特に１章、５章および６章に記載されている標準プロトコールを使用して、好都合に調製できる。ポリペチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｓｈｅｐｈａｒｄ，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｄ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｉｎ Ｒｏｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９（５２２１）：２０２−２０４，１９９５の９章に記載されているような化学合成によって（例えば、溶液合成または固相合成を使用して）合成できる。
本発明はまた、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を含む組成物を被検対象に投与するステップを含む、被験対象をＣ型肝炎ウイルス感染症に対して免疫化するための方法も提供する。
関連する実施形態において本発明はまた、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を含む組成物を被検対象に投与するステップを含む、被検対象におけるＣ型肝炎感染症を治療するための方法も提供する。
本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を含む有効量の組成物を被検対象または患者に投与するステップを含む、被験対象または患者における体液媒介性または細胞媒介性の免疫応答を誘発するための方法も更に提供する。
これらの実施形態によれば、組成物は一般的に、Ε２特異抗体の生成を含む免疫応答を誘発するのに十分な条件下で投与される。本発明の組成物は、単回投与または単回塗布として投与してもよい。代替方法として、組成物に反復投与または反復塗布を含めてもよく、例えば組成物を２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の回数投与できる。
本発明が思量するワクチン投与レジメンの例は、以下のとおりである：初期ワクチン投与後、被験対象は典型的に２〜４週間の間隔（例えば３週間の間隔）を置いてブーストを投与され、任意選択的に、続いて反復的ブーストを投与される。本発明の特定の実施形態においては、単回投与ワクチンスケジュールが提供される。このスケジュールに従えば、組成物を単回投与するだけでＣ型肝炎を予防するのに十分であり、初期ワクチン投与後に一切ブーストを必要とせずに済む。
一部の実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２に対して生成される抗体は、例えば宿主細胞侵入またはウイルス出芽などのＨＣＶライフサイクルの重要部分を少なくとも部分的に中和する抗体を包含する。
本発明は、ＨＣＶ感染症の治療もしくは予防における、またはそのための薬剤の製造における、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２の使用に更に関する。ヒト化抗体および脱免疫抗体（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）もまた、本発明に包含される。用語「製造」は、産生またはスクリーニングを包含する。
別の実施形態において本発明は、実質的に二量体型および／または三量体型、および／または高次型ＨＣＶ Ε２糖蛋白質を含む組成物の有効量を被検対象または患者に投与するステップを含む、被験対象または患者における体液媒介性または細胞媒介性の免疫応答を誘発するための方法も提供する。
関連する実施形態において本発明は、実質的に二量体型および／または三量体型、および／または高次型ＨＣＶ Ε２糖蛋白質を含む組成物の有効量を被検対象または患者に投与するステップを含む、被検対象におけるＣ型肝炎感染症を治療するための方法、または被験対象をＣ型肝炎ウイルス感染症に対して免疫化するための方法を提供する。
一部の実施形態において本発明は、（ｉ）１種以上の二量体もしくは三量体または高次型ＨＣＶ Ε２型に結合しおよび／または（ｉｉ）単量体ＨＣＶ Ε２に結合しない抗体または薬剤を選択するステップを含む、治療用抗体または他の治療用結合剤を選択するための方法を提供する。
本明細書に用いられている用語「有効量」は、「治療上有効量」および「予防上有効量」を包含し、本発明の組成物を単回投与にて、または連続放出（ｓｅｒｉｅｓ ｒｅｌｅａｓｅ）系もしくは徐放系の一部として投与した場合に、一部の被験対象において所望の治療的、予防的、または生理的効力が得られる十分な量を意味する。時には所望の治療効果と共に好ましくない効果（例えば、副作用）が顕在化することがあり得る。よって、開業医は、適正な「有効量」を定量する際に潜在的な利益と潜在的リスクのバランスをとる。組成物の正確な所要量は、被験対象の化学種、年齢および全身状態、投与様式、ならびにこれらに類するものに応じて被験対象ごとに異なる。それゆえに、正確な「有効量」を特定することが不可能な場合もある。ただし、任意の個々の症例における適正な「有効量」は、当業者がありきたりの技法または実験を使用して定量し得る。当業者であれば、組成物もしくは他の薬剤の前回投与、被験対象のサイズ、被験対象の症状の重篤度、もしくは感染した母集団におけるの症状の重篤度、ウイルス量、および特定の組成物、または選択された投与経路などの因子に基づいて所要量を定量できるであろう。
用語「治療」は、１種以上のＨＣＶ症状にあるかまたは進行したＨＣＶ症状を起こすリスクもしくはＨＣＶ伝播のリスクに曝されている少なくとも一部の被験対象において、測定可能なまたは統計学的に有意な任意の改善を指す。
用語「防止」および「予防」ならびにこれらに類する用語は交換可能に使用され、今後の感染の防止もしくは減衰、またはＨＣＶに感染するリスクの軽減、またはＨＣＶ感染症に伴う病態もしくは病態の徴候の重篤度の緩和もしくは発病の抑制を目的に、ＨＣＶに感染したことを知らない被験対象に本発明の組成物を投与することを包含する。
ワクチン組成物の投与は、一般に予防を目的としたものである。組成物の予防的投与は、以後何らかの感染症の防止または減衰に役立つ。「薬理学的に許容可能な」組成物は、レシピエント患者が耐容性を示す組成物である。有効量のワクチンが投与されることが、企図されている。「有効量」とは、十分な体液性または細胞性免疫を誘導するなど所望の生物学的効力を得るのに十分な量のことを云う。これは、ワクチンの種類、レシピエントの年齢、性別、健康状態、および体重に依存し得る。所望の生物学的効力の例は、無症状化、症状の軽減、組織または経鼻的分泌におけるウイルス力価の低減、Ｃ型肝炎ウイルス感染の完全な予防、およびＣ型肝炎ウイルス感染に対する局部的予防を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本発明のワクチンまたは組成物が存在することによってレシピエント患者において感染性Ｃ型肝炎ウイルス株に対し少なくとも１つの一次もしくは二次の体液性または細胞性免疫応答を増強するかその増強を示す検出可能な生理的変化が起こる結果になった場合には、本発明のワクチンまたは組成物が生理的に有意なものになる。ワクチン組成物は、ウイルス感染症に対する保護を目的に投与される。対照群または一連の患者と比較して統計学的に有意な改善がある場合、「予防」は絶対的なものである必要はない（即ち、防止または根絶が完全なものである必要はない）。予防は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の症状発現の重篤度または速度を低減することだけに限定されてもよい。
一実施形態では、感染症の発症前（予期される感染症を防止もしくは減衰させるため）、または感染症の発症後のいずれかに、本発明のワクチン組成物を被験対象に提供し、それによりウイルス感染症から保護する。一部の実施形態では、被験対象間のウイルス伝播を低減する目的から、本発明のワクチン組成物を感染症の発症の前または後に被験対象に提供する。
Ｃ型肝炎感染症もしくはＨＣＶ感染症に伴う症状の治療または防止を目的に、本発明の組成物を唯一の活性医薬剤として投与してもよくまたは１種以上の薬剤と併用してもよいことが、更に認識されるであろう。本発明の組成物もしくは組成物の組み合わせと併用投与される他の薬剤には、ＨＣＶ感染によって引き起こされる疾患に対する治療薬、または直接もしくは間接的機序によってＨＣＶウイルスの複製を抑制する治療薬が包含される。これらの薬剤は、限定はされないが、宿主免疫モジュレータ（例えば、インターフェロン−α、ペグ化インターフェロン−α、コンセンサスインターフェロン、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、およびこれらに類するもの）；イノシン酸デヒドロゲナーゼ（例えば、リバビリン、およびこれらに類するもの）など、宿主細胞作用を阻害する抗ウイルス化合物；免疫機能を調節するサイトカイン（例えば、インターロイキン２、インターロイキン６、およびインターロイキン１２）；１型ヘルパーＴ細胞応答の発生を増強する化合物；干渉ＲＮＡ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）；アンチセンスＲＮＡ；ＨＣＶに対するＨＣＶ抗原もしくは抗原アジュバントの組み合わせを含むワクチン；宿主の細胞成分と相互作用し、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）が開始したＨＣＶウイルス複製の翻訳ステップを阻害することによりウイルス蛋白質合成をブロックするか、またはビロポリン（ｖｉｒｏｐｏｒｉｎ）ファミリの膜蛋白質（例えば、ＨＣＶ Ｐ７、およびこれらに類するもの）を標的とする薬剤と共にウイルス粒子の成熟および放出をブロックするための薬剤；ならびにウイルス複製に関与するウイルスゲノムの他の蛋白質を標的化することによってＨＣＶの複製を阻害し、および／または他のウイルス標的の作用を妨げる、任意の薬剤もしくは薬剤の組み合わせ（例えばＮＳ３／ＮＳ４Ａプロテアーゼの阻害剤、ＮＳ３ヘリカーゼ、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ、ＮＳ４Ａ蛋白質、およびＮＳ５Ａ蛋白質）が挙げられる。
更に別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、ＨＣＶライフサイクルにおいて標的となる他の阻害剤（限定はされないが、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、メタロプロテアーゼ、ＮＳ４Ａ蛋白質、ＮＳ５Ａ蛋白質、および内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）を含む）を更に含有していてもよい。
投与は一般的に一定時間、Ε２特異抗体の生成を含む免疫応答または細胞性免疫応答を誘発するのに十分な条件下で行われる。 免疫原性組成物は、肺経由、経口、静脈内（水溶性の場合）、腹膜内、筋内、皮下、皮内、髄腔内もしくは坐薬経路、またはインプラント（例えば、徐放製剤を使用）などの便宜的な方法で投与し得る。投与は全身投与または局所投与であり得るが、全身投与の方が便宜性が高い。他の投与の経路としては、パッチ剤貼付、細胞転写、インプラント、舌下、眼内、局所、経口、直腸、経膣、経鼻、または経皮が企図されている。
本明細書において「免疫応答」は、本発明の組成物の存在に対する身体全体の反応を指し、抗体作製、および組成物に対する免疫の発現を包含する。ゆえに、抗原に対する免疫応答はまた、被験対象において関心のある抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答の発生も包含する。「体液性免疫応答」は、血漿細胞が生成した抗体によって媒介される。「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介されるものである。
本明細書において「抗体価」は、被験対象ごとの免疫前試料の希釈率を超える値を生じさせた、免疫後血清の最高希釈率として定義し得る。
本発明の実施形態はまた、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２から単離された成分に対する免疫応答を評価するためのアッセイも提供する。
アッセイは、抗体応答および遅延型過敏症応答の測定を目的としたアッセイなどの、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイを含んでもよい。一実施形態において、Ｂ細胞作用のほかＢ細胞／Ｔ細胞の相互作用を測定し得る。抗体応答アッセイでは、抗原チャレンジに続いて、血中の抗体価を比較し得る。これらのレベルは、抗体の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤ）に応じて数量化できる。また、血液中の抗体およびリンパ球の濃度を抗原性刺激なしで定量して、免疫系の発生を評価することもできる。
アッセイはまたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを含んでいてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、細胞が分裂する能力、細胞が他の細胞の分裂を助ける能力、またはリンフォカイン（ｌｙｍｏｐｈｏｋｉｎｅ）および細胞が他の因子を放出し、活性化マーカーを発現させ、且つ標的細胞を溶解する能力を定量するステップを含み得る。マウスおよびヒトにおけるリンパ球はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで比較できる。一実施形態において、末梢血液細胞、脾細胞、またはリンパ節細胞などのような類似する源からのリンパ球が比較される。ただし、ヒトおよびマウスの脾細胞における末梢血細胞の非限定例のような異なる源からのリンパ球を比較することも可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは、（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびマクロファージの場合）細胞を精製してもよいし、または（例えば、脾細胞もしくはリンパ節細胞の場合）その生来の状態のままにしておいてもよい。精製は、所望の結果を得るための任意の方法であり得る。細胞は、有糸分裂促進因子または特異性抗原を使用して増殖する能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験し得る。特異性抗原の存在下で細胞が分裂する能力は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して定量し得る。培養細胞からの上澄み液を試験して、細胞が特異的リンフォカインを分泌する能力を数量化してもよい。培養物から細胞を除去して、活性化抗原を発現する能力を試験することもできる。この試験の実施には、活性化抗原に結合する抗体またはリガンド、および活性化抗原をコードするＲＮＡを結合するプローブの使用に関する非限定例に挙げられているような、何らかの好適な方法を用いることができる。
また、一実施形態においては、表現型細胞アッセイを行うことによって、特定の細胞種の頻度を定量できる。末梢血球の計数を行うことによって、血中のリンパ球またはマクロファージの数を定量できる。ＣＤ４細胞数およびＣＤ４／ＣＤ８比率の定量に関する非限定例に挙げられているように、抗体を使用して末梢血リンパ球をスクリーニングすることによって、或る抗原を発現する細胞のパーセントを定量できる。
これらの実施形態によれば、組成物は一般的に、Ε２特異抗体応答または細胞性免疫応答の生成を含めた免疫応答を誘発するのに十分な条件下で、一定時間投与される。本発明の組成物は、単回投与または単回塗布として投与してもよい。代替方法として、組成物に反復投与または反復塗布を含めてもよく、例えば組成物を２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の回数投与できる。
更なる実施形態において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を免疫学的に有効量だけ被験対象に注射するステップと、生成された抗体を単離し精製するステップと、を含む、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２組成物に対する抗体を生成するための方法を提供する。別の実施形態において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２に対して産生される精製抗体を提供する。
別の実施形態において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させた型ＨＣＶ Ε２に対して産生される抗体を提供する。一部の実施形態において、抗体は三量体、または二量体もしくは高次型、または三量体および二量体型ＨＣＶ Ε２糖蛋白質、または三量体および高次型ＨＣＶ Ε２糖蛋白質に存在するエピトープに特異的であり、単量体、二量体、三量体および高次型ＨＣＶ Ε２間、または単量体および二量体／三量体型ＨＣＶ Ε２間で識別され得る。
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。更に、抗体は、典型的には当該技術分野の熟練者に公知の基準を用い、診断、予後、治療的、予防的、およびスクリーニングの用途に合わせて選択し得る。
用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体から誘導される全ての多様な型を包含し、限定はされないが、全長抗体（例えば、無傷のＦｃ領域を有する）抗原結合性フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む；ならびに単鎖抗体などの組み換え方法を使用して生成された抗体由来のポリペチドを包含する。本明細書に用いられている用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」はまた、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、または脱免疫抗体（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）も指すほか、例えばトランスジェニック動物においてまたはバクテリオファージディスプレイを介して生成されるヒト抗体も指す。また、治療的に許容可能な他の型の抗体、およびその抗原結合性フラグメント、例えば、海生軟骨動物（ｃａｒｔｉｌａｇｅｎｏｕｓ ｍａｒｉｎｅ ａｎｉｍａｌ）もしくはラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）またはそのような抗体を基にしたライブラリから誘導される単一ドメイン抗体も包含し得る。抗体のフラグメント化型または修飾型を選択する際にはまた、フラグメントまたは修飾型が抗体またはフラグメントの半減期に対して受ける何らかの影響に対する配慮を必要とすることもあり得る。
一部の実施形態において、抗体は薬学的にもしくは薬理学的に許容可能な担体、希釈液または賦形剤を具備する。
他の実施形態において、抗体は診断または予後の目的に合わせて選択される。一部の実施形態においては、抗三量体、または抗二量体もしくは抗高次型ＨＣＶ Ε２糖蛋白質抗体を具備するキットが提供される。
「薬学的に許容可能な担体および／または希釈液」は、別段有害ではない（即ち、それ自体でまたは活性組成物と共に実質的な有害な反応を引き起こす可能性の低い）材料からなる賦形薬である。担体は、あらゆる溶媒、分散媒、被覆物、抗菌剤、および抗真菌剤、張度調節のための薬剤、吸収率もしくはクリアランス率増減のための薬剤、ｐＨ維持用のバッファ、キレート剤、メンブレン交差剤、または障壁交差剤を包含し得る。薬学的に許容可能な塩は、別段有害でない塩である。薬剤、または薬剤を含む組成物は、薬学的に許容可能な無毒性塩類（酸添加塩類または金属複合体など）の形で投与してもよい。
経口投与の場合、組成物を固体製剤または液体製剤（例えば、カプセル、丸薬、錠剤、トローチ剤、粉末、懸濁液、または乳剤）に処方し得る。組成物を経口投与の形で調製する際には、経口液体製剤（例えば、懸濁液、エリキシル剤、および溶液など）の場合は、例えば、水、グリコール類、油類、アルコール類、香料類、保存料、着色剤、懸濁剤、およびこれらに類するもの；または経口固体製剤（例えば、粉末、カプセル、および錠剤など）の場合は、デンプン、糖、希釈液、造粒剤、潤滑油、結合剤、崩壊剤などの担体、およびこれらに類するものなどのような通常の医薬媒介物であれば、いかなるものも使用できる。固体薬用担体が使用されていることが明らかな場合、錠剤およびカプセルは、投与が容易であるという理由から最も有利な経口投与単位形式である。錠剤は、結合剤（例えば、トラガカンタ、トウモロコシ、デンプン、またはゼラチン）、崩壊剤（例えば、アルギン酸）、および潤滑油（例えば、ステアリン酸マグネシウム）を含有していてもよい。錠剤は、所望により、標準的な技術によって糖衣錠または腸溶錠とすることができる。活性組成物はカプセル化することにより、安定した状態で胃腸管を通過できるようになる。例えば、国際公開第９６／１１６９８号パンフレットを参照のこと。
非経口投与の場合、組成物を担体に溶解し、溶液または懸濁液として投与し得る。経粘膜送達または経皮的（パッチを含む）送達の場合、組成物送達の用途には、当該技術上公知の適切な浸透剤が使用される。吸入の場合、送達には乾燥粉末エアロゾル、液体送達系、エアジェット噴霧器、推薬系などの何らかの便宜的な系が使用される。例えば、調製物をエアロゾルまたは噴霧の形で投与してもよい。また、組成物を持続送達または徐放の形で送達してもよい。例えば、持続送達可能な生分解性ミクロスフィアもしくはカプセル、または他のポリマー構成を製剤に混入してもよい。製剤は、薬物動態および生体分布が変わるように修飾し得る。薬物動態の概略説明については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９０（ｓｕｐｒａ）を参照のこと。一部の実施形態においては、調製物を脂質単層または二重層（例えば、リポソームもしくはミセル）に移入してもよい。当該技術分野において公知の標的化治療薬を用い、或る種の細胞または組織に特異的な薬剤を送達することもできる。
実際に投与される活性薬剤の量、ならびに投与の速度および時間経過は、疾患の性質および重篤度に依存する。治療の処方、例えば、投与、時間調整などの決定は、一般開業医または専門家の責任の範囲内にあり、典型的には、個々の患者の病態、送達部位、投与方法、および開業医に公知の他の因子が考慮される。技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９０（ｓｕｐｒａ）に見出され得る。
調製可能な持効性製剤は、免疫応答を誘導するうえで特に好都合である。持効性製剤の例としては、基質が造形物（例えば、フィルムまたはミクロ莢膜）の形態であるポリペチドを含有する、固体疎水性ポリマーの半透性基質が挙げられる。持効性基質の例としては、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、ポリエステル繊維（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸塩とのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸グリコール酸などのポリマー類の場合は分子の放出可能期間が１００日間にもわたるが、ヒドロゲルによっては蛋白質の放出期間がそれより短いものもある。脂質含量が約３０％超のコレステロールで、選択された比率が至適な治療用に調整されている、小型（約２００〜８００オングストローム）のユニラメラ種のリポソームを用いることもできる。
蛋白質の安定化は、スルフヒドリル残留物を修飾するステップと、酸性液から凍結乾燥させるステップと、含水量を制御するステップと、適切な添加剤を使用するステップと、特定のポリマーマトリックス組成物を作製するステップと、を介して遂行し得る。ｉｎ ｖｉｖｏでの蛋白質の半減期は、当該技術分野において公知の技術（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基などの他の要素を結合するという手段を含む）を使用して延長できる。
当該技術分野において開示されているプライム・ブースト免疫付与化戦略が企図されている。例については、国際公開第２００３／０４７６１７号パンフレットを参照のこと。ゆえに、組成物は、ワクチン、プライミングまたはブースト剤の形を取り得る。
別の態様では、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を使用した、スクリーニング法が提供されている。実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２を含むスクリーニング法は、識別結合分子の同定を意図したものである。結合分子（抗体または抗原結合フラグメントなど）、配位子、ペプチド、有機分子または無機分子は一般に、当該技術分野において認知されているプロトコールを使用して、単離されスクリーニングされる。
本発明はまた、ＨＣＶ感染症の診断もしくはモニタリング、または抗ＨＣＶ治療プロトコールのモニタリングにおける、あるいはそのための診断薬の製造における、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２の使用にも供する。
本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２糖蛋白質またはそれをコードする核酸を被験対象に投与するステップと、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２に結合可能な（とりわけレセプタ結合をブロックできる）その被検対象由来の抗体を選択するステップと、を含む、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２組成物に対する精製抗体を生成するための方法を提供する。一部の実施形態においては、ウイルス活性を中和する能力（ウイルス感染性、ウイルス出芽またはウイルス量（ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ）を低減する能力など）について、抗体または抗原結合フラグメントを試験する。
本発明は、推定の相互作用化合物を実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２糖蛋白質に接触させるステップと、推定の相互作用化合物とΕ２組成物との間の相互作用の結合特性、ＣＤ８１などのＨＣＶレセプタに結合する能力、またはＨＣＶにより結合された他の宿主残基に結合する能力を定量するステップと、を含むスクリーニング方法を思量する。
本発明は、被験対象に由来する試料を実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２糖蛋白質に接触させるステップと、試料成分とＨＣＶ Ε２糖蛋白質との間の相互作用を定量するステップと、を含む方法を思量する。一部の実施形態においては、様々なＨＣＶ遺伝子型からの様々な二量体および／または三量体、または単量体を枯渇化させたΕ２糖蛋白質のアレイを使用してもよい。一部の実施形態において、試料は血液試料などの抗体を含む試料である。
一部の実施形態において、試料は感染した被験対象に由来するものである。対照試料には、感染していない個人に由来する試料が包含される。試料は、被験対象のいずれの部分に由来するものでもよい。便宜的な試料としては、血液、血清、血漿、尿、痰、およびこれらに類するものが挙げられる。当業者に公知の好適なアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、およびＥＩＡなどのアッセイ、および競合アッセイが挙げられる。被験対象アッセイは、特にセロサーベイランスに有効である。
別の態様において本発明は、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２糖蛋白質を含む、キットまたは固体基質または半固体基質を提供する。本発明のキットまたは基質は、診断、予後、治療的もしくは予防的用途、更にはＨＣＶ Ε２結合分子もしくはＨＣＶレセプタ結合分子の設計、および／またはスクリーニングの用途での使用に対応するように企図されている。キットおよび基質はまた、ＨＣＶ感染症に対する治療プロトコールの効能をモニターするのにも有効である。一部の実施形態において、キットまたは基質は、実質的に単量体ＨＣＶ Ε２を更に別の部分に含む。
実質的に単量体ＨＣＶ Ε２を含む組成物は、含率が８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％（重量基準）超の単量体Ε２を有する組成物の調製物を含む。
一部の実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２糖蛋白質を含むキットは、ウイルス感染症の診断もしくは予後、病原体モニタリング、またはセロサーベイランスキットに好都合にも使用され、（またはそうしたキットにおける使用に対応したものであり）、且つ任意選択的にパッケージ、指示書、ならびにバッファ、基質、抗体もしくはリガンド、対照抗体もしくは対照リガンド、および検出試薬などのような他の様々なコンポーネントを具備する。
一部の実施形態においては、抗三量体および抗二量体、ならびに抗高次型ＨＣＶ Ε２特異抗体が使用される。
用語「単離された」および「精製された」は、通常その生来状態において単離および精製を伴う成分を、実質的または本質的に含有しない材料を意味する。例えば、「単離された核酸分子」は、天然状態でその側面に位置する配列から単離された核酸またはポリヌクレオチド（例えば、通常はフラグメントに隣接している配列から除去されたＤＮＡフラグメント）を指す。特に、単離されたＨＣＶ Ε２は、蛋白質をその生来の細胞環境から、および細胞の他の成分との会合から、ｉｎ ｖｉｔｒｏで単離および／または精製することを含む。限定されるものではないが、単離された核酸、ポリヌクレオチド、ペプチドもしくはポリペチドは、精製により単離された生来の配列を指す場合もあれば、組み換え手段または合成手段によって生成される配列を指す場合もある。一部の実施形態において、実質的に単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２の精製物は、少なくとも９５〜９９％純度である。
改変体と云った場合は、要素（ｐａｒｔｓ）、誘導体、および化学的類似体が包含される。企図される化学的類似体には、側鎖の修飾、合成時の人為的アミノ酸および／またはそれらの誘導体の移入、ならびにリンカーもしくは架橋剤または他の手段の使用によって、とりわけ立体制約因子を課すことが含まれる。
以下、非限定例を挙げながら本発明について更に詳しく説明する。実施例に使用されている材料および方法は、下掲のとおりである。
蛋白質精製およびサイズ排除クロマトグラフィ：哺乳動物において発現されるΕ２蛋白質
３つの別個の分離株から２つの型Ε２糖蛋白質を生成し、３つの可変領域（ＨＶＲ１２３−ｈｉｓ）が欠失した野生型Ε２６６１−ｈｉｓ構造物（ＷＴ−ｈｉｓ、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ）および修正版（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）Ε２６６１−ｈｉｓを、２９３Ｆ細胞を使用して哺乳類の発現系にて発現させた。ＷＴ−ｈｉｓは国際公開第２００８／０２２４０１号パンフレットに記載されている。代替方法として、昆虫系または酵母発現系を使用して、Ε２糖蛋白質を生成することもできる。特に注記がない限り、３つの可変領域が欠失したＷＴおよび派生型（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）のΕ２６６１−ｈｉｓと云った場合は、ＨＣＶのＨ７７ｃ（遺伝型１ａ）株からのΕ２配列を指す。
メーカーの指示書に従い、Ｎｉ−ＭＡＣバッファＡで平衡化させたＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して組織培養上澄み液を精製し、Ｎｉ−ＭＡＣバッファＢで結合蛋白質を溶出させた。蛋白質を含有する画分をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）で検出し、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ高速液体蛋白質クロマトグラフィシステム（ＦＰＬＣ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、リン酸緩衝食塩水（１×ＰＢＳ；１０ｍＭのＮａＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．３））にバッファ交換した。
Ε２６６１／５−ｈｉｓ（ＪＦＨ１株：ＪＦＨ１株においては余剰な４つのアミノ酸残基に資するインサーションが存在するという理由から、Ε２外部ドメインの端は事実上、残基６６５に位置する）の異なる型を単離するため、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣシステムを使用し、ＴＳＫＧ３０００ｓｗＸＬカラム（２１．５ｍｍ×６０ｃｍ、ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カラム容量（ＣＶ）２００ｍＬ）を１×ＰＢＳ中で平衡化させ、分取サイズ排除クロマトグラフィを行った。最大注入容量は２ｍｌであった。装填の前に、メーカーの指示書に従い、１０，０００のＤａｌｔｏｎ（Ｄａ）分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）濾過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して精製蛋白質を約１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。この濃度で蛋白質が溶液から析出したことから、これらの蛋白質の予測等電点（ＰＩ）（ＰｒｏｔＰａｒａｍ）を回避するため、バッファがｐＨ７．３〜６．８に滴定された。平均流速２ｍｌ／分で試料をラン（ｒｕｎ）して、２ｍｌずつの画分を６０〜１６０ｍＬ収集した。複数のラン（ｒｕｎ）からの画分をプールして０．１〜１ｍｇ／ｍＬ採取した。
Ｗａｔｅｒｓ社製の高性能液体クロマトグラフィシステム（ＨＰＬＣ、 Ａｌｌｉａｎｃｅ）、および最大装填容量０．２ｍＬの小型ＴＳＫＧ３０００ｓｗｘｌカラム（ＴＯＳＯＨ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、１５ｍＬ ＣＶ）を使用して、分析用サイズ排除クロマトグラフィを行った。最高の解像度が得られるよう、１×ＰＢＳ中で流速０．２５ｍＬ／分にて６０分間実験を実施した。この方法を使用して、ピーク単量体および二量体画分について室温で７２時間にわたって安定性分析を実施し、その間、２４時間ごとにラン（ｒｕｎ）をプログラムした（０分での標準試料を含む）。精製ウシ血清アルブミンおよび卵白アルブミンを０．５ｍｇ／ｍＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にてサイズ標準対照（ｓｉｚｅ−ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。
ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して吸光度２８０ｎｍにて蛋白質を定量した。ＰｒｏｔＰａｒａｍ（Ｅｘｐａｓｙ）にてアミノ酸配列から定量された理論的な吸光係数（ε）を使用して、濃度を調整した。
ＷＴおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の４つの別個の画分を単離するため、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅクロマトグラフィを行った。蛋白質を５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に装填し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール（低ＵＶ）ｐＨ７．４含有の結合バッファに入れた。予備溶出洗浄ステップを２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのイミダゾール（低ＵＶ）ｐＨ７．４を使用して行い、溶出を２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭのイミダゾール（低ＵＶ）ｐＨ７．４で行った。続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｐｇ２６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でサイズ排除クロマトグラフィを行った。選択された画分をプールし、０．２２μｍを濾過した。
蛋白質ごとに非分画混合調製物を調製した。その際、上記と同じＮｉセファロースクロマトグラフィ法を使用したが、サイズ排除は行わなかった。試料をＮｉセファロースから溶出させた後、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で直接に脱塩した。
細菌において発現される蛋白質
残基１１３〜２０１（ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１）間のＣＤ８１大細胞外ループ（ＬＥＬ）に連結されたマルトース結合性蛋白質（ＭＢＰ）からなるキメラの発現および精製は、前述したとおりである（Ｄｒｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３２８：２５１−２５７，２００５；Ｄｒｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：１１１４３−７，２００２）。この二量体型のＣＤ８１−ＬＥＬは、Ε２−ＣＤ８１の相互作用を詳細に特性評価する目的に使用されてきたもので、生来のＣＤ８１と極似の擬態物で且つクローディン−１の第１細胞外ループ（ＥＣ１）との相互作用が可能であることが立証されてきた（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５：２１０９２−１０２，２０１０）ばかりでなく、細胞関連の全長ＣＤ８１間のホモタイプな相互作用、およびｈＣＤ８１−ＬＥＬの結晶構造に見られるホモ二量体を反映するものでもある。
ＣＤ８１ ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１ ＷＴおよびＦ１８６Ｓ形質転換ＢＬ２１ ＤＥ３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、塩類およびアンピシリンを補給したテリフィックブロス（ＴＢ）中で生育された。
０．１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−Ｉ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用い室温で４時間蛋白質発現を誘導し、細胞を回収し、洗浄して、−８０℃で保存した。可溶蛋白質をＳバッファのソノポレーションで単離し、２０，０００ｘｇで清澄化し、０．４５ｕｍフィルターに通して濾過した。メーカーの指示書に従い、アミロース樹脂（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して蛋白質をアフィニティ精製した。１０ｍＭのマルトースに溶出させた蛋白質陽性画分を、ブラッドフォードアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）で定量した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣを使用し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ １６／２０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＳバッファで平衡化させて、サイズ排除クロマトグラフィを行い、二量体および単量体蛋白質を単離した。ＨＲ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＡＫＴＡ ＦＰＬＣを使用した分析用サイズ排除クロマトグラフィで、単一の二量体ピークの単離を確認した。３０，０００Ｄａ ＭＷＣＯ濾過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して蛋白質を濃縮し、上述したように定量した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
着色済みＰｒｅｃｉｓｉｏｎ−Ｐｌｕｓサイズ標準マーカーを使用して、プレキャスト４〜１２％のＮｕ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）で、精製Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質を分析した。必要に応じて蛋白質を非還元または還元条件に置き、クーマシーブリリアントブルー溶液（０．１％ｗ／ｖクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、５％ｖ／ｖ氷酢酸、５０％ｖ／ｖメタノール）で染色して可視化した。ゲルを１０％（ｖ／ｖ）メタノール、および１０％（ｖ／ｖ）酢酸で脱色し、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＬＩ−ＣＯＲ蛍光スキャナおよび定量ソフトウェアでクーマシー染色蛋白質の移行を分析した。
１０μｌの４Ｘ還元／非還元試料バッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加された各ＨＣＶ−Ｈｉｓ改変体３μｇずつを使用して、ＷＴおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の４つの別個の画分および非分画の混合物を分析した。試料を７０℃で３分間加熱して、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｎｕ ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せた。還元ゲル用に、５００ｕｌのＮｕＰＡＧＥ酸化防止剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＮＰ０００５）をゲルタンクの中心成分（ｃｅｎｔｒｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）に添加してから、２００ｖを印加した。
ウエスタンブロット分析
４Ｘ還元試料バッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加された各ＨＣＶ−Ｈｉｓ改変体０．５μｇずつを使用して、ＷＴおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の４つの別個の画分および非分画混合物を分析した。前述したように、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後、蛋白質を１時間の湿潤転写（ｗｅｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ）によってＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク含有のＰＢＳで一晩ブロックした。一次抗体を１％スキムミルク含有の０．０５％ＴＢＳに１：１０００（Ｐｅｎｔａ−ＨｉｓおよびΕ２）の希釈率で添加した。０．０５％ＴＢＳで１０分ずつ３回洗浄を行った。ヒツジ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰの二次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１％スキムミルク含有の０．０５％ＴＢＳに１：２０００の希釈率で添加した。０．０５％ＴＢＳで１０分ずつ３回洗浄を行った。メーカーの指示書に従い、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ，Ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｄｅ ＲＰＮ２１３２）をメンブレンに塗布し、バンドを５２０ｎｍにて可視化した。
マススペクトロメトリ分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）マススペクトロメトリ（ＭＳ）を使用して、マススペクトロメトリ分析を行った。メーカーの指示書に従い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析前にＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、単量体および二量体Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質（ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３）を精製した。
バイオセンサー分析および評価
全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００ユニット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。蛋白質リガンドを１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）にバッファ交換した後、アミンカップリング法でＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定し、約８００の応答単位（ＲＵ）を得た。固定化は１×ＨＢＳ−Ｎバッファ（０．０１Ｈｅｐｅｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ）中で行った。あらゆる実験において、前述のフローセル内で陰性対照リガンドを固定したか、または、代わりに、陰性対照検体注射剤を使用して非特異的結合を減算できるようにした。速度実験をＨＢＳ−ＥＰバッファ（０．０１Ｈｅｐｅｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中で流速１０ｕＬ／分にて行った。蛋白質検体を４〜５回の連続２倍希釈（ｓｅｒｉａｌ ｔｗｏ−ｆｏｌｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）でＨＢＳ−ＥＰに溶かし、開始濃度を０．１ｍｇ／ｍＬとしてシステムに注入した。注入を２５０秒間行い、会合速度を得て、６００秒間解離させた。濃度精度が保証されるように、中点濃度にて独立したローディングコントロールを含めた。各サイクル間で流速１００ｕＬ／分にて再生成を行い、１００ｍＭのリン酸に２つの１５ｕＬパルスを含めた。
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、平衡熱力学に基づく３つの理論的結合モデルに従い、未加工のバイオセンサーデータに対して大域的適合を行った。注目すべきことに、バックグラウンド減算後は、いずれの未加工データにもバルク屈折率効果（ＲＩ）が観測されなかった。このため、ＲＩは、適合時に定数ゼロ値に設定された。それぞれの反応スキーム内で、成分ＡおよびＢはそれぞれリガンドおよび検体を表す。
「１：１ラングミュア結合」モデル。
Figure 0005897024
 式中、「ｋａ」は順方向で「ｋｄ」は逆方向である。
ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ
検体とリガンド間の会合速度（ｋａ＝１／Ｍｓ）は正反応を表し、モル検体濃度（Ｍ）および秒単位の時間（ｓ）の関数である。解離速度（ｋｄ＝１／ｓ）は、時間に相関するが濃度には依存しない逆反応を表す。平衡解離定数、即ちモル単位（Ｍ）のＫＤは、解離速度（ｋｄ）を会合速度（ｋａ）で除算することによって計算できる。
「二状態結合（立体配座変化）」モデル。
Figure 0005897024
 式中、「ｋａ１」は順方向で「ｋｄ１」は逆方向である。
Figure 0005897024
 式中、「ｋａ２」は順方向で「ｋｄ２」は逆方向である。
ＫＤ＝（ｋｄ１／ｋａ１）×（ｋｄ２／ｋａ２）
このモデルは、上述した１：１の結合相互作用を一次会合速度（ｋａ１＝１／Ｍｓ）および解離速度（ｋｄ１＝１／ｓ）で記述する、２つの反応速度式を生成する。二次会合速度（ｋａ２＝１／ｓ）および解離速度（ｋｄ２＝１／ｓ）は、検体とリガンドとの間の相互作用時に発生する立体配座変化のキネティクスを表す。この相互作用は、時間に相関するが検体濃度には依存しないものとして記述される。全般的なＫＤ値は、一次方程式および二次方程式によって生成されたＫＤ値を乗算することによって得られる。
「二価検体」モデル：
Figure 0005897024
 式中、ｋａ１（×２）は順方向でｋｄ１は逆方向である。
Figure 0005897024
 式中、ｋａ２は順方向でｋｄ２（×２）は逆方向である。
ＫＤ＝ｎ／ａ
このモデルは、上述した１：１の結合相互作用を一次会合速度（ｋａ１＝１／Ｍｓ×２）および解離速度（ｋｄ１＝１／ｓ）で記述する一方、２つの利用可能なリガンド結合部位が反映されるように会合速度（ｋａ）を２倍に乗算する、２つの反応速度式を生成する。二次会合速度（ｋａ２＝１／ＲＵｓ）は、応答単位（ＲＵ）および秒単位の時間（ｓ）の関数として計算される。２つの利用可能なリガンド結合部位が反映されるように、二次解離速度（ｋｄ２＝１／Ｍｓ×２）を２倍に乗算する。特に、一価結合および二価結合の次数はそれぞれの濃度で異なることから二価結合モデルはアフィニティ定数（ＫＤ）を生成できず、その結果、解離速度（ｋｄ）が濃度非依存ではなくなる。
センサーチップによって検出された屈折率の変化が、チップ上に吸収される質量の変化（応答単位（ＲＵ）で測定される）と比例する場合、各リガンドの検体結合能（Ｒｍａｘ）の理論的最大数を以下の方程式を使用して計算した。
Ｒｍａｘ＝（検体質量（ＭＷ）／リガンド質量（ＭＷ））×ＲＬ×Ｓ
式中、ＲＬは固定されたリガンドのレベル（ＣＤ８１−ＬＥＬ二量体）（ＲＵ）、Ｓは相互作用の化学量論比であり、それによって、分子量、ＲＵおよび結合速度の関係を記述する。理論的Ｒｍａｘは多くの場合、アミンカップリングなどの非特異的な固定化法を使用するときは特に、固定されたリガンドの官能性／有効性が損なわれるのが一般的であるため、実験的Ｒｍａｘを超える。実験的Ｒｍａｘを直接使用して相互作用システムのＫＤを定量し得るが、チップを飽和させるには大量の検体が必要とされ、しばしば定量が困難であるため、代わりに、上記のような複数の検体濃度にて会合センサーグラムの大域的適合によって、実験的ＲｍａｘおよびＫＤが予測される。動力学解析にはＫＤ濃度の０．１〜１０倍が至適である。
直接結合（ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）エンザイムイムノアッセイ。
９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ酵素結合免疫吸着プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ）を、４℃にて一晩１６時間、ＰＢＳで希釈した０．５ｇ／ｍｌのスノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）レクチン（Ｓｉｇｍａ）で被覆した。次いで、レクチンを除去して、未被覆部位をＢＳＡ１０ＰＢＳ（１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）含有ＰＢＳ）で室温にて１〜２時間ブロックした。その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）含有のＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍｌの組み換えΕ２蛋白質を添加して、室温にて１時間インキュベートした。続いて、プレートをＰＢＳＴ中で４回洗浄した。続いて、モルモット血清を含むＢＳＡ５ＰＢＳＴ（５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ含有ＰＢＳＴ）の連続希釈液を、スノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）レクチンで被覆したプレートに結合されたΕ２に適用し、室温にて２時間インキュベートした。メーカーの指示書に従い、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体ウサギ抗モルモット免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）（ＢＳＡ５ＰＢＳＴで１：１０００に希釈）を使用して結合抗体を検出し、テトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ）で現像させた。結果として得られた吸光度値（光学密度）をＦｌｕｏｓｔａｒ（ＢＭＧ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で４５０ｎｍ〜６２０ｎｍ（バックグラウンド）にて読み取った。
ＣＤ８１阻害アッセイ
概略説明すると、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ酵素結合免疫吸着プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ）を、５μｇ／ｍＬの二量体ＣＤ８１ ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１を含有するＰＢＳで被覆し、４℃で１６時間インキュベートした。ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１を除去した後、ＢＳＡ１０ＰＢＳ（１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）含有ＰＢＳ）で３７℃にて２時間ブロックし、非特異的な結合を減少させた。続いて、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍ）含有ＰＢＳ）中で４回洗浄した。免疫血清を含むＢＳＡ５ＰＢＳＴ（５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ含有ＰＢＳＴ）の連続希釈液をＨ７７ｃまたはＪＦＨ１ ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のいずれか５０ｎｇと混合してから、ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１で被覆されたイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε２６６１−ｈｉｓを、ウサギ抗ｈｉｓ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して検出した。ＰＢＳＴで更に洗浄した後、メーカーの指示書に従い、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体ウサギ抗モルモット免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）（ＢＳＡ５ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで１：１０００に希釈）を使用して、ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１に結合された残基Ε２複合体を検出し、テトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ）で現像させた。結果として得られた吸光度値（光学密度）をＦｌｕｏｓｔａｒ（ＢＭＧ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で４５０ｎｍ〜６２０ｎｍ（バックグラウンド）にて読み取った。各血清試料について８０％阻害力価を計算した。
ＨＣＶｐｐ中和アッセイ
ｐＮＬ４３．ＬＵＣ．Ｒ−Ｅ、および非機能的（ｎｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）Ε１Ε２（空）をコードするｐｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘベクターまたはＨ７７ｃ ｐΕ１Ε２ベクター（Ｄｒｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５４６：３８５−９０，２００３）のいずれか各１μｇでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコトランスフェクションした。トランスフェクション後７２時間目に、ＨＣＶｐｐを含む培養液上清を収集して濾過した（０．４５μｍ）。モルモット血清の連続希釈液をＨ７７ｃ ＨＣＶｐｐウイルスと共に３７℃で１時間インキュベートしてから、４つに分注して（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）、前日に４８ウェル組織培養プレート（Ｎｕｎｃ，Ｎａｌｇｅ）内に単層で３×１０４細胞／ウェルで播種しておいたＨｕｈ７．５細胞に添加した。４時間のインキュベーション（３７℃、５％のＣＯ２）後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を交換した。更に３日間インキュベーション（３７℃、５％のＣＯ２中）した後、細胞を溶解して、ルミネセンスオプティクス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｐｔｉｃｓ）搭載のＦｌｕｏｓｔａｒ（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でルシフェラーゼ活性をアッセイした。
ＨＣＶ細胞培養由来ウイルス（ＨＣＶｃｃ）侵入、侵入阻害、および中和アッセイ。
前述したように、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ遺伝子を含む感染性Ｊ６／ＪＦＨ１キメラ遺伝子型２ａゲノムをコードするプラスミドＤＮＡからＨＣＶ ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。感染を消失させるＧＮＤ変異を含む同じプラスミドを、陰性対照として含めた。Ｔ７ Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキットを使用して、ＸｂａＩでの消化により線状化したＤＮＡプラスミドを転写した。続いて、ＤＮＡ鋳型をＤＮａｓｅＩと共にインキュベートして除去し、フェノールクロロホルム法を使用して、増幅されたＲＮＡを析出させた。ＲＮＡを定量し、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルで撮像した。メーカーの指示書に従い、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を使用してＲＮＡをＨｕｈ７．５細胞単層中にトランスフェクションし、７２時間後に、ＨＣＶｃｃを含有する上澄み液を回収した。上澄み液を清澄化して、−８０℃で保存した。
ＨＣＶｃｃ感染力価を限界希釈アッセイ（ＴＣＩＤ５０）（Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９（５７３４）：６２３−６２６，２００５）で定量した。概略説明すると、ウイルス株を連続希釈し、９６ウェルのディッシュに３×１０３／ウェルで蒔かれた細胞に適用した。感染後７２時間目に細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、抗ＦＬＡＧ抗体で感染した細胞が検出されるのに先立って、氷冷メタノール中で固定した。ＰＢＳＴで１：３に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと共役したヤギ抗マウスポリクローナル抗体を使用して結合抗体を検出し、室温にて１時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳＴで１回洗浄した。３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質を添加して感染した細胞を可視化し、室温にて５分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、乾燥が回避されるようにＰＢＳバッファ５０μｌを細胞に添加した。細胞を顕微鏡で可視化し、陽性ウェルを計算した。
ＴＣＩＤ５０をリード−ミュンヒ（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ，Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｆｉｆｔｙ ｐｅｒｃｅｎｔ ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ２７：４９３−４９７，１９３８）を使用して計算した。リード−ミュンヒ（Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ）法では、５０％の感染を生起する正確な希釈率を計算するために、次の方程式を用いる。
Figure 0005897024
 Ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０＝（ｌｏｇ５０％超の希釈率）−（ＰＤ×ｌｏｇ希釈比）
ＨＣＶｃｃ中和アッセイの場合、モルモット血清の連続希釈液１００ｕｌを１０％ウシ胎仔血清含有のＤＭＥＭで調製し、非必須アミノ酸（ＤＭＦＮＥＡＡ）を１００ｕｌのＨＣＶｃｃウイルスに添加し、室温にて１時間インキュベートしてから、前日に９６ウェル組織培養プレートに８×１０３細胞／ウェルで播種しておいたＨｕｈ７．５細胞に添加した。４時間後に、細胞から抗体／ウイルスの混合物を除去して、ＰＢＳ中で３回洗浄して、５００ｕＬのＤＭＦＮＥＡＡで置き換えた。感染後４４時間目に、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、ルミネセンスオプティクス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｐｔｉｃｓ）搭載のＦｌｕｏｓｔａｒ（ＢＭＧ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とを使用して、組織培養上澄み液におけるルシフェラーゼ活性を定量した。
実施例１
Ε２６６１−ｈｉｓ ＷＴおよびΕ２コアドメイン糖蛋白質の単離および特性評価
Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質（Ｈ７７ｃ、Ｃｏｎ１およびＪＦＨ−１分離株由来のＷＴならびにΔＨＶＲ１＋２＋３の両方）の大量調製物を２９３Ｆ細胞にて発現させ、ニッケルアフィニティクロマトグラフィを使用して分泌された蛋白質をＣ末端ポリヒスチジンタグを介して精製した。ｃＤＮＡの調製は、Ｃｏｎ１ Ε２（ＨＣＶ Ｃｏｎ１ポリ蛋白質残基３８４−６６１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２３８７９９）およびＪＦＨ１ Ε２（ＨＣＶ ＪＦＨ−１ ポリ蛋白質残基３８４−６６５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４７６３９）をコードして行われた。
単量体化学種のＷＴおよびΕ２コアドメイン蛋白質を単離するため、分取グレードの高解像度サイズ排除クロマトグラフィを行った（図１）。発現プロファイルΕ２６６１／５−ｈｉｓ全体で５０画分を複数のラン（ｒｕｎ）から収集し、対応する画分をプールした。更なる特性評価のために、Ε２６６１／５−ｈｉｓ単量体、二量体および高次分子量「ショルダー」にまたがる約２０中央画分（０．１〜１ｍｇ／ｍＬの蛋白質を含む）を単離した。
図２〜４に示すように、各３つの分離株のＷＴ、ΔＨＶＲ１＋２＋３に対する分析用サイズ排除クロマトグラフィにおいて、ピーク画分の単離が単量体ピークおよび二量体ピークを表していることが確認されただけでなく、「ショルダー」内部の３つ目の別個のピークが三量体化学種を表しているらしいことも確認された。
分析ゲル濾過カラム上で単一欠失（ΔＨＶＲ１、ΔＨＶＲ２ ΔｉｇＶＲ）、二重欠失（ΔＨＶＲ１＋２、ΔＨＶＲ２＋３、ΔＨＶＲ１＋３）または三重欠失（ΔＨＶＲ１＋２＋３）、Ε２の可変領域の欠失を含むＨ７７ｃ Ε２６６１−ｈｉｓのニッケルアフィニティ精製型を分析し、無傷のＨ７７ｃ ＷＴ（ＷＴ）Ε２６６１−ｈｉｓと比較した。Ε２６６１−ｈｉｓの単量体、二量体、三量体、および高分子量型を裏付ける証がΕ２６６１−ｈｉｓの全ての型に含まれていることは、結果から明らかである。
分析用サイズ排除クロマトグラフィを使用した安定性分析から実証されたように、室温にて７２時間にわたって単量体化学種または二量体化学種の分解は検知できなかったか、または高次型への自然発生的な会合は存在しなかった（データ不図示）。Ｃｏｎ１およびＪＦＨ１ Ε２６６１／５−ｈｉｓ蛋白質を同様に精製し、推定の単量体、二量体、および三量体に対応する個々のピークの分析的ゲル濾過を誘導した。
図６〜８においてＨ７７ｃ、Ｃｏｎ１およびＪＦＨ−１ＷＴ（Ａ）、ならびにΔＨＶＲ１＋２＋３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質に関して示すように、非還元条件下および還元条件下で各画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。高次三量体および二量体蛋白質の大部分がジスルフィド結合されていたが、還元剤で処理された後は単量体に移行した。また、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、Ｈ７７ｃ誘導ＷＴ画分１３〜２３全体で約１００〜１５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、および４５ｋＤａ間を移行している更に他の化学種が検出されたことから、これらの型は極めて混成的であることが認められた（図６Ａの下側パネル）。ΔＨＶＲ１＋２＋３画分においては、画分１５〜１８全体で１００ｋＤａ、４５ｋＤａ、および４０ｋＤａにて移行する化学種がほかにも観測された。蛋白様化学種が小型化されたことは、高次分子量画分内のΕ２６６１−ｈｉｓ分子の一部が、切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型Ε２６６１−ｈｉｓおよび／またはＮ−結合型グリコシル化によって差次的に修飾されたΕ２６６１−ｈｉｓと共に、異常なジスルフィドを形成してしまうことを示唆している可能性がある。また、分泌された他の蛋白質が非変性条件（ｎａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下でΕ２６６１−ｈｉｓと共精製され、２６６１−ｈｉｓと共に異常なジスルフィドを形成した可能性も想定し得る。より高分子量の化学種は、酸化されたままの二量体Ε２６６１−ｈｉｓ型を表している可能性が高いが、生合成中にΕ２６６１−ｈｉｓ分子と共に異常なジスルフィドに関与した他の高分子量蛋白質が分泌された可能性があることも表し得る。
同様な移行プロファイルは、Ｃｏｎ１およびＪＦＨ１ Ｈ７７ｃ ＷＴ（Ａ）、ならびにΔＨＶＲ１＋２＋３（Ｂ）Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の個々の画分に収集された蛋白質において観測された（図７および８）。
非還元条件下および還元条件下で、Ｈ７７ｃ ＷＴおよびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の３つの別個のピークの平均分子量を定量した。
実施例２
組み換えＣＤ８１へのΕ２６６１−ｈｉｓ蛋白質の結合に関する動力学解析
Ｈ７７ｃ、Ｃｏｎ１およびＪＦＨ１分離株由来のＷＴ蛋白質およびΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１／５−ｈｉｓ蛋白質の両方の高純度且つ安定な単量体試料を正常に単離した後、ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１への結合の比較動力学解析を行った。二量体ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１ ＷＴをアミンカップリングを介してセンサーチップに固定し、ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１Ｆ１８６Ｓ変異体を先行する（またはリファレンス ）フローセルに固定して、非特異的結合を減算できるようにした。センサーチップによって検出された屈折率の変化は、チップに吸収された質量の変化と比例し、それゆえに、応答単位（ＲＵ）の増加／減少は、固定されたリガンドと相互作用する検体の会合／解離を表す。
これを更に調査するために、Ｈ７７ｃ、ＣｏｎおよびＪＦＨ１分離株由来の、ＷＴならびにΔＨＶＲ１＋２＋３の単量体、二量体および三量体試料を表す様々な画分間でバイオセンサーを使用した動力学解析技術を実施した。図９においてＨ７７ｃに関して示したように、ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１（Ｆ１８６Ｓ対照を含む）をチップに固定し、Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質を数とおりの濃度で注射して、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで大域的適合を有効にした。適合ごとに「最良適合」モデルを最低Ｃｈｉ２値で定量して最小残差を観測した。
ＷＴ二量体のＲｍａｘが予測値を下回っていることは、この調製物の約半分が作用しない可能性のあることを示唆する。
二量体ＷＴおよびＨＶＲ１＋２＋３ Ｈ７７ｃ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質は両方とも、「二価検体」モデルが好ましいものであることを示した。「１：１ラングミュア結合」モデルもまた、各蛋白質によって生成されたバイオセンサー曲線に対して良好な適合を示したことから、ＫＤ値を推定する目的に使用できると云える。図１０に示す単量体、二量体および三量体Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の全てのＫＤ値は、高次分子量型がＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１と結合していたことを確証するものである。
単量体蛋白質に二状態結合（立体配座変化）を用い且つ二量体／三量体蛋白質に１：１結合を用いた最良適合データから明らかとなったように、Ｈ７７ｃにおいて二量体／三量体蛋白質のＣＤ８１に対するアフィニティ（低い方のＫＤ値）が約１０倍高い原因として二価相互作用が最も考えられる（図１０）。Ｃｏｎ１およびＪＦＨ−１は、似た傾向を示している（図１０）。二量体のＨ７７ｃ ΔＨＶＲ１＋２＋３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質は、ＣＤ８１に対するアフィニティがＷＴに比べて（約２倍）大きい。
実施例３
モルモットにΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓの単量体、二量体および混合蛋白質をワクチン接種する。
ＨＣＶ糖蛋白質Ε２レセプタ結合ドメイン（Ε２６６１）の組み換え型から３つの全ての可変領域を欠失させた結果、誘発された交差中和抗体の平均力価は、マウスの無傷Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質によって誘発されたものよりも高いことが実証された。
大型の非近交系動物モデルにおいてΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ−ｈｉｓ蛋白質に対する反応を定量するために、Ｈ７７ｃ Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ組み換え抗原で免疫されたモルモットで用量反応実験を行った。ゲル濾過クロマトグラフィで観測されたΕ２６６１−ｈｉｓのいくつかの型の機能的有意性を、ワクチン接種用の単量体および二量体型Ε２６６１−ｈｉｓを分離して調査した。
抗原がワクチン調製物の免疫原性に影響するかどうかを判断するために、３週間間隔で３０μｇまたは１００μｇの抗原を含有するＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバントを用い、モルモット４匹ずつの各群に３回ワクチン接種した（表１）。その後、モルモットを出血させて、血清を−８０℃で保存した。ニッケルアガロースアフィニティクロマトグラフィで抗原を精製し、単量体、二量体および高分子量型Ε２の混和物（混合物）を得た。ＴＳＫ３０００ｓｗカラム上で様々な型をゲル濾過によって分離した。マススペクトロメトリおよび沈降平衡によって単量体および二量体型の分子量を確認した。
実施例４
単量体のΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓを示す相同平均抗体価は、混合型および二量体型と比べて弱免疫原性である
エンザイムイムノアッセイで、相同免疫化（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ）Ｈ７７ｃ Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原を結合する能力についてモルモット血清を試験した。Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓでワクチン接種されたモルモットにおいて抗体が相同免疫化（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ）抗原を認識する能力を有するようになったことが、結果から判明した。ワクチン群の間で、強力な用量特異的効果および抗原特異的作用が観測された。全ての場合において、１００μｇの蛋白質は、３０μｇのものよりも免疫原性が高かった。なお、混合型のΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓでワクチン接種されたモルモットが誘発した抗体の平均力価は、二量体または単量体抗原でワクチン接種されたモルモットと比較して有意に高く、単量体群において観測された抗体平均力価が最も低かった（図１１）。１００μｇ混合群において平均抗体価は３０μｇ混合群よりも約０．５ｌｏｇ高く、二量体群よりも１ｌｏｇ高く、単量体群よりも２ｌｏｇ高かった（図１２）。
実施例５
ＷＴおよびΔ１２３型Ε２６６１−ｈｉｓ混合物への免疫血清の結合
直接結合（ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）エンザイムイムノアッセイで、ＷＴおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ混合物に対する免疫血清の反応性を調べた。データが示しているように、全ての動物によって誘発された、ＷＴおよびΔ１２３抗原に対して反応する能力を有する抗体の平均力価は、有意なものであった。ただし、Δ１２３に対する抗体反応性の平均力価は、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質と比べて５〜１０倍高かった（図１３）。誘発された抗体価は用量に関連し、用量の効果は１００μｇ増大した。加えて、混合物および二量体型Ε２６６１−ｈｉｓを投与されている動物によって誘発された抗体の平均力価は単量体蛋白質でワクチン接種された動物と比べて高かったことから、免疫原の型が抗体の力価に影響したと云える。
実施例６
免疫血清によって細胞表面レセプタＣＤ８１へのΕ２の結合を阻止する
免疫血清がＨＣＶ糖蛋白質Ε２からＣＤ８１への結合を阻止する能力は、免疫血清がＨＣＶを標的細胞に侵入できないように阻害する能力の主要な指標であると考えられている。固相エンザイムイムノアッセイでは、免疫血清がＣＤ８１（ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１）の大細胞外ループの組み換え型とＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質との間の相互作用をブロックする能力を調べた。
免疫血清の連続希釈液をＨ７７ｃまたはＪＦＨ１ ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のいずれか１００ｎｇと混合してから、ＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１で被覆されたイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε２６６１−ｈｉｓを、抗ｈｉｓ抗体を使用して検出した。各血清試料について８０％阻害力価を計算した。これらは、図１４においてドット−プロットとしてプロットされている。データが示しているように、Δ１２３蛋白質の混合物でワクチン接種された動物によって誘発された平均力価が最も高く、Ε２−ＣＤ８１阻害抗体は、相同Ｈ７７ｃおよび非相同ＪＦＨ１ Ε２６６１−ｈｉｓの両方がＣＤ８１に結合するのを阻害できた。二量体型Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質でワクチン接種された動物において誘発されたΕ２−ＣＤ８１阻害抗体の平均力価は低く、各群内の少なくとも１つの動物は、８０％阻害率に達し得る抗体を誘発することに失敗した。Ε２−ＣＤ８１阻害抗体の平均力価は、単量体Ε２６６１−ｈｉｓでワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も低かった。これは、二量体型ＷＴおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓの両方がΕ２−ＣＤ８１阻害抗体の誘導において単量体Ε２６６１−ｈｉｓよりも優れることを実証している。ただし、Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の混合物の内部に存在するΕ２６６１−ｈｉｓの型は、二量体Ε２６６１−ｈｉｓ単独よりも優れる。
実施例７
Ｈ７７ｃ ＨＣＶｐｐの相同中和（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ７７ｃ Ε１Ε２糖蛋白質を含有するレトロウイルスの疑似型粒子を使用して、免疫血清が相同中和（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を媒介する能力を定量した。加熱により不活性化された免疫血清の連続希釈液を、ＨＣＶｐｐと予混合してからＨｕｈ７．５細胞に４時間添加した。洗浄後に、更に３日間にわたって細胞をインキュベートし、細胞溶菌液におけるルシフェラーゼ活性を数量化した。結果から、ＨＣＶｐｐの中和を媒介する能力は用量および抗原依存的でもあったことが判明した（図１５）。１００μｇの抗原混合物を投与されたモルモットが誘発したＮＡｂ平均力価は、１００μｇの単量体、３０μｇの二量体または１００μｇの二量体について観測された同値の約１０倍であった（図１６）。３０μｇ単量体を投与されたモルモットは、ＨＣＶｐｐを中和する能力が限定されていることが判明した。その曲線は、抗原なしの対照群に類似している（図１５）。
実施例８
細胞培養由来Ｊ６−ＪＦＨ１の交差中和を免疫血清によって媒介する
免疫血清の連続希釈液を、Ｊ６−ＪＦＨ１細胞培養由来ＨＣＶと混合してＨｕｈ７．５細胞に添加した。上澄み液のルシフェラーゼ活性を、感染症の４４時間後に数量化した。結果を図１７に示す。１００μｇの抗原混合物を投与されているモルモットは、血清希釈率１／４０にて侵入阻害率が９０％に達したことから、交差中和を媒介する能力が強力であることが判明した（図１７）。１００μｇについて観測された５０％中和平均力価は、３０μｇおよび１００μｇ単量体群よりもおよそ２ｌｏｇ高く、二量体群および３０μｇ混合群よりも１ｌｏｇ高かった（図１８を参照のこと）。
実施例９
蛋白質を４つの別個の画分に分画する
２９３Ｆ細胞においてＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のＨ７７ｃ配列が発現した。ＨｉｓＴｒａｐカラム上で、分泌された発現蛋白質を含有する組織培養上澄み液にニッケル−アフィニティ精製を行い、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ ２６／６０カラム上でゲル濾過を行った。ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ（図１９）およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ（図２０）の４つの個別のオリゴマーピーク（ピーク１、２、３、４）を観測し、ピークごとに画分を収集してプールした。加えて、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の「非分画」調製物をＨｉｓＴｒａｐカラム上で部分的に精製したが、ゲル濾過は行わなかった。
分析ゲル濾過カラム上で、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ（図２１）およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ（図２２）について、各ピーク１〜４に対応するプールされた画分を調べた。単一の図中にピーク１〜４の個々のラン（ｒｕｎ）を重ね合わせて配置し、それらの相対的な溶出時間を図示した。クロマトグラムの上側に、分子量標準の溶離時間を示す。
還元（図２３）および非還元条件下で（図２４）、ゲル濾過精製型のＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。還元条件下では、ピーク４のＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓがそれぞれ、約５５〜６５ｋＤａおよび５０〜６０ｋＤａの広帯域として移行する（図２３）。非還元条件下では、ピーク４の大部分のＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓはそれぞれ約５５〜６５ｋＤａおよび５０〜６０ｋＤａの広帯域として移行し、１単位のＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓを含む単量体型の蛋白質と一貫性を持つ（図２４）。二量体蛋白質（２単位）に対して予期される分子量と一貫して、少量の約１００ｋＤａ蛋白質が存在した。観測された広帯域は、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓでは、１１部位および９部位のそれぞれにおいて混成Ｎ−結合型グリコシル化との一貫性がある。単量体型Ε２６６１−ｈｉｓのほとんどは、他の（Ε２６６１−ｈｉｓ以外の）混在蛋白質に乏しく、９５％超の純度であると推定された。
還元条件下では、ピーク３のＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓがそれぞれ、約５５〜６５ｋＤａおよび５０〜６０ｋＤａで移行した。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてピーク３蛋白質の平均的移行は幾分速かった。このことは、これらの蛋白質の質量が、ピーク４において観測された対応する単量体型を下回ることを示唆している。これは、蛋白質グリコシル化（ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）のレベルが低下したことを示している可能性がある（図２３）。より高分子量の型のＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質もまた、約１００ｋＤａで移行し、分子量が二量体Ε２６６１−ｈｉｓと対応していることが、明瞭に見られた。非還元条件下では、ピーク３の蛋白質の大部分が約１００ｋＤａという予期された分子量で移行し、少量の単量体Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質が存在する二量体型Ε２６６１−ｈｉｓ（２単位）と一貫性を持つ（図２４）。
還元条件下では、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓピーク２がそれぞれ、約５５〜６５ｋＤａおよび５０〜６０ｋＤａで移行した。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてピーク２蛋白質の平均的移行は幾分速かった。このことは、これらの蛋白質の質量が、ピーク４において観測された対応する単量体型を下回ることを示唆している。これは、ピーク２蛋白質において蛋白質グリコシル化（ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）のレベルが低下したことを示している可能性がある（図２３）。非還元条件下では、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓピーク２蛋白質の大部分がそれぞれ約１７０ｋＤａおよび１６０ｋＤａにて移行し、少なくとも３単位のΕ２６６１−ｈｉｓの存在と一貫性を持つ。ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓの両方に、少量の混在１００ｋＤａ二量体Ε２６６１−ｈｉｓが存在した（図２４）。
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１の移行によって明らかにされたように、蛋白質化学種の混成範囲は２０ｋＤａ〜２５０ｋＤａに及ぶ（図２３）。非還元条件下では、蛋白質の大部分は濃縮ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ）と分離ゲル（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｇｅｌ）との間の界面に残留した。このことは、この化学種の非還元型の分子量が３００ｋＤａを超え、且つΕ２６６１−ｈｉｓの単位を４つ以上含むことを示唆している（図２４）。一方、かなりの量の混在蛋白質が、２０〜２５０ｋＤａの範囲に及ぶスミアとして観測された。
各ピーク１〜４においてΕ２６６１−ｈｉｓ蛋白質に対応する蛋白質の化学種を分析するため、０．５μｇの各蛋白質を４〜１２％のＮｕ−ＰＡＧＥゲル上に載せて、還元条件下でラン（ｒｕｎ）させた後、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。Ｃ末端６ｘＨｉｓエピトープタグに特異的なＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体（図２５）またはΕ２残基４１１〜４２８内に存在するエピトープに特異的なＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体のいずれかを使用して、ブロットをプローブした（図２６）。各画分１〜４において、約５０〜６０ｋＤａで移行するΕ２６６１−ｈｉｓ蛋白質化学種がＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体によって検出されたことが、結果から判明した。ピーク１の蛋白質に対しては更に低い反応性が呈された。ピーク２および３の二量体型もまた存在する（図２５）。
各ピーク１〜４では、Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質が抗Ε２抗体によって検出された（図２６）。ピーク４内の蛋白質の大部分は５０〜６０ｋＤａの化学種であり、約１００ｋＤａの化学種は少量検出された。ピーク３には、５０〜６０ｋＤａの化学種および１００ｋＤａ型Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質が含まれていた。ピーク２には、５０〜６０ｋＤａの化学種、および１００〜２００ｋＤａの範囲に及ぶ広範な蛋白質スミアが含まれていた。ピーク１には、Ε２６６１−ｈｉｓの５０〜６０ｋＤａの化学種のほか、１００〜２００ｋＤａ超の範囲に及ぶより高分子量の型が含まれていた。
実施例１０
モルモットにＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質でワクチン接種する
３週間ごとに計３回、非分画、またはピーク１、２、３もしくは４蛋白質のいずれかのΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ１００μｇと７５ＩＳＣＯ（商標）単位（ＩＵ）ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバントとの混合物でモルモットにワクチン接種した。最終のワクチン接種後２週間目に、最後の出血を行った。代替方法として、２週間ごとに計３回、モルモットに１００μｇの非分画、またはピーク１、２、３もしくは４のＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質と７５ＩＵ ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバントとの混合物を投与し、最終の免疫化後１週目に最後の出血を行った。
実施例１１
モルモットにおけるＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質の相同画分に対する抗体反応
固相エンザイムイムノアッセイでは、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４および非分画材料のいずれか１つでワクチン接種された動物から誘導された免疫血清について、相同抗原に結合する能力を調べた。マイクロプレートをＧＮＡレクチンおよび相同免疫抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をＢＳＡでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。
結果（図２７）から明らかなように、相同抗原に反応する抗体の平均力価は、ピーク１およびピーク２の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も高かった。抗体の平均力価は、ピーク３および４蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も低く、これらの抗体の平均力価は非分画免疫群において誘発されたものより低かった。
固相エンザイムイムノアッセイでは、Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質ピーク１〜４または非分画混合物でワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清を、相同免疫化（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ抗原に対する反応性に関して比較した。マイクロプレートをＧＮＡレクチンおよび相同免疫抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をＢＳＡでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。
結果（図２８）からわかるように、ピーク１およびピーク２のΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質を投与されたモルモットにおいて誘発された抗体価が最も高かった。ピーク１およびピーク２の免疫原群の間で平均抗体価は類似していた。抗体の平均力価のうち最も低かったのは、ピーク４の蛋白質によって誘発されたもので、平均抗体価はピーク１またはピーク２を使用して得られた平均力価の少なくとも１／２０、ピーク３の１／１０、非分画混合物の１／８であった。非分画混合物を使用して得られた平均抗体価は、ピーク３を使用して抗原として得られたものと類似していた。この結果が示しているように、非分画混合物中に存在する免疫原性の大部分はピーク１およびピーク２中に存在するΕ２６６１−ｈｉｓ蛋白質の型に起因する可能性があり、この型はΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓの三量体型または高次型からなる。
実施例１２
非分画ＷＴおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質に対する抗体反応性
固相イムノアッセイでは、Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４または非分画混合物のいずれか１つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清について、相同Ｈ７７ｃ由来のＷＴおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓの非分画調製物に結合する能力を調べた。イムノアッセイでは、ＷＴ非分画蛋白質を抗原として使用することで、誘導された抗体の総レベルを標準化抗原と比較できる。エンザイムイムノアッセイでは、Ε２６６１−ｈｉｓのΔ１２３型を被覆抗原として使用することで、Ε２の保存領域の大部分に対する総免疫応答を調べることができる。マイクロプレートをＧＮＡレクチンで被覆し、続いてＷＴまたはΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質で被覆した。未被覆部位をＢＳＡでブロックした後、免疫血清の連続希釈液を加えた。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。
結果（図２９）から明らかなように、相同ＷＴ（Ａ）およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ（Ｂ）蛋白質に反応する抗体の平均力価は、ピーク１およびピーク２の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も高かった。非分画ＷＴ（Ａ）またはΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ（Ｂ）に反応する抗体平均力価は、ピーク３の蛋白質または非分画免疫血清でワクチン接種された動物によって誘発されたものの間で類似していた。抗体の平均力価は、ピーク４の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も低かった。Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓでワクチン接種された動物から採取された免疫血清が、非分画ＷＴおよびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質に対して示した反応性はそれぞれ類似していた。各免疫群由来の免疫血清が相同免疫化（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ）抗原（図２８）およびΕ２６６１−ｈｉｓ蛋白質の非分画混合物（図２９）に結合する能力が同等であったことから、抗体がΕ２６６１−ｈｉｓ蛋白質に対して特異的であることが確証される。
実施例１３
ワクチン接種されたモルモット由来の血清が、Ε２および組み換え型の一次ＨＣＶ細胞レセプタＣＤ８１間の相互作用を阻害する能力
ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４または非分画混合物のいずれか１つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清について、ＨＣＶ ＣＤ８１に対する一次細胞レセプタの組み換え型と相同Ｈ７７ｃ Ε２６６１−ｈｉｓとの間の結合をブロックする能力を調べた。このアッセイでは、免疫血清内に存在する抗体のうち、Ε２６６１抗原上に存在するエピトープに結合できそれにより組み換えＣＤ８１との相互作用を阻止するものの総量を測定した。相同Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質を使用して、誘発された抗体をブロックしている総Ε２−ＣＤ８１を定量する一方、Ε２６６１−ｈｉｓ抗原の非相同配列を使用して、異なるΕ２抗原に対する抗体応答の交差反応性の度合い、およびこの交差反応抗体がΕ２とＣＤ８１との相互作用を妨げる能力を測定した。免疫血清の連続希釈液を非分画Ｈ７７ｃ Ε２６６１−ｈｉｓに添加してからＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１で被覆されたエンザイムイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε２６６１−ｈｉｓを抗ｈｉｓ抗体、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した免疫グロブリンおよびＴＭＢ基質で検出した。
結果（図３０Ａ）から明らかなように、相同Ε２−ＣＤ８１阻害抗体の平均力価は、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓピーク２の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も高かった（平均力価３４４）。Ε２−ＣＤ８１阻害抗体の平均力価は、ピーク１および非分画蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたもの（それぞれ平均力価１８および１８）が最も低かった。Ε２−ＣＤ８１阻害抗体の平均力価は、分画されたピーク２〜４の蛋白質で免疫化して誘発されたものの方が、非分画ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原で免疫化して誘発されたものよりも高かった。
その後、ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ抗体について、ＣＤ８１に結合する非相同型の非分画ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓの結合を阻害する能力を調べた（図３０Ｂ）。ＪＦＨ１ Ε２蛋白質は、Ε２領域全体にまたがるアミノ酸の３１％にあるＨ７７ｃとは異なる。非相同Ε２蛋白質とＣＤ８１との相互作用を妨げる能力は、種々のΕ２配列に対する抗体応答の広がりの尺度と見なすことができる。ピーク２のＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清は、非相同Ε２−ＣＤ８１阻害抗体の平均力価（平均７７）が最も高かった。ピーク３の蛋白質でワクチン接種された動物３匹もまた、非相同Ε２−ＣＤ８１阻害抗体を誘発した。ピーク１の蛋白質および非分画材料を投与された動物は、非相同Ε２がＣＤ８１に結合するのをブロックする能力のある抗体を誘発しなかった。
Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４または非分画Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のいずれか１つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清について、ＨＣＶ ＣＤ８１に対する一次細胞レセプタの組み換え型と相同Ｈ７７ｃ Ε２６６１−ｈｉｓとの間の結合をブロックする能力を調べた。免疫血清の連続希釈液を非分画Ｈ７７ｃ Ε２６６１−ｈｉｓに添加してからＭＢＰ−ＬＥＬ１１３−２０１で被覆されたエンザイムイムノアッセイプレートに添加した。結合Ε２６６１−ｈｉｓを抗ｈｉｓ抗体、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した免疫グロブリンおよびＴＭＢ基質で検出した。
結果（図３１Ａ）から明らかなように、相同Ε２−ＣＤ８１阻害抗体の平均力価は、Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓのピーク２の蛋白質でワクチン接種された動物において誘発されたもの（平均９４０）が最も高かった。ピーク１、３または４でワクチン接種された動物において誘発されたΕ２−ＣＤ８１の５０％阻害力価は、非分画免疫群の２〜３倍であった。
その後、Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗体について、ＣＤ８１に結合する非相同型の非分画Ε２６６１−ｈｉｓの結合を阻害する能力を調べた（図３１Ｂ）。ＣＤ８１への非相同Ε２６６１−ｈｉｓの結合を阻害する能力を有する抗体の平均力価は、Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓピーク２の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたもの（平均力価２５６）が最も高かった。ピーク４（単量体Ε２）蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発された非相同Ε２−ＣＤ８１阻害抗体の平均力価（平均力価２６）は最も低かった。ＣＤ８１への非相同Ε２６６１−ｈｉｓの結合を阻害する能力を有する抗体の平均力価のうち、ピーク１、３または非分画混合物を投与された動物によって誘発されたもの（それぞれ５５、７７および４５）は、中程度であった。
実施例１４
Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質でワクチン接種されたモルモットにおける相同中和抗体応答
Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清について、相同Ｈ７７ｃ Ε１Ε２糖蛋白質（Ｈ７７ｃ ＨＣＶｐｐ）含有の疑似型レトロウイルス粒子を中和する能力を調べた。この実験では、免疫抗原の配列において表されるのと同じ（相同）ＨＣＶ糖蛋白質を使用して、ウイルス感染症をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻止できる免各疫群からの動物によって誘発される抗体の、ビリオン調製物中の総量を定量する。そのような抗体は、ウイルスが肝細胞に侵入するのをｉｎ ｖｉｔｒｏで阻止できるという点で機能的と見なされる。中和抗体の特異性は、ＣＤ８ＬへのΕ２の結合を阻害できる抗体のみに限定されない。加熱により不活性化された免疫血清をＤＭＦ１０で連続希釈し、等量のＨ７７ｃ ＨＣＶｐｐを用い３７℃で１時間インキュベートした後、前日に３×１０４細胞／ウェルで播種しておいたＨｕｈ７．５細胞に添加した。３日後に、ルミノメータで、細胞溶菌液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。
結果（図３２）から明らかなように、相同ウイルス侵入の５０％をブロック（中和化）する能力のある抗体の平均力価（ＩＣ５０）は、ピーク１またはピーク２の蛋白質でワクチン接種されたモルモットによって誘発されたものが最も高かった（図３２の最上部）。平均ＩＣ５０平均力価は、ピーク１（平均２３６３）およびピーク２の免疫血清群（平均２２８８）と類似していた。５０％相同中和抗体応答は、ピーク３または４蛋白質でワクチン接種されたモルモットによって誘発されたもの（それぞれ平均７２７および７０５）が最も低く、非分画免疫群（平均力価９１８）と類似していた。
抗体が相同ウイルス侵入の８０％をブロックする能力を測定した結果、ピーク１またはピーク２の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発された平均力価（平均ＩＣ８０平均力価＝２８０および１７０）は、他の全ての群よりも高いことがわかった（図３２Ｂ）。非分画混合物によって誘導されたＩＣ８０平均力価（平均１０９）は、ピーク３（平均６５）およびピーク４の抗原によって誘導されたもの（平均５４）よりも高かった。
実施例１５
Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質でワクチン接種されたモルモットにおける非相同（交差）中和抗体応答
Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質でワクチン接種されたモルモットに由来する免疫血清について、非相同Ｊ６／ＪＦＨ１キメラ遺伝型２ａ細胞培養（ＨＣＶｃｃ）由来ウイルスを交差中和する能力を調べた。この実験では、免疫抗原の配列と比べてかなり異種株の（非相同）ＨＣＶ糖蛋白質をコードするＨＣＶ株を使用して、ウイルス感染症をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻止できる各免疫群からの動物によって誘発される抗体の総量を定量する。そのような抗体は、遺伝的に異なるウイルスが肝細胞に侵入するのをｉｎ ｖｉｔｒｏで阻止できるという点で機能的で、且つ交差中和を行えるものと見なされる。加熱により不活性化された免疫血清を連続希釈し、当量のＨＣＶｃｃと混合した。血清／ウイルスの混合物をＨｕｈ７．５細胞に適用し、３７℃でインキュベートした後、除去して組織培養培地内で４４時間インキュベートした。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ基質およびルミノメータを使用して、組織培養液に存在するルシフェラーゼ活性を測定した。
結果が示しているように、非分画Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発された抗体は、ウイルス感染量の５０％を中和する能力（ＩＣ５０）の平均が３６０で範囲が１００〜９００に及んだ（図３３Ａ）。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバントのみでワクチン接種された動物２匹は平均５０％中和平均力価が４０および６０で、他の動物３匹は感染性ウイルスの５０％またはそれ以上を中和できなかった。
交差中和抗体の平均力価は、ピーク１のΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたもの（平均ＩＣ５０＝１７００）が最も高かった（図３３Ａ）。ピーク２のΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓおよび非分画免疫群でワクチン接種された動物によって誘発された交差中和抗体の平均力価は、それぞれ３４０および３６２で類似していた。ピーク３または４蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発された交差中和抗体の平均力価は、有意なものでなかった。
ピーク１の蛋白質でワクチン接種された動物はいずれも、ウイルスの感染量の８０％を中和する能力を有し、平均力価が３２０で範囲が１００〜７００に及んだ。ピーク２の蛋白質でワクチン接種された動物の平均ＩＣ８０平均力価（平均３８）は、非分画混合物（平均４６）と類似していた（図３３Ｂ）。ピーク３または４免疫群内の動物はいずれも、非相同ウイルス感染量の８０％を中和できなかった。
実施例１６
ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清の、Ｈ７７ｃ ＷＴおよびΔ１２３抗原に対する反応性
エンザイムイムノアッセイで、Ｈ７７ｃ ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のいずれか１つでワクチン接種されたモルモットから採取された免疫血清が、非分画Ｈ７７ｃ ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に結合する能力を比較した。イムノアッセイでは、ＷＴ非分画蛋白質を抗原として使用することで、誘導された抗体の総レベルを標準化抗原と比較できる。エンザイムイムノアッセイでは、Ε２６６１のΔ１２３型を被覆抗原として使用することで、Ε２の保存領域の大部分に対する総免疫応答を調べることができる。マイクロプレートをＧＮＡレクチンおよび非分画Ｈ７７ｃ抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をＢＳＡでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。
結果が示しているように、非分画Ｈ７７ｃ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に反応する抗体の平均力価は、ピーク１およびピーク２のＷＴ Ｈ７７ｃ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も高く、非分画ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓで免疫化された動物よりも有意に高かった（図３４Ａ）。非分画ＷＴ Ｈ７７ｃ Ε２６６１−ｈｉｓに反応する抗体の平均力価は、ピーク４の蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も低かった。抗体の平均力価は、ピーク３の蛋白質および非分画免疫群でワクチン接種された動物によって誘発されたものの間では類似していた一方、ピーク１およびピーク２の免疫血清における平均抗体価よりも低く、ピーク４免疫群よりは高かった。各免疫群由来の免疫血清が相同免疫化（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ）抗原（図２７）およびΕ２６６１−ｈｉｓ蛋白質の非分画混合物（図３４）に結合する能力が同等であったことから、抗体がΕ２６６１−ｈｉｓ蛋白質に対して特異的であることが確証される。
ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓでワクチン接種された動物由来の免疫血清が非分画Ｈ７７ｃ Δ１２３抗原に結合する能力を比較した結果、３つの可変領域が全て欠失したΕ２のコアドメインに対する抗体の反応性は全般的に低いことが判明した。Ε２のコアドメインに反応する抗体の平均力価は、ピーク２の免疫血清によって生成されたものが最も高かった。Ε２のコアドメインに反応する抗体の平均力価は、他の全ての群によって誘発されたものの間で類似していた（図３４Ｂ）。
実施例１７
ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清の、ＪＦＨ１ ＷＴおよびΔ１２３抗原に対する交差反応性
エンザイムイムノアッセイで、Ｈ７７ｃ ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のいずれか１つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清が、ＪＦＨ１ ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原の非分画混合物と交差反応する能力を比較した。異種株のＨＣＶ由来のＷＴ非分画蛋白質を抗原として使用することで、誘導された交差反応性抗体の総レベルを標準化抗原と比較できる。エンザイムイムノアッセイでは、非相同Ε２６６１−ｈｉｓのΔ１２３型を被覆抗原として使用することで、その異種株のΕ２の保存領域の大部分に対する総交差反応性免疫応答を調べることができる。遺伝型２ａ ＪＦＨ１ Ε２配列は、遺伝型１ａ Ｈ７７ｃ Ε２配列のものとは最も異なる配列の１つであり、Ｈ７７ｃ Ε２とＪＦＨ１ Ε２は、無傷型Ε２６６１においては３１％異なり、３つの可変領域が欠失したΕ２のコアドメインにおいては２０％異なる。マイクロプレートをＧＮＡレクチンおよび非分画抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をＢＳＡでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。
結果が示しているように、非分画ＷＴ ＪＦＨ１ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対する平均抗体価は、ピーク２のＷＴ Ｈ７７ｃ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質でワクチン接種された動物における平均抗体価の方が他の免疫群の平均力価に比べて４倍高かった（図３５Ａ）。交差反応性抗体の平均力価は、ピーク４単量体蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も低く、非分画免疫群の１／５であった。交差反応性抗体の平均力価は、ピーク１および３蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものの間で相互に、および非分画免疫群と類似していた。
免疫血清がＪＦＨ１ Ε２コアドメイン（Δ１２３）と交差反応する能力を調べた結果、抗体の平均力価は、ピーク２の免疫血清によって誘発されたものが、ピーク１、３および４免疫群と比べて４倍高いことが判明した（図３５Ｂ）。ＪＦＨ１のΔ１２３コアドメインに対する抗体交差反応の平均力価は、単量体ピーク４の蛋白質が誘発したものが最も低く、他の全ての免疫群と比べて少なくとも１／３低かった（図３５Ｂ）。
実施例１８
ＷＴ免疫血清群による相同ウイルスの中和
ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質ピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方のワクチン接種を受けたモルモットによる免疫血清の誘発について、相同Ｈ７７ｃ Ε１Ε２糖蛋白質（Ｈ７７ｃ ＨＣＶｐｐ）含有の疑似型レトロウイルス粒子を中和する能力を調べた。この実験では、免疫抗原の配列において表されるのと同じ（相同）ＨＣＶ糖蛋白質を発現するビリオン調製物中の、ウイルス感染症をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻止できる各免疫群からの動物が誘発する抗体の総量を定量する。そのような抗体は、ウイルスが肝細胞に侵入するのをｉｎ ｖｉｔｒｏで阻止できるという点で機能的と見なされる。加熱により不活性化された免疫血清をＤＭＦ１０で連続希釈し、等量のＨ７７ｃ ＨＣＶｐｐを用い３７℃で１時間インキュベートした後、前日に３×１０４細胞／ウェルで播種しておいたＨｕｈ７．５細胞に添加した。３日後に、ルミノメータで、細胞溶菌液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。
結果が示しているように、ウイルス感染量の５０％を中和する能力を有する抗体の平均力価は、ピーク１、２、３および非分画混合物を投与された動物由来の免疫血清のものが、抗原なし免疫群の抗体の当該平均力価をかなり上回っていた（図３６Ａ）。抗原なし免疫群に対する平均中和抗体価は、単量体ピーク４の蛋白質を投与された動物の間で類似していた。相同ウイルスの５０％中和を媒介する能力を有する抗体の平均力価は、ピーク１および２免疫群によって誘発されたもの（それぞれ平均２１５０および１６００）の間で類似しており、これらはピーク３（平均１１７５）および非分画免疫群（平均１０１３）よりも高かった。
各ピーク２および非分画免疫群内で、動物３匹が誘発した中和抗体の平均力価は有意に低いと考えられ、且つそれらの平均力価は域外値である。これらの血清が示す特性は異常であり、アッセイを繰り返し行うことによって中和抗体の平均力価の高いものが存在することが判明し得る。域外値を分析の対象から除外した結果、非分画免疫群の平均ＩＣ５０力価が１５００であったのに対し、ピーク２は平均５０％中和力価２４６０を誘導したことが判明した。
相同ウイルス感染量の８０％を阻止する能力を有する抗体を誘発した動物は、ピーク１、２、３および非分画免疫群内のものだけに限られていた（図３６Ｂ）。ピーク１の免疫血清によって誘発された平均８０％中和力価（平均力価２２５）は、他の全ての免疫群と比べて高かった。域外値を含むピーク２免疫群の平均ＩＣ８０力価は１１６であったが、３つの域外値を除外した結果、平均力価が１７４に上昇した。ＩＣ８０平均力価は、非分画およびピーク３免疫群によって誘発されもの（８６）の間で類似していた。非分画免疫群から３つの域外値を排除すると、平均ＩＣ８０力価が１２６に上昇した。データが示しているように、ピーク１、２および３は、ＷＴ Ε２を免疫原として使用して中和抗体を誘発するための、好ましい免疫原である。
実施例１９
遺伝型２ａ細胞培養由来ＨＣＶの交差中和
ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のどちらか一方でワクチン接種されたモルモットが誘発した免疫血清について、非相同Ｊ６／ＪＦＨ１キメラ遺伝型２ａ細胞培養（ｃｃ）由来ＨＣＶを中和する能力を調べた。この実験では、免疫抗原の配列と比べてかなり異なる（非相同）ＨＣＶ糖蛋白質をコードするＨＣＶ株を使用して、ウイルス感染症をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻止できる免各疫群からの動物によって誘発される抗体の総量を定量する。そのような抗体は、遺伝的に異なるウイルスが肝細胞に侵入するのをｉｎ ｖｉｔｒｏで阻止できるという点で機能的で、且つ交差中和を行えるものと見なされる。加熱により不活性化された免疫血清をＤＭＦ１０＋ＮＥＡＡで連続希釈し、当量の３．１６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＨＣＶｃｃと３７℃で２０分間混合した。前日に８×１０３細胞／ウェルで播種して３７℃で５時間インキュベートしておいたＨｕｈ７．５細胞に、血清／ウイルスの混合物を塗布した。血清／ウイルスの混合物を除去し、ＰＢＳで４回洗浄して、ＤＭＦ１０＋ＮＥＡＡに添加して４４時間インキュベートした。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ基質およびルミノメータを使用して、組織培養液に存在するルシフェラーゼ活性を測定した。
ＩＣ５０の交差中和抗体の平均力価は、ピーク１およびピーク２のＷＴ蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたもの（それぞれ平均力価１５５および３６８）が、他の免疫群に比べて高かった（図３７Ａ）。ＨＣＶの非相同株の５０％中和を媒介する能力を有する抗体の平均力価は、ピーク３および４（それぞれ平均３４および３９）が最も低く、非分画蛋白質によって誘発された平均ＩＣ５０力価は４８であった（図３７Ａ）。
ピーク１、２および非分画蛋白質でワクチン接種された動物のうち、ウイルス感染量の８０％を中和する能力を有する抗体を誘発したものは、ごく少数に限られていた（図３７Ｂ）。免疫群ピーク１内の動物５匹、ピーク２内の２匹、および非分画群内の３匹は、ＩＣ８０平均力価を有し（図３７Ｂ）、それらの平均力価（それぞれ３８、２７および３０）は類似していた。ピーク１、ピーク２および非分画免疫群において反応する動物の平均力価はそれぞれ４８、５０および４７であった。これらの結果が示しているように、ピーク１およびピーク２は、ＷＴ Ε２６６１を免疫原として使用して交差中和抗体を誘発するための、好ましい免疫原である。
実施例２０
野生型免疫血清の、Ｃｏｎ１ ＷＴおよびΔ１２３ Ε２６６１抗原に対する交差反応性
エンザイムイムノアッセイで、Ｈ７７ｃ ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のいずれか１つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清が、遺伝型１ｂ Ｃｏｎ１ ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原の非分画混合物と交差反応する能力を比較した。異種株のＨＣＶ由来のＷＴ非分画蛋白質を抗原として使用することで、誘導された交差反応性抗体の総レベルを標準化抗原と比較できる。エンザイムイムノアッセイでは、非相同Ε２６６１のΔ１２３型を被覆抗原として使用することで、その異種株のΕ２の保存領域の大部分に対する総交差反応性免疫応答を調べることができる。遺伝型１ｂ Ｃｏｎ１ Ε２配列は、ＪＦＨ１と比べて遺伝型１ａ Ｈ７７ｃ Ε２配列のものとの差異が少なく、Ｈ７７ｃ Ε２およびＣｏｎ１ Ε２は無傷型Ε２６６１においては２０％異なり、３つの可変領域が欠失したΕ２のコアドメインにおいては１５％異なる。マイクロプレートをＧＮＡレクチンおよび非分画抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をＢＳＡでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。
結果が示しているように、交差反応性抗体の平均力価は、ピーク２の蛋白質を投与された動物において誘発されたものが最も高く、他の免疫群の少なくとも２倍であった（図３８Ａ）。交差反応性抗体の平均力価は、ピーク４の蛋白質によって誘発されたものが最も低く、ピーク２の１／８で、非分画免疫群の１／３であった。
免疫血清がＣｏｎ１ Ε２コアドメイン（Δ１２３）と交差反応する能力を調べた結果、抗体の平均力価は、ピーク２の免疫血清によって誘発されたものが、ピーク１、３および４免疫群と比べて高いことが判明した（図３８Ｂ）。ピーク２によって誘発された平均力価（２３３７５０）は、ピーク４免疫群の平均力価（９０００）の２６倍であった。Ｃｏｎ１のΔ１２３コアドメインと交差反応する抗体の平均力価は、単量体ピーク４の蛋白質によって誘発されたものが、他の全ての免疫群と比べて最も低かった（図３８Ｂ）。
実施例２１
Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清の、Ｃｏｎ１野生型およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対する交差反応性
エンザイムイムノアッセイで、Ｈ７７ｃ Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または非分画混合物のいずれか１つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清が、遺伝型１ｂ Ｃｏｎ１ ＷＴ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原の非分画混合物と交差反応する能力を比較した。マイクロプレートをＧＮＡレクチンおよび非分画抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をＢＳＡでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。
結果が示しているように、ＷＴ Ｃｏｎ１ Ε２６６１抗原と交差反応する抗体の平均力価は、ピーク１（平均２２００００）および２（平均３０００００）蛋白質でワクチン接種された動物によって誘発されたものが最も高く、他の免疫群の平均力価の少なくとも２倍であった（図３９Ａ）。交差反応性抗体の平均力価は、ピーク４の蛋白質によって誘発されたもの（平均２００００）が他の群と比べて最も低かった。
免疫血清がＣｏｎ１ Ε２コアドメイン（Δ１２３）と交差反応する能力を調べた結果、Ｃｏｎ１ Ε２６６１−ｈｉｓのコアドメインと交差反応する抗体の平均力価は、ピーク１およびピーク２の免疫血清のもの（それぞれ平均力価は２１７５００および２８８７５００）が他の免疫群と比べて高いことが判明した（図３９Ｂ）。コアドメインに対して交差反応する抗体の平均力価は、ピーク４の蛋白質によって誘発されたもの（平均３９６００）が他の群と比べて最も低かった。
実施例２２
Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ免疫血清の、ＪＦＨ１ ＷＴ抗原およびΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗原に対する交差反応性
エンザイムイムノアッセイで、Ｈ７７ｃ Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ蛋白質のピーク１〜４または分画された混合物のいずれか１つでワクチン接種されたモルモット由来の免疫血清が、ＪＦＨ１ ＷＴ Ε２６６１抗原およびΔ１２３ Ε２６６１抗原の非分画混合物と交差反応する能力を比較した。Ｈ７７ｃ Ε２およびＪＦＨ１ Ε２は、Ε２６６１の無傷型においては３１％異なり、３つの可変領域が欠失したΕ２のコアドメインにおいては２０％異なる。マイクロプレートをＧＮＡレクチンおよび非分画抗原で被覆し、続いて、未被覆部位をＢＳＡでブロッキングして、免疫血清の連続希釈液を添加した。結合型免疫グロブリンを西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗モルモット免疫グロブリンで検出し、ＴＭＢ基質で可視化した。
結果が示しているように、ＷＴ ＪＦＨ１ Ε２配列に反応する抗体の平均力価は、Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓピーク１およびピーク２の抗原によって誘発されたものが有意に高く、非分画Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓが誘導した平均力価の約２倍であった（図４０Ａ）。ピーク１およびピーク２のΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓによって誘発された平均抗体価はそれぞれ５０６２５および５３５００であった。ピーク３（平均２３１８８）によって誘発された交差反応性抗体の平均力価は、非分画Δ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓと比較して同程度であった。ピーク４によって誘発された交差反応性抗体の平均力価４２２５は、非分画免疫群の１／５で、且つピーク１およびピーク２の１／１０であった。
Ε２の非相同コアドメインに存在する保存エピトープをΔ１２３ Ε２６６１−ｈｉｓ抗体が認識する能力の調査では、ピーク１およびピーク２免疫群の抗体の平均力価（それぞれ平均３６６２５および４１２５０）が最も高いことが認められた（図４０Ｂ）。ピーク３（平均１３３６３）および４（平均８０８８）免疫群の交差反応性抗体の平均力価は、非分画免疫群（平均２２５００）よりも低く、ピーク１およびピーク２免疫群の約１／３〜１／４であった。
多くの変更態様が、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に明らかとなろう。
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出典
Ａｎｇｕｓ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：２７９−９４，２０１１
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Claims (15)

  1. Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ２（Ε２）糖蛋白質を含有する組成物であって、
    前記ＨＣＶ Ε２が単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２であることにより、前記組成物が８０％（重量基準）を超える三量体、または三量体以上の高次型ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質を含む、組成物。
  2. Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ２（Ε２）糖蛋白質を含み、前記ＨＣＶ Ε２は８０％（重量基準）を超える三量体ＨＣＶ Ε２糖蛋白質である、組成物。
  3. Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ２（Ε２）糖蛋白質を含み、前記ＨＣＶ Ε２は８０％（重量基準）を超える高次型ＨＣＶ Ε２糖蛋白質である、組成物。
  4. Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ２（Ε２）糖蛋白質を含み、前記ＨＣＶ Ε２は８０％（重量基準）を超える三量体以上の高次型ＨＣＶ Ε２糖蛋白質である、組成物。
  5. 薬学的にもしくは生理的に許容可能な担体、および／または希釈剤を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. アジュバントを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記アジュバントがＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）である、請求項６に記載の組成物。
  8. ＨＣＶ感染症の治療または予防のための薬剤の製造における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  9. ＨＣＶ感染症の診断またはモニタリング、または抗ＨＣＶ治療プロトコールのモニタリングのための診断薬の製造における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  10. 前記診断薬が抗体であるか、またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項９に記載の使用。
  11. 前記組成物が、被検対象または患者における免疫応答を誘発するためのものである、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
  12. 前記組成物が、被検対象をＨＣＶ感染症に対して免疫化するためのものである、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
  13. 前記組成物が、被験対象におけるＨＣＶ感染症を治療または予防するためのものである、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
  14. 前記組成物が、単量体を枯渇化させたＨＣＶ Ε２に対する精製抗体を生成するためのものである、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
  15. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット、固体基質または半固体基質。
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