CZ20004802A3 - Částice obsahující obalové proteiny HCV a jejich použití pro očkování - Google Patents

Abstract

Obalové proteiny HCV indukují prospěšnou odpověď u šimpanzů chronicky infikovaných HCV. Imunizace může být výhodně prováděna s použitím obalových proteinů HCV ve formě částic, které jsou tvořeny s pomocí detergentu. Když jsou obalové proteiny jako takové prezentovány chronickým nosičům HCV, jsou vysoce imunogenní a stimulují jak buněčnou tak humorální imunitní odpověď.

Description

Oblast techniky následek odpovědi. Kromě toho

Předkládaný vynález se týká zjištění, že obalové proteiny HCV indukují prospěšnou imunitní odpověď u šimpanzů, kteří jsou chronicky infikovaní heterologním subtypem la nebo subtypem 1b kmene HCV. Konkrétněji se předkládaný vynález týká zjištění, že obalové proteiny jsou vysoce imunogenní a mají za stimulaci jak buněčné tak humorální imunitní se předkládaný vynález týká zjištění, že alkylací má za následek ještě více blokování imunogenní cysteinu proteiny.

Navíc obalové proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být inkorporovány do částic, které projevují vysokou imunogeničnost a imunoreaktivitu. Bylo dále prokázáno, že tyto částice mohou inkorporovat další proteiny.

Dosavadní stav techniky

Infekce virem hepatitidy C (HCV) je závažný zdravotní problém jak v rozvinutých, tak v rozvojových zemích. Odhaduje se, že přibližně 1 až 5 % světové populace je postiženo virem. Vychází najevo, že infekce HCV je nejdůležitější příčina hepatitidy spojené s transfúzí a často progreduje do chronického poškození jater. Kromě toho existují důkazy pro to, že následkem HCV je indukce hepatocelulárního karcinomu. V důsledku toho je vysoká poptávka po spolehlivých diagnostických metodách a účinných terapeutických přípravcích. Jsou také zapotřebí senzitivní a specifické metody screeningu krevních produktů kontaminovaných HCV a zlepšené metody pro pěstování HCV.

·· ···· ·· ···· ·« • · · 4 4 4 · ·· 4 ·· · 4 9 9

HCV je RNA virus s pozitivním vláknem o velikosti přibližně 9 600 baží, které kóduje alespoň tři strukturální a šest nestrukturálních proteinů. Na základě sekvenční homologie byly strukturální proteiny funkčně určeny jako jeden jádrový protein a., dva obalové proteiny: El a E2. Protein El se skládá ze 192 aminokyselin a obsahuje 5 až 6 N-glykosylačních míst, v závislosti na HCV genotypu. Protein E2 se skládá z 363 až 370 aminokyselin a obsahuje 9 až 11 N-glykosylačních míst, v závislosti na HCV genotypu (viz přehledy Major a Feinstone, 1997, Maertens a Stuyver, 1997). Protein El obsahuje různé variabilní domény (Maertens a Stuyver, 1997), zatímco protein E2 obsahuje tři hypervariabilní domény, z nichž hlavní doména je lokalizována na N-koncové části proteinu (Maertens a Stuyver, 1997). Druhý obalový protein byl produkován rekombinantními technikami v Escherichia coli, hmyzích buňkách, kvasinkách a savčích buňkách. Použití expresních systémů ve vyšších eukaryotech a zejména v savčích buněčných kulturách vede k obalovým proteinům, které jsou ve vzorcích od pacientů úspěšně rozpoznávány protilátkami (Maertens et al., 1994).

Předpokládá se, že obalový protein El potřebuje obalový protein E2 k tomu, aby dosáhl správného uspořádání molekuly (Deleersnyder et al., 1997). Kromě toho se předpokládá, že El a E2 tvoří heterodimery, které mohou tvořit základní jednotku virového obalu (Yi et al·., 1997). Ve WO 98/21338 autorů Liang et al. byly tyto předpoklady použity pro konstrukci HCV částic, které obsahují El a E2, a také jádrový protein a P7. Jinými slovy, ve stavu techniky se nepředpokládá použití El nebo E2 nezávisle pro imunizaci a další účely. Ale Houghton (1997) publikoval, že opakované imunizace s rekombinantním gpElE2 (4 x 25 pg) tří šimpanzů s chronickou infekcí HCV nevyvolaly významnou imunitní odpověď. Původci předkládaného vynálezu usuzovali, že indukce proti-obalové imunitní odpovědi • · · · • 9 • · · ·

I » · 9 9 9 9 9 t 9 9 9 9 9 9 » · · 9 li * · · φ t 9 9 9 9 9 9 «

9 9 9 9 9 4 u pacientů s chronickou hepatitidou C by byla pro pacienta opravdu žádoucí a prospěšná, protože se zdá, že vyšší hladiny těchto protilátek korelují s dobrou reakcí na léčbu interferonem, a tudíž mohou pomoci pacientovi odstranit virus (PCT/EP 95/03031, Maertens et al·.). Protože protilátkové hladiny proti El u chronických nosičů HCV patří mezi nejnižší ze všech HCV protilátek, uvažovali původci předkládaného vynálezu dále o tom, že může být prospěšné zvýšit hladiny těchto protilátek a eventuálně buněčnou reakci pro vyvolání kontroly infekce nebo dokonce odstranění infekce hostitelem. Zdá se, že také vyšší hladiny buněčné imunity proti El korelují s dobrou odpovědí na terapii interferonem (LerouxRoels et al., 1996).

Kromě důležitosti anti-El imunity ve vztahu k léčbě interferonem, další údaje poukazují na to, že některé další části HCV genomu mohou být důležité pro indukci specifické imunitní odpovědi, která může umožnit kontrolu infekce. Také reaktivita T buněk proti C-koncové oblasti jádrového proteinu byla pozorována častěji u pacientů odpovídajících na léčbu interferonem (Leroux-Roels et al., 1996). U pacientů odstraňujících HCV po transplantaci jater byly prokázány silně neutralizující protilátky proti proteinu NS4B (Villa et al., 1998). Také mezi NS3 bylo mapováno několik T buněčných epitopů, které se zdají korelovat s odstraňováním HCV během akutní fáze (viz: PCT/EP 94/03555, autoři Leroux-Roels et al., Leroux-Roels et al., 1996, Rehermann et al., 1996 a 1997, Diepolder et al., 1995 a 1997). Kromě toho protilátky k NS5A, podobně jako protilátky El, vykazují vyšší hladiny ve výchozím stavu před terapií interferonem alfa u dlouhodobě reagujících osob (LTR) ve srovnání s osobami, které na léčbu nereagují.

Do současnosti nebyla úspěšná terapeutická vak.cinace proti HCV. Ukázalo se, že také profylaktické vakcinace je účinná pouze proti homoiognímu kmeni HCV (Choo et al., 1994).

• · · · • · · ·

Předkládaný vynález se týká překvapivého zjištění, že podávání HCV obalového antigenu může dramaticky zlepšit stav chronické aktivní hepatitidy u jedince infikovaného heterologním kmenem nebo izolátem, jak u infekce heterologním subtypem la nebo heterologním subtypem 1b. Opravdu, u šimpanzů s chronickou infekcí, kterým bylo podáváno šest dávek 50 pg Els í tj. aminokyseliny - aa 192 až 326 z El), byly překvapivě prokázány mohutné humorální a buněčné imunitní reakce, které se neobjevily po celé období chronické infekce před touto vakcinací. Kromě toho, během dvou až pěti měsíců se virový antigen stal v játrech nezjistitelný a nedal se detekovat alespoň 5 měsíců po vakcinaci. Ačkoliv titry HCV RNA v séru neklesly, hladiny jaterních enzymů v séru vykazovaly jasnou tendenci k normalizaci. A nejdůležitější bylo, že u obou typů vakcinace se dramaticky zlepšila jaterní histologie. Předkládaný vynález se dále týká překvapujícího zjištění, že protein El použitý k vakcinaci, který byl exprimován jako jednoduchý HCV protein bez své hydrofobní kotvy, tvoří stabilní částice. Je nutné také poznamenat, že pro zabránění indukce imunitní odpovědi proti nerelevantním epitopům, byl protein El používaný pro vakcinací konstruován jako kanonická sekvence jednotlivých klonů pocházejících z jednoho sérového vzorku jednoho chronického nosiče. Kromě toho, předkládaný vynález se týká zjištění, že indukce těchto anti-El reakcí může být zesílena použitím antigenů odlišného genotypu, než jsou genotypy infekce vyskytující se u hostitele. Navíc se předkládaný vynález týká zjištění, že když jsou cysteiny HCV obalových proteinů alkylovány, například pomocí sloučenin jako N-(jodethyl)-trifluoracetamid, ethylenimin nebo aktivní halogeny, jako například jodacetamid, projevují oligomerní částice, jak jsou popsány výše, ještě vyšší imunogeničnost, Konečně se předkládaný vynález týká také zjištění, že mutace cysteinů HCV obalových proteinů na jinou další přirozeně se ·· ···· ·· ···· · · ·· · · * · · » · • · · 9 « fl ·« • * 9 · · · · · · · • » * ·· · · 9 9 99 9 vyskytující aminokyselinu, přednostně methionin, kyselinu glutamovou, glutamin nebo lysin, má v oligomerních částicích, jak jsou popsány výše, za následek také vyšší ímunogeničnost ve srovnání s původními obalovými proteiny.

Cíle vynálezu

Z literatury je jasné, že . je urgentní potřeba vývoje spolehlivých vakcín a účinných terapeutických přípravků pro infekci HCV. Předkládaný vynález se tudíž týká poskytnutí antigenního přípravku, který je schopný indukovat specifickou humorální a buněčnou imunitu k HCV obalovým proteinům, dokonce (ale ne jenom) u chronických nosičů HCV. Tytéž antigeny mohou být použity pro diagnostiku imunitní reakce.

Konkrétněji se předkládaný vynález týká poskytnutí antigenního přípravku, jak je definován výše, který se skládá ze stabilních částic jednoduchých obalových proteinů HCV. Je jasné, že v současnosti nejsou v oboru známy takové částice nebo způsob přípravy těchto částic. Kromě toho v oboru není žádný údaj, že by nějaký antigenní přípravek, obsahující tyto stabilní částice nebo tyto purifikované jednoduché obalové proteiny HCV, mohl být úspěšně použit jako (heterologní) profylaktická nebo terapeutická vakcína proti HCV. Předkládaný vynález se tedy také týká poskytnutí způsobu produkce stabilních částic, které mohou být úspěšně použity jako profylaktický nebo terapeutický přípravek proti HCV, navíc k poskytnutí DNA vakcín kódujících HCV antigeny. Konkrétněji se předkládaný vynález týká poskytnutí způsobu produkce těchto částic na základě tvorby částic pomocí detergentů (viz dále). Kromě toho se předkládaný vynález týká poskytnutí způsobů přípravy částic skládajících se z antígenů získaných z odlišných HCV genotypů.

Kromě toho se předkládaný vynález týká poskytnutí antigenu, který je kanonická sekvence z jednotlivých klonů, ·· ···· ·· ···· ·· · β · · · · · « · * · • · · · · β · · * • · · Ο · « · · · « 9 • ♦ * <··«· · · « • · · · · «Λ « · · » » která může umožnit správnější uspořádání molekul proteinů. To je proto, aby se zabránilo stimulaci imunity proti nerelevantním epitopům.

Navíc se předkládaný vynález týká poskytnutí antigenního přípravku., zejména pro terapeutickou vakcinaci, který je založen na genotypu HCV, kterým je infikován chronický nosič. V tomto zřeteli se předkládaný vynález týká poskytnutí obalového proteinu buď odlišného nebo homologního genotypu nebo subtypu ve srovnání s genotypem nebo subtypem chronického nosiče.

Další cíl vynálezu je poskytnutí způsobu léčení nebo terapeutické vakcinace chronicky infikovaných pacientů používající výše uvedené antigeny nebo DNA vakcíny eventuálně v kombinaci s dalšími sloučeninami. Předkládaný vynález se také týká poskytnutí způsobu profylaktické vakcinace lidí proti HCV.

Další cíl vynálezu je poskytnutí oligomerních částic, které mají lepší imunogeničnost díky mutaci alespoň jednoho cysteinového vyskytuj ící glutamovou, zbytku HCV obalového proteinu na přirozeně se aminokyselinu, výhodně methionin, kyselinu glutamin nebo lysin. Alternativně může být prováděna alkylace alespoň jednoho cysteinového zbytku HCV obalového proteinu. Konkrétně může. být zmíněný protein alkylován pomocí sloučenin jako jsou ethylenimin, N-(jodethyl)-trifluoracetamid nebo aktivní halogeny. V tomto zřeteli se předkládaný vynález týká poskytnutí dalšího použití oligomerních částic jako. nosičů pro účinnou prezentaci epit.opů jiných než HCV (non-HCV).

Dalším cílem, předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu léčení pacientů, akutně nebo chronicky infikovaných, antiobalovou protilátkou,, jako je například protilátka anti-El, např. protilátka anti-El oblasti V2, buď samotnou nebo v kombinaci s další léčbou.

« 9 • » 9*99 • · · ·· · 9 9 9 9

999 »99 999

9*9 «*· 9999 *

9*9 999*999 • 99 «9*9 9 9*99

Další cíl vynálezu je poskytnutí antigenu stimulujícího T buňky, jako je například jádrový antigen, El, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A nebo NS5B spolu s obalovými proteiny podle vynálezu.

Má .se za to, že všechny cíle předkládaného vynálezu splňují provedení uvedená níže.

Popis připojených tabulek a obrázků

Tabulka 1 poskytuje sekvence klonů El získaných od jednoho chronického nosiče, konstrukt El použitý pro produkci vakcíny je kanonickou sekvencí všech těchto jednotlivých klonů. V1-V5, variabilní oblastí 1-5, C4, konstantní doména 4, HR, hydrofobní oblast, HCV-B con, kanonická sekvence v pozicích, které jsou variabilní mezi klony a HCV-J.

Tabulka 2 poskytuje sekvence proteinu El vakcíny a proteinu E2, jak byly nalezeny u infikovaných šimpanzů Phila a Tona. Subtyp 1b izolovaný od Phila se lišil o 5,92 % od kmene vakcíny. Odlišnost mezi vakcínou a subtypem la izolátu od Tona byla 20,74 %.

Tabulka 3 poskytuje schematický přehled změn indukovaných terapeutickou vakcinací u dvou chronicky infikovaných šimpanzů (Ton a Phil). Analýza byla prováděna tak, jak je vysvětleno pro obrázky 8 a 11. Kromě toho byly z jaterních biopsií ohodnoceny histologické změny a stupeň zánětu.

Tabulka 4 poskytuje sekvence peptidů použitých pro mapování B buněčných epitopů. Za povšimnutí stojí, že HR se překrývá s V4V5.

Tabulka 5 ukazuje přeuspořádání NS3, aby se vytvořil kratší protein nesoucí všechny hlavní epítopy korelující s clearancí viru.

Tabul-ka 6 ukazuje reaktivitu v LIA Els-acetamidu proti Els-maleimidu ve vzorcích séra chronických nosičů HCV. Proteiny byly imobilizovány na LIA membránách. LIA proužky byly postříkány Els-acetamidem jako takovým, zatímco Els-maleimid (také obsahující biotin-maleimid) byl před postřikem sloučen do komplexu se streptavidinem. Antigeny byly navázány na LIA membrány, a proužky byly zpracovány v podstatě tak, jak je popsáno v práci Zrein et al. (1998). Lidské protilátky namířené proti těmto antigenům byly vizualizovány s použitím lidského antí-IgG konjugovaného s alkalickou fosfatázou. Pro barevné vyvolání proužků byly použity NBT a BCIP. Obarvení bylo ohodnoceno od 0,5 do 4, jak je vysvětleno v práci Zreina et al. (1998). Použití limitu 0,5 pro tento test pro počet pozitivních vzorků (#pos) a procento (%pos) je uvedeno vespod v tabulce.

Obrázek chromatografie exprimovaných

1: superponované profily z vylučovací v PBS/3% Empigen-BB proteinů Els a E2s a purifikovaných podle Maertense et al.

(PCT/EP95/03031) .

Obrázek chromatografie purifikovaných profily z vylučovací a E2s exprimovaných a al. (PCT/EP95/03031) a

2: superponované (SEC) proteinů Els podle Maertense et podrobených dalšímu běhu na stejné SEC koloně v PBS/0,2% CHAPS, aby byly získány specifické oligomerní struktury odhadované domnělé molekulové hmotnosti 250 až 300 kD. Podobný stupeň asociace může být získán s použitím 3% betainu.

«·*· ·· ···· ·· « • · · ·· · ···· » · » ··· · · · • · · 9 * » ···« · ♦ · ♦ ·» ·· ·*·

Obrázek chromátografie purifikovaných profily z vylučovací E2s exprimovaných a al. (PCT/EP95/03031) ,

3: superponované proteinů Els a podle Maertense et podrobených druhému běhu v 0,2% CHAPS nebo 3% betainu, a podrobených třetímu běhu na stejné SEC koloně v 0,05% CHAPS, aby byly získány specifické homo-oligomerní struktury s odhadovanou domnělou molekulovou hmotností 250 až 300 kD (E2s) a >600 kD (Els). Podobný stupeň asociace může být získán s použitím 0,1 nebo 0,5% betainu.

Obrázek 4: analýza dynamickým rozptylem světla, vyjádřená jako procento počtu částic ve vztahu k pozorovanému průměru v nm, Els v PBS/0,05% CHAPS.

Obrázek 5: analýza dynamickým rozptylem světla, vyjádřená jako procento počtu částic ve vztahu k pozorovanému průměru v nm, Els v PBS/0,1% betainu (horní část) nebo 0,5% betainu (spodní část).

Obrázek 6: EM barvení A) Els v PBS/0,05% CHAPS a B) Els v PBS/3% betainu.

Obrázek 7: distribuce velikosti částic Els v PBS/0,05‘

CHAPS.

Obrázek 8: vývoj protilátek anti-El indukovaný šesti postupnými a 3 upomínacími imunizacemi (označeno malými šipkami) u šimpanze infikovaného lb (Phil) a vývoj ALT, HCV RNA a anti-El protilátek. Protilátky antí-El vázající se k pevné fázi El byly detekovány s použitím protilidského IgG specifického sekundárního antiséra konjugovaného s peroxidázou. Jako substrát pro vývoj barvení byl použit TMB. Výsledky jsou vyjádřeny jako koncový titr. Hladiny ALT byly • · ·««« ·· · · zjišťovány klinickým analyzátorem a jsou vyjádřeny jako U/l. HCV RNA v séru byla určována s použitím přístroje HCV Monitor (Roche, Bazilej, Švýcarsko). Míra virové infekce jater byla zjišťována semikvantitativním určením množství E2 antigenu obarveného v jaterní biopsii s použitím specifické monoklonální protilátky (ECACC přístupové číslo 98031215, jak popsáno v EP přihlášce č. 98870060.5).

Obrázek 9: mapování epitopů protilátkových reakcí indukovaných imunizací s El u šimpanze Phila. Reaktivita protilátek na různé peptidy byla měřena nepřímým testem ELISA, ve kterém jsou biotinylované peptidy (viz také tabulka 4) adsorbovány na mikrotitrační destičky pomocí streptavidinu. Specifické protilátky byly detekovány s použitím protilidského IgG specifického sekundárního antiséra konjugovaného s peroxidázou. Jako substrát pro vývoj barvení byl použit TMB.

Obrázek 10: výsledky proliferačního testu lymfocytů před a po vakcinaci u šimpanze Phila. Zmrazené PBMC byly rozmraženy a stimulovány ve trojím provedení různými antigeny. Negativní kontrola bylo samotné médium, zatímco jako pozitivní kontrola byl použit konkavalin A v koncentraci 5 ug/ml. PBMC v koncentraci 2-4 x 10⁵ bunšk/jamka v celkovém objemu 150 μΐ byly pěstovány v médiu RPMI 1640 doplněném s 10% teplem inaktivovaným FCS v 96-jamkových mikrotitračních destičkách se dnem ve tvaru U společně s kontrolami nebo 1 pg/ml El po 90 hodin ve 37 °C ve zvlhčované atmosféře obsahující 5% CO₂. Během posledních 18 hodin byl buňkám podán puls 0,5 pCi (³H)thymidinu na jamku. Pak byly kultury sklizeny na filtrech ze skleněných vláken a bylo zjišťováno vychytáváni značky. Výsledky jsou vyjádřeny jako stimulační indexy (SI) : průměrné cpm antigenu/průměrné cpm samotného média ve trojím provedení.

«··♦ • φ · φ «' · ···· φφφ φφφ φφφ • · φ φφφ φφφφ ·

Obrázek 11: vývoj protilátek anti-El indukovaný šesti postupnými a 3 upomínacími imunizacemi (označeno malými šipkami) u šimpanze Tona infikovaného HCV subtypem la. Je ukázán vývoj ALT, HCV RNA v séru a zjišťování HCV antigenu v játrechr Anti-El protilátky byly určovány prostřednictvím nepřímého testu ELISA, specifické protilátky vázající se k pevné fázi potažené El byly detekovány s použitím protilidského IgG specifického sekundárního antíséra konjugovaného s peroxidázou. Jako substrát pro vývoj barvení byl použit TMB. Výsledky jsou vyjádřeny jako koncový titr. Hladiny ALT byly zjišťovány klinickým analyzátorem a jsou vyjádřeny jako U/l. HCV RNA v séru byla určována s použitím přístroje HCV Monitor (Roche, Bazilej, Švýcarsko). E2 antigen byl barven v jaterní biopsii s použitím specifické monoklonální protilátky (ECACC přístupové číslo 98031215, jak popsáno v EP přihlášce č. 98870060.5). Semikvantitativní hodnocení je označeno černými čtverečky pro jasně pozitivní barvení ve většině buněk, šedými čtverečky pro jasné barvení v menšině buněk a bílými čtverečky pro biopsie nevykazující detekovatelné barvení. HCV RNA je označena malými černými obdélníčky. Barvení E2 může být potvrzeno barvením na El a jádrový protein (data neukázána).

Obrázek 12: mapování epitopů protilátkové reakce indukované imunizací s El u šimpanze Tona. Reaktivita protilátek na různé peptidy byla měřena nepřímým testem ELISA, ve kterém jsou biotinylované peptidy (viz také tabulka 4) adsorbovány na mikrotitrační destičky pomocí streptavidinu. Specifické protilátky jsou detekovány s použitím protilidského IgG specifického sekundárního antiséra konjugovaného s peroxidázou. Jako substrát pro vývoj barvení byl použit TMB.

• · ···· ·· ···· ·· • · ·♦· '·«« • · ·*·» · # · «· * ·· ·· «· ··*

Obrázek 13: analýza El protilátkové odpovědi na El proteiny subtypu la a subtypu lb u šimpanze Tona. Za tímto účelem byl vytvořen pro El genotyp la, pocházející ze sekvence HCV-H, rekombinantní virus vakcinie exprimující stejnou část El jako .pro genotyp lb (viz níže) . El pocházel z hrubých lyzátů z buněk RK13 infikovaných virem vakcinie (připraveno tak, jak je popsáno v práce Maertense et al., PCT/EP95/03031). Reaktivita protilátek byla měřena nepřímým testem ELISA, ve kterém El byl adsorbován na mikrotitrační destičky prostřednictvím vazby s vysokým obsahem manózy aglutinínu Galanthus nivalis (GNA). Specifické protilátky byly detekovány s použitím protilidského IgG specifického sekundárního antiséra konjugovaného s peroxidázou. Jako substrát pro vývoj barvení byl použit TMB. Výsledky jsou vyjádřeny jako rozdíl OD (OD jamky s adsorbovaným El minus OD jamky bez adsorbovaného El) .

Obrázek 14: výsledky proliferačního testu lymfocytů před a po vakcinaci u šimpanze Tona. Zmrazené PBMC byly rozmraženy a stimulovány ve trojím provedení různými antigeny. Negativní kontrola bylo samotné médium, zatímco jako pozitivní kontrola byl použit konkavalin A v koncentraci 5 pg/ml. PBMC v koncentraci 2-4 x 10⁵ buněk/jamka v celkovém objemu 150 μΐ byly pěstovány v médiu RPMI 1640 doplněném s 10% teplem inaktivovaným FCS v 96-jamkových mikrotitračních destičkách se dnem ve tvaru U společně s kontrolami nebo 1 pg/ml El po 90 hodin ve 37 °C ve zvlhčované atmosféře obsahující 5% CO₂. Během posledních 18 hodin byl buňkám podán puls 0,5 pCi (³H)thymidinu na jamku. Pak byly kultury sklizeny na filtrech ze skleněných vláken a bylo zjišťováno vychytávání značky. Výsledky jsou vyjádřeny jako stimulační indexy (SI): průměrné cpm antigenu/průměrné cpm samotného média ve trojím provedení.

Obrázek 15: mapy konstruktů použitých ke získání exprese E2 proteinu s odstraněnou N-koncovou hypervariabilní oblastí. Konstrukty pvHCV-92 a pvHCV-99 jsou intermediární konstrukty použité pro konstrukci delečních mutant pvHCV-100 a pvHCV-101.

Obrázek odpovídáj ící výše).

16: sekvence (nukleotidy: A, translace: B) s konstrukty zobrazenými na obrázku 15 (viz

Obrázek 17: protilátkové titry získané na myších při imunizaci s různými El preparáty jak popsáno v příkladu 9. Titry byly určovány pomocí testu ELISA: myší séra byla naředěna 1/20 a dále (0,5 log_i0) a inkubována na mikrotitračních destičkáchpotažených Els (buď acetamidem nebo maleimidem). Po promytí byly navázané protilátky detekovány s použitím proti-myšího IgG specifického sekundárního antiséra konjugovaného s peroxidázou. Jako substrát pro vývoj barvení byl použit TMB. Výsledky jsou vyjádřeny jako koncový titr a jsou ukázány standardní odchylky (n = 6).

Obrázek 18: mapování epitopů protilátkové reakce indukované imunizací s různými Els preparáty u myší.

Reaktivita protilátek na různé peptidy byla měřena nepřímým testem ELISA, ve kterém jsou biotinylované peptidy (uvedené adsorbovány na mikrotitrační destičky pomocí Myší séra byly naředěny 1/20 a specifické protilátky jsou detekovány s specifického sekundárního v tabulce 4) streptavidinu použitím proti-myšího IgG antiséra konjugovaného s peroxidázou. Jako substrát pro vývoj barvení byl použit TMB.

Obrázek 19: izotypizace imunoglobulinového profilu myší imunizovaných různými Els preparáty. Specifické protilátky tříd a podtříd Ig byly adsorbovány na mikrotitrační destičky.

·999 ·· 9999 99 ·

9 · 99 9 9999 • 9» 999 999

9 9 99 9 9 9 9 9 9

999 «999 99 9

9 99 99 99 999

Po vychytání myších Ig z imunního séra ředěného 1/500, byly Els inkubovány v 1 pg/ml. Vytvořené imunní komplexy byly dále inkubovány s polyklonálním králičím antisérem namířeným proti El. Nakonec byly králičí protilátky detekovány s použitím kozího proti-králičího Ig specifického sekundárního antiséra konjugovaného s peroxidázou. Jako substrát pro vývoj barvení byl použit TMB. Výsledky byly normalizovány pro IgGi (tj. signál IgGi byl pro každé zvíře nezávisle považován za 1 a všechny výsledky pro další izotypy byly vyjádřeny relativně k tomuto výsledku IgGi) ·

Obrázek 20: protilátkové titry indukované dvěma imunizacemi kolem dne 1000 s Els-acetamidem u šimpanze Phila. Protilátky anti-El byly zjišťovány prostřednictvím nepřímého testu ELISA: specifické protilátky vázající se k pevné fázi El byly detekovány s použitím protilidského IgG specifického sekundárního antiséra konjugovaného s peroxidázou. Titr je vyjádřen v jednotkách/ml, tyto jednotky se vztahují k laboratornímu standardu, který je založen na lidském séru.

Obrázek 21: protilátkové titry indukované dvěma imunizacemi kolem dne 900 s Els-acetamidem u šimpanze Tona. Protilátky anti-El byly zjišťovány prostřednictvím nepřímého testu ELISA: specifické protilátky vázající se k pevné fázi El byly detekovány s použitím protilidského IgG specifického sekundárního antiséra konjugovaného s peroxidázou. Titr je vyjádřen v jednotkách/ml, tyto jednotky se vztahují k laboratornímu standardu, který je založen na lidském séru.

Obrázek 22: SEC profil konečného redukčního kroku detergentem (0,2 až 0,05% CHAPS): samotná částice El (A), samotná částice E2 (B), nebo ekvimolární směs El a E2, smíšená částice (C) . Obrázek také ukazuje překrývání hodnot OD testu ·· ·«♦· 99 99 9 9

9 9 9 9 9 • 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 99 9 9

ELISA specificky detekující pouze El (vrchní část), pouze E2 (prostřední část) a ELISA detekující pouze smíšené částice (spodní část).

Obrázek 23: SEC profil konečného redukčního kroku detergentem (0,2 až 0,05% CHAPS): samotná částice El genotypu lb (vrchní část), samotná částice El genotypu 4 (prostřední část) nebo ekvimolární směs El genotypu lb a 4, smíšená částice (spodní část). Obrázek také ukazuje překrývání hodnot OD testu ELISA specificky detekující pouze smíšené částice (viz také obrázek 22).

Podstata vynálezu

Vynález zde popisovaný navazuje na dříve publikovanou práci a projednávané patentové přihlášky. Jako příklad, tato práce se skládá z vědeckých článků, patentů nebo projednávaných patentových přihlášek. Všechny tyto publikace a přihlášky, citované výše nebo níže, jsou zahrnuty formou odkazu.

Předkládaný vynález se týká HCV vakcinace. Bylo poprvé dosaženo úspěšné imunoterapie šimpanzů s vážnou chronickou aktivní hepatitidou C prostřednictvím vakcinace s HCV antigenem. Vakcína neindukovala pouze dobrou imunitní odpověď, ale vyvolávala také clearance (vymizení) virového antigenu z jater a významné zlepšení histologické aktivity a nemoci jater. Předkládaný vynález se dále týká purifikovaných jednoduchých HCV obalových proteinů a zejména oligomerních částic. Tyto oligomerní částice se skládají v podstatě z HCV obalových proteinů a mají průměr 1 až 100 nm, jak změřeno dynamickým rozptylem světla nebo eventuálně elektronovým mikroskopem. V tomto ohledu je nutné zdůraznit, že částice mohou být tvořeny pouze proteiny El a/nebo E2 nebo jejích částmi (viz níže). Tudíž oligomerní částice podle ·· ···· ·· ·♦· předkládaného vynálezu se zásadně liší od částic podobných HCV popsaných ve WO 98/21338, které se nutně skládají z El a E2 a jádrového proteinu a P7. Termíny „oligomerní částice skládající se v podstatě z HCV obalových proteinů jsou zde definované jako struktury specifické povahy a tvaru, obsahující několik základních jednotek HCV El a/nebo E2 obalových proteinů, o kterých se předpokládá, že se skládají z jednoho nebo dvou El a/nebo E2 monomerů, v příslušném pořadí. Je jasné, že částice podle předkládaného vynálezu jsou definovány tak, aby neměly infekční RNA genom HCV. Částice podle předkládaného vynálezu mohou být částice vyššího řádu sférického tvaru, které mohou být prázdné, skládající se z pláště obalových proteinů, a do kterých mohou být inkorporovány lipidy, detergenty, jádrový protein HCV nebo pomocné molekuly. Tyto částice mohou být také opouzdřeny lipozomy nebo apolípoproteiny, jako jsou například apolipoprotein B nebo lípoproteiny o nízké denzitě, nebo každým, jiným prostředkem, pro cílení uvedených částic do specifického orgánu nebo tkáně. V tomto případě jsou takové prázdné sférické částice často nazývány „částice podobné viru nebo VLPs. Alternativně mohou být částice vyššího řádu pevné sférické struktury, ve kterých se kompletní sféra skládá z HCV El nebo E2 oligomerů obalových proteinů, a do kterých mohou být dále inkorporovány lipidy, detergenty, jádrový protein HCV nebo pomocné molekuly, nebo které mohou být zase samy opouzdřeny lipozomy nebo apolipoproteiny, jako jsou například apolipoprotein B nebo lípoproteiny o nízké denzitě, nebo každým, jiným prostředkem pro cílení uvedených částic do specifického orgánu nebo tkáně, např. pomocí asialoglykoproteinů. Částice se mohou také skládat z menších struktur (ve srovnání s prázdnými nebo pevnými sférickými strukturami uvedenými výše), které jsou obvykle kulatého (viz dále) tvaru a které obvykle neobsahují více než jednu vrstvu ·♦·· ·· ···♦ 44 4 • · 4 44 4 ···«

4 4 444 444 ••4 444 4444 4

7 444 4444444

J- / 4*4 4444 44444

HCV obalových proteinů. Typickým příkladem těchto malých částic jsou struktury podobné rozetám, které se skládají z menšího počtu HCV obalových proteinů, obvykle mezi 4 a 16. Specifický příklad těchto částic zahrnuje menší částice získané s-Els v 0,2% CHAPS, jak je zde uvedeno jako příklad, které zjevně obsahují 8 až 10 monomerů Els. Tyto struktury podobné rozetám jsou obvykle organizovány v ploše a mají kulatý tvar, jsou např. ve formě kola. Opět mohou být dále inkorporovány lipidy, detergenty, jádrový protein HCV nebo pomocné molekuly, nebo menší částice mohou být zase samy opouzdřeny lipozomy nebo apolipoproteiny, jako jsou například apolipoprotein B nebo lipoproteiny o nízké denzitě, nebo každým jiným prostředkem pro cílení uvedených částic do specifického orgánu nebo tkáně. Menší částice mohou také tvořit malé sférické nebo kuličkovité struktury skládající se z podobného malého množství HCV El nebo E2 obalových proteinů, a do kterých mohou být dále inkorporovány lipidy, detergenty, jádrový protein HCV nebo pomocné molekuly, nebo které mohou být dále opouzdřeny lipozomy nebo apolipoproteiny, jako jsou například apolipoprotein B nebo lipoproteiny o nízké denzitě, nebo každým jiným prostředkem pro cílení uvedených částic do specifického orgánu nebo tkáně. Velikost (tj. průměr) výše uvedených částic, jak měřeno technikami dynamického rozptylu světla, které jsou v oboru dobře známy (viz dále v části příklady), je obvykle mezi 1 až 100 nm, výhodněji mezi 2 až 70 nm, ještě výhodněji mezi 2 až 40 nm, mezi 3 až 20 nm, mezi 5 až 16 nm, mezi 7 až 14 nm nebo mezi 8 až 12 nm.

Vynález se dále týká oligomerní částice, jak je definována výše, kde uvedené obalové proteiny jsou vybrány ze skupiny skládající se z proteinů HCV El, HCV Els, HCV E2, sekvence id. č. 13 nebo sekvence id. č. 14, nebo jejich částí. Proteiny HCV El a HCV E2 a detailní popis, jak purifikovat tyto proteiny, jsou dobře popsány a charakterizovány v PCT/EP 95/03031, φφφφ φφ φφφφ

Maertens et al. HCV Els, sekvence id. č. 13 nebo sekvence id. č. 14, nebo jejich části, mohu být purifikovány podobně, jak je popsáno pro HCV El a HCV E2 v PCT/EP 95/03031, Maertens et al. Je zdůrazněno, že celý obsah, zahrnující všechny definice, tohoto dokumentu je zahrnut formou odkazu do předkládané přihlášky. Protein HCV Els se vztahuje k aminokyselinám 192 až 326 z El a představuje protein El bez jeho C-koncové hydrofobní kotvy. Termín „nebo jeho část se týká každé části zde uvedených proteinů, které jsou imunogenní, jakmile jsou jednou součástí Částice podle předkládaného vynálezu.

Vynález se dále týká oligomerních částic, jak jsou zde popsány, kde alespoň jeden cysteinový zbytek HCV obalového proteinu, jak popsáno výše, je alkylován, výhodně alkylován prostřednictvím alkylačních činidel, jako jsou například aktivní halogeny, ethylenimin nebo N(jodethyl)trifluoracetamid. V tomto ohledu je nutné rozumět, že alkylace cysteinů se týká cysteinů, ve kterých vodík na atomu síry je nahrazen (CH₂)_nR, kde n je 0, 1, 2, 3 nebo 4 a R = H, COOH, NH₂, CONH₂, fenyl nebo jakýkoliv jejich derivát. Alkylace může být prováděna každým způsobem v oboru známým, jako například aktivními halogeny X(CH₂)„R, kde X je halogen jako například I, Br, Cl nebo F. Příklady aktivních halogenů jsou methyljodid, kyselina jodoctová, jodacetamid a 2-bromethylamin. Další způsoby alkylace zahrnují použití ethyleniminu nebo N-(jodethyl)trifluoracetamidu, oba mají za následek substituci H skupinou -CH₂-CH₂-NH₂ (Hermanson, 1996). Termín „alkylační činidla, jak se zde používá, se týká sloučenin, které jsou schopné provádět alkylaci, jak je zde popsána. Tyto alkylace mají nakonec za následek modifikovaný cystein, který může napodobovat jiné aminokyseliny. Alkylace prostřednictvím ethyleniminu má za následek strukturu připomínající lysin tak, že jsou zavedena nová štěpná místa pro trypsin (Hermanson, 1996). Podobně použití methyljodidu má ♦· ·♦>· ·· ···· „mutovaný kóduj ících

z.sl následek aminokyselinu připomínající methionin, zatímco použití jodacetátu a jodacetamidu má za následek aminokyselinu připomínající kyselinu glutamovou a glutamin, v příslušném pořadí. Analogicky jsou tyto aminokyseliny výhodně použity v přímé mutaci cysteinu. Předkládaný vynález se tudíž týká oligomerních částic, jak jsou zde popsány, přičemž alespoň jeden cysteinový zbytek HCV obalového proteinu, jak zde popsáno, je mutován na přirozenou aminokyselinu, výhodně na methionin, kyselinu glutamovou, glutamin nebo lysin. Termín se týká místně cílené mutageneze nukleových kyselin tyto aminokyseliny, t j . metod v oboru dobře známých, jako je například místně cílená mutageneze pomocí PCR nebo oligonukleotidem zprostředkovaná mutageneze, jak je popsáno v práci Sambrook et al. (1989).

Termín „purifikovaný, jak se zde používá, se týká přípravku, kde požadované složky, jako například HCV obalové proteiny nebo oligomerní částice, zahrnují alespoň 35 % celkových složek přípravku. Požadované složky výhodně zahrnují alespoň přibližně 40 výhodněji alespoň přibližní ještě výhodněji ještě výhodněji alespoň přibližně 60 alespoň přibližně 70 %, ještě výhodněji alespoň přibližně %, ještě výhodněji alespoň přibližně 90 %, ještě výhodněji alespoň přibližně 95 %, a nej výhodněji alespoň přibližně 98 % z celkové frakce složek přípravku. Přípravek může obsahovat další sloučeniny, jako například sacharidy, soli, lipidy, rozpouštědla apod., bez ovlivnění určované procentové čistoty, jak se zde používá. Termín „izolovaná HCV oligomerní částice míní přípravek HCV oligomerních částic, který je alespoň z 35 % čistý. V tomto ohledu je jasné, že termín „purifikovaný jednoduchý HCV obalový protein, jak se zde používá, se týká izolovaných HCV obalových proteinů v podstatně čisté formě. Termíny „v podstatě purifikované oligomerní částice a „jednoduché HCV obalové proteiny, jak se zde používá, ·· ··«· «·»· ·· 9 • · ··« ····· • · · · » · · · · • · » · · · «··· · ··· · · · · ·· · ·· · ·* *· 99 999 znamenají HCV oligomerní částice nebo jednoduché HCV obalové proteiny, a to takové, že mohou být použity pro in vitro diagnostické metody a léčiva. Tyto HCV oligomerníčástice jsou v podstatě bez buněčných proteinů, proteinů pocházejících z vektorů.nebo jiných HCV virových složek. Obvykle jsou tyto částice nebo proteiny purifikovány do homogenity (čisté alespoň z 80 %, výhodně 85 %, výhodněji 90%, výhodněji 95 %, výhodněji 97 %, výhodněji 98%, výhodněji 99 %, ještě výhodněji 99,5 % a nejvýhodněji by kontaminující proteiny neměly být detekovány obvyklými metodami jako jsou například SDS-PAGE a barvení stříbrem).

Předkládaný vynález se také týká oligomerní částice, jak je definována výše, přičemž uvedené obalové proteiny jsou každá možná směs HCV El, HCV Els, HCV E2, sekvence id. č. 13 nebo sekvence id. č. 14, nebo jejích částí, například částice se může v podstatě skládat podle předkládaného z proteinů HCV El a vynálezu

HCV E2, proteinů HCV El

HCV Els, proteinů HCV Els a HCV E2 a proteinů HCV El, HCV Els a HCV E2. Kromě toho se předkládaný vynález dále týká oligomerní částice, jak je definována výše, přičemž uvedené proteiny pocházejí z různých kmenů, subtypů nebo genotypů HCV, například uvedené proteiny pocházejí z genotypu 1b a genotypu 4, nebo jsou směs skládající se z HCV obalových proteinů z jednoho kmene nebo genotypu HCV a alespoň jednoho dalšího kmene nebo genotypu HCV. Odlišné HCV kmeny nebo genotypy jsou dobře definovány a charakterizovány Maertens et al. Opět je zdůrazněno, v PCT/EP 95/04155, že celý obsah tohoto dokumentu, včetně všech definicí, je zahrnut formou odkazu v předkládané přihlášce. Předkládaný vynález se tedy týká oligomerních částic· obsahujících obalové proteiny pocházející z jakéhokoliv kmene nebo genotypu HCV v oboru známého nebo částic obsahujících směs proteinů pocházejících z jakéhokoliv kmene nebo genotypu HCV v oboru známého. V tomto ohledu se »· «·»· ·· ··«« • · · · · · · • · · · · · · ··· · * · · « « <· ·· «·

95/03031, např. krokem, jak je předkládaný vynález také týká kanonických sekvencí pocházejících z jednotlivých klonů, jak uvedeno jako příklad níže a v části Příklady (viz dále).

Předkládaný vynález se dále týká oligomerní částice, jak je zde popsána, kterou lze získat způsobem, jakož i uvedeného způsobu produkce uvedených oligomerních částic. Uvedený způsob je charakterizován následujícími kroky:

I) purifikace HCV obalových proteinů, eventuálně zahrnující použití volitelně prvního detergentu. V podstatě byl purifikační postup kroku I) popsán obsáhle v PCT/EP 95/03031, Maertens et al. Podle předkládaného vynálezu je důležité, že blokující krok v purifikačním postupu, jak popsán v PCT/EP s NEM-biotinem, je prováděn s alkylačním popsáno v předkládané přihlášce, výhodně s použitím jodacetamidu. Kromě toho purifikační postup kroku

I) může eventuálně zahrnovat použití činidla štěpícího disulfidovou vazbu a eventuálně zahrnuje použití alkylačního činidla. Nakonec má postup kroku I) za následek purifikované HCV obalové proteiny v roztoku.

II) nahrazení roztoku uvedených purifikovaných HCV obalových proteinů detergentem nebo solí, což má za následek tvorbu oligomerních částic.

III) znovuzískání nebo purifikace uvedených oligomerních částic, eventuálně zahrnující další snížení koncentrace detergentu nebo soli z kroku II), což dále napomáhá tvorbě a stabilizaci uvedených oligomerních částic, tvořených po uvedeném nahrazení.

Výhodněji se předkládaný vynález týká oligomerní částice, jak je zde definována, a také způsobu tvorby uvedené částice, přičemž uvedený volitelný první detergent je Empigen-BB. Výhodněji se předkládaný vynález týká oligomerní částice, jak je zde definována, a také způsobu produkce uvedené částice, přičemž detergent z kroku II) je CHAPS, oktylglukasid nebo • · · · · · • ·

Tween, výhodněji Tween-20 nebo Tween-80 nebo jakýkoliv jiný detergent. Výhodněji se předkládaný vynález týká oligomerní částice, jak je zde definována, a také způsobu produkce uvedené částice, přičemž uvedená sůl je betain. Ještě výhodněj i se předkládaný vynález týká oligomerní částice, jak je definována výše, a také způsobu produkce uvedené částice, přičemž uvedený Empigen-BB je použit v koncentraci 1 až 10 % a kde uvedený CHAPS nebo Tween jsou použity v koncentraci 0,01 % až 10 % nebo uvedený betain je použit v koncentraci 0,01 % až 10 %. Ještě výhodněji se předkládaný vynález týká oligomerní částice, jak je definována výše, a také způsobu produkce uvedené částice, přičemž uvedený Empigen-BB je použit v koncentraci 3 % a kde uvedený CHAPS nebo betain jsou použity v koncentracích 0,2 % nebo 0,3 %, v příslušném pořadí, a poté je pufr je vyměněn a uvedený CHAPS nebo betain jsou použity v koncentracích 0,05 % nebo 0,1 až 0,5 %, v příslušném pořadí. Je nutné rozumět, že všechna procenta použitá ve způsobu popsaném výše jsou udávána jako hmotnost/objem. Je jasné, že způsob popsaný výše (viz také PCT/EP 95/03031 a část Příklady předkládané přihlášky) je příklad toho, jak produkovat částice podle předkládaného vynálezu. V tomto ohledu se předkládaný vynález také týká jakéhokoliv dalšího způsobu v oboru známého, který může být použit k produkci oligomerních částic podle předkládaného vynálezu, jako například vynechání redukčního činidla, jak je popsáno v PCT/EP 95/03031 a v části Příklady (níže), a místo toho použití hostitelských buněk, které mají optimalizovaný redoxní stav v endoplazmatickém retikuiu pro redukci cysteínových můstků. Kromě toho je jasné, že může být použita celá řada alkylbetainů, jako například ty se zbytkem Cnz kde n = pozitivní celé číslo pohybující se od 1 do 20, jakož i deriváty betainu, jako například sulfobetainy.

Protože bylo poprvé dosaženo úspěšné imunoterapie šimpanzů s těžkou chronickou aktivní hepatitidou C prostřednictvím • · · · · · vakcinace purifikovaným HCV antigenem, týká se předkládaný vynález také purifikovaných jednoduchých HCV obalových proteinů, obzvláště El nebo Els. Kromě toho se předkládaný vynález týká přípravku obsahujícího uvedené jednoduché HCV obalové proteiny, a jeho použití jako HCV vakcíny nebo pro výrobu HCV vakcíny.

Aby se zabránilo indukci imunitní odpovědi proti nerelevantním epitopům, je HCV obalový protein použitý pro vakcinací výhodně konstruován jako kanonická sekvence jednotlivých subtypů, kmenů nebo klonů. Předkládaný vynález se tudíž také týká použití HCV antigenu (buď ve formě peptídu, proteinu nebo polynukleotidu) pro vakcinaci nebo diagnostiku. Kromě toho se předkládaný vynález také týká oligomerní částice, jak je zde definována, a jejího použití, ve které je HCV obalový protein kódovaný kanonickými sekvencemi založenými na kvazídruhové (quasispecies) variabilitě v izolátu (izolátová kanonická sekvence) nebo založenými na kanonické sekvenci odlišných izolátů v subtypu (subtypová kanonická sekvence), typu nebo druhu (typová nebo druhová kanonická sekvence) nebo v kompletním HCV rodu (rodová kanonická sekvence) . Pak aminokyselinová sekvence tohoto kanonického HCV obalového proteinu je kanonická sekvence odvozená z izolátové, subtypové, kmenové nebo rodové kanonické sekvence. Pro význam termínu „kanonický se odkazuje obzvláště na práci Maertense a Stuyvera (1997) a odkazy tam použité.

Oligomerní částice podle předkládaného vynálezu předkládá velice účinně epitopy (viz níže). Oligomerní částice je tudíž prostředek pro prezentaci epitopů takovým způsobem, že mohou vyvolat vydatnou imunitní odpověď. V tomto kontextu se rozumí, že HCV obalové proteiny, jak jsou zde definovány, nemusí obsahovat výlučně HCV epitopy. HCV obalové proteiny, které tvoří oligomerní částice, mohou obsahovat epitopy, které pocházejí ze samotného HCV a eventuálně obsahují epitopy, které pocházejí z jiných exogenních agens, jako například HBV nebo HIV. Jinými slovy, oligomerní částice s kostrou HCV obalového proteinu může být použita jako nosič pro prezentaci non-HCV epitopů, eventuálně kromě HCV epitopů. Předkládaný vynález tudíž obsahuje také oligomerní částici, jak je zde definována, ale eventuálně bez HCV epitopů, a její aplikaci a výrobu, eventuálně obsahující non-HCV epitopy. Termín „exogenní agens, jak se zde používá, se týká každého agens, ať už živého či ne, které je schopno vyvolat imunitní odpověď a které není pro hostitele endogenní, a které není HCV. Specificky se tento termín týká skupiny skládající se z patogenních agens, alergenů a haptenů. Patogenní agens zahrnují priony, viry, prokaryota a eukaryota. Konkrétněji viry zahrnují obzvláště HBV, HIV nebo herpesvirus, ale ne HCV. Alergeny zahrnují látky nebo molekuly schopné vyvolat imunitní reakci u hostitele samy o sobě, když je hostitel těmto alergenům vystaven. Hapteny se chovají podobně jako alergeny, co se týče schopnosti vyvolat imunitní odpověď, ale na rozdíl od alergenů hapteny potřebují nosičskou molekulu.

Předkládaný vynález se také týká přípravku obsahujícího oligomerní částici, jak je definována výše. Konkrétněji se předkládaný vynález týká přípravku vakcíny. Termín „přípravek vakcíny se týká imunogenního přípravku schopného vyvolat ochranu proti HCV, ať už částečnou nebo úplnou. Zahrnuje tudíž HCV peptidy, proteiny nebo polynukleotidy. Ochrana proti HCV se týká konkrétně lidí, ale týká se také primátů kromě člověka, trimera myši (Zauberman et al., 1999) nebo dalších savců.

Částice podle předkládaného vynálezu mohou být použity jako také, v biotinylované formě (jak je vysvětleno ve WO 93/18054) a/nebo spojené do komplexu s Neutralitě Avidin (Molecular Probes lne., Eugene, OR, USA). Je nutné také poznamenat, že „přípravek vakcíny obsahuje kromě aktivní • · · ·

Vhodné nosiče makromolekuly, kyseliny polymléčné, jako látky vhodný excipient, ředidlo, nosič a/nebo adjuvans, které samy o sobě nevyvolávají produkci protilátek škodlivých pro jedince, který dostává přípravek, ani nevyvolávají ochranu.

jsou typicky velké pomalu metabolizované například proteiny, polysacharidy, kyseliny polyglykolové, polymerní aminokyseliny, aminokyselinové kopolymery a inaktivní virové částice. Tyto nosiče jsou odborníkovi známé. Výhodné adjuvans pro zvýšení účinnosti přípravku zahrnují bez omezení: hydroxid hlinitý, hliník v kombinaci s 3-0-deacylovaným monofosforyllipidem A, jak popsáno ve WO 93/19780, fosfát hlinitý, jak bylo popsáno ve WO 93/24148, N-acetyl-muramyl-Lthreonyl-D-isoglutamin, jak popsáno v patentu Spojených Států č. 4 66 918, N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, Nacetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanin2-(1'2'dipalmitoy1-sn-glycero-3-hydroxy-fosforyloxy)ethylamin a RIBI (ImmunoChem Research lne., Hamilton, MT, USA), který obsahuje monofosforyllipid A, detoxikovaný endotoxin, trehalóza-6,6-dimykolát, a skelet buněčné stěny (MPL+TDM+CWS) ve 2% emulzi squalen/Tween 80. Každá ze tří složek MPL, TDM nebo CWS může být také použita samotná nebo kombinovaná 2 krát 2. Navíc mohou být použita adjuvans, jako například Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA) nebo SAF-1 (Syntex), a také adjuvans, jako například kombinace mezi QS21 a 3-de-0-acetylovaným monofosforyllipidem A (WO 94/00153) nebo MF-59 (Chiron) nebo adjuvans na bázi póly[di(karboxylatofenoxy)fosfazenu] (Virus Research

Institute) nebo adjuvans na bázi blokového polymeru jako například Optivax (Vaxcel, Cythx) inulinu, jako například Algammulin neúplné Freundovo adjuvans, (IFA) nebo preparáty Gerbu (Gerbu Biotechnik). Rozumí se, že úplné Freundovo adjuvans (CFA) může být použito pro aplikace netýkající se lidí, jakož i pro nebo adjuvans na bází a Gammalnulin (Anutech), : i rozpuštění nebo suspenzi Přípravek může být také vědecké účely. „Přípravek vakcíny dále obsahuje excipienty a ředidla, které jsou v podstatě netoxické a nejsou léčebné, jako například voda, fyziologický roztok, glycerol, ethanol, smáčedla nebo emulgátory, látky pufrující pH, konzervační činidla apod. Typicky je přípravek vakcíny připraven buď jako tekutý roztok nebo suspenze pro injekci. Mohou být také připraveny pevné formy, vhodné pro v tekutých nosičích před injekcí, v emulzi nebo opouzdřený v lipozomech pro zvýšení adjuvantního účinku. Polypeptidy mohu být také inkorporovány do imunních stimulujících komplexů spolu se saponiny, například Quil A (ISCOMS). Přípravek vakcíny obsahuje imunologicky účinné množství polypeptidů podle předkládaného vynálezu, a také jakoukoliv jinou z výše uvedených složek. „Imunologicky účinné množství znamená, že podávání tohoto množství jedinci, buď v jedné dávce nebo jako část série, je účinné pro prevenci nebo léčbu. Toto množství kolísá v závislosti na zdravotním a tělesném stavu léčeného jedince, taxonomické skupině léčeného jedince (např. člověk, primát kromě člověka, primát, apod.), kapacitě imunitního systému jednotlivce vyvolat účinnou imunitní odpověď, na stupni požadované ochrany, formulaci vakcíny, odhadu ošetřujícího lékaře, kmeni infikujícího HCV a dalších relevantních faktorech. Očekává se, že množství bude spadat do relativně širokého rozmezí, které může být určeno rutinními zkouškami. Obvykle bude množství kolísat oč 0,01 do 1000 pg/dávku, konkrétněji od 0,1 do 100 pg/dávku. Přípravky vakcíny jsou obvykle podávány parenteráině, typicky injekcí, například subkutánně nebo intramuskulárně. Další přípravky vhodné pro další způsoby podávání zahrnují perorální formulace a čípky. Dávkování může být podle rozpisu s jednou dávkou nebo rozpisu mnohonásobných dávek. Vakcína může být podávána ve spojení s dalšími imunoregulačními agens. Předkládaný vynález se tudíž týká použití oligomerní částice, jak je zde • * · · ···· definována, pro profylaktickou indukci imunity proti HCV. Je nutné poznamenat, že vakcína může být také použitelná pro léčení jednotlivce jak zdůrazněno výše, v tomto případě je nazývána „terapeutická vakcína.

Předkládaný vynález se také týká přípravku, jak definován výše, který také obsahuje HCV jádrový antigen, proteiny El, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a/nebo NS5B, nebo jejich části. Částice El, E2 a/nebo E1E2 mohou být například spojeny s antigeny stimulujícími T buňky, jako například jádrový antigen, P7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a/nebo NS5B. Konkrétně se předkládaný vynález týká přípravku, jak definován výše, kde uvedený protein NS3, nebo jeho část, mají aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci id. č. 1 nebo v sekvenci id. č. 2 (viz dále část Příklady). Purifikace těchto proteinů NS3 zahrnuje výhodně reverzibilní modifikaci cysteinových zbytků a ještě výhodněji sulfonaci cysteinů. Metody pro získání těchto reverzibilních modifikací, včetně sulfonace, byly popsány pro proteiny NS3 v práci Maertense et al. (PCT/EP 99/02547). Je nutné zdůraznit, že celý obsah tohoto dokumentu, včetně všech definicí, je zahrnut formou odkazu do předkládané přihlášky.

Z výše uvedeného je jasné, že předkládaný vynález se také týká použití oligomerní částice, jak definována výše, nebo přípravku, jak definován výše, pro výrobu přípravku HCV vakcíny. Konkrétně se předkládaný vynález týká použití oligomerní částice, jak definována výše, pro indukci imunity proti HCV u chronických nosičů HCV. Konkrétněji se předkládaný vynález týká použití oligomerní částice, jak definována výše, pro indukci imunity proti HCV u chronických nosičů HCV před každou další léčbou, současně s ní nebo po ní, jako například před dobře známou léčbou interferonem buď v kombinaci s podáváním malých léků pro léčbu HCV, jako například ribavirinu, nebo bez této kombinace. Tento přípravek může být také použít před transplantací jater nebo po ní, nebo před ·

• · » 4 očekávanou infekcí, jako například bodným poraněním jehlou. Kromě toho se předkládaný vynález týká soupravy obsahující oligomerní částice nebo jednoduché HCV obalové proteiny podle předkládaného vynálezu pro detekci HCV protilátek vyskytujících se v biologickém vzorku. Termín „biologický vzorek, jak se zde používá, se vztahuje ke vzorku tkáně nebo tekutiny izolované z jedince, včetně-, ale bez omezení, například séra, plazmy, lymfatické tekutiny, vnějších částí kůže, respiračního traktu, intestinálního traktu a močopohlavního traktu, oocytů, slz, slin, mléka, krvinek, nádorů, orgánů, gastrické sekrece, hlenu, mozkomíšního moku, vnějších sekretů, jako například exkrementů, moči, spermatu, apod. Protože oligomerní částice a jednoduché HCV obalové proteiny podle předkládaného vynálezu jsou vysoce imunogenní, a stimulují jak humorální, tak buněčnou imunitní odpověď, týká se předkládaný vynález také soupravy pro detekci HCV ve vztahu k T buněčné odpovědi, obsahující oligomerní částici nebo purifikovaný jednoduchý HCV obalový protein podle předkládaného vynálezu. T buněčná odpověď na HCV může být například měřena tak, jak je popsáno v části Příklady, nebo jak popsáno v PCT/EP 94/03555, Leroux-Roels et al. Je nutné zdůraznit, že celý obsah tohoto dokumentu, včetně všech definic, je zahrnut formou odkazu do předkládané přihlášky.

Je jasné, že předkládaný vynález se také týká použití specifických HCV imunoglobulinů pro léčení a prevenci HCV infekce. Je zde poprvé dokázáno, že přiměřené hladiny HCV protilátek, obzvláště HCV obalových protilátek, navozují zmírnění hepatitidy C. Je také poprvé dokázáno, že přiměřené hladiny protilátek mohou vázat cirkulující virus, a že přítomnost komplexu Ab-virus koinciduje s vymizením HCV antigenu z jater a se zmírněním jaterního postižení. HCV obalové protilátky mohou být indukovány vakcinaci nebo mohou být pasivně přeneseny injekcí poté, co byly protilátky •4 4 4·· • 4 · 4 ·

purifikovány ze spojených vzorků HCV-infikované krve nebo z krve získané z jedinců očkovaných proti HCV. Předkládaný vynález se tedy dále týká specifických protilátek tvořených proti oligomerním částicím, jak jsou popsány výše, nebo proti přípravku,, jak je popsán výše, nebo proti jednoduchému HCV obalovému proteinu. Konkrétně se předkládaný vynález týká soupravy obsahující uvedené protilátky pro detekci HCV antigenů. Termín „specifické protilátky, jak se zde používá, se vztahuje k protilátkám, které jsou vypěstovány proti epitopům, které jsou specifické pro oligomerní částice, jak popsáno v předkládaném vynálezu. Jinými slovy, specifické protilátky jsou vypěstovány proti epitopům, které jsou následkem tvorby oligomerních částic a vyskytují se pouze na nich. Kromě toho jsou známy různé postupy produkce HCV peptidů. Tyto postupy mohou mít za následek HCV peptidy schopné prezentovat epitopy. Je možné, že HCV peptidy, získané těmito různými a odlišnými postupy, jsou schopné prezentovat podobné epitopy. Podobné epitopy jsou epitopy vyplývající z odlišných produkčních nebo purifikačních postupů, ale rozeznavatelné jednou a touže protilátkou. Ale oligomerní částice podle předkládaného vynálezu prezentují epitopy neobyčejně účinně. Následkem toho jsou epitopy na oligomerních částicích vysoce imunogenní. Předkládaný vynález se tedy také týká epitopů na oligomerních částicích, uvedené epitopy jsou alespoň 10 krát, výhodně alespoň 20 krát, výhodně alespoň 50 krát, výhodně alespoň 100 krát, výhodně alespoň 500 krát, a nejvýhodněji alespoň 1000 krát více imunogenní než epitopy na HCV-peptidech, které nejsou produkovány podle předkládaného vynálezu, tj. nejsou produkovány tvorbou částic pomocí detergentu. Odborník ocení, že uvedená imunogeničnost může být například detekována, a tudíž srovnávána pomocí imunizace savců prostřednictvím podávání srovnatelných množství peptidů, produkovaných každou metodou. Kromě toho, termín „specifická • « ·· * protilátka se vztahuje k protilátkám, které jsou pěstovány proti purifikovanému jednoduchému HCV obalovému proteinu. Jak se zde používá, termín „protilátka se vztahuje k polyklonálním nebo monoklonálním protilátkám. Termín „monoklonální protilátka se vztahuje k protilátkovému přípravku, který má homogenní populaci protilátek. Termín „protilátka není omezující, co se týče živočišného druhu nebo zdroje protilátek, ani není míněno, aby byl omezující, co se týče způsobu, kterým jsou vytvářeny. Kromě toho, termín „protilátka se také vztahuje k humanizovaným protilátkám, ve kterých je alespoň část oblasti rámce imunoglobulinu odvozená z lidské imunoglobulinové sekvence a jednořetězcových protilátek, jako například popsaných v patentu Spojených Států č. 4 946 778, k fragmentům protilátek jako například F_ab, F_(ab)2, F_v, a dalším fragmentům, které si podržely funkci vazby antigenu a specifičnost základní protilátky.

Kromě toho předkládaný vynález také poskytuje použití oligomerní částice, jak je popsána výše, nebo přípravku, jak je popsán výše, pro detekci protilátek proti HCV obalovým proteinům. Jak se zde používá, termín „detekovat se vztahuje ke každému testu v oboru známém, který je pro detekci vhodný. Konkrétně se termín vztahuje ke každému testu, jak popsáno ve WO 96/13590.

Termíny „peptid, „polypeptid a „protein jsou v předkládaném vynálezu používány zaměnitelně. Termín „polypeptid se vztahuje k polymeru aminokyselin (aminokyselinová sekvence) a netýká se specifické délky molekuly. Oligopeptidy jsou tudíž zahrnuty v definici polypeptidu. Rozumí se, že peptidomimetika jsou obsažena v termínech „polypeptid, „peptid a „protein.

Předkládaný vynález se také týká použití oligomerní částice, jak je zde popsána, pro indukci imunity proti HCV, charakterizovanou tím, že uvedená oligomerní částice je • » · · · » ····

« · • · • ·

*.»’ použita jako část série časových intervalů a sloučenin.

V tomto ohledu se rozumí, že termín „série časových intervalů a sloučenin se vztahuje k podávání sloučenin použitých pro vyvolání imunitní reakce jedinci v časových intervalech. Tyto sloučeniny mohou obsahovat jakoukoliv z následujících složek: oligomerni částice, přípravek HCV DNA vakcíny, HCV polypeptidy.

V tomto ohledu, série zahrnuje podávání, buď:

I) HCV antigenu, jako například oligomerni částice, s časovými intervaly, nebo

II) HCV antigenu, jako například oligomerni částice v kombinaci s přípravkem HCV DNA vakcíny, kdy uvedené oligomerni částice a uvedený přípravek HCV DNA vakcíny mohou být podávány současně nebo v různých časových intervalech, včetně střídavých časových intervalů, nebo

III) buď I) nebo II) eventuálně v kombinaci s dalšími HCV peptidy, s časovými intervaly.

V tomto ohledu je jasné, že přípravek HCV DNA vakcíny obsahuje nukleové kyseliny kódující HCV obalové proteiny, včetně peptidů El, E2, E1/E2, peptidu Els, sekvence id. č. 13, sekvence id. č. 14, peptidu NS3, dalších HCV peptidů nebo části uvedených peptidů. Kromě toho se rozumí, že uvedené HCV peptidy zahrnují HCV obalové peptidy, včetně peptidů El, E2, E1/E2, peptidu Els, sekvence id. č. 13, sekvence id. č. 14, peptidu NS3, dalších HCV peptidů nebo jejich částí. Termín „další HCV peptidy se vztahuje ke každému HCV peptidu nebo jeho fragmentu, s výhradou, že uvedený HCV peptid není El, E2, Els, sekvence id. č. 13, sekvence id. č. 14 nebo peptid NS3.

V odstavci II) výše uvedeného schématu přípravek HCV DNA vakcíny obsahuje výhodně nukleové kyseliny kódující HCV obalové peptidy. V odstavci II) výše uvedeného schématu se přípravek HCV DNA vakcíny skládá ještě výhodněji z nukleových kyselin kódujících HCV obalové peptidy, eventuálně v kombinaci s přípravkem HCV-NS3 DNA vakcíny. V tomto ohledu je jasné, že přípravek HCV DNA vakcíny obsahuje plazmidový vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující HCV peptid, jak je popsán výše, operativně spojený s transkripčními regulačními prvky. Jak se zde používá „plazmidový vektor se vztahuje k molekule nukleové kyseliny schopné transportu jiné nukleové kyseliny, ke které byla připojena. Výhodné vektory jsou vektory schopné autonomní replikace a/nebo exprese nukleových kyselin, ke kterým byly připojeny. Obecně, ale bez omezení, jsou plazmidové vektory cirkulární dvojvláknové DNA smyčky, které, ve své formě vektoru, nejsou vázány na chromozom. Jak se zde používá termín „polynukleotidová sekvence se vztahuje k polynukleotidům, jako například deoxyribonukleové kyselině (DNA), a, ribonukleové kyselině (RNA). Rozumí se, kde příslušné, ze termín také zahrnuje, jako ekvivalenty, analogy buď RNA nebo DNA vytvořené z nukleotídových analogů, a jednovláknové (sense nebo antisense) a dvojvláknové polynukleotidy. Jak se zde používá, termín „transkripční regulační prvky se vztahuje k nukleotidové sekvenci, která obsahuje esenciální regulační prvky, takové, že jsou po zavedení do živé buňky obratlovce schopné řídit buněčný aparát, aby produkoval translační produkty kódované polynukleotidem. Termín „operativně spojen se týká postavení vedle sebe, taková, aby byly prováděny jejich transkripční regulační prvky s nukleotidovou sekvencí jsou schopné provádět expresi uvedené nukleotidové sekvence. Odborník ocení, že mohou být úspěšně použity různé transkripční promotory, terminátory, nosičské vektory nebo sekvence specifických genů.

Nakonec se předkládaný vynález týká imunotestu pro detekci HCV protilátky, tento test obsahuje: 1) poskytnutí oligomerní částice nebo purifikovaného jednoduchého HCV obalového kdy konfigurace složek je obvyklé funkce, operativně

Tudíž spojeny

9·· ·· • 9 ·· proteinu, jak je zde definován, nebo jeho funkčního ekvivalentu, 2) inkubace biologického vzorku s uvedenou oligomerní částicí nebo uvedeným HCV obalovým proteinem za podmínek, které umožní tvorbu komplexu protiiátka-antigen, 3) zjištění, ' zda byl vytvořen uvedený komplex protiiátka-antigen obsahující uvedenou oligomerní částici nebo uvedený HCV obalový protein.

Předkládaný vynález bude nyní následující příklady, které vyloží provedení. Ale je nutné poznamenat, že tato provedení jsou pouze ilustrativní a nemohou být chápána tak, že vynález jakkoliv omezují.

doložen odkazy na obzvláště výhodná

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese, purifikace a homo-oligomerizace HCV El proteinu pomocí detergentu

HCV Els protein (aminokyseliny 192 až 326) byl exprimován a purifikován z buněk RK13 s použitím rekombinantního viru vakcinie pvHCV-llA podle protokolu popsaného v Maertens et ai. (PCT/EP 95/03031). Kromě toho purifikovaný protein El ve 3% Empigen-BB, který projevuje zjevnou molekulovou hmotnost odpovídající El homo-dimeru (přibližně okolo 60 kD, obrázek i), byl spojen dohromady a spojené frakce byly opět aplikovány na kolonu pro vylučovací chromatografii (podle PCT/EP 95/03031) a puštěny v přítomnosti 0,2% CHAPS nebo 3% betainu. Překvapivě, ačkoliv je protein Els zbaven oblasti své membránové kotvy, lze získat u obou detergentu homogenní populaci specificky spojených El homo-olígomeru se zjevnou molekulovou hmotností 260 až 280 kD (obrázek 2). Tyto homo34

oligomerní struktury mohou obsahovat přibližný počet 9 Els monomerů. Je jasné, že toto je hrubý odhad, protože tvar oligomerů může drasticky ovlivnit jeho zjevnou molekulovou hmotnost, jak je změřena vylučovací chromatografií. Změnou z 0,2% CHAPS na 0,05% CHAPS a opakováním stejného postupu se zjevná molekulová hmotnost dále posunula za rozlišovací schopnost kolony (póry kolony > 600 kD, obrázek 3), což svědčí pro tvorbu částic. Změna z 3% betainu na 0,1% betain poskytla populaci Els oligomerů s podobným chováním (data nejsou ukázána). Mohou být vybrány další detergenty, se kterými může být dosaženo podobné oligomerizace s pomocí detergentu. Oligomerizace vedoucí ke tvorbě částic není unikátní pro CHAPS nebo betain, protože podobné výsledky byly získány s použitím Tween-20 nebo Tween-80 nebo oktylglukasidu. Kromě toho může být možné další odstranění detergentu, které může umožnit vznik ještě větších částic. Přítomnost detergentu není tudíž déle potřebná pro získání částic. Částice mohou být získány pomocí např. SCC, bez detergentu. Je pozoruhodné, že El monomer byl velký přibližně 31 kD, zatímco E2 monomer by velký přibližně 70 kD. Tyto hodnoty se ale mohu lišit v závislostí na glykosylačním stavu proteinu.

Příklad 2

Analýza oligomerních struktur Els vyššího řádu pomocí dynamického rozptylu světla

Aby se potvrdil neočekávaný výsledek, že byly vytvořeny částice, byly preparáty Els v 0,05% CHAPS a 0,1% betainu, připravené podle příkladu 1 nebo v 0,1% betainu, připravené ředěním preparátů v 0,5% betainu, podrobeny analýze pomocí dynamického rozptylu světla (DLS).

·· ··♦· ♦ ···

*♦ · ·· ·· ··

Technika dynamického rozptylu světla měří Brownův pohyb a vztahuje se k velikosti částic, čím je částice větší, tím je pomalejší Brownův pohyb. Rychlost Brownova pohybu je definována vlastností známou jako difúzní koeficient (obvykle označen 'symbolem D). Velikost částice je vypočítána z difúzního koeficientu s použitím Stokes-Einsteinovy rovnice: d(H) = κΤ/3πηΏ, kde d(H) je hydrodynamický průměr, κ je Boltzmannova konstanta, T je absolutní teplota, η je viskozita. Je významné, že měřený průměr je hodnota, která se vztahuje k tomu, jak částice difunduje v tekutině. Proto je nazývána hydrodynamický průměr. Difúzní koeficient je derivován z autokorelační funkce (variace intenzity fluktuace světla s časem). Přístroj používá počítačem řízený korelátor pro automatický výpočet intenzity autokorelační funkce.

Pro měření distribuce velikosti je výše uvedená autokorelační funkce korigována tak, aby se získaly lineární křivky a přístroj je vybaven počítačovým programem pro analýzu distribuce velikosti. Ale technika má omezující předpoklady podobné předpokladům u techniky nazývané víceúhlový laserový rozptyl světla (MALLS) a žádná metoda nemůže být považována za poskytující absolutní data. Výsledky distribuce velikosti z DLS musí být interpretovány spíše jako semikvantitativní indikátory polyčispersity než věrné znázornění distribuce.

Vzorky obsahující částice Els (80-400 pg Els/ml PBS-0,05% CHAPS, 0,1% nebo 0,5% betain) byly pipetovány do měřicí buňky přístroje LSP 3.53 DLS vybaveného s lOmW HeNe laserem (PolymerLabs). Výstup analýzy je poskytnut na obrázcích 4 (Els v 0,05% CHAPS) a 5 (Els v 0,1%. nebo 0,5% betainu) .

Tyto analýzy opravdu potvrdily neočekávaný výsledek, že získané Els struktury byly sférické, monodisperzní částice. Els částice v PBS/0,1% betainu vykazovaly distribuci průměrné velikosti 21,3 ± 4 nm, v PBS/0,5% betainu: 27,9 ± 5 nm, zatímco průměr 12,5 byl získán pro Els v PBS/0,05% CHAPS.

····

Příklad 3

Analýza velikosti a tvaru pomocí elektronového mikroskopu μΐ Els (226 pg/mi v PBS/0,05% CHAPS a 143 pg/mi v PBS 3% betainu) bylo vizualizováno standardním negativním barvením s 1% uranylacetátem na uhlíkem stabilizovaných mřížkách. Vzorek byl aplikován 30 s a pak opláchnut dH₂O před barvením po dobu 5 s a fotografií (obrázek 6).

Statistická analýza poskytla následující výsledky: Els částice v CHAPS měly průměrnou hodnotu 8,7 ± 0,27 (rozmezí 4,3-29,0, 95% Cl 5,4) a Els částice v betainu byly méně homogenní s průměrnou hodnotou 9,7 ± 0,55 nm (rozmezí 4,340,5, 95% Cl 11,0). Překvapivě 3% betainový preparát, který původně vykazoval m.h. 250 až 300 kD, jak analyzováno pomocí SEC, vykazuje ještě větší částice než 0,05% CHAPS preparát, který původně vykazoval m.h. > 600 kD. Původci tudíž udávají hypotézu, že intermediární homo-oligomerní formy Els získané pomocí 3% betainu mohou časem tvořit částice vyššího řádu. tento překvapivý výsledek ukazuje další možnosti získání částic vyššího řádu. Distribuce velikosti částic (obrázek 7) ukazuje, že preparát CHAPS je monodisperzní, ačkoliv je pozorováno napojování do delších částic (až do 29 nm pro 0,05% CHAPS). Protože větší struktury jsou v DLS analýzách nadhodnoceny, výskyt těchto větších částic, i když menšího počtu, může vysvětlit větší průměr získaný DLS analýzou (příklad 2). Rozdíl v průměru může být také vysvětlen faktem, že DLS měří částici v pohybu, zatímco elektronový mikroskop měří statické částice. Je jasné, že imunogeničnost těchto preparátů, jak ukázáno v příkladech níže, je způsobená preparátem jako celkem a může být způsobena průměrnými, menšími nebo většími částicemi, nebo jejich směsí.

·· ··«« ·· ····

Příklad 4

Imunizace šimpanze chronicky infikovaného HCV subtypem lb

Šimpanz (Phil) infikovaný už více než 13 let (5015 dnů před imunizací) HCV kmenem subtypu lb byl očkován El (aa 192 až 326), který pochází z odlišného kmene genotypu lb, s 95,1% identitou na aminokyselinové úrovni (viz také tabulka 2) a který byl připraven tak, jak je popsáno v příkladech 1 až 3. Šimpanz dostal celkem 6 intramuskulárních imunizací, pokaždé 50 pg El v PBS/0,05% CHAPS smíchaném s RIBI R-730 (MPLA+TDM+CWS) podle protokolu výrobce (Ribi lne. Hamilton, MT) . 6 imunizací bylo podáno ve dvou sériích tří injekcí se třítýdenním intervalem a s pauzou 6 týdnů mezi těmito dvěma sériemi. Počínaje 150 dnů před imunizací, během období imunizace a až do 1 roku po imunizaci (viz níže) byly u šimpanze kontinuálně sledovány různé parametry ukazující aktivitu nemoci indukované HCV. Tyto parametry zahrnovaly biochemické vyšetření krve, ALT, AST, gamaGT, biochemické parametry v krvi, virovou infekci v séru, virovou infekcí v játrech a histologické vyšetření jater. Kromě toho imunitní odpověď na imunizaci byla monitorována jak na humorální, tak na buněčné úrovni. Během tohoto období bylo také sledováno, zde se u zvířete nevyskytly jakékoliv vedlejší účinky imunizace, jako například změna chování, klinické příznaky, změna tělesné hmotnosti, teplota a lokální reakce (zarudnutí, otok, indurace). Tyto účinky nebyly detekovány.

ALT hladiny (a zejména gamaGT, data neukázána) jasně poklesly, jakmile protilátková hladina proti El dosáhla svého maxima (obrázek 8). Hladina ALT začala znovu poněkud rychle stoupat, jakmile začala hladina protilátek klesat, ale gamaGT ««♦·

4444 • 4 4 44 · 4 4 4

444 44» 44 • 44 444 · 4 4 4

4·4 4 4 4 4 ·· ·· · 44 44 44 4 zůstávala na nižší úrovni, dokud anti-El zůstávala detekovatelná.

Antigen E2 v játrech poklesl na téměř nezjistitelné hladiny během období, ve kterém byla detekovatelná anti-El, a E2 antigen znovu stoupal krátce po vymizení těchto protilátek. Když se v játrech stal nezjistitelný jádrový antigen a antigen E2, zánět jater významně ustoupil (viz také tabulka 3). To je hlavní důkaz, že vakcína snižuje jaterní poškození, pravděpodobně odstraněním, alespoň částečným, virových antigenů z jejich hlavního cílového orgánu, jater.

Virémie v séru, jak měřeno přístrojem Amplicor HCV Monitor (Roche, Bazilej, Švýcarsko), zůstávala přibližně nezměněna během celého trvání studie.

Detailnější analýzy humorální odpovědi odhalily, že maximální koncový titr dosáhl 14,5 x 10³ (po šesté imunizaci) a že tento titr klesl na nezjistitelné hodnoty 1 rok po imunizaci (obrázek 8) . Obrázek 9 ukazuje, že hlavní epitopy, které mohou být napodobeny peptidy, rozpoznávané B buňkami, jsou lokalizovány v N-koncové oblasti E2 (peptidy V1V2 a V2V3, pro detaily o použitých peptidech viz tabulku 4). Protože reaktivita proti rekombinantni El je vyšší a déle trvá, může být také z tohoto obrázku odvozeno, že protilátky rozpoznávající tyto peptidy představují pouze část celkové protilátkové populace proti El. Zbývající část je namířena proti epitopům, které nemohu být peptidy napodobeny, tj. diskontinuálním epitopům. Tyto epitopy jsou přítomné pouze na kompletní molekule El nebo dokonce na struktuře podobné částici. Takové imunitní odpověď proti El je unikátní, alespoň při srovnání s reakcí, které je normálně pozorována u lidských chronických nosičů HCV (WO 96/13590, Maertens et al.) a u šimpanzů (van Doorn et al., 1996), u kterých stoupají anti-El protilátky při přirozeném průběhu infekce. U těchto pacientů, je anti-El částečně také namířena proti diskontinuálním ·· ···· »· ··*·

epitopům, ale větší část je namířena proti epitopu C4 (± 50 % pacientova séra) a menší část proti V1V2 (kolísající od 2 do 70 % v závislosti na genotypu) a reaktivita proti V2V3 byla zaznamenána pouze výjimečně (Maertens et al., 1997).

Analýza T buněčné reaktivity ukázala, že také tento kompartment imunitního systému je stimulován specificky vakcínou, protože stimulační index těchto T buněk stoupl z 1 na 2,5 a zůstal poněkud zvýšený během sledovaného období (obrázek 10). Je to tato T buněčná reaktivita, která je pozorována pouze u osob reagujících dlouhodobě na terapii interferonem (viz PCT/EP 94/03555, autoři Leroux-Roels et al., Leroux-Roels et al., 1996).

Příklad 5

Imunizace chronického nosiče HCV odlišným subtypem

Šimpanz (Ton) infikovaný už více než 10 let (3809 dnů před imunizací) HCV genotypu la byl očkován El z genotypu lb, pouze s 79,3% identitou na aminokyselinové úrovni (viz také tabulka 2) a který byl připraven tak, jak je popsáno v předcházejících příkladech. Šimpanz dostal celkem 6 intramuskulárních imunizací 50 pg El v PBS/0,05% CHAPS pokaždé smíchaném s RIBI R-730 podle protokolu výrobce (Ribi lne. Hamilton, MT) . 6 imunizací bylo podáno ve dvou sériích tří injekcí se třítýdenním intervalem a s pauzou 4 týdnů mezi těmito dvěma sériemi. Počínaje 250 dnů před imunizací, během období imunizace a až do 9 měsíců po imunizaci (viz níže) byly u šimpanze kontinuálně sledovány různé parametry ukazující aktivitu nemoci indukované HCV. Tyto parametry zahrnovaly biochemické vyšetření krve, ALT, AST, gamaGT, biochemické parametry v krvi, virovou infekci v séru, virovou infekci v játrech a histologické vyšetření jater. Kromě toho imunitní ·« ···· ·· ··*· • · · · · ·«·· ··« · · · · · • · · · · · · · · · · » · ······ ·· · ·* ·· ·· · odpověď na imunizaci byla monitorována jak na humorální, tak na buněčné úrovni. Během tohoto období bylo také sledováno, zde se u zvířete nevyskytly jakékoliv vedlejší účinky imunizace, jako například změna chování, klinické příznaky, změna tělesné hmotnosti, teplota a lokální reakce (zarudnutí, otok, indurace). Tyto účinky nebyly detekovány.

ALT hladiny (a hladiny gamaGT, data neukázána) jasně poklesly, jakmile protilátková hladina proti El dosáhla svého maxima (obrázek 11). Hladiny ALT a gamaGT začaly znovu stoupat, jakmile začala hladina protilátek klesat, ale ALT a gamaGT zůstávala na nižší úrovni během celého období sledování. Hladiny ALT byly dokonce po vakcinaci sníženy (62 ± 6 U/l) ve srovnání s obdobím před vakcinaci (85 ± 11 U/l) . Protože v séru bylo objeveno méně ukazatelů tkáňového poškození, byly tyto nálezy první indikace, že vakcinace indukovala zlepšení jaterního onemocnění.

Hladiny antigenu E2 se staly nezjistitelné v období, ve kterém titr anti-El zůstával vyšší než 1,0 x 10³, ale stal se opět zjistitelný v období snížení hladin El protilátky. Spolu s vymizením HCV antigenů zánět jater výrazně ustoupil od mírné chronické aktivní hepatitidy k minimální formě chronické perzistentní hepatitidy (tabulka 3). To je další hlavní důkaz, že vakcína snižuje jaterní poškození, pravděpodobně odstraněním, alespoň částečným, virových antigenů z jejich hlavního cílového orgánu, jater.

Virémie v séru, jak měřeno přístrojem Amplicor HCV Monitor (Roche, Bazilej, Švýcarsko), zůstávala na přibližně stejných hladinách během celého trvání studie.

Detailnější analýzy humorální odpovědi odhalily, že maximální koncový titr dosáhl 30 x 10³ (po šesté imunizaci) a že tento titr klesl na 0,5 x 10³ devět měsíců po imunizaci (obrázek 11) . Obrázek 12 ukazuje, že hlavní epitopy, které mohou být napodobeny peptidy a jsou rozpoznávané B buňkami, ····

999· » · ·

I» 9

V · ·

99 jsou lokalizovány v N-koncové oblasti (peptidy V1V2 a V2V3, pro detaily o použitých peptidech viz tabulku 4). Protože reaktivita proti rekombinantní El je vyšší a déle trvá, může být také z tohoto obrázku odvozeno, že protilátky rozpoznávající tyto peptidy představují pouze část celkové protilátkové populace proti El. Zbývající část je nejpravděpodobněji namířena proti epitopům, které nemohu být peptidy napodobeny, tj. diskontinuálním epitopům. Tyto epitopy jsou pravděpodobně přítomné pouze na kompletní molekule El nebo dokonce na struktuře podobné částici. Takové imunitní odpověď proti El je unikátní, alespoň při srovnání s reakcí, které je normálně pozorována u lidských chronických nosičů HCV, kteří mají detekovatelné anti-El. U těchto pacientů, je anti-El částečně také diskontinuální, ale větší část je namířena proti epitopů C4 (50 % pacientova séra) a menší část proti V1V2 (kolísající od 2 do 70 % v závislosti na genotypu) a výjimečně byla zaznamenána reaktivita proti V2V3 (Maertens et al., 1997). Protože tento šimpanz je infikován s la izolátem, byla protilátkové odpověď také vyhodnocena na zkřížená reaktivitu s El-la antigenem. Jak lze vidět na obrázku 13, tyto zkříženě reagující protilátky opravdu vznikají, i když tvoří pouze část celkové protilátkové populace. Významná je korelace mezi opětným výskytem vírového antigenu v játrech a vymizením zjistitelných anti-laEl protilátek v séru.

Analýza T buněčné reaktivity ukázala, že také tento kompartment imunitního systému je stimulován specificky vakcínou, protože stimulační index těchto T buněk stoupl z 0,5 na 5 a zůstal zvýšený během sledovaného období (obrázek 14).

• · • · • · • · ·· •e* ··** • · « · • · · ♦ • · · · · · • · » · · • ·· ♦ · ·· • · · • · • * • · ·· ·

Příklad 6

Opětné podávání upomínací dávky El chronickým nosičům HCV

Protože protilátkové titry, jak pozorováno v příkladech 4 a 5 nebyly trvalé a časem se snižovaly, dokonce na nezjistitelné hladiny u šimpanze infikovaného 1b, bylo zkoumáno, jestliže může být tato protilátkové odpověď opět zvýšena podáním další upomínací dávky. Oba šimpanzi byli opět imunizováni třemi po sobě jdoucími intramuskulárními imunizacemi s třítýdenním intervalem (50 pg El smíchané s adjuvans RIBI) . Jak lze soudit z obrázků 8 a 11, odpověď anti-El mohla být opravdu posílena, vírový antigen v játrech opět klesl pod detekční limit, třebaže virová infekce v séru zůstala u Tona konstantní (obrázek 11). Poprvé během sledovaného období byla měřena virémie < 10⁵ ekvivalentů genomu na ml.

Pozoruhodný je nález, že, jak již byl případ první série imunizací, šimpanz infikovaný subtypem lb HCV kmene (Phil) odpovídal nižšími titry anti-El, než šimpanz infikovaný subtypem la HCV kmene (maximální titr v prvním kole 14,5 x 10³ proti 30 x 10³ pro Tona a po dalších upomínacích dávkách pouze 1,2 x 10³ pro Phila proti 40 x 10³ pro Tona). Ačkoliv prospěšný účinek se zdál být u obou zvířat podobný, bylo možné z tohoto pokusu uzavřít, že imunizace chronického nosiče s proteinem El pocházejícím z jiného subtypu nebo genotypu může být obzvláště prospěšná pro dosažení vyšších titrů, možná obchází předem existující a specifickou imunitní supresi vyskytující se u hostitele a indukovanou infikujícím subtypem nebo genotypem. Alternativně mohou nižší titry pozorované v homologním uspořádání (vakcína lb + infekce lb) indikovat vazbu velkého množství protilátek na virus. Indukované protilátky mohou mít tudíž neutralizující kapacitu.

• · · ·

Příklad 7a

Konstrukce NS3 proteinu spojujícího hlavní epitopy, o nichž je známo, že-'koreluj i s kontrolou infekce

Také další epitopy kromě těch z El, mohou být spojovány s odstraňováním HCV během akutní fáze nebo prostřednictvím interferonové terapie. Několik těchto epitopů bylo lokalizováno v NS3 (Leroux-Roels et al., 1996, Rehermann et al., 1996 a 1997, Diepolder et al., 1995 a 1997). Dva z hlavních epitopů jsou epitop CTL mapovaný Rehermannem a spolupracovníky (aa 1073 až 1081) a T buněčný (CD4) epitop mapovaný Diepolderem a spolupracovníky (aa 1248 až 1261). Naneštěstí tyto epitopy jsou rozloženy po celém proteinu NS3. Aby byly alespoň tyto epitopy dostupné, je zapotřebí relativně velkého proteinu (aa 1073 až 1454). Produkce takového velkého proteinu obvykle skýtá malé výtěžky a může mít za následek po vakcinaci odpověď, která je pouze z malé části cílena na důležité epitopy. Produkce menšího proteinu tudíž by byla vhodnější řešení tohoto problému. Tiby se tak učinilo, je nutné v tomto menším proteinu některé epitopy přemístit. S využitím znalosti, že existuje jiný epitop CTL (aa 1169 až 1177), který není spojen s clearancí HCV (Rehermann et al., 1996 a 1997), byla navržena molekula NS3, která začíná v aa 1166 a končí v aa 1468 (tabulka 5). Tento konstrukt již obsahuje epitopy popsané Weinerem a spolupracovníky a Diepolderem a spolupracovníky. Mutací oblasti 1167 až 1180 na sekvenci oblasti 1071 až 1084, byl nerelevantní epitop CTL změněn na epitop, o kterém Rehermann a spolupracovníci zjistili, že je spojen s virovou clearancí. Konstrukt byl dále modifikován tak, aby obsahoval methionin v pozici 1166, aby se umožnila iniciace translace. Tento methionin je odštěpen v E. coli, « · · ·· ·· protože je následován alaninem. Tímto způsobem je zavedení nových epitopů, které se nevyskytují v přirozeném NS3, omezeno na minimum. Alternativně, jestliže by exprese tohoto proteinu byla nešikovná, může být CTL epitop připojen k C-koncové části v aa 1468,' jak detailně zobrazeno v tabulce 5.

Kódující sekvence fragmentu HCV NS-3 byla izolována a exprimována, jak popsáno v práci Meartense et al.

(PCT/EP99/02547, klon 19b, HCV aa 1188 až 1468 byly použity jako výchozí materiál). K tomuto fragmentu byl fúzován CTL epitop, který byl popsán Rehermannem a nevyskytuje se ve fragmentu 19b NS-3. Byly konstruovány obě N-koncová a Ckoncová fúze, protože působení fúze na expresní hladiny, citlivost k proteolytickému rozpadu a funkčnost může být ovlivněna pozicí epitopu.

S použitím plazmidu PIGRI2NS-3, což je E. coli expresní plazmid exprimující fragment NS-3 19b pod kontrolou levostranného promotoru fágu lambda, jako templátu pro PCR, byly NS-3 19b kódující sekvence, fúzované v příslušném pořadí N-koncově a C-koncově s Rehermannovým CTL epitopem (pojmenované NS-319bTn a NS-319bTc, v příslušném pořadí), nejdříve subklonovány do klonovacího vektoru pGEM-T (Promega) za vzniku vektorů pGEM-TNS-319bTn a pGEM-TNS-319bTc. Sekvence amplifikované PCR byly ověřeny prostřednictvím DNA sekvenční analýzy.

V případě fúze sekvence T buněčného epitopu k N-koncové oblasti NS-3, bylo PCR prováděno s dlouhým sense primerem nesoucím CTL epitop a krátkým antisense primerem homologním k sekvencím 3' z NS-3 19b stopkodonu. Sekvence primerů jsou uvedeny níže.

Primer 9038 (sense) ' -GCCATGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTCGTGC GGCTGTTTGCACCCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGG-3¹ (sekvence id. č. 5) • · · · · · • ♦

Primer 1901 (antisense)

5'-TTTTATCAGACCGCTTCTGCG-3' (sekvence id. č. 6)

V přfpadě NS-3 fúzovaného na C-koncovou část, bylo prováděno PCR s krátkým sense primerem homologním k sekvencím 5' startovacího kodonu z NS-3 o velikosti 19b a dlouhým antisense primerem nesoucím epitop CTL, po kterém následovaly stopovací kodony v rámci. Sekvence primerů jsou zobrazeny níže.

Primer 1052 (sense)

5'-AGCAAACCACCAAGTGGA-3' (sekvence id. č. 7)

Primer 9039 (antisense)

5’-CTCTAGACTATTAACCGTGGTAAACGGTCCAGCAAACACCGTTGATGCAGGTC GCCAGGCTGAAGTCGACTGTCTGG-3* (sekvence id. č. 8)

Počínaje kódujícími sekvencemi klonovanými do vektorů pGEM-T, jsou sekvence NS-3 19bT vloženy do expresního vektoru pIGRI2 E.coli. Pro NS-3 19bT fúzovaný na N-koncové části byla kódující sekvence NS-3 19bT izolována jako fragment NcoI/SnaBI o velikosti 379 bp a ligována s fragmenty SnaBI/AllwNI a AlwNI/NcoI z vektoru pIGRI2NS-3, výsledkem byl vektor pIGRl2NS-3Tn. Pro NS-3 19bT fúzovaný na C-koncové části byla kódující sekvence NS-3 19bT izolována jako fragment SnaBI/Spel o velikosti 585 bp a vložena do vektoru pIGRl2NS-3 otevřeného SnaBI/Spel, výsledkem byl vektor pIGRl2NS-3Tc.

Oba vektory pIGRl2NS-3Tn a pIGRI2NS-3Tc byly pak transformovány do E. coli expresního kmene MClO61(pAcI) a po tepelné indukci promotoru lambda P_L byly expresní hladiny analyzovány na SDS-PAGE a westernových blotech s použitím polyklonálního králičího anti-NS-3 séra.

♦ » * Λ * é

Aminokyselinová sekvence proteinu NS-3 19bTn

MATCINGVCWTVYHGRAAVCTRGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTF QVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPNIRTG VRTITTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDIIICDECHSIDSTSILGIGTVLDQAETAGARL WLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSSTGEIPFYGKAIPIEVIKGGRHLIFCHSKKKCDELAA KLSGFGINAVAYYRGLDVSVIPTSGDWWATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFS (sekvence id. č. 1)

Aminokyselinová sekvence proteinu NS-3 19bTc

MGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAY AAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPNIRTGVRTITTGAPITYSTYGKFLADG GCSGGAYDIIICDECHSIDSTS1LGIGTVLDQAETAGARLWLATATPPGSVTVPHPNI EEV ALSSTGEIPFYGKAIPIEVIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLSGFGINAVAYYRGLDVSVIP TSGDVWVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLATCINGVCWTVYHG (sekvence id. č. 2)

Nukleotidová sekvence kódující oblasti NS-3 19bTn

ATGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTCGTGCGGCTGTT

TGCACCCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGAAACC

ACCATGCGGTCCCCGGTCTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGCAGACA

TTCCAAGTGGCCCATCTACACGCCCCCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTAAGGTGCCG

GCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGGTACTTGTCCTGAACCCATCCGTTGCCGCC

ACCTTAGGATTCGGGGCGTATATGTCTAAAGCACATGGTGTCGACCCTAACATTAGA

ACTGGGGTAAGGACCATCACCACGGGCGCCCCCATTACGTACTCCACCTACGGCAA

GTTTCTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGGGGCGCTTACGACATCATAATATGTGATGA

GTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTGGGCATCGGCACCGTCCTGGATCAGGC

GGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACTGCTACACCTCCGGGGTCGGT

CACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCTGTCCAGCACTGGAGAGATCCC

CTTTTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATCAAAGGGGGGAGGCACCTCATTTT

CTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGCAAAGCTATCGGGCTTCGGAA

TCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGATGTGTCCGTCATACCGACTAGCGGAG

ACGTCGTTGTTGTGGCAACAGACGCTCTAATGACGGGCTTTACCGGCGACTTTGACT ·· ·*·· ·· ···· ·9 · · · · · · · · · ·

9·· 9·· · · · · · » ♦ · · « · · »

9 9 + ·*»··· • * fr «9 «» ·· ·*-»

CAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCACCCAGACAGTCGACTTCAGCTAA (sekvence id. č. 3)

Nukleotidová sekvence kódující oblasti NS-3 19bTc

ATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGAAACCACC

ATGCGGTCCCCGGTCTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGCAGACAT

TCCAAGTGGCCCATCTACACGCCCCCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTAAGGTGC

CGGCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGGTACTTGTCCTGAACCCATCCGTTGC

CGCCACCTTAGGATTCGGGGCGTATATGTCTAAAGCACATGGTGTCGACCCTAAC

ATTAGAACTGGGGTAAGGACCATCACCACGGGCGCCCCCATTACGTACTCCACCT

ACGGCAAGTTTCTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGGGGCGCTTACGACATCATAAT

ATGTGATGAGTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTGGGCATCGGCACCGTC

CTGGATCAGGCGGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACTGCTACA

CCTCCGGGGTCGGTCACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCTGTCCA

GCACTGGAGAGATCCCCTTTTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATCAAAGG

GGGGAGGCACCTCATTTTCTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGC

AAAGGTATCGGGCTTCGGAATCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGATGTG

TCCGTCATACCGACTAGCGGAGACGTCGTTGTTGTGGCAACAGACGCTCTAATGA

CGGGCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCACCCA

GACAGTCGACTTCAGCCTGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTAC CACGGTTAA (sekvence id. č. 4)

Příklad 7b

Purifikace proteinů NS-3 19bTn a NS-3 19bTc

Buněčné suspenze E. coli z tkáňových kultur z erlenmeyerových baněk byly rozbity rozrušovačem buněk (CSL, model B) při 140 MPa (1,4 kbar) v 50 mM TRIS, pH 8. Tento lyzát byl pročištěn centrifugací (15 000 g, 30 min, 4 °C) . Supernatant byl odstraněn, protože oba konstrukty, N-koncové i C-koncové části byly získány z peletu. Ukázalo se, že tento pelet byl vysoce stabilní, co se týkalo konstruktu N-koncové části, což umožnilo důkladné promývání (první promytí 2% sarkosyl, 0.5 M guanidiniumchlorid a 10 mM DTT, druhé a třetí promytí 1% Triton X-100, 0,5M guanidiniumchlorid a lOmM EDTA) před solubilizací. To nebyl případ C-koncového konstruktu. Dále byl ' purifikován N-koncový konstrukt. Omytý pelet byl nakonec rozpuštěn v 6M guanidiniumchloridu/50mM Na₂HPO₄, při pH 7,2, a byl sulfonován, jak popsáno v práce Maertense et al. (PCT/EP99/02547). Sulfonovaný pelet byl nejdříve zbaven solí na koloně Sephadex G25 s 6M ureou/50mM triethanolaminem, pH 7,5, a nakonec postupně dvakrát purifikován prostřednictvím aniontoměničové chromatografie ve stejném složení pufru. První výměna aniontů byla prováděna na Hyper DQ (50 pm) koloně (BioSpra lne. Marlborough, Ma, USA) a NS3 byl získán mezi 0,11 a 0,19M NaCl. Po naředění byly tyto frakce aplikovány na druhou Hyper DQ (20 pm) kolonu (BioSpra lne. Marlborough, Ma, USA) a NS3 byl získán ve frakcích obsahujících 0,125M NaCl. Tyto frakce byly zbaveny solí 6M ureou v BS, pH 7,5. Konečná čistota byla určena > 90 % na základě SDS-PAGE po barvení stříbrem. Sekvencování N-koncové části pomocí Edmanovy degradace ukázalo, že tento NS3 má intaktní N-koncovou část, ve které je požadovaný epitop přítomen ve správné sekvenci. Bylo také potvrzeno, že methionin použitý pro začátek translace, byl odštěpen, jak předem určeno.

Příklad 8

Konstrukce E2 proteinu bez hypervariabilní oblasti I

Byla zaznamenána imunodominantní homologní odpověď na HVR I oblast z E2. Tato odpověď má malé použití v pojetí vakcíny, protože pojetí vakcíny je heterologní struktura (kmen vakcíny je vždycky odlišný od kmenů v terénu). Je tedy nutná delece této oblasti, aby vznikl protein E2 indukující protilátky • * · » * · 4 · · 9 · 4 · «9« · 9 * · « · proti konzervativnějším, ale méně imunogenním oblastem E2. Pomocí pečlivé analýzy E2 vedoucí sekvence a E2 hypervariabilní oblasti byl navržen nejlepší konstrukt pro expresi proteinu E2 bez HVR I. Tento konstrukt umožňuje expresi pěptídu E2 začínající v pozici aa 409 místo aa 384. Jako vedoucí sekvence bylo použito 20 aminokyselin C-koncové části El. Ale protože zobrazení této HVR je nejednoznačné, byla vyrobena druhá verze (začínající v aa 412), která má také vysokou pravděpodobnost, že bude štěpena ve správné pozici.

Intermediární konstrukt pvHCV-99 (viz také obrázky 15 a 16)

V expresní kazetě byl měla být kódující sekvence E2-715 uvedena El vedoucím signálním peptidem, začínajícím v Met364. Byla tedy v plazmidu pvHCV-92 (obrázek 15), který obsahuje kódující sekvenci pro E2-715 HCV typ lb s dlouhou verzí El signálního peptidu (začínající v Met347), provedena delece dvojitým štěpením s EcoRI a Ncol, po kterém následovalo doplnění 5'-přesahu doplňující reakcí s T4 DNA polymerázou. Ligace získaných tupých konců (recirkularizace fragmentu o velikosti 6621 bp), měla za následek plazmid pvHCV-99, který kóduje stejný fragment (E2-715) s kratším El vedoucím signálním peptidem (začínajícím v Met364). pvHCV-99 byl uložen v seznamu kmenů jako ICCG 3635. Je jasné, že mohou být použity HCV nebo heterologní signální sekvence.

Plazmidy pvHCV-100 a -101 obsahovaly deleci E2 sekvence, tj. deleci hypervariabilní oblasti (HVR-I). V plazmidu pvHCV100 byly deletovány aminokyseliny 384(His)-408(Ala), zatímco v plazmidu pvHCV-101 byly deletovány aminokyseliny 384(His)411(Ile).

Konstrukce pvHCV-100

Pro konstrukci pvHCV-100 byly navrženy dva oligonukleotidy:

HCV-pr 409 [8749]:

5'- CTT TGC CGG CGT CGA CGG GCA GAA AAT CCA GCT CGT AA -3' (sekvence id. č. 9)

HCV-pr 408 [8750] :

5’- TTA CGA GCT GGA TTT TCT GCC CGT CGA CGC CGG CAA AG -3' (sekvence id. č. 10)

PCR amplifikace (denaturace 5 min 95°C> 30 cyklů amplifikace skládajících se z nasedání primerů v 55 °C, polymerizace v 72 °C a denaturace v 95 °C, vše po 1 min, elongace 10 min v 72 °C) templátu pvHCV-99 s Gpt-pr [3757] a HCV-pr 408 [8750] měla za následek fragment o velikosti 221 bp, zatímco amplifikace s HCV-pr 409 [8749] a TKr-pr [3756] měla za následek fragment o velikosti 1006 bp. Oba PCR fragmenty se navzájem překrývaly o 19 nukleotidů. Tyto dva fragmenty byly spojeny a amplifikovány pomocí PCR s primery Gpt-pr [3757] a TKr-pr [3756]. Výsledný fragment o velikosti 1200 bp byl štěpen s EcoRI a HindlII a ligován do vektoru pgsATA18 [ICCG 1998] (5558 bp) štěpeného EcoRI/HindlII. Tento konstrukt, pvHCV 100, byl analyzován restrikční a sekvenční analýzou a uložen v seznamu sekvencí jako ICCG 3636.

Konstrukce pvHCV-101

Pro konstrukci pvHCV-101 byly navrženy dva oligonukleotidy:

• 4 ·»·· « « 4 · · · • t 4 4 4 4 4 4

4*4 4 4 4 4 + 4 4

4*4 4 4 4 » 4 4 i «4 44 44 4

HCV-pr 411 [8747] :

5'- CTT TGC CGG CGT CGA CGG GCA GCT CGT AAA CAC CAA CG -3' (sekvence id. č. 11 )

HCV-pr 410 [8748]:

5'- CGT TGG TGT TTA CGA GCT GCC CGT CGA CGC CGG CAA AG -3' (sekvence id. č. 12)

PCR amplifikace templátu pvHCV-99 s Gpt-pr [3757] a HCV-pr 410 [8748] měla za následek fragment o velikosti 221 bp, zatímco amplifikace s HCV-pr 411 [8747] a TKr-pr [3756] měla za následek fragment o velikosti 997 bp. Oba PCR fragmenty se navzájem překrývaly o 19 nukleotidů. Tyto dva fragmenty byly spojeny a amplifikovány pomocí PCR s primery Gpt-pr [3757] a TKr-pr [3756]. Výsledný fragment o velikostí 1200 bp byl štěpen s EcoRI a HindlII a ligovén do vektoru pgsATA18 [ICCG 1998] (5558 bp) štěpeného EcoRI/HindlII. Tento konstrukt, pvHCV 101, byl analyzován restrikční a sekvenční analýzou a uložen v seznamu sekvencí jako ICCG 3637.

Všechny plazmidy byly kontrolovány sekvenční analýzou a uloženy v seznamu kmenů Innogenetics. Pro každý plazmid byly provedeny dvě mini-DNA izolace (PLASmíx) za sterilních podmínek a spojeny. Byla určena koncentrace DNA a pomocí restrikční analýzy bylo provedeno QA. Purifikovaná DNA byla použita pro tvorbu rekombinantního viru vakcinie, jak popsáno (Maertens et al., PCT/EP9S/03031). Rekombinantni viry vvHCV100 a vvHCV-101 byly pěstovány na Věro buňkách ověřených WHO. Po dvou kolech plakové purifikace byl expresní produkt analyzován prostřednictvím westernových blotů, jak popsáno (Maertens et al., PCT/EP9S/03031). Proteiny byly vizualizovány specifickou anti-E2 monoklonální protilátkou (IGH 212, kterou je možné získat od vynálezců v Innogenetics N.V., Zwijnaarde, Belgie) s předběžně vypočítanou molekulovou hmotností 69 a 37 kD pro vvHCV-100 a 68 a 35 kD pro vvHCV-101. Tyto molekulové • « 9 · • r ·· ··

9 · 9 * 9 9 · · 9» 9 « · • 9 9 99 9 · 99 9 hmotnosti ukazují na přítomnost glykosylovaného a neglykosylovaného proteinu E2, což bylo potvrzeno ošetřením vzorků s PNGaseF před analýzou westernovými bloty. Toto ošetření mělo za následek detekci pouze jednoho proteinu o velikosti 37 kD a 35 kD pro vvHCV-100 a vvHCV-101, v příslušném pořadí.

Aminokyselinová sekvence zralého E2 pocházejícího z pvHCV-100

QKIQLVNTNGSWH1NRTALNCNDSLQTGFFAALFYKHKFNSSGCPERLASCRSIDKFAQGWG

PLTYTEPNSSDQRPYCWHYAPRPCGIVPASQVCGPVYCFTPSPWVGTTDRFGVPTYNWGAN

DSDVLILNNTRPPRGNWFGCTWMNGTGFTKTCGGPPCNIGGAGNNTLTCPTDCFRKHPEATY

ARCGSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRFEAACNWTRGERCDLED

RDRSELSPLLLSTTEWQILPCSFTTLPALSTGLIHLHQNIVDVQYLYGVGSAWSLVIK (sekvence id. č. 13)

Aminokyselinová sekvence zralého E2 pocházejícího z pvHCV-101 QLVNTNGSWHINRTALNCNDSLQTGFFAALFYKHKFNSSGCPERLASCRSIDKFAQGWGPLT

YTEPNSSDQRPYCWHYAPRPCGIVPASQVCGPVYCFTPSPVWGTTDRFGVPTYNWGANDSD

VLILNNTRPPRGNWFGCTWMNGTGFTKTCGGPPCNIGGAGNNTLTCPTDCFRKHPEATYARC

GSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRFEAACNWTRGERCDLEDRDR

SELSPLLLSTTEWQILPCSFTTLPALSTGLIHLHQNIVDVQYLYGVGSAWSLVIK (sekvence id. č. 14)

Příklad 9

Částice El s dále zlepšenou imunogeničností

Jak vysvětleno v příkladu 1, Els protein byl purifikován podle protokolu popsaného v PCT/EP 95/03031, Maertens et al. Tento protokol zahrnuje kovalentní modifikaci cysteinů (volné cysteiny a cysteiny zapojené do intermolekulových můstků, těchto po redukci cysteinových můstků pomocí DTT) s použitím maleimidových derivátů (N-ethylmaleimid a biotinmaleimid, oba « » • · · · jodacetamid kompletního blokované získané od firmy Sigma). Jako alternativní metoda blokování maleimidu byly také vyhodnocovány aktivní halogeny. Tyto sloučeniny, t j . aktivní halogeny, blokují volné cysteiny prostřednictvím alkylace. Jako příklad byl hodnocen aktivní halogen (jodacetamid, Merck). Pro purifikaci El byl použit stejný protokol, jak popsán v Maertens et al. (PCT/EP. 95/03031), ale místo maleimidových sloučenin byl použit Protein Els získaný tímto postupem reagoval během purifikačního postupu podobně jako proteiny maleimidem. Při konečném snížení koncentrace detergentu na 0,05% CHAPS nebo změně na 0,5% betain, jak popsáno v příkladu 1, byly získány podobné částice, jak určeno pomocí DLS. Ale při imunizaci myší s tímto acetamidem modifikovaným Els byl zjištěn překvapivý výsledek.

Celkem tři skupiny myší, každá po 6, byly imunizovány s Els s použitím tří injekcí s třítýdenním intervalem, každá injekce obsahovala 5 pg Els ve 100 pg/ml PBS a smíchané se stejným objemem adjuvans RIBI (R-700). První skupina dostala El-maleimid formulovaný v 0,05% CHAPS, druhá skupina dostala El-acetamid také formulovaný v 0,05% CHAPS, zatímco třetí skupina dostala El-acetamid formulovaný v 0,12% betainu. Nakonec byla všem myším odebrána krev 10 dnů po třetí imunizaci. Pro každé zvíře individuálně byly zjišťovány koncové titry (definované jako ředění séra, které má stále za následek OD dvakrát vyšší než hodnoty pozadí) proti Elmaleimidu a El-acetamidu. Obrázek 17 ukazuje tyto koncové titry, uvedené jako průměr se standardními odchylkami. U myší, které dostaly El-maleímíd, byla vyvolána pouze protilátková odpověď, která byla schopná rozpoznat epitopy obsahující maleimid (vůbec žádná reaktivita na El-acetamid), u myší, které dostaly El-acetamid byla jasně vyvolána protilátková odpověď proti pravým epitopům El, protože protilátky byly reaktivní jak proti El-acetamidu, tak proti El-maleimidu. To • · · · « · • » « · bylo jasně prokázáno dalším pokusem, ve kterém protilátky pro specifické oblasti El byly zjišťovány s použitím peptidů, které nebyly modifikovány ani acetamidem,, ani maleimidem. Výsledky, jak ukázáno na obrázku 18, ukazují, že myši imunizované El-acetamidem (formulované v CHAPS a betainu) produkovaly protilátkovou odpověď, která byla schopná rozpoznávat peptidy V1V2, V2V3, V3V4, V5C4, C4V6. Protože V6 nebyla část Els, původci uzavírají, že byly vyvolány protilátky proti C4, V3 (V3V4 je pozitivní, zatímco V4V5 není) a V1V2. Myši imunizované Els-maleimidem produkovaly pouze velmi nízkou odpověď proti peptidům V1V2 a V2V3. To zdůraznilo ještě jednou fakt, že rozumně vysoký titr měřený pro tyto myší protilátky proti Els-maleimidu je hlavně namířený proti epitopům závislým na maleimidu. Kromě toho původci byli schopní prokázat, že Els-acetamid indukovaná odpověď je částečně typu Thl, protože podstatné množství indukovaných

protilátek	je subtypí	i IgG2(a+b). Množství	IgG2	je dokonce
vyšší pro	betainovou	formulaci ve srovnání s	formulací CHAPS
(obrázek 9	) . Z těchto	výsledků je uzavíráno,	že	HCV obalové
proteiny,	ve kterých	alespoň jeden cystein	(ale	potenciálně
více než	jeden cystein) je alkylován,	j sou	mimořádně
imunogenní	proteiny.
Proto	tedy byl	acetamidem modifikovaný	El	formulovaný

v betainu také použit pro upomínací dávky pro šimpanze Phila a Tona. Oba šimpanzi byli imunizováni opět dvěma následujícími intramuskulárními imunizacemi s třítýdenním časovým intervalem (50 pg El smíchaný s adjuvans RIBI jako pro příklady 4 a 5) . Jak může být usuzováno z obrázků 20 a 21, anti-El odpověď mohla být opravdu znovu posílena, a to na vyšší hladiny, než byly získané v předešlých imunizacích po dvou injekcích. Tato titrace byla prováděna proti standardu, což je směs tří lidských sér s vysokým titrem anti-El (získaných od chronických nosičů HCV). Anti-El titr těchto sér byl definován • 4 · · 4 · ·· 44 ¢4 • 4 • · 4 44 4 444

4 4 4 4 4 44

444 4 4 4 4 4 4 4 * · 4 · 4 » 44

444 4444 4 4 4 jako jedna jednotka/ml. U šimpanze Phila (obrázek 20) byly indukovány titry dvakrát tak vysoké, jako u lidských nosičů pouze po dvou imunizacích. U šimpanze Tona (obrázek 21) byly indukovány titry až 140 krát vyšší. Toto zdůraznilo ještě jednou vyšokou imunogeničnost těchto El částic.

Příklad 10

Alkylovaný El je lepší kvality pro diagnostické použití

Els-acetamid, jak je popsán v příkladu 9, byl dále hodnocen jako antigen pro detekci anti-El protilátek ve vzorcích séra lidských chronických nosičů HCV. Jako příklad byly tyto antigeny navázány na membrány LIA, a proužky byly zpracovány v podstatě tak, jak popsáno v práci Zreina et al. (1998). Nejdříve byly hodnoceny vzorky séra od 72 dárců krve, aby se zjistila optimální koncentrace antigenu El, která může být v testu použita pro vyloučení „falešně pozitivních výsledků. Ukázalo se, že pro Els-maleimid je tato koncentrace 8 pg/ml, zatímco pro Els-acetamid koncentrace až do 50 pg/ml neměla za následek falešně pozitivní výsledky (žádné vzorky nevykázaly relativní obarvení vyšší než 0,5). S použitím 8 a 50 pg/ml, v příslušném pořadí, pro Els-maleimid a Els-acetamid byl ve 24 vzorcích séra od HCV chronických nosičů prováděn screening na protilátky proti Els. Jak je ukázáno v tabulce 6, Els-acetamid měl jasně za následek více vzorků s pozitivním výsledkem (67 % proti 38 % pro Els-maleimid). Nebyl nalezen žádný vzorek, který měl pozitivní výsledek pouze pro Elsmaleimid. U vzorků, které měly pozitivní výsledek jak na Elsmaleimid tak na Els-acetamid, byla reaktivita pro druhý uvedený vyšší. Z tohoto příkladu může být uzavřeno, že alkylované obalové proteiny HCV jsou lepší antigeny pro • · ···· »· ···· ·· • · ·»· ·«·· < · · · · · · «· ♦ · « * · * · * · · detekci lidských protilátek, než obalové proteiny modifikované maleimidem.

Příklad 11

Produkce smíšených částic obsahujících El a E2

Els a E2s (vvHCV-44) byly produkovány a purifikovány tak, jak je popsáno v Maertens et al. (PCT/EP 95/03031), kromě faktu, že modifikace maleimidem byla nahrazena alkylací s použitím jodacetamidu. Els a E2s v 3% empigenu samotné nebo jako ekvimolární směs byly injikovány na kolonu Superdex-200 PC 3.2/30 ekvilibrovanou v PBS/0,2% CHAPS. Tato kolona je navržena pro použití s přístrojem SMART™ HPLC od firmy Pharmacia LKB, Švédsko). Byl prováděn screening frakcí prostřednictvím tří odlišných sendvičových testů ELISA. Pro tyto testy ELISA byly El-(IGH 207) a E2-(IGH 223)specifické monoklonální protilátky použity pro potahování v koncentraci 2 pg/ml. Frakce z gelové filtrace byly inkubovány v ředění 1/2500. Dvě další monoklonální protilátky El (IGH 200) a E2 (IGH 212), konjugované s biotinem, byly použity pro detekci navázaného antigenu. Pro vyvolání navázaného biotinu na žlutou barvu, která byla odečítána ve 450 nm, byl použit systém streptavidin-HRP/TMB.

Systém ELISA byl použit v homologním (anti-El potah/antiE1 detekce nebo anti-E2 potah/anti-E2 detekce) a heterologním uspořádání (anti-El potah/anti-E2 detekce) . Druhý teoreticky detekuje pouze částice, ve kterých jsou inkorporovány oba El a E2. Reaktivní frakce byly sloučeny, koncentrovány na filtru s limitem 10 kD a opět prodělaly chromatografii na koloně Superdex-200 v PBS/0,05% CHAPS. Všechny tyto frakce byly testovány na reaktivitu s použitím odlišného uspořádání testu ELISA. Jak lze usoudit z obrázku 22, přidání E2 k El nemá za • φ φφφφ φ» φφφφ

ΦΦ φφφ φφφ • φ φ φφφ φφ φφφ φφφφ φφ φφ φ φ φ φφ φφ důsledek větší posun v retenčním čase, ve srovnání se samotným El, což indikuje, že částice jsou vskutku stále přítomny. Tyto částice obsahují jak El, tak E2, protože pouze v tomto uspořádání heterologní ELISA dává pozitivní výsledky.

Příklad 12

Produkce smíšených částic obsahujících El ze 2 odlišných genotypů

Els genotypu lb a genotypu 4 (vvHCV-72) byly produkovány a purifikovány tak, jak je popsáno v Maertens et al. (PCT/EP

95/03031), kromě faktu, modifikace maleimidem byla nahrazena alkylaci s použitím jodacetamidu pro genotyp lb. Els-lb a Els-4 v 3% empigenu samotné nebo jako ekvimolární směs byly injikovány na kolonu Superdex-200 PC 3.2/30 ekvilibrovanou v PBS/0,2% CHAPS. Tato kolona je navržena pro použiti s přístrojem SMART™ HPLC od firmy Pharmacia LKB, Švédsko). Hlavní frakce obsahující protein byly sloučeny, koncentrovány na filtru s limitem 10 kD a opět prodělaly chromatografii na koloně Superdex-200 v PBS/0,05% CHAPS. Všechny tyto frakce byly testovány na reaktivitu s použitím uspořádání testu ELISA, které může detekovat pouze částice obsahující El obou genotypů. Pro tento test ELISA byl použit potah streptavidinu v koncentraci 2 pg/ml. Frakce z gelové filtrace byly inkubovány v ředění 1/2500. Pro detekci navázaného antigenu byla použita El monoklonální protilátka (IGH 200), která rozpoznává pouze El genotypu 1 a 10. Pro vyvolání testu na žlutou barvu, která byla odečítána ve 450 nm, byl použit kozí-anti-myší-HRP/TMB systém. Jak lze usoudit z obrázku 23, přidání El-4 k El-lb nemá za důsledek větší posun v retenčním čase proteinů, což indikuje, že částice jsou vskutku stále přítomny. Tyto částice obsahují oba proteiny El, ·· ···· ·· ·· ·· · tj. Els genotypu lb a genotypu 4, protože pouze v tomto uspořádání dává ELISA pozitivní výsledky.

·♦ ···· * · ·*

SEZNAM LITERATURY

Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C., Blight K., Xu Jí; Hahn Y.S., Rice C.M., Dubuisson

J. Formation of native hepatitis C virus glycoprotein complexes. J. Virol. 1997: 71: 697-704.

Diepolder HM, Zachoval R, Hoffmann RM, Wierenga EA, Santantonio T, Jung MC, Eichenlaub D, Pape GR. Possible mechanism involving T-lymphocyte response to non-structural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis C virus infection. Lancet 1995: 346: 1006-1007.

Diepolder HM, Gerlach JT, Zachoval R, Hoffmann RM, Jung MC, Wierenga EA, Scholz S, Santantonio T, Houghton M, Southwood S, Sette A, Pape GR. Immunodominant CD4+ T-cell epitope within nonstructural protein 3 in acute hepatitis C virus infection. J. Virol., 1997: 71: 6011-6019.

Fancy, D.A., Melcher, K., Johnston, S. T. and Kodadek, T. New chemistry for the study of multiprotein complexes: the six-histidine tag as a receptor for a protein crosslinking reagent. ChemBiol (1996)3: 551-559.

G.T. Hermanson in Bioconjugate Techniques (1996) Part I section 1.43 and section 2.2.1, Academie Press San Diego CA, USA.

Houghton M. Immunity to HCV: The čase for vaccine development. 4th International meeting on hepatitis C Virus and related viruses. Sattelite Symposium: New appraoch to prevention and therapy of HCV infection. March 7 1997, Kyoto, Japan.

Leroux-Roels G, Esquivel CA, DeLeys R, Stuyver L, Elewaut A, Philippe J, Desombere I, Paradijs J, Maertens G Lymphoproliferative responses to hepatitis C virus core, El, E2, and NS3 in patients with chronic hepatitis C infection treated with interferon alfa. Hepatology 1996: 23: 8-16.

Maertens G. and Stuyver L. Genotypes and genetic variation of hepatitis C virus. In: The

Co ···· ·· ·4«4 4« 4 • 4 »4* 4 4 4 44 • 4 · 4 4 4 4 4 4

4 4 44 » 444 4 4 «44 · 4 ♦ 4 «4 4 « 4» 4 4 44 «4« molecular medicine of viral hepatitis. Ed: Harrison T.J. and Zuckerman A.J. 1997

Major M.E. and Feinstone S.M. The molecular virology of hepatitis C. Hepatology 1997: 25:1527-1538.

Maertens G., Depla E., Ducatteeuw A., Vandeponseele P., Bosman F., Venneman A., de Martynoff G., Stuyver L., Dekeyser F., Vandeperre B., Zrein M. And Buyse M.-A. Hepatology 1997: 26: 186A.

Rehermann B, Chang KM, McHutchinson J, Kokka R, Houghton M, Rice CM, Chisari FV. Differential cytotoxic T-lymphocyte responsiveness to the hepatitis B and C viruses in chronically infected patients. J Virol 1996 70: 7092-7102.

Rehermann B, Takaki A, Liebetrau A, Luda S, Seifert U, Salha K, Manns M, Wiese M. Characterization of the cytotoxic and helper T cell response in patients 18 years after a single source outbreak of HCV infection. Hepatology, 1997:26:406A

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor, NY USA van Doom LJ, Kleter B, Pike I, Quint W. Analysis of hepatitis C virus isolates by serotyping and genotyping. J Clin Microbiol 1996; 34: 1784-1787.

Villa E., Buttafoco P., Grottola A., Scarcelli A.„ Giannini F., Manerti F. Neutitalizing antibodies against HCV: liver transplant as an experimental model. J. Hepatol. 1998: 28:

Weiner AJ, Erickson AL, Kansopon J, Crawford K, Muchmore E, Houghton M, Walker CM Association of cytotoxic T lymphocyte (CTL) escape mutations with persistent hepatitis C virus (HCV) infection. Princess Takamatsu Symp, 1995: 25: 227-235.

Yi M., Nakamoto Y„ Kaneko S., Yamashita T., Murakami S. Delineation of regions important čí ·· ···· *♦ ··· · ·· · ·· ··· · · · ·· • · · · · · ··· • · · ·««··»· »· · · · *· · · *· · for heteromeric association of Hepatitis C virus El andE2. Virol. 1997a: 231:119-129.

Zauberman, A., Nussbaum, O., Dan, E., Eren, R., Ben-Moshe, O., Arazi, Y., Berre, S., Lubin, I., Shouval, D., Galun, E., Reisner, Y. and Dagan, S. The trimera mouše systém: a mouše model for hepatitis C infection and evaluation of therapeutic agents. June 6-9, 1999; Oral 4.3. In: 6th International Symposium on Hepatitis C & Related Viruses. Bethesda USA

Zrein, M., Louwagie, J., Boeykens, H., Govers, L., Hendrickx, G., Bosman, F., Šablon, E., Demarquilly, C., Bonifáce, M. and Šaman, E. (1998) Assessment of a new immunoassay for serological confirmation and discrimination of human T-celI lymphotropic virus infections. Clin. Diagn. Lab. Imm. 5: 45-49.

6% • · · ·· ·· ··

CM

CA ro U £ . . ><

CO o 3 ro U m f*5 O\ c 04 B

T-( i> £ o» B

V} 5 04 í>

CO

Els kanonická sekvence HCV-B

2 í>

co

ΟΊ co Z . O > « £ . ,

Ή

N

O

Λ

+> n rt H	·“»	o u sa	O\	« Os	ri < M U o o	<1 w v*	a ▼H τΉ	•v T·^	r~
O\	tH	1·^
>	>	U	U	U	u	u	c	0	0	ΰ
Λ	ϋ	υ	u	U	U	u	u	u	o	u	u
O	a	a	a	Π«	a	a	a	a	a	a	a

192 a 326 Els, které jsou zcela konzervativní,

(TJ	>1 c
Φ	Φ
•H	>o rtj
N	c
Φ	N
e	>1
φ υ	> 3
•H	O
N	m
O	•r-i
O-i	Φ
*	C

·· ···4 o

X

Ή

Ο

Ή η

£ «

ίΒ rl >

b »

Η □

β £

Φ «9 'Φ β

Φ

Ν

cn	o:		0$	Pí
un	XI	*	H	H	<£>
09	a	*		E^	09
	Eh			EH	m
	Eh		E-<	E-·
	Oj		Oj	Oj
		*	>	>
	3	*	W	W
	0	K	< *
	§	*	§	a
	t-H E-<	*	3
	<		3
	>	*	XI	xi
	£		Eh	t< ·
	Oj		Oj	Oj
	Ej		E<
	2	*	X)	XI
	e		i	<
	u		O	6
	05		oí	Pí
	W		w	w

<

S

Ο

W £

υ

Oj >

Ο

Oj

Εη

Κ

XI

Η <

Ο ť

Η

Κ

Ο

Oj >Η

C0

Ο a

ο

Q £

W

	>H		u
	•rl		Q
	>H		s
	Pj	>6	h
		•rl	£*
	CO	w
»	H	0	P*
	w	β	hI O
	>1	X	H
	β	0	W

Ή ο

j?

Ο •rl β

ο $

Η

W

C0

S

W υ

I

0	O	o	O	o
* w	ω	>	>	>
* t5		XI	XI *	H
		XI	XI	XI

Q

Η ο

νο

Φ

Λ!

Η β

«

Η ο

φ

Ž ³ φ φ m η

Φ rH (Ο

Η •Η

X!

Oj β

Ο

Ε-* a

>1

P

Λ a

CO

Tabulka

··	··<· • •	• «	·« • •	···· • •	·· ·
• •	• •	• •	« •	• ·
•	•	•	•	•	• ·	•	•
	··	•		··	*·	• ·		• ·

o

Oj fO

C >φ ε

N

Ή

C >

o	CD	•rd
o	•a		p		'5*1	'fd
LO	a	+1	fd		a	a
	Ό		a	w	a	a	co
vř	'fd	r-	φ	Cti	Ή	Ή	1
i—1	>N	CO	a	O	ε	ε ι	1 CM

—
i—1	Ό		+1
•rd	Φ
X	>a	1
CL,	a	O CM

c >

•H

P •H

N

O a

>φ	'>1	'fd
a			44
i—1	X	>N	>N	QO
•cd		>Φ	><D	1
CO	o	P	P	+ CD

m

W &

a.

o in

X u>

Ή

O n>

C •rl o

Λ!

>

a o

O •rl •P

8· •P 'Φ a

<u >

o

M ·§ a

H >0

Π3 a

5*,

P

P a

OT

Ό a φ O >a E-ι O-i a

a

	>φ					Ή
	ε		a			a
	N		>			1—I
o		CD	H			*f0
o	'fd		4-J			ε
o	a	+1	fd		a	•H
	Ό		a	X	•o	C	CM
o	'<TS	CM	φ	X	'fd	•H	1
co	>N	CD	a	o	>N	ε i	! i—i

Ή

C >

•H

4->

•H

N

O i—i a r*d

+1	>φ a	'>1 44	'fd a
CO		i—!	X	X	a
1	LO	•rd		Φ	Ή
CM	CO	CO	o	1—i	ε

a a P

Ό -H

	Ή	a	>
		ď>						P	Ό	•H
		o			a			Ή	•H	P
		i—1			a			P	P	44
		—·			φ		P	a	•r4	a
					a		>φ	a	P
				•rd		a	φ	a	'a
		£			P		'a	x	a	44
		X			a	φ	N		φ	υ
	9	>			a	•rd		irl	X	•rd
		—-			a	ir4	a		Cn
	t—1	o	a		.Η	o	a	a	Ή	o
	ω	X	M		a	r-d	i—1		a	i—1
ε			•—	a	φ	o	'a	1—1	>	o
a	a	a		a	>	44	P	a	•rd	P
a	P	P	E-i	P	a	m	a	P	P	m
'Φ	•rd	•d	a	'Φ	a	•rd	o	o	44	•H
CD		E-i		a	CQ	X	X	X		X

··· ·«·· · · · ·· · ·· ·· ·» ···

so	T	ΓΟ	©		o
cq	rf	\©	σ\	rq	T
fS	<s	rq	cí	m	fO
cq	Γ4	©	r-t	00	rl
O\	r-t	m	Ό	OO	©
	Γ4	rq	cq	cq

o rH m

'rl >0

VO	e*	o	Ό	O\
m	N	m	t**	Λ
o	O	rw	r-i	©
r^	rH	rH	rM	r-(

cq	f0		Tt*	©
>	>	>		u	>
r-4	cq	m	K	m	rr
>	>	>	hM	>	O

Π)

Λ!

Η i

Ό •rl

4J

3>

H

W

E z z

Tabulka oo es ce

44 • <	44·4 •	44 • 4	44·· •	• 4 4 4	44
• ·	•	4 4	4 4	4 4
44	4	• 4	44	44	4 4

Φ o

c $

Φ «

'«j c

n>

í>

O

Λ £

Φ o

c s

Φ m

'Φ tí

Φ

N

O

M •rl

Í>1
Λ	C •H r~4 Φ m >1 λ; o ň •H ε Π3 'Φ c Φ N O
O	P
4-1	•H
•H	>P
a	a
Φ
	Ή c
	r—i
υ	O
	Λ4 0
fi
rH	Ή
'fÚ	>n
ε	i—I
•H	fO
	Ό
•H
ε	• ·
	o C!
o	Φ
c	>N
Φ	P
>N	-P
p	Ό
-P	O
Ό	a
O
CL	φ
>Φ	>m
+J	Ό
•H	o
	tí
O	•o
>	Φ
Ό	•r-i

fO \O es es

Tabulka 6

antigen	Els-maleimid	Els-acetamid
pg/ml	8	50
17758	2	4
17761	0	0.5
17763	0	03
17766	0	1
17767	0	1
17771	0.5	2
17773	0	0
17775	0	03
17776	0	0.5
17777	0.5	2
17779	0	0
17784	3	4
17785	03	2
17786	0	2
17789	2	4
17790	2	4
17794	2	4
17795	0	1
17796	0	0
17798	0	03
17820	2	4
17825	2	3
17827	2	4
17842	1	2
#pos	9	16
%pos	38	67

• · · · · ·

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Oligomerní částice, která se v podstatě skládá z HCV obalových proteinů a má průměr 1 až 100 nm.

   2. Oligomerní částice podle nároku 1 mající průměr 2 až 40 nm.

   3. Oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, ve které aminokyselinová sekvence HCV obalového proteinu je kanonická sekvence pocházející z izolátové, subtypové, kmenové nebo rodové kanonické sekvence.

   4. Oligomerní Částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 eventuálně obsahující epitopy jiné než HCV (non-HCV).

   5. Oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde alespoň jeden cysteínový zbytek obalového proteinu je alkylován.

   6. Oligomerní Částice podle nároku 5, kde cysteínový zbytek je alkylován prostřednictvím aktivních halogenů, ethyleniminu nebo N-(jodethyl)trifluoracetamidu.

   7. Oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde alespoň jeden cysteínový zbytek obalového proteinu je mutován na přírodní aminokyselinu, výhodně vybranou ze skupiny skládající se z methioninu, kyseliny glutamové, glutaminu a lysinu.

   8. Oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde obalové proteiny jsou HCV El proteiny nebo jejich části.

   • · · ·

   69 ·· · ·* ··

   9. Oligomerni částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde obalové proteiny jsou HCV Els proteiny nebo jejich části.

   10. Oligomerni částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde obalové proteiny jsou HCV E2 proteiny nebo jejich části.

   11. Oligomerni částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde obalové proteiny jsou proteiny sekvence id. č. 13 a/nebo sekvence id. č. 14 nebo jejich části.

   12. Oligomerni částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kde obalové proteiny jsou kódovány nukleotidovou izolátovou kanonickou sekvencí, nukleotidovou subtypovou kanonickou sekvencí, nukleotidovou druhovou kanonickou sekvencí nebo nukleotidovou rodovou kanonickou sekvencí nebo její částí.

   13. Oligomerni částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde obalové proteiny jsou směsí proteinů HCV El, HCV Els, HCV E2 a/nebo sekvencí id. č. 13 a/nebo sekvencí id. č. 14 nebo jejich Částí.

   14. Oligomerni částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, kde obalové proteiny nebo jejich části pocházejí z odlišných HCV kmenů nebo genotypů.

   15. Oligomerni částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kde obalové proteiny nebo jejich části jsou směs obsahující HCV obalové proteiny z jednoho kmene nebo genotypu HCV a alespoň z jednoho dalšího kmene nebo genotypu HCV.

   16. Oligomerni částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, kterou lze získat způsobem charakterizovaným následujícími kroky:

   • · * ·

   I purifikace HCV obalových proteinů v roztoku, prvního eventuálně zahrnuj ící použití volitelného detergentu, eventuálně disulfidovou vazbu, zahrnuj ící použití činidla Štěpícího

   - eventuálně zahrnující použití alkylačního činidla,

   II - nahrazení roztoku purifikovaných HCV obalových proteinů detergentem nebo solí, což má za následek oligomerní částice,

   III - purifikace oligomerních částic tvořených po nahrazení, eventuálně zahrnující další snížení koncentrace detergentu nebo soli z kroku II.

   17. Oligomerní částice podle nároku 16, přičemž volitelný první detergent je Empigen-BB, přičemž detergent z kroku II je CHAPS, oktylglukasid, Tween nebo jakýkoliv jiný detergent a kde sůl je betain.

   18. Oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 16 nebo 17, přičemž Empigen-BB je použit v koncentraci 1 % až 10 % a kde CHAPS nebo Tween je použit v koncentraci 0,01 % až 10 % nebo betain je použit v koncentraci 0,01 % až 10 %.

   19. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 16 až 18 vyznačující se tím, že produkuje oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14.

   20. Způsob přípravy oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:

   I - purifikace HCV obalových proteinů v roztoku, eventuálně zahrnující použití volitelného prvního detergentu, • · · · • · · · eventuálně zahrnující použití činidla štěpícího disulfidovou vazbu,

   - eventuálně zahrnující použití alkylačního činidla,

   II - nahrazení roztoku purifikovaných HCV obalových proteinů detergentem nebo solí, což má za následek oligomerní částice,

   III - purifikace oligomerních částic tvořených po nahrazení, eventuálně zahrnující další sníženi koncentrace

   detergentů nebo soli z kroku II. 21. Způsob přípravy oligomerní částice podle nároku 20 vyznačuj ící se t i m, že volitelný první detergent je Empigen- BB, přičemž detergent z kroku II je

   CHAPS, oktylglukasid, Tween nebo jakýkoliv jiný detergent a kde sůl je betain.

   22. Způsob přípravy oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 20 nebo 21 vyznačující se tím, že Empigen-BB je použit v koncentraci 1 % až 10 % a kde CHAPS nebo Tween je použit v koncentraci 0,01 % až 10 % nebo betain je použit v koncentraci 0,01 % až 10 %.

   23. Přípravek vyznačující se tím, že obsahuje oligomerní částici podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22.

   24. Přípravek podle nároku 23 vyznačující se tím, že také obsahuje HCV jádrový antigen, P7, El, E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a/nebo NS5B proteiny nebo jejich části.

   25. Přípravek tím, že NS3 sekvenci danou podle nároku protein, nebo sekvencí id. č.

   24 vyznač jeho části, má 1 nebo sekvencí u j i c i se aminokyselinovou id. č. 2.

   • · · · · · • · · • * · · · · • · · • · ♦ · · • « · · • · · • · · 72 • · · « · · * • 9 · 26. Použití oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25 pro výrobu přípravku HCV vakcíny. 27 . Použití oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 1

   až 25 pro-indukci imunity proti HCV u chronických nosičů HCV.

   28. Použití oligomerní částice podle nároku 27 pro indukci imunity proti HCV u chronických nosičů HCV před jakoukoliv další léčbou, současně s ní nebo po ní.

   29. Použití oligomerní částice podle nároku 27 pro indukci imunity proti HCV u jedinců infikovaných HCV před transplantací jater nebo po ní, nebo po předpokládané infekci.

   30. Použití oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 28 pro profylaktickou indukci imunity proti HCV.

   31. Použití oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 28 pro indukci imunity . proti HCV, kdy oligomerní částice nebo přípravek jsou použity jako část série časových intervalů a sloučenin.

   32. Oligomerní částice nebo přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25 pro použití jako HCV vakcína.

   33. Oligomerní částice nebo přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25 pro indukci imunity proti HCV u chronických nosičů HCV.

   34. Oligomerní částice nebo přípravek podle nároku 33 pro indukci imunity proti HCV u chronických nosičů HCV před jakoukoliv další léčbou, současně s ní nebo po ní.

   • · · · • · · • * · • · ·

   73 *· ’

   35. Oligomerní částice nebo přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25 pro indukci imunity proti HCV u jedinců infikovaných HCV před transplantací jater nebo po ní, nebo po předpokládané infekci.

   36. Oligomerní částice nebo přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25 pro profylaktickou indukci imunity proti HCV.

   37. Oligomerní částice nebo přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25 pro indukci imunity proti HCV, kdy oligomerní částice nebo přípravek jsou použity jako Část série časových intervalů a sloučenin.

   38. Purifikovaný jednoduchý HCV obalový protein.

   39. Purifikovaný jednoduchý HCV obalový protein podle nároku 38, kde obalový protein je El nebo Els.

   40. Přípravek vyznačující se tím, že obsahuje purifikovaný jednoduchý HCV obalový protein podle kteréhokoliv z nároků 38 nebo 39.

   41. Přípravek podle nároku 40 vyznačující se tím, že je pro použití jako HCV vakcína.

   42. Použití přípravku podle nároku 40 jako HCV vakcíny.

   43. Použití přípravku podle nároku 40 pro výrobu HCV vakcíny.

   44. Specifické protilátky vytvořené proti oligomerní částici podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25 nebo proti purifikovanému jednoduchému HCV obalovému proteinu podle kteréhokoliv z nároků 38 až 40.

   • 4 • •44

   4 ·

   45. Použití specifické protilátky podle nároku 44 pro léčbu nebo prevenci HCV infekce.

   46. Souprava pro detekci HCV antigenů vyznačuj ící se t i m, že obsahuje specifickou protilátku podle nároku 44 .

   47. Souprava pro detekci HCV protilátek přítomných v biologickém vzorku vyznačující se tím, že obsahuje ve vhodné nádobce oligomerní částici podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25, nebo purifikovaný jednoduchý HCV obalový protein podle kteréhokoliv z nároků 38 až 40.

   48. Souprava pro detekci T buněčné odpovědi se vztahem k HCV vyznačující se tím, že obsahuje oligomerní částici podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25 nebo purifikovaný jednoduchý HCV obalový protein podle kteréhokoliv z nároků 38 a z 4 0 .

   49. Imunotest pro detekci HCV protilátky vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje:

   1) poskytnutí oligomerní částice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25 nebo purifikovaného jednoduchého HCV obalového proteinu podle kteréhokoliv z nároků 38 až 40, nebo jejich části,
2. 2) inkubaci biologického vzorku s oligomerní částicí nebo HCV obalovým proteinem v podmínkách, které umožňují tvorbu komplexů protilátka-antigen,
3. 3) stanovení, zda je vytvořen komplex protilátka-antigen obsahující oligomerní částici nebo HCV obalový protein.