KR20140036127A - 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 C형 간염 바이러스 (HCV) 외막 2 (E2) 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 HCV E2는 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2이다. HCV 면역 반응을 유도하는 방법이 또한 제공된다.
Description
본 발명은 일반적으로, C형 간염 바이러스 (HCV) 백신 및 진단 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 HCV 외막 2 (E2) 당단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 특히, HCV 감염의 치료, 예방, 진단 및 예후에 유용하다.
본 발명의 상세한 설명에서 참고문헌에 대한 상세 목록은 또한, 본 발명의 상세한 설명의 마지막에 열거되어 있다.
본 상세한 설명의 임의의 선행 기술에 대한 인용은, 본 선행 기술이 어떤 국가에서든 보편적인 일반 지식의 일부를 이룸을 인정하거나 시사하는 형태가 아니며, 그렇게 취급되어서도 안 된다.
세계 보건 기구에 따르면, C형 간염 바이러스 (HCV)는 전 세계적으로 대략 1억 7천만 내지 2억 명을 감염시킨다. 정부 차원에서, 감염된 바늘 및 체액을 통해 HCV가 전달되는 방식에 대한 인식을 높이고, 예방 프로그램을 시행하고 있음에도, HCV 감염 발생률은 계속 증가하고 있다. HCV에 감염된 사람들 중 대략 80%는 바이러스의 보균자이다. 호주에서, 매년 약 16,000 건의 신규 HCV 감염 사례가 보고되고 있으며, 이러한 신규 감염은 주사 약물 사용자들에서 가장 많다. HCV는 가장 흔한 혈액 매개성 바이러스 감염으로, 감염자들 중 상당수에서 사망 또는 발병 (morbidity)을 야기한다.
HCV는 간과 특정 면역 세포를 감염시키는 것으로 알려져 있다. 그 결과, HCV는 다른 형태의 간염에 비해, 섬유증, 간경변, 지방증 및 간세포암 (간암)과 같은 중증 간 질환을 더 빈번하게 야기한다. HCV는 간 이식 수여체에서, 암의 주된 원인이다. 일반적으로, 감염의 준-임상적 성질로 인해 급성기 감염은 인지가 잘 되지 않아, 감염자 중 80%가, 만성 상태로 진행되는 것으로 생각된다. 만성 감염은, 면역계의 바이러스 제균성 면역 반응의 발생 부전으로 생기는 것이다. 6 가지의 주 HCV 유전자형 (1 내지 6) 및 여러 가지 서브타입 (a, b, c, 등)이 존재하고 있다. 현재로서는, HCV에 대한 백신이 존재하지 않으며, HCV 감염을 치료하는 데 이용될 수 있는 유일한 방법은 항-바이러스제이다. 항-바이러스제 설계에 대한 일반적인 아이디어는, 불능 또는 저해가능한, 중요한 바이러스 단백질, 또는 단백질의 일부를 동정하는 것이다. 중등도 (moderate) 또는 중증의 섬유증을 앓고 있는 환자를 위해 선택되는 표준 치료는, 알파-인터페론 및 리바비린 (ribavirin)의 병용을 포함한다. 알파-인터페론 및 리바비린의 병용 치료법의 항바이러스 효과는, 1회 투여로도, 혈중 HCV의 농도를 급속도로 감소시킨다. 그러나, 종래의 HCV에 대한 알파-인터페론 치료는 여러 문제점을 가지고 있다. 예를 들어, (i) 수 주 또는 수 개월간의 치료 후 알파-인터페론 치료를 중단한 경우, 바이러스 비중 (virus load)이 신속하게 재확립되며; (ii) 알파-인터페론/리바비린을 이용한 치료는, 감기-유사 증상, 적혈구 또는 백혈구의 수 감소, 골수 세포 저해, 신경정신학적 증상, 특히 우울증 및 빈혈을 비롯한 여러 부작용과 관련 있으며; (iii) 알파-인터페론이 체내에 흡수된 후 빠르게 제거되기 때문에, 효과적인 치료를 위해서는, 환자에게 빈번한 투약 요법을 지킬 것이 요구되며; 그리고 (iv) 이러한 치료의 비용이 비싸다는 점들이다. 치료 효과는 유전자형에 따라 다르고, 바이러스 제거 (viral clearance)는 유전자형 1 또는 4인 환자들 중 대략 절반 정도에서만 이루어진다.
상기 문제점들 중 일부, 특히 상기 (iii)의 항목의 문제점은, 인터페론에 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착시키는 '페길화 (pegylation)' 처리를 알파-인터페론에 대해 수행함으로써, 해결되고 있다. 페길화된 인터페론을 리바비린과 함께 투여하면, 인터페론의 반감기가 증가하고, 투여 빈도는 감소하는 이점을 가지므로, 환자 순응도가 향상된다. 그러나, 이러한 치료는, 치료받는 환자들 중 50% 미만에서 효과가 있는 것으로 입증되었다. 만성 HCV 환자의 수적 증가를 고려하면, 예방 및 치료 둘 다를 목적으로 하는 백신을 개발할 필요가 있다.
모든 백신의 필수 요소는, 바이러스 중화 항체의 유도이다. HCV의 경우, HCV 당단백질 E2가 바이러스 중화 항체 반응의 주된 표적이다. 중화 항체는, HCV 감염의 동물 및 인간 모델에서, HCV 제거에 중요한 것으로 입증된 바 있다 (Angus and Patel, 2011, Vanwolleghem et al., 2008, Law et al., 2008, Pestka et al., 2007). HCV는 고도의 돌연변이성 바이러스로서, HCV 감염을 예방하기 위해서는, 매우 다양한 유전자형과 서브타입의 HCV를 인지할 수 있는 중화 항체를 백신이 유도하는 것이 바람직하다.
HCV의 주된 세포성 수용체는 CD81 (Pileri et al., 1998)이다. CD81은, 모든 HCV 균주가 간세포 안으로 들어가는 데 필수적이다 (Koutsoudakis et al., 2007, Zhang et al., 2004, McKeating et al., 2004, Bartosch et al., 2003, Pileri et al., 1998). 바이러스 입자와 CD81의 상호작용을 방지하는 능력을 가진 항체가 중화성이 있을 수 있다 (Mancini et al., 2009, Law et al., 2008). 고역가의 E2-CD81 저해 항체는, 백신 연구에서, HCV 예방과 연관되어 있었다 (Youn et al., 2005) (Stamataki et al., 2008).
그러나, E2-CD81 저해 항체가 침팬지에서, 보다 양호한 HCV 예방과 연관되어 있지만, 이들이 유일한 잠재적인 중화 기전은 아니다. 다른 바이러스 시스템에서, 중화는 융합 루프 (fusion loop)에 대한 항체 (Sultana et al., 2009, Stiasny et al., 2006), 및 공동수용체 상호작용 (Blish et al., 2008, Lusso et al., 2005)에 대한 항체를 통해 이루어질 수 있다. 아울러, 플라비바이러스 (flaviviral) 입자의 표면에서의 에피토프에 대한 교차-결합도, 중화의 주 형태로서 기술된 바 있다 (Kaufmann et al., 2010).
HCV 당단백질 E2는, 아미노산 잔기 384-661에 이르는 개별 수용체 결합 도메인 (RBD)을 포함한다. RBD는 661 잔기를 지나, E2의 세포외 도메인의 C-말단 경계까지 연장될 수 있다. E2 RBD를 이종적으로 발현시키면, CD81에 결합하는 능력을 가진 가용성 단백질이 분비된다. RBD에는, 초가변부1, 초가변부 2 (HVR2) 및 유전자형간 가변부 (intergenotypic variable region) (igVR)라고 하는 3 종의 가변부가 존재한다. 이들 3 종의 가변부는 당단백질의 코어 도메인 (core domain)의 바깥쪽에 위치하며, E2의 CD81 결합 부위 형성에 직접 참여하지 않는다 (McCaffrey et al., 2007). RBD에서 3 가지 가변부가 결손되면, 구조 의존성 (conformation dependent) 항체에 의해 인지되며, 야생형 (WT) 수준의 CD81 결합성을 보유하는, 가용성 형태의 당단백질이 발현된다. E2의 코어 도메인이 최소화된 이러한 형태를 △123 E2661이라고 한다.
HCV 감염을 치료 또는 예방하기 위한 현행 그리고 실험적 치료법의 문제점을 고려하여, HCV 감염의 치료 및 예방에 있어 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있고, HCV 감염을 검출하기 위한 진단 시약을 제조할 수 있으며, 항-HCV 치료법을 모니터링하기 위한 조성물을 제공하고자 하는 충족되지 않은 시급한 요구가 존재한다.
본 명세서 전체에서, 문맥상 다른 의미를 나타내지 않는 한, 단어 "~을 포함하다", 또는 "~을 포함한다"나 "~을 포함하는"과 같은 변형된 표현들은, 언급된 요소나 정수, 또는 요소들이나 정수들의 군을 포함하는 것이지만, 임의의 다른 요소나 정수, 또는 요소들이나 정수들의 군을 배제하는 것이 아님을 이해해야 할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 표현 ("a", "an" 및 "the")은, 문맥상 명확하게 다르게 나타내지 않는 한, 복수형을 포함한다. 그래서, 예를 들어, "조성물"을 지칭하는 것은, 단수의 조성물 뿐만 아니라 2 가지 이상의 조성물을 포함하는 것이며; "제제 (agent)"를 지칭하는 것은 1 가지 제제 뿐만 아니라 2 가지 이상의 제제를 포함하는 것이고; "본 발명"을 지칭하는 것은 본 발명의 하나의 측면과 여러 가지 측면들을 포함하는 것 등이다.
본 발명은, 실질적으로 HCV E2 단량체가 결여된 C형 간염 바이러스 (HCV) 외막 2 (E2) 당단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "E2 단량체가 실질적으로 결여된" 또는 "실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2"라는 문구는, E2 단량체를 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만 또는, 1% (중량에 의해) 미만으로 포함하는 조성물을 지칭한다.
일부 실시 양태에서, 단량체 형태의 HCV E2의 비율은 15 중량%, 14 중량%, 13 중량%, 12 중량%, 11 중량%, 10 중량%, 9 중량%, 8 중량%, 7 중량%, 6 중량%, 5 중량%, 4 중량%, 3 중량%, 2 중량%, 1 중량%, 0.5 중량% 또는 0.1 중량% 미만이다.
실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 당단백질은, 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조되는 당단백질로부터 파생될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 조성물은, 실질적으로는 단량체 HCV E2가 없으며, 단량체 HCV E2는 1% 미만 또는 0.1% 미만이다.
관련된 측면에서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 조성물에는 삼량체 HCV E2가 농화 (enrichment)되어 있으며, 삼량체 HCV E2 당단백질이 70 중량%, 71 중량%, 72 중량%, 73 중량%, 74 중량%, 75 중량%, 76 중량%, 77 중량%, 78 중량%, 79 중량%, 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량% 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
다른 측면에서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 조성물에는 이량체 HCV E2가 농화되어 있으며, 이량체 HCV E2 당단백질이 70 중량%, 71 중량%, 72 중량%, 73 중량%, 74 중량%, 75 중량%, 76 중량%, 77 중량%, 78 중량%, 79 중량%, 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량% 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
다른 측면에서, 단량체 결여 조성물에는 삼량체 또는 보다 고차원적인 복합체의 HCV E2가 농화되어 있으며, 삼량체 또는 보다 고차원의 형태의 HCV E2 당단백질이 70 중량%, 71 중량%, 72 중량%, 73 중량%, 74 중량%, 75 중량%, 76 중량%, 77 중량%, 78 중량%, 79 중량%, 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량% 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, E2 당단백질은 실질적으로 HCV E2 삼량체이다. 관련 실시 양태에서, E2 당단백질은 실질적으로 삼량체 및 보다 고차원의 형태의 HCV E2이다. 다른 실시 양태에서, E2 당단백질은 실질적으로 보다 고차원의 형태의 HCV E2이다.
실질적으로 삼량체 HCV E2를 포함하는 조성물은, E2 삼량체가 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
실질적으로 HCV E2의 삼량체 형태 또는 보다 고차원의 형태를 포함하는 조성물은, E2의 삼량체 및 보다 고차원의 형태가 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
실질적으로 HCV E2의 보다 고차원의 형태를 포함하는 조성물은, 보다 고차원의 형태의 E2가 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, E2 당단백질은 실질적으로 HCV E2 이량체이다.
실질적으로 HCV E2 이량체를 포함하는 조성물은, E2 이량체가 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, E2 당단백질은 실질적으로 HCV E2 이량체 및 E2 삼량체이다.
일부 실시 양태에서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 포함하는 본원에서 기술된 조성물은, HCV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용된다.
본 발명은 추가로, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 포함하는 조성물을 유효량으로 대상 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상 또는 환자에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상을 C형 간염 바이러스 감염에 대해 면역화하는 방법을 제공한다.
C형 간염 바이러스 감염에 대해 대상을 면역화하기 위한, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 포함하는 조성물, 특히 백신 조성물이 또한, 본 발명에서 고려된다.
관련 실시 양태에서, 본 발명은 또한, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상에서 C형 간염의 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
이들 실시 양태들에 따르면, 조성물은 일반적으로, E2-특이적 항체의 생성을 포함하는 면역 반응을 유도하기에 충분한 조건에서 충분한 시간 동안 투여된다. 본 발명의 조성물은 단일 투여 또는 적용으로 투여될 수 있다. 대안적으로는, 상기 조성물은 반복 투여 또는 적용을 수반할 수 있으며, 예를 들어, 상기 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 회 이상 투여될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 면역학적 유효량으로 대상에게 주입하는 단계, 및 생성되는 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2에 대한 정제된 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 실시 양태에서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 조성물은 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 추가로 포함한다.
다른 실시 양태에서, 실질적으로 단량체가 결여된 조성물은 보강제를 추가로 포함한다. 한 예시적인 실시 양태에서, 보강제는 사포닌계 보강제이다. 관련된 측면에서, 보강제는 콜레스테롤 및 스테롤을 추가로 포함하는 사포닌계 보강제로, 이것의 예시적인 예는 ISCOMATRIX™ 보강제이다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2에 대해 생성되거나 또는 이와 반응성인 정제된 항체를 제공한다.
일부 실시 양태에서, 생성된 항체는, 숙주 세포 침입 또는 바이러스 출아와 같은 HCV 생활 주기의 주요 일부를 적어도 부분적으로 중화하는 것들을 포함한다.
본 발명은 추가로, HCV 감염의 치료 또는 예방에 있어, 또는 이를 위한 약제의 제조에 있어, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, HCV 감염의 진단 또는 모니터링, 또는 항-HCV 치료 프로토콜의 모니터링에 있어, 또는 이를 위한 진단 시약 (예컨대 항체)의 제조에 있어, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2의 용도를 제공한다.
다른 측면에서, 스크리닝 방법은, 항체, 항원-결합 단편, 리간드, 펩티드, 유기 또는 무기 분자와 같은 결합 분자를 동정하기 위해, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 이용하도록 제공된다.
다른 측면에서, 본 발명은, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 당단백질을 포함하는 키트, 또는 고체 또는 반-고체 기질을 제공한다. 본 발명의 키트 또는 기질은, 진단, 예후, 치료 또는 예방 적용에 사용하기 위한 것, 뿐만 아니라, HCV E2 결합 분자 또는 HCV 수용체 결합 분자를 설계 및/또는 스크리닝하는 데 사용하기 위한 것이다. 상기 키트 및 기질은 또한, HCV 감염에 대한 치료 프로토콜의 효능을 모니터링하는 데 유용하다.
상기의 요약은 본 발명의 모든 실시 양태를 철저하게 언급한 것이 아니며 그런 식으로 제시되어서도 안 된다.
도 1은 H77c WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 분취 크기-배제 크로마토그래피를 나타낸 그래프이다. 농축된 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his 단백질의 분취 등급 (preparative grade)의 TSKG3000SW 크기-배제 프로파일은 각각 상부 및 하부 패널에 나타나 있다. 샘플을 2 mL/분의 유속으로 100 분 동안 1x PBS 중에서 흐르게 한다. 여러 번의 운영 중에, 60분 내지 160분에 2 mL의 분획들을 회수하고, 추가의 분석을 위해 상응하는 분획들을 모아 둔다. WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his 둘다에서 해리된 단량체 피크와 이량체 피크가 모두 나타난다. 0.5 ㎍/mL의, 정제된 소 혈청 알부민 및 오브알부민 (ovalbumin) 단백질이, 표시된 바와 같이, 크기-표준물로 제공되었다.
도 2는 다른 형태의 H77c WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 분리를 보여주는 데이타의 그래프이다. 모은 분획물에 대한 분석용 TSKG3000SW 크기-배제 프로파일에서, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분취 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타난다. 모든 샘플은 0.25 mL/분의 유속으로 60 분 동안 1x PBS 중에서 흘려 주었고, 단량체, 이량체 및 삼량체 피크들로 해리되었다. 0.5 mg/mL의, 소 혈청 알부민 및 오브알부민 단백질이, 표시된 바와 같이, 크기-표준물로 제공되었다.
도 3은 다른 형태의 Con1 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 분리를 보여주는 데이타의 그래프이다. 모은 분획물에 대한 분석용 TSKG3000SW 크기-배제 프로파일에서, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분취 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타난다. A. WT E2661-his 올리고머 및 B. △HVR1+2+3 E2661-his 올리고머. 모든 샘플을 0.25 mL/분의 유속으로 60 분 동안 1x PBS 중에서 순수하게 흘려 주었고, 단량체, 이량체 및 삼량체 피크들로 해리되었다.
도 4는 서로 다른 형태의 JFH1 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 분리를 보여주는 데이타의 그래프이다. 모은 분획물의 분석용 TSKG3000SW 크기-배제 프로파일은, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분취 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타난다. A. WT E2661-his 올리고머 및 B. △HVR1+2+3 E2661-his 올리고머. 모든 샘플을 0.25 mL/분의 유속으로 60 분 동안 1x PBS 중에서 순수하게 흘려 주었고, 단량체, 이량체 및 삼량체 피크들로 해리되었다.
도 5는 개개 및 복수의 가변부의 서열이 결핍된 정제된 E2661 단백질의 발현 프로파일을 나타낸 것이다. H77c 유전자형 1a로부터 유도된 E2661-his 가변부 결손 돌연변이체들 각각의 분석용 크기-배제 크로마토그래피 프로파일은, TSKG3000SWXL 컬럼 및 HPLC 시스템으로 수행된 바와 같이 나타내었다. 서로 다른 형태의 정제된 소 혈청 알부민 (BSA)과 오브알부민은, 표시된 바와 같이, 크기-표준물로 제공되었다.
도 6은 서로 다른 형태의 H77c WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 특징을 나타낸 것이다. A. WT E2661-his 분획물 13-31 및 B. △HVR1+2+3 E2661-his 분획물 15-33에 대한, 분취 크기-배제 크로마토그래피로부터 모은 분획의, 25-200 kDa의 크기-표준물을 사용한 비-환원성 및 환원성 (+β-머캅토에탄올) 조건에서의 정량적인 SDS-PAGE 분석. 별표 (*)는, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분석용 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타난다. SDS-PAGE 분석으로부터 추정되는, 단량체, 이량체, 및 삼량체 종들에 대해 계산한 분자량을 도면 아래의 표에 나타낸다.
도 7은 서로 다른 형태의 Con1 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 특징을 나타낸 것이다. A. WT E2661-his 분획물 13-31 및 B. △HVR1+2+3 E2661-his 분획물 16-34에 대한, 분취 크기-배제 크로마토그래피로부터 모은 분획의, 25-200kDa의 크기-표준물을 사용한 비-환원성 및 환원성 (+β-머캅토에탄올) 조건에서의 정량적 SDS-PAGE 분석. 별표 (*)는, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분석용 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타난다. 환원성 및 비-환원성 SDS-PAGE 둘다에서, 단량체, 이량체 및 고차의 분자량 (HMr)의 종 (추정상 삼량체)들에 상응하는 분획물에 대해 계산한 분자량을 각각의 SDS-PAGE 결과 아래에 표로 나타낸다.
도 8은 서로 다른 올리고머 형태의 JFH1 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 특징을 나타낸 것이다. A. WT E2661-his 분획물 15-32 및 B. △ HVR1+2+3 E2661-his 분획물 18-36에 대한, 분취 크기-배제 크로마토그래피로부터 모은 분획의, 25-200kDa의 크기-표준물을 사용한 비-환원성 및 환원성 (+β-머캅토에탄올) 조건에서의 정량적 SDS-PAGE 분석. 별표 (*)는, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분석용 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타나는 분획들을 나타낸다. 환원성 및 비-환원성 SDS-PAGE 둘다에서, 단량체, 이량체 및 고차의 분자량 (HMr) 종 (추정상 삼량체)들에 상응하는 분획물에 대해 계산한 분자량을 각각의 SDS-PAGE 결과 아래에 표로 나타낸다.
도 9는, H77c 분리물로부터 유도된, 서로 다른 형태의 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 바이오센서 곡선을 나타내는 그래프이다. 0.1 ㎍/mL에서 시작하는 연속적인 2-배 희석 농도에서의 여러 가지 단백질의 바이오센서 곡선. 상부 패널. WT E2661-his 분획물 및 하부 패널. △HVR1+2+3 E2661-his 분획물은 각각, 분석용 크기-배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 바와 같이, 삼량체, 이량체 및 단량체 피크를 표시한다. 수직 밴드는, 주입의 '시작' 및 '중지'의 위치를 나타낸 것이다. 1:1의 화학양론에 대한 Rmax 값이 나타나 있으며, 2:1 결합 화학양론에 대한 Rmax 값은 괄호 안에 나타나 있다.
도 10은 CD81 MBP-LEL113 -201의 거대 세포외 루프에 결합하는 H77c (유전자형 1a), Con1 (유전자형 1b) 및 JFH1 (유전자형 2a) WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his 삼량체, 이량체 및 단량체 단백질의 친화성을 비교하여 나타낸 그래프이다. 이량체 및 삼량체 단백질에 대한 '1:1 Langmuir' 결합 모델 및 단량체 단백질에 대한 '2-상태 (two-state)' (구조적 변화) 모델을 이용해 수득되는 몰 (M) 단위의 평균 KD 값. 3 회의 독립적인 실험의 평균 및 표준 오차가 표시되며, n=1인 Con1 및 JFH1에 대해서는 예외이다. 각각의 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his 단백질에 대해 수득한 KD 값의 유의 오차 (p<0.05)는 별표 (*)로 표시되어 있다.
도 11은 동종 H77c △123 E2661-his 항원에 대한 30 ㎍ 또는 100 ㎍의, 단량체 [A (gp1-1 내지 gp1-4) 및 B (gp 2-1 내지 2-4)], 이량체 [C(gp 3-1 내지 3-4) 및 D(gp4-1 내지 4-4) ] 또는 혼합물 [E (gp5-1 내지 5-4) 및 F(gp6-1 내지 6-4)] E2-his 조성물을 투여하여 생성된 기니아 피그 면역 혈청의 적정 곡선을 나타내는 데이타의 도면이다. ISCOMATRIX™ 보강제 단독 (항원 없음)으로 유도된 기니아 피그 혈청의 반응성은 각 그래프에서 gp 7-1 내지 7-4 선으로 나타나 있다.
도 12는 동종 면역화 H77c △123 E2661-his 항원에 대한 기니아 피그 혈청의 평균 항체 역가를 나타낸 도면이다. 100 ㎍ 혼합물 군의 평균 항체 역가는, 30 ㎍ 혼합물 군에서보다 대략 0.5 log 더 높으며, 이량체 군보다 1 log 더 높고, 단량체 군보다 2 log 더 높았다.
도 13은 WT 및 △123 형태의 E2661-his의 혼합물에 대한 면역 혈청의 반응성을 보여주는 직접 결합성 효소 면역분석법의 데이타를 나타낸 도면이다. 항체 역가는 용량 의존적이었으며, 100 ㎍이 30 ㎍ 보다 더 양호한 것으로 보인다. 이량체 및 혼합물 형태의 E2661을 제공받은 동물은 단량체 단백질로 백신접종된 동물과 비교해 평균 역가가 더 높은 항체를 유도하였다.
도 14는, 고상 효소 분석법에서, H77c (유전자형 1a) 및 JFH1 (유전자형 2a) WT E2661-his 단백질이, D81 (MBP-LEL113 -201)의 거대 세포외 루프의 재조합 형태에 결합하지 못하도록 저해하는, 면역 혈청의 저해력을 보여주는 데이타를 나타낸 도면이다. 단량체 E2661-his로 백신접종된 동물은 가장 평균 역가가 낮은 E2-CD81 저해 항체를 유도하였다. 이량체 형태로 백신접종된 동물은, 단량체 형태와 비교해 평균 역가가 더 높은 H77c E2-CD81 저해 항체를 유도하였다. 삼량체 종을 포함하는 혼합물로 백신접종된 동물로부터 수득된 면역 혈청은 가장 평균 역가가 높은 H77c E2-CD81 저해 항체를 유도하였다. 또한, 심지어 30 ㎍의 낮은 백신 투여량에서도 모든 동물들에서 반응이 관찰되었으며, 이는 E2661-his의 삼량체 종을 포함하는 조제물이 이량체 E2661-his 단독보다 더 우수함을 시사한다. 30 ㎍ 또는 100 ㎍의, E2661-his의 이량체, 또는 혼합물을 제공받은 동물로부터 수득된 혈청만 JFH1 E2-CD81의 상호작용을 80% 저해하였으며, 100 ㎍ 혼합물 군의 모든 동물들은 80% 저해를 달성하였다.
도 15는 H77c HCVpp의 동종 중화를 매개하는, 기니아 피그 혈청의 능력을 나타내는 데이타의 도면이다. HCVpp의 중화를 매개하는 능력 또한, 투여량 및 항원 의존성이었으며; 단량체 (A 및 B), 이량체 (C 및 D), 및 혼합물 (E 및 F)을 참조한다. 30 ㎍ 단량체를 제공받은 대상은, HCVpp를 중화하는 능력이 불량한 것으로 나타났으며, 곡선은 대조군인 무(無)-항원 군 (G)과 유사하다. E2에 대한 중화 모노클로날 항체를 이용한 양성 대조군이 또한, G (mab 24)에 나타나 있다.
도 16은 H77c HCVpp에 대한 기니아 피그 혈청의 평균 50% 중화 역가를 나타내는 그래프이다. 100 ㎍의 혼합물 항원을 제공받은 대상에서는, 100 ㎍ 단량체, 30 ㎍ 이량체 또는 100 ㎍ 이량체에 대해 관찰된 것보다 대략 10 배 더 높은 중화 평균 역가가 유도되었다. 25 및 75 백분위수 (상자), 평균 (선), 및 평균의 표준 오차를 나타내었다.
도 17은, 단량체 (A 및 B), 이량체 (C 및 D), 혼합 조제물 (E 및 F)에 대한 J6-JFH1 HCVcc의 교차 중화를 매개하는, 면역 혈청의 능력을 보여주는 그래프이다. 대조군인 무-항원, 및 E2에 대한 중화 모노클로날 항체를 또한 실험하였다 (G 및 H). 100 ㎍ 혼합물 항원을 제공받은 대상은, 1/40 혈청 희석에서, 도입을 90% 저해하는, 강력한 교차 중화 매개력을 나타내었다.
도 18은 J6-JFH1 HCVcc에 대한 백신 군의 평균 50% 중화 역가를 나타낸 그래프이다. 100 ㎍ 혼합물 군에서 관찰된 평균 50% 중화 역가는, 30 ㎍ 및 100 ㎍ 단량체 군보다 약 2 log 더 높으며, 이량체 군 및 30 ㎍ 혼합물 군보다 1 log 더 높았다.
도 19는 WT E2661-his 단백질의 대표적인 겔 여과 크로마토그램을 나타낸 것이다. 단백질을 Superdex 200 pg 26/60 분취용 겔 여과 컬럼에서 실험하였으며, 회수된 피크 1-4는 나타낸 바와 같았다. 분자량 표준물에 대한 용리 시간은 크로마토그램 상부에 나타낸다.
도 20은 △123 E2661-his 단백질의 대표적인 겔 여과 크로마토그램을 나타낸 것이다. 단백질을 Superdex 200 pg 26/60 분취용 겔 여과 컬럼에서 실험하였으며, 회수된 피크 1-4는 나타낸 바와 같다. 분자량 표준물에 대한 용리 시간은 크로마토그램 상위에 나타낸다.
도 21은 WT E2661-his 피크 1-4를 표시하는, 모은 분획물에 대한 분석용 겔 여과 프로파일을 나타낸 것이다. Superdex 200 PC 3.2/30 컬럼 상에서 진행된 개개의 겔 여과를 중첩하여 이들의 상대적인 용리를 나타내었다. 크기 마커가 표시되어 있다.
도 22는 △123 E2661-his 피크 1-4를 표시하는, 모은 분획물에 대한 분석용 겔 여과 프로파일을 나타낸 것이다. Superdex 200 PC 3.2/30 컬럼 상에서 진행된 개개의 겔 여과를 중첩하여 이들의 상대적인 용리를 나타내었다. 크기 마커가 표시되어 있다.
도 23은 피크 1-4의 환원성 SDS-PAGE를 나타낸 것이다. 3 ㎍의, 각각의 E2661-his 단백질을 10㎕의 4 x 환원성 샘플 완충제에 첨가하였다. 샘플을 70℃에서 3 분 동안 가열하고, 4-12% Bis-Tris_Nu PAGE SDS-PAGE 겔에 주입하였다. 500㎕의 NuPAGE 항산화제를 겔 탱크의 센터에 첨가한 후, 200 V에서 진행시켰다. BioRad Precision Plus Standards의 이동은 좌측에 표시된다.
도 24는 피크 1-4의 비-환원성 SDS-PAGE를 나타낸 것이다. 3 ㎍의, 각각의 E2661-his 단백질을 10㎕의 4 x 비-환원성 샘플 완충제에 첨가하였다. 샘플을 70℃에서 3 분 동안 가열하고, 4-12% Bis-Tris_Nu PAGE SDS-PAGE 겔에 주입하였다. BioRad Precision Plus Standards의 이동은 좌측에 표시된다.
도 25는 피크 1-4의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 0.5 ㎍의, E2661-his의 피크 1-4를 4X 환원성 샘플 완충제에 첨가하였다. 환원성 SDS-PAGE 분석을 도 23에서 기술한 바와 같이, 수행하였다. 그런 후, E2661-his 변이체를, 습식 이동 (wet transfer) (1 h)을 통해 PVDF 막에 이동시켰다. PBS 중의 2% 스킴 밀크로 막을 밤새 블롯킹처리하였다. 1차 항 펜타-His 항체를, 1% 스킴 밀크를 포함하는 0.05% TBS에 1:1000 희석으로 첨가하였다. 3 회 세정한 후, 양 (sheep) 항-마우스 IgG HRP (Millipore)를, 1% 스킴 밀크를 포함하는 0.05% TBS에 1:2000 희석으로 첨가하였다. 3 회 세정한 후, 제조사의 지침에 따라, ECL Plus Western Blotting Detection Reagent로 블롯을 현상하고, 520 nm에서 스캔하였다. BioRad Precision Plus Standards의 이동은 좌측에 표시된다.
도 26은 피크 1-4의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 0.5 ㎍의, E2661-his의 피크 1-4를 4X 환원성 샘플 완충제에 첨가하였다. 환원성 SDS-PAGE 분석을 도 23에서 기술한 바와 같이, 수행하였다. 그런 후, E2661-his 변이체를, 습식 이동 (1 h)을 통해 PVDF 막에 이동시켰다. PBS 중의 2% 스킴 밀크로 막을 밤새 블롯킹처리하였다. 1차 항 펜타-His 항체를, 1% 스킴 밀크를 포함하는 0.05% TBS에 1:1000 희석으로 첨가하였다. 3 회 세정한 후, 양 (sheep) 항-마우스 IgG HRP (Millipore)를, 1% 스킴 밀크를 포함하는 0.05% TBS에 1:2000 희석으로 첨가하였다. 3 회 세정한 후, 제조사의 지침에 따라, ECL Plus Western Blotting Detection Reagent로 블롯을 현상하고, 520 nm에서 스캔하였다. BioRad Precision Plus Standards의 이동은 좌측에 표시된다.
도 27은, WT E2661-his 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 동종 면역 항원에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물 2 ㎍/ml로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 28은, △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 동종 면역 항원에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물 2 ㎍/ml로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 29는, △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 비분획화된 유전자형 1a H77c WT 및 △123 E2661-his 항원에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 비분획화된 H77c WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 항원 2 ㎍/ml로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 30은, WT E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 동종 (H77c, A)과 이종 (JFH1, B) E2661 간의, CD81에 대한 결합 저해 능력을 나타낸 그래프이다. 면역 혈청의 연속 희석물을 100ng의, 비분획화된 H77c 또는 JFH1 E2661-his 단백질에 첨가한 후, MBP-LEL113 -201 코팅된 효소 면역분석법 플레이트에 첨가하였다. 결합된 E2661-his를 항-his 항체로 검출하고, 이어서, 항-래빗 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 접합된 면역글로불린과 TMB 기질로 검출하였다. E2661-his와 MBP-LEL113 -201 간의 결합을 50% 저해하는 데 필요한 항체의 희석비율을 각각의 동물에 대해 계산하였다.
도 31은, △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 동종 (H77c, A)과 이종 (JFH1, B) E2661 간의, CD81에 대한 결합 저해 능력을 나타낸 그래프이다. 면역 혈청의 연속 희석물을 100ng의, 비분획화된 H77c 또는 JFH1 E2661-his 단백질에 첨가한 후, MBP-LEL113 -201 코팅된 효소 면역분석법 플레이트에 첨가하였다. 결합된 E2661-his를 항-his 항체로 검출하고, 이어서, 항-래빗 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 접합된 면역글로불린과 TMB 기질로 검출하였다. E2661과 MBP-LEL113-201 간의 결합을 50% 저해하는 데 필요한 항체의 희석비율을 각각의 동물에 대해 계산하였다.
도 32는, △123 E2661-his 기니아 피그 혈청의 동종 HCV에 의한 간 세포 배양물의 감염 예방력을 나타낸 그래프이다. △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그에 의해 유도된 면역 혈청을, 동종 H77c E1E2 당단백질 (H77c HCVpp)을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 입자를 중화하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 DMF10에 연속 희석하고, 37℃에서 1 시간 동안 동일 부피의 H77c HCVpp와 함께 인큐베이션한 후, 하루 전에 3 x 104 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 첨가하였다. 4 시간 후, 바이러스-혈청 혼합물을 제거하고, 배지를 교체하였다. 3 일 후, 세포 용혈물의 루시퍼라아제 활성을 광도계에서 측정하였다. IC50 역가는 바이러스 감염을 50% 저해하는 데 필요한 면역 혈청의 희석 (A)으로 계산하며, 한편, IC80 역가는 바이러스 감염을 80% 저해하는 데 필요한 혈청의 희석 (B)이다.
도 33은, △123 E2661-his 기니아 피그 혈청의 이종 HCV 균주에 의한 간 세포 배양물의 감염 예방력을 나타낸 그래프이다. △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그에 의해 유도된 면역 혈청을, J6/JFH1 키메라 세포 배양물 (HCVcc) 유전자형 2a 바이러스를 중화하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 DMF10+NEAA 중에 연속 희석하고, 37℃에서 20 분 동안 동일 부피의 3.16 TCID50/ml HCVcc와 혼합하였다. 혈청/바이러스 혼합물을, 하루 전에 8x103 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 적용하고, 37℃에서 5 시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청/바이러스 혼합물을 제거하고, PBS로 4 회 세정한 다음, DMF10+NEAA를 첨가하고, 44 시간 동안 인큐베이션하였다. 조직 배양액에 존재하는 루시퍼라아제 활성을 Renilla 루시퍼라아제 기질 및 광도계로 측정하였다. IC50 역가는 바이러스 감염을 50% 저해하는 데 필요한 면역 혈청의 희석 (A)으로 계산하며, 한편, IC80 역가는 바이러스 감염을 80% 저해하는 데 필요한 혈청의 희석 (B)이다.
도 34는, 효소 면역분석법에서, 비분획화된 H77c WT 및 △123 E2661-his 항원에 대한 WT E2661-his 면역 혈청의 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 2 ㎍/mL의, 비분획화된 H77c WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 항원으로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 35는, 효소 면역분석법에서, H77c WT 피크 1-4 E2661-his 단백질 중 하나, 또는 비분획화된 E2661-his 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 이종 JFH1 WT 및 △123 E2661-his 항원에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 2 ㎍/mL의, 비분획화된 JFH1 WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 항원으로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 36은, 야생형 E2661-his 기니아 피그 혈청의 동종 HCV에 의한 간 세포 배양물의 감염 예방력을 나타낸 그래프이다. WT E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그에 의해 유도된 면역 혈청을, 동종 H77c E1E2 당단백질 (H77c HCVpp)을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 입자를 중화하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 DMF10에 연속 희석하고, 37℃에서 1 시간 동안 동일 부피의 H77c HCVpp와 함께 인큐베이션한 후, 하루 전에 3 x 104 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 첨가하였다. 4 시간 후, 바이러스-혈청 혼합물을 제거하고, 배지를 교체하였다. 3 일 후, 세포 용혈물의 루시퍼라아제 활성을 광도계에서 측정하였다. IC50 역가는 바이러스 감염을 50% 저해하는 데 필요한 면역 혈청의 희석 (A)으로 계산하며, 한편, IC80 역가는 바이러스 감염을 80% 저해하는 데 필요한 혈청의 희석 (B)이다.
도 37은, WT E2661-his 면역 혈청의 이종 HCV 균주에 의한 간 세포 배양물의 감염 예방력을 나타낸 그래프이다. WT E2661-his 피크 1-4 단백질 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그에 의해 유도된 면역 혈청을, J6/JFH1 키메라 세포 배양물 (HCVcc) 유전자형 2a 바이러스를 중화하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 DMF10+NEAA 중에 연속 희석하고, 37℃에서 20 분 동안 3.16 TCID50/ml HCV cc와 혼합하였다. 혈청/바이러스 혼합물을, 하루 전에 8x103 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 적용하고, 37℃에서 5 시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청/바이러스 혼합물을 제거하고, PBS로 4 회 세정한 다음, DMF10+NEAA를 첨가하고, 40 시간 동안 인큐베이션하였다. 조직 배양액에 존재하는 루시퍼라아제 활성을 Renilla 루시퍼라아제 기질 및 광도계로 측정하였다. IC50 역가는 바이러스 감염을 50% 저해하는 데 필요한 면역 혈청의 희석 (A)으로 계산하며, 한편, IC80 역가는 바이러스 감염을 80% 저해하는 데 필요한 혈청의 희석 (B)이다.
도 38은, 효소 면역분석법에서, 이종 Con1 (유전자형 1b) 야생형 및 △123 E2661-his 항원에 대한, WT E2661-his 면역 혈청의 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 2 ㎍/mL의, 비분획화된 Con1 WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 혼합물로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 39는, 효소 면역분석법에서, 이종 Con1 (유전자형 1b) 야생형 및 △123 E2661-his 항원에 대한, △123 E2661 면역 혈청의 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 2 ㎍/mL의, 비분획화된 Con1 WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 혼합물로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 40은, 효소 면역분석법에서, 이종 JFH1 (유전자형 2a) WT 및 △123 E2661-his 항원에 대한, △123 E2661 면역 혈청의 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 2 ㎍/mL의, 비분획화된 JFH1 WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 혼합물로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
표 1은, 기니아 피그 백신 투여 군 (1 내지 7), 및 항원 유형, 항원 양, 보강제, 및 실시예 3에서 기술한 바와 동일한 것들을 제공받는 각 군의 대상체의 수를 열거한 것이다.
도 2는 다른 형태의 H77c WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 분리를 보여주는 데이타의 그래프이다. 모은 분획물에 대한 분석용 TSKG3000SW 크기-배제 프로파일에서, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분취 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타난다. 모든 샘플은 0.25 mL/분의 유속으로 60 분 동안 1x PBS 중에서 흘려 주었고, 단량체, 이량체 및 삼량체 피크들로 해리되었다. 0.5 mg/mL의, 소 혈청 알부민 및 오브알부민 단백질이, 표시된 바와 같이, 크기-표준물로 제공되었다.
도 3은 다른 형태의 Con1 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 분리를 보여주는 데이타의 그래프이다. 모은 분획물에 대한 분석용 TSKG3000SW 크기-배제 프로파일에서, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분취 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타난다. A. WT E2661-his 올리고머 및 B. △HVR1+2+3 E2661-his 올리고머. 모든 샘플을 0.25 mL/분의 유속으로 60 분 동안 1x PBS 중에서 순수하게 흘려 주었고, 단량체, 이량체 및 삼량체 피크들로 해리되었다.
도 4는 서로 다른 형태의 JFH1 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 분리를 보여주는 데이타의 그래프이다. 모은 분획물의 분석용 TSKG3000SW 크기-배제 프로파일은, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분취 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타난다. A. WT E2661-his 올리고머 및 B. △HVR1+2+3 E2661-his 올리고머. 모든 샘플을 0.25 mL/분의 유속으로 60 분 동안 1x PBS 중에서 순수하게 흘려 주었고, 단량체, 이량체 및 삼량체 피크들로 해리되었다.
도 5는 개개 및 복수의 가변부의 서열이 결핍된 정제된 E2661 단백질의 발현 프로파일을 나타낸 것이다. H77c 유전자형 1a로부터 유도된 E2661-his 가변부 결손 돌연변이체들 각각의 분석용 크기-배제 크로마토그래피 프로파일은, TSKG3000SWXL 컬럼 및 HPLC 시스템으로 수행된 바와 같이 나타내었다. 서로 다른 형태의 정제된 소 혈청 알부민 (BSA)과 오브알부민은, 표시된 바와 같이, 크기-표준물로 제공되었다.
도 6은 서로 다른 형태의 H77c WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 특징을 나타낸 것이다. A. WT E2661-his 분획물 13-31 및 B. △HVR1+2+3 E2661-his 분획물 15-33에 대한, 분취 크기-배제 크로마토그래피로부터 모은 분획의, 25-200 kDa의 크기-표준물을 사용한 비-환원성 및 환원성 (+β-머캅토에탄올) 조건에서의 정량적인 SDS-PAGE 분석. 별표 (*)는, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분석용 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타난다. SDS-PAGE 분석으로부터 추정되는, 단량체, 이량체, 및 삼량체 종들에 대해 계산한 분자량을 도면 아래의 표에 나타낸다.
도 7은 서로 다른 형태의 Con1 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 특징을 나타낸 것이다. A. WT E2661-his 분획물 13-31 및 B. △HVR1+2+3 E2661-his 분획물 16-34에 대한, 분취 크기-배제 크로마토그래피로부터 모은 분획의, 25-200kDa의 크기-표준물을 사용한 비-환원성 및 환원성 (+β-머캅토에탄올) 조건에서의 정량적 SDS-PAGE 분석. 별표 (*)는, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분석용 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타난다. 환원성 및 비-환원성 SDS-PAGE 둘다에서, 단량체, 이량체 및 고차의 분자량 (HMr)의 종 (추정상 삼량체)들에 상응하는 분획물에 대해 계산한 분자량을 각각의 SDS-PAGE 결과 아래에 표로 나타낸다.
도 8은 서로 다른 올리고머 형태의 JFH1 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 특징을 나타낸 것이다. A. WT E2661-his 분획물 15-32 및 B. △ HVR1+2+3 E2661-his 분획물 18-36에 대한, 분취 크기-배제 크로마토그래피로부터 모은 분획의, 25-200kDa의 크기-표준물을 사용한 비-환원성 및 환원성 (+β-머캅토에탄올) 조건에서의 정량적 SDS-PAGE 분석. 별표 (*)는, 단량체 및 이량체 피크 뿐만 아니라 분석용 크기-배제 크로마토그래피 프로파일과는 독립적인 고차원의 분자 덩어리 형태 (추정상 삼량체)가 나타나는 분획들을 나타낸다. 환원성 및 비-환원성 SDS-PAGE 둘다에서, 단량체, 이량체 및 고차의 분자량 (HMr) 종 (추정상 삼량체)들에 상응하는 분획물에 대해 계산한 분자량을 각각의 SDS-PAGE 결과 아래에 표로 나타낸다.
도 9는, H77c 분리물로부터 유도된, 서로 다른 형태의 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his의 바이오센서 곡선을 나타내는 그래프이다. 0.1 ㎍/mL에서 시작하는 연속적인 2-배 희석 농도에서의 여러 가지 단백질의 바이오센서 곡선. 상부 패널. WT E2661-his 분획물 및 하부 패널. △HVR1+2+3 E2661-his 분획물은 각각, 분석용 크기-배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 바와 같이, 삼량체, 이량체 및 단량체 피크를 표시한다. 수직 밴드는, 주입의 '시작' 및 '중지'의 위치를 나타낸 것이다. 1:1의 화학양론에 대한 Rmax 값이 나타나 있으며, 2:1 결합 화학양론에 대한 Rmax 값은 괄호 안에 나타나 있다.
도 10은 CD81 MBP-LEL113 -201의 거대 세포외 루프에 결합하는 H77c (유전자형 1a), Con1 (유전자형 1b) 및 JFH1 (유전자형 2a) WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his 삼량체, 이량체 및 단량체 단백질의 친화성을 비교하여 나타낸 그래프이다. 이량체 및 삼량체 단백질에 대한 '1:1 Langmuir' 결합 모델 및 단량체 단백질에 대한 '2-상태 (two-state)' (구조적 변화) 모델을 이용해 수득되는 몰 (M) 단위의 평균 KD 값. 3 회의 독립적인 실험의 평균 및 표준 오차가 표시되며, n=1인 Con1 및 JFH1에 대해서는 예외이다. 각각의 WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his 단백질에 대해 수득한 KD 값의 유의 오차 (p<0.05)는 별표 (*)로 표시되어 있다.
도 11은 동종 H77c △123 E2661-his 항원에 대한 30 ㎍ 또는 100 ㎍의, 단량체 [A (gp1-1 내지 gp1-4) 및 B (gp 2-1 내지 2-4)], 이량체 [C(gp 3-1 내지 3-4) 및 D(gp4-1 내지 4-4) ] 또는 혼합물 [E (gp5-1 내지 5-4) 및 F(gp6-1 내지 6-4)] E2-his 조성물을 투여하여 생성된 기니아 피그 면역 혈청의 적정 곡선을 나타내는 데이타의 도면이다. ISCOMATRIX™ 보강제 단독 (항원 없음)으로 유도된 기니아 피그 혈청의 반응성은 각 그래프에서 gp 7-1 내지 7-4 선으로 나타나 있다.
도 12는 동종 면역화 H77c △123 E2661-his 항원에 대한 기니아 피그 혈청의 평균 항체 역가를 나타낸 도면이다. 100 ㎍ 혼합물 군의 평균 항체 역가는, 30 ㎍ 혼합물 군에서보다 대략 0.5 log 더 높으며, 이량체 군보다 1 log 더 높고, 단량체 군보다 2 log 더 높았다.
도 13은 WT 및 △123 형태의 E2661-his의 혼합물에 대한 면역 혈청의 반응성을 보여주는 직접 결합성 효소 면역분석법의 데이타를 나타낸 도면이다. 항체 역가는 용량 의존적이었으며, 100 ㎍이 30 ㎍ 보다 더 양호한 것으로 보인다. 이량체 및 혼합물 형태의 E2661을 제공받은 동물은 단량체 단백질로 백신접종된 동물과 비교해 평균 역가가 더 높은 항체를 유도하였다.
도 14는, 고상 효소 분석법에서, H77c (유전자형 1a) 및 JFH1 (유전자형 2a) WT E2661-his 단백질이, D81 (MBP-LEL113 -201)의 거대 세포외 루프의 재조합 형태에 결합하지 못하도록 저해하는, 면역 혈청의 저해력을 보여주는 데이타를 나타낸 도면이다. 단량체 E2661-his로 백신접종된 동물은 가장 평균 역가가 낮은 E2-CD81 저해 항체를 유도하였다. 이량체 형태로 백신접종된 동물은, 단량체 형태와 비교해 평균 역가가 더 높은 H77c E2-CD81 저해 항체를 유도하였다. 삼량체 종을 포함하는 혼합물로 백신접종된 동물로부터 수득된 면역 혈청은 가장 평균 역가가 높은 H77c E2-CD81 저해 항체를 유도하였다. 또한, 심지어 30 ㎍의 낮은 백신 투여량에서도 모든 동물들에서 반응이 관찰되었으며, 이는 E2661-his의 삼량체 종을 포함하는 조제물이 이량체 E2661-his 단독보다 더 우수함을 시사한다. 30 ㎍ 또는 100 ㎍의, E2661-his의 이량체, 또는 혼합물을 제공받은 동물로부터 수득된 혈청만 JFH1 E2-CD81의 상호작용을 80% 저해하였으며, 100 ㎍ 혼합물 군의 모든 동물들은 80% 저해를 달성하였다.
도 15는 H77c HCVpp의 동종 중화를 매개하는, 기니아 피그 혈청의 능력을 나타내는 데이타의 도면이다. HCVpp의 중화를 매개하는 능력 또한, 투여량 및 항원 의존성이었으며; 단량체 (A 및 B), 이량체 (C 및 D), 및 혼합물 (E 및 F)을 참조한다. 30 ㎍ 단량체를 제공받은 대상은, HCVpp를 중화하는 능력이 불량한 것으로 나타났으며, 곡선은 대조군인 무(無)-항원 군 (G)과 유사하다. E2에 대한 중화 모노클로날 항체를 이용한 양성 대조군이 또한, G (mab 24)에 나타나 있다.
도 16은 H77c HCVpp에 대한 기니아 피그 혈청의 평균 50% 중화 역가를 나타내는 그래프이다. 100 ㎍의 혼합물 항원을 제공받은 대상에서는, 100 ㎍ 단량체, 30 ㎍ 이량체 또는 100 ㎍ 이량체에 대해 관찰된 것보다 대략 10 배 더 높은 중화 평균 역가가 유도되었다. 25 및 75 백분위수 (상자), 평균 (선), 및 평균의 표준 오차를 나타내었다.
도 17은, 단량체 (A 및 B), 이량체 (C 및 D), 혼합 조제물 (E 및 F)에 대한 J6-JFH1 HCVcc의 교차 중화를 매개하는, 면역 혈청의 능력을 보여주는 그래프이다. 대조군인 무-항원, 및 E2에 대한 중화 모노클로날 항체를 또한 실험하였다 (G 및 H). 100 ㎍ 혼합물 항원을 제공받은 대상은, 1/40 혈청 희석에서, 도입을 90% 저해하는, 강력한 교차 중화 매개력을 나타내었다.
도 18은 J6-JFH1 HCVcc에 대한 백신 군의 평균 50% 중화 역가를 나타낸 그래프이다. 100 ㎍ 혼합물 군에서 관찰된 평균 50% 중화 역가는, 30 ㎍ 및 100 ㎍ 단량체 군보다 약 2 log 더 높으며, 이량체 군 및 30 ㎍ 혼합물 군보다 1 log 더 높았다.
도 19는 WT E2661-his 단백질의 대표적인 겔 여과 크로마토그램을 나타낸 것이다. 단백질을 Superdex 200 pg 26/60 분취용 겔 여과 컬럼에서 실험하였으며, 회수된 피크 1-4는 나타낸 바와 같았다. 분자량 표준물에 대한 용리 시간은 크로마토그램 상부에 나타낸다.
도 20은 △123 E2661-his 단백질의 대표적인 겔 여과 크로마토그램을 나타낸 것이다. 단백질을 Superdex 200 pg 26/60 분취용 겔 여과 컬럼에서 실험하였으며, 회수된 피크 1-4는 나타낸 바와 같다. 분자량 표준물에 대한 용리 시간은 크로마토그램 상위에 나타낸다.
도 21은 WT E2661-his 피크 1-4를 표시하는, 모은 분획물에 대한 분석용 겔 여과 프로파일을 나타낸 것이다. Superdex 200 PC 3.2/30 컬럼 상에서 진행된 개개의 겔 여과를 중첩하여 이들의 상대적인 용리를 나타내었다. 크기 마커가 표시되어 있다.
도 22는 △123 E2661-his 피크 1-4를 표시하는, 모은 분획물에 대한 분석용 겔 여과 프로파일을 나타낸 것이다. Superdex 200 PC 3.2/30 컬럼 상에서 진행된 개개의 겔 여과를 중첩하여 이들의 상대적인 용리를 나타내었다. 크기 마커가 표시되어 있다.
도 23은 피크 1-4의 환원성 SDS-PAGE를 나타낸 것이다. 3 ㎍의, 각각의 E2661-his 단백질을 10㎕의 4 x 환원성 샘플 완충제에 첨가하였다. 샘플을 70℃에서 3 분 동안 가열하고, 4-12% Bis-Tris_Nu PAGE SDS-PAGE 겔에 주입하였다. 500㎕의 NuPAGE 항산화제를 겔 탱크의 센터에 첨가한 후, 200 V에서 진행시켰다. BioRad Precision Plus Standards의 이동은 좌측에 표시된다.
도 24는 피크 1-4의 비-환원성 SDS-PAGE를 나타낸 것이다. 3 ㎍의, 각각의 E2661-his 단백질을 10㎕의 4 x 비-환원성 샘플 완충제에 첨가하였다. 샘플을 70℃에서 3 분 동안 가열하고, 4-12% Bis-Tris_Nu PAGE SDS-PAGE 겔에 주입하였다. BioRad Precision Plus Standards의 이동은 좌측에 표시된다.
도 25는 피크 1-4의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 0.5 ㎍의, E2661-his의 피크 1-4를 4X 환원성 샘플 완충제에 첨가하였다. 환원성 SDS-PAGE 분석을 도 23에서 기술한 바와 같이, 수행하였다. 그런 후, E2661-his 변이체를, 습식 이동 (wet transfer) (1 h)을 통해 PVDF 막에 이동시켰다. PBS 중의 2% 스킴 밀크로 막을 밤새 블롯킹처리하였다. 1차 항 펜타-His 항체를, 1% 스킴 밀크를 포함하는 0.05% TBS에 1:1000 희석으로 첨가하였다. 3 회 세정한 후, 양 (sheep) 항-마우스 IgG HRP (Millipore)를, 1% 스킴 밀크를 포함하는 0.05% TBS에 1:2000 희석으로 첨가하였다. 3 회 세정한 후, 제조사의 지침에 따라, ECL Plus Western Blotting Detection Reagent로 블롯을 현상하고, 520 nm에서 스캔하였다. BioRad Precision Plus Standards의 이동은 좌측에 표시된다.
도 26은 피크 1-4의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 0.5 ㎍의, E2661-his의 피크 1-4를 4X 환원성 샘플 완충제에 첨가하였다. 환원성 SDS-PAGE 분석을 도 23에서 기술한 바와 같이, 수행하였다. 그런 후, E2661-his 변이체를, 습식 이동 (1 h)을 통해 PVDF 막에 이동시켰다. PBS 중의 2% 스킴 밀크로 막을 밤새 블롯킹처리하였다. 1차 항 펜타-His 항체를, 1% 스킴 밀크를 포함하는 0.05% TBS에 1:1000 희석으로 첨가하였다. 3 회 세정한 후, 양 (sheep) 항-마우스 IgG HRP (Millipore)를, 1% 스킴 밀크를 포함하는 0.05% TBS에 1:2000 희석으로 첨가하였다. 3 회 세정한 후, 제조사의 지침에 따라, ECL Plus Western Blotting Detection Reagent로 블롯을 현상하고, 520 nm에서 스캔하였다. BioRad Precision Plus Standards의 이동은 좌측에 표시된다.
도 27은, WT E2661-his 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 동종 면역 항원에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물 2 ㎍/ml로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 28은, △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 동종 면역 항원에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물 2 ㎍/ml로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 29는, △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 비분획화된 유전자형 1a H77c WT 및 △123 E2661-his 항원에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 비분획화된 H77c WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 항원 2 ㎍/ml로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 30은, WT E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 동종 (H77c, A)과 이종 (JFH1, B) E2661 간의, CD81에 대한 결합 저해 능력을 나타낸 그래프이다. 면역 혈청의 연속 희석물을 100ng의, 비분획화된 H77c 또는 JFH1 E2661-his 단백질에 첨가한 후, MBP-LEL113 -201 코팅된 효소 면역분석법 플레이트에 첨가하였다. 결합된 E2661-his를 항-his 항체로 검출하고, 이어서, 항-래빗 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 접합된 면역글로불린과 TMB 기질로 검출하였다. E2661-his와 MBP-LEL113 -201 간의 결합을 50% 저해하는 데 필요한 항체의 희석비율을 각각의 동물에 대해 계산하였다.
도 31은, △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 동종 (H77c, A)과 이종 (JFH1, B) E2661 간의, CD81에 대한 결합 저해 능력을 나타낸 그래프이다. 면역 혈청의 연속 희석물을 100ng의, 비분획화된 H77c 또는 JFH1 E2661-his 단백질에 첨가한 후, MBP-LEL113 -201 코팅된 효소 면역분석법 플레이트에 첨가하였다. 결합된 E2661-his를 항-his 항체로 검출하고, 이어서, 항-래빗 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 접합된 면역글로불린과 TMB 기질로 검출하였다. E2661과 MBP-LEL113-201 간의 결합을 50% 저해하는 데 필요한 항체의 희석비율을 각각의 동물에 대해 계산하였다.
도 32는, △123 E2661-his 기니아 피그 혈청의 동종 HCV에 의한 간 세포 배양물의 감염 예방력을 나타낸 그래프이다. △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그에 의해 유도된 면역 혈청을, 동종 H77c E1E2 당단백질 (H77c HCVpp)을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 입자를 중화하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 DMF10에 연속 희석하고, 37℃에서 1 시간 동안 동일 부피의 H77c HCVpp와 함께 인큐베이션한 후, 하루 전에 3 x 104 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 첨가하였다. 4 시간 후, 바이러스-혈청 혼합물을 제거하고, 배지를 교체하였다. 3 일 후, 세포 용혈물의 루시퍼라아제 활성을 광도계에서 측정하였다. IC50 역가는 바이러스 감염을 50% 저해하는 데 필요한 면역 혈청의 희석 (A)으로 계산하며, 한편, IC80 역가는 바이러스 감염을 80% 저해하는 데 필요한 혈청의 희석 (B)이다.
도 33은, △123 E2661-his 기니아 피그 혈청의 이종 HCV 균주에 의한 간 세포 배양물의 감염 예방력을 나타낸 그래프이다. △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그에 의해 유도된 면역 혈청을, J6/JFH1 키메라 세포 배양물 (HCVcc) 유전자형 2a 바이러스를 중화하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 DMF10+NEAA 중에 연속 희석하고, 37℃에서 20 분 동안 동일 부피의 3.16 TCID50/ml HCVcc와 혼합하였다. 혈청/바이러스 혼합물을, 하루 전에 8x103 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 적용하고, 37℃에서 5 시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청/바이러스 혼합물을 제거하고, PBS로 4 회 세정한 다음, DMF10+NEAA를 첨가하고, 44 시간 동안 인큐베이션하였다. 조직 배양액에 존재하는 루시퍼라아제 활성을 Renilla 루시퍼라아제 기질 및 광도계로 측정하였다. IC50 역가는 바이러스 감염을 50% 저해하는 데 필요한 면역 혈청의 희석 (A)으로 계산하며, 한편, IC80 역가는 바이러스 감염을 80% 저해하는 데 필요한 혈청의 희석 (B)이다.
도 34는, 효소 면역분석법에서, 비분획화된 H77c WT 및 △123 E2661-his 항원에 대한 WT E2661-his 면역 혈청의 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 2 ㎍/mL의, 비분획화된 H77c WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 항원으로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 35는, 효소 면역분석법에서, H77c WT 피크 1-4 E2661-his 단백질 중 하나, 또는 비분획화된 E2661-his 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의, 이종 JFH1 WT 및 △123 E2661-his 항원에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 2 ㎍/mL의, 비분획화된 JFH1 WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 항원으로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 36은, 야생형 E2661-his 기니아 피그 혈청의 동종 HCV에 의한 간 세포 배양물의 감염 예방력을 나타낸 그래프이다. WT E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그에 의해 유도된 면역 혈청을, 동종 H77c E1E2 당단백질 (H77c HCVpp)을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 입자를 중화하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 DMF10에 연속 희석하고, 37℃에서 1 시간 동안 동일 부피의 H77c HCVpp와 함께 인큐베이션한 후, 하루 전에 3 x 104 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 첨가하였다. 4 시간 후, 바이러스-혈청 혼합물을 제거하고, 배지를 교체하였다. 3 일 후, 세포 용혈물의 루시퍼라아제 활성을 광도계에서 측정하였다. IC50 역가는 바이러스 감염을 50% 저해하는 데 필요한 면역 혈청의 희석 (A)으로 계산하며, 한편, IC80 역가는 바이러스 감염을 80% 저해하는 데 필요한 혈청의 희석 (B)이다.
도 37은, WT E2661-his 면역 혈청의 이종 HCV 균주에 의한 간 세포 배양물의 감염 예방력을 나타낸 그래프이다. WT E2661-his 피크 1-4 단백질 중 어느 하나, 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그에 의해 유도된 면역 혈청을, J6/JFH1 키메라 세포 배양물 (HCVcc) 유전자형 2a 바이러스를 중화하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 DMF10+NEAA 중에 연속 희석하고, 37℃에서 20 분 동안 3.16 TCID50/ml HCV cc와 혼합하였다. 혈청/바이러스 혼합물을, 하루 전에 8x103 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 적용하고, 37℃에서 5 시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청/바이러스 혼합물을 제거하고, PBS로 4 회 세정한 다음, DMF10+NEAA를 첨가하고, 40 시간 동안 인큐베이션하였다. 조직 배양액에 존재하는 루시퍼라아제 활성을 Renilla 루시퍼라아제 기질 및 광도계로 측정하였다. IC50 역가는 바이러스 감염을 50% 저해하는 데 필요한 면역 혈청의 희석 (A)으로 계산하며, 한편, IC80 역가는 바이러스 감염을 80% 저해하는 데 필요한 혈청의 희석 (B)이다.
도 38은, 효소 면역분석법에서, 이종 Con1 (유전자형 1b) 야생형 및 △123 E2661-his 항원에 대한, WT E2661-his 면역 혈청의 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 2 ㎍/mL의, 비분획화된 Con1 WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 혼합물로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 39는, 효소 면역분석법에서, 이종 Con1 (유전자형 1b) 야생형 및 △123 E2661-his 항원에 대한, △123 E2661 면역 혈청의 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 2 ㎍/mL의, 비분획화된 Con1 WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 혼합물로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
도 40은, 효소 면역분석법에서, 이종 JFH1 (유전자형 2a) WT 및 △123 E2661-his 항원에 대한, △123 E2661 면역 혈청의 반응성을 나타낸 그래프이다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 (0.5 ㎍/mL)으로 코팅한 다음, 2 ㎍/mL의, 비분획화된 JFH1 WT (A) 또는 △123 (B) E2661-his 혼합물로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
표 1은, 기니아 피그 백신 투여 군 (1 내지 7), 및 항원 유형, 항원 양, 보강제, 및 실시예 3에서 기술한 바와 동일한 것들을 제공받는 각 군의 대상체의 수를 열거한 것이다.
본 발명은, 제제의 특정 스크리닝 절차, 제제의 특정 제형, 및 여러 가지 의료적 방법으로 한정되지 않으며, 이들은 다양할 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는본 발명이 속하는 당해 기술분야의 당업자가 보편적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에서 기술된 것들과 유사하거나 동일한 임의의 물질 및 방법은 본 발명을 실행하거나 시험하는 데 사용될 수 있다. 실무자들은, 당해 기술분야의 정의와 용어, 및 당해 기술분야의 당업자에게 공지된 다른 방법에 대해, 특히, Sambrook et al ., 1989 (supra), Coligan et al ., Current Protocols In Protein Science, John Wiley & Sons, Inc., 1995-1997, 특히 Chapters 1, 5 and 6, 및 Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology , Supplement 47, John Wiley & Sons, New York, 1999; Colowick and Kaplan, eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir and Blackwell, eds., Handbook of Experimental Immunology , Vols . I- IV, Blackwell Scientific Publications, 1986; Joklik ed., Virology , 3 rd Edition, 1988; Fields and Knipe, eds, Fundamental Virology , 2 nd Edition, 1991; Fields et al ., eds, Virology , 3 rd Edition, Lippincott-Raven, Philadelphia, Pa, 1996을 참조한다.
본 발명은 C형 간염 바이러스 (HCV) 외막 2 (E2) 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 HCV E2 당단백질에는 HCV E2 단량체가 실질적으로 결여되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "E2 단량체가 실질적으로 결여된" 또는 "실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2"라는 표현은, E2 단량체를 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만 또는, 또는 1% (중량에 의해) 미만으로 포함하는 조성물을 지칭한다.
용어 "HCV E2 당단백질", "E2 당단백질", "E2 이량체", "E2 삼량체" 또는 "E2", "E2 단량체", "HCV E2" 등은 HCV의 임의의 유전자형 또는 분리물 유래의 E2 당단백질을 포함한다. 상기 용어는 추가로, 수용체 결합을 매개하거나, 또는 구조적 및/또는 다른 에피토프를 인지하는 하나 이상의 항체에 의해 중화 항체 결합을 매개하는 것, 또는 E1E2 이량체 형성을 매개하는 이들 단백질을 비롯하여, 전장 E2 당단백질의 일부를 포함하는 비-자연 발생 변이체를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 단량체 형태의 HCV E2의 비율은 15 중량%, 14 중량%, 13 중량%, 12 중량%, 11 중량%, 10 중량%, 9 중량%, 8 중량%, 7 중량%, 6 중량%, 5 중량%, 4 중량%, 3 중량%, 2 중량%, 1 중량%, 0.5 중량% 또는 0.1 중량% 미만이다.
실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 당단백질은 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조되는 당단백질일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 조성물에는 실질적으로는 단량체 HCV E2가 없으며, 단량체 HCV E2가 1% 미만 또는 0.1% 미만이다.
다른 측면에서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 조성물에는 삼량체 및 보다 고차원의 형태의 HCV E2가 농화되어 있으며, 삼량체 및 보다 고차원의 형태의 HCV E2 당단백질이 70 중량%, 71 중량%, 72 중량%, 73 중량%, 74 중량%, 75 중량%, 76 중량%, 77 중량%, 78 중량%, 79 중량%, 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량% 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, HCV E2 당단백질의 "고차원의 형태"라는 문구는, E2 단백질 서브유닛을 4개 이상 가진 E2 단백질의 형태를 지칭한다. 이러한 형태는 사량체 (4), 오량체 (5), 육량체 (6), 칠량체 (7), 팔량체 (8), 구량체 (9), 10량체 (10), 11량체 (11), 12량체 (12), 13량체 (13), 14량체 (14), 15량체 (15), 16량체 (16), 17량체 (17), 18량체 (18), 19량체 (19), 20량체 (20), 21-량체, 22-량체, 23-량체 등으로 알려져 있다.
다른 측면에서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 조성물에는 삼량체 HCV E가 농화되어 있으며, 삼량체 HCV E2 당단백질이 70 중량%, 71 중량%, 72 중량%, 73 중량%, 74 중량%, 75 중량%, 76 중량%, 77 중량%, 78 중량%, 79 중량%, 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량% 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
다른 측면에서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 조성물에는 이량체 HCV E가 농화되어 있으며, 이량체 HCV E2 당단백질이 70 중량%, 71 중량%, 72 중량%, 73 중량%, 74 중량%, 75 중량%, 76 중량%, 77 중량%, 78 중량%, 79 중량%, 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량% 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
다른 측면에서, 조성물은 실질적으로 HCV E2 삼량체를 포함한다. 다른 측면에서, 상기 조성물은 실질적으로 삼량체 및 보다 고차원의 형태의 HCV E2를 포함한다. 더욱 다른 측면에서, 상기 조성물은 실질적으로 보다 고차원의 형태의 HCV E2를 포함한다.
실질적으로 삼량체 HCV E2를 포함하는 조성물은, E2 삼량체가 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
실질적으로 삼량체 및 보다 고차원의 형태의 HCV E2를 포함하는 조성물은, E2 삼량체 및 보다 고차원의 형태가 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
실질적으로 HCV E2의 보다 고차원의 형태를 포함하는 조성물은, 보다 고차원의 형태의 E2가 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
조제물 내의 E2 단량체, 이량체 및 삼량체 및 보다 고차원의 형태의 각각의 중량% 또는 비율을 결정하는 방법은 당해 기술분야의 당업자에게 개시되어 있거나 공지되어 있다.
일 실시 양태에서, E2 당단백질은 실질적으로 HCV E2 삼량체 또는 보다 고차원의 형태이다.
삼량체 및 보다 고차원의 형태의 HCV E2를 포함하는 조성물은, E2 삼량체 및 보다 고차원의 형태가 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, E2 당단백질은 실질적으로 HCV E2 삼량체이다.
실질적으로 삼량체 HCV E2를 포함하는 조성물은, E2 삼량체가 약 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, E2 당단백질은 실질적으로 HCV E2 이량체이다.
실질적으로 이량체 HCV E2를 포함하는 조성물은, E2 이량체가 약 80 중량%, 81 중량%, 82 중량%, 83 중량%, 84 중량%, 85 중량%, 86 중량%, 87 중량%, 88 중량%, 89 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 이상인 조성물의 조제물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, E2 당단백질은 실질적으로 HCV E2 이량체 및 E2 삼량체이다. 실질적으로 이량체 및 삼량체 형태의 HCV E2를 포함하는 조성물은, E2 이량체 및 삼량체가 70 중량%, 75 중량%, 80 중량% 85 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 97 중량%, 또는 99 중량% 이상인 조제물, 및/또는 E2 단량체가 30 중량%, 29 중량%, 28 중량%, 27 중량%, 26 중량%, 25 중량%, 24 중량%, 23 중량%, 22 중량%, 21 중량%, 20 중량%, 19 중량%, 18 중량%, 17 중량%, 16 중량%, 15 중량%, 14 중량%, 13 중량%, 12 중량%, 11 중량%, 10 중량%, 9 중량%, 8 중량%, 7 중량%, 6 중량%, 5 중량%, 4 중량%, 3 중량%, 2 중량%, 1 중량% 미만 또는 1 중량% 미만인 조제물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 조성물은, HCV E2 당단백질의 혼합물로부터 단량체를 결여시키거나, 또는 이량체 및/또는 삼량체 E2 및/또는 보다 고차원의 형태를 농화함으로써, 수득될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 단량체는 결여되며, 및/또는 이량체 및/또는 삼량체 및/또는 보다 고차원의 형태는 농화된다.
다른 실시 양태에서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 조성물은 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 추가로 포함한다.
다른 실시 양태에서, 실질적으로 단량체가 결여된 조성물은 보강제를 추가로 포함한다. 면역원에 대한 대상의 반응은, 하나 이상의 보강제가 포함된 혼합물로서 투여되는 경우, 증대될 수 있다. 면역 보강제는 전형적으로, 하기 중 하나 이상의 방식으로 작용한다: (1) 면역조정 (2) 제시 증대 (enhanced presentation) (3) CTL 생성 (4) 표적화; 및/또는 (5) 데폿 생성 (depot generation). 예시적인 보강제는, 미립자 또는 비-미립자 보강제, 컴플리트 프로운트 (complete Freund's) 보강제 (CFA), 알루미늄염, 에멀젼, ISCOMS, LPS 유도체, 예컨대 MPL, 및 3D와 같은 이의 유도체, 미코박테리아 유도 단백질, 예컨대 무라밀 (muramyl) 디- 또는 트리-펩티드, 특히 퀼라야 사포나리아 (Quillaja saponaria) 유래의 사포닌, 예컨대 QS21 및 ISCOPREP™ 사포닌, ISCOMATRIX™ 보강제, 및 펩티드, 예컨대 티모신 알파 1을 포함한다. 보강제에 대한 더 상세한 설명은 Cox and Coulter, "Advances in Adjuvant Technology and Application", in Animial Parasite Control Utilizing Biotechnology, Chapter 4, Ed. Young, W.K., CRC Press 1992, and in Cox and Coulter, Vaccine 15(3): 248- 256, 1997에서 확인할 수 있다.
약학적 조성물은 통상적인 약학적 조제 기술에 따라 편리하게 제조된다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing, Company, Easton, PA, U.S.A., 1990를 참조한다. 이들 조성물은, 활성 성분들 중 한 가지 외에도, 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제, 또는 당해 기술분야의 당업자에게 잘 공지된 기타 물질들을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비-독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 간섭해서는 안 된다. 담체는 예를 들어, 정맥내, 경구 또는 비경구와 같은 투여에 바람직한 조제물의 형태에 따라, 매우 다양한 형태를 취할 수 있다.
HCV E2 당단백질의 한 가지 예시적인 형태는, 유전자형 H77 1a (E2661)의 아미노산 384-661을 포함하는 E2 당단백질의 수용체 결합 부위, 또는 다른 HCV 유전자형으로부터 유래된 상응하는 부위이다.
일부 실시 양태에서, HCV E2 당단백질은 HCV의 자연 발생 변이체와 실질적으로 유사한 아미노산 서열 또는 구조를 포함한다. 예를 들어, E2 단백질은 JFH-1, Con1, H77c 또는 ED43 분리물과 같이, 당해 기술분야에 공지된 하나 이상의 분리물의 아미노산 서열과 실질적으로 유사할 수 있거나, 또는 유전자형 1 내지 6 중 어느 하나에 의해 발현되는 E2 당단백질 중 하나 이상, 또는 이의 단편과 실질적으로 유사할 수 있다.
다른 실시 양태에서, HCV E2 당단백질은, 숙주 세포 수용체에 결합하며, 및/또는 중화 또는 구조적 에피토프에 의해 인지되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는, HCV E2 당단백질의 자연 발생 변이체이다. 변이체의 한 가지 형태는 자연 발생 균주 또는 이의 배양중 (inculture) 변이체의 절단된 (truncated) 형태 또는 이의 단편이다. 예시적인 단편은 수용체 결합 도메인을 포함한다. 다른 변형된 HCV E2 당단백질은 돌연변이체, 유사체 (analog) 또는 유도체를 포함한다.
대안적으로 또는 부가적으로, 일부 실시 양태에서, HCV E2 당단백질은 하나 이상의 가변부에 결손 돌연변이와 같은 돌연변이를 포함한다. 예시적인 돌연변이체는, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있는 국제 특허 공보 제WO 2008/022401 호에 개시되어 있다. 본원에서 나타낸 바와 같이, 3종의 가변부를 포함하거나 또는 이를 포함하지 않는 E2 당단백질은 기능성 수용체 결합 이량체 및/또는 삼량체를 형성하고, 허용 숙주 세포로의 바이러스 도입을 저해할 수 있다.
일 실시 양태에서, E2 단백질은 E2661△123 (△123, D123, △HVR1+2+3, D123 E2661-his, D123 E2661, △123 E2661 및 △123 E2661-his라고도 지칭되는 △HVR123)이다. 일부 실시 양태에서, E2661 △123 E2는, 가변부 1과 2, 및 igVR (3) 대신에 짧은 링커 모티프가 존재하는 HCV H77c의 아미노산 384-661 (△HVR123)을 포함한다. 본 발명의 다른 실시 양태는, 제거되거나 또는 짧은 링커로 대체된 HVR1, HVR2 또는 igVR의 임의의 조합을 가진 HCV E2 단백질을 포함한다. 이들은 △1; △1,2 (△12); △2; △2,3 (△23); △3; 및 △1,3 (△13)으로 축약될 수 있다.
본 발명은 추가로, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 포함하는 조성물을 유효량으로 대상 또는 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상 또는 환자에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
C형 간염 바이러스의 감염으로부터 대상을 면역화하는, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 포함하는 조성물, 특히 백신 조성물이 본 발명에 의해 고려되기도 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "백신"은, 대상에서 면역학적 반응을 유도하는 하나 이상의 면역학적 활성 성분을 포함하며, 상기 활성 성분의 면역학적 활성을 증대시키는 하나 이상의 부가적인 성분 (예를 들어, 보강제)을 포함할 수 있지만 반드시 포함하지는 않는, 약학적 조성물을 지칭한다. 백신은 부가적으로, 약학적 조성물에 전형적인 추가의 성분을 포함할 수 있다. 백신의 면역학적 활성 성분은 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 조성물을 포함한다. 용어 "백신" 및 "백신 조성물"은 본 발명에서 상호호환적으로 사용된다.
본 발명에서 고려되는 "대상"은, 인간, 또는 실험실이나 당 기술분야에서 용인되는 테스트 또는 수송 동물을 포함한 동물이다. "환자"는 치료 또는 예방이 필요한 인간 대상을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 실질적으로 이량체, 또는 실질적으로 삼량체, 또는 이량체와 삼량체의 혼합물, 또는 삼량체와 보다 고차원의 형태의 혼합물, 또는 이량체, 삼량체와 보다 고차원의 형태의 혼합물, 또는 보다 고차원의 형태의, HCV E2 를 포함하는, HCV 감염에 대해 대상을 면역화하는 조성물, 특히 백신 조성물이 고려된다.
다른 측면에서, 본 발명은, 인간 또는 인간을 제외한 동물 대상에서 항체 및/또는 세포성 면역 반응을 발생시키는데 사용하기 위한, 실질적으로 이량체 또는 삼량체 및/또는 보다 고차원의 형태의 HCV E2의 당단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
진핵 세포에 의해 발현되는 재조합 HCV E2 당단백질은 일반적으로, 단량체, 이량체, 삼량체 및 보다 고차원의 형태의 혼합물로서 존재한다.
HCV E2는 진핵 또는 원핵 세포에서 발현될 수 있다. 진핵 세포는 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 포유류, 식물, 효모 및 곤충 세포를 포함한다. 재조합 단백질은, 숙주 세포에서 단백질이 발현되게 하거나, 또는 보다 바람직하게는, 숙주 세포가 성장하는 배양 배지에 단백질이 분비되게 하기에 충분한 기간 동안, 숙주 세포를 배양함으로써 제조된다.
"재조합 숙주 세포", "숙주 세포", "세포", "세포주", "세포 배양물", 및 단세포 개체로서 배양되는 원핵세포 미생물 또는 진핵 세포주를 지칭하는 기타 이러한 용어들은 상호호환적으로 사용되며, 재조합 벡터 또는 다른 이송 DNA용 수여체로서 사용될 수 있거나 또는 사용되어 온 세포를 지칭하며, 형질감염된 본래의 세포의 자손을 포함한다.
적합한 포유류 세포주에는, BHK, VERO, HT1080, 293, 293T, 293F, RD, COS-7, CHO, Jurkat, HUT, SUPT, C8166, MOLT4/클론8, MT-2, MT-4, H9, PM1, CEM, 골수종 세포 (예를 들어, SB20 세포) 및 CEMX174가 포함되나 이로 제한되지 않으며, 이들은 예를 들어, ATCC로부터 입수가능하다. 다른 숙주 세포는, 제한 없이, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris )와 같은 효모, 또는 Sf9 세포와 같은 곤충 세포를 포함한다.
합성 DNA는, 적합한 프로모터 및 다른 적절한 전사 조절 요소를 포함하는 발현 백터로 분자 클로닝에 의해 재조합적으로 발현되며, 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 이동되어, 재조합 단백질을 생성할 수 있다. 이러한 조작 기술은 Sambrook et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2nd ed.). Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausubel et al ., Current Protocols in Molucular Biology, Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York, 1988에 나타나 있다.
예를 들어, 효모에서 발현되는 구축물은 바람직하게는, 프로모터 (예컨대 GAL10, GAL7, ADH1, TDH3 또는 PGK), 및 종결 서열 (예컨대 사카로마이세스 세레비 지애 (S. cerevisiae ) ADH1 종결자)과 같은 것에 작동가능하게 연결된, 관련 전사 및 번역 조절 서열과 함께, 합성 유전자를 포함한다. 효모는, 사카로마이세스 세레비지애 ( Saccharomyces cerevisiae ), 한세눌라 폴리모파 ( Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris ), 클루이베로마이세스 프라길리스 ( Kluyveromyces fragilis ), 클루이베로마이세스 락티스 ( Kluyveromyces lactis ), 및 스키조사카로마이세스 폼베 ( Schizosaccharomyces pombe )로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. Yeast Genetics: Rose et al ., A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1990을 또한 참조한다. 핵산 분자는, 효모 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 효모에서 발현되도록 코돈이 최적화될 수 있다 (Sharp and Cowe, Yeast , 7: 657-678, 1991 참고). 임의의 소정의 세포 유형에 적절한 벡터 및 조절 요소는, 본 상세한 설명의 교시 및 발현 벡터에 대한 당해 기술분야의 정보를 참조하여, 당해 기술분야의 당업자가 선택할 수 있다.
숙주 세포주에서 클로닝되고 발현되는 데 이용가능한 벡터는 당해 기술분야에 잘 공지되어 있으며, 포유류 세포주 또는 효모 (진균류) 세포에서 클로닝 및 발현시키기 위한 벡터, 박테리아 세포주에서 클로닝 및 발현시키기 위한 벡터, 파지 (phage)에서 클로닝 및 발현시키기 위한 벡터, 및 곤충 세포주에서 클로닝 및 발현시키기 위한 벡터를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 발현된 단백질은 표준 단백질 정제 방법으로 회수할 수 있다.
번역 조절 요소는 M. Kozak (예를 들어, Kozak, Mamm Genome , 7(8): 563-74, 1996; Kozak, Biochimie ., 76(9): 815-21, 1994; Kozak, J Cell Biol , 108(2): 229-241, 1989; Kozak and Shatkin, Methods Enzymol , 60: 360-375, 1979)에 의해 검토된 바 있다.
재조합 당단백질은 예를 들어, Sambrook, et al ., 1989 (supra), 특히 Sections 13, 16 and 17; Ausubel et al ., Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994, 특히 Chapters 10 and 16; and Coligan et al ., 1995-1997 (supra), 특히 Chapters 1, 5 and 6에서 기술된 바와 같이, 표준 프로토콜을 이용해 통상적으로 제조될 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, Chapter 9 of Atherton and Shephard, Peptide Synthesis. In Nicholson ed., Synthetic Vaccines, published by Blackwell Scientific Publications, and in Roberge et al ., Science , 269(5221): 202-204, 1995에서 기술된 바와 같이, 예를 들어, 용액 합성 또는 고체상 합성을 이용한 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스의 감염으로부터 상기 대상을 면역화하는 방법을 제공한다.
관련 실시 양태에서, 본 발명은 또한, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상에서 C형 간염의 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 포함하는 조성물을 유효량으로 대상 또는 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상 또는 환자에서 체액성 또는 세포 매개성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
이들 실시 양태들에 따르면, 조성물은 일반적으로, E2-특이적 항체의 생성을 포함하는 면역 반응을 유도하기에 충분한 조건에서 충분한 시간 동안 투여된다. 본 발명의 조성물은 단일 투여 또는 적용으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 반복 투여 또는 적용을 수반할 수 있으며, 예를 들어, 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 회 또는 그 이상 투여될 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는 백신 요법의 예는 하기와 같다: 처음 백신 후, 전형적으로 2 내지 4 주 간격, 예를 들어, 3 주 간격 후에, 대상에게 1 회의 부스팅 (boosting) 접종을 하고, 이어서, 선택적으로 부스팅 접종을 반복한다. 본 발명의 특정 실시 양태에서, 단일-투여 백신 스케쥴이 제공되는데, 이때, 조성물의 1 회 투여량은, 처음 백신 접종 이후 어떠한 부스팅 없이도, C형 간염을 예방하기에 충분하다.
일부 실시 양태에서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2에 대해 제조된 항체는, 숙주 세포 침범 또는 바이러스 출아와 같은 HCV 생활 주기에 있어 중요한 부분을 적어도 부분적으로 중화하는 것들을 포함한다.
본 발명은 추가로, HCV 감염의 치료 또는 예방에서, 또는 이를 위한 약제의 제조에 있어서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2의 용도에 관한 것이다. 인간화된 및 탈면역화된 항체가 또한, 본 발명에 포함된다. 용어 "제조"는 생성 또는 스크리닝을 포함한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은, 실질적으로 이량체 및/또는 삼량체 및/또는 보다 고차원의 형태의 HCV E2의 당단백질을 포함하는 조성물을 유효량으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상 또는 환자에서 체액성 또는 세포-매개성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
관련 실시 양태에서, 본 발명은, 실질적으로 이량체 및/또는 삼량체 및/또는 보다 고차원의 형태의 HCV E2 당단백질을 포함하는 조성물을 유효량으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상에서 C형 간염의 감염을 치료하거나, 또는 C형 간염의 감염으로부터 상기 대상을 면역화하는 방법을 제공한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명은, (i) 하나 이상의 이량체 또는 삼량체 또는 보다 고차원의 형태의 HCV E2에 결합하며, 및/또는 (ii) 단량체 HCV E2에는 결합하지 않는, 항체 또는 제제를 선별하는 단계를 포함하는, 치료 항체 또는 다른 치료 결합제를 선별하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료적 유효량" 및 "예방적 유효량"을 포함한 용어 "유효량"은, 일부 대상에서 바람직한 치료, 예방 또는 생리학적 효과를 제공하는, 단일 투여량으로의, 또는 시리즈 또는 서방성 시스템의 부분으로서의, 본 발명의 조성물의 충분한 양을 의미한다. 바람직하지 못한 효과, 예를 들어, 부작용은 때때로 바람직한 치료 효과와 함께 나타날 수 있으며; 이에, 실무자들은, 적절한 "유효량"을 결정할 경우, 잠재적인 이익과 잠재적인 위험도 간에 균형을 맞춘다. 필요한 조성물의 정확한 양은, 대사의 종 (species), 연령 및 일반적인 상태, 투여 경로 등에 따라, 대상마다 다를 것이다. 그래서, 정확한 '유효량'을 명시하는 것은 불가능할 수 있다. 그러나, 임의의 개별적인 경우에 적절한 '유효량'은 통상적인 기술 또는 실험으로, 당해 기술분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 당해 기술분야의 당업자는, 조성물 또는 다른 제제의 투여 전에, 대상의 크기, 대상의 증상의 중증도, 또는 감염된 집단에서 증상의 중증도, 바이러스 수, 및 선별된 특정 투여 조성물 또는 투여 경로와 같은 요소들을 바탕으로 필요한 양을 결정할 수 있을 것이다.
용어 "치료"는 적어도 일부 대상에서, HCV의 하나 이상의 증상, 또는 HCV의 증상이 악화될 위험 또는 HCV가 전달될 위험이, 임의의 측정가능하게 또는 통계적으로 유의하게 완화되는 것을 지칭한다.
용어 "예방" 및 "방지" 등은 상호호환적으로 사용되며, 후속적인 감염을 예방 또는 약화시키거나, 또는 감염될 위험을 감소시키거나, 또는 HCV 감염과 연관된 상태의 중증도나 발병, 또는 상태의 징후를 감소시키기 위해, HCV로 감염된 것으로 알려지지 않은 대상에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
백신 조성물의 투여는 일반적으로, 예방이 목적이다. 예방 목적의 조성물 투여는, 임의의 후속적인 감염을 방지하거나 약화시키도록 작용한다. "약리학적으로 허용가능한" 조성물은 수여체인 환자에게 관용성인 조성물이다. 유효량의 백신이 투여되는 것으로 고려된다. "유효량"은, 충분한 체액성 또는 세포성 면역을 유도하는 것과 같이, 바람직한 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 양이다. 이는, 백신 유형, 수여체의 연령, 성별, 건강상태, 및 체중에 따라 다를 수 있다. 바람직한 생물학적 효과의 예에는, 무(無)-증상 (production of no symptom), 증상의 감소, 조직이나 비내 분비물에서의 바이러스 역가의 감소, C형 간염 바이러스에 의한 감염에 대한 완벽한 보호, 및 C형 간염 바이러스에 의한 감염에 대한 부분적인 보호가 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 백신 또는 조성물은, 수여체인 환자의 생리학적인 면에서, 감염성의 C형 간염 바이러스의 하나 이상의 균주에 대한 하나 이상의 1차 또는 2차 체액성 또는 세포성 면역 반응을 증대시키거나 증대를 나타내는 것과 같은 검출가능한 변화를 가져올 경우, 생리학적으로 유의하다. 백신 조성물은 바이러스 감염으로부터 예방하도록 투여된다. "예방"은, 완벽할 필요는 없는데, 즉, 환자의 대조군 집단 또는 세트와 비교해 통계적으로 유의한 향상이 존재한다면, C형 간염의 감염이 완전히 예방 또는 근절될 필요까지는 없다. 예방은, C형 간염 바이러스 감염의 증상의 중증도, 또는 발병의 신속성을 감소시키는 데 제한될 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 백신 조성물은, (수반된 감염의 예방 또는 약화를 위해) 감염의 발병 전에, 또는 감염의 개시 후에, 대상에게 제공되어, 바이러스 감염에 대해 보호한다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 백신 조성물은, 감염의 개시 전 또는 후에 대상에게 제공되어, 대상들 간의 바이러스 전파를 감소시킨다.
본 발명의 조성물은 C형 간염의 감염, 또는 HCV 감염과 연관된 증상을 치료 또는 예방하기 위해, 단독의 활성 약학적 제제로 투여되거나, 또는 하나 이상의 제제와 병용해서 투여될 수 있는 것으로, 추가로 여겨질 것이다. 본 발명의 조성물 또는 조성물들의 병용물과 함께 투여될 다른 제제는, HCV 감염에 의해 야기되는 질환에 대한 치료법, 또는 직접 또는 간접적인 메카니즘으로 HCV 바이러스 복제를 저해하는 것을 포함한다. 이들 제제에는, 숙주 면역 조정제 (예를 들어, 인터페론-알파, 페길화된 인터페론-알파, 컨센서스 (consensus) 인터페론, 인터페론-베타, 인터페론-감마, CpG 올리고뉴클레오티드 등); 이노신 모노포스페이트 탈수소효소와 같이 숙주 세포의 기능을 저해하는 항바이러스 화합물 (예를 들어, 리바비린 등); 면역 기능을 조정하는 사이토카인 (예를 들어, 인터루킨 2, 인터루킨 6, 및 인터루킨 12); 유형 1 보조 T 세포 반응의 발달을 증대시키는 화합물; 간섭 RNA; 안티-센스 RNA; HCV 항원, 또는 HCV에 대한 항원 보강제 조합물을 포함하는 백신; 숙주 세포 성분과 상호작용하여, HCV 바이러스 복제의 내부 리보좀 유입 자리 (IRES)로써 개시되는 번역 단계를 저해함으로써 바이러스 단백질 합성을 차단하거나, 또는 예를 들어, HCV P7 등과 같은 막 단백질의 비로포린 (viroporin) 패밀리로 표적화된 제제를 이용한 바이러스 입자의 성숙 및 방출을 차단하는 제제; 및 바이러스 복제와 관련된 바이러스 게놈의 다른 단백질을 표적으로 하여 HCV의 복제를 저해하며, 및/또는 NS3/NS4A 프로테아제, NS3 헬리카아제, NS5B 중합효소, NS4A 단백질 및 NS5A 단백질의 저해제와 같이, 다른 바이러스 표적의 기능을 간섭하는, 임의의 제제 또는 제제들의 조합물이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
보다 다른 실시 양태에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물은 추가로, 헬리카아제, 중합효소, 메탈로프로테아제, NS4A 단백질, NS5A 단백질, 및 내부 리보좀 유입 자리 (IRES)를 포함하나 이로 제한되지 않는, HCV 생활 주기의 표적에 대한 다른 저해제(들)를 포함할 수 있다.
투여는, 일반적으로, E2-특이적 항체의 생성 또는 세포성 면역 반응의 발생을 포함하는 면역 반응을 유도하기에 충분한 조건에서 충분한 시간 동안 이루어진다. 면역원성 조성물은 폐, 경구, 정맥내 (수용성인 경우), 복강내, 근육내, 피하, 피내, 척추강내, 또는 좌제 경로 또는 (예를 들어, 서방성 제형을 이용하는) 이식과 같은 편리한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있지만, 전신 투여가 더 편리하다. 다른 고려되는 투여 경로는, 패치, 세포 이동, 이식, 설하, 안내, 국소 (topical), 경구, 직장내, 질내, 비내 또는 경피 경로이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "면역 반응"은, 항체를 제조하고 조성물에 대한 면역을 발달시키는 것을 비롯하여, 본 발명의 조성물의 존재에 대한 신체의 반응을 통틀어서 지칭한다. 따라서, 항원에 대한 면역 반응은 또한, 표적 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 대상에서 전개시키는 것을 포함한다. "체액성 면역 반응"은 혈장 세포에 의해 생성되는 항체에 의해 매개된다. "세포성 면역 반응"은 T 림프구 및/또는 다른 백혈구 세포에 의해 매개되는 반응이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체 역가"는, 면역 전 샘플에 비해 높은 값을 나타내는, 면역 후 혈청에서의 최대 희석으로서 정의된다.
본 발명의 실시 양태는 또한, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2로부터 분리된 성분에 대한 면역 반응을 평가하기 위한 분석법을 제공한다. 분석법은, 항체 반응 및 지연 유형의 과민 반응을 측정하기 위한 분석법과 같은 생체내 분석법을 포함할 수 있다. 일 실시 양태에서, 우선 항체 반응을 측정하기 위한 분석법은, B-세포 기능 뿐만 아니라 B-세포/T-세포 상호작용을 측정할 수 있다. 항체 반응 분석법에서, 혈액 내 항체 역가는 항원 기회 감염 (challenge) 후와 비교될 수 있다. 이들 농도들은 IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 또는 IgD와 같은 항체의 유형에 따라 정량화될 수 있다. 또한, 면역 시스템의 전개는, 항원 자극의 부재 시의, 혈액 내 항체 및 림프구의 농도를 측정함으로써 평가될 수 있다.
분석법은 또한, 시험관내 분석법을 포함할 수 있다. 시험관내 분석법은, 세포가 분열되거나, 또는 다른 세포의 분열을 돕거나, 또는 림포카인 및 다른 인자들을 방출하고, 활성화의 마커를 발현하고, 표적 세포를 용혈하는 능력을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 마우스 및 인간의 림프구가 시험관내 분석법에서 비교될 수 있다. 일 실시 양태에서, 말초혈액 세포, 비장세포, 또는 림프절 세포와 같이, 유사한 공급원으로부터 유래한 림프구가 비교된다. 그러나, 인간의 말초 혈액 세포와 마우스의 비장세포에 대한 비-제한적 예에서와 같이, 서로 다른 공급원의 림프구의 비교도 가능하다. 시험관내 분석법을 위해, 세포를 정제하거나 (예를 들어, B-세포, T-세포, 및 대식세포), 또는 본래의 상태대로 놔둘 수 있다 (예를 들어, 비장세포 또는 림프절 세포). 정제는 바람직한 결과를 낳는다면, 어떤 방법이어도 괜찮다. 세포는, 미토겐 또는 특이적 항원을 이용한 이것의 증식력에 관해, 시험관내에서 테스트될 수 있다. 특이적 항원이 존재하는 경우의 세포의 분열능은 혼합물 림프구 반응 (MLR) 분석법을 이용해 측정될 수 있다. 배양된 세포로부터의 상층액을 테스트하여, 특이적 림포카인을 분비하는 세포의 능력을 정량화할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하여, 활성화 항원을 발현하는 세포의 능력에 관해 테스트할 수 있다. 이는, 활성화 항원에 결합하는 항체 또는 리간드, 뿐만 아니라 활성화 항원을 코딩하는 RNA에 결합하는 탐침의 이용에 관한 비-제한적 예에서와 같이 적합한, 어떤 방법으로도 행해질 수 있다.
또한, 일 실시 양태에서, 표현형 세포 분석법은 소정의 세포 유형의 빈도를 측정하기 위해 수행될 수 있다. 말초 혈액 세포 계수는, 혈액 내 림프구 또는 대식세포의 수를 측정하기 위해 수행될 수 있다. 항체를 사용하여, 말초 혈액 림프구를 스크리닝하여, CD4 세포 계수 및 CD4/CD8 비를 측정하는 비-제한적 예에서와 같이 소정의 항원을 발현하는 세포의 백분율을 측정할 수 있다.
이들 실시 양태들에 따르면, 조성물은 일반적으로, E2-특이적 항체의 생성을 포함하는 면역 반응, 또는 세포성 면역 반응을 유도하기에 충분한 조건에서 충분한 시간 동안 투여된다. 본 발명의 조성물은 단일 투여 또는 적용으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 반복 투여 또는 적용을 수반할 수 있는데, 예를 들어 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 회 또는 그 이상 투여될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 조성물의 면역학적 유효량을 대상에게 주입하는 단계, 및 생성된 항체를 분리하고 정제하는 단계를 포함하는, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 조성물에 대한 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2에 대해 생성된, 정제된 항체를 제공한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은, 실질적으로 단량체가 결여된 형태의 HCV E2에 대해 생성된 항체를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 항체는, 삼량체 또는 이량체 또는 보다 고차원의 형태, 또는 삼량체 및 이량체 형태의 HCV E2 당단백질, 또는 삼량체 및 보다 고차원의 형태의 HCV E2 당단백질에 존재하는 에피토프에 특이적이며, 단량체, 이량체, 삼량체 및 HCV E2의 보다 고차원의 형태 사이를, 또는 단량체 및 이량체/삼량체 형태의 HCV E2 사이를 구별할 수 있다.
항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 아울러, 항체는, 전형적으로 관련 기술분야의 당업자에게 공지된 범주를 이용해, 진단, 예후, 치료, 예방, 및 스크리닝 목적으로 선별될 수 있다.
용어 "항체" 및 "항체들"은 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함하며, (예를 들어, 본래의 Fc 영역을 가지는) 전장 항체; 예를 들어, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 비롯한 항원-결합 단편; 및 단쇄 항체와 같이 재조합 방법을 이용해 제조된 항체-유도 폴리펩티드를 포함하나 이로 제한되지 않는, 모노클로날 항체로부터 유도된 모든 여러 형태들을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 및 "항체들"은 또한, 예를 들어, 유전자도입 동물에서 또는 파지 디스플레이를 통해 생성되는 인간 항체, 뿐만 아니라, 항체, 인간 또는 인간화된 항체, 영장류화된 항체 또는 탈면역화된 항체를 지칭한다. 상기 용어는 또한, 치료적으로 허용가능할 수 있는 다른 형태의 항체, 및 이의 항원-결합 단편, 예를 들어, 연골 해양 동물 또는 카멜리대 ( Camelidae )로부터, 또는 상기 항체를 기반으로 한 라이브러리로부터 유도된 단일 도메인 항체를 포함한다. 단편화된 또는 변형된 형태의 항체를 선별하는 것은, 상기 단편화된 또는 변형된 형태가 상기 항체 또는 상기 단편의 반감기에 미치는 영향을 고려하는 것을 수반할 수도 있다.
일부 실시 양태에서, 항체에는, 약학적으로 또는 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제가 제공된다.
다른 실시 양태에서, 항체는 진단 또는 예후를 위해 선별된다. 일부 실시 양태에서, 항-삼량체 또는 항-이량체 또는 항-고차원의 형태의 HCV E2 당단백질 항체를 포함하는 키트가 제공된다.
"약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제"는, 다르게는 바람직하지 못한 것이 아닌, 즉, 물질 자체가 또는 활성 조성물과 함께, 실질적인 부작용을 야기하지 않는 물질로 이루어진 약학적 비히클이다. 담체는 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 조정제, 흡수율 또는 청소율 증가 또는 감소제, pH 유지용 완충제, 킬레이트제, 막 또는 장벽 통과제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 표현하자면, 바람직하지 못한 것이 아닌 염이다. 상기 제제, 또는 상기 제제를 포함하는 조성물은, 산 부가염 또는 금속 복합체와 같이, 약학적으로 허용가능한 비-독성 염의 형태로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위해, 조성물은 캡슐제, 환제, 정제, 론제지, 산제, 현탁제 또는 에멀젼과 같은 고체 또는 액체 조제물로 제형될 수 있다. 경구 투여 형태의 조성물을 제조하는 경우, 경구 액체 조제물 (예를 들어, 현탁제, 엘릭셔 및 용액)의 경우, 물, 글리콜, 오일, 알코올, 풍미제, 방부제, 착색제, 현탁화제 등과 같은 통상적인 약학적 매질; 또는 경구 고체 조제물 (예를 들어, 산제, 캡슐제 및 정제)의 경우, 전분, 당, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등과 같은 담체 중 어느 것이든지 사용될 수 있다. 투여의 용이성으로 인해, 정제 및 캡슐제가 가장 유리한 경구 투여 유닛 형태를 대표하며, 이 경우, 고체 약학적 담체가 확실히 사용된다. 정제는 트라가칸쓰, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 알긴산과 같은 붕해제; 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 포함할 수 있다. 바람직하다면, 정제는 표준 기술에 의해 당-코팅 또는 장용-코팅될 수 있다. 활성 조성물은 캡슐화되어서, 위장관로를 통과하는 동안 안정할 수가 있다. 예를 들어, 국제 특허 공보 제WO 96/11698 호를 참조한다.
비경구 투여를 위해, 조성물은 담체에 용해되어, 용액 또는 현탁제으로 투여될 수 있다. 경점막 또는 경피 (패치 포함) 전달의 경우, 조성물의 전달을 위해, 당해 기술분야에 공지된 적절한 침투제가 사용된다. 흡입을 위해서는, 건조 분말 에어로졸, 액체 전달 시스템, 에어 젯 분무기, 프로펠런트 시스템과 같은 임의의 통상의 시스템을 사용해 전달한다. 예를 들어, 제형은 에어로졸 또는 미스트 형태로 투여될 수 있다. 조성물은 또한, 지속성 전달 또는 서방성 포맷으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 지속성 전달을 할 수 있는 생분해성 미세구 또는 캡슐 또는 다른 중합체 구조물이 제형에 포함될 수 있다. 재형은 약물 동력학 및 생물학적 분배 (biodistribution)를 변경하기 위해, 변형될 수 있다. 약물 동력학에 관한 일반적인 고찰은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990 (supra)을 참조한다. 일부 실시 양태에서, 제형은 리포좀 또는 미셀과 같이, 지질 단층 또는 이층에 혼입될 수 있다. 소정의 유형의 세포 또는 조직에 더욱 특이적으로 제제를 전달하기 위해, 당해 기술분야에 공지된 표적 치료법이 이용될 수 있다.
투여되는 활성제의 실제량 및 투여 속도와 시간 경로는 질환의 성질 및 중증도에 따라 다를 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투여량, 시점 등에 관한 결정은 은 일반의 또는 전문의의 책임 내에 속하고, 전형적으로, 개개의 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법, 및 의사가 알고 있는 기타 요소들을 고려한다. 기술 및 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990 (supra)에서 찾을 수 있다.
제조될 수 있는, 서방성 조제물은 특히, 면역 반응을 유도하는 데 편리하다. 서방성 조제물의 예는, 폴리펩티드를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 필름, 또는 마이크로캡슐과 같은 성형 물품의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는, 폴리에스테르, 하이드로젤 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드, L-글루타민산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100 일 이상 분자를 방출하게 할 수 있으며, 더 단기간 동안 소정의 하이드로젤 방출 단백질을 방출하게 할 수 있다. 리포좀은, 지질 함량이 약 30% 콜레스테롤이 넘는 작은 (약 200 내지 800Å) 단일층 (unilamellar) 유형으로 사용될 수 있으며, 선별된 비율은 최적의 치료법에 맞게 조정된다.
단백질의 안정화는 술피드릴 잔기를 변형하고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 적용함으로써 이루어질 수 있다. 단백질의 생체내 반감기는, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 기와 같은 다른 요소를 부착하는 것을 비롯하여 당해 기술분야에서 공지된 기술로 연장될 수 있다.
당해 기술분야에 개시된 바와 같은 프라임-부스트 면역화 (Prime-boost immunization) 전략이 고려된다. 예를 들어, 국제 특허 공보 제WO/2003/047617 호를 참조한다. 그래서, 조성물은 백신, 프라이밍 또는 부스팅 제제 형태일 수 있다.
다른 측면에서, 스크리닝 방법은, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 사용하도록 제공된다. 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2를 수반하는 스크리닝 방법은 결합 분자를 동정하는 것에 관한 것이다. 항체 또는 항원 결합 단편, 리간드, 펩티드, 유기 또는 무기 분자와 같은 결합 분자는 일반적으로 당해 기술분야에서 인정된 프로토콜을 이용해 분리되고 스크리닝된다.
본 발명은 또한, HCV 감염의 진단 또는 모니터링, 또는 항-HCV 치료 프로토콜의 모니터링에 있어서, 또는 이를 위한 진단 시약의 제조에 있어서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2의 용도를 제공한다.
본 발명은, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 당단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 대상에게 투여하는 단계, 및 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2에 결합하고 특히 수용체 결합을 차단할 수 있는 항체를 상기 대상으로부터 선별하는 단계를 포함하는, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 조성물에 대한 정제된 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 바이러스 감염성, 바이러스 출아 또는 바이러스 수를 감소시키는 능력과 같이, 바이러스 활성을 중화시키는 능력에 관해, 항체 또는 항원 결합 단편을 테스트한다.
본 발명은, 추정상 상호작용하는 화합물을, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 당단백질과 접촉시키는 단계; 및 추정상 상호작용하는 화합물과 E2 조성물 간의 상호작용, 또는 CD81과 같은 HCV 수용체 또는 HCV에 의해 결합되는 다른 숙주 모이티 (moiety)에의 결합능력이라는 결합 특징을 측정하는 단계를 포함하는, 스크리닝 방법을 고려한다.
본 발명은, 대상으로부터의 샘플을 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 당단백질과 접촉시키는 단계; 및 샘플 성분과 HCV E2 당단백질 간의 상호작용을 측정하는 단계를 포함하는, 방법을 고려한다. 일부 실시 양태에서, 서로 다른 HCV 유전자형으로부터 유래된 서로 다른 이량체 및/또는 삼량체, 또는 단량체가 결여된 E2 당단백질의 분석법을 적용할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 샘플은 혈액 샘플과 같이, 항체를 포함하는 샘플이다.
일부 실시 양태에서, 샘플은 감염된 대상의 것이다. 대조군 샘플은 비감염자의 샘플을 포함한다. 샘플은 대상의 어느 부분에서든지 가져올 수 있다. 편리한 샘플로는, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 대변 등이 있다.
적합한 분석법은 당해 기술분야의 당업자에게 공지된 것이며, ELISA, RIA 및 EIA-유사 분석법 및 경쟁적 분석법을 포함한다. 본 발명의 분석법은 특히, 혈청감시에 유용하다.
다른 측면에서, 본 발명은, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 당단백질을 포함하는 키트, 또는 고체 또는 반-고체 기질을 제공한다. 본 발명의 키트 또는 기질은, 진단, 예후, 치료 또는 예방 적용에 사용될 뿐만 아니라, HCV E2 결합 분자 또는 HCV 수용체 결합 분자의 설계 및/또는 스크리닝에 사용되는 것으로 고려된다. 상기 키트 및 상기 기질은, HCV 감염에 대한 치료 프로토콜의 효능을 모니터링하는 데에도 유용하다. 일부 실시 양태에서, 상기 키트 또는 상기 기질은, 다른 부분에, 실질적으로 단량체인 HCV E2를 더 포함한다.
실질적으로 단량체인 HCV E2를 포함하는 조성물은 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 97 중량%, 또는 99 중량%가 넘는 단량체 E2를 가진 조제물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2 당단백질을 포함하는 키트는, 바이러스 감염의 진단 또는 예후, 또는 병원균 모니터링 또는 혈청감시 키트에 편리하게 사용되며 (또는 사용되고자 하며), 선택적으로 포장재, 지침서, 및 완충제, 기질, 항체 또는 리간드, 대조군 항체 또는 리간드, 및 검출 시약과 같은 다른 여러 성분을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 항-삼량체 및 항-이량체 및 항-고차원의 형태의 HCV E2-특이적 항체가 적용된다.
용어 "분리된" 및 "정제된"은, 정상적으로는 천연 상태에서 가지고 있는 성분들이 실질적으로 또는 필수적으로 존재하지 않는 물질을 의미한다. 예를 들어, "분리된 핵산 분자"는, 자연 발생 상태에서 분자의 옆에 존재하는 서열로부터 분리된, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 단편에 정상적으로 인접해 있는 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. 특히, 분리된 HCV E2는, 이의 천연적인 세포 환경으로부터, 및 세포의 다른 성분과의 연계로부터, 단백질을 시험관내에서 분리 및/또는 정제하는 것을 포함한다. 한정을 하지 않고, 분리된 핵산, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 또는 폴리펩티드는, 정제에 의해 분리된 고유의 서열, 또는 재조합이나 합성 수단에 의해 생성된 서열을 지칭할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 정제된, 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2는 적어도 95% 내지 99% 순수하다.
변이체에 대한 지칭에는, 부분 (part), 유도체 및 화학적 유사체가 포함된다. 고려되는 화학적 유사체에는, 측쇄의 변형, 합성 동안 비천연 아미노산 및/또는 이들의 유도체의 혼입, 및 특히 구조적 구축물을 도입하기 위한 링커 또는 크로스-링커의 사용, 또는 다른 방법이 포함된다.
본 발명은 하기 비-제한적 실시예에 의해 더 설명된다. 실시예에서 사용된 물질 및 방법은 하기에 제공된다.
단백질 정제 및 크기-배제 크로마토그래피: 포유류-발현된
E2
단백질.
3 가지 서로 다른 분리물 유래의 2 가지 형태의 E2 당단백질을 제조하였으며, 야생형 E2661-his 구축물 (WT-his, WT E2661-his), 및 3종의 가변부가 소실된 변형된 버전의 E2661 (HVR123-his)을 293F 세포를 이용해 포유류 발현 시스템에서 발현시켰다. WT-his는 WO 2008/022401에 기술되어 있다. 대안적으로, E2 당단백질을 만들기 위해, 곤충 시스템 또는 효모 발현 시스템이 또한 사용될 수 있다. 다르게 나타낸 부분을 제외하고는, WT, 및 3종의 가변부가 소실된 변형된 버전의 E2661-his 에 관한 언급은, HCV의 H77c (유전자형 1a) 균주 유래의 E2 서열을 지칭한다.
Ni-MAC 완충제 A로 평형화한 Ni-Sepharose 6 Fast-Flow 수지 (GE Healthcare)를 사용해 조직-배양 상층액을 정제하고, 결합된 단백질을 제조사의 지침에 따라 Ni-MAC 완충제 B로 용리하였다. 단백질-포함 분획들을 Bradford 분석법 (BioRad)에 의해 검출하고, HiPrep 26/10 탈염 컬럼 (GE Healthcare) 및 AKTA Explorer 패스트-액체 단백질 크로마토그래피 시스템 (FPLC, GE Healthcare)을 이용해, 완충제를 인산염 완충 식염수 (1x PBS; 10mM NaPO4, 150mM NaCl, pH 7.3)로 교체하였다.
서로 다른 형태의 E2661 /5-his (JFH1 균주 - JFH1 균주에, 추가의 4개 아미노산 잔기를 부가하는 삽입이 존재하여, E2 세포외 도메인의 말단은 실제로 665 잔기에 존재함)를 분리하기 위해, 1x PBS 중에 평형화한 AKTA Explorer FPLC 시스템 및 TSKG3000swXL 컬럼 (21.5mm x 60cm, TOSOH Biosciences, 200mL 컬럼 부피 (CV))을 사용해 분취 크기-배제 크로마토그래피를 수행하였다. 최대 주입 부피는 2mL였으며, 주입 전에, 10,000 달톤 (Da) 분자량 컷-오프 (Molecular-weight cut-off; MWCO) 여과 유닛 (Amicon)을 제조사의 지침에 따라 사용해, 정제된 단백질을 대략 10mg/mL로 농축시켰다. 이 농도의 용액으로부터 단백질이 침전되므로, 완충제를 pH 7.3에서 6.8로 적정하여, 이들 단백질 (ProtParam)의 예상 등전점 (pI)을 피하였다. 2mL/분의 평균 유속으로 샘플을 흘려주고, 2mL 분획들을 60-160mL으로 회수하였다. 여러 번 진행시켜 분획들을 모아, 0.1-1 mg/mL을 수득하였다.
Waters 고성능 액체 크로마토그래피 시스템 (HPLC, Alliance) 및 더 작은 TSKG3000swxl 컬럼 (TOSOH, 7.8mm x 30cm, 15mL CV)을 사용해, 0.2mL의 최대 주입 부피에서, 분석용 크기-배제 크로마토그래피를 수행하였다. 최대 해상도를 위해, 1x PBS 내에서, 0.25mL/분의 유속으로 60 분 동안 실험을 수행하였다. 0 분에서의 대조군 샘플을 포함해, 24 시간마다 진행되도록 하면서, 실온에서 상기 방법을 이용해, 피크 단량체 및 이량체 분획물에 대해 72 시간 동안 안정성 분석을 수행하였다. 0.5mg/mL의 정제된 소 혈청 알부민 및 오브알부민 (GE Healthcare)을 크기-표준 대조군으로 사용하였다.
NanoDrop (Thermo Scientific)을 이용해 280 nm에서의 흡광도로, 단백질을 정량화하였다. ProtParam (Expasy)에서 아미노산 서열로부터 측정되는 바와 같이, 이론상 소산계수 (theoretical extinction coefficients; ε)를 이용해, 농도를 조정하였다.
WT 및 △123 E2661-his 단백질의 4개의 구별되는 분획들을 분리하기 위해, Ni 세파로스 고성능 크로마토그래피를 수행하였다. 20 mM 인산나트륨, 0.5M NaCl, 10 mM 이미다졸 (저 UV) pH 7.4를 포함하는 결합 완충제 중 5 ml HisTrap HP 컬럼 (GE Healthcare)에 단백질을 주입하였다. 20 mM 인산나트륨, 0.5M NaCl, 25 mM 이미다졸 (저 UV) pH 7.4를 사용하여 예비-용리 세정 단계를 수행하고, 20 mM 인산나트륨, 0.5M NaCl, 500 mM 이미다졸 (저 UV) pH 7.4를 사용하여 용리를 수행하였다. 크기-배제 크로마토그래피를 Superdex 200 pg 26/60 컬럼 (GE Healthcare)에서 수행하였다. 선별된 분획들을 모아, 0.22 ㎛에서 여과하였다.
각각의 단백질에 대한 비분획된 혼합물 조제물을, 크기-배제 처리를 하지 않는 점을 제외하고는, 상기와 같이 Ni 세파로스 크로마토그래피에서 동일한 방법으로 제조하였다. Ni 세파로스 샘플로부터 용리한 후, 즉시, 상기 샘플을 HiPrep 26/10 탈염 컬럼 (GE Healthcare)에서 탈염시켰다.
박테리아-발현 단백질.
잔기 113 내지 201의 CD81 거대 세포외 루프 (LEL)에 연결된, 말토오스-결합 단백질 (MBP) (MBP-LEL113 -201)로 이루어진 키메라의 발현 및 정제는 이미 기술되어 있다 (Drummer et al., Biochem Biophys Res Commun 328: 251-257, 2005; Drummer et al., J Virol 76: 11143-7, 2002). 이러한 이량체 형태의 CD81-LEL을 사용해, E2-CD81 상호작용을 광범위하게 특정화하였으며, 상기 CD81-LEL은 본래의 CD81을 잘 흉내내며, 클라우딘-1의 제1 세포외 루프 (EC1)와 상호작용할 수 있는 것으로 나타나 있다 (Harris et al ., J Biol Chem 285: 21092-102, 2010). 이 외에도, hCD81-LEL의 결정 구조에서 관찰된 상동이량체 뿐만 아니라, 세포-연관된 전장 CD81 간의 동형 (homotypic) 상호작용을 반영한다.
CD81 MBP-LEL113 -201 WT 및 F186S로 형질전환된 BL21 DE3 세포 (Invitrogen)를, 염 및 앰피실린이 보충된 테리픽 배지 (terrific broth; TB)에서 성장시켰다.
0.1mM 이소프로필 β-D-I-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 실온에서 4 시간 동안 단백질 발현을 유도하고, 세포를 회수하고, 세정하고, -80℃에 보관하였다. 가용성 단백질을 S-완충제 중에서 초음파 분해에 의해 분리하고, 20,000xg에서 정화하고, 0.45㎛ 필터를 통해 여과하였다. 단백질을, 아밀로오스 수지 (New England Biolabs)를 사용해 제조사의 지침에 따라, 친화성-정제하였다. 10mM 말토오스 중에서 용리된 단백질-양성 분획들을 Bradford 분석법 (BioRad)에 의해 측정하였다. S-완충제 내에서 평형화된 AKTA FPLC 및 Superdex 200pg 16/20 컬럼 (GE Healthcare)을 이용한 크기-배제 크로마토그래피에 의해 이량체 및 단량체 단백질을 분리하였다. HR Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 및 AKTA FPLC를 이용한 분석용 크기-배제 크로마토그래피로, 단일 이량체 피크의 분리를 확인하였다. 30,000 Da MWCO 여과 유닛 (Amicon)을 이용해 단백질을 농축시키고, 전술한 바와 같이 정량화하였다.
폴리아크릴아미드
겔 전기영동 (
PAGE
).
프리스테인드 (prestained) Precision-Plus 크기-표준 마커 (Bio-Rad)를 사용하여 프리-캐스트 (pre-cast) 4-12% Nu-PAGE (Novex)에 의해, 정제된 E2661-his 단백질을 분석하였다. 단백질을, 필요한 대로, 비-환원성 또는 환원성 조건으로 처리하고, 쿠마시 브릴리언트 블루 용액 (0.1% w/v Coomassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad), 5% v/v 빙초산, 50% v/v 메탄올)으로 염색하여 가시화하였다. 10% (v/v) 메탄올 및 10% (v/v) 아세트산으로 겔을 탈색시키고, 쿠마시로 염색된 단백질의 이동을 Odyssey LI-COR 형광 스캐너 및 정량화 소프트웨어에 의해 분석하였다.
WT 및 △123 E2661-his 단백질의 4개의 별개 분획물 및 비분획화된 혼합물을, 각각의 HCV-His 변이체 3 ㎍을 4X 환원성/비환원성 샘플 완충제 (Invitrogen) 10㎕에 첨가한 것을 사용하여, 분석하였다. 상기 샘플을 70℃에서 3 분 동안 가열하고, 4-12% Bis-Tris Nu-PAGE SDS-PAGE 겔에 주입하였다. 환원성 겔의 경우, 500㎕ NuPAGE 항산화제 (Invitrogen, NP0005)를 겔 탱크의 중심 성분에 첨가한 후, 200V를 적용하였다.
웨스턴
블롯
분석
WT 및 △123 E2661-his 단백질의 4개의 별개 분획물 및 비분획화된 혼합물을, 각각의 HCV-His 변이체 0.5 ㎍을 4X 환원성 샘플 완충제 (Invitrogen)에 첨가한 것을 사용하여, 분석하였다. 환원성 SDS-PAGE를 전술한 바와 같이 수행하였다. 그런 다음, 단백질을 습식 이동 (1h)를 통해 PVDF 막에 이동시켰다. 상기 막을 PBS 중의 2% 스킴 밀크로 밤새 블롯킹처리하였다. 0.05% TBS 1% 스킴 밀크에 1:1000 (Penta·His & E2)의 희석으로 1 차 항체를 첨가하였다. 0.05% TBS에서 10 분간 3회 세정하였다. 양 항-마우스 Ig HRP (Millipore)의 2차 항체를, 0.05% TBS 1% 스킴 밀크에 1:2000 희석으로 첨가하였다. 0.05% TBS에서 10 분간 3회 세정하였다. ECL Plus 웨스턴 블로팅 검출 시약 (GE, 제품 코드 RPN2132)을 제조사의 지침에 따라 상기 막에 적용하고, 밴드를 520 nm에서 가시화하였다.
질량분석법 분석.
매트릭스-어시스티드 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 비행시간 (time-of-flight; TOF) 질량분석법 (MS): MALDI-TOF-MS으로 질량분석법 분석을 수행하였다. 단량체 및 이량체 E2661-his 단백질 - WT 및 △HVR1+2+3 -을 ZipTip (Millipore)을 이용해 제조사의 지시사항에 따라 정제한 후, MALDI-TOF-MS 분석을 수행하였다.
바이오센서 분석 및 평가.
모든 실험을 Biacore 2000 유닛 (GE Healthcare)을 이용해 수행하였다. 단백질 리간드를 아민-결합 방법을 통해 CM5 칩 (GE Healthcare)에 고정하기 전에, 10mM 소듐 아세테이트, pH 4.2로 완충제를 교환하여, 대략 800 반응 유닛 (RU)을 수득하였다. 1xHBS-N 완충제 (0.01 Hepes, 0.15M NaCl, 3mM EDTA)에서 고정시켰다. 모든 실험에 있어서, 음성-대조군 리간드를 선행한 유세포에 고정하거나, 대안적으로는, 음성-대조군 분석물을 주입함으로써, 비-특이적 결합을 차감하였다. HBS-EP 완충제 (0.01 Hepes, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20) 내에서, 10㎕/min의 유속으로, 속도 실험을 수행하였다. 시작 농도가 0.1mg/mL인 HBS-EP에서 2-배 연속 희석을 4-5 회 하였을 때, 단백질 분석물을 시스템에 주입하였다. 250 초 동안 주입하여, 결합 속도를 수득하였으며, 600 초 동안 해리시켰다. 중간점 농도에서의 독립적인 주입 대조군을 포함하여, 농도 정확성을 보장하였다. 100㎕/분의 유속에서, 각 주기 사이 간에 재생 (regeneration)을 수행하였으며, 100mM 인산의 15㎕ 펄스를 2 회 수반하였다.
BIAevaluation 소프트웨어 (GE Healthcare)를 이용한 평형 열역학을 기반으로 한 3 가지 이론상 결합 모델에 따라, 원 (raw) 바이오센서 데이타를 글로벌 피팅처리하였다. 놀랍게도, 백그라운드를 차감한 후의 원 데이타 중 어디에서도 큰 굴절률 효과 (RI)가 관찰되지 않았으며, RI는 피팅 동안 일정한 0 값으로 고정되었다. 여러 가지 반응 도식에서, 성분 A 및 B는 각각 리간드 및 분석물을 나타낸다.
"1:1 Langmuir 결합" 모델.
A + B ↔ AB (여기서, "ka"는 정방향이고, "kd"는 역방향임).
KD = kd/ka
분석물과 리간드 간의 결합 속도 (ka=1/Ms)는, 정방향 반응을 나타내며, 분석물의 몰농도 (M)와 초 (second)로 나타낸 시간 (s)의 함수이다. 해리 속도 (kd=1/s)는 역반응을 시간의 함수로서 나타낸 것이지만, 농도에는 독립적이다. 몰 단위 (M)로 나타낸 평형 해리 상수 또는 KD는, 해리 속도 (kd)를 결합 속도 (ka)로 나누어서 계산할 수 있다.
"2-상태 결합 (구조적 변화)" 모델.
A + B ↔ AB (여기서, "ka1"은 정방향이고, "kd1"은 역방향임).
AB ↔ AB* (여기서, "ka2"는 정방향이고, "kd2"는 역방향임).
KD = (kd1/ka1) x (kd2/ka2)
이 모델은, 1차 결합 속도 (ka1=1/Ms) 및 해리 속도 (kd1=1/s)가 상기와 같이 1:1 결합 상호작용을 나타내는, 2개의 속도 방정식을 제공한다. 2차 결합 속도 (ka2=1/s) 및 해리 속도 (kd2=1/s)는 분석물과 리간드 간의 상호작용 시 발생하는 구조적 변화의 속도를 나타낸다. 이러한 상호작용은 시간 (s)의 함수로서 기술되지만, 분석물 농도에는 독립적이다. 전체 KD 값은, 1차 및 2차 방정식에서 발생한 KD 값을 곱하여서, 수득한다.
"2가 분석물 (bivalent analyte)" 모델:
A + B ↔ AB (여기서, ka1 (x2)은 정방향이고, kd1은 역방향임).
AB + B ↔ AB2 (여기서, ka2는 정방향이고, kd2 (x2)는 역방향임).
KD = n/a
이 모델은, 1차 결합 속도 (ka1=1/Ms x 2) 및 해리 속도 (kd1=1/s)가 상기와 같이 1:1 결합 상호작용을 나타내는, 2개의 속도 방정식을 제공하나, 2개의 이용가능한 리간드-결합 부위를 반영하기 위해, 결합 속도 (kd)는 2-배로 곱한다. 2차 결합 속도 (ka2=1/RUs)는 반응 유닛 (RU) 및 초로 나타낸 시간 (s)의 함수로 계산한다. 2개의 이용가능한 리간드-결합 부위를 반영하기 위해, 2차 해리 속도 (kd2=1/Ms x 2)는 2-배로 곱한다. 놀랍게도, 2가 결합 모델은, 1가- 또는 2-가 결합의 정도가 서로 다른 농도에서 서로 다르므로, 친화성 상수 또는 KD를 제공할 수 없고, 따라서, 해리 속도 (kd)는 더 이상 농도에 독립적이지 않다.
센서 칩에 의해 검출된 굴절률 변화가, 반응 유닛 (RU)에서 측정된 바와 같이 칩에 흡수된 질량 변화와 비례하므로, 각각의 리간드의, 이론상 최대 분석물 결합능 (Rmax)은 하기 방정식으로 계산하였다:
Rmax = (분석물 질량 (MW)/리간드 질량 (MW)) x RL x S,
본원에서, RL은 고정된 리간드 (CD81-LEL 이량체) (RU)의 농도이며, S는 상호작용의 화학양론비로서, 분자량, RU 및 결합비 간의 관계를 나타낸다. 이론적 Rmax는 종종, 실험적 Rmax 보다 더 높은데, 특히 아민 결합과 같은 비-특이적 고정 방법을 사용하는 경우, 고정된 리간드의 기능성/이용가능성이 보통 절충되기 때문이다. 실험적 Rmax 는 상호작용하는 시스템의 KD를 측정하는 데 바로 사용될 수 있으나, 칩을 포화시키는 데 필요한 분석물의 양이 많아서, 종종 측정하기가 어렵다. 대신, 실험적 Rmax 및 KD는 전술한 바와 같은 다중 분석물 농도에서 결합 센서그램의 글로벌 피팅에 의해 예측되며: KD 농도의 0.1-10 배가 카이네틱 분석에 최적이다.
직접 결합 효소 면역분석법.
96-웰 Maxisorb 효소 연결 면역흡착 플레이트 (Nalge Nunc)를 PBS 중에 희석시킨 0.5 ㎍/ml Galanthus nivalis 렉틴 (Sigma)으로 4℃에서 16 시간 동안 밤새 코팅하였다. 다음, 렉틴을 제거하고, 코팅되지 않은 부위를 BSA10PBS (PBS 중 10mg/mL BSA (Sigma))로 실온에서 1-2 시간 동안 블롯킹처리하였다. 그런 후, 0.05% 트윈 20을 포함하는 PBS (PBST) 중에 희석시킨 재조합 E2 단백질 2 ㎍/ml을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 상기 플레이트를 PBST 중에서 4 회 세정하였다. 다음, BSA5PBST (PBST 중 5mg/mL BSA) 중 기니아 피그 혈청의 연속 희석물을 Galanthus nivalis 렉틴-코팅된 플레이트에 결합된 E2에 적용하고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 호스래디쉬 퍼옥시다아제 접합체 래빗 항-기니아 피그 면역글로불린 (DAKO) (BSA5PBST 중 1:1000 희석)을 사용해 검출하고, 테트라-메틸벤지딘 기질 (Sigma)을 제조사의 지침에 따라 사용해 현상하였다. 결과의 흡광도 값 (광학 밀도)을 Fluostar (BMG technologies)에서 450 nm-620 nm (백그라운드)에서 판독하였다.
CD81
저해 분석법.
간략하게는, 96-well Maxisorb 효소연결 면역흡착 플레이트 (Nalge Nunc)를 PBS 중 이량체 CD81 MBP-LEL113 -201 5 ㎍/mL으로 코팅하고, 4℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. MBP-LEL113 -201 을 제거한 후, BSA10PBS (PBS 중 10mg/mL BSA (Sigma))로 37℃에서 2 시간 동안 블롯킹처리하여, 비-특이적 결합을 감소시켰다. 그런 다음, 상기 플레이트를 PBST (PBS 중 0.05% Tween-20 (Sigma))중에서 4 회 세정하였다. BSA5PBST (PBST 중 5mg/mL BSA) 중 면역 혈청의 연속 희석물을 H77c 또는 JFH1 WT E2661-his 단백질 50ng과 혼합한 후, MBP-LEL113 -201 코팅된 면역분석법 플레이트에 첨가하였다. 결합된 E2661-his를 래빗 항-his 항체 (Rockland Immunochemicals)를 사용해 검출하였다. PBST에서 더 세정한 후, MBP-LEL113 -201 에 결합된, 잔여의 E2 복합체를, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 접합체 래빗 항-기니아 피그 면역글로불린 (DAKO) (BSA5PBST 중 1:1000 희석)을 사용해 검출하고, 테트라-메틸벤지딘 기질 (Sigma)을 제조사의 지침에 따라 사용해 현상하였다. 결과의 흡광도 값 (광학 밀도)을 Fluostar (BMG technologies)에서 450 nm-620 nm (백그라운드)에서 판독하였다. 80% 저해 역가를 각각의 혈청 샘플에 대해 계산하였다.
HCVpp
중화 분석법
pNL43.LUC.R-E- + H77c pE1E2 벡터 (Drummer et al., FEBS Lett 546: 385-90, 2003) 또는 비기능성 E1E2를 코딩하는 pcDNA4HisMax 벡터 (빈 벡터)의 각각 1 ㎍을 이용해 HEK 293T 세포를 공동형질감염시켰다. 형질감염 후 72 시간째에, HCVpp를 포함하는 배양물 상층액을 회수하고, 여과하였다 (0.45 ㎛). 기니아 피그 혈청의 연속 희석물을 H77c HCVpp 바이러스와 함께 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 하루 전에 48-웰 조직 배양 플레이트 (Nunc, Nalge)에 3 x 104 세포/웰로 단층으로 접종한 Huh7.5 세포에 첨가하고, 이 실험을 4 세트로 동일하게 진행하였다. 4 시간 동안 인큐베이션 (37 ℃, 5% CO2)한 후, 세포를 PBS로 세정하고, 배지를 교체하였다. 3 일 동안 더 인큐베이션 (37 ℃, 5% CO2)한 후, 세포를 용혈시키고, 루시퍼라아제 활성을 형광 옵틱이 피팅된 Fluostar (BMG labtechnologies)에서 분석하였다.
HCV
세포 배양물-유도된 바이러스 (
HCVcc
) 도입, 도입의 저해 및 중화 분석법.
전술한 바와 같이, Gaussia 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 감염성 J6/JFH1 키메라 유전자형 2a 게놈을 코딩하는 플라스미드 DNA로부터 HCV RNA를 시험관내에서 전사시켰다. 감염성 상실에 기여하는 GND 돌연변이를 포함하는 동일한 플라스미드를 음성 대조군으로 포함하였다. DNA 플라스미드를 XbaI로 분해하여 선형으로 만들고, T7 Megascript 키트를 사용해 전사시켰다. 그런 다음, DNaseI와 함께 인큐베이션해서, DNA 주형을 제거하고, 증폭시킨 RNA를 페놀-클로로포름 방법을 이용해 침전시켰다. RNA를 정량화하고, 1% 아가로스-폴리알데하이드 겔에 의해 이미지로 만들었다. DMRIE-C (Invitrogen) 시약을 제조사의 지침에 따라 사용해 Huh7.5 세포 단층에 RNA를 형질감염시키고, HCVcc를 포함하는 상층액을 72 시간 후에 회수하였다. 상층액을 정화하고, -80℃에 보관하였다.
HCVcc 감염성 역가를 제한 희석 분석법 (TCID50)에 의해 측정하였다 (Lindenbach et al ., Science 309(5734): 623-626, 2005). 간단히 말해서, 바이러스 스탁을 연속 희석하고, 96-웰 디쉬에 3x103/웰로 평판배양한 세포에 적용하였다. 감염 후 72 시간째에, 세포를 1x PBS로 세정하고, 빙냉 (ice-cold) 메탄올에 고정한 다음, 항-FLAG 항체를 이용해 감염된 세포를 검출하였다. 결합된 항체를, PBST 중에 1:3으로 희석한, 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 공액된 폴리클로날 염소 항-마우스를 사용해 검출하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 세포를 PBS로 2 회 세정하고, PBST로 1 회 세정하였다. 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB) 기질을 첨가하여, 감염된 세포를 가시화하고, 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 PBS로 2 회 세정하고, PBS 완충제 50 ㎕를 세포에 첨가하여, 건조되지 않도록 하였다. 현미경으로 세포를 확인하고, 양성 웰을 계산하였다.
Reed-Muench의 방법을 이용해 TCID50을 계산하였다 (Reed and Muench, A simple method of estimating fifty percent endpoints, The American Journal of Hygiene 27: 493-497, 1938). Reed-Muench 방법은, 하기 방정식에 의해 50% 감염을 제공하는, 정확한 희석을 계산한다:
log TCID50 = (log 50% 초과의 희석) - (PD x log 희석 배수)
HCVcc 중화 분석법을 위해, 10% 태아 소 혈청 및 비필수 아미노산을 포함하는 DMEM (DMFNEAA) 중에 제조된 기니아 피그 혈청의 연속 희석물 100 ㎕를 HCVcc 바이러스 100 ㎕에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 하루 전에 96웰 조직 플레이트에 8x103 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 첨가하였다. 4 시간 후, 항체/바이러스 혼합물을 상기 세포로부터 제거하고, PBS 중에서 3 회 세정하고, 500 ㎕ DMFNEAA로 교체하였다. 감염 후 44 시간째에, 조직 배양 상층액의 루시퍼라아제 활성을 Renilla 루시퍼라아제 키트 (Promega), 및 광학 옵틱이 피팅된 Fluostar (BMG laboratories)로 정량화하였다.
실시예
1
E2
661
-
his
WT
및
E2
코어 도메인 당단백질의 분리 및 특정화
H77c, Con1 및 JFH-1 분리물로부터 유도된, WT 및 △HVR1+2+3의 E2661-his 단백질의 대량 조제물을, 293F 세포에서 발현시키고, 분비된 단백질을, C-말단 폴리히스티딘 태그를 통해 니켈-친화성 크로마토그래피를 이용해 정제하였다. Con1 E2 (HCV Con1 폴리단백질 잔기 384-661; GenBank Accession No. AJ 238799) 및 JFH1 E2 (HCV JFH-1 폴리단백질 잔기 384-665; GenBank Accession No. AB 047639)를 코딩하는 cDNA를 제조하였다.
WT 및 E2 코어 도메인 단백질의 단량체 종을 분리하기 위해, 분취용-규모의 고해상 크기-배제 크로마토그래피를 수행하였다 (도 1). 여러 번 진행한 후, 발현 프로파일 E2661 /5-his에 대한 50 가지의 분획들을 회수하고, 해당 분획들을 모았다. 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL의 단백질을 포함하는, E2661 /5-his 단량체, 이량체 및 보다 고차원 분자량 '숄더 (shoulder)'를 포곽하는 대략 20 가지의 중심 분획들을, 추가의 특정화를 위해 분리하였다.
도 2-4에서 나타난 바와 같이, 3 가지 분리물의 각각의 WT, △HVR1+2+3에 대한 분석용 크기-배제 크로마토그래피를 통해, 단량체 및 이량체 피크로 표시되는 피크 분획물의 분리가 확인되었으며, 뿐만 아니라, 삼량체 종을 나타내는 것으로 보이는 '숄더'에서 제 3의 독립적인 피크가 확인되었다.
E2의 가변부가 단일 (△HVR1, △HVR2, △igVR), 이중 (△HVR1+2, △HVR2+3, △HVR1+3) 또는 삼중 결실 (△HVR1+2+3)된, 니켈 친화성의, 정제된 형태의 H77c E2661-his를 분석용 겔 여과 컬럼으로 분석하고, 고유의 H77c WT (WT) E2661-his와 비교하였다. 그 결과, 모든 형태의 E2661-his는 단량체, 이량체, 삼량체 및 고분자량 형태의 E2661-his에 대한 증거를 포함하고 있음을 알 수 있다.
분석용 크기-배제 크로마토그래피를 이용한 안정성 분석에서, 실온에서 72 시간 동안 단량체 또는 이량체 종으로의 검출가능한 분해, 또는 고차 형태로의 자발적인 조합은 없는 것으로 확인된다 (데이타는 나타내지 않음). Con1 및 JFH1 E2661/5-his 단백질을 유사하게 정제하였으며, 추정상 단량체, 이량체 및 삼량체에 해당하는 분석용 겔 여과의 개개 피크가 확인되었다.
H77c, Con1 및 JFH-1WT (A) 및 △HVR1+2+3 (B) E2661-his 단백질에 대해, 도 6-8에서 나타난 바와 같이, 각각의 분획을 비-환원성 및 환원성 조건에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 고차 삼량체 및 이량체 단백질은, 이들이 오직 환원제 처리 후 단량체와 함께 이동하는 바와 같이, 대체로 이황화 결합되어 있었다. 환원성 SDS-PAGE에서, 이들 형태들이 H77c-유래 WT 분획 13-23에서, 대략 100-150 kDa, 55kDa 내지 45kDa로 이동하는 것으로 검출된 부가적인 종들과는 매우 이질적인 것으로 밝혀졌다 (도 6A 하부 패널). △HVR1+2+3 분획들에서, 100kDa, 45kDa 및 40kDa으로 이동하는 부가적인 종은, 분획 15-18에서 관찰되었다. 더 작은 단백질계 종들은, 더 고분자량의 분획물에서 E2661-his 분자 중 일부가, 절단형 E2661-his 및/또는 N-연결된 당화에 의해 다르게 변형된 E2661-his와 비이상적인 이황화 결합을 형성함을 시사하는 것일 수 있다. 네이티브 (native) 조건에서 E2661-his와 함께 공동-정제된 다른 분비 단백질과 비이상적인 이황화 결합이 형성되었을 가능성도 있다. 고분자량 종들은 산화된 채로 존재하는 이량체 E2661-his 형태를 나타내는 것이 틀림없지만, 생합성 동안 E2661-his 분자와 함께 비이상적인 이황화 결합을 형성한 그외 다른 더 큰 분비 단백질일 가능성도 있다.
유사한 이동 프로파일이, Con1 및 JFH1 H77c WT (A) 및 △HVR1+2+3 (B) E2661-his 단백질들의 개개의 분획에서 회수된 단백질들에서 관찰되었다 (도 7 및 8).
H77c WT 및 △HVR1+2+3 E2661-his 단백질에 대한 3개의 독립적인 피크들의 평균 분자량을 비-환원성 및 환원성 조건에서 정량화하였다.
실시예
2
재조합
CD81
에 대한,
E2
661
-
his
단백질의 결합
카이네틱
분석
H77c, Con1 및 JFH1 분리물로부터 유래된 WT 및 △HVR1+2+3 E2661 /5-his 단백질 모두 고순도의 안정적인 단량체 샘플을 성공적으로 분리한 후, MBP-LEL113-201에 대한 결합 카이네틱 비교 분석을 수행하였다. 이량체 MBP-LEL113-201 WT를 아민 결합을 통해 센서 칩에 고정하고, MBP-LEL113-201 F186S 돌연변이를 선행 (또는 기준) 유세포에 고정하여 비-특이적 결합을 제외할 수 있도록 하였다. 센서 칩에 의해 검출된 굴절률의 변화는 칩에 흡착된 질량의 변화에 비례하므로, 반응 유닛 (RU)의 증가/감소는 고정된 리간드와 상호작용하는 분석물의 결합/해리를 표시한다.
이를 더 분석하기 위해, 바이오센서 기술을 이용한 카이네틱 분석을, H77c, Con 및 JFH1 분리물 유래의 WT 및 △HVR1+2+3의 단량체, 이량체 및 삼량체 샘플인 여러 가지 분획들에 대해 수행하였다. MBP-LEL113-201 (F186S 대조군 포함)을 상기 칩에 고정하고, 도 9에 나타낸 바와 같은 BIAevaluation 소프트웨어에 의해 H77c에 대해 글로벌 피팅이 가능하도록, 다수의 여러 가지 농도에서 E2661-his 단백질을 주입하였다. "베스트-핏 (best-fit)" 모델은 최저 Chi2 값에 의해 결정하고, 가장 작은 나머지를 각각의 피트에서 관찰하였다.
WT 이량체의 Rmax는 예측한 것보다 낮으며, 이는, 상기 조제물의 대략 절반 정도가 비-기능성일 수 있음을 제시한다.
이량체 WT 및 HVR1+2+3 H77c E2661-his 단백질들 모두, "2가 분석물" 모델에 대해 선호도를 나타내었다. "1:1 Langmiur 결합" 모델은 또한, 각각의 단백질에 의해 구축된 바이오센서 곡선에 양호하게 피팅되었으며, KD 값을 추정하는 데 사용될 수 있었다. 도 10에서, 단량체, 이량체 및 삼량체 E2661-his 단백질에 대한 KD 값 모두를 나타내었으며, 이로써, 고차원의 분자 덩어리 형태가 MBP-LEL113-201에 결합한다는 것이 검증되었다.
단량체 단백질에 대한 2-state 결합 (구조적 변화) 및 이량체/삼량체 단백질에 대한 1:1 결합의 베스트 피트 데이타는, H77c에서, 이량체/삼량체 단백질 대부분이 2가 상호작용으로 인해 CD81에 대략 10 배 더 높은 친화성 (더 낮은 KD 값)을 가진다는 것을 입증해 주었다 (도 10). Con1 및 JFH-1은 유사한 경향을 나타낸다 (도 10). 이량체 H77c △HVR1+2+3 E2661-his 단백질은 이의 WT 카운터파트보다 CD81에 대해 보다 높은 친화성 (약 2배)을 가진다.
실시예
3
△123
E2
661
-
his
의 단량체,
이량체
및 혼합물 단백질의
기니아
피그에
백신접종
재조합 형태의 HCV 당단백질 E2 수용체 결합 도메인 (E2661)으로부터 3종의 가변부들을 모두 제거하면, 마우스에서, 교차-중화 항체의 평균 역가가 무손상 E2661-his 단백질보다 높아진다는 것이 입증되었다.
더 큰, 이계 교배한 동물 모델에서, △123 E2661-his 단백질에 대한 반응을 알아보기 위해, H77c △123 E2661-his 재조합 항원으로 면역화한 기니아 피그에서, 투여량 반응 실험을 수행하였다. 겔 여과 크로마토그래피에서 관찰된, 여러 가지 형태의 E2661-his의 기능적 유의성은, 백신접종를 위해 단량체 및 이량체 형태의 E2661-his를 분리함으로써, 조사하였다.
여러 가지 형태의 항원이 백신 제형의 면역원성에 영향을 주는지 알아보기 위해, 각각 4 마리의 기니아 피그로 이루어진 군을, ISCOMATRIX™ 보강제 중의 30 ㎍ 또는 100 ㎍ 항원으로 3 주 간격으로 3 회 백신접종하였다 (표 1). 이후, 기니아 피그에서 채혈하고, 혈청을 -80℃에 보관하였다. 니켈 아가로오스 친화성 크로마토그래피로 항원을 정제하여, 단량체, 이량체 및 고분자량 형태의 E2 (혼합물)의 혼합물을 수득하였다. TSK3000sw 컬럼에서 겔 여과에 의해 여러 가지 형태를 분리하였다. 단량체 및 이량체 형태의 분자량을 질량분석법 및 침강평형으로 확인하였다.
실시예
4
단량체 △123
E2
661
을 나타내는 동종 평균 항체
역가는
혼합물 및
이량체
형태에 비해 면역원성이 약하다.
동종 면역화 H77c △123 E2661-his 항원에 결합하는 능력에 대해, 기니아 피그 혈청을 효소 면역분석법으로 조사하였다. 그 결과, △123 E2661-his로 백신접종된 기니아 피그는 동종 면역 항원을 인식할 수 있는 항체를 생성한 것으로 나타났다. 강력한 투여 및 항원 특이 효과가 백신 군들에서 관찰되었다. 모든 경우에, 100 ㎍의 단백질이 30 ㎍보다 더 면역원성이 높았다. 아울러, 혼합물 형태의 △123 E2661-his로 백신접종된 기니아 피그의 평균 항체 역가는, 이량체 또는 단량체 항원으로 백신접종된 기니아 피그에 비해 유의하게 더 높았으며, 최저 평균 항체 역가는 단량체 군에서 관찰되었다 (도 11). 100 ㎍ 혼합물 군의 평균 항체 역가는 30 ㎍ 혼합물 군보다 대략 0.5 log 더 높았으며, 이량체 군보다 1 log 더 높았으며, 단량체 군보다 2 log 더 높았다 (도 12).
실시예 5
면역 혈청은
WT
및 △123 형태의
E2
661
-
his
혼합물에 결합한다.
WT 및 △123 E2661-his 혼합물에 대한 면역 혈청의 반응성을, 직접 결합 효소 면역분석법으로 분석하였다. 데이타에 따르면, 모든 동물들에서, WT 및 △123 항원에 대해 반응할 수 있는 유의한 평균 역가의 항체가 유도되는 것으로 보인다. 그러나, △123에 대해 반응성인 항체의 평균 역가는 WT E2661-his 단백질에 비해 5-10 배 더 높았다 (도 13). 유도된 항체의 역가는 투여량과 관련 있었으며, 100 ㎍이 더 효과적인 투여량이었다. 또한, 혼합물 및 이량체 형태의 E2661-his를 투여받는 동물이 단량체 단백질로 백신접종된 동물에 비해 더 높은 평균 역가의 항체를 유도하였으므로, 면역원의 형태가 항체의 역가에 영향을 주었다.
실시예 6
면역 혈청은
E2
가 세포 표면 수용체
CD81
에 결합하는 것을 저해한다.
HCV 당단백질 E2가 CD81에 결합하는 것을 저해하는 면역 혈청의 능력은, HCV의 표적 세포 침투력을 저해하는 면역 혈청의 능력을 나타내는 주요 지표로 여겨진다. WT E2661-his 단백질과 CD81의 재조합 형태의 거대 세포외 루프 (MBP-LEL113 -201) 간의 상호작용을 차단하는 면역 혈청의 능력을 고상 효소 면역분석법으로 시험하였다.
면역 혈청의 연속 희석물을 100ng의, H77c 또는 JFH1 WT E2661-his 단백질과 혼합한 다음, MBP-LEL113-201이 코팅된 면역분석법 플레이트에 첨가하였다. 결합된 E2661-his를 항-his 항체를 사용해 검출하였다. 80% 저해 역가를 각각의 혈청 샘플에 대해 계산하고, 도 14의 점그래프로 나타내었다. 데이타를 보면, △123 단백질의 혼합물로 백신접종된 동물에서 최고의 평균 역가가 유도되었으며; E2-CD81 저해 항체는 동종 H77c 및 이종 JFH1 E2661 둘 모두가 CD81에 결합하는 것을 저해할 수 있는 것으로 나타났다. E2-CD81 저해 항체의 더 낮은 평균 역가는, 이량체 형태의 E2661-his 단백질로 백신접종된 동물에서 유도되었으며, 각 군에서 한 마리 이상의 동물에서 80% 저해를 달성할 수 있는 항체의 유도에 실패하였다. 단량체 E2661-his로 백신접종된 동물은 E2-CD81 저해 항체를 최저 평균 역가로 유도하였다. 이로써, 이량체 형태의 WT 및 △123 E2661-his 모두 E2-CD81 저해 항체의 유도에 있어 단량체 E2661-his 보다 더 우수한 것으로 입증된다. 그러나, E2661-his 단백질 혼합물에 존재하는 E2661-his의 형태는 이량체 E2661-his 단독에 비해 더 우수하다.
실시예 7
H77c
HCVpp
의 동종 중화
동종 중화를 매개하는 면역 혈청의 능력은, H77c E1E2 당단백질을 포함하는 레트로바이러스 슈도타입 입자를 사용해 측정하였다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청의 연속 희석물을 HCVpp와 혼합하고, Huh7.5 세포에 4 시간 동안 첨가하였다. 세정 후, 세포를 3 일 더 인큐베이션하고, 루시퍼라아제 활성을 세포 용혈물에서 정량하였다. 그 결과, HCVpp의 중화를 매개하는 능력 역시 투여량 및 항원에 의존적이었다 (도 15). 100 ㎍의 혼합물 항원을 투여받은 기니아 피그에서는 NAb 평균 역가가 100 ㎍ 단량체, 30 ㎍ 이량체 또는 100 ㎍ 이량체에서의 관찰 결과에 비해 대략 10 배 더 높게 나타났다 (도 16). 30 ㎍ 단량체를 투여받은 기니아 피그는 제한된 HCVpp 중화능력을 나타내었으며, 곡선이 대조군인 무-항원 군과 유사하였다 (도 15).
실시예 8
면역 혈청은 세포 배양물 유래의
J6
-
JFH1
의 교차 중화를 매개한다.
면역 혈청의 연속 희석물을 J6-JFH1 세포 배양물 유래의 HCV와 혼합하고, Huh7.5 세포에 첨가하였다. 상층액의 루시퍼라아제 활성을 감염시킨 지 44 시간 후에 측정하고, 그 결과를 도 17에 나타낸다. 100 ㎍ 혼합물 항원을 투여받은 기니아 피그에서는, 1/40 혈청 희석물에서, 도입을 90% 저해하는 강력한 교차 중화 매개력이 확인되었다 (도 17). 100 ㎍ 혼합물 군에서 관찰된 평균 50% 중화 역가는 30 ㎍ 및 100 ㎍ 단량체 군보다 약 2 log 더 높고, 이량체 군 및 30 ㎍ 혼합물 군보다 1 log 더 높았다 (도 18 참고).
실시예 9
단백질을 4 개의 개별
분획물로
분리
WT E2661-his 및 △123 E2661-his 단백질의 H77c 서열을 293F 세포에서 발현시켰다. 분비된 발현 단백질을 포함하는 조직 배양물 상층액을 HisTrap 컬럼에서의 니켈-친화성으로 정제한 후, superdex 200 pg 26/60 컬럼에서 겔 여과를 하였다. WT E2661-his (도 19) 및 △123 E2661-his (도 20)에서 4개의 개별 올리고머 피크 (피크 1, 2, 3, 4)들이 관찰되었고, 각각의 피크 분획들을 회수하고, 모았다. 또한, WT E2661-his 및 △123 E2661-his 단백질의 "비분획화된" 조제물을 HisTrap 컬럼에서 부분적으로 정제하였으나, 겔 여과 처리는 하지 않았다.
피크 1-4의 각각에 상응하는, 모은 분획들을 WT E2661-his (도 21) 및 △123 E2661-his (도 22)에 대한 분석용 겔 여과 컬럼으로 시험하였다. 피크 1-4에 대한 개별 진행 결과를 하나의 도면에 중첩하여, 이들의 상대적인 용리 시간을 나타내었다. 분자량 표준물의 용리 시간은 크로마토그램 상부에 나타내었다.
겔 여과 정제된 형태의 WT E2661-his 및 △123 E2661-his 단백질을 환원성 (도 23) 및 비-환원성 조건에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다 (도 24). 환원성 조건에서, 피크 4의 WT E2661-his 및 △123 E2661-his는 각각 대략 55-65 kDa 및 50-60 kDa의 넓은 띠 (broad band)로서 이동하였다 (도 23). 비-환원성 조건에서, 피크 4의 WT E2661-his 및 △123 E2661-his 대부분은, 각각 WT E2661-his 및 △123 E2661-his의 1 유닛을 포함하는 단량체 형태의 단백질과 일치하는, 대략 55-65 kDa 및 50-60 kDa의 넓은 띠로서 이동하였다 (도 24). 소량의 ~100kDa 단백질이 이량체 단백질 (2 유닛)로 예상되는 분자량과 일치하여 존재하였다. 관찰된 넓은 띠는 각각 WT E2661-his 및 △123 E2661-his에 대한 11 및 9 위치에서의 이종 N-연결 당화와 일치한다. 단량체 형태의 E2661-his에는 다른 (비-E2661-his) 오염 단백질이 거의 없으며, 순도가 >95%로 추정되었다.
환원성 조건에서, WT E2661-his 및 △123 E2661-his 피크 3은 각각 ~55-65 KDa 및 50-60 KDa으로 이동하였다. 환원성 SDS-PAGE에서 피크 3 단백질의 평균 이동은 다소 빨랐으며, 이는 이들 단백질이 피크 4에서 관찰된 해당하는 단량체 형태보다 분자량이 더 작음을 시사한다. 이는 단백질의 당화 수준이 더 낮다는 것을 나타내는 표시일 수 있다 (도 23). 보다 고분자량의 형태의 WT E2661-his 및 △123 E2661-his 단백질도 나타났으며, 대략 100 kDa으로 이동하고, 이량체 E2661-his의 분자량에 해당하였다. 비-환원성 조건에서, 피크 3 단백질의 대부분은 이량체 형태의 E2661-his (2 유닛)와 일치하는 ~100 kDa의 예상 분자량으로 이동하였으며, 단량체 E2661-his 단백질도 소량 존재하였다 (도 24).
환원성 조건에서, WT E2661-his 및 △123 E2661-his 피크 2는 각각 ~55-65 KDa 및 50-60 KDa으로 이동하였다. 환원성 SDS-PAGE에서 피크 2 단백질의 평균 이동은 다소 빨랐으며, 이는 이들 단백질이 피크 4에서 관찰된 해당하는 단량체 형태보다 분자량이 더 작음을 시사한다. 이는 피크 2 단백질에서, 단백질의 당화 수준이 더 낮다는 것을 나타내는 표시일 수 있다 (도 23). 비-환원성 조건에서, WT E2661-his 및 △123 E2661-his 피크 2 단백질의 대부분은 E2661-his의 3개 이상의 유닛과 일치하는, 각각 ~170 kDa 및 160 kDa으로 이동하였다. 소량의 오염성인, 100kDa의 이량체 E2661-his 단백질이 WT E2661-his 및 △123 E2661-his 둘 다에 존재하였다 (도 24).
환원성 SDS-PAGE에서 WT E2661-his 및 △123 E2661-his 피크 1의 이동은, 20 kDa 내지 250 kDa 범위의 단백질 종의 이종적인 범위를 나타내었다 (도 23). 비-환원성 조건에서, 피크 1 단백질의 대부분은 스태킹 겔 (stacking gel)과 리졸빙 겔 (resolving gel) 사이 계면에 머물러 있었으며, 이는 비환원 형태의 상기 종의 분자량이 >300 kDa이며, 4 유닛 이상의 E2661-his를 포함함을 시사한다 (도 24). 그러나, 상당한 양의 오염성 단백질이 20-250 kDa 범위에서 스미어 (smear)로서 관찰되었다.
어떤 단백질 종이 각각의 피크 1-4에서 E2661-his 단백질에 상응하는지를 분석하기 위해, 각각의 단백질 0.5 ㎍을 4-12% nu-PAGE 겔에 주입하고, 환원성 조건에서 전개시킨 후, PVDF 막으로 이동시켰다. E2의 잔기 411-428에 존재하는 에피토프 (도 26)에 대한 특이 항체 또는 C-말단 6xHis 에피토프 태그 (도 25)에 특이적인 펜타-His 항체로 블롯을 탐침하였다. 그 결과, 펜타-His 항체는 대략 50-60 kDa으로 이동하는 각 분획 1-4의 E2661-his 단백질 종을 검출하였다. 피크 1 쪽에는 낮은 반응성이 나타났다. 피크 2 및 3의 이량체 형태도 표시되었다 (도 25).
항-E2 항체는 피크 1-4의 각각에서 E2661-his 단백질을 검출하였다 (도 26). 피크 4의 단백질 대부분은 50-60 kDa이었으며, ~100 kDa의 종도 소량 검출되었다. 피크 3은 E2661-his 단백질의 50-60 kDa 종과 100 kDa 형태를 포함하고 있었다. 피크 2는 50-60 kDa 종과, 100-200 kDa 범위의 넓은 단백질 스미어를 포함하고 있었다. 피크 1은 E2661-his의 50-60 kDa 종 뿐만 아니라 100 내지 >200 kDa 범위의 고분자량 형태를 포함하고 있었다.
실시예 10
WT
E2661
-
his
및 △123
E2661
-
his
단백질을 이용한
기니아
피그
백신접종
비분획화된, 또는 피크 1, 2, 3 또는 4 단백질의 △123 E2661-his 100 ㎍을 75 ISCO™ 유닛 (IU) ISCOMATRIX™ 보강제와 함께 기니아 피그에, 3 주 간격으로 3 회 백신접종하였다. 마지막 백신접종 후 2 주째에, 마지막으로 채혈하였다. 대안적으로는, 비분획화된, 또는 피크 1, 2, 3 또는 4 WT E2661-his 단백질 혼합물 100 ㎍을 75 IU ISCOMATRIX™ 보강제와 함께 기니아 피그에, 2 주 간격으로 3 회 투여하고, 마지막 면역처리 후 1주째에 마지막으로 채혈하였다.
실시예
11
WT
E2
661
-
his
및 △123
E2
661
-
his
단백질의 동종
분획물에
대한,
기니아
피그의
항체 반응
WT E2661-his 피크 1-4 중 어느 하나, 및 비분획화된 물질로 백신접종된 동물에서 유도된 면역 혈청을, 고체-상 효소 면역 분석법으로, 동종 항원에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 및 동종 면역 항원으로 코팅한 후, 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리하고, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
그 결과 (도 27), 피크 1 및 피크 2 단백질로 백신접종된 동물은 동종 항원에 반응성인 항체를 최고 평균 역가로 유도하였다. 피크 3 및 4 단백질로 백신접종된 동물은 항체를 최저 평균 역가로 유도하였으며, 비분획화된 면역 군에서 유도된 항체의 평균 역가보다 더 낮았다.
△123 E2661-his 단백질 피크 1-4 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청을, 고상 효소 면역분석법에서, 동종 면역 항원에 대한 반응성에 대해 비교하였다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 및 동종 면역 항원으로 코팅한 후, 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리하고, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
그 결과 (도 28), 피크 1 및 피크 2 △123 E2661-his 단백질을 투여한 기니아 피그에서 최고 역가의 항체가 유도되었다. 피크 1과 피크 2 면역원 군 간의 평균 항체 역가가 유사하였다. 최저 평균 역가의 항체는, 피크 4 단백질에 의해 유도되었으며, 이것의 평균 항체 역가는 피크 1 또는 2를 사용해 수득된 것보다 적어도 20배 더 낮으며, 피크 3 보다 10배 더 낮으며, 비분획화된 혼합물보다 8 배 더 낮았다. 비분획화된 혼합물을 사용해 수득된 평균 항체 역가는 피크 3을 면역원으로 사용하여 수득된 것과 유사하였다. 이 결과를 보면, 비분획화된 혼합물에 존재하는 면역원성 대부분이, 삼량체 및/또는 보다 고차원의 형태의 △123 E2661-his로 이루어진 피크 1 및 피크 2에 존재하는 E2661-his 단백질의 형태로 인한 것일 수 있다.
실시예 12
비분획화된
WT
및 △123
E2
661
-
his
단백질에 대한 항체 반응성
△123 E2661-his 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그의 면역 혈청을, 고체상 면역분석법에서, 동종 H77c로부터 유도된 WT 및 △123 E2661-his의 비분획화된 조제물에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 면역분석법에서, WT 비분획화된 단백질을 항원으로 사용하면, 표준화된 항원에 대해 유도된 항체의 총 농도를 비교할 수 있다. 효소 면역분석법에서, △123 형태의 E2661-his를 코팅 항원으로 사용하면, E2의 가장 보존된 영역에 대한 전체 면역 반응을 알아볼 수 있다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴으로 코팅한 후, WT 또는 △123 E2661-his 단백질로 코팅하였다. 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
그 결과 (도 29), 피크 1 및 2 단백질로 백신접종된 동물은, 동종 WT (A) 및 △123 E2661-his (B) 단백질에 대해 반응성 항체를 최고 평균 역가로 유도하였다. 피크 3 단백질 또는 비분획화된 면역 혈청으로 백신접종된 동물은, 비분획화된 WT (A) 또는 △123 E2661-his (B)에 대해 반응성 항체를 유사한 평균 항체 역가로 유도하였다. 피크 4 단백질로 백신철된 동물은 최저 평균 역가의 항체를 유도하였다. △123 E2661-his로 백신접종된 동물로부터 수득된 면역 혈청은, 비분획화된 WT 및 △123 E2661-his 단백질에 대한 반응성을 유사하게 나타내었다. 각 면역 군의 면역 혈청이 동종 면역 항원 (도 28) 및 E2661-his 단백질의 비분획화된 혼합물 (도 29)에 유사하게 결합하는 능력은, 항체가 E2661-his 단백질에 특이적임을 확인시켜 준다.
실시예
13
E2
와 재조합 형태의 1차
HCV
세포 수용체
CD81
간의 상호작용을 저해하는, 백신접종된
기니아
피그의
혈청의 능력
WT E2661-his 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그의 면역 혈청을, 동종 H77c E2661-his와, 재조합 형태의, HCV CD81의 1차 세포 수용체 간의 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 이 분석법에서, E2661 항원에 존재하는 에피토프에 결합하여, 재조합 CD81과의 상호작용을 방지할 수 있는, 면역 혈청에 존재하는 항체의 양을 측정한다. 동종 E2661-his 단백질을 이용하여, 유도된 전체 E2-CD81 차단 항체를 확인하고, E2661-his 항원의 이종 서열을 사용하여, 비(非)-유사 E2 항원에 대한 항체 반응의 교차 반응성의 정도, 및 E2와 CD81 간의 상호작용을 방지하는 항체의 교차-반응성을 확인한다. 면역 혈청의 연속 희석물을, 비분획화된 H77c E2661-his에 첨가한 후, MBP-LEL113 -201이 코팅된 효소 면역분석법 플레이트에 첨가하였다. 결합된 E2661-his를 항-his 항체, 항-래빗 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 면역글로불린, 및 TMB 기질을 이용해 검출하였다.
그 결과 (도 30A), WT E2661-his 피크 2 단백질로 백신접종된 동물은 최고 평균 역가를 가진 동종 E2-CD81 저해 항체 (평균 역가 344)를 유도하였다. 피크 1 및 비분획화된 단백질로 백신접종된 동물은 최저 평균 역가의 E2-CD81 저해 항체 (평균 역가가 각각 18 및 18)를 유도하였다. 분획화된 피크 2-4 단백질로 면역화하면, 비분획화된 WT E2661-his 항원보다 더 높은 평균 역가의 E2-CD81 저해 항체가 유도되었다.
다음, 이종 형태의 비분획화된 WT E2661-his가 CD81에 결합하는 것을 저해하는, WT E2661-his 항체의 능력 (도 30B)을 시험하였다. JFH1 E2 단백질은 전체 E2 영역에 대해 H77c와 아미노산이 31%가 상이하다. 이종 E2 단백질과 CD81의 상호작용을 방지하는 면역 혈청의 능력은, 다양한 E2 서열에 대한 항체 반응의 폭 (breadth)의 측정값으로서 나타날 수 있다. 피크 2 WT E2661-his의 면역 혈청은 최고 평균 역가의 이종 E2-CD81 저해 항체 (평균 77)를 가지고 있었다. 피크 3 단백질로 백신접종된 3 마리의 동물 또한, 이종 E2-CD81 저해 항체를 유도하였다. 피크 1 단백질 및 비분획화된 물질을 투여받은 동물은, 이종 E2의 CD81과의 결합을 차단할 수 있는 항체를 유도하지 못하였다.
△123 E2661-his 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 △123 E2661-his 단백질로 백신접종된 기니아 피그의 면역 혈청을, 동종 H77c E2661-his와, 재조합 형태의, HCV CD81에 대한 1차 세포 수용체 간의 결합을 차단할 수 있는 능력에 대해 시험하였다. 면역 혈청의 연속 희석물을 비분획화된 H77c E2661-his에 첨가한 후, MBP-LEL113-201이 코팅된 효소 면역분석법 플레이트에 첨가하였다. 결합된 E2661-his를, 항-his 항체, 항-래빗 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 면역글로불린, 및 TMB 기질을 이용해 검출하였다.
그 결과 (도 31A), △123 E2661-his 피크 2 단백질로 백신접종된 동물에서, 동종 E2-CD81 저해 항체가 최고 평균 역가로 유도되었다. 피크 1, 3 또는 4로 백신접종된 동물에서 유도된 50% E2-CD81 저해 역가는 비분획물의 면역 군보다 2 내지 3배 더 높았다.
다음, 이종 형태의 비분획화된 E2661-his가 CD81에 결합하는 것을 저해하는, △123 E2661-his 항체의 능력 (도 31B)을 시험하였다. △123 E2661-his 피크 2 단백질로 백신접종된 동물은 이종 E2661-his의 CD81과의 결합을 저해할 수 있는 항체를 최고 평균 역가로 유도하였으며, 평균 역가는 256이었다. 피크 4 (단량체 E2) 단백질을 제공받은 동물은 이종 E2-CD81 저해 항체를 최저 평균 역가 (평균 역가 26)로 유도하였다. 피크 1, 3 또는 비분획화된 혼합물을 수여받은 동물은, 이종 E2661-his가 CD81에 결합하는 것을 저해할 수 있는 평균 역가가 중간 수준인 항체를 가지고 있었다 (각각 55, 77 및 45).
실시예 14
△123
E2
661
-
his
단백질로
백신접종된
기니아
피그에서
동종 중화 항체 반응
△123 E2661-his 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그의 면역 혈청을, 동종 H77c E1E2 당단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 입자 (H77c HCVpp)를 중화하는 능력에 대해 시험하였다. 이 실험은, 면역 항원의 서열과 동일한 (동종) HCV 당단백질을 이용한 시험관내 비리온 조제물에서, 바이러스 감염을 방지할 수 있는 면역군 각각의 동물로부터 유도된 항체의 총 양을 측정한다. 상기 항체는, 시험관내에서 바이러스가 간 세포에 들어가지 못하도록 할 수 있기 때문에, 기능성인 것으로 생각된다. 중화 항체의 특이성은, E2가 CD81에 결합하는 것을 저해할 수 있는 항체로만 한정되지 않는다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 DMF10에서 연속 희석하고, 동일 부피의 H77c HCVpp와 함께 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 하루 전에 3 x 104 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 첨가하였다. 3 일 후, 세포 용혈물의 루시퍼라아제 활성을 광도계에서 측정하였다.
그 결과 (도 32), 피크 1 또는 피크 2 단백질로 백신접종된 기니아 피그는 동종 바이러스 도입을 50% 차단 (중화)할 수 있는 최고 평균 역가 (IC50)의 항체를 유도하였다 (도 32 상부). 평균 IC50 역가는 피크 1 (평균 2363) 및 피크 2 면역 혈청 군 (평균 2288)에서 유사하였다. 피크 3 또는 4 단백질로 백신접종된 기니아 피그는 최저 50% 동종 중화 항체 반응 (각각 평균 727 및 705)을 유도하였으며, 비분획화된 면역 군 (평균 역가 918)과 유사하였다.
동종 바이러스 도입을 80% 차단하는 항체의 능력을 측정하면, 피크 1 또는 피크 2 단백질로 백신접종된 동물에서 모든 다른 군보다 더 높은 평균 역가가 나타났으며 (도 32B), 평균 IC80 평균 역가는 280 및 170인 것으로 나타났다. 비분획화된 혼합물에 의해 유도된 IC80 평균 역가 (평균 109)는 피크 3 (평균 65) 및 피크 4 (평균 54) 항원에 의해 유도된 것보다 더 높았다.
실시예
15
△123
E2
661
-
his
단백질로
백신접종된
기니아
피그에서
이종 (교차-) 중화 항체 반응
△123 E2661-his 단백질로 백신접종된 기니아 피그의 면역 혈청을, 이종 J6/JFH1 키메라 유전자형 2a 세포 배양물 (HCVcc)로부터 유도된 바이러스를 교차-중화하는 능력에 대해 시험하였다. 이 실험은, 면역 항원의 서열에 비해, 매우 다른 (이종) HCV 당단백질을 코딩하는 HCV 균주를 이용하여, 시험관내에서 바이러스 감염을 방지할 수 있는 면역 군 각각의 동물로부터 유도된 항체의 총 양을 측정한다. 상기 항체는, 시험관내에서 유전적으로 다른 바이러스가 간 세포에 들어가지 못하도록 할 수 있기 때문에, 기능성이며 교차 중화성인 것으로 생각된다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 연속 희석하고, 동일 부피의 HCVcc와 혼합하였다. 혈청/바이러스 혼합물을 Huh 7.5 세포에 적용하고, 37℃에서 인큐베이션한 후, 제거하고, 조직 배양 배지에서 44 시간 동안 인큐베이션하였다. 조직 배양액에 존재하는 루시퍼라아제 활성을, Renilla 루시퍼라아제 기질 및 광도계를 사용해 측정하였다.
그 결과, 비분획화된 △123 E2661-his 단백질로 백신접종된 동물은, 바이러스의 감염성 바이러스 투여량의 50%를 중화할 수 있는 항체 (IC50)를 360의 평균 및 100 내지 900의 범위로 유도하였다 (도 33A). ISCOMATRIX™ 보강제만 백신접종한 2 마리의 동물은 평균 50% 중화 평균 역가가 40 및 60이었으며, 다른 3 마리의 동물은 감염성 바이러스를 50% 이상 중화하지 못하였다.
피크 1 △123 E2661-his 단백질로 백신접종된 동물은, 최고 평균 역가의 교차 중화 항체를 유도하였으며, 평균 IC50은 1700이었다 (도 33A). 피크 2 △123 E2661-his 및 비분획화된 면역 군으로 백신접종된 동물은 각각 평균이 340 및 362로, 교차 중화 항체를 유사한 평균 역가로 유도하였다. 피크 3 또는 4 단백질로 백신접종된 동물은, 유의한 평균 역가의 교차-중화 항체를 유도하는 데 실패하였다.
피크 1 단백질로 백신접종한 동물들 모두, 평균 역가가 320이고 범위가 100-700이었으며, 바이러스의 감염량을 80% 중화할 수 있었다. 피크 2 단백질로 백신접종된 동물의 평균 IC80 평균 역가 (평균 38)는 비분획화된 혼합물 (평균 46)과 유사하였다 (도 33B). 피크 3 또는 4 면역 군의 동물들 중 어느 것도 이종 바이러스의 감염량을 80% 중화하지 못하였다.
실시예
16
H77c
WT
및 △123 항원에 대한,
WT
E2
661
-
his
면역 혈청의 반응성
비분획화된 H77c WT E2661-his 항원 및 △123 E2661-his 항원에 결합하는, H77c WT E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의 능력을 효소 면역분석법에서 비교하였다. 면역분석법에서, WT 비분획화된 단백질을 항원으로 사용하면, 표준화된 항원에 대해 유도된 항체의 총 농도를 비교할 수 있다. 효소 면역분석법에서, △123 형태의 E2661을 코팅 항원으로 사용하면, E2의 가장 보존된 영역에 대한 전체 면역 반응을 알아볼 수 있다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 및 비분획화된 H77c 항원으로 코팅한 후, 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리하고, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
그 결과, 피크 1 및 2 WT H77c E2661-his 단백질로 백신접종된 동물은, 비분획화된 H77c E2661-his 항원에 대해 반응성인 항체를 최고 평균 역가로 유도하였으며, 비분획화된 WT E2661-his로 면역처리된 동물보다 유의하게 더 높았다 (도 34A). 피크 4 단백질로 백신접종된 동물은, 비분획화된 WT H77c E2661-his에 대해 반응성인 항체를 최저 평균 역가로 유도하였다. 피크 3 단백질 및 비분획화된 면역 군으로 백신접종된 동물은 유사한 평균 역가의 항체를 유도하였으나, 상기 평균 항체 역가는 피크 1 및 2 면역 혈청의 것보다 더 낮지만, 피크 4 면역 군보다는 더 높았다. 각 면역 군의 면역 혈청이 동종 면역 항원 (도 27) 및 E2661-his 단백질의 비분획화된 혼합물 (도 34)에 유사하게 결합하는 능력은, 항체가 E2661-his 단백질에 특이적임을 확인시켜 준다.
비분획화된 H77c △123 항원에 결합하는, WT E2661-his로 백신접종된 동물의 면역 혈청의 능력과 비교하여, 3종의 가변부가 모두 소실된 E2의 코어 도메인에 반응성인 항체가 전반적으로 더 낮은 것으로 나타났다. 피크 2 면역 혈청은, E2의 코어 도메인에 반응성인 항체를 최고 평균 역가로 생성하였다. 모든 다른 군들은, E2의 코어 도메인에 반응성인 항체를 유사한 평균 역가로 유도하였다 (도 34B).
실시예 17
JFH1
WT
및 △123 항원에 대한,
WT
E2
661
-
his
면역 혈청의 교차 반응성
JFH1 WT E2661-his 항원 및 △123 E2661-his 항원의 비분획화된 혼합물과 교차 반응하는, H77c WT E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의 능력을, 효소 면역분석법에서 비교하였다. 면역분석법에서, 다른 균주의 HCV로부터 유도된 WT 비분획화된 단백질을 항원으로 사용하면, 표준화된 항원에 대해 유도된 교차-반응성 항체의 총 농도를 비교할 수 있다. 효소 면역분석법에서, △123 형태의 이종 E2661-his를 코팅 항원으로 사용하면, 다른 균주의 E2의 가장 보존된 영역에 대한 총 교차-반응성 면역 반응을 알아볼 수 있다. 유전자형 2a JFH1 E2 서열은 유전자형 1a H77c E2 서열과 가장 상이한 서열 중 하나이며; H77c E2 및 JFH1 E2는 무손상 형태의 E2661과 31% 상이하며, 3종의 가변부가 소실된 E2의 코어 도메인과 20% 상이하다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 및 비분획화된 항원으로 코팅한 후, 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리하고, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
그 결과, 피크 2 WT H77c E2661-his 단백질로 백신접종된 동물의 평균 항체 역가는, 다른 면역군의 평균 역가에 비해, 비분획화된 WT JFH1 E2661-his 항원에 대해 4배 더 높았다 (도 35A). 피크 4 단량체 단백질로 백신접종된 동물은, 교차 반응성 항체를 최저 평균 역가로 유도하였으며, 비분획화된 면역 군보다 5 배 더 낮았다. 피크 1 및 3 단백질로 백신접종된 동물은, 서로에 대해 그리고 비분획화된 면역 군에 대해 교차-반응성인 항체를 유사한 평균 역가로 유도하였다.
JFH1 E2 코어 도메인 (△123)에 대한, 면역 혈청의 교차 반응력 조사를 통해, 피크 2 면역 혈청이 피크 1, 3 및 4 면역 군에 비해 평균 역가가 4배 더 높은 항체를 유도하였다 (도 35B). 단량체 피크 4 단백질의 경우, 모든 다른 면역 군과 비교해, JFH1의 △123 코어 도메인에 대해 3배 이상 낮은 최저 평균 역가의 항체를 유도하였다 (도 35B).
실시예
18
WT
면역 혈청 군에 의한 동종 바이러스의 중화
WT E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그에 의해 유도된 면역 혈청에서, 동종 H77c E1E2 당단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 입자 (H77c HCVpp)에 대한 중화력을 시험하였다. 이 실험은, 면역 항원의 서열과 동일한 (동종) HCV 당단백질을 발현하는 비리온 조제물에서, 시험관내에서 바이러스 감염을 방지할 수 있는 면역 군 각각의 동물로부터 유도된 항체의 총 양을 측정한다. 상기 항체는, 시험관내에서, 바이러스가 간 세포에 들어가지 못하도록 할 수 있기 때문에, 기능성인 것으로 생각된다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 DMF10 중에서 연속 희석하고, 동일 부피의 H77c HCVpp와 함께 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 하루 전에 3x104 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 첨가하였다. 3 일 후, 세포 용혈물의 루시퍼라아제 활성을, 광도계에서 측정하였다.
그 결과, 피크 1, 2, 3 및 비분획화된 혼합물로 백신접종된 동물의 면역 혈청은, 바이러스의 감염성 바이러스 투여량의 50%를 중화할 수 있는 항체의 평균 역가 (IC50)가 무(無)-항원 면역 군보다 높았다 (도 36A). 단량체 피크 4 단백질을 제공받은 동물들은 무-항원 면역 군과 유사한 평균 중화 항체 역가를 나타내었다. 피크 1 및 2 면역 군 (각각 평균 2150 및 1600)에서, 동종 바이러스의 50% 중화를 매개할 수 있는 유사한 평균 역가의 항체가 유도되었으며, 이는 피크 3 (평균 1175) 및 비분획화된 면역 군 (평균 1013) 보다 높았다.
피크 2 및 비분획화된 면역 군의 각각에서, 3 마리의 동물은 중화 항체의 평균 역가를 유의하게 낮게 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 비정상적인 수치 (outlier)이다. 이들 혈청은 비정상적인 특징을 나타내었으며, 반복 분석법을 통해, 중화 항체의 더 높은 평균 역가가 존재함을 알 수 있었다. 분석에서 비정상적인 수치를 제외하면, 피크 2는 2460의, 평균 50% 중화 평균 역가를 유도하였으며, 한편, 비분획화된 면역 군의 평균 IC50 역가는 1500이었다.
피크 1, 2, 3 및 비분획화된 면역 군의 동물들만, 동종 바이러스의 감염량의 80%를 저해할 수 있는 항체를 유도하였다 (도 36B). 피크 1 면역 혈청은 평균 역가가 225로, 모든 다른 면역 군과 비교해, 평균 80% 중화 역가를 더 높게 유도하였다. 비정상적인 수치를 포함하는, 피크 2 면역 군의 평균 IC80 역가는 116으로, 이들 비정상적인 수치를 제외하면, 평균 역가가 174로 증가하였다. 비분획화된 및 피크 3 면역 군은 86이라는, 유사한 IC80 평균 역가를 유도하였다. 비분획화된 면역 군으로부터 3개의 비정상적인 수치를 제외하면, 평균 IC80 역가가 126으로 증가하였다. 데이타를 보면, 피크 1, 2 및 3은, WT E2를 면역원으로 사용하여 중화 항체를 유도하는 데 있어서 바람직한 면역원이다.
실시예
19
유전자형 2a 세포 배양물로부터 유도된
HCV
의 교차 중화
이종 J6/JFH1 키메라 유전자형 2a 세포 배양물 (cc)로부터 유도된 HCV를 중화하는, WT E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그에 의해 유도된 면역 혈청의 중화력을 조사하였다. 이 실험은, 면역 항원의 서열과 비교해, 매우 다른 균주 (이종) HCV 당단백질을 코딩하는 HCV 균주를 사용해, 시험관내에서 바이러스 감염을 방지할 수 있는 면역 군 각각의 동물로부터 유도된 항체의 총 양을 측정한다. 상기 항체는, 시험관내에서, 유전적으로 다른 바이러스가 간 세포에 들어가지 못하도록 할 수 있기 때문에, 기능성이며 교차 중화성인 것으로 생각된다. 가열에 의해 불활화된 면역 혈청을 DMF10+NEAA에서 연속 희석하고, 동일 부피의 3.16 TCID50/ml HCVcc와 37℃에서 20 분 동안 혼합하였다. 혈청/바이러스 혼합물을, 하루 전에 8 x 103 세포/웰로 접종한 Huh 7.5 세포에 적용하고, 37℃에서 5 시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청/바이러스 혼합물을 제거하고, PBS로 4 회 세정한 다음, DMF10+NEAA를 첨가하고, 44 시간 동안 인큐베이션하였다. 조직 배양액에 존재하는 루시퍼라아제 활성을, Renilla 루시퍼라아제 기질 및 광도계를 사용해 측정하였다.
피크 1 및 2 WT 단백질로 백신접종된 동물은, 평균 역가가 각각 155 및 368로, 다른 면역 군과 비교해, 교차-중화 항체의 IC50 평균 역가를 더 높게 유도하였다 (도 37A). 이종 균주의 HCV의 50% 중화를 매개할 수 있는 항체의 최저 평균 역가는 피크 3 및 4 (각각 평균 34 및 39)에 의해 유도되었으며, 비분획화된 단백질은 48이라는, 평균 IC50 역가를 유도하였다 (도 37A).
피크 1, 2 및 비분획화된 단백질로 백신접종된 동물들 중 소수만이, 감염량의 80%를 중화할 수 있는 항체를 유도하였다 (도 37B). 피크 1의 면역 군에서 5 마리, 피크 2에서 2 마리, 및 비분획화된 군에서 3 마리는, IC80 평균 역가를 가졌으며 (도 37B), 평균 역가는 유사하였다 (각각 38, 27 및 30). 피크 1, 2 및 비분획화된 면역 군에서 반응하는 동물의 평균 역가는 각각 48, 50 및 47이었다. 이들 결과는, 피크 1 및 2가, WT E2661을 면역원으로 사용하여, 교차-중화 항체를 유도하는 데 있어서, 바람직한 면역원임을 보여준다.
실시예
20
Con1
WT
및 △123
E2
661
항원에 대한 야생형 면역 혈청의 교차-반응성
유전자형 1b Con1 WT E2661-his 항원 및 △123 E2661-his 항원의 비분획화된 혼합물과 교차-반응하는, H77c WT E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의 능력을, 효소 면역분석법으로 비교하였다. 면역분석법에서, 다른 균주의 HCV로부터 유도된 WT 비분획화된 단백질을 항원으로 사용하면, 표준화된 항원에 대해 유도된 교차-반응성 항체의 총 농도를 비교할 수 있다. 효소 면역분석법에서, △123 형태의 이종 E2661을 코팅 항원으로 사용하면, 다른 균주의 E2의 가장 보존된 영역에 대한 총 교차-반응성 면역 반응을 알아볼 수 있다. 유전자형 1b Con1 E2 서열은 JFH1과 비교해 유전자형 1a H77c E2 서열과의 상이성이 낮으며; H77c E2 및 Con1 E2는 무손상 형태의 E2661과 20% 상이하며, 3종의 가변부가 소실된 E2의 코어 도메인과 15% 상이하다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 및 비분획화된 항원으로 코팅한 후, 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리하고, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
그 결과, 피크 2 단백질을 제공받은 동물에서 교차-반응성 항체의 최고 평균 역가가 유도되었으며, 상기 역가는 다른 면역 군보다 적어도 2배 더 높았다 (도 38A). 교차-반응성 항체의 최저 평균 역가는 피크 4 단백질에 의해 유도되었으며, 피크 2 및 3보다 8 배 더 낮고, 비분획화된 면역 군보다 3배 더 낮았다.
Con1 E2 코어 도메인 (△123)에 대한 면역 혈청의 교차 반응력 조사를 통해, 피크 2 면역 혈청이 피크 1, 3 및 4 면역 군에 비해 평균 역가가 높은 항체를 유도하였다 (도 38B). 피크 2에 의해 유도된 평균 역가 (233750)는 피크 4 면역 군의 것 (9000)보다 26 배 더 높았다. 단량체 피크 4 단백질의 경우, 모든 다른 면역 군과 비교해, Con1의 △123 코어 도메인에 대해 최저 평균 역가의 교차 반응성 항체를 유도하였다 (도 38B).
실시예
21
Con1
야생형 및 △123
E2
661
-
his
항원에 대한, △123
E2
661
-
his
면역 혈청의 교차-반응성
유전자형 1b Con1 WT E2661-his 항원 및 △123 E2661-his 항원의 비분획화된 혼합물과 교차-반응하는, H77c △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나 또는 비분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의 능력을, 효소 면역분석법으로 비교하였다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 및 비분획화된 항원으로 코팅한 후, 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리한 후, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
그 결과, 피크 1 (평균 220000) 및 피크 2 (평균 300000) 단백질로 백신접종한 동물에서, WT Con1 E2661-his 항원과 교차-반응성인, 최고 평균 역가의 항체가 유도되었으며, 다른 면역 군의 평균 역가보다 적어도 2배 더 높았다 (도 39A). 교차-반응성 항체의 최저 평균 역가는, 다른 군들과 비교해 피크 4 단백질에 의해 유도되었다 (평균 20000).
Con1 E2 코어 도메인 (△123)에 대한, 면역 혈청의 교차 반응력 조사를 통해, 피크 1 및 피크 2 면역 혈청이, 다른 면역 군에 비해 Con1 E2661-his의 코어 도메인에 교차 반응성인 항체의 평균 역가를 각각 217500 및 2887500으로 더 높게 가졌다 (도 39B). 코어 도메인에 대한 교차-반응성 항체의 최저 평균 역가는 다른 군들과 비교해 피크 4 단백질에 의해 유도되었다 (평균 39600).
실시예
22
JFH1
WT
및 △123
E2
661
-
his
항원에 대한, △123
E2
661
-
his
면역 혈청의 교차-반응성
JFH1 WT E2661-his 항원 및 △123 E2661-his 항원의 비분획화된 혼합물과 교차-반응하는, H77c △123 E2661-his 단백질 피크 1-4 중 어느 하나 또는 분획화된 혼합물로 백신접종된 기니아 피그로부터 수득된 면역 혈청의 능력을, 효소 면역분석법에서 비교하였다. H77c E2 및 JFH1 E2는 무손상 형태의 E2661과 31% 상이하며, 3종의 가변부가 소실된 E2의 코어 도메인과 20% 상이하다. 마이크로타이터 플레이트를 GNA 렉틴 및 비분획화된 항원으로 코팅한 후, 코팅되지 않은 부위는 BSA로 블롯킹처리하고, 면역 혈청의 연속 희석물을 첨가하였다. 결합된 면역글로불린을 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항-기니아 피그 면역글로불린으로 검출하고, TMB 기질로 가시화하였다.
그 결과, △123 E2661-his 피크 1 및 2 항원은 WT JFH1 E2 서열에 대해 반응성인, 유의하게 더 높은 평균 역가의 항체를 유도하였으며, 비분획화된 △123 E2661-his에 의해 유도된 평균 역가보다 대략 2배 더 높았다 (도 40A). 피크 1 및 2 △123 E2661-his에 의해 유도된 평균 항체 역가는 각각 50625 및 53500이었다. 피크 3 (평균 23188)은 비분획화된 △123 E2661-his와 비교해, 유사한 평균 역가의 교차-반응성 항체를 유도하였다. 피크 4는, 평균 역가가 평균 4225로 낮은 교차-반응성 항체를 유도하였으며, 이 값은 비분획화된 면역 군보다 5 배 더 낮고, 피크 1 및 2보다 10 배 더 낮았다.
E2의 이종 코어 도메인에 존재하는 보존된 에피토프를 인지하는, △123 E2661-his 항체의 능력을 알아보면, 피크 1 및 2 면역 군이 항체의 최고 평균 역가를 가졌다 (각각 평균 36625 및 41250) (도 40B). 피크 3 (평균 13363) 및 4 (평균 8088) 면역 군은, 비분획화된 면역 군 (평균 22500)보다 평균 역가가 더 낮은 교차 반응성 항체를 가지며, 피크 1 및 2 면역 군보다 대략 3-4배 더 낮다.
당해 기술분야의 당업자는, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위에서, 여러 가지 변형을 알 수 있을 것이다.
| 기니아 피그 백신 군 | ||||
| 군 | 항원 | 양 (㎍) | 보강제 | 피그 수 |
| 1 | 단량체 | 30 | ISCOMATRIX | 4 |
| 2 | 단량체 | 100 | ISCOMATRIX | 4 |
| 3 | 이량체 | 30 | ISCOMATRIX | 4 |
| 4 | 이량체 | 100 | ISCOMATRIX | 4 |
| 5 | 혼합물 | 30 | ISCOMATRIX | 4 |
| 6 | 혼합물 | 100 | ISCOMATRIX | 4 |
| 7 | 무(無)-항원 | - | ISCOMATRIX | 4 |
Claims (19)
- 실질적으로 단량체가 결여된 C형 간염 바이러스 (HCV) 외막 2 (E2) 당단백질을 포함하는 조성물.
- 제1 항에 있어서,
상기 HCV E2 당단백질의 이량체, 삼량체, 또는 보다 고차원의 형태 (higher order form)를 70 중량% 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물. - 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
상기 HCV E2 당단백질의 삼량체 형태, 또는 삼량체와 보다 고차원의 형태를 80 중량% 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물. - 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
상기 HCV E2 당단백질의 이량체를 80 중량% 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물. - 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
상기 HCV E2 당단백질의 보다 고차원의 형태를 80 중량% 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물. - 삼량체 HCV E2 당단백질이 80 중량%이상인, C형 간염 바이러스 (HCV) 외막 2 (E2) 당단백질을 포함하는 조성물.
- 보다 고차원의 형태의 HCV E2 당단백질이 80 중량% 이상인, C형 간염 바이러스 (HCV) 외막 2 (E2) 당단백질을 포함하는 조성물.
- 삼량체 및 보다 고차원의 형태의 HCV E2 당단백질이 80 중량% 이상인, C형 간염 바이러스 (HCV) 외막 2 (E2) 당단백질을 포함하는 조성물.
- 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서,
약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물. - 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서,
보강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물. - 제10 항에 있어서,
상기 보강제가 ISCOMATRIX™인 것을 특징으로 하는, 조성물. - HCV 감염의 치료 또는 예방에 있어서, 또는 상기의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
- HCV 감염의 진단 또는 모니터링, 또는 항-HCV 치료 프로토콜의 모니터링에 있어서, 또는 이를 위한 진단 시약의 제조에 있어서, 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
- 제13 항에 있어서,
상기 진단 시약이 항체, 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도. - 면역 반응을 유도하기에 충분한 조건에서 충분한 시간 동안, 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 유효량으로 대상 또는 환자에 투여하는 단계를 포함하는,
상기 대상 또는 환자에서 면역 반응을 유도하는 방법. - 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는,
상기 대상을 HCV 감염으로부터 면역화하는 방법. - HCV를 치료 또는 예방하기에 충분한 조건에서 충분한 시간 동안, 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는,
상기 대상에서 HCV 감염을 치료 또는 예방하는 방법. - 실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2의 유효량을 대상에게 투여하는 단계, 및
제조되는 항체를 정제하는 단계를 포함하는,
실질적으로 단량체가 결여된 HCV E2에 대한 정제된 항체를 제조하는 방법. - 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 키트, 또는 고체 또는 반-고체 기질.
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