FR2887260A1 - Sequences nucleotidiques mutees du virus de l'hepatite c - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique mutée, cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou un fragment de la protéine Core, et le cas échéant la protéine E1 et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine E1 et / ou de la protéine E2 du virus de l'hépatite C. ladite séquence nucléotidique mutée étant telle qu'elle code dans un cadre de lecture 0 pour la susdite protéine, mais qu'elle ne permet pas l'expression d'une protéine ARFP ou de fragments d'une protéine ARFP de plus de 11 acides aminés. codés dans le cadre de lecture +1 par la susdite séquence nucléotidique non mutée, pour la préparation d'un vaccin ou d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des infections liées au virus de l'hépatite C.
Description
SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES MUTEES DU VIRUS DE
L'HEPATITE C L'invention concerne des séquences nucléotidiques mutées du virus de l'hépatite 5 C. Il n'existe pas à ce jour de vaccin destiné à prévenir les infections par le virus de l'hépatite C (VHC). Parmi les approches envisagées, la préparation de vaccins sous-unitaires, c'est à dire de vaccins contenant une partie seulement du virus (par opposition aux vaccins entiers), est prometteuse.
Le génome du VHC code pour une unique polyprotéine, c'est à dire un ensemble de trois protéines structurales (Core, El et E2) et de sept protéines non-structurales (P7. NS2, NS3, NS4A, NS4B. NS5A et NS5B), les différentes protéines étant obtenues à partir de la polyprotéine par clivage protéolytique.
La protéine Core du VHC est l'antigène viral le plus conservé et est la cible de l'immunité cellulaire de type B et T. Elle constitue donc un antigène vaccinal de choix. Toutefois, cet antigène est associé à toute une série de propriétés, dont certaines sont indésirables dans une formulation vaccinale, c'est à dire des propriétés immunosuppressives (Large M.K. et al., .1 Immun. 162:931-938, 1999 Soguero C. et al., .1. I îro/. 76:9345-9354, 2002; Yoa Z.Q. et al., .1. Virol. 78:6409-6419).
A moins que de telles propriétés puissent être supprimées, il semble difficile à ce jour d'utiliser la protéine Core et / ou les séquences codant pour la protéine Core pour concevoir un vaccin.
Un certain nombre de publications récentes ont démontré qu'un ensemble de protéines codées par un cadre de lecture alternatif, et désignées sous le terme générique d'ARFP (pour alternative reading frame protein ), de taille 16-17 kDa, sont codées in vitro par la séquence nucléotidique codant pour la protéine Core sauvage. La famille ARFP serait responsable, en partie ou en totalité, des mécanismes modulant l'immunité qui sont associés à Core. y compris les mécanismes immunosuppresseurs.
Des études in vitro indiquent que des glissements du cadre de lecture au niveau du ribosome ainsi que des initiations internes peuvent conduire à la traduction de protéines de type ARFP (Branch et al., Semin. Liver Dis. 25:105-117, 2005).
Un premier événement de glissement du cadre de lecture a été décrit pour les séquences de génotype la (Xu Z. et al., EMBO.1 20:3840-3848, 2001; Varaklioti A. et al., .1 Biol. Chem. 277:17713-17721, 2002; Roussel J. et al., J. Gen. Virol. 84:1751-1759, 2003). Le ribosome initie la traduction du codon AUG du cadre ouvert de lecture de la polyprotéine du VHC et. aux codons 9-10. il rencontre une séquence riche en AAA qui stimule un événement de glissement du cadre de lecture au codon Il, lequel événement de glissement consiste en un déplacement du ribosome dans le cadre de lecture +1. De plus, on a montré qu'une séquence de glissement telle que ce signal AAA est également capable de déplacer le ribosome dans le cadre de lecture +2/ 1 (Xu et al., .1 I%irol., 77:1578-1583, 2003).
D'autres événements de glissement du cadre de lecture ont été décrits pour une Io séquence du génotype lb (Boulant et al., J. Biol. Chem., 278:45785-45792, 2003). Selon ce compte-rendu. ARFP est produite du fait de deux événements de glissement du cadre de lecture survenant à deux positions dans l'ARN du VHC qui forment des éléments structuraux de l'ARN hautement conservés. Le premier de ces glissements du cadre de lecture est situé au codon 42 dans les cellules procaryotes.
Enfin, selon d'autres travaux (Vassilaki, J. Rio/. Chem. 278:40503-40513, 2003), l'expression d'ARFP semble pouvoir survenir sans traduction de séquences initiales de Core, et sans glissement du cadre de lecture. Selon ces travaux, l'expression d'ARFP pourrait être initiée entre les codons 80 et 88 et également au niveau du codon 26 (Baril et al., Nucl. Acid Res. 33:4474-1486).
Quelques documents de l'art antérieur mentionnent des séquences nucléotidiques mutées de la protéine Core permettant de limiter ou d'abolir l'expression d'ARFP mais entraînant une modification de la protéine Core. Les mutations décrites consistent notamment à introduire des codons STOP dans le cadre de lecture +1. C'est le cas des publications de Varaklioti et al. et de Vassilaki et al. sus-citées.
Toutefois. l'état de la technique révèle qu'il n'a jamais été envisagé d'utiliser des séquences nucléotidiques mutées du VHC, contenant notamment des codons STOP dans le cadre de lecture +1, pour préparer des vaccins contre le VHC. D'ailleurs, l'art antérieur ne divulgue pas de séquences nucléotidiques mutées permettant à la fois d'obtenir une expression normale de la protéine Core normale et d'abolir l'expression d'ARFP.
L'un des aspects de l'invention est de fournir de nouvelles séquences nucléotidiques mutées permettant la préparation de médicaments, de vaccins, de méthodes de diagnostic ou de pronostic, dans le cadre du traitement ou de la prévention des pathologies liées à une infection par le VHC Un autre aspect de l'invention est de fournir des séquences nucléotidiques mutées codant pour tout ou partie de la polyprotéine du VHC. induisant de façon moindre par rapport aux séquences nucléotidiques sauvages les mécanismes immunosuppresseurs mentionnés ci-dessus.
L'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique mutée. cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou un fragment de la protéine Core. et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2 du virus de l'hépatite C, ladite séquence nucléotidique mutée étant telle qu'elle code dans un cadre de lecture 0 pour la susdite protéine, mais qu'elle ne permet pas l'expression d'une protéine ARFP ou de fragments d'une protéine ARFP de plus de 11 acides aminés, codés dans le cadre de lecture +1 par la susdite séquence nucléotidique non mutée, pour la préparation d'un vaccin ou d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des infections liées au virus de l'hépatite C. La séquence nucléotidique mutée en question peut être dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique représentant la totalité ou une partie seulement du génome du VHC.
Avantageusement, la séquence nucléotidique d'origine comprend la totalité du 20 génome du VHC.
Avantageusement, la séquence nucléotidique d'origine comprend un fragment du génome du VHC, notamment un fragment codant pour la protéine Core ou un fragment codant pour la protéine Core et le peptide signal de E1 ou un fragment codant pour la protéine Core. le peptide signal de El et les 15 acides aminés suivants de El ou un fragment codant pour la protéine Core et la protéine El ou un fragment codant pour la protéine Core. la protéine El et la protéine E2.
La séquence nucléotidique selon l'invention peut également comprendre des nucléotides (éventuellement modifiés chimiquement) ou un ou des fragments d'ADN supplémentaires, notamment à l'extrémité 5' et / ou à l'extrémité 3' et notamment être encadrée par des séquences nucléotidiques différentes de celles correspondant au génome du VHC.
Le cadre de lecture 0 est défini par rapport au codon ATG signalant le début de la protéine Core. Les expressions cadre de lecture +1 et cadre de lecture +2 s'entendent par référence audit cadre de lecture O. Il faut noter que la protéine codée par la séquence nucléotidique mutée de l'invention comprend ou est constituée par la protéine Core dans sa totalité, et ce bien que la protéine ARFP, qui est en principe exprimée à partir de la séquence nucléotidique d'origine non mutée, contienne un fragment de la protéine Core.
L'invention repose sur l'introduction dans une séquence d'une ou plusieurs mutations appropriées par rapport aux séquences nucléotidiques de souches sauvages du VHC, ces mutations permettant notamment d'introduire un ou plusieurs codons STOP dans le cadre de lecture +1 et éventuellement dans le cadre de lecture +2, lesquelles mutations n'affectent pas l'expression ex vivo de la protéine Core et abolissent l0 substantiellement l'expression de protéines ARFP et tout ou partie des mécanismes immuno-suppresseurs associés aux protéines ARFP et / ou à la protéine Core.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée d'une séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine E l et / ou de la protéine E2, de souches de génotype 1 a, 1 b, 2, 3, 4, 5 ou 6 du virus de l'hépatite C. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus. dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, de souches de génotype la ou lb du virus de l'hépatite C. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core et un fragment de la protéine El, représentée par la séquence générale du génotype 1 a (SEQ ID NO: 1) ou par la séquence consensus du génotype la (SEQ ID NO: 23) ou par la séquence générale du génotype lb (SEQ ID NO: 2) ou par la séquence consensus du génotype lb (SEQ ID NO: 24) ou par une séquence présentant plus de 90 % d'homologie avec l'une de ces séquences, ou par la séquence consensus du génotype 2 (SEQ ID NO: 3) ou par la séquence consensus du génotype 3 (SEQ ID NO: 4) ou par la séquence consensus du génotype 4 (SEQ ID NO: 5) ou par la séquence consensus du génotype 5 (SEQ ID NO: 6) ou par la s séquence consensus du génotype 6 (SEQ ID NO: 7) ou par une séquence présentant plus de 70 % d'homologie avec l'une de ces séquences.
On désigne par homologie la proportion d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques. Cette homologie peut être mesurée en cherchant à aligner lesdites séquences en utilisant un algorithme tel que défini dans Altschul et al. (Nucl. Ariel Res. 25:3389, 1997) ou en utilisant par exemple le logiciel Clustal W, bien connu de l'homme du métier et décrit dans Thompson et al. (Nucl. Acid Res. 22:4673, 1994).
Les séquences générales SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 et les séquences consensus SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 24 correspondent à 618 nucléotides. Les 573 premiers nucléotides de ces séquences correspondent à l'alignement de séquences de souches des divers génotypes sus-cités codant pour la protéine Core et le peptide signal de El. Les 45 derniers nucléotides correspondent à un autre alignement de séquences codant pour les 15 acides aminés de la protéine El qui suivent le peptide signal de El.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype l a, 42 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession des séquences sont les suivants: AF009606; AF01 1751 AF011752; AF011753; M67463 M62381 AF290978; M55970; AF271632 AY695436; AY695437; M74812; AY231582; M74811; M74808 M62382 D00831; D10749; AF268569; AF268570; AF268571; AF268572 M62321 AF268574 AF268576; AF268578 AF268579; AF268577; AF268580 AF268573 AF268575: M74804; AF511950 AF529293; AJ278830; X84079 L12353 AY615798 M74805; AY885238; A. 1557443; A.1557444.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype 1 a, 290 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession des séquences sont les suivants: AF009606; AY231582 M67463; AY746844; AY746845; AY746850 AY746847; AY746849 AY746853 AY746846; AY746848; AY746854; AY746851; AY746852 AY746897 AY746900; AY746901; AY746903; AY746908; AY746904; AY746902 AY746907; AY746906; AY746905; AY746899; AY746898; AY746751 AY746752 AY746760; AY746757; AY746759; AY746762 AY746753 AY746758 AY746756; AY746761 AY746755; AY746754; M62321 AY885238 A.1557443; AJ557444; AY746632; AY746635 AY746643: AY746633 AY746638 AY746636: AY746637 AY746642; AY746639 AY746640 AY746634 AY746641 AY746702; AY746706; AY746704; AY746707 AY746710 AY746703; AY746708; AY74671 I; AY746709; AY746713; AY746705 AY746712 AY746855 AY746857 AY746860 AY746859 AY746858 AY746861 AY746862 AY746866 AY746867 AY746870 AY746871 AY746872: AY746865 AY746869 AY746863 AY746864 AY746868 AY746883 AY746884 AY746885 AY746887 AY746888 AY746891 s AY746894 AY746892 AY746893 AY746895 AY746896; AY746890; AY746886 AY746889 AY746775 AY746777 AY746776 AY746783 AY746781; AY746778 AY746779 AY746782 AY746785 AY746740 AY746741; AY746744 AY746742 AY746745 AY746743 AY746750 AY746746; AY746747 A Y 746749 AY746748 AY746921 AY746922 AY746926 AY746929 AY74693] AY746928 AY746930 AY746924 AY746925 AY746927 AY746923 AY746798 AY746799 AY746800 AY746805 AY746801 AY746803 AY746802 AY746806 AY746808 AY746807 AY746809 AY746804 AY746821 AY746823 AY746826 AY746829 AY746830 AY746828 AY746824 AY746825 AY746822 AY746831 AY746827 AY746620 AY746625 AY746630 AY746631 AY746628 AY746627 AY746622 AY746629 AY746623; AY746626 AY746621 AY746624 AY746763 AY746764 AY746768; AY746770 AY746773; AY746765 AY746767 AY746774 AY746766; AY746771 AY746772 AY746769 AY746810 AY746816 AY746817 AY746815 AY746813 AY746814 AY746819 AY746820 AY746812 AY746811 AY746818 AY746932 AY746937 AY746939 AY746935; AY746942 AY746934 AY746936 AY746940 AY746933 AY746938 AY746941 AY746680: AY746684 AY746687 AY746688 AY746686 AY746690 AY746682 AY746685 AY746689 AY746683 AY746909 AY746920 AY746911 AY746914 AY746917 AY746912 AY746916; AY746919 AY746918 AF529293 AY746656 AY746659 AY746660; AY746666 AY746663; AY746665 AY746661 AY746658 AY746662; AY746664 AY746657; AY746832 AY746838 AY746839 AY746840 AY746843 AY746835 AY746841 AY746833 AY746837 AY746836 AY746834 AY746842 AY746667 AY746671 AY746672 AY746675 AY746676 AY746677; AY746673 AY746669 AY746670 AY746674 AY746668 AY746678 AY746679 AY746714 AY746718 AY746715 AY746719 AY746720: AY746724 AY746722 AY746716 AY746726 AY746723 AY746721; AY746725 AY746717 AY746610 AY746611: AY746617 AY746618 AY746613 AY746615 AY746616 AY746614 AY746619 AY746612 AY746727; AY746728 AY746729; AY746736 AY746739 AY746734 AY746730 AY746733; AY746735 AY746738; AY746731 AY746737 AY746732 AY388455.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype 1 b. 182 séquences ont été alignées. les numéros d'accession des séquences sont les suivants: AB008441 AB008442 AB008443; AB049090 AB049091; M74807 AF165051 AF165052 AF207759 AB 154177; AB 154178 AB 154203; AB 154204; AB 154206; AB 154179; AB 154180 AB 154185 AB 154186; AB 154189; AB 154194; AB 154205; AB 154191; AB 154192; Io AB 154193 AB 154199 AB 154201 AB 154202; AF313916; AB 154190; AB 154181; AB 154182; AB 154183; AB 154184 AB 154200 AB 154187; AB 154188 AB 154195 AB 154196; AB 154197; AB 154198; AY070174; AY587844; D50481; D50485 AF207766 AF165057; AF165058 AB049101; AF208024; AF207761; AJ132996 A.1132997 M74809 M74815; D10934; AB049099; AB049089; AB049098 AF207752 AF207753; AY045702 M74814; M74806; M86779 D14484; U45476 AB008445 AB008447; AB008446 AB191333 AF207773 AB049087 AB049096 AF165055 AF165056; AB049095; X61593; X61595; L20498 S76540 AB016785 L12354; AF165063; AF165064; D50480 D50483; A.1238799 AJ238800; M74810 AF207770 AB049088; AB049100; AF207767; AF165059 AF165060 AF207756; AF207763 AF207774; AF207772; AF165045; AF165046; AF207755 AF165053; AF165054; AF333324; D89872; D90208; X65924; M74888; AF054247; AF054250; AF054255 AF054258 AF054248; AF054252; AF054257 AF054249; AF054254 AF054253 D10750 AF054259; D00832; D13558 AF207758; AB049093 M74813; AF165047 AF165048; AY460204; M58335; L02836; A.1000009; AF207754 M96362; U16362; AF207771; D10687; D10688; U45461; U45462; U45463; D10074; D11168; D11355; AB049092 D00574; D89815; AB049097: AB080299 D85516; AF207762; AF207765: AF165049 AF165050; AF207760: AF483269; AY587016; D30613; D45172; X61591; X61596; X61594; AF356827 AF176573 U01214; AF207764; AF139594; D13406; S62220; AF207757; AF165061; AF165062; L38318; D63857; X61592; M84754; AB049094; D50482; D50484; AY308072 AF207769; AY236366.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype lb, 149 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants: AB049087 AB049089 AB049092; AB049094; AB049095; AF165055; AF165056; AF333324; D90208.
D89872: AF165053; AF165054; AB049096; AB049090; AF165063 AF165064 AB049088; AB049091; AF165051; AF165052; AB049093; AF403238; AF165057 AF165058 AF165061 AF165062 AF402571 AF403228 AF403237 AF403233 AF403234 AF403229 AF403231 AF403236 AF403232 AJ238799 AJ238800 AB049097 AB049100; AB080299; AF165059; AF165060; AB154177 AB154178 AB 154179 AB 154180; AB 154189; AB 154190; AB 154193; AB 154185; AB 154186 AB 154187 AB 154188; AB 154199 AB 154203; AB 154204 AB 154201 AB 154202 AB154205: AB154206 AB154191; AB154192; AB154181. AB154182: AB154194; AB 154200: AB 154195 AB 154196 AB 15418 3 AB 154184: AB 154197: AB 154198 Io AF483269: AY746598; AY746601 AY746604; AY746605 AY746607 AY746609 AY746608; AY746603; AY746602; AY746599; AY746600; AJ849974; AY070174; AY587844; AY746786; AY746795; AY746790; AY746789 AY746788; AY746797 AY746787 AY746796 AY746793 AY746794 AY746792 AY746791; U45461; U45462; U45463; AB049101; A. 1849973 AB049098 M58335; AF139594; AB049099; AF356827; AJ132996; AJ132997 AY746644 AY746645; AY746646; AY746655; AY746649; AY746654 AY746650 AY746653; AY746647 AY746651 AY746652; AY746648 U45476 AY746691 AY746694 AY746696 AY746693; AY746700; AY746701 AY746695 AY746699; AY746692; AY746698: AY746697 AY308072 AF403239 AF165049; AF165050; AY746873; AY746881; AY746874; AY746882 AY746880 AY746875; AY746879 AY746878; AY746876; AY746877.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype 2, 71 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants: AB030907 D10077 AF238486; AY232738; AY232739; AY232742; AY232743 D10988 AY232744 AY232745 AY232730 AY232731 AY232732 AY232733; AY232734 AY232735 AY232736; AY232737; AY232740; AY232741; AY232748 AY232749; AY232746; AY232747; AB031663; AY070214 AY070215 D31972 L38326; D50409; L38321 L38322; L38319; L38324 L38328; L38329 L38320 L38330: L38337; D49754 D49757 L29631; L38333; D49745; D49755 D49746: D49756: AB047639; AB047640; AB047641; AF177036; D00944 AB047644; AB047645 AF169004; AF238481 AF238483; AF238482 D10075 AF169003; L38334; L38336; AF169005; AF238484; L38335; AF169002; AB047642; AF238485; AB047643; AY746460; AY236365.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype 2, 6 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants: AB030907; D10988 AB031663 AB047639; D00944; D50409.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype 3, 43 séquences ont été alignées.
Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants: AF046866; D14305 D17763; D14311; L12355; D14307; D14309; X76918; D28917 D16612; D16620 D16618; AY231584; AY231585; AY231586; AY231587; AY231588; AY231589 AY231590 D49374; D11443; D16616; D37840; D37839; AY434137 AY434140 AY434153 D16614; D49747; D49749; D6382I; D49750; D49752; D49753.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype 3, 14 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants: AF046866 D17763; D28917 AY231584 AY231585; D49374; AY231586; AY231587; AY231590 AY231589 AY231588; AF216786; AF216787; AF216788.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype 4, 10 séquences ont été alignées.
Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants: D45193; Yl 1604 L38338; U10238; L29587; L29624; L38323; L38332; U10236; U10235.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype 4, 9 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants: AJ401094; AJ401096 Y11604; AJ401095; AJ401 101; AJ401097; AJ401098; AJ401 100 AJ401099.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype 5, 4 séquences ont été alignées. les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants: AF064490; D50466; L.29577; Y13184.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype 5, 2 séquences ont été alignées. Elles portent les numéros d'accession suivants: AF064490; Y13184.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype 6, 40 séquences ont été alignées.
les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants: AY231583; D37841; D84262; AY859526; D88469; D88476; D88475; L38339; D88473; Y12083; D37848; D37849; D37850; D84265; D88465; L38331; D88466; D84264; D88468; D88470; D88471; D88472; AY434111; D49748; D63822; D49758; D49751; D31971; D88474; D88477; D88478; D37843; D37844; D37845; D38078; D37846; L38341; L38340; D84263; D88467.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype 6, 4 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants: AY231583 D84262; AY859526; Y12083. i0
Tous les numéros d'accession précédents font référence à la base de données GenBank.
Par ailleurs il faut noter que les séquences générales représentées par SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 sont des séquences dans lesquelles des lettres génériques sont utilisées en plus des quatre lettres réelles A, T, G, C, et ce conformément aux conventions usuelles: Y = C ou T; R = A ou G: K = G ou T; M = A ou C; W=AouT; S = C ou G V = A ou C ou G; H = A ou C ou T; D = A ou G ou T; B = C ou G ou T; N = A ou C ou G ou T. Ainsi les séquences générales SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 correspondent à une forme générique des séquences issues de diverses souches dont les l0 numéros d'accession ont été donnés ci-dessus.
Les séquences SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 24 sont des séquences consensus correspondant respectivement aux génotypes 2 à 6. 1 a et 1 b, qui sont formées à partir des seules lettres A. T, G ou C et représentent des séquences dans lesquelles chaque nucléotide à une position donnée est le nucléotide le plus fréquent parmi les souches alignées du génotype en question à la position donnée.
La séquence nucléotidique mutée de l'invention peut être dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core et un fragment de la protéine El, représentée par l'une des séquences associées au génotype la, lb, 2, 3, 4, 5 ou 6 du VHC, dont le numéro d'accession est répertorié dans les listes ci-desssus.
La séquence nucléotidique mutée de l'invention peut également être dérivée d'une séquence elle-même dérivée par dégénérescence du code génétique de l'une des séquences consensus SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 ou de l'une des séquences des souches de génotype 1 a, 1 b. 2, 3. 4. 5 ou 6 dont les numéros d'accession figurent ci-dessus.
Avantageusement l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, présentant une ou plusieurs mutations par rapport à la séquence nucléotidique d'origine codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core du virus de l'hépatite C. Avantageusement l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie cidessus, comportant une ou des mutations qui correspondent à l'introduction d'un ou plusieurs codons STOP dans le cadre de lecture T1 de la séquence nucléotidique d'origine.
Les codons STOP sont de la forme TAG, TAA ou TGA si l'on prend pour référence le brin d'ADN codant, ou UAG, UAA ou UGA si l'on prend pour référence l'A RN transcrit.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence 5 nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, présentant également une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la restauration d'un ou de plusieurs codons synonymes dans le cadre de lecture 0.
En effet, la présence d'une ou de plusieurs mutations permettant d'introduire un ou plusieurs codons STOP dans le cadre de lecture +1 peut modifier les acides aminés to codés dans le cadre de lecture 0, auquel cas il est avantageux, afin d'éviter cette modification, d'introduire une ou plusieurs mutations supplémentaires, généralement situées 1, 2 ou 3 nucléotides après la ou les mutations introduisant le ou les codons STOP dans le cadre de lecture +1. Ces mutations supplémentaires annulent l'effet des mutations liées au codon STOP dans le cadre +1 en permettant de restaurer le codage des acides aminés normaux dans le cadre O. Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n (par exemple 3, 6, 9...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+1 (par exemple 4, 7, 10...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+2 (par exemple 5, 8, Il...).
Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le cadre de lecture H nécessite une seule mutation ponctuelle (substitution).
Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le cadre de lecture +1 nécessite deux mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le cadre de lecture +1 nécessite trois mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n (par exemple 3. 6. 9...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+1 (par exemple 4, 7, 10...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+2 (par exemple 5. 8. 1 1...).
Selon un mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme lO dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture + 1 nécessite une seule mutation ponctuelle (substitution).
Selon un mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 nécessite deux mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 nécessite trois mutations ponctuelles (substitutions).
Des mutations peuvent également permettre d'introduire des codons STOP dans le cadre de lecture +2. Bien que la famille ARFP soit normalement exprimée dans le cadre de lecture +1. il peut être avantageux d'introduire de tels codons STOP dans le cadre de lecture +2 puisqu'un glissement ducadre de lecture en +2 / -1 est toujours possible malgré tout.
Tout comme dans le cas du cadre de lecture +1, des mutations supplémentaires peuvent également permettre de restaurer des codons synonymes dans le cadre de lecture 0 à la suite des mutations permettant d'introduire des codons STOP dans le cadre de lecture 0.
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n (par exemple 3, 6, 9...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+l (par exemple 4, 7, 10...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+2 (par exemple 5, 8, 1 1...).
Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le 5 cadre de lecture +2 nécessite une seule mutation ponctuelle (substitution).
Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le cadre de lecture +2 nécessite deux mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le cadre de lecture +2 nécessite trois mutations ponctuelles (substitutions).
Io Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n (par
exemple 3. 6. 9...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+1 (par exemple 4, 7, 10...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+2 (par exemple 5, 8. 1 1...).
Selon un mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 nécessite une seule mutation ponctuelle (substitution).
Selon un mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 nécessite deux mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 nécessite trois mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie cidessus, présentant une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la modification de la structure secondaire de l'ARN transcrit correspondant à ladite séquence nucléotidique mutée et / ou à l'optimisation de la traduction dudit ARN transcrit.
Ces mutations supplémentaires ont en particulier pour but d'éviter les motifs suivants: - les boîtes TATA, les sites Chi et les sites d'entrée du ribosome; les séquences riches en AT ou riches en GC; - les séquences répétées et les structures secondaires relativement stables de l'ARN; les sites donneurs et accepteurs d'épissage (cryptiques), les points de branchement.
En particulier, l'élimination des boîtes TATA permet de limiter la transcription, l'élimination des sites Chi permet de limiter la recombinaison. L'épissage est avantageusement évité dans la mesure où il peut permettre un changement du cadre de lecture.
De plus, les répétitions indirectes de plus de 8 nucléotides sont avantageusement évitées dans la mesure du possible afin d'éviter la constitution de structures secondaires stables sur l'ARN et de ce fait d'éviter les événements d'initiation interne. En outre, les mutations supplémentaires peuvent avoir pour but d'éviter les codons rares, afin d'augmenter l'efficacité de la traduction (disponibilité relative des différents ARNt).
Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivée par mutation de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8 de la souche J de génotype lb du virus de l'hépatite C, codant pour la protéine Core.
La souche.1 du génotype 1 b a été décrite notamment par Kato et al. . Proc. Na!!. 25 Acad. Sci. USA 87:9524-9528 (1990).
Selon un mode de réalisation alternatif, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivée par mutation de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 9 de la souche J de génotype 1 b du virus de l'hépatite C, codant pour la protéine Core et le peptide signal El.
L'ensemble constitué par la protéine Core et le peptide signal H (codé par exemple par SEQ ID NO: 9) est baptisé capside.
Selon un mode de réalisation alternatif, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivée par mutation de la séquence nucléotidique de la souche J de génotype 1 b du virus de 10 l'hépatite C représentée par SEQ ID NO: 10, codant pour la protéine Core et un fragment de El ou par SEQ ID NO: 11. codant pour la protéine Core et la protéine El ou par SEQ ID NO: 12, codant pour la protéine Core, la protéine El et la protéine E2.
L'expression codant pour la protéine Core et un fragment de El signifie dans 5 le cas de la SEQ ID NO: 10 codant pour la protéine Core, le peptide signal de E1, et les 15 acides aminés de E1 suivant ce peptide signal .
Avantageusement, [invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 8 ou 9 ou 1 0 ou l 1 ou 12, et présentant un ensemble de mutations portant sur l'un des triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 ou 293-295, ledit ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides du triplet de nucléotides susmentionné, introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15.
La séquence représentée par SEQ ID NO: 13 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10, avec une substitution T-G en position 66 pour introduire un codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 22/23).
La séquence représentée par SEQ ID NO: 14 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10, avec une substitution C-A en position 139 pour introduire un codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 46/47), et une substitution C-->A en position 141 pour restaurer un codon synonyme.
La séquence représentée par SEQ ID NO: 15 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10, avec une substitution T-A en position 295 pour introduire un codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 98/99), et deux substitutions pour restaurer un codon synonyme, à savoir C-->G en position 296 et A-C en position 297.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 8 ou 9 ou 10 ou 11 ou 12, et présentant deux ensembles de mutations portant respectivement sur deux triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295. chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant deux codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18.
La séquence représentée par SEQ ID NO: 16 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10, avec une substitution T-G en position 66 pour introduire un premier codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 22/23), une substitution C--iA en position 139 pour introduire un deuxième codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 46/47), et une substitution C-A en position 141 pour restaurer un codon synonyme.
La séquence représentée par SEQ ID NO: 17 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10, avec une substitution T-G en position 66 pour introduire un premier codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 22/23), une substitution T-A en position 295 pour introduire un deuxième codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 98/99), et deux substitutions (C-G en position 296 et A->C en position 297) pour restaurer un codon synonyme.
La séquence représentée par SEQ ID NO: 18 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10, avec une substitution C-*A en position 139 pour introduire un premier codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 46/47) et une substitution C-A en position 141 pour restaurer un codon synonyme, ainsi qu'une substitution T-A en position 295 pour introduire un deuxième codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 98/99), et deux substitutions (C-G en position 296 et A-C en position 297) pour restaurer un codon synonyme.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 8 ou 9 ou 10 ou 11 ou 12, et présentant trois ensembles de mutations portant respectivement sur les trois triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant trois codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 19.
La séquence représentée par SEQ ID NO: 19 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10, avec une substitution T-G en position 66 pour introduire un premier codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 22/23), une substitution C-A en position 139 pour introduire un deuxième codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 46/47) et une substitution C-A en position 141 pour restaurer un codon synonyme, ainsi qu'une substitution T-A en position 295 pour introduire un deuxième codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 98/99), et deux substitutions (C-G en position 296 et A-C en position 297) pour restaurer un codon synonyme.
Les STOP introduits aux codons 22/23 et 98/99 présentent a priori plutôt un intérêt pour les séquences dérivées d'une séquence de génotype la, tandis que le STOP introduit au codon 46/47 présente a priori plutôt un intérêt pour les séquences dérivées d'une séquence de génotype 1 h. Toutefois, il faut noter que les mécanismes décrits en introduction pour un génotype particulier de VHC (la ou 1 b) ne sont pas nécessairement exclusifs. Cette idée est soutenue par le fait que le pourcentage des patients infectés par un VHC de génotype la qui présentent des réponses immunitaires anti-ARFP est trop élevé pour que l'expression d'ARFP soit régie uniquement par le signal AAA que l'on rencontre rarement dans les séquences du VHC de type la.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 8 et présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1. 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 9, et présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O. Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: I O ou I l ou 12, et présentant au moins un ensemble de mutations portant sur Fun au moins des trois triplets de nucléotides n 65-67. 137-139 et 293-295, et au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O. Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 1 0 ou 1 l ou 12, présentant pour seules mutations, au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des trois triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, et au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1 nucléotide de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 1 0 ou I l ou 12, présentant au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des trois triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, et au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de l nucléotide de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, et présentant également des mutations correspondant à la restauration de codons synonymes dans le cadre de lecture 0, chacune de ces mutations consistant respectivement en une substitution portant sur un nucléotide situé en position p+l par rapport à une mutation située en position p introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10 ou 1 1 ou 12, présentant au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des trois triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295. et au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1 nucléotide de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0. et présentant également des mutations correspondant à la restauration de codons synonymes dans le cadre de lecture 0, chacune de ces mutations consistant respectivement en une substitution portant sur un nucléotide situé en position p+2 par rapport à une mutation située en position p introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 8 et présentant 7 ensembles de mutations portant respectivement sur les 7 triplets de nucléotides n 6567, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 7 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 9, et présentant 8 ensembles de mutations portant respectivement sur les 8 triplets de nucléotides n 6567. 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10 ou 11 ou 12, et présentant 11 ensembles de mutations portant respectivement sur les 11 triplets de nucléotides n 65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 1 1 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant s pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être la séquence SEQ ID NO 20.
La séquence représentée par SEQ ID NO: 20 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10 et présente 20 substitutions, dont 12 servent à obtenir 1 1 codons STOP dans le cadre de lecture +1, tandis que 8 servent à restaurer des codons synonymes.
Mutations destinées à introduire des codons STOP dans le cadre +1 codon 22/23: T- G en position 66; codon 46/47: C-A en position 139; codon 98/99: T-A en position 295; codon 122/123: C-> G en position 366; codon 126/127: T-G en position 378 codon 133/134: CCT en position 399; codon 155/156: C-G en position 465 et C-A en position 466; codon 182/183: T-->A en position 547 codon 194/195: C-A en position 583 codon 197/198: T-A en position 592 codon 202/203: C-->G en position 609.
Mutations destinées à restaurer des codons synonymes: C-A en position 141; C-G en position 296; A-C en position 297; G-A en position 468; C-G en position 548; T-->C en position 549; C-A en position 585 et C-G en position 593.
Il faut également remarquer que deux codons STOP sont déjà naturellement présents dans le cadre de lecture +1, l'un sur le codon 162/163 (nucléotides 485-487) et l'autre sur le codon 185/186 (nucléotides 554556).
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus. dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 8, et comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-1 1, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369371, 393-395, 444-446, 516-518, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1. 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O. Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 9, et comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-1 1, 33-35. 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174176, 213-215. 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10 ou 11 ou 12, et comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-11, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569, 576-578, 612-614, 615-617, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être la séquence SEQ ID NO: 21 ou la séquence SEQ ID NO: 22.
La séquence représentée par SEQ ID NO: 21 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10 et présente, outre toutes les substitutions déjà décrites à propos de la séquence représentée par SEQ ID NO: 20, 38 substitutions supplémentaires, dont 32 servent à obtenir 23 codons STOP dans le cadre de lecture +2, tandis que 6 servent à restaurer des codons synonymes.
Les substitutions supplémentaires destinées à obtenir des codons STOP dans le 30 cadre +2 sont les suivantes: A-iT en position 9 (codon 3/4) ; C-->T en position 33 (codon 11/12) ; C--T en position 45 (codon 15/16) ; C-T en position 48 et C-A en position 49 (codon 16/17) ; y) - G-YT en position 114 et C-A en position 115 (codon 38/39) ; - C-T en position 126 (codon 42/43) - T-A en position 157 et C-*G en position 158 (codon 52/53) ; C-A en position 1 75 (codon 58/59) ; C-T en position 213 (codon 71/72) ; C-YT en position 264 (codon 88/89) ; C-T en position 300 et C-A en position 301 (codon 100/101) ; C-A en position 310 (codon 103/104) ; A-T en position 330 (codon 110/111) ; C-iT en position 336 et C-A en position 337 (codon 112/113) ; G-T en position 348 et C-->A en position 349 (codon 116/117) ; C-*T en position 369 (codon 123/124) ; CCT en position 393 (codon 131/132) ; C-iT en position 444 (codon 148/149) ; C-T en position 516. T-*A en position 517 et C-G en position 518 (codon 172/173) ; T-A en position 568 et C-G en position 569 (codon 189/190) ; C-> T en position 576 (codon 192/193) ; G-->T en position 612 (codon 204/205) ; et C-T en position 615 (codon 205/206).
Mutations destinées à restaurer des codons synonymes: C-A en position 51; C-A en position 1 17; C-T en position 159; T-A en position 177; T-iA en position 303; T-C en position 519.
La séquence représentée par SEQ ID NO: 22 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO: 10 et présente, outre toutes les substitutions déjà décrites à propos de la séquence représentée par SEQ ID NO: 20 et de la séquence représentée par SEQ ID NO: 21, des mutations supplémentaires destinées à la modification de la structure secondaire de l'ARN transcrit correspondant à ladite séquence nucléotidique mutée et / ou à l'optimisation de la traduction dudit ARN transcrit.
Ces mutations supplémentaires figurant dans la séquence représentée par SEQ ID NO: 22 sont les suivantes: Position 4: A->T; position 5 G->C; position 12 T-C; position 21 T-->C; position 24 A-G; position 27 A-G position 37 C-A; position 39 T-iG; position 52 C-A; position 54 C-G; position 69 G-A position 75 G-A: position 78 s 15 20 CFA; position 81 T-A; position 84 T-A; position 93 T-G; position 96 T-A position 102 T-G position 109 T-C position 120 G-*A position 123 C-)A position 129 G-A; position 130 T-C position 135 T-A; position 144 G-A position 150 G-A position 162 G-iA; position 163 C-A; position 165 G--> A position 166 T-A position 167 C-G position 168 G-K position 171 A-G position 184 C-A position 186 A-G position 189 A-G position 192 T-iA position 198 C-iA position 201 G-A position 204 T-A position 205 C-A position 207 C-A; position 208 C-)A; position 216 G-A; position 219 T-A position 222 G-A position 225 C-)A; position 231 T-A; position 240 G-A Io position 246 T*A; position 252 C-A; position 255 C-G; position 258 T-)C position 261 C*A position 267 G-A position 270 T-A; position 276 G-A position 291 C-G; position 306 C-)G position 307 T-A; position 308 C-G position 318 T--> C position 324 C-->A; position 327 C-A; position 340 C-A position 342 T-->A position 346 T-A; position 347 C-G; position 351 T-iG position 354 T-)C; position 355 T-C; position 360 T-)A; position 363 G-)A position 372 T-)C position 375 C-->A position 387 C-) A position 390 C-T position 396 C-)T position 405 G-A position 414 G-A position 417 TAG position 420 C-G position 423 C-A position 426 C-A position 429 C-*T position 432 A-G position 438 C-)A; position 441 T-A; position 447 G > A position 456 G-A; position 459 T-)C; position 471 T-G; position 477 G-A position 480 C-)T; position 489 C--T; position 492 T-) C; position 498 AC position 501 G-A; position 513 T-A position 525 T-A; position 534 C-G position 535 T-C position 537 A-*G position 540 T-A position 541 T-*C position 553 T- K; position 561 C-T; position 564 A-C; position 573 T-A position 579 G-)A; position 588 C-T; position 597 G-C; position 600 A-C position 606 T-C; position 618 C-T.
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de l'une quelconque des séquences nucléotidiques mutées telles que définies ci-dessus, qui code dans son cadre de lecture 0 pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, la séquence protéique de ladite protéine Core ne présentant pas de mutation parrapport à la séquence protéique de la protéine Core normale.
La protéine comprenant ou constitué par la protéine Core, qui est codée par la séquence nucléotidique d'origine ou initiale (non mutée) peut être d'origine naturelle (produite par le virus de l'hépatite C) ou recombinante. La protéine comprenant ou constitué par la protéine Core, qui est codée par la séquence nucléotidique mutée susmentionnée selon l'invention, est une protéine recombinante. Bien que ces deux protéines (codée par la séquence nucléotidique non mutée et codée par la séquence nucléotidique mutée) aient la même séquence protéique, c'est à dire présentent le même succession d'acides aminés, elles peuvent présenter des différences chimiques selon leur mode d'obtention, en particulier lorsque la première est naturelle et la seconde recombinante. Ces différences chimiques peuvent par exemple concerner les ponts disulfure ou se rapporter à la maturation par clivage protéolytique, à la modification coIo ou post-traductionnelle d'origine lipidique et / ou glucidique.
L'invention concerne également une séquence nucléotidique présentant une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2 d'une souche du virus de l'hépatite C, permettant l'expression par une cellule vivante de la protéine Core et ne permettant pas l'expression par une cellule vivante d'une protéine ARFP ou d'un fragment d'une protéine ARFP de plus de Il acides aminés.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique de souche de génotype la, 1 b, 2, 3. 4, 5 ou 6 du virus de l'hépatite C, codant dans le cadre de lecture 0 pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, et ne codant pas pour une protéine ARFP ou pour un fragment de protéine ARFP de plus de 1 1 acides aminés dans le cadre de lecture +1.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique de souche de génotype 1 a ou lb du virus de l'hépatite C, codant dans le cadre de lecture 0 pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core. et le cas échéant la protéine E1 et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, et ne codant pas pour une protéine ARFP ou pour un fragment de protéine ARFP de plus de 11 acides aminés dans le cadre de lecture +1.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée.
qui est telle qu'un ou plusieurs codons STOP sont présents dans ledit cadre de lecture +1. Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente une plusieurs mutations supplémentaires correspondent à la restauration d'un ou de plusieurs codons synonymes dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée. qui présente une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la modification de la structure secondaire de l'ARN transcrit correspondant à ladite séquence nucléotidique mutée et / ou à l'optimisation de la traduction dudit ARN transcrit.
o Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente un ensemble de mutations portant sur l'un des triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 ou 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 1 0 ou SEQ ID NO: I l ou SEQ ID NO: 12, ledit ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente deux ensembles de mutations portant respectivement sur deux triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 1 0 ou SEQ ID NO: I 1 ou SEQ ID NO: 12. chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant deux codons STOP respectifs dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0 ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente trois ensembles de mutations portant respectivement sur les trois triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 1 1 ou SEQ ID NO: 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1.
2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant trois codons STOP respectifs dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O. ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 19.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379. 398-400, 464-466, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID Io NO: 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590592, 608-610 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O. Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente 7 ensembles de mutations portant respectivement sur les 7 triplets de nucléotides n 65- 67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O. Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente 8 ensembles de mutations portant respectivement sur les 8 triplets de o nucléotides n 65-67, 137- 139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente 1 l ensembles de mutations portant respectivement sur les 11 triplets de nucléotides n 65-67, 137-139, 293295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466. 545-547, 581-583. 590-592, 608610 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 1 l codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être représentée par SEQ ID NO: 20.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui comporte en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-11, 33-35, 4547, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311. 330-332, 336-338, 348-350. 369-371, 393-395, 444-446, 516-518 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O. Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui comporte en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-1 1, 33- 35. 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264- 266, 300-302, 309- 311. 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444- 446, 516-518, 567-569 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O. Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui comporte un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou Io plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-11, 33-35, 45-47. 48-50. 114-116, 126-128, 156-158, 174-176. 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569, 576-578, 612-614, 615-617 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0. ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être représentée par SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui est telle que la séquence protéique de la protéine Core codée par la séquence nucléotidique ne présente pas de mutation par rapport à la séquence protéique de la protéine Core normale.
Toutes les séquences nucléotidiques susmentionnées font référence à des molécules d'ADN simple brin ou à des molécules d'ADN double brin (auquel cas les positions sont données par rapport au brin codant).
Par ailleurs, l'invention concerne un ARN transcrit correspondant à l'une des séquences nucléotidiques sus-mentionnées ou une molécule d'acide nucléique (ADN ou ARN) monocaténaire complémentaire de l'une des séquences nucléotidiques sus-mentionnées.
3o L'invention concerne également un vecteur recombinant contenant une séquence nucléotidique selon l'invention.
Le vecteur recombinant ou vecteur d'expression peut notamment être sous forme de plasmide éventuellement couplé à des agents vectorisants (tels que des liposomes, des lipides cationiques...), ou sous forme de virus (tels que les poxvirus ou les adénovirus).
Avantageusement, ledit vecteur d'expression contient les éléments de contrôle de l'expression.
Ces éléments de contrôle de l'expression peuvent notamment consister en un promoteur d'origine virale ou en une séquence optimisant la traduction, par exemple une séquence de Shine-Dalgarno ou de Kozak.
L'invention concerne également un hôte cellulaire transformé ou transfecté par le vecteur d'expression susmentionné.
Des exemples d'hôtes cellulaires transformés ou transfectés sont: les cellules procaryotes, les cellules eucaryotes, notamment d'insectes, de mammifères ou de plantes. les cellules issues de lignées cellulaires, mais également les organismes transgéniques. notamment les mammifères transgéniques, tels que les souris transgéniques.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une séquence nucléotidique susmentionnée, ou un vecteur d'expression susmentionné, ou un hôte cellulaire transformé ou transfecté susmentionné, en tant que substance active, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont appropriées pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra-auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d'administration. Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules. des granules. des poudres, des solutions ou suspensions orales injectables, des timbres transdermiques ( patch ), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres. Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes usuelles des domaines considérés. Lesdites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration journalière de 0,001 à 10 mg de substance active par kg de poids corporel, selon la forme galénique. II peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle. le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration. le poids et la réponse du patient.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la présente invention concerne également une méthode de traitement des pathologies associées au virus de l'hépatite C 5 qui comprend l'administration, à un patient, d'une dose efficace d'un médicament (ou composition pharmaceutique) de l'invention.
L'invention concerne également un extrait et / ou surnageant cellulaire provenant d'une culture de cellules transfectées par une séquence nucléotidique susmentionnée, contenant, avant toute étape éventuelle de récupération des protéines, une protéine -o contenant la protéine Core et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine El et / ou de la protéine E2. mais ne contenant pas de protéine ARFP ou de fragment de protéine ARFP de plus de 1 1 acides aminés.
L'invention concerne également un extrait de sérum ou de plasma d'un hôte, notamment humain ou animal, transfecté par une séquence nucléotidique susmentionnée, contenant, avant toute étape éventuelle de récupération des protéines. une protéine contenant la protéine Core et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine E1 et / ou de la protéine E2, mais ne contenant pas de protéine ARFP ou de fragment de protéine ARFP de plus de 11 acides aminés.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une protéine contenant la protéine Core et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine El et / ou de la protéine E2, mais ne contenant pas de protéine ARFP ou de fragment de protéine ARFP de plus de I l acides aminés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de transformation de cellules hôtes appropriées avec un vecteur d'expression susmentionné, la mise en culture des cellules ainsi transformées, et la récupération. et le cas échéant la purification de la protéine susmentionnée.
L'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro, ou de 30 pronostic, de pathologies liées à une infection par le virus de l'hépatite C, chez l'homme ou l'animal, comprenant: la mise en présence d'une protéine obtenue selon le procédé précédent. ou d'un anticorps préparé à partir de la protéine obtenue selon le procédé précédent, avec un échantillon biologique prélevé chez un sujet présentant ou susceptible de présenter une infection par le virus de l'hépatite C, la détection respectivement d'anticorps contre la protéine Core du virus de l'hépatite C éventuellement présents dans ledit échantillon biologique ou de protéines Core éventuellement présentes dans ledit échantillon biologique.
L'invention concerne aussi la vaccination prophylactique et thérapeutique, qui peut être mise en oeuvre par injection d'un vaccin à base d'au moins un vecteur d'expression ou vecteur recombinant comprenant les séquences nucléotidiques de l'invention. injection suivie de rappels ou non. La vaccination peut également être mise en oeuvre en injectant deux types de vecteurs d'expression de l'invention différents, par exemple tout d'abord un adénovirus, puis un poxvirus, de façon simultanée ou différée dans le temps, et vice et versa. Ces vecteurs peuvent être contenus dans un kit pharmaceutique.
Brève description des figures
Figure 1. Détection d'ARFP à la suite d'une transfection.
La détection se fait par Western Blot en utilisant des anticorps monoclonaux anti- ARFP (15E7F 1) et anti-Core (19D9D6). Sur la figure 1A la détection de Core et d'ARFP est simultanée, en présence d'inhibiteur de protéasome (MG-132). Sur la figure 1B la 20 détection de Core et d'ARFP est séparée, en présence ou en absence de MG-132. Les données sont représentatives de 4 expériences indépendantes.
Figure 2. Expression de Core et d'ARFP101 par les adénovirus recombinants.
Des cellules THP-1 (figure 2A) et Huh7 (figure 2B) infectées ou non par les vecteurs adénoviraux recombinants (Ad) codant pour la f3galactosidase, CoreE 1 E2 (CE1E2), Core et ARFP!oI sont infectées à une multiplicité d'infection de 200 et 100 respectivement. 60 heures après infection, l'inhibiteur de protéasome est ajouté et on effectue une analyse par Western 131ot à 72 heures en utilisant des anticorps monoclonaux anti-ARFP et Anti-Core. Les résultats représentent 5 expériences différentes.
Figure 3. Marquage par immunofluorescence de cellules THP-1.
Le marquage révèle une expression cytoplasmique diffuse d'ARFP101. Des cellules THP-1 sont infectées par Ad-ARFPIo1 (A), -Core (B), -CEIE2 (C) ou -f3-Gal (D, E, F) à une multiplicité d'infection de 200 pendant 72 heures en présence de MG-132 pendant les dernières 12 heures. Les cellules sont ensuite marquées avec un anticorps monoclonal anti-ARFP (A, D) et anti-Core (B, C, E, F) puis un anticorps polyclonal antisouris de lapin conjugué à TRITC. Grossissement: 100X.
Figure 4. Expression de chimiokines.
Le criblage de facteurs solubles est effectué sur le surnageant de cellules THP-1 infectées pendant 72 heures par Ad-(3Ga1, -CEIE2, -Core ou -ARFP10i (multiplicité d'infection = 200) en absence de MG-I32. Les facteurs solubles libérés sont mesurés en utilisant le Human Cytokine Array III. Les témoins positifs et négatifs sont en double aux positions a-1/2, b-1/2 et 1-7/8 et les témoins négatifs aux positions c-1/2, d-1/2 et k-7/8. g-3/4 = interleukine 8; h-5/6 = RANTES.
Figure 5. Mise en évidence du blocage du glissement du cadre de lecture du ribosome par la séquence synthétique CAARFP.
On analyse par cytométrie de flux l'expression de GFP par des cellules transfectées avec une séquence codant pour Core et la séquence codant pour la GFP insérée dans le cadre de lecture 0 (en haut à gauche) ou +1 (en haut à droite) par rapport à la première; ou avec la séquence CAARFP et la séquence codant pour la GFP dans le cadre +1 (en bas à gauche) ou + 2 (en bas à droite) par rapport à la première.
Figure 6. Mise en évidence de la production endogène de Core par les cellules infectées par Ad-CAARFP.
On étudie l'expression de la protéine Core par des cellules 'HP-1 infectées par Ad-CAARFP, -CEIE2, -Core ou -(3Gal.
Figure 6A. Analyse par cytométrie de flux (FACScalibur, BD Biosciences) après marquage avec un anticorps anti-Core (19D9D6. dilution 1/10000) puis avec un anticorps anti-souris de chèvre conjugué à la FITC (1/100).
- Figure 6B. Analyse par Western Blot. Haut: Core; bas: actine.
Figure 6C. Analyse par microsopie de fluorescence en utilisant un anticorps monoclonal Anti-Core.
Figure 7. Mise en évidence de l'induction de MIP-1 (3, MCP-1 et IL-8 par l'expression endogène de Core et / ou ARFP.
On mesure par ELISA la production de MCP-1, MIP-1(3 et IL-8 par les cellules Tl1P-1 infectées par Ad-0gal, -CEIE2, -Core, -ARFPi0i et -CAARFP ou non-infectées après culture pendant 72 heures, lavage et incubation pendant: (A) 24 heures supplémentaires ou (B) 48 heures supplémentaires avant le prélèvement du surnageant. Les résultats sont exprimés en valeurs moyennes + erreur type.
Analyse statistique: Figure 7A. graphe IL-8: P<0,001 entre Ad-CEIE2 et Ad-[3Gal et non significatif entre Ad-CAARFP et Ad-CE 1E2 Figure 7A, graphe MIP-133: P=0.05 entre Ad-CE 1E2 et Ad-Gal et P=0,007 entre AdCAARFP et Ad-CEIE2; Figure 7A, graphe MCP-1: P=0,01 entre Ad-CAARFP et AdCEIE2; Figure 7B, graphe IL-8: P<0,001 entre Ad-CEIE2 et Ad-f3Gal et P=0,008 entre Ad-CAARFP et Ad-CEIE2; Figure 7B, graphe MIP- l: P=0,002 entre Ad-CE] E2 et Ad-(3Gal et P<0,001 entre Ad-CAARFP et Ad-CE I E2 Figure 7B, graphe MCP-1: P=0,03 entre Ad-CAARFP et Ad-CEIE2.
Figure 8. Mise en évidence de l'induction d'IL-8, MIP-l(3 et MCP-1 par la Core exogène.
On mesure la production de MCP-1, MIP-113 et IL-8 par des cellules THP-1 qui sont: incubées avec de la protéine Core exogène à 5.tg/ml (u), 2,5 tg/ml (Y) ou 1,25 g/ml (0), les mesures étant effectuées dans le surnageant à différents temps (figure 8A), ou incubées avec la construction adénovirale pendant 72 heures, puis lavées et incubées dans 24 plaques à 106 cellules / ml pendant encore 48 heures en présence de 20 Core exogène à 5 tg/ml (figure 8B).
Analyse statistique: Figure 8B, graphe IL-8: P=0,001 entre Ad-CE2E2 et Adr3Gal et non significatif entre Ad-CAARFP et Ad-CE 1E2; Figure 8B. graphe MCP-1: P=0,02 entre Ad-CEIE2 et Ad-F3Ga1 et P=0.01 entre 25 Ad-CAARFP et Ad-ARFPIoi.
Partie expérimentale Cultures cellulaires On maintient des cellules d'hépatomes humaines Huh 7 à 37 C dans une 30 atmosphère à 5% de CO2 dans du milieu DMEM complet contenant du milieu Eagles modifié de Dulbecco auquel on a ajouté 10% de sérum foetal de veau, 2 mM de L-glutamine et 100 IU/ml de pénicilline / streptamycine (Sigma). La lignée THP-1 (de l'ATCC), une lignée cellulaire humaine de leucémie monocytaire, est cultivée dans du milieu RPMI complet contenant 10 % de sérum foetal de veau auquel on a ajouté 2 mM de L-glutamine et 100 IU /ml de pénicilline / streptomycine.
Plasmides et constructions d'adénovirus recombinants Les plasmides pTGHisCE 1E2 et pTGHisCore sont construits par PCR en insérant une séquence poly-histidine tagcgccaccatgcatcaccatcaccatcaccatcacggtggtgtg entre le codon d'initiation AUG et le second codon, dans les plasmides décrits dans Himoudi et al.. J. Virol.. 76. 12735-12746 (2002).
Les plasmides pQBCore GFP (0) et pQBCore GFP (+1) sont tels que décrits dans Boulant et al., J. Biot. Chem., 278, 45785-45792 (2003).
Io La séquence CAARFP correspond à SEQ ID NO: 22. Elle a été synthétisée par GeneArt. Afin de vérifier qu'aucun glissement du cadre de lecture n'est produit à partir du cadre +1 et +2 de cette séquence codante, 3 plasmides contenant la séquence codant pour la GFP (green fluorescent protein) dans le cadre de lecture 0, +1 ou +2 de la séquence des nucléotides 1-420 (pQB I-CAARFP-GFP(0)), 1-421 (pQB 1-CAARFP- GFP(+l)) ou 1-422 (pQBI-CAARFP-GFP(+2)) de CAARFP sont construits et utilisés dans des études d'expression in vitro.
Les adénovirus CEIE2, Core, GFP et (3-galactosidase ([3-Gal) ont été décrits dans Himoudi et al., .1. Virol., 76, 12735-12746 (2002). AdARFP10i et AdCAARFP sont construits comme suit: la séquence de nucléotides 470-775 (bornes incluses) par rapport au début du génome du VHC ou 128-433 (bornes incluses) par rapport au début du gène Core, flanquée d'un triplet initiateur ATG en 5', correspondant à un polypeptide de 101 acides aminés du domaine ARFP du génotype lb entre les codons 43 et 144 (séquence représentée par SEQ ID NO: 25), respectivement la séquence CAARFP, est amplifiée par PCR et insérée dans un plasmide navette d'adénovirus (pTG 13387) contenant une cassette d'expression sous le contrôle d'un promoteur de cytomégalovirus afin de permettre la recombinaison homologue avec les séquences adénovirales du vecteur principal (pTG6624).
Les vecteurs pTG13387 et pTG6624 ont été fournis par TRANSGENE S.A. (France). La recombinaison homologue est effectuée chez E. coli et les préparations virales sont titrées par immunofluorescence en utilisant un anticorps monoclonal spécifique de la protéine de liaison de l'ADN viral (Lusky et al. .1 Virol., 72, 2022-2032, 1998; Reich et al. Virology, 128, 480-484, 1983).
Transfection de l'ADN et infection par les adénovirus Les cellules Huh7 sont transfectées par les différentes constructions de plasmides décrites ci-dessus en présence de lipofectamine / Réactif Plus (Invitrogen) selon le protocole du fabricant. En bref, on mélange 2,8 g d'ADN avec lalipofectamine et on incube à température ambiante pendant 15 minutes. Après l'ajout du réactif Plus, cette solution est mélangée avec 106 cellules / ml dans du DMEM sans sérum bovin foetal. Après 3 heures d'incubation. on ajoute le milieu DMEM complet et on incube encore les cellules pendant 72 heures avant la purification de la protéine avec étiquette Histidine ou les analyses de la GFP.
On infecte des monocouches sous-confluentes de cellules Huh7 avec les o adénovirus recombinants appropriés à une multiplicité d'infection de 100 unités infectieuses (IU) par cellule pendant 72 heures avant analyse par Western Blot (transfert de protéines). On infecte 10 millions de cellules THP-1 à une multiplicité d'infection de 200 comme décrit dans Gerszten et al., J. Biol. Chem., 276, 26846-26851 (2001).En bref, les cellules sont incubées dans 0,5 ml de milieu RPMI 1640 sans sérum contenant les différents adénovirus dans une plaque à 12 puits pendant 1 heure, le volume est ensuite complété à 3 ml avec du milieu RPMI complet. 72 heures après l'infection on récolte les cellules et soit on les lyse pour l'analyse par Western Blot, soit on les marque avec des anticorps monoclonaux appropriés pour le marquage d'immunofluoresence / de cytométrie de flux, soit on les lave et on les incube à 106 cellules / ml avec ou sans 5 g/ml d'ARFP99 (polypeptide synthétique de 99 acides aminés issu d'ARFP, cf. Bain et al., J. Virol. 78:10460-40469. 2004), 5 g/ml de protéine Core pendant 24/48 heures pour l'analyse des cytokines.
Purification des protéines avec étiquette histidine 72 heures après la transfection, on re-suspend 6.106 cellules Huh7 dans un tampon de lyse contenant 20 mM de Tris-HCI, à pH 8, 500 mM de NaCl, 8 M d'urée, un inhibiteur de protéase complet (Roche, un comprimé pour 40 ml), 10 ml de [3-mercaptoéthanol (tampon A), on homogénéise par sonication, on congèle à -80 C pendant 15 minutes et on centrifuge à 13000 tours par minute pendant 20 minutes. Le surnageant est récupéré et incubé avec 100!Il de billes de nickel paramagnétiques (Promega) préalablement équilibrées avec le tampon A, pendant 1 heure. Après 3 lavages avec le tampon A, les protéines histidine sont éluées avec 100 l de tampon A contenant 500 mM d'imidazole (élution 1). Après une seconde élution avec 100 l (élution 2), on les sépare sur un gel d'électrophorèse à 15 % et on les analyse par Western Blot.
Western Blot (transfert de protéines) On incube les cellules THP-1 ou Huh7 infectées par les différents adénovirus dans du tampon de lyse glacé contenant du Triton X-100 à 1 % et un inhibiteur de protéase complet (Roche). Les cellules lysées sont centrifugées à 12000 g pendant 10 minutes, et on dose la concentration en protéine dans les fractions cytosoliques (Comassie Blue, Pierce), comme cela est décrit par le fabriquant. On charge les fractions cytoplasmiques sur un gel d'acrylamide à 7,5 % et le tout migre pendant 2 heures. Après le transfert électrophorétique, on sature en premier lieu des membranes de fluorure de polyvinylidène (membranes de transfert Hybond PVDF, Amersham) pendant 1 heure avec un tampon bloquant (lait sans graisses 5 %, Tween 20 0,3 % (v/v) dans du PBS, ou solution saline phosphate tamponnée) puis on incube avec un anticorps monoclonal anti-ARFP ou anti-Core pour saturer les sites de liaison, après quoi on incube avec de l'anti-ARFP monoclonal de souris (15E7F1 produit par bioMérieux) ou de l'anticorps anti-Core monoclonal de souris (19D9D6, bioMérieux) dans du tampon bloquant. Après trois lavages dans du PBS avec 0,5 % de Tween 20, on incube les membranes pendant 2 heures avec des anticorps IgG anti-souris de chèvre conjugués à HRP dans un rapport 1:2000 dans le tampon bloquant (Dako). Après trois lavages finaux, on révèle les protéines par chimioluminescence (ECL Western-blotting detection system. Amersham). Le contenu en actine est évalué sur la même membrane après avoir appliqué le tampon Restore (Pierce) pendant 1 heure à température ambiante et incubé l'anticorps monoclonal anti-actine (Sigma). On réalise une évaluation semiquantitative de l'expression des protéines en utilisant le programme Scion Image (Frederick, Maryland, USA).
Marquage intracellulaire des protéines du VHC On dispose des cellules THP1 à une concentration finale de 5.106 / puits dans des plaques à 24 puits et on les infecte avec différents adénovirus à une multiplicité d'infection de 200. 72 heures après l'infection, on lave les cellules deux fois dans du PBS glacé, on les fixe et on les perméabilise en utilisant le réactif cytofix / cytoperm (Becton Dickinson, France). Le marquage est effectué par incubation séquentielle avec d'abord l'anticorps monoclonal anti-ARFP (15E7F1 1/100) ou l'anticorps monoclonal anti-Core (19D9D6, 1/100) puis l'anticorps anti-souris de lapin conjugué à TRITC (Dako Cytomation). Les cellules sont contre-marquées avec de l'Hoechst à 1/200 dilué dans du PBS et 80 % de glycérol et observées en utilisant la microscopie de fluorescence.
Analyses de cytométrie de flux On transfecte des cellules Huh7 avec les plasmides pQBGFP pendant 72 heures et on analyse l'expression de la GFP par cytométrie de flux en utilisant un FACScalibur (BD Biosciences) . Après 72 heures d'infection, on fixe les cellules THP-1 et on les perméabilise avec Cytofix/cytoperm (Becton Dickinson). on incube avec l'anticorps monoclonal anti-Core (19D9D6, 1/10000) pendant 30 minutes à température ambiante. L'anticorps conjugué à FITC est ajouté pendant encore 30 minutes avant les analyses par cytométrie de flux.
Mesure de la production de facteurs solubles Io Criblage des facteurs solubles. Les facteurs solubles libérés dans les surnageants cellulaires sont mesurés en utilisant à la fois le Human Cytokine Array III (RayBiotech) permettant la détection de 42 facteurs solubles et le kit de cytokines bioplex-17 (Biorad) en suivant les instructions du fabriquant.
Dosages d'immunoadsorbants liés à des enzymes (ELISA). L'évaluation quantitative d'interleukines sécrétées dans les surnageants cellulaires est obtenue en utilisant le dosage d'immunoadsorbants liés à des enzymes (IL-8, MCP-1, BDBioscience, MIP-1f3 RD Bioscience). Les concentrations (en pg/ml) d'échantillons inconnus sont calculées en interpolant avec des courbes standard mises sur chaque plaque. La sensibilité de détection d'IL-8, de MCP-1 et de MIP-1(3 est respectivement de 10, 7 et 30 pg/ml.
Statistiques Des tests t de Student sont appliqués pour comparer les niveaux de cytokines.
Exemples
Les exemples suivants montrent: 1. Que les séquences Core ou C-El-E2 sont capables d'exprimer une protéine ARFP +1 in vitro (cellules eucaryotes). C'est la première fois que ce fait est directement démontré en utilisant un anticorps anti-ARFP.
2. Qu'une séquence Core peut être modifiée afin d'exprimer avec succès une protéine Core sauvage sans expression d'ARFP (construction originale de CAARFP).
3. Qu'il est possible d'attribuer des propriétés spécifiques et distinctes à Core, CAARFP et ARFP par rapport à la modulation de l'expression de cytokines / chimiokines in vitro (en utilisant un système d'expression fondé sur un adénovirus). A savoir que: - l'expression endogène de Core induit l'expression d'IL-8; - lexpression endogène de CAARFP induit une expression réduite d'IL-8 par rapport à Core et est dépourvue de la capacité à stimuler la production de MCP-1 et MIP-1 f3; - l'expression endogène d'ARFP induit des niveaux élevés d'IL-8, de MCP-1 et de MIP-1(3.
Exemple 1: expression d'ARFP dans le contexte des vecteurs codant pour Core ou CoreElE2 On montre qu'une ARFP ( alternative reading frame protein ) de 17 kDa est exprimée dans les cellules transfectées avec des plasmides codant soit pour His-Core soit pour His-CoreElE2. Cette protéine est très probablement produite à des niveaux très faibles puisque sa détection n'est possible par transfert de protéines (Western blot) qu'après purification des protéines marquées His sur colonnes Ni (voir figure 1).
Protocole: des Huh7 sont transfectées par pTG HisCE1 E2 ou pTG HisCore pendant 72 heures. Un inhibiteur de protéasome (MG132) est ajouté (A) ou non (B) dans le milieu de culture pendant les 6 dernières heures. Après séparation sur des billes magnétiques Ni et électrophorèse, on effectue un Western Blot en utilisant un anticorps monoclonal anti-ARFP (dilution 1/1000, 15E7F1 bioMérieux, obtenu à partir de souris immunisées par la protéine AF de génotype la (Komurian-Pradel et al., Hepatology, 40:900, 2004) ; l'épitope est totalement conservé entre le génotype la et lb d'ARFP) et un anticorps anti-Core (dilution 1/40000, 19D9D6). On détecte à la fois Core avec l'étiquette His (21 kDa) et ARFP avec l'étiquette His (17 kDa) par Western Blot à partir de cellules transfectées par pTG HisCore ou pTG His-CEIE2. Les résultats sont représentatifs de quatre expériences indépendantes.
Les données présentées prouvent sans ambiguïté l'existence d'une ARFP codée par la séquence codant soit pour CoreElE2 soit pour Core. La protéine His-ARFP a un poids moléculaire apparent de 17 kDa et ne semble pas être sensible à la dégradation par le protéasome.
Exemple 2: la protéine ARFP n'est pas détectée dans les lignées cellulaires infectées par Ad-Core ou Ad-CEIE2 Les lignées cellulaires Huh7 et THPI sont infectées avec les adénovirus recombinants codant pour 13-Gal (témoin négatif), CEIE2, et le polypeptide de 101 acides aminés entre le codon 43 et le codon 144 du cadre de lecture +1 de Core (ARFP101) . 72 heures après infection, on analyse les lysats cellulaires par Western Blot pour l'expression de Core et d'ARFP. A ce moment, plus de 80 % des cellules infectées par Ad-GFP sont positives pour la GFP. Comme attendu, et comme observé à la fois avec les extraits cellulaires de THP- 1 et Huh7, Core est détectée à la suite de l'infection par Ad-CEIE2 et Ad- Core (Figures 2A et 2B). L'intensité de la bande spécifique de Core est bien plus importante dans les cellules infectées avec Ad-CETE2, ce qui reflète peut-être une stabilité plus élevée de la protéine Core dans ce contexte. De même, on détecte ARFPI01 dans les cellules infectées par Ad- ARFP1o1. Toutefois ce polypeptide l0 n'est détecté que quand l'infection est effectuée en présence de l'inhibiteur de protéasome MG-132 (Figures 2A, B). Cependant, même en présence d'inhibiteur de protéasome, ARFP n'est pas détectée dans les cellules infectées par Ad-CEIE2 ou Ad-Core. Ces données suggèrent que si ARFP est exprimée par la séquence de génotype lb de Core utilisée dans cette étude, la quantité de cette protéine doit être très faible et n'est pas détectable à moins que la protéine stabilisée par l'étiquette Histidine ne soit purifiée.
Puis on a analysé la localisation sub-cellulaire d'ARFP. Des cellules THP1 ont été infectées par les différents adénovirus et marquées avec un anticorps monoclonal spécifique anti-Core ou anti-ARFP. La protéine Core est facilement détectable dans les cellules infectées par Ad-CEIE2 ou Core. Des structures de localisation subcellulaires en anneaux et en points sont observées (Figures 3B, C, flèches). Cependant, comme on peut s'y attendre à partir des résultats de Western blot, le marquage à l'anticorps anti-ARFP ne révèle pas de signal spécifique dans les cellules infectées par Ad-CEIE2 ou - Core. Néanmoins une expression diffuse d'ARFP est observée lors de l'infection par Ad-ARFP101 (Figure 3A) Exemple 3: les chimiokines IL-8, MCP-1, et MIP-1P sont produites par les cellules THP-1 infectées avec un adénovirus codant pour Core, CEIE2 ou ARFPIoi On infecte des cellules THP-1 avec Ad-Core, -CEIE2, -ARFP101, en parallèle avec Ad-(3Gal, comme témoin négatif, ou Ad-NS5a, comme témoin positif (Polyak et al.. J. . 75:60956106, 2001), en absence d'inhibiteur de protéasome (MG132) pendant 72 heures. Puis on lave les cellules et on les incube pendant encore 24 ou 48 heures dans du milieu de culture avant de prélever le surnageant.
Le criblage de facteurs solubles en utilisant des membranes Ray Biotech (membranes RayBio Human Cytokine Antibody Array III) ou des dosages BioPlex révèle que IL-8 (CXCL-8). MCP-1 (CCL-2) et MIP-1 (CCL-4) sont spécifiquement induits dans les cellules infectées par Ad-Core. -CEIE2 ou -ARFP101 en comparaison des cellules non infectées ou des cellules infectées avec Ad-f3Gal.
La figure 4 représente le résultat du criblage. Toutes les préparations adénovirales présentent des niveaux indédectables d'endotoxines. Seules deux cytokines sont détectées avec ce test: RANTES (CCL5) et IL-8 (CXCL-8) . La production de RANTES n'est pas liée à l'expression antigénique du VHC car elle est observée dans IO les cellules infectées par tous les adénovirus. Au contraire, les cellules infectées par Ad-Core et -ARFPIo, libèrent des niveaux plus élevés d'IL-8 que les cellules infectées par Adf3-Gal ou par Ad-CEU E2.
Le tableau l suivant illustre une expérience dans laquelle les cellules THP-1 sont infectés par Ad-[3Gal, -CE] E2, -Core et -ARFP10, pendant 72 heures, lavées et à nouveau incubées dans du milieu pendant encore 48 heures, puis analysées avec le panel 17-plex de cytokines humaines de Bioplex (concentrations exprimées en pg/ml; n.d. = non déterminable, c'est à dire en dessous de la limite de détection).
Tableau 1
Non-infectées [3-Gal CE1E2 Core ARFPIOI IL-1[3 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
IL-2 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
IL-4 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
IL-5 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
IL-6 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
IL-7 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
IL-8 10 22 100 135 164 IL-10 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
IL-12 n.d. n.d. n.d. n.d. ' n.d.
IL-13 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
IL-17 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
TN F-a n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
IFN-y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
GM-CSF n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
G-SCF n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
MCP-1 0 12 84 164 221 MIP-1(3 15 64 295 339 315 On constate sur le tableau précédent que très peu de facteurs solubles sont produits par les cellules THP-1. Seules 3 chimiokines (IL-8 ou CXCL-8, MCP-1 ou CCL-2, et MIP-1(3 ou CCL-4) sont sécrétées. Les niveaux sont faibles ou indétectables dans les cellules non-infectées par Ad-(3-Gal. Quand les antigènes du VHC sont exprimés, les niveaux des 3 chimiokines sont accrus. Le niveau de MIP-1 Ç3 est équivalent avec Ad-CEIE2, -Core et -ARFPIoi, mais pour IL-8 et MCP-1 la tendance est à un niveau beaucoup plus élevé dans les cellules infectées par Ad-ARFPIoi par rapport aux cellules infectées par Ad-Core, et dans les cellules infectées par Ad-Core par rapport aux cellules infectées par Ad-CEI E2.
Ces données ont été confirmées en utilisant des kits ELISA spécifiques pour IL-8, MCP-1 (BD Biosciences) et MIP-1 [3 (R&D Systems). Alors que l'expression endogène d'ARFP est responsable sans ambiguïté de la sécrétion de chimiokines dans les cellules infectées par Ad-ARFPIoi, la contribution relative de Core et ARFP à la libération de chimiokines dans les cellules infectées par Ad-Core ou -CEIE2 est plus délicate. Cette question est à l'origine des exemples expérimentaux qui suivent.
Exemple 4: Construction d'un adénovirus codant pour Core et déplété vis à vis de l'expression d'ARFP On a construit un adénovirus recombinant contenant une séquence Core modifiée (CAARFP) de telle sorte que la protéine Core est exprimée normalement mais que toute protéine éventuellement issue d'un événement de glissement du cadre de lecture ou d'initiation interne est évitée (Ad-CAARFP). La séquence correspondante est représentée par SEQ ID NO: 22.
Afin de vérifier l'absence de protéine traduite à partir d'un cadre de lecture alternatif, une séquence codant pour la GFP est insérée en aval de la séquence CAARFP dans les cadres de lecture 0, +1 ou +2. Les plasmides correspondants sont transfectés dans des cellules Huh7 et l'expression de GFP est évaluée par cytométrie de flux (FACScalibur, BD Biosciences). Un événement de glissement du cadre de lecture ou d'initiation interne dans un cadre de lecture alternatif est donc visualisé par l'expression de la GFP dans les cellules transfectées par les constructions correspondantes. Comme on le voit sur la figure 5, la GFP est seulement exprimée lorsqu'elle est insérée dans le cadre de lecture de la séquence codant pour Core (45 % de cellules positives). mais pas s quand elle est insérée dans le cadre de lecture +1 ou +2 (0,04 et 0,01 % de cellules positives) de la séquence CAARFP. Au contraire, quand la GFP est insérée en aval de la séquence codant pour Core de type sauvage dans le cadre de lecture +1, 1,2 % des cellules sont positives pour la GFP, ce qui confirme que dans ce contexte le glissement de cadre de lecture est rare mais réel.
Io Ces données démontrent qu'aucune protéine de cadre de lecture alternatif n'est produite dans les cellules transfectées par la séquence CAARFP. De plus, les niveaux de protéine Core dans les cellules infectées par Ad-CAARFP sont dans la gamme de ceux détectés dans les cellules infectées par Ad-Core ou -CE12 (figure 6).
Exemple 5: Absence d'induction de MIP-1(3 ou de MCP-1 dans les cellules THP-1 infectées par Ad-CAARFP; l'expression d'ARFP et de Core participe à l'induction de la sécrétion d'IL-8 dans les cellules infectées par AdCore ou - CEl E2 On infecte des cellules THP-1 en parallèle avec Ad-fore, -CEIE2, -ARFP10i et - CAARFP pendant 72 heures, on les lave et on les incube dans du milieu pendant encore 24 ou 48 heures avant le prélèvement du surnageant. On mesure la sécrétion de MCP-1 et MIP-1 par ELISA. Comme cela est représenté à la figure 7, des quantités basales des deux chimiokines sont produits soit par les cellules non-infectées soit par les cellules THP-1 infectées par Ad-(3Gal (allant de 50 à 500 pg/ml pour MCP-1 et 150 à 500 pg/ml pour MIP-1(3 à 24 ou 48 heures). Comme précédemment observé, l'infection des cellules THP-1 par Ad-ARFP10i stimule de manière significative la production de chimiokine MCP-1 et MIP- 1 F3 à 24 et 48 heures. Les niveaux de ces deux chimiokines sont également accrus dans les cellules infectées par Ad-Core ou -CEIE2. Mais quand les cellules sont infectées par Ad-CAARFP, la sécrétion à la fois de MCP-I et de MIP- 1 [3 est abolie, atteignant des niveaux comparables à ceux des cellules THP-1 non-infectées ou infectées par Ad-PGal.
Étant donné qu'ARFP n'est pas produite dans les cellules infectées par AdCAARFP, ces données démontrent clairement que l'expression d'ARFP et non celle de Core est responsable de l'induction de la libération de MCP-1 et de MIP-1f3 dans les cellules infectées par Ad-Core ou -CEIE2.
La sécrétion d'IL-8 est également mesurée dans les surnageants de cellules THP-1 infectées par Ad-fore, -CEIE2, -ARFP 10 i et -CAARFP. Comme cela a été montré pour MCP-1 et MIP-1R, la sécrétion d'IL-8 est fortement accrue dans les cellules infectées par Ad-C, -CEIE2, -ARFPi0i par rapport à des cellules non-infectées ou infectées par Ad-RGal (figure 7). Néanmoins, quand des cellules THP-1 sont infectées par Ad-CAARFP, bien que les niveaux d'IL-8 soient plus faibles par rapport aux cellules infectées par Ad-Core. -CEIE2 ou -ARFP101, ils demeurent plus élevés que les niveaux produits par les cellules non-infectées ou infectées par Ad- [3Gal. Ces données suggèrent fortement que, à la différence de la sécrétion de MCP-1 et de MIP-113 qui dépend entièrement de l'expression endogène d'ARFP, les deux protéines Core et ARFP sont impliquées dans la stimulation de la libération d'IL-8 par les cellules THP-1 infectées par Ad-Core ou -CE 1E2.
Exemple 6: la protéine Core exogène (mais non le polypeptide ARFPIo1) potentialise la production d'IL-8 et de MCP-1 dans les cellules infectées par Ad-Core, -CEIE2 ou -ARFP1o1 On sait que les patients ayant une infection chronique par le VHC présentent une activation proinflammatoire accrue et que les protéines Core et NS3 déclenchent la production de cytokines pro-inflammatoires dans les monocytes (Dolganiuc et al., J. Imniunol., 170, 5615-5624, 2003; Dolagniuc et al., Gastroenterolo ', 127, 1513-1524, 2004). Ici on montre que Core induit d'une façon dépendant de la dose la production de MCP-l. IL-8 et MIP-113 avec un niveau maximal de MCP-1 et MIP-1J3 trouvé à 7 heures après l'incubation (respectivement 997 et 152 pg/ml, Figure 8B). La protéine ARFPioi n'induit pas de production de chimiokines. Cette induction de chimiokines par la protéine Core est causée par l'intermédiaire de l'interaction Core-TLR-2 et induit rapidement la phosphorylation de P38MAPK et P42-P44MAPK.
Afin d'étudier l'effet de la protéine Core sur les monocoytes infectés par les différents adénovirus, on infecte des cellules THP-1 pendant 72 heures et on les incube avec de la Core exogène pendant 48 heures. Comme on le voit sur la figure 8B, les niveaux de MCP-1 et IL-8 produits par les cellules infectées par l'adénovirus témoin sont plus élevés que par les cellules non-infectées, ce qui suggère une implication de la protéine adénovirale dans la potentialisation de la sécrétion de chimiokine induite par la protéine Core exogène (1462 et 1054 pg/mI pour IL-8 et MCP- 1 respectivement). Les cellules infectées par Ad-CEIE2, -Core et -ARFPi0i et incubées avec de la protéine Core exogène produisent une quantité de IL-8 et de MCP-1 trois fois plus élevée que les cellules infectées par le témoin adénovirus et incubées avec Core. Les cellules infectées avec AdCAARFP et incubées avec de la Core exogène produisent des niveaux d'IL-8 comparables aux cellules infectées par Ad-CE I E2 et incubées avec de la Core exogène, tandis que le niveau de MCP-1 est plus faible et comparable aux cellules infectées avec le témoin adénovirus et incubées avec la Core exogène.
Finalement ces résultats prouvent que la production de MIP-1(3, de MCP-1 et lo d'IL-8 par la Core exogène est causée par l'intermédiaire de l'interaction Core-TLR-2 et que la Core exogène potentialise la production de MCP-1 et d'IL-8 induite par l'expression endogène d'ARFP ou d'ARFP et de Core respectivement.
Claims (51)
1. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée, cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou un fragment de la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2 du virus de l'hépatite C. ladite séquence nucléotidique mutée étant telle qu'elle code dans un cadre de lecture 0 pour la susdite l0 protéine, mais qu'elle ne permet pas l'expression d'une protéine ARFP ou de fragments d'une protéine ARFP de plus de I l acides aminés, codés dans le cadre de lecture +1 par la susdite séquence nucléotidique non mutée, pour la préparation d'un vaccin ou d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des infections liées au virus de l'hépatite C.
2. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 1, cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, de souches de génotype 1 a, 1 b, 2, 3, 4, 5 ou 6 du virus de l'hépatite C.
3. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 1 ou 2. cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine E l et / ou de la protéine E2, de souches de génotype la ou lb du virus de l'hépatite C.
4. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 3, cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core et un fragment de la protéine E1, représentée par la séquence générale du génotype la (SEQ ID NO: 1) ou par la séquence consensus du génotype la (SEQ ID NO: 23) ou par la séquence générale du génotype lb (SEQ ID NO: 2) ou par la séquence consensus du génotype 1 b (SEQ ID NO: 24) ou par une séquence présentant plus de 90 % d'homologie avec l'une de ces séquences, ou par la séquence consensus du génotype 2 (SEQ ID NO: 3) ou par la séquence consensus du génotype 3 (SE.Q ID NO: 4) ou par la séquence consensus du génotype 4 (SEQ ID NO: 5) ou par la séquence consensus du génotype 5 (SEQ ID NO: 6) ou par la séquence consensus du génotype 6 (SEQ ID NO: 7) ou par une séquence présentant plus de 70 % d'homologie avec l'une de ces séquences.
5. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 4, présentant une ou plusieurs mutations par rapport à la séquence nucléotidique d'origine codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core du virus de l'hépatite C.
6. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications l à 5, dans laquelle la ou les mutations correspondent à l'introduction d'un ou plusieurs codons STOP dans le cadre de lecture +1 de la séquence nucléotidique d'origine.
7. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 6, présentant une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la restauration d'un ou de plusieurs codons synonymes dans le cadre de lecture 0.
8. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 7, présentant une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la modification de la structure secondaire de l'ARN transcrit correspondant à ladite séquence nucléotidique mutée et / ou à l'optimisation de la traduction dudit ARN transcrit.
9. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 8. cette séquence mutée étant dérivée par mutation de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8 de la souche J de génotype 1 b du virus de l'hépatite C, codant pour la protéine Core.
10. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 8. cette séquence mutée étant dérivée par mutation de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 9 de la souche J de génotype 1 b du virus de l'hépatite C, 5 codant pour la protéine Core et le peptide signal El.
11. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 8, cette séquence mutée étant dérivée par mutation de la séquence nucléotidique de la souche.l de génotype 1 b du virus de l'hépatite C représentée par SEQ ID NO: 10, codant l0 pour la protéine Core et un fragment de El ou par SEQ ID NO: 11, codant pour la protéine Core et la protéine E l ou par SEQ ID NO: 12, codant pour la protéine Core, la protéine El et la protéine E2.
12. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 9 à 11, présentant un ensemble de mutations portant sur l'un des triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 ou 293-295, ledit ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides du triplet de nucléotides susmentionné, introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15.
13. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 9 à 1 1, présentant deux ensembles de mutations portant respectivement sur deux triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant deux codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18.
14. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 9 à 11, présentant trois ensembles de mutations portant respectivement sur les trois triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant trois codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 19.
15. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 9, présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O.
16. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 10, présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295. et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377- 379, 398-400, 464-466, 545547, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O.
17. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 11, présentant au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des trois triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, et au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608- 610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
18. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 9, présentant 7 ensembles de mutations portant respectivement sur les 7 triplets de nucléotides n 65-67. 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398400, 464-466, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 7 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
19. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 10, présentant 8 ensembles de mutations portant respectivement sur les 8 triplets de nucléotides n 65- w 67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
20. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication Il, présentant 1 1 ensembles de mutations portant respectivement sur les 1 1 triplets de nucléotides n 65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 11 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O. ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être la séquence SEQ ID NO: 20.
21. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 9, 12 à 15 ou 18, comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-1 1, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264- 266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-39.5, 444- 446, 516-518, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O.
22. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 10, 12 à 14, 16 ou 19, comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-1 1, 33-35, 45-47. 48-50, 114-116, 126- 128. 156-158. 174-176. 213-215. 264-266, 300-302. 309-311, 330-332, 336- 338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O.
23. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 1, 12 à 14, 17 ou 20, comportant en outre un ou plusieurs ensembles de Io mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-11.33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174- 176. 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369- 371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569, 576-578, 612-614, 615-617, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être la séquence SEQ ID NO: 21 ou la séquence SEQ ID NO: 22.
24. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 23, codant dans son cadre de lecture 0 pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, la séquence protéique de ladite protéine Core ne présentant pas de mutation par rapport à la séquence protéique de la protéine Core normale.
25. Séquence nucléotidique présentant une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2 d'une souche du virus de l'hépatite C, permettant l'expression par une cellule vivante de la protéine Core et ne permettant pas l'expression par une cellule vivante d'une protéine ARFP ou d'un fragment de protéine ARFP de plus de 1 1 acides aminés.
26. Séquence nucléotidique selon la revendication 25 présentant une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique de souche de génotype la, lb, 2, 3, 4, ou 6 du virus de l'hépatite C, codant dans le cadre de lecture 0 pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine E1 et / ou de la protéine E2, et ne codant pas pour une protéine ARFP ou pour un fragment de 5 protéine ARFP de plus de 1 1 acides aminés dans le cadre de lecture +1.
27. Séquence nucléotidique selon la revendication 25 ou 26 présentant une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique de souche de génotype la ou 1 b du virus de l'hépatite C, codant dans le cadre de lecture 0 pour une protéine l0 comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, et ne codant pas pour une protéine ARFP ou pour un fragment de protéine ARFP de plus de 1 1 acides aminés dans le cadre de lecture +1.
28. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 27, dans laquelle un ou plusieurs codons STOP sont présents dans ledit cadre de lecture +1.
29. Séquence nucléotidique selon la revendication 28, présentant une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondent à la restauration d'un ou de plusieurs codons synonymes dans le cadre de lecture O.
30. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 29, présentant une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la modification de la structure secondaire de l'ARN transcrit correspondant à ladite séquence nucléotidique mutée et / ou à l'optimisation de la traduction dudit ARN transcrit.
31. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 30 présentant un ensemble de mutations portant sur l'un des triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 ou 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: l0 ou SEQ ID NO: 1 l ou SEQ ID NO: 12, ledit ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15.
32. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 30 présentant deux ensembles de mutations portant respectivement sur deux triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67. 137-139 et 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant deux codons STOP respectifs dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0 ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18.
33. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 30 présentant trois ensembles de mutations portant respectivement sur les trois triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 1 1 ou SEQ ID NO: 12. chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant trois codons STOP respectifs dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO: 19.
34. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 33 présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398- 400, 464-466, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
35. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 33 présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-29.5, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP I0 supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O.
36. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 33 présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590592, 608-610 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
37. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 34, présentant 7 ensembles de mutations portant respectivement sur les 7 triplets de nucléotides n 65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398400, 464-466, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
38. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 33 ou 35, présentant 8 ensembles de mutations portant respectivement sur les 8 triplets de nucléotides n 65-67. 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398400. 464-466. 545-547, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O.
39. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 33 ou 36, présentant 11 ensembles de mutations portant respectivement sur les 11 triplets de nucléotides n 65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, Io 581-583. 590-592, 608-610 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 1 l codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être représentée par SEQ ID NO: 20.
40. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 31 à 34 ou 37, comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-11, 33- 35, 45-47. 48-50, 114-116, 126128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O.
41. Séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 31 à 32. 35 ou 38, comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-1 1, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311. 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395,444-446, 516-518, 567-569 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO: 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O.
42. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 31 à 33. 36 ou 39, comportant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n 9-11, 33-35, 45- 47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569. 576-578, 612-614. 615-617 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID 1 0 NO: 1 0 ou SEQ ID NO: I l ou SEQ ID NO: 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être représentée par SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22.
43. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 42, dans laquelle la séquence protéique de la protéine Core codée par la séquence nucléotidique ne présente pas de mutation par rapport à la séquence protéique de la protéine Core normale.
44. Vecteur d'expression contenant l'une des séquences nucléotidique selon l'une
des revendications 25 à 43.
45. Vecteur d'expression selon la revendication 44 contenant les éléments de contrôle de l'expression.
46. Hôte cellulaire transformé ou transfecté par un vecteur d'expression selon la revendication 45.
47. Composition pharmaceutique comprenant la séquence nucléotidique de l'une des revendications 25 à 43, ou un vecteur d'expression selon la revendication 44 ou 45. ou un hôte cellulaire transformé ou transfecté selon la revendication 46, en tant que substance active, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
48. Extrait et / ou surnageant cellulaire provenant d'une culture de cellules transfectées par une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 43, contenant, avant toute étape éventuelle de récupération des protéines, une protéine contenant la protéine Core et le cas échéant la protéine E 1 et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine El et / ou de la protéine E2, mais ne contenant pas la protéine ARFP ou un fragment de la protéine ARFP de plus de 11 acides aminés.
49. Extrait de sérum ou de plasma d'un hôte, notamment humain ou animal, transfecté par une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 43, contenant, avant toute étape éventuelle de récupération des protéines, une protéine contenant la protéine Core et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine El et / ou de la protéine E2, mais ne contenant pas la protéine ARFP ou un fragment de la protéine ARFP de plus de 11 acides aminés.
50. Procédé de préparation d'une protéine contenant la protéine Core et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine El et / ou de la protéine E2, mais ne contenant pas la protéine ARFP ou un fragment de la protéine ARFP de plus de 11 acides aminés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de transformation in vitro de cellules hôtes appropriées avec un vecteur d'expression selon la revendication 44 ou 45, la mise en culture des cellules ainsi transformées, et la récupération, et le cas échéant la purification de la protéine susmentionnée.
51. Méthode de diagnostic in vitro, ou de pronostic, de pathologies liées à une infection par le virus de l'hépatite C, chez l'homme ou l'animal, comprenant: la mise en présence d'une protéine obtenue selon le procédé de la revendication 50, ou d'un anticorps préparé à partir de la protéine obtenue selon le procédé de la revendication 50, avec un échantillon biologique prélevé chez un sujet présentant ou susceptible de présenter une infection par le virus de l'hépatite C, la détection respectivement d'anticorps contre la protéine Core du virus de l'hépatite C éventuellement présents dans ledit échantillon biologique ou de protéines Core éventuellement présentes dans ledit échantillon biologique.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| FR0506170A FR2887260A1 (fr) | 2005-06-17 | 2005-06-17 | Sequences nucleotidiques mutees du virus de l'hepatite c |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| FR0506170A Pending FR2887260A1 (fr) | 2005-06-17 | 2005-06-17 | Sequences nucleotidiques mutees du virus de l'hepatite c |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2887260A1 (fr) |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| US6685944B1 (en) * | 1998-08-21 | 2004-02-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Modified HCV peptide vaccines |
-
2005
- 2005-06-17 FR FR0506170A patent/FR2887260A1/fr active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6685944B1 (en) * | 1998-08-21 | 2004-02-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Modified HCV peptide vaccines |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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| BRANCH ANDREA D ET AL: "The hepatitis C virus alternate reading frame (ARF) and its family of novel products: The alternate reading frame protein/F-protein, the double-frameshift protein, and others", SEMINARS IN LIVER DISEASE, vol. 25, no. 1, February 2005 (2005-02-01), pages 105 - 117, XP009062779, ISSN: 0272-8087 * |
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