WO2006134280A2 - Sequences nucleotidiques mutees du virus de l'hepatite c - Google Patents

Sequences nucleotidiques mutees du virus de l'hepatite c Download PDF

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WO2006134280A2
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Geneviève INCHAUSPE
Christine Bain
Anne Fournillier
Marc Fiorucci
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    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to mutated nucleotide sequences of hepatitis C virus.
  • HCV hepatitis C virus
  • the HCV genome codes for a single polyprotein, ie a set of three structural proteins (Core, E1 and E2) and seven nonstructural proteins (P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A and NS5B) the different proteins being obtained from the polyprotein by proteolytic cleavage.
  • the core protein of HCV is the most conserved viral antigen and is the target of type B and T cell immunity. It is therefore a vaccine antigen of choice. However, this antigen is associated with a variety of properties, some of which are undesirable in a vaccine formulation, i.e., immunosuppressive properties (Large MK et al., J. Immun 162: 931-938, 1999; Soguero C et al., J. Virol., 76: 9345-9354, 2002; Yoa ZQ et al., J. Virol. 78: 6409-6419).
  • ARFP alternative reading frame protein
  • a first reading frame shift event has been described for genotype sequences Ia (Xu Z. et al., EMBO J. 20: 3840-3848, 2001; Varaklioti A. and al, J Biol. Chem. 277: 17713-17721, 2002; Roussel J. et al., J. Gen. Virol. 84: 1751-1759, 2003).
  • the ribosome initiates translation of the AUG codon from the open reading frame of the HCV polyprotein and, at codons 9-10, encounters an AAA-rich sequence that stimulates a frame reading slip event at codon 11, which event slip consists of a displacement of the ribosome in reading frame +1.
  • a slip sequence such as this AAA signal is also able to displace the ribosome in the + 2 / -1 reading frame (Xu et al., J Virol, 77: 1578-1583, 2003 ).
  • One of the aspects of the invention is to provide novel mutated nucleotide sequences for the preparation of drugs, vaccines, diagnostic methods or prognosis, in the context of the treatment or prevention of pathological conditions related to an infection by HCV
  • Another aspect of the invention is to provide mutated nucleotide sequences coding for all or part of the HCV polyprotein, inducing less than the wild-type nucleotide sequences the immunosuppressive mechanisms mentioned above.
  • the invention relates to the use of a mutated nucleotide sequence, said mutated sequence being derived by mutation of a nucleotide sequence coding for a protein comprising or consisting of the Core protein or a fragment of the Core protein, and where appropriate the E1 protein and / or the E2 protein of hepatitis C virus and / or one or more fragments of the E1 protein and / or the E2 protein of the hepatitis C virus, said mutated nucleotide sequence being such that it code in a reading frame 0 for the above protein, but it does not allow the expression of an ARFP protein or fragments of an ARFP protein of more than 11 amino acids encoded in the reading frame +1 by the aforesaid non-mutated nucleotide sequence, for the preparation of a vaccine or a medicament for the prevention or treatment of infections related to the hepatitis C virus.
  • the mutated nucleotide sequence according to the invention allows the expression of an immunogenic protein, in particular by the expression of a Core protein or a Core protein fragment, and advantageously does not allow the expression of a ARFP protein inducing immunosuppressive mechanisms.
  • Core protein fragment fragments which comprise. or consist of at least 60 amino acids, in particular at least 70 amino acids, in particular at least 80 amino acids, and more particularly at least 100 amino acids of the Core protein.
  • the mutated nucleotide sequence in question may be derived by mutation of a nucleotide sequence representing all or only part of the HCV genome.
  • the original nucleotide sequence comprises the entire genome of HCV.
  • the original nucleotide sequence comprises a fragment of the HCV genome, in particular a fragment coding for the Core protein or a fragment coding for the Core protein and the E1 signal peptide or a fragment coding for the Core protein, the signal peptide. of El and the following 15 amino acids of El or a coding fragment for the Core protein and the El protein or a coding fragment for the Core protein, the El protein and the E2 protein.
  • the nucleotide sequence according to the invention may also comprise nucleotides (optionally chemically modified) or one or more additional DNA fragments, in particular at the 5 'end and / or the 3' end and in particular be flanked by sequences nucleotides different from those corresponding to the HCV genome.
  • Reading frame 0 is defined relative to the ATG codon signaling the beginning of the core protein.
  • the terms “reading frame +1" and “reading frame +2" are understood by reference to said reading frame 0.
  • the protein encoded by the mutated nucleotide sequence of the invention comprises or consists of the Core protein in its entirety, and this although the ARFP protein, which is in principle expressed from the nucleotide sequence of non-native origin. mutated, contains a fragment of the core protein.
  • the invention is based on the introduction into a sequence of one or more mutations appropriate to the nucleotide sequences of wild strains of HCV, these mutations allowing in particular to introduce one or more STOP codons in the reading frame +1 and optionally in the +2 reading frame, which mutations do not affect the ex vivo expression of the Core protein and substantially abolish the expression of ARFP proteins and all or part of the ARFP protein-associated immunosuppressive mechanisms and / or Core protein.
  • the invention more particularly relates to the above-mentioned use of a mutated nucleotide sequence as defined above, derived by mutation of a nucleotide sequence coding for a protein comprising or consisting of the Core protein and, where appropriate, the El protein. and / or the E2 protein of the hepatitis C virus and / or one or more fragments of the E1 protein and / or the E2 protein, genotype 1a, Ib, 2, 3, 4, 5 or 6 strains of the hepatitis C virus
  • the invention more particularly relates to the above-mentioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived by mutation of a nucleotide sequence coding for a protein comprising or consisting of the Core protein and, where appropriate, the El protein and or the E2 protein of the hepatitis C virus and / or one or more fragments of the E1 protein and / or the E2 protein, of the genotype 1a or Ib strains of the hepatitis C virus.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived by mutation of a nucleotide sequence coding for a protein comprising or consisting of the Core protein and a fragment of the El protein represented by the general sequence of the genotype la (SEQ ID NO: 1) or by the consensus sequence of the genotype la (SEQ ID NO: 23) or by the general sequence of the genotype Ib (SEQ ID NO: 2) or by the consensus sequence of the genotype Ib (SEQ ID NO: 24) or by a sequence having more than 90% homology with the one of these sequences, or by the consensus sequence of genotype 2 (SEQ ID NO: 3) or by the consensus sequence of genotype 3 (SEQ ID NO: 4) or by the consensus sequence of genotype 4 (SEQ ID NO: 5) or by the consensus sequence of genotype 5 (SEQ ID NO: 6) or by the consensus sequence of genotype 6 (SEQ ID NO: 7) or by a sequence having more than 70% homology
  • homology refers to the proportion of identity between two nucleic acid sequences. This homology can be measured by seeking to align said sequences using an algorithm as defined in Altschul et al. (Nucl Acid Res 25: 3389, 1997) or using, for example, Clustal W software, well known to those skilled in the art and described in Thompson et al. (Nucl Acid Res 22: 4673, 1994).
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and the consensus sequences SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 correspond to 618 nucleotides.
  • the first 573 nucleotides of these sequences correspond to the sequence alignment of the various above-mentioned genotypes encoding the core protein and the E1 signal peptide.
  • the last 45 nucleotides correspond to another alignment of sequences coding for the 15 acids amino acids of the El protein which follow the signal peptide of El.
  • sequence accession numbers are: AF009606; AFOl 1751; AFOl 1752; AFOl 1753; M67463; M62381; AF290978; M55970; AF271632; AY695436; AY695437; M74812; AY231582; M74811; M74808; M62382; D00831; D10749; AF268569; AF268570; AF268571; AF268572; M62321; AF268574; AF268576; AF268578; AF268579; AF268577; AF268580; AF268573; AF268575; M74804; AF511950; AF529293; AJ278830; X84079; L12353; AY615798; M74805; AY885238;
  • sequence accession numbers are: AF009606; AY231582; M67463; AY746844; AY746845; AY746850; AY746847; AY746849; AY746853; AY746846; AY746848; AY746854; AY746851 AY746852; AY746897 AY746900; AY746901; AY746903; AY746908 AY746904; AY746902 AY746907; AY746906; AY746905; AY746899 AY746898; AY746751 AY746752; AY746760; AY746757; AY746759 AY746762; AY746753
  • accession numbers of the sequences are as follows: AB008441; AB008442; AB008443; AB049090; AB049091; M74807; AF 165051; AF 165052; AF207759; AB154177; AB154178; AB154203; AB154204; AB154206; AB154179; AB154180; AB154185; AB154186; AB154189; AB154194; AB154205; AB154191; AB154192; AB154193; AB154199; AB154201; AB154202; AF313916; AB154190; AB154181; AB154182; AB154183; AB154184; AB154200; AB154187; AB154188; AB154195; AB154196; AB154197; AB154198; AY0
  • accession numbers of these sequences are as follows: AB049087; AB049089; AB049092; AB049094; AB049095; AF165055; AF165056; AF333324; D90208; D89872; AF165053; AF165054; AB049096; AB049090; AF165063; AF165064; AB049088; AB049091; AF165051; AF165052; AB049093; AF403238; AF165057; AF165058; AF165061; AF165062; AF402571; AF403228; AF403237; AF403233; AF403234; AF403229; AF403231; AF403236; AF403232; AJ238799; AJ238800
  • accession numbers of these sequences are as follows: AB030907; D 10077; AF238486; AY232738; AY232739; AY232742; AY232743; D 10988; AY232744; AY232745; AY232730; AY232731; AY232732; AY232733; AY232734; AY232735; AY232736; AY232737; AY232740; AY232741; AY232748; AY232749; AY232746; AY232747; AB031663; AY070214; AY070215; D31972; L38326; D50409; L38321; L38322; L38319; L38324; L38328; L38329; L38320; L38330; L38337; D49754;
  • accession numbers of these sequences are as follows: AB030907; D10988; AB031663; AB047639; D00944; D50409.
  • accession numbers of these sequences are as follows: AF046866; D 14305; D17763; D14311; L12355; D14307; D14309; X76918; D28917; D16612; D16620; D16618; AY231584; AY231585; AY231586; AY231587; AY231588; AY231589; AY231590; D49374; Dl 1443; D16616; D37840; D37839; AY434137; AY434140; AY434153; D16614; D49747; D49749; D63821; D49750; D49752; D49753.
  • accession numbers of these sequences are as follows: AF046866; D17763; D28917; AY231584; AY231585; D49374; AY231586; AY231587; AY231590; AY231589; AY231588; AF216786; AF216787; AF216788.
  • accession numbers of these sequences are as follows: D45193; Y, 1604; L38338; U10238; L29587; L29624; L38323; L38332; U10236; U10235.
  • accession numbers of these sequences are as follows: AJ401094; AJ401096; Y, 1604; AJ401095; AJ401101; AJ401097; AJ401098; AJ401100; AJ401099.
  • accession numbers of these sequences are as follows: AF064490; D50466; L29577; Y13184.
  • accession numbers of these sequences are as follows: AY231583; D37841; D84262; AY859526; D88469; D88476; D88475; L38339; D88473; Y12083; D37848; D37849; D37850; D84265; D88465; L38331; D88466; D84264; D88468; D88470; D88471; D88472; AY434111; D49748; D63822; D49758; D49751; D31971; D88474; D88477; D88478; D37843; D37844; D37845; D38078; D37846; L38341; L38340; D84263; D88467.
  • accession numbers of these sequences are as follows: AY231583; D84262; AY859526; Y12083.
  • the general sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 correspond to a generic form of sequences from various strains whose accession numbers were given above.
  • sequences SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 are consensus sequences corresponding respectively to genotypes 2 to 6, la and Ib, which are formed from the only letters A , T, G or C and represent sequences in which each nucleotide at a given position is the most common nucleotide among the aligned strains of the genotype in question at the given position.
  • the mutated nucleotide sequence of the invention may be derived by mutation of a nucleotide sequence coding for a protein comprising or consisting of the Core protein and a fragment of the El protein, represented by one of the sequences associated with the genotype Ia, Ib , 2, 3, 4, 5 or 6 HCV, whose accession number is listed in the lists above.
  • the mutated nucleotide sequence of the invention may also be derived from a sequence itself derived by degeneracy of the genetic code of one of the consensus sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 or one of the sequences of the genotype strains 1a, 1b, 2, 3, 4, 5 or 6, the accession numbers of which appear above.
  • the invention relates to the above-mentioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, exhibiting one or more mutations with respect to the original nucleotide sequence coding for a protein comprising or consisting of the core protein of the first virus. 'Hepatitis C.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, comprising one or more mutations which correspond to the introduction of one or more STOP codons into the reading frame +1 of the nucleotide sequence. original.
  • the STOP codons are of the TAG, TAA or TGA form if the coding DNA strand, or UAG, UAA or UGA is taken as reference if the transcribed RNA is taken as reference.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, also having one or more additional mutations corresponding to the restoration of one or more synonymous codons in the reading frame 0.
  • the presence of one or more mutations making it possible to introduce one or more STOP codons into reading frame +1 can modify the amino acids encoded in reading frame 0, in which case it is advantageous, in order to avoid this modification, to introduce one or more additional mutations, usually located 1, 2 or 3 nucleotides after the mutation (s) introducing the STOP codon (s) in reading frame +1.
  • additional mutations cancel the effect of the STOP codon-related mutations in the +1 frame by restoring normal amino acid coding in frame 0.
  • the mutations intended to obtain the STOP codons in the +1 frame are preferentially present on nucleotides located in the 3n-type position (for example 3, 6, 9, etc.).
  • the mutations intended to obtain the STOP codons in the +1 frame are preferentially present on nucleotides located in the 3n + 1 position (for example 4, 7, 10, etc.).
  • the mutations intended to obtain the STOP codons in the +1 frame are preferentially present on nucleotides located in the 3n + 2 position (for example 5, 8, 11, etc.).
  • the introduction of a STOP codon in the reading frame +1 requires a single point mutation (substitution).
  • the introduction of a STOP codon in the reading frame +1 requires two point mutations (substitutions).
  • the introduction of a STOP codon in the reading frame +1 requires three point mutations (substitutions).
  • the mutations intended to restore synonymous codons following the introduction of STOP codons in the +1 frame are preferably present on nucleotides located in the 3n-like position (for example 3, 6, 9, etc.). ).
  • the mutations intended to restore synonymous codons following the introduction of STOP codons in the +1 frame are preferably present on nucleotides located in the 3n + 1 position (for example 4, 7, 10. ..).
  • the mutations intended to restore synonymous codons following the introduction of STOP codons in the +1 frame are preferably present on nucleotides located in the 3n + 2 position (for example 5, 8, 11. ..).
  • the restoration of a synonym codon in reading frame 0 following one or more mutations introducing a STOP codon in reading frame +1 requires a single point mutation (substitution).
  • the restoration of a synonym codon in reading frame 0 following one or more mutations introducing a STOP codon in reading frame +1 requires two point mutations (substitutions).
  • the restoration of a synonym codon in reading frame 0 following one or more mutations introducing a STOP codon into reading frame +1 requires three point mutations (substitutions).
  • Mutations can also introduce STOP codons into the +2 reading frame.
  • the ARFP family is normally expressed in the +1 reading frame, it may be advantageous to introduce such STOP codons in the +2 reading frame since a sliding of the reading frame at +2 / -1 is always possible despite everything.
  • additional mutations can also be used to restore synonymous codons in reading frame 0 as a result of the mutations allowing the introduction of STOP codons in the +2 reading frame.
  • the mutations intended to obtain the STOP codons in the +2 frame are preferably present on nucleotides located in the 3n position (for example 3, 6, 9, etc.).
  • the mutations intended to obtain the STOP codons in the +2 framework are preferably present on nucleotides located in the 3n + 1 position (for example 4, 7, 10, etc.).
  • the mutations intended to obtain the STOP codons in the +2 frame are preferentially present on nucleotides located in. position of type 3n + 2 (for example 5, 8, 11 ).
  • the introduction of a STOP codon in the +2 reading frame requires a single point mutation (substitution).
  • the introduction of a STOP codon in the +2 reading frame requires two point mutations (substitutions).
  • the introduction of a STOP codon in the +2 reading frame requires three point mutations (substitutions).
  • the mutations intended to restore synonymous codons following the introduction of STOP codons in the +2 frame are preferably present on nucleotides located in the 3n position (for example 3, 6, 9, etc.). ).
  • the mutations intended to restore synonymous codons following the introduction of STOP codons in the +2 frame are preferably present on nucleotides located in the 3n + 1 position (for example 4, 7, 10. ..).
  • the mutations intended to restore synonymous codons following the introduction of STOP codons in the +2 frame are preferably present on nucleotides located in the 3n + 2 position (for example 5, 8, 11. ..).
  • restoring a synonymous codon in the reading frame 0 as a result of one or more mutations introducing a stop codon in reading frame 2 requires a single point mutation (substitution).
  • the restoration of a synonym codon in reading frame 0 following one or more mutations introducing a STOP codon in reading frame +2 requires two point mutations (substitutions).
  • the restoration of a synonym codon in reading frame 0 following one or more mutations introducing a STOP codon in reading frame +2 requires three point mutations (substitutions).
  • the invention relates to the above-mentioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, exhibiting one or more additional mutations corresponding to the modification of the secondary structure of transcribed PARN corresponding to said mutated nucleotide sequence. and / or optimizing the translation of said transcribed RNA.
  • connection points The splice donor and acceptor sites (cryptic), the connection points.
  • TATA boxes makes it possible to limit transcription
  • Chi sites makes it possible to limit recombination. Splicing is advantageously avoided insofar as it can allow a change of the reading frame.
  • indirect repeats over 8 nucleotides are preferably avoided to the extent possible to avoid the formation of stable secondary structures of RNA and thereby avoid the im events internal tiation.
  • additional mutations may aim to avoid rare codons, in order to increase translation efficiency (relative availability of different tRNAs).
  • the invention relates to the above-mentioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived by mutation of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 of the strain J of genotype Ib of the virus. hepatitis C, coding for the core protein.
  • strain J of genotype Ib has been described in particular by Kato et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 9524-9528 (1990).
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived by mutation of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 of the genotype Ib strain of the hepatitis C virus, coding for the core protein and the E1 signal peptide.
  • the set consisting of the core protein and the E1 signal peptide (coded for example by SEQ ID NO: 9) is called the capsid.
  • the invention relates to the above-mentioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived by mutation of the nucleotide sequence of the genotype Ib strain of the hepatitis C virus represented by SEQ ID NO: 10, coding for the core protein and an E1 fragment or by SEQ ID NO: 11, encoding the Core protein and the E1 protein or by SEQ ID NO: 12, encoding the Core protein, the E1 protein and the E2 protein.
  • the expression "coding for the core protein and an E1 fragment” means in the case of SEQ ID NO: 10 "coding for the Core protein, the E1 signal peptide, and the 15 E1 amino acids following this signal peptide. ".
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9 or 10 or 11 or 12, and having a set of mutations relating to one of the nucleotide triplets 65-67, 137-139 or 293-295, said set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of the aforementioned nucleotide triplet, introducing a STOP codon in the context of reading +1 and not introducing a STOP codon in the reading frame O, said mutated nucleotide sequence being in particular represented by SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • sequence represented by SEQ ID NO: 13 is derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10, with a T ⁇ G substitution at position 66 to introduce a STOP codon into reading frame +1 (codon 22/23) .
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 14 is derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10, with a C -> A substitution at position 139 to introduce a STOP codon in reading frame +1 (codon 46/47 ), and a C -> A substitution at position 141 to restore a synonym codon.
  • SEQ ID NO: 15 is derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10, with a substitution T -> A at position 295 to introduce a STOP codon in reading frame +1 (codon 98/99 ), and two substitutions to restore a synonym codon, namely C -> G at position 296 and A -> C at position 297.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9 or 10 or 11 or 12, and having two sets of mutations carrying respectively on two triplets of nucleotides selected from nucleotide triplets 65-67, 137-139 and 293-295, each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the aforementioned triplets, introducing, two STOP codons in reading frame +1 and not introducing a STOP codon in reading frame 0, said mutated nucleotide sequence being in particular represented by SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 16 is derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10, with a substitution T -> G at position 66 to introduce a first STOP codon in reading frame +1 (codon 22 / 23), a C -> A substitution at position 139 to introduce a second STOP codon in reading frame +1 (codon 46/47), and a C -> A substitution at position 141 to restore a synonym codon.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 17 is derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10, with a T ⁇ G substitution at position 66 to introduce a first STOP codon in reading frame +1 (codon 22/23) , a substitution T -> A at position 295 to introduce a second STOP codon into reading frame +1 (codon 98/99), and two substitutions (C -> G at position 296 and A-> C at position 297 ) to restore a synonym codon.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 18 is derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10, with a C -> A substitution at position 139 to introduce a first STOP codon into reading frame +1 (codon 46 / 47) and a C -> A substitution at position 141 to restore a synonymous codon, as well as a substitution T -> A at position 295 to introduce a second STOP codon in reading frame +1 (codon 98/99), and two substitutions (C -> G at position 296 and A-> C at position 297) for restore a synonym codon.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9 or 10 or 11 or 12, and having three sets of mutations carrying respectively on the three triplets of nucleotides 65-67, 137-139 and 293-295, each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the aforementioned triplets, introducing three STOP codons in the frame reading +1 and not introducing a STOP codon in reading frame 0, said mutated nucleotide sequence being in particular represented by SEQ ID NO: 19.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 19 is derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10, with a substitution T -> G at position 66 to introduce a first STOP codon into the reading frame +1 (codon 22 / 23), a C -> A substitution at position 139 to introduce a second STOP codon in reading frame +1 (codon 46/47) and a C -> A substitution at position 141 to restore a synonymous codon, thus a substitution T -> A at position 295 to introduce a second STOP codon in reading frame +1 (codon 98/99), and two substitutions (C -> G at position 296 and A -> C in position 297) to restore a synonym codon.
  • the STOPs introduced at codons 22/23 and 98/99 are at first rather interesting for the sequences derived from a sequence of genotype 1a, whereas the STOP introduced at codon 46/47 presents a priori rather an interest for the derived sequences. of a genotype sequence Ib.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 8 and having one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides. selected from nucleotide triplets 65-67, 137-139 and 293-295, and one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides selected from nucleotide triplets No.
  • each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of 1 one of the abovementioned triplets, introducing at least one additional STOP codon in the reading frame +1 and not introducing a STOP codon in the reading frame 0.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 9, and having one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets No. 65-67, 137-139 and 293-295, and one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets No.
  • each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the abovementioned triplets, introducing at least one additional STOP codon into the reading frame +1 and does not introduce a STOP codon in read frame 0.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 11 or 12, and having at least one set of mutations relating to the at least one of the three triplets of nucleotides No. 65-67, 137-139 and 293-295, and at least one set of mutations relating to at least one of the triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets No.
  • each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the aforementioned triplets, introducing at least one additional STOP codon in reading frame +1 and not introducing a STOP codon in reading frame 0.
  • the invention relates to the above-mentioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 11 or 12, presenting for only mutations, at least one set of mutations bearing on at least one of the three triplets of nucleotides no.
  • each set of mutations consisting of the 1 nucleotide substitution of one of the triplets above, introducing at least one STOP codon additional in reading frame +1 and not introducing STOP codon in reading frame 0.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 11 or 12, exhibiting at least one set of mutations relating to one at least three triplets of nucleotides No. 65-67, 137-139 and 293-295, and at least one set of mutations relating to at least one of the triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets No.
  • each set of mutations consisting of the 1 nucleotide substitution of one of the aforementioned triplets, introducing the minus one additional STOP codon in reading frame +1 and not introducing a STOP codon in reading frame 0, and also having mutations corresponding to the restoration of synonymous codons in reading frame 0, each of these mutations consisting respectively of a substitute ion on a nucleotide located in position p + 1 with respect to a mutation in position p introducing a STOP codon in reading frame +1.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 11 or 12, exhibiting at least one set of mutations relating to one at least three triplets of nucleotides No. 65-67, 137-139 and 293-295, and at least one set of mutations relating to at least one of the triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets No.
  • each set of mutations consisting of the 1 nucleotide substitution of one of the aforementioned triplets, introducing the minus one additional STOP codon in reading frame +1 and not introducing a STOP codon in reading frame 0, and also having mutations corresponding to the restoration of synonymous codons in reading frame 0, each of these mutations consisting respectively of a substitute ion on a nucleotide located in position p + 2 with respect to a mutation in position p introducing a STOP codon in reading frame +1.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by .
  • SEQ ID NO: 8 and having 7 sets of mutations respectively relating to 7 triplets of nucleotides 65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the abovementioned triplets, introducing 7 STOP codons in the reading frame +1 and not introducing a STOP codon into the reading frame 0.
  • the invention relates to the above-mentioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 9, and having 8 sets of mutations respectively relating to the 8 triplets of nucleotides no. 65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of the one of the aforementioned triplets, introducing 8 STOP codons in the reading frame +1 and not introducing a STOP codon in the reading frame 0.
  • the invention relates to the abovementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 11 or 12, and having 11 sets of mutations respectively relating to the 11 triplets.
  • nucleotide sequence mutant may in particular be the sequence SEQ ID NO: 20.
  • SEQ ID NO: 20 is derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10 and has 20 substitutions, 12 of which are used to obtain 11 STOP codons in reading frame +1, while 8 serve to restore codons. synonymous.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 8, and further comprising one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides selected from nucleotide triplets No.
  • each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the aforementioned triplets introducing a STOP codon into the +2 reading frame and not introducing a STOP codon into reading frame 0.
  • the invention relates to the aforementioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 9, and further comprising one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides selected from nucleotide triplets No.
  • each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the abovementioned triplets introducing a STOP codon in the +2 reading frame and not introducing a STOP codon in reading frame 0.
  • the invention relates to the above-mentioned use of the mutated nucleotide sequence as defined above, derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 11 or 12, and further comprising one or more sets of mutations carrying respectively on one or more triplets of nucleotides selected from triplets of nucleotides No.
  • each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the abovementioned triplets introducing a STOP codon into the +2 reading frame and not introducing a STOP codon into reading frame 0, said mutated nucleotide sequence being in particular, be the sequence SEQ ID NO: 21 or the sequence SEQ ID NO: 22.
  • sequence represented by SEQ ID NO: 21 is derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10 and has, in addition to all the substitutions already described with respect to the sequence represented by SEQ ID NO: 20, 38 additional substitutions, of which 32 serve to obtain 23 STOP codons in the +2 reading frame, while 6 serve to restore synonymous codons.
  • sequence represented by SEQ ID NO: 22 is derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 10 and has, in addition to all the substitutions already described with respect to the sequence represented by SEQ ID NO: 20 and the sequence represented by SEQ ID NO: 21, additional mutations for modification of the secondary structure of transcribed RNA corresponding to said mutated nucleotide sequence and / or optimization of translation of said transcribed RNA.
  • Position 4 A ->T; position 5G ->C; position 12 T ->C; position 21 T ->C; position 24 A ->G; position 27 A ->G; position 37 C ->A; position 39 T ->G; position 52 C ->A; position 54 C ->G; position 69 G ->A; position 75 G ->A; position 78 C ->A; position 81 T ->A; position 84 T ->A; position 93 T ->G; position 96 T ->A; position 102 T ->G; position 109 T ->C; position 120 G ->A; position 123 C ->A; position 129 G ->A; position 130 T ->C; position 135 T ->A; position 144 G ->A; position 150 G ->A; position 162G ->A; position 163 C ->A; position 165 G ->A; position 166 T ->A; position 167 C ->G; position 168G ->C; position 171 A ->G; position 184 C
  • the invention relates to the aforementioned use of any of the mutated nucleotide sequences as defined above, which encodes in its reading frame 0 for a protein comprising or consisting of the protein Core or by a fragment of the core protein, the protein sequence of said core protein or said core protein fragment having no mutation with respect to the protein sequence of the normal core protein or the corresponding fragment of the normal core protein.
  • normal core protein any wild core protein expressed by the natural variants of the different genotypes of the hepatitis C virus.
  • the protein comprising or consisting of the Core protein, which is encoded by the original or initial (non-mutated) nucleotide sequence may be of natural origin (produced by the hepatitis C virus) or recombinant.
  • the protein comprising or consisting of the Core protein, which is encoded by the aforementioned mutated nucleotide sequence according to the invention is a recombinant protein.
  • the invention also relates to a nucleotide sequence having one or more mutations with respect to a nucleotide sequence encoding a protein comprising or consisting of the Core protein or a fragment of the Core protein, and optionally the El protein and / or the protein E2 of hepatitis C virus and / or E1 and / or E2 protein fragment (s) of hepatitis C virus strain, allowing expression by a living cell of the core protein and not allowing not the expression by a living cell of an ARJFP protein or a fragment of an ARFP protein of more than 11 amino acids.
  • the invention relates to the abovementioned nucleotide sequence, which exhibits one or more mutations with respect to a nucleotide sequence of genotype 1a, Ib, 2, 3, 4, 5 or 6 strain of the hepatitis C virus, encoding the reading frame 0 for, a protein comprising or consisting of the Core protein or a fragment of the Core protein, and optionally the E1 protein and / or the E2 protein of the hepatitis C virus and / or one or more fragments of the E1 protein and / or the E2 protein, and not coding for an ARFP protein or for an ARFP protein fragment of more than 11 amino acids in the reading frame +1.
  • the invention relates to the above-mentioned nucleotide sequence, which exhibits one or more mutations with respect to a nucleotide sequence of genotype 1a or Ib of the hepatitis C virus encoding in reading frame 0 for a protein comprising or consisting of the Core protein or a fragment of the Core protein, and where appropriate the E1 protein and / or the E2 protein of the hepatitis C virus and / or one or more fragments of the E1 protein and / or the protein E2, and not coding for an ARFP protein or for an ARFP protein fragment of more than 11 amino acids in reading frame +1.
  • the invention relates to the aforementioned nucleotide sequence, which is such that one or more STOP codons are present in said reading frame +1.
  • the invention relates to the above-mentioned nucleotide sequence, which has a number of additional mutations corresponding to the restoration of one or more synonymous codons in reading frame 0.
  • the invention relates to the aforementioned nucleotide sequence, which has one or more additional mutations corresponding to the modification of the secondary structure of transcribed PARN corresponding to said mutated nucleotide sequence and / or to the optimization of the translation of said transcribed RNA.
  • the invention relates to the above-mentioned nucleotide sequence, which has a set of mutations relating to one of the nucleotide triplets 65-67, 137-139 or 293-295 with respect to the nucleotide sequence represented by SEQ ID - NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12, said set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the aforementioned triplets introducing a STOP codon into the reading frame +1 and not introducing a STOP codon in the " reading frame O", said sequence mutated nucleotide that may be especially represented by SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the invention relates to the aforementioned nucleotide sequence, which has two sets of mutations respectively relating to two triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets No. 65-67, 137-139 and 293-295 with respect to the nucleotide sequence represented by by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12, each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one aforementioned triplets, introducing two respective STOP codons in the reading frame +1 and not introducing a STOP codon in the reading frame O said mutated nucleotide sequence can be represented in particular by SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18.
  • the invention relates to the aforementioned nucleotide sequence, which has three sets of mutations respectively relating to the three triplets of nucleotides No. 65-67, 137-139 and 293-295 relative to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12, each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the aforementioned triplets, introducing three respective STOP codons in the reading frame +1 and not introducing a STOP codon in the reading frame O, said mutated nucleotide sequence being in particular represented by SEQ ID NO: 19.
  • the invention relates to the above-mentioned nucleotide sequence, which has one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets Nos. 65-67, 137-139 and 293-295, and one or several sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets Nos.
  • each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the abovementioned triplets, introducing at least one additional STOP codon into the reading frame +1 and not introducing a STOP codon in the frame O.
  • the invention relates to the abovementioned nucleotide sequence, which has one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets no. 65-67, 137-139. and 293-295, and one or more sets of mutations respectively relating to one or more of the triplets of nucleotides selected from nucleotide triplets No.
  • each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the abovementioned triplets, introducing at least one additional STOP codon into the reading frame + 1 and not introducing a STOP codon in reading frame 0.
  • the invention relates to the above-mentioned nucleotide sequence, which has one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets Nos. 65-67, 137-139 and 293-295, and one or more sets of mutations respectively relating to one or more of the triplets of nucleotides selected from nucleotide triplets No.
  • the invention relates to the abovementioned nucleotide sequence, which has 7 sets of mutations respectively relating to 7 triplets of nucleotides 65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400 , 464-466, with respect to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8, each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the aforementioned triplets, introducing 8 STOP codons in the context of reading +1 and not introducing a STOP codon in reading frame 0.
  • the invention relates to the abovementioned nucleotide sequence, which has 8 sets of mutations respectively relating to 8 triplets of nucleotides 65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400 , 464-466, 545-547, relative to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the aforementioned triplets, introducing 8 STOP codons in the reading frame +1 and not introducing a STOP codon in reading frame 0.
  • the invention relates to the abovementioned nucleotide sequence, which has 11 sets of mutations relating respectively to the 11 triplets of nucleotides Nos. 65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610 relative to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12, each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the aforementioned triplets, introducing 11 STOP codons into the reading frame +1 and not introducing a STOP codon in the reading frame 0, said mutated nucleotide sequence can in particular be represented by SEQ ID NO: 20.
  • the invention relates to the aforementioned nucleotide sequence, which furthermore comprises one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets Nos. 9-11, 33-35, 45-47. , 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369.
  • each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the aforementioned triplets introducing a STOP codon in the +2 reading frame and not introducing a STOP codon in reading frame 0.
  • the invention relates to the aforementioned nucleotide sequence, which furthermore comprises one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides chosen from nucleotide triplets Nos. 9-11, 33-35, 45-47. , 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369.
  • each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of the one of the aforementioned triplets introducing a STOP codon in the +2 reading frame and not introducing a STOP codon in the reading frame 0.
  • the invention relates to the aforementioned nucleotide sequence, which comprises one or more sets of mutations respectively relating to one or more triplets of nucleotides chosen from triplets of nucleotides No. 9-11, 33-35, 45-47, 48- 50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569, 576-578, 612-614, 615-617 relative to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO : 12, each set of mutations consisting of the substitution of 1, 2 or 3 nucleotides of one of the abovementioned triplets introducing a STOP codon in the reading frame +2 and not introducing a codon STOP in the reading frame 0, said
  • the invention relates to the abovementioned nucleotide sequence, which is such that the protein sequence of the core protein or the core protein fragment encoded by the nucleotide sequence does not show a mutation with respect to the protein sequence of the normal core protein. (or wild) or corresponding fragment of the normal Core protein.
  • the invention relates to a transcribed RRN corresponding to one of the abovementioned nucleotide sequences or a single-stranded nucleic acid (DNA or RNA) molecule complementary to one of the abovementioned nucleotide sequences.
  • the invention also relates to a recombinant vector containing a nucleotide sequence according to the invention.
  • the recombinant vector or expression vector can in particular be in plasmid form optionally coupled to vectorizing agents (such as liposomes, cationic lipids, etc.), or in the form of viruses (such as poxviruses or adenoviruses).
  • vectorizing agents such as liposomes, cationic lipids, etc.
  • viruses such as poxviruses or adenoviruses.
  • said expression vector contains the control elements of the expression.
  • expression control elements is meant the elements necessary to ensure the expression of the nucleotide sequence according to the invention after its transfer into a cell or a host organism.
  • the control elements may vary depending on the host, the expression vector, the level of expression sought. Such elements are known to those skilled in the art. Among these elements, the sponsor is of particular importance.
  • the promoter that can be used in the context of the present invention may be of viral, cellular or even synthetic origin. In addition, it may be ubiquitous or specific, for example of a given cell type or activatable under defined conditions.
  • HSV-I Herpes Simplex Virus
  • MLP adenovirus late promoter
  • vaccinia virus promoters promoters 7.5K, H5R, TK, p28, p1 and KlL
  • cellular promoters As examples of cellular promoters, mention may be made more particularly promoters of the phosphoglycero kinase genes (PGK, Adra et al., 1987, Gene 60, 65-74), albumin (Pinkert et al., 1987, Genes Dev., 1, 268-277), phosphoenol pyruvate carboxy kinase (PEPCK) (Eisenberger et al., 1992, Mol., Cell Biol 12, 1396-1403), cholesterol 7-alpha hydroylase (CYP-7) (Lee et al., 1994, J. Biol Chem 269, 14681-14689).
  • PGK phosphoglycero kinase genes
  • albumin Pinkert et al., 1987, Genes Dev., 1, 268-277
  • PEPCK phosphoenol pyruvate carboxy kinase
  • CYP-7 cholesterol 7-alpha hydroylase
  • alpha-1 antitrypsin (Ciliberto et al., 1985, Cell 41, 531-540), transferrin (Mendelzon et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18, 5717-5721); and factor IX (US 5,814,716) that confer liver-specific expression.
  • the expression vector of the invention may comprise one or more control elements that make it possible in particular to optimize the transcription of the nucleotide sequence, the stability or the transport of the messenger RNAs and / or their translation into protein.
  • control elements are known to those skilled in the art, for example the 5 ', 3' non-coding sequences, introns, splicing sequence, transcription termination sequence, Shine-Dalgarno sequence, or Kozak sequence. .
  • the invention also relates to a cellular host transformed or transfected with the aforementioned expression vector.
  • transfection refers to any conventional method of introducing a vector into a cellular host and includes infection with a virus.
  • a viral vector can be introduced into the host by transfection of its genome or by infection of the viral particle.
  • transformed or transfected cellular hosts are: prokaryotic cells, eukaryotic cells, especially insects, mammals or plants, primary cells or cells derived from cell lines, but also transgenic organisms, especially transgenic mammals, such as transgenic mice.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleotide sequence mentioned above, or an expression vector mentioned above, or a transformed or transfected cellular host mentioned above, as an active substance, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • compositions of the invention are suitable for oral, sublingual, subcutaneous, intramuscular, intravenous, topical, local, intratracheal, intranasal, transdermal, rectal, intraocular, intra-auricular administration, said active ingredient being administrable under unitary form of administration in one or more times.
  • the unit dosage forms may be, for example, tablets, capsules, granules, powders, injectable oral solutions or suspensions, transdermal patches, sublingual, oral, intratracheal, intraocular forms of administration. , intranasal, intra-auricular, by inhalation, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration forms, rectal administration forms or implants.
  • the unit doses suitable for the present invention comprise from 10 to 10 13 virus particles.
  • Unit doses comprising from 10 to 5x10 pfu (plaque forming unit) of vaccinia virus (MVA) or from 5x10 to 5x10 ⁇ viral particles of adenovirus are particularly suitable for the present invention.
  • MVA vaccinia virus
  • the dosage appropriate to each patient is determined by the physician according to the mode of administration, the weight and the response of the patient.
  • the present invention also relates to a method for treating pathologies associated with the hepatitis C virus which comprises administering to a patient, an effective dose of a drug ( or pharmaceutical composition) of the invention.
  • compositions of the invention may be combined with other therapeutic modalities (radiation, chemotherapy and / or surgery) and / or other conventional therapeutic treatments for treating diseases associated with the hepatitis C virus, for example, protease inhibitors, antivirals, vaccine preparations using other HCV antigens (especially those described in WO2004 / 111082), or antibodies.
  • other therapeutic modalities radiation, chemotherapy and / or surgery
  • other conventional therapeutic treatments for treating diseases associated with the hepatitis C virus for example, protease inhibitors, antivirals, vaccine preparations using other HCV antigens (especially those described in WO2004 / 111082), or antibodies.
  • interferon alfa for example pegylated IFN- ⁇ 2a or not
  • ribavirin for example pegylated IFN- ⁇ 2a or not
  • the invention also relates to an extract and / or cell supernatant derived from a culture of cells transfected with a nucleotide sequence mentioned above or an expression vector mentioned above, containing, before any possible step of protein recovery, a protein containing the core protein. or a fragment of the Core protein and, where appropriate, the El protein and / or the E2 protein of the hepatitis C virus and / or a fragment of the El protein and / or the E2 protein, but not containing any protein ARFP or ARFP protein fragment of more than 11 amino acids.
  • the invention also relates to a serum or plasma extract from a host, in particular a human or an animal, transfected with a aforementioned nucleotide sequence or an aforementioned expression vector, containing, before any possible step of protein recovery, a protein containing the core protein or a fragment of the core protein and, where appropriate, the E1 protein and / or the E2 protein of the hepatitis C virus and / or a fragment of the E1 protein and / or the E2 protein, but not containing no ARFP protein or ARFP protein fragment of more than 11 amino acids.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a protein containing the Core protein or a fragment of the Core protein and, where appropriate, the El protein and / or the E2 protein of the hepatitis C virus and / or a fragment of the El protein and / or E2 protein, but not containing ARFP protein or ARFP protein fragment of more than 11 amino acids, characterized in that it comprises a step of transforming appropriate host cells with a aforementioned expression vector, culturing the thus transformed cells, and recovering, and optionally, purifying the aforementioned protein.
  • the step of transforming said host cells can be carried out by any technique for introducing a vector or a nucleotide sequence into a cell.
  • the invention also relates to a method for in vitro diagnosis, or prognosis, of pathologies related to infection with the hepatitis C virus, in humans or animals, comprising:
  • hepatitis C, - • the detection of antibodies respectively against the core protein of hepatitis C may be present in said biological sample or proteins Core possibly present in said biological sample.
  • the invention also relates to prophylactic and therapeutic vaccination, which can be implemented by injecting a vaccine based on at least one expression vector or recombinant vector comprising the nucleotide sequences of the invention, injection followed by recalls or not.
  • the vaccination can also be implemented by injecting two different types of expression vectors of the invention, for example first an adenovirus, then a poxvirus, simultaneously or delayed in time, and vice versa. These vectors can be contained in a pharmaceutical kit.
  • Detection is by Western Blot using anti-ARFP (15E7F1) and anti-Core (19D9D6) monoclonal antibodies.
  • Figure IA the detection of Core and ARFP is simultaneous, in the presence of proteasome inhibitor (MG-132).
  • Fig. 1B the detection of Core and ARFP is separated, in the presence or absence of MG-132.
  • the data are representative of 4 independent experiments.
  • THP-I cells (FIG. 2A) and Huh7 cells (FIG. 2B) infected or not by the recombinant adenoviral vectors (Ad) encoding ⁇ -galactosidase, CoreElE2 (CE1E2), Core and ARFP10I are infected at a multiplicity of infection. of 200 and 100 respectively. 60 hours after infection, the proteasome inhibitor is added and Western Blot analysis is performed at 72 hours using anti-ARFP and Anti-Core monoclonal antibodies. The results represent 5 different experiences.
  • the labeling reveals a diffuse cytoplasmic expression of ARFPioi- THP-I cells are infected with Ad-ARFP 101 (A), -Core (B), -CE1E2 (C) or - ⁇ -Gal (D, E, F) at a multiplicity of infection of 200 for 72 hours in the presence of MG-132 during the last 12 hours.
  • the cells are then labeled with an anti-ARFP (A, D) and anti-Core (B, C, E, F) monoclonal antibody and then a TRITC conjugated rabbit polyclonal anti-mouse antibody.
  • Magnification 100x.
  • FIG. 4 Expression of chemokines.
  • the factors Soluble released are measured using the Human Cytokine Array III. Positive and negative controls are duplicated at positions a- 1/2, b-1/2 and 1-7 / 8 and negative controls at positions c-1/2, d-1/2 and k-7/8 .
  • g- 3/4 ⁇ interleukin 8; h-5/6 RANTES.
  • GFP expression was analyzed by flow cytometry by cells transfected with a coding sequence for Core and the GFP coding sequence inserted in reading frame 0 (top left) or +1 (top right) compared to the first; or with the sequence C ⁇ ARFP and the sequence coding for the GFP in the frame +1 (bottom left) or +2 (bottom right) relative to the first.
  • Core protein expression is investigated by Ad-C ⁇ ARFP, -CE1E2, -Core or - ⁇ Gal-infected THP-I cells.
  • FIG. 6A Flow cytometry analysis (FACScalibur, BD Biosciences) after labeling with an anti-core antibody (19D9D6, dilution 1/10000) and then with a goat anti-mouse mouse antibody conjugated to FITC (1/100).
  • Figure 7 Demonstration of the induction of MIP-l ⁇ , MCP-I and IL-8 by the endogenous expression of Core and / or ARFP.
  • MCP-I, MIP-I ⁇ and IL-8 are measured by ELISA by THP-I cells infected with Ad- ⁇ gal, -CE1E2, -Core, -ARFP- 101 and -C ⁇ ARFP or non-infected after culture for 72 hours, wash and incubate for: (A) 24 additional hours or (B) 48 hours more before taking the supernatant. The results are expressed in mean values ⁇ standard error.
  • Figure 7A, IL-8 graph P ⁇ 0.001 between Ad-CE1E2 and Ad- ⁇ Gal and not significant between Ad-C ⁇ ARFP and Ad-CE1E2;
  • THP-I cells The production of MCP-I, MIP-I ⁇ and IL-8 is measured by THP-I cells which are: incubated with exogenous Core protein at 5 ⁇ g / ml (m), 2.5 ⁇ g / ml (T ) or 1.25 ⁇ g / ml (•), the measurements being carried out in the supernatant at different times (FIG. 8A), or incubated with the adenoviral construct for 72 hours, then washed and incubated in 24 plates at 10 6 cells / ml for another 48 hours in the presence of exogenous Core at 5 ⁇ g / ml (FIG. 8B).
  • FIG. 9A illustrates the evaluation of the CD8 + T response specific for the DLM epitope (corresponding to residues 132-140 of the HCV polyprotein) by CTL test after intramuscular injection of the plasmids gWiz C 206 ⁇ ARFP, gWiz C 206 and gWiz .
  • the results are expressed as a percentage of specific lysis as a function of the effector / target ratio per mouse (3 mice immunized for gWiz C 206 ⁇ ARFP and gWiz C 206 , 2 mice immunized for gWiz) using target cells loaded with the epitope DLM. .
  • FIG. 9A illustrates the evaluation of the CD8 + T response specific for the DLM epitope (corresponding to residues 132-140 of the HCV polyprotein) by CTL test after intramuscular injection of the plasmids gWiz C 206 ⁇ ARFP, gWiz C 206 and gWiz .
  • FIG. 9B illustrates the evaluation of the specific CD8 + T response of the DLM epitope by ELISPOT-IFN ⁇ test after intramuscular injection of the plasmids gWiz C 206 ⁇ ARFP, gWiz C 206 and gWiz.
  • the results are expressed as the number of spots (corresponding to the IFN ⁇ producing cells) relative to 10 6 cells for the mice immunized with the plasmid gWiz C 206 ⁇ ARFP (3 immunized mice), the plasmid gWiz C 206 (3 immunized mice) or the non-recombinant plasmid gWiz (2 immunized mice).
  • FIG. 10 Trans-activation of the PIL-8 promoter in Huh-7 hepatocyte cells co-performed with the plasmids indicated in the table and a reporter plasmid expressing luciferase under the control of the IL-8 promoter.
  • the expression of the proteins is detected by Western blotting using anti-ARFP, anti-core and anti-actin antibodies (transfection control).
  • Huh 7 human hepatoma cells are maintained at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere in complete DMEM medium containing modified Dulbecco's Eagles medium to which 10% of fetal calf serum, 2 mM of L-glutamine and 100 IU / ml penicillin / streptamycin (Sigma).
  • the THP-I (ATCC) line a human monocyte leukemia cell line, is cultured in complete RPMI medium containing 10% fetal calf serum to which 2 mM L-glutamine and 100 IU / ml have been added. penicillin / streptomycin.
  • Plasmids pTGHisCElE2 and pTGHisCore are constructed by PCR by inserting a poly-histidine tagcgccaccatgcatcaccatcaccatcaccatcacggtggtgtg sequence (SEQ ID NO: 26) between the AUG initiation codon and the second codon, in the plasmids described in Himoudi et al., J. Virol, 76, 12735-12746 (2002).
  • Plasmids pQBCore GFP (0) and pQBCore GFP (+1) are as described in Boulant et al., J. Biol. Chem., 278, 45785-45792 (2003).
  • CAARFP (or CAARFP 206 ) corresponds to SEQ ID NO: 22. It was synthesized by GeneArt and encodes a polypeptide of 206 residues (including, in addition to the initiating methionine, the 190 residues of the HCV core protein and the first 15 residues of the envelope protein E1).
  • 3 plasmids containing the sequence coding for GFP (green fluorescent protein) in reading frame 0, +1 or +2 of the sequence of nucleotides 1-420 (pQB1-C ⁇ ARFP-GFP (O)), 1-421 (pQB1-C ⁇ ARFP-GFP (+ 1)) or 1-422 (pQB1-C ⁇ ARFP-GFP (+2)) of C ⁇ ARFP are constructed and used in in vitro expression studies.
  • Ad-ARFP 101 and AdC ⁇ ARFP are constructed as follows: the ARFP 101 sequence which covers nucleotides 470-775 (bounded boundaries) relative to the start of the HCV genome or 128-433 (bounded boundaries) relative to the beginning of the Core gene, flanked by a 5 'ATG initiator triplet, and corresponding to a 101 amino acid polypeptide of the ARFP genotype Ib domain between codons 43 and 144 (sequence represented by SEQ ID NO: 25) as well as the C ⁇ ARFP sequence (SEQ ID NO: 22), are amplified by PCR.
  • Each sequence is inserted into an adenovirus shuttle plasmid (pTG13387) containing an expression cassette under the control of a cytomegalovirus (CMV) promoter to allow homologous recombination with the main vector adenoviral sequences (pTG6624).
  • pTG13387 adenovirus shuttle plasmid
  • CMV cytomegalovirus
  • the vectors pTG13387 and pTG6624 were provided by TRANSGENE SA (France). Homologous recombination is carried out in E. coli and the viral preparations are titrated by mimunofluorescence using a monoclonal antibody specific for the viral DNA binding protein (Lusky et al., J. Virol., 72, 2022-2032, 1998; Reich et al., Virology, 128, 480-484, 1983).
  • the adenoviral vector is designated Ad-C ⁇ ARFP or Ad-C 206 ⁇ ARFP.
  • the sequence coding for the mutated Core protein according to the invention is also introduced into a gWiz (Gene Therapy System) expression plasmid under the control of the CMV promoter, to give gWiz C ⁇ ARFP (or gWiz C 206 ⁇ ARFP).
  • gWiz Gene Therapy System
  • Vectors encoding a 191-residue Core C ⁇ ARFP protein comprising, besides the initiating methionine, the 190 residues of the HCV core protein but lacking the first residues of the envelope protein E1 were also constructed.
  • the mutations intended to abolish the natural expression of the ARFP polypeptide are the same as those of SEQ ID NO: 22.
  • nucleotide sequence CAARFP 191 is amplified from the sequence C ⁇ ARPP 2 o 6 described above using primers sense gagatactcgagacctccactàaccctaaaccccagaggaaa (SEQ ID NO: 27) and antisense aacattcccgctagcgcatgagcggccgcagta (SEQ ID NO: 28).
  • the C ⁇ ARFP 191 sequence is introduced into an adenoviral vector in the E1 region and under the control of the CMV promoter as well as in the gWiz (Gene Therapy System) expression plasmid also under the control of the CMV promoter, to give adenovirus.
  • C 191 ⁇ ARFP and gWiz C 191 ⁇ ARFP respectively.
  • the wild-type nucleotide sequence coding for the core protein of strain J of genotype Ib HCV version 191 or 206 residues was also cloned in the same vectors (gWiz C 191 and gWiz C 206 ).
  • Huh7 cells are transfected with the different plasmid constructs described above in the presence of lipofectamine / Reactive Plus (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. Briefly, 2.8 ⁇ g of DNA is mixed with lipofectamine and incubated at room temperature for 15 minutes. After addition of Reagent Plus, this solution is mixed with 10 cells / ml in DMEM without fetal bovine serum. After 3 hours of incubation, the complete DMEM medium is added and the cells are further incubated for 72 hours prior to purification of the Histidine tagged protein or GFP assays.
  • lipofectamine / Reactive Plus Invitrogen
  • Influent monolayers of Huh7 cells were infected with the appropriate recombinant adenoviruses at a multiplicity of infection of 100 infectious units (IU) per cell for 72 hours prior to Western blot analysis (protein transfer).
  • Ten million THP-I cells were infected at a multiplicity of infection of 200 as described in Gerszten et al., J. Biol Chem., 276, 26846-26851 (2001). Briefly, the cells are incubated in 0.5 ml of serum-free RPMI 1640 medium containing the various adenoviruses in a 12-well plate for 1 hour, the volume is then supplemented to 3 ml with complete RPMI medium.
  • the cells are harvested and either lysed for Western Blot analysis, or labeled with monoclonal antibodies suitable for immunofluorescence staining / flow cytometry, or washed and the incubates at 10 6 cells / ml with or without 5 ⁇ g / ml of ARFP 99 (synthetic polypeptide of 99 amino acids from ARFP, see Bain et al., J. Virol 78: 10460-10469, 2004), 5 ⁇ g / ml Core protein for 24/48 hours for cytokine analysis.
  • ARFP 99 synthetic polypeptide of 99 amino acids from ARFP
  • histidine proteins are eluted with 100 ⁇ l of buffer A containing 500 mM imidazole (elution 1). After a second elution with 100 ⁇ l (elution 2), they are separated on a 15% electrophoresis gel and analyzed by Western blotting.
  • the adenovirus-infected THP-I or Huh7 cells were incubated in ice-cold lysis buffer containing 1% Triton X-100 and a complete protease inhibitor (Roche).
  • the lysed cells are centrifuged at 12000 g for 10 minutes, and the protein concentration is assayed in the cytosolic fractions (Comassie Blue, Pierce), as described by the manufacturer.
  • the cytoplasmic fractions are loaded onto a 7.5% acrylamide gel and all migrate for 2 hours.
  • polyvinylidene fluoride membranes (Hybond PVDF, Amersham transfer membranes) are saturated for 1 hour with a blocking buffer (milk without fat 5%, Tween 20 0.3% (v / v)). in PBS, or buffered saline phosphate solution) and then incubated with an anti-ARFP or anti-core monoclonal antibody to saturate the binding sites, after which incubation with mouse monoclonal Panti-ARFP (15E7F1 produced by bioMérieux) or mouse monoclonal anti-core antibody (19D9D6, bioMérieux) in blocking buffer.
  • a blocking buffer milk without fat 5%, Tween 20 0.3% (v / v)
  • THP-I cells are available at a final concentration of 5x10 6 / well in 24-well plates and infected with different adenoviruses at a multiplicity of infection of 200. 72 hours after infection, the cells are washed twice. Once in ice-cold PBS, they are fixed and permeabilized using cytofix / cytoperm reagent (Becton Dickinson, France). The labeling is carried out by sequential incubation with firstly the anti-ARFP monoclonal antibody (15E7F1 1/100) or the anti-Core monoclonal antibody (19D9D6, 1/100) and then the conjugated rabbit anti-mouse antibody. at TRITC (Dako Cytomation). Cells are counter-labeled with 1: 200 PHoechst diluted in PBS and 80% glycerol and observed using fluorescence microscopy.
  • Huh7 cells were transfected with pQBGFP plasmids for 72 hours and GFP expression was assayed by flow cytometry using FACScalibur (BD Biosciences). After 72 hours of infection, the THP-I cells are fixed and permeabilized with Cytofix / cytoperm (Becton Dickinson), incubated with the anti-Core monoclonal antibody (19D9D6, 1/10000) for 30 minutes at room temperature. . The FITC conjugated antibody is added for another 30 minutes before the flow cytometric analyzes.
  • soluble factors released in the cell supernatants are measured using both the Human Cytokine Array III (RayBiotech) allowing the detection of 42 soluble factors and the bioplex-17 cytokine kit (Biorad) according to the manufacturer's instructions.
  • Enzyme-linked immunosorbent assays Quantitative evaluation of interleukins secreted in cell supernatants is obtained using the enzyme-linked immunoadsorbent assay (IL-8, MCP-I, BD Bioscience, MIP-I ⁇ RD Bioscience). The concentrations (in ⁇ g / ml) of unknown samples are calculated by interpolating with standard curves placed on each plate. The detection sensitivity of IL-8, MCP-I and MEP-I ⁇ is respectively 10, 7 and 30 ⁇ g / ml.
  • the HLA-A2 transgenic mice Five days before the plasmid injection, the HLA-A2 transgenic mice are injected with cardiotoxin (50 ⁇ L at 10 ⁇ M, Latoxan) intramuscularly in order to induce point muscle necrosis and to promote the recruitment of dendritic cells ( DC) and therefore a better internalization of the DNA.
  • the mice are then immunized at the same site by two intramuscular injections at two week intervals of 100 ⁇ g of plasmid taken up in 100 ⁇ l of PBS Ix.
  • the plasmids tested are the gWiz C 206 ⁇ ARFP plasmid expressing the mutated Core protein according to the invention, the gWiz plasmid expressing the wild-type Core protein (gWiz C 206 ) and the non-recombinant gWiz plasmid as a negative control.
  • the plasmid preparations are purified to remove bacterial endotoxins (endotoxin-free column, Macherey-Nagel). The animals are sacrificed two weeks after the second injection, the spleens are then removed and milled in order to recover the splenocytes and the cellular response is evaluated by ELISPOT and CTL test as described in Himoudi et al. (2002, Virol 76, 12753-12746).
  • the cytotoxicity assay relies on the ability of effector cells induced by the spleen of immunized mice to lyse target cells with an epitope of interest (Brinster, 2001, Hepatology 34, 1207-1217).
  • the splenocytes are cultured in 24-well plate in the presence of the target epitope DLM (5 ⁇ M) and murine recombinant IL-2 (10 LVmL) for 5 days in essential alpha medium ( ⁇ MEM).
  • ⁇ MEM essential alpha medium
  • the splenocytes are then re-stimulated by co-cultivation with irradiated splenocytes of naive mice incubated with the DLM epitope (10 ⁇ M).
  • mice immunized splenocytes thus cultivated are brought into contact with cells EL4S3 "Rob HHD (murine cell line transfected stably expressing the HLA A2 molecule) labeled with Cr 51 (target cells) and loaded or not with 10 ⁇ M of the DLM epitope
  • the spontaneous release and the total release of Cr 51 are determined from the wells containing the target cells loaded or not respectively placed in culture medium or lysis buffer (HCl
  • the quantification of released Cr 51 is performed using a counting apparatus Cobra II (Perkin Elmer, France).
  • the specific cytotoxicity is calculated by applying the formula: (release of chromium in the test - spontaneous release) / (total release - spontaneous release) X 100. Each determination is made in triplicate and the. Given results correspond to an average of the three values.
  • the results are represented in the form of a graph giving the percentage of specific lysis as a function of the effector / target ratio.
  • the purpose of the ELISPOT (Enzyme Linked Immunospot) test is to measure the number of specific cells of an epitope producing IFN ⁇ .
  • the splenocytes of the immunized mice (2x10 5 ) are cultured in triplicate for 40 hours in 96-well "Multiscreen" plates (Millipore) previously incubated with a murine anti-IFN ⁇ monoclonal antibody (Pharmingen, 10 ⁇ g / ml).
  • the culture is carried out in ⁇ MEM medium in the presence of recombinant interleukin-2 (IL-2) (PeproTech Inc; 1 OR / ml) alone as a negative control or with 10 ⁇ M of specific DLM peptide contained in the core (DLMGYIPLV corresponding to residues 132-140 of the HCV polyprotein: Himoudi et al, 2002, J. Virol.16, 12753-12746).
  • IL-2 interleukin-2
  • PeproTech Inc 1 OR / ml
  • 10 ⁇ M of specific DLM peptide contained in the core DLMGYIPLV corresponding to residues 132-140 of the HCV polyprotein: Himoudi et al, 2002, J. Virol.16, 12753-12746.
  • Concavalin A 5 ⁇ g / ml
  • the IFN ⁇ producing cells are detected by means of a biotinylated anti-mouse IgG antibody (Pharmingen, USA) which binds steptavidin coupled to HRP (HorseRadish Peroxidase) and the addition of the peroxidase substrate then produces a colored reaction.
  • the number of spots (a spot corresponding to an IFN ⁇ producing cell) is quantified in an automated manner (Zeiss microscope coupled to the KS-ELISpot software).
  • the number of specific spots corresponding to the production of IFN ⁇ by the specific cells of the DLM epitope is obtained by subtracting from the average number of spots (average triplicate) observed in the well where the cells are in the presence of the DLM epitope. , the average number of spots of the negative control (IL-2 only). The results are reported to one million cells. Answers exceeding 40 specific spots for 10 6 cells are considered positive.
  • mDC dendritic cells Transformation of monocytes into dendritic cells
  • the monocytes are purified according to the techniques of the art then incubated for 6 days in the presence of GM-CSF (200 ng / ml) and interleukin 4 (200 nl / ml).
  • the state of maturation of DCmo is determined by the analysis of cell markers in flow cytometry. To validate transformation, DCs must have a positive CDIa, positive HLA-DR, and negative CD14 phenotype. DCs lacking CD80, CD83 and CD86 stimulation markers are referred to as immature (iDC).
  • iDC immature
  • DC maturation is performed by incubating with TNF ⁇ (200 ng / mL, PreproTech) for 48 hours.
  • monocytes into macrophages The monocytes are purified and then incubated for 6 days in the presence of GM-CSF (10 ng / ml) and M-CSF (10 ng / ml). The expression of cell surface markers is analyzed by flow cytometry. To validate the transformation, macrophages must have a positive phenotype for CD1a, CD14, CD11c, and HLA-DR.
  • DC and Macrophage Infection Protocol DCs and macrophages are infected with recombinant adenoviruses appropriate for a 500-fold Multiplicity of Infection (MOI) for 48 hours. These conditions make it possible to infect more than 70% of the cells as determined with adenovirus GFP in the absence of lipofectamine.
  • MOI Multiplicity of Infection
  • Core or C-E1-E2 sequences are capable of expressing an ARFP +1 protein in vitro (eukaryotic cells). This is the first time that this fact has been directly demonstrated using an anti-ARFP antibody.
  • That a core sequence can be modified to successfully express wild core protein without ARFP expression (original construction of C ⁇ ARFP).
  • C ⁇ ARFP endogenous expression of C ⁇ ARFP induces reduced expression of IL-8 over Core and lacks the ability to stimulate the production of MCP-I and MIP-1 ⁇ ;
  • Example 1 ARFP expression in the context of the vectors encoding for Core or CoreElE2 It is shown that an ARFP ("alternative reading frame protein") of 17 kDa is expressed in cells transfected with plasmids encoding either His-Core or His-CoreElE2. This protein is very probably produced at very low levels since its detection is only possible by protein transfer (Western blot) after purification of the His-tagged proteins on Ni columns (see FIG. 1).
  • Huh7 are transfected with pTG HisCElE2 or pTG HisCore for 72 hours.
  • a proteasome inhibitor (MG132) is added (A) or not (B) to the culture medium for the last 6 hours.
  • MG132 proteasome inhibitor
  • a Western Blot is carried out using an anti-ARFP monoclonal antibody (dilution 1/1000, 15E7F1 bioMérieux, obtained from mice immunized with the ⁇ F protein of genotype la (Komurian-Pradel and al., Hepatology, 40: 900, 2004), the epitope is fully conserved between ARFP genotype 1a and Ib) and an anti-Core antibody (1/40000, 19D9D6 dilution). Core was detected with His (21 kDa) and ARFP with His (17 kDa) tag by Western Blot from pTG His-Core or pTG His-CE1E2 transfected cells. The results are representative of four independent experiments.
  • the presented data unambiguously prove the existence of an ARFP encoded by the sequence coding either for CoreElE2 or for Core.
  • the His-ARFP protein has an apparent molecular weight of 17 kDa and does not appear to be sensitive to proteasome degradation.
  • Example 2 The ARFP protein is not detected in cell lines infected with Ad-Core or Ad-CE1E2
  • the Huh7 and THP1 cell lines are infected with recombinant adenoviruses encoding ⁇ -Gal (negative control), CE1E2, and the 101 amino acid polypeptide between codon 43 and codon 144 of Core reading frame +1 (ARFP 101). ). 72 hours after infection, Western Blot cell lysates were analyzed for Core and ARFP expression. At this point, more than 80% of Ad-GFP infected cells are positive for GFP. As expected, and as observed with both THP-I and Huh7 cell extracts, Core is detected as a result. Ad-CE1E2 and Ad-Core infection ( Figures 2A and 2B).
  • the intensity of the specific core band is much greater in cells infected with Ad-CE 1E2, which may reflect a higher stability of the core protein in this context.
  • ARFP 101 is detected in cells infected with Ad-ARFP 1 Q 1 .
  • this polypeptide is detected only when the infection is carried out in the presence of the proteasome inhibitor MG-132 (FIGS. 2A, B).
  • proteasome inhibitor MG-132 (FIGS. 2A, B).
  • ARFP is not detected in cells infected with Ad-CE1E2 or Ad-Core.
  • Chemokines IL-8, MCP-I, and MIP-1 ⁇ are produced by THP-I cells infected with an adenovirus encoding Core, CE1E2 or ARFP 10
  • TFJP-I cells were infected with Ad-Core, -CE1E2, -ARFP 101 , in parallel with Ad- ⁇ Gal, as a negative control, or Ad-NS5 ⁇ , as a positive control (Polyak et al, J. Virol, 75: 60956106 2001), in the absence of proteasome inhibitor (MG132) for 72 hours. The cells are then washed and incubated for another 24 or 48 hours in culture medium before taking the supernatant.
  • IL-8 CXCL-8
  • MCP-I CCL-2
  • MEP-1 ⁇ CCL-4
  • Figure 4 shows the result of the screening. All adenoviral preparations have indescribable levels of endotoxin. Only two cytokines are detected with this test: RANTES (CCL5) and IL-8 (CXCL-8). RANTES production is not related to HCV antigen expression as it is observed in cells infected with all adenoviruses. In contrast, cells infected with Ad- Core and ARFP 101 release higher levels of IL-8 than cells infected with Ad- ⁇ -Gal or Ad-CE1E2.
  • MIP-l ⁇ The level of MIP-l ⁇ is equivalent with Ad-CE1E2, -Core and -ARFP 10I , but for IL-8 and MCP-I the trend is at a much higher level in cells infected with Ad-ARFP 101 compared to cells infected with Ad-Core, and in Ad-Core infected cells compared to cells infected with Ad-CE 1E2.
  • a recombinant adenovirus containing a modified core sequence (C ⁇ ARFP) has been constructed such that the Core protein is normally expressed but any protein possibly resulting from a sliding event of the reading frame or internal initiation is avoided (Ad- C ⁇ ARFP).
  • Ad- C ⁇ ARFP The corresponding sequence is represented by SEQ ID NO: 22.
  • a sequence coding for the GFP is inserted downstream of the C ⁇ ARFP sequence in the 0, +1 or +2 reading frames.
  • the corresponding plasmids are transfected into Huh7 cells and the expression of GFP is evaluated by flow cytometry (FACScalibur, BD Biosciences).
  • a sliding event of the frame of reading or internal initiation in an alternative reading frame is thus visualized by the expression of GFP in the cells transfected by the corresponding constructs.
  • GFP is only expressed when inserted into the reading frame of the core coding sequence (45% positive cells), but not when inserted into the reading frame. 1 or +2 (0.04 and 0.01% of positive cells) of the C ⁇ ARFP sequence.
  • GFP is inserted downstream of the wild-type Core coding sequence in reading frame +1, 1.2% of cells are positive for GFP, confirming that in this context frame slip reading is rare but real.
  • Example 5 Absence of induction of MIP-1 ⁇ or MCP-I in THP-I cells infected with Ad-C ⁇ ARFP; the expression of ARFP and Core participates in the induction of IL-8 secretion in cells infected with Ad-Core or - CE1E2
  • THP-I cells were infected in parallel with Ad-Core, -CE1E2, -ARFPioi and-C ⁇ ARFP for 72 hours, washed and incubated in medium for another 24 or 48 hours before the supernatant was removed.
  • the secretion of MCP-I and MIP-1 ⁇ was measured by ELISA.
  • basal amounts of both chemokines are produced either by uninfected cells or by Ad- ⁇ Gal-infected THP-I cells (ranging from 50 to 500 ⁇ g / ml for MCP-I and 150 to 500 ⁇ g / ml for MIP-I ⁇ at 24 or 48 hours).
  • IL-8 Secretion of IL-8 is also measured in supernatants of Ad-Core infected THP-1 cells, -CE1E2, -ARFP 101 and -C ⁇ ARFP.
  • secretion of IL-8 is greatly increased in Ad-C, -CE1E2, -ARFP 101 -infected cells compared to non-infected or infected cells.
  • Ad- ⁇ Gal Figure 7
  • THP-I cells are infected with Ad-C ⁇ ARFP, although IL-8 levels are lower compared to Ad-Core infected cells, -CE1E2 or -ARFP 101 , they remain higher than levels produced by uninfected or Ad- ⁇ Gal infected cells.
  • Example 6 Exogenous core protein (but not ARFP 101 polypeptide) potentiates IL-8 and MCP-I production in Ad-Core infected cells, -CE1E2 or -ARFP 101
  • THP-I cells were infected for 72 hours and incubated with exogenous core for 48 hours.
  • the levels of MCP-I and IL-8 produced by the control adenovirus-infected cells are higher than those of the non-infected cells, suggesting involvement of the adenoviral protein in potentiation of chemokine secretion induced by the exogenous Core protein (1462 and 1054 ⁇ g / ml for IL-8 and MCP-I respectively).
  • Cells infected with Ad-CE1E2, -Core and -ARFP 101 and incubated with exogenous Core protein produce an amount of IL-8 and MCP-I three times higher than cells infected with the adenovirus control and incubated with Core .
  • Cells infected with Ad-C ⁇ ARFP and incubated with exogenous Core produce IL-8 levels comparable to cells infected with Ad-CE1E2 and incubated with exogenous Core, while the level of MCP-I is lower and . comparable to cells infected with the adenovirus control and incubated with the exogenous Core.
  • the immunogenicity of the core protein derived from the mutated C ⁇ ARFP sequence according to the invention was studied in a transgenic mouse model for the HLA-A2 molecule and compared with that conferred by the wild core protein.
  • the HLA-A2 transgenic mice are immunized by two intramuscular injections of the plasmid gWiz C 206 ⁇ ARFP according to the invention or the plasmid gWiz carrying the coding sequence for the wild core protein (gWiz C 206 ) OR the non-recombinant gWiz plasmid as a negative control.
  • the T-induced cell response is analyzed by CTL and ELISPOT using as target the DLM epitope contained in the Core protein.
  • the results of the CTL tests illustrated in FIG. 9A show that the Core polypeptide encoded by the plasmid gWiz C 206 ⁇ ARFP induces a CTL response of a level equivalent to the response induced by the wild-type Core protein produced from the plasmid gWiz C 206 .
  • the CTL response noted following the injection of the non-recombinant plasmid gWiz is very low.
  • the results of the ELISPOT tests illustrated in FIG. 9B confirm the good immunogenic capacity of the Core polypeptide encoded by the plasmid gWiz C 206 ⁇ ARFP. Indeed, it is observed that the plasmid gWiz C 206 ⁇ ARFP induces a significant production of IFN ⁇ in two of three treated mice as gWiz C 206 .
  • the protein derived from the mutated Core sequence so as to abolish the production of the ARFP polypeptide does indeed induce a cell-mediated response specific to the antigen expressed at least equivalent in intensity to that conferred by the wild core, as shown in the Figures. 9A and 9B.
  • Example 8 Trans-activation of the IL-8 promoter by the CE1E2 protein or the Core protein requires the presence of the ARFP protein.
  • Example 5 It has been observed in Example 5 that secretion of IL-8 is greatly increased in cells infected with constructs expressing the wild core protein (Ad-Core, Ad-CE1E2) and ARFP protein (Ad-ARFP ( I) with respect to cells infected with Ad- C 206 ⁇ ARFP. It has therefore been sought to understand by which mechanism (s) the Core and ARFP proteins are involved in stimulating the secretion of IL-8 and the ability of these proteins to trans-activate the promoter to IL-8. 8 has been evaluated.
  • the Huh-7 cells are transfected with one of the plasmids allowing the expression of the HCV proteins, the plasmid pIL-8-Luc in which the reporter gene Photinus pyralis (Firefly) luciferase is placed under the control of the promoter IL-8 (Omata et al., 2005, J. Infect Dis., 192, 266-275) and finally a plasmid encoding constitutively expressed GFP (Green Fluorescent Protein) which makes it possible to normalize the efficiency of transfections.
  • the reporter gene Photinus pyralis (Firefly) luciferase is placed under the control of the promoter IL-8 (Omata et al., 2005, J. Infect Dis., 192, 266-275)
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the tested HCV plasmids are gWiz-Core 191 , gWiz-CElE2, gWiz-ARFP 101 and gWiz-C 191 ⁇ ARFP.
  • Cells transfected with the empty gWiz plasmid constitute the negative control.
  • the luciferase activity relative to each plasmid HCV is measured by luminometry (Luminometer Turner Design, DL Ready) after lysis of the tri-transfected cells.
  • the percentage of GFP-positive cells is 89-90% in all cases indicating a similar transfection level of the cells independent of the transfected plasmids.
  • the luciferase activity in Huh7 cells co-expresses the CE1E2 or wild core protein is 5 times greater than that obtained in the control cells.
  • a significant increase in luciferase activity relative to the control is also observed in the cells transfected with the plasmid gWiz-ARFP 101.
  • the expression of the Core protein resulting from the mutated sequence C 191 ⁇ ARFP did not virtually no effect on luciferase activity.
  • the expression of the wild-type Core allowing the natural expression of ARPP induces the trans-activation of the IL-8 promoter (column 2) while the expression of the Core resulting from the mutated C ⁇ ARFP sequence does not have this effect (column 3).
  • the lack of a transactivating effect of the core protein from WiZ-C 191 A ARFP is not compensated for or supplemented by the addition of the ARFP 101 plasmid even at the highest dose, the level of luciferase activity being similar to that observed with construction gWiz-C 191 ⁇ ARFP alone (columns 4, 5 and 6).
  • the core protein derived from the mutated C 191 ⁇ ARFP sequence decreases the expression of the ARFP protein. It has therefore been investigated whether this deleterious effect is also exerted on the expression of the other HCV proteins, such as, for example, the nonstructural proteins NS3, NS4 and / or NS5B.
  • the Huh-7 cells were co-transfected with the gWiz-Core 191 plasmid expressing the wild core or gWiz-C 191 ⁇ ARFP expressing the mutated core and with the plasmid encoding ARFP.
  • gWiz-ARFP 101 or a plasmid expressing an NS3-NS4 fusion protein or a plasmid expressing the NS5b protein.
  • the expression of the viral proteins is determined by Western blotting with the aid of the corresponding antibodies (anti-ARFP, anti-Core, anti-NS3 and anti-NS5B antibodies).
  • the expression of the capsid protein is of a comparable level that the cells are transfected with the plasmid gWiz-Core 191 or gWiz-C 191 ⁇ ARFP.
  • the deleterious effect of the mutated Core protein on the ARFP protein observed above is confirmed.
  • the production of the ARFP 101 protein is considerably reduced in the cells co-transfected with the plasmids gWiz-C 191 ⁇ ARFP and gWiz-ARFP 101 relative to the amount of ARFP 1 O 1 produced in the co-transfected cells. with gWiz-Core 191 and gWiz-ARFP 101 plasmids.
  • nonstructural proteins NS3 and NS5b is not affected by co-transfection with gWiz-C 191 ⁇ ARFP.
  • the inability to trans-activate the IL-8 promoter by the protein derived from the mutated Core sequence according to the invention can not be complemented in trans by the ARFP 101 protein.
  • the mechanisms put in place remain unclear and could be linked for example to an increased degradation of the ARFP 101 protein, a slowed down translation, an inhibited or slowed transcription and / or a degradation of the mRNAs.
  • IDC was infected at a MOI of 500 with the various recombinant adenoviral vectors (Ad) described above, encoding ⁇ -galactosidase (Ad- ⁇ -Gal) as a control, CoreElE2 (Ad-CE 1E2), the wild core protein (Ad-Core), the ARFP 1O1 polypeptide (Ad-ARFP 101 ) and the core protein mutated so as not to express ARFP (Ad-C191 ⁇ ARFP). 48 hours after infection, the cells are lysed and the lysate is subjected to Western Blot analysis using the anti-Core monoclonal antibody.
  • Ad ⁇ -galactosidase
  • the C 191 ⁇ ARFP sequence encodes a protein having a molecular weight identical to the wild core protein encoded by Ad-CE1E2 or Ad-Core.
  • Ad-CE1E2 a greater amount of Core protein is detected in Ad-CE 1E2 infected DC than in Ad-Core infected cells. It can be noted that the amount of Core detected after infection of DC by the Ad-C 191 ⁇ ARFP vector is equivalent to that produced after Ad-CE1E2 infection.
  • the detected surface markers are typical of an immature dendritic cell that iDCs are infected by adenovirus constructs expressing the proteins of the HCV (Ad CE1E2, Ad-Core, Ad-101 and Ad-ARFP ⁇ ARFP C 191), by the control vector Ad- ⁇ -Gal or uninfected.
  • the soluble factors released in culture supernatants of the infected iDCs are assayed using the bioplex-17 cytokine kit (Biorad).
  • the amounts of IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12p70, IL-13 and IL-17 released by the infected cells by the different adenoviral constructs expressing the HCV proteins are below the detection threshold of the device ( ⁇ 7pg / ml) as well as in the negative controls iDC infected with uninfected Ad- ⁇ -Gal and iDC.
  • Table 2 shows the results of the IL-6, IL-8, MCP-I and MCP-Ib assays in culture supernatants of HCV adenovirus-infected iDCs relative to the level detected for each.
  • the amount of cytokines produced by the adenovirus-infected iDCs expressing the ARFP 101 polypeptide does not differ from that produced by the control cells infected with Ad - ⁇ -Gal.
  • the infection of iDCs with Ad-C 191 ⁇ ARFP reveals no stimulatory effect on the production of cytokines (levels comparable to those determined for the control cells).
  • the production of IL-6, IL-8, MCP-I and MIP-1 1 cytokines would be dependent on the native expression of ARFP protein from wild-sourced species.
  • the mDCs are infected with the various recombinant adenoviral vectors for 48 hours and then incubated for an additional 48 hours with TNF ⁇ (25 ng / ml).
  • TNF ⁇ 25 ng / ml.
  • the expression of the CD80, CD83 and CD86 cell surface markers is analyzed by flow cytometry and the concentrations of cytokines released are assayed using the bioplex-17 cytokine kit (Biorad).
  • results illustrate that no phenotypic change is associated with infection by adenoviral constructs and expression of HCV polypeptides.
  • the percentage of positive cells and the intensity of fluorescence are of the same order of magnitude between cells infected with adenovirus Ad-CE1E2, Ad-Core, Ad-ARFP 101 and Ad-C 191 ⁇ ARFP, Ad- ⁇ Adenovirus control. -Gal and uninfected cells.
  • the amounts of IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12p70, IL-13 and IL-17 released from infected cells by the different adenoviral constructs are below the detection threshold of the device ( ⁇ 7pg / ml) as in uninfected mDCs.
  • expression of HCV antigens in mDC does not alter the production profile of cytokines.
  • the amounts of IFN ⁇ , TNF ⁇ , G-CSF, MCP-I and MIP-Ib released in the culture supernatants after infection of AdCe1E2, Ad-Core, Ad-ARFP 101 and Ad-C 191 ⁇ ARFP adenoviruses are identical to the quantities produced by the control cells infected with Ad- ⁇ -Gal.
  • Macrophages are obtained from monocytes as described in the experimental part and infected at a MOI 500 with the different adenoviral constructs. 48 hours after infection, the expression of the CD1 Ic, CD14 and CD40 markers is analyzed by flow cytometry and the expression of the HCV proteins and the concentrations of cytokines released are evaluated in the culture supernatants.
  • Adenoviral infection and the expression of HCV proteins do not modify the expression of the CDlIc, CD14 and CD40 surface antigens, the expression pattern being similar in macrophages infected with adenovirus HCV Ad-CE 1E2, adenovirus Core, Ad-ARFPi 01 and Ad-C 191 ⁇ ARFP and in control macrophages uninfected or infected with Ad- ⁇ -Gal.
  • the amounts of IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7 IL-12p70, IL-13 and IL-17 of the cells infected with the different adenoviral constructs are less than detection threshold of the device ( ⁇ 7pg / ml).
  • the following Table 3 shows the results of the IL-6, IL-8, MCP-I and MCP-Ib assays in culture supernatants of macrophages infected with adenoviral HCV constructs relative to the level detected for each.
  • adenovirus-infected macrophages synthesize IL-6, IL-8, MCP-I and MIP-1b. But levels of IL-6, IL-8 and especially MIP-1b are higher in macrophages that produce wild-type core protein or ARFP 101 infected with Ad-CE1E2, Ad-Core or Ad-ARFP. 101 ). Conversely, the production of cytokines is not affected by the expression of the mutated Core protein (Ad-C 191 ⁇ ARFP), the ytokine levels being identical to those detected in the control cells.
  • the macrophages are infected with the different de noviral constructs and then incubated in the presence of 200 ng / mL of TNF ⁇ for 48 additional hours and the soluble factors released in the culture supernatants are evaluated.
  • Adenovirus-infected activated adenoviruses synthesize IL-6, IL-10, IFN ⁇ / TNF ⁇ , and MIIP-1b. If the expression of HCV proteins does not modify the production of IL-6, TFN ⁇ / TNF ⁇ and MIP-Ib, conversely there is a marked decrease in production.
  • IL-10 in activated macrophages infected with Ad-CE1E2 levels 3 times lower than those produced in control cells infected with Ad- ⁇ -Gal
  • Ad-Core reduction by a factor of 3.8
  • Ad -ARFP 101 reduction by a factor of 4.6
  • the infection of Ad-C 191 ⁇ ARFP-activated macrophages does not provide this immunomodulatory effect on the production of IL-10 (levels equivalent to those produced by Ad- ⁇ -Gal-infected macrophages), which confirms the role of the natural expression of the ARFP polypeptide from the wild core sequence.
  • the present invention provides to the public a sequence encoding a core protein having an amino acid sequence identical to the wild core protein produced by the HCV virus but whose nucleotide sequence has been modified so that no polypeptide can not be generated by internal initiation or reading phase shift +1 and +2.
  • the mutated Core sequence according to the invention has immunomodulatory properties very different from those conferred by the wild core sequence encoded by the HCV virus.
  • the Core protein derived from the mutated sequence is no longer capable of stimulating the production of the MCP-I and MIP-Ib chemokines and in particular reduces the production of IL-8 in the monocyte line THP-I (Example 5) as well as in cells presenting dendritic cell and macrophage antigens (Example 9).
  • the reduction of IL-8 can be explained by a failure or at least a reduction in the ability of this mutated Core sequence to trans-activate the IL-8 promoter unlike the wild-type Core sequence (Example 8).
  • the mutated sequence according to the invention encodes a Core protein which remains immunogenic and induces a specific cell-mediated response (Example 7).
  • the mutated core sequence according to the invention has the advantage, among other things, of coding for a core protein having the same amino acid sequence as the wild-type core but which does not induce or only little the production of proinflammatory cytokines (IL-6, IL -8, MCP-I and / or MIP-Ib).
  • a vaccine composition comprising the nucleotide sequence according to the invention or its expression product has the advantage of reducing the potential pathogenicity associated with the wild core protein without altering its immunogenicity.

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique mutée, cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou un fragment de la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2 du virus de l'hépatite C, ladite séquence nucléotidique mutée étant telle qu'elle code dans un cadre de lecture 0 pour la susdite protéine, mais qu'elle ne permet pas l'expression d'une protéine ARFP ou de fragments d'une protéine ARPP de plus de 11 acides aminés, codés dans le cadre de lecture +1 par la susdite séquence nucléotidique non mutée, pour la préparation d'un vaccin ou d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des infections liées au virus de l'hépatite C.

Description

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES MUTEES DU VIRUS DE
L'HEPATITE C
L'invention concerne des séquences nucléotidiques mutées du virus de l'hépatite C.
Il n'existe pas à ce jour de vaccin destiné à prévenir les infections par le virus de l'hépatite C (VHC). Parmi les approches envisagées, la préparation de vaccins sous- unitaires, c'est à dire de vaccins contenant une partie seulement du virus (par opposition aux vaccins entiers), est prometteuse.
Le génome du VHC code pour une unique polyprotéine, c'est à dire un ensemble de trois protéines structurales (Core, El et E2) et de sept protéines non-structurales (P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A et NS5B), les différentes protéines étant obtenues à partir de la polyprotéine par clivage protéolytique.
La protéine Core du VHC est l'antigène viral le plus conservé et est la cible de l'immunité cellulaire de type B et T. Elle constitue donc un antigène vaccinal de choix. Toutefois, cet antigène est associé à toute une série de propriétés, dont certaines sont indésirables dans une formulation vaccinale, c'est à dire des propriétés immunosuppressives (Large M.K. et al., J Immun. 162:931-938, 1999 ; Soguero C. et al., J Virol. 76:9345-9354, 2002 ; Yoa Z.Q. et al, J Virol. 78:6409-6419).
A moins que de telles propriétés puissent être supprimées, il semble difficile à ce jour d'utiliser la protéine Core et / ou les séquences codant pour la protéine Core pour concevoir un vaccin.
Un certain nombre de publications récentes ont démontré qu'un ensemble de protéines codées par un cadre de lecture alternatif, et désignées sous le terme générique d'ARFP (pour « alternative reading frame protein »), de taille 16-17 kDa, sont codées in vitro par la séquence nucléotidique codant pour la protéine Core sauvage. La famille ARFP serait responsable, en partie ou en totalité, des mécanismes modulant l'immunité qui sont associés à Core, y compris les mécanismes immunosuppresseurs.
Des études in vitro indiquent que des glissements du cadre de lecture au niveau du ribosome ainsi que des initiations internes peuvent conduire à la traduction de protéines de type ARPP (Branch et al, Semin. Liver Dis. 25:105-117, 2005).
Un premier événement de glissement du cadre de lecture a été décrit pour les séquences de génotype la (Xu Z. et al., EMBO J. 20:3840-3848, 2001 ; Varaklioti A. et al, J Biol. Chem. 277:17713-17721, 2002 ; Roussel J. et al., J. Gen. Virol. 84:1751- 1759, 2003). Le ribosome initie la traduction du codon AUG du cadre ouvert de lecture de la polyprotéine du VHC et, aux codons 9-10, il rencontre une séquence riche en AAA qui stimule un événement de glissement du cadre de lecture au codon 11, lequel événement de glissement consiste en un déplacement du ribosome dans le cadre de lecture +1. De plus, on a montré qu'une séquence de glissement telle que ce signal AAA est également capable de déplacer le ribosome dans le cadre de lecture +2/-1 (Xu et al., J Virol, 77:1578-1583, 2003).
D'autres événements de glissement du cadre de lecture ont été décrits pour une séquence du génotype Ib (Boulant et al, J Biol. Chêm., 278:45785-45792, 2003). Selon ce compte-rendu, ARFP est produite du fait de deux événements de glissement du cadre de lecture survenant à deux positions dans l'ARN du VHC qui forment des éléments structuraux de l'ARN hautement conservés. Le premier de ces glissements du cadre de lecture est situé au codon 42 dans les cellules procaryotes.
Enfin, selon d'autres travaux (Vassilaki, J Biol. Chem. 278:40503-40513, 2003), l'expression d'ARFP semble pouvoir survenir sans traduction de séquences initiales de Core, et sans glissement du cadre de lecture. Selon ces travaux, l'expression d'ARFP pourrait être initiée entre les codons 80 et 88 et également au niveau du codon 26 (Baril et al., Nucl. AcidRes. 33:4474-1486).
Quelques documents de l'art antérieur mentionnent des séquences nucléotidiques mutées de la protéine Core permettant de limiter ou d'abolir l'expression d'ARFP mais entraînant une modification de la protéine Core. Les mutations décrites consistent notamment à introduire des codons STOP dans le cadre de lecture +1. C'est le cas des publications de Varaklioti et al. et de Vassilaki et al. sus-citées.
Toutefois, l'état de la technique révèle qu'il n'a jamais été envisagé d'utiliser des séquences nucléotidiques mutées du VHC, contenant notamment des codons STOP dans le cadre de lecture +1, pour préparer des vaccins contre le VHC. D'ailleurs, l'art antérieur ne divulgue pas de séquences nucléotidiques mutées permettant à la fois d'obtenir une expression normale de la protéine Core normale et d'abolir l'expression d'ARFP.
L'un des aspects de l'invention est de fournir de nouvelles séquences nucléotidiques mutées permettant la préparation de médicaments, de vaccins, de méthodes de diagnostic ou de pronostic, dans le cadre du traitement ou de la prévention des pathologies liées à une infection par le VHC Un autre aspect de l'invention est de fournir des séquences nucléotidiques mutées codant pour tout ou partie de la polyprotéine du VHC, induisant de façon moindre par rapport aux séquences nucléotidiques sauvages les mécanismes immunosuppresseurs mentionnés ci-dessus.
L'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique mutée, cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou un fragment de la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2 du virus de l'hépatite C, ladite séquence nucléotidique mutée étant telle qu'elle code dans un cadre de lecture 0 pour la susdite protéine, mais qu'elle ne permet pas l'expression d'une protéine ARFP ou de fragments d'une protéine ARFP de plus de 11 acides aminés, codés dans le cadre de lecture +1 par la susdite séquence nucléotidique non mutée, pour la préparation d'un vaccin ou d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des infections liées au virus de l'hépatite C.
La séquence nucléotidique mutée selon l'invention permet l'expression d'une protéine immunogène, notamment par l'expression d'une protéine Core ou d'un fragment de protéine Core, et de manière avantageuse ne permet pas l'expression d'une protéine ARFP induisant des mécanismes immunosuppresseurs.
Par « fragment de la protéine Core », on désigne des fragments qui comprennent . ou sont constitués d'au moins 60 acides aminés, en particulier d'au moins 70 acides aminés, en particulier d'au moins 80 acides aminés, et plus particulièrement d'au moins 100 acides aminés de la protéine Core.
La séquence nucléotidique mutée en question peut être dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique représentant la totalité ou une partie seulement du génome du VHC.
Avantageusement, la séquence nucléotidique d'origine comprend la totalité du génome du VHC.
Avantageusement, la séquence nucléotidique d'origine comprend un fragment du génome du VHC, notamment un fragment codant pour la protéine Core ou un fragment codant pour la protéine Core et le peptide signal de El ou un fragment codant pour la protéine Core, le peptide signal de El et les 15 acides aminés suivants de El ou un fragment codant pour la protéine Core et la protéine El ou un fragment codant pour la protéine Core, la protéine El et la protéine E2. La séquence nucléotidique selon l'invention peut également comprendre des nucléotides (éventuellement modifiés chimiquement) ou un ou des fragments d'ADN supplémentaires, notamment à l'extrémité 5' et / ou à l'extrémité 3' et notamment être encadrée par des séquences nucléotidiques différentes de celles correspondant au génome du VHC.
Le cadre de lecture 0 est défini par rapport au codon ATG signalant le début de la protéine Core. Les expressions « cadre de lecture +1 » et « cadre de lecture +2 » s'entendent par référence audit cadre de lecture 0.
De préférence, la protéine codée par la séquence nucléotidique mutée de l'invention comprend ou est constituée par la protéine Core dans sa totalité, et ce bien que la protéine ARFP, qui est en principe exprimée à partir de la séquence nucléotidique d'origine non mutée, contienne un fragment de la protéine Core.
L'invention repose sur l'introduction dans une séquence d'une ou plusieurs mutations appropriées par rapport aux séquences nucléotidiques de souches sauvages du VHC, ces mutations permettant notamment d'introduire un ou plusieurs codons STOP dans le cadre de lecture +1 et éventuellement dans le cadre de lecture +2, lesquelles mutations n'affectent pas l'expression ex vivo de la protéine Core et abolissent substantiellement l'expression de protéines ARFP et tout ou partie des mécanismes immuno-suppresseurs associés aux protéines ARFP et / ou à la protéine Core.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée d'une séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, de souches de génotype la, Ib, 2, 3, 4, 5 ou 6 du virus de l'hépatite C.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, de souches de génotype la ou Ib du virus de l'hépatite C.
Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core et un fragment de la protéine El, représentée par la séquence générale du génotype la (SEQ ID NO : 1) ou par la séquence consensus du génotype la (SEQ ID NO : 23) ou par la séquence générale du génotype Ib (SEQ ID NO : 2) ou par la séquence consensus du génotype Ib (SEQ ID NO : 24) ou par une séquence présentant plus de 90 % d'homologie avec l'une de ces séquences, ou par la séquence consensus du génotype 2 (SEQ ID NO : 3) ou par la séquence consensus du génotype 3 (SEQ ID NO : 4) ou par la séquence consensus du génotype 4 (SEQ ID NO : 5) ou par la séquence consensus du génotype 5 (SEQ ID NO : 6) ou par la séquence consensus du génotype 6 (SEQ ID NO : 7) ou par une séquence présentant plus de 70 % d'homologie avec l'une de ces séquences.
On désigne par « homologie » la proportion d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques. Cette homologie peut être mesurée en cherchant à aligner lesdites séquences en utilisant un algorithme tel que défini dans Altschul et al. (Nucl. Acid Res. 25:3389, 1997) ou en utilisant par exemple le logiciel Clustal W, bien connu de l'homme du métier et décrit dans Thompson et al. (Nucl. Acid Res. 22:4673, 1994).
Les séquences générales SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 et les séquences consensus SEQ ID NO : 3 à SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24 correspondent à 618 nucléotides. tes 573 premiers nucléotides de ces séquences correspondent à l'alignement de séquences de souches des divers génotypes sus-cités codant pour la protéine Core et le peptide signal de El. Les 45 derniers nucléotides correspondent à un autre alignement de séquences codant pour les 15 acides aminés de la protéine El qui suivent le peptide signal de El.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype la, 42 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession des séquences sont les suivants : AF009606 ; AFOl 1751 ; AFOl 1752 ; AFOl 1753 ; M67463 ; M62381 ; AF290978 ; M55970 ; AF271632 ; AY695436 ; AY695437 ; M74812 ; AY231582 ; M74811 ; M74808 ; M62382 ; D00831 ; D10749 ; AF268569 ; AF268570 ; AF268571 ; AF268572 ; M62321 ; AF268574 ; AF268576 ; AF268578 ; AF268579 ; AF268577 ; AF268580 ; AF268573 ; AF268575 ; M74804 ; AF511950 ; AF529293 ; AJ278830 ; X84079 ; L12353 ; AY615798 ; M74805 ; AY885238 ; AJ557443 ; AJ557444.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype la, 290 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession des séquences sont les suivants : AF009606 ; AY231582 ; M67463 ; AY746844 ; AY746845 ; AY746850 ; AY746847 ; AY746849 ; AY746853 ; AY746846 ; AY746848 ; AY746854 ; AY746851 AY746852 ; AY746897 AY746900 ; AY746901 ; AY746903 ; AY746908 AY746904 ; AY746902 AY746907 ; AY746906 ; AY746905 ; AY746899 AY746898 ; AY746751 AY746752 ; AY746760 ; AY746757 ; AY746759 AY746762 ; AY746753
AY746758 ; AY746756 ; AY746761 ; AY746755 ; AY746754 ; M62321 ; AY885238 AJ557443 ; AJ557444 ; AY746632 ; AY746635 ; AY746643 ; AY746633 ; AY746638
AY746636 AY746637 ; AY746642 AY746639 : AY746640 ; AY746634 AY746641 ; AY746702 ; AY746706 AY746704 AY746707 AY746710 ; AΫ746703 ; AY746708 AY746711 AY746709 AY746713 AY746705 ; AY746712 ; AY746855 AY746857 AY746860 AY746859 AY746858 ; AY746861 ; AY746862 AY746866 AY746867 AY746870 AY746871 ; AY746872 ; AY746865 AY746869 AY746863 AY746864 AY746868 ; AY746883 ; AY746884 AY746885 AY746887 AY746888 AY746891 ; AY746894 ; AY746892 AY746893 AY746895 AY746896 AY746890 ; AY746886 ; AY746889 AY746775 AY746777 AY746776 AY746783 ; AY746781 ; AY746778 AY746779 AY746782 AY746785 AY746740 ; AY746741 ; AY746744 AY746742 AY746745 AY746743 AY746750 ; AY746746 ; AY746747 AY746749 AY746748 AY746921 AY746922 ; AY746926 ; AY746929 AY746931 AY746928 AY746930 AY746924 ; AY746925 ; AY746927 AY746923 AY746798 AY746799 AY746800 ; AY746805 ; AY746801 AY746803 AY746802 AY746806 AY746808 ; AY746807 ; AY746809 AY746804 AY746821 AY746823 AY746826 ; AY746829 ; AY746830 AY746828 AY746824 AY746825 AY746822 ; AY746831 ; AY746827 AY746620 AY746625 AY746630 AY746631 ; AY746628 ; AY746627 AY746622 AY746629 AY746623 AY746626 ; AY746621 ; AY746624 AY746763 AY746764 AY746768 ÀY746770 ; AY746773 ; AY746765 AY746767 AY746774 AY746766 AY746771 ; AY746772 ; AY746769 AY746810 AY746816 AY746817 AY746815 ;
AY746813 ; AY746814 AY746819 AY746820 AY746812 AY746811 ;
AY746818 ; AY746932 AY746937 AY746939 AY746935 AY746942 ;
AY746934 ; AY746936 AY746940 AY746933 AY746938 AY746941 ;
AY746680 ; AY746684 AY746687 AY746688 AY746686 AY746690 ;
AY746682 ; AY746685 AY746689 AY746683 AY746909 AY746920 ;
AY746911 ; AY746914 ; AY746917 ; AY746912 ; AY746916 ; AY746919 ; AY746918 ; AF529293 AY746656 ; AY746659 AY746660 ; AY746666
AY746663 ; AY746665 AY746661 ; AY746658 ; AY746662 AY746664
AY746657 ; AY746832 AY746838 ; AY746839 ; AY746840 AY746843
AY746835 ; AY746841 AY746833 ; AY746837 ; AY746836 AY746834
AY746842 ; AY746667 AY746671 ; AY746672 ; AY746675 AY746676
AY746677 ; AY746673 AY746669 ; AY746670 ; AY746674 AY746668
AY746678 ; AY746679 AY746714 ; AY746718 ; AY746715 AY746719
AY746720 ; AY746724 AY746722 ; AY746716 ; AY746726 AY746723
AY746721 ; AY746725 AY746717 ; AY746610 ; AY746611 AY746617
AY746618 ; AY746613 AY746615 ; AY746616 ; AY746614 AY746619
AY746612 ; AY746727 AY746728 AY746729 ; AY746736 AY746739
AY746734 ; AY746730 ; AY746733 AY746735 ; AY746738 AY746731 AY746737 ; AY746732 ; AY388455.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype Ib, 182 séquences ont été alignées, les numéros d'accession des séquences sont les suivants : AB008441 ; AB008442 ; AB008443 ; AB049090 ; AB049091 ; M74807 ; AF 165051 ; AF 165052 ; AF207759 ; AB154177 ; AB154178 ; AB154203 ; AB154204 ; AB154206 ; AB154179 ; AB154180 ; AB154185 ; AB154186 ; AB154189 ; AB154194 ; AB154205 ; AB154191 ; AB154192 ; AB154193 ; AB154199 ; AB154201 ; AB154202 ; AF313916 ; AB154190 ; AB154181 ; AB154182 ; AB154183 ; AB154184 ; AB154200 ; AB154187 ; AB154188 ; AB154195 ; AB154196 ; AB154197 ; AB154198 ; AY070174 ; AY587844 ; D50481 ; D50485 ; AF207766 ; AF165057 ; AF165058 ; AB049101 ; AF208024 ; AF207761 ; AJ132996 ; AJ132997 ; M74809 ; M74815 ; D10934 ; AB049099 ; AB049089 ; AB049098 ; AF207752 ; AF207753 ; AY045702 ; M74814 ; M74806 ; M86779 ; D14484 ; U45476 ; AB008445 ; AB008447 ; AB008446 ; AB191333 ; AF207773 ; AB049087 ; AB049096 ; AF165055 ; AF165056 ; AB049095 ; X61593 ; X61595 ; L20498 ; S76540 ; AB016785 ; L12354 ; AF165063 ; AF165064 ; D50480 ; D50483 ; AJ238799 ; AJ238800 ; M74810 ; AF207770 ; AB049088 ; AB049100'; AF207767 ; AF165059 ; AF165060 ; AF207756 ; AF207763 ; AF207774 ; AF207772 ; AF165045 ; AF165046 ; AF207755 ; AF165053 ; AF165054 ; AF333324 ; D89872 ; D90208 ; X65924 ; M74888 ; AF054247 ; AF054250 ; AF054255 ; AF054258 ; AF054248 ; AF054252 ; AF054257 ; AF054249 ; AF054254 ; AF054253 ; D10750 ; AF054259 ; D00832 ; D13558 ; AF207758 ; AB049093 ; M74813 ; AF165047 ; AF165048 ; AY460204 ; M58335 ; L02836 ; AJ000009 ; AF207754 ; M96362 ; U16362 ; AF207771 ; D10687 ; D10688 ; U45461 ; U45462 ; U45463 ; D10074 ; D11168 ; D11355 ; AB049092 ; D00574 ; D89815 ; AB049097 ; AB080299 ; D85516 ; AF207762 ; AF207765 ; AF165049 ; AF165050 ; AF207760 ; AF483269 ; AY587016 ; D30613 ; D45172 ; X61591 ; X61596 ; X61594 ; AF356827 ; AF176573 ; U01214 ; AF207764 ; AF139594 ; D13406 ; S62220 ; AF207757 ; AF165061 ; AF165062 ; L38318 ; D63857 ; X61592 ; M8.4754 ; AB049094 ; D50482 ; D50484 ; AY308072 ; AF207769 ; AY236366.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype Ib, 149 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants : AB049087 ; AB049089 ; AB049092 ; AB049094 ; AB049095 ; AF165055 ; AF165056 ; AF333324 ; D90208 ; D89872 ; AF165053 ; AF165054 ; AB049096 ; AB049090 ; AF165063 ; AF165064 ; AB049088 ; AB049091 ; AF165051 ; AF165052 ; AB049093 ; AF403238 ; AF165057 ; AF165058 ; AF165061 ; AF165062 ; AF402571 ; AF403228 ; AF403237 ; AF403233 ; AF403234 ; AF403229 ; AF403231 ; AF403236 ; AF403232 ; AJ238799 ; AJ238800 ; AB049097 ; AB049100 ; AB080299 ; AF165059 ; AF165060 ; AB154177 ; AB154178 ; AB154179 ; AB154180 ; AB154189 ; AB154190 ; AB154193 ; AB154185 ; AB154186 ; AB154187 ; AB154188 ; AB154199 ; AB154203 ; AB154204 ; AB154201 ; AB154202 ; AB154205 ; AB154206 ; AB154191 ; AB154192 ; AB154181 ; AB154182 ; AB154194 ; AB154200 ; AB154195 ; AB154196 ; AB154183 ; AB154184 ; AB154197 ; AB154198 ; AF483269 ; AY746598 ; AY746601 ; AY746604 ; AY746605 ; AY746607 ; AY746609 ; AY746608 ; AY746603 ; AY746602 ; AY746599 ; AY746600 ; AJ849974 ; AY070174 ; AY587844 ; AY746786 ; AY746795 ; AY746790 ; AY746789 ; AY746788 ; AY746797 ; AY746787 ; AY746796 ; AY746793 ; AY746794 ; AY746792 ; AY746791 ; U45461 ; U45462 ; U45463 ' ; AB049101 ; AJ849973 ; AB049098 ; M58335 ; AF139594 ; AB049099 ; AF356827 ; AJ132996 ; AJ132997 ; AY746644 ; AY746645 ; AY746646 ; AY746655 ; AY746649 ; AY746654 ; AY746650 ; AY746653 ; AY746647 ; AY746651 ; AY746652 ; AY746648 ; U45476 ; AY746691 ; AY746694 - ; AY746696 ; AY746693 ; AY746700 ; AY746701 ; AY746695 ; AY746699 ; AY746692 ; AY746698 ; AY746697 ; AY308072 ; AF403239 ; AF 165049 ; AF 165050 ; AY746873 ; AY746881 ; AY746874 ; AY746882 ; AY746880 ; AY746875 ; AY746879 ; AY746878 ; AY746876 ; AY746877.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype 2, 71 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants : AB030907 ; D 10077 ; AF238486 ; AY232738 ; AY232739 ; AY232742 ; AY232743 ; D 10988 ; AY232744 ; AY232745 ; AY232730 ; AY232731 ; AY232732 ; AY232733 ; AY232734 ; AY232735 ; AY232736 ; AY232737 ; AY232740 ; AY232741 ; AY232748 ; AY232749 ; AY232746 ; AY232747 ; AB031663 ; AY070214 ; AY070215 ; D31972 ; L38326 ; D50409 ; L38321 ; L38322 ; L38319 ; L38324 ; L38328 ; L38329 ; L38320 ; L38330 ; L38337 ; D49754 ; D49757 ; L29631 ; L38333 ; D49745 ; D49755 ; D49746 ; D49756 ; AB047639 ; AB047640 ; AB047641 ; AF177036 ; D00944 ; AB047644 ; AB047645 ; AF169004 ; AF238481 ; AF238483 ; AF238482 ; D10075 ; AF169003 ; L38334 ; L38336 ; AF169005 ; AF238484 ; L38335 ; AF169002 ; AB047642 ; AF238485 ; AB047643 ; AY746460 ; AY236365.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype 2, 6 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants : AB030907 ; D10988 ; AB031663 ; AB047639 ; D00944 ; D50409.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype 3, 43 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants : AF046866 ; D 14305 ; D17763 ; D14311 ; L12355 ; D14307 ; D14309 ; X76918 ; D28917 ; D16612 ; D16620 ; D16618 ; AY231584 ; AY231585 ; AY231586 ; AY231587 ; AY231588 ; AY231589 ; AY231590 ; D49374 ; Dl 1443 ; D16616 ; D37840 ; D37839 ; AY434137 ; AY434140 ; AY434153 ; D16614 ; D49747 ; D49749 ; D63821 ; D49750 ; D49752 ; D49753.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype 3, 14 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants : AF046866 ; D17763 ; D28917 ; AY231584 ; AY231585 ; D49374 ; AY231586 ; AY231587 ; AY231590 ; AY231589 ; AY231588 ; AF216786 ; AF216787 ; AF216788.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype 4, 10 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants : D45193 ; Yl 1604 ; L38338 ; U10238 ; L29587 ; L29624 ; L38323 ; L38332 ; U10236 ; U10235.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype 4, 9 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants : AJ401094 ; AJ401096 ; Yl 1604 ; AJ401095 ; AJ401101 ; AJ401097 ; AJ401098 ; AJ401100 ; AJ401099.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype 5, 4 séquences ont été alignées, les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants : AF064490 ; D50466 ; L29577 ; Y13184.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype 5, 2 séquences ont été alignées. Elles portent les numéros d'accession suivants : AF064490 ; Yl 3184.
Pour les 573 premiers nucléotides du génotype 6, 40 séquences ont été alignées, les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants : AY231583 ; D37841 ; D84262 ; AY859526 ; D88469 ; D88476 ; D88475 ; L38339 ; D88473 ; Y12083 ; D37848 ; D37849 ; D37850 ; D84265 ; D88465 ; L38331 ; D88466 ; D84264 ; D88468 ; D88470 ; D88471 ; D88472 ; AY434111 ; D49748 ; D63822 ; D49758 ; D49751 ; D31971 ; D88474 ; D88477 ; D88478 ; D37843 ; D37844 ; D37845 ; D38078 ; D37846 ; L38341 ; L38340 ; D84263 ; D88467.
Pour les 45 derniers nucléotides du génotype 6, 4 séquences ont été alignées. Les numéros d'accession de ces séquences sont les suivants : AY231583 ; D84262 ; AY859526 ; Y12083.
Tous les numéros d'accession précédents font référence à la base de données GenBank.
Par ailleurs il faut noter que les séquences générales représentées par SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 sont des séquences dans lesquelles des lettres génériques sont utilisées en plus des quatre lettres réelles A, T, G, C, et ce conformément aux conventions usuelles : Y = C ou T ; R = A ou G : K = G ou T ; M = A ou C ; W = A ou T ; S = C ou G ; V = A ou C ou G ; H = A ou C ou T ; D = A ou G ou T ; B = C ou G ou T ; N = A ou C ou G ou T. Ainsi les séquences générales SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 correspondent à une forme générique des séquences issues de diverses souches dont les numéros d'accession ont été donnés ci-dessus.
Les séquences SEQ ID NO : 3 à SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24 sont des séquences consensus correspondant respectivement aux génotypes 2 à 6, la et Ib, qui sont formées à partir des seules lettres A, T, G ou C et représentent des séquences dans lesquelles chaque nucléotide à une position donnée est le nucléotide le plus fréquent parmi les souches alignées du génotype en question à la position donnée.
La séquence nucléotidique mutée de l'invention peut être dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core et un fragment de la protéine El, représentée par l'une des séquences associées au génotype la, Ib, 2, 3, 4, 5 ou 6 du VHC, dont le numéro d'accession est répertorié dans les listes ci-desssus.
La séquence nucléotidique mutée de l'invention peut également être dérivée d'une séquence elle-même dérivée par dégénérescence du code génétique de l'une des séquences consensus SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24 ou de l'une des séquences des souches de génotype la, Ib, 2, 3, 4, 5 ou 6 dont les numéros d'accession figurent ci-dessus. Avantageusement l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, présentant une ou plusieurs mutations par rapport à la séquence nucléotidique d'origine codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core du virus de l'hépatite C.
Avantageusement l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, comportant une ou des mutations qui correspondent à l'introduction d'un ou plusieurs codons STOP dans le cadre de lecture +1 de la séquence nucléotidique d'origine.
Les codons STOP sont de la forme TAG, TAA ou TGA si l'on prend pour référence le brin d'ADN codant, ou UAG, UAA ou UGA si l'on prend pour référence l' ARN transcrit.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, présentant également une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la restauration d'un ou de plusieurs codons synonymes dans le cadre de lecture 0.
En effet, la présence d'une ou de plusieurs mutations permettant d'introduire un ou plusieurs codons STOP dans le cadre de lecture +1 peut modifier les acides aminés codés dans le cadre de lecture 0, auquel cas il est avantageux, afin d'éviter cette modification, d'introduire une ou plusieurs mutations supplémentaires, généralement situées 1, 2 ou 3 nucléotides après la ou les mutations introduisant le ou les codons STOP dans le cadre de lecture +1. Ces mutations supplémentaires annulent l'effet des mutations liées au codon STOP dans le cadre +1 en permettant de restaurer le codage des acides aminés normaux dans le cadre 0.
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n (par exemple 3, 6, 9...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+l (par exemple 4, 7, 10...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+2 (par exemple 5, 8, 11...).
Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le cadre de lecture +1 nécessite une seule mutation ponctuelle (substitution). Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le cadre de lecture +1 nécessite deux mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le cadre de lecture +1 nécessite trois mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n (par exemple 3, 6, 9...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+l (par exemple 4, 7, 10...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +1 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+2 (par exemple 5, 8, 11...).
Selon un mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 nécessite une seule mutation ponctuelle (substitution).
Selon un mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 nécessite deux mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 nécessite trois mutations ponctuelles (substitutions).
Des mutations peuvent également permettre d'introduire des codons STOP dans le cadre de lecture +2. Bien que la famille ARFP soit normalement exprimée dans le cadre de lecture +1, il peut être avantageux d'introduire de tels codons STOP dans le cadre de lecture +2 puisqu'un glissement du cadre de lecture en +2 / -1 est toujours possible malgré tout.
Tout comme dans le cas du cadre de lecture +1, des mutations supplémentaires peuvent également permettre de restaurer des codons synonymes dans le cadre de lecture 0 à la suite des mutations permettant d'introduire des codons STOP dans le cadre de lecture +2. Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n (par exemple 3, 6, 9...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+l (par exemple 4, 7, 10...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à obtenir les codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en. position de type 3n+2 (par exemple 5, 8, 11...).
Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le cadre de lecture +2 nécessite une seule mutation ponctuelle (substitution).
Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le cadre de lecture +2 nécessite deux mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation particulier l'introduction d'un codon STOP dans le cadre de lecture +2 nécessite trois mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n (par exemple 3, 6, 9...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+l (par exemple 4, 7, 10...).
Selon un mode de réalisation particulier les mutations destinées à restaurer des codons synonymes suite à l'introduction de codons STOP dans le cadre +2 sont préférentiellement présentes sur des nucléotides situés en position de type 3n+2 (par exemple 5, 8, 11...).
Selon un' mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 nécessite une seule mutation ponctuelle (substitution).
Selon un mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 nécessite deux mutations ponctuelles (substitutions). Selon un mode de réalisation particulier la restauration d'un codon synonyme dans le cadre de lecture 0 à la suite d'une ou plusieurs mutations introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 nécessite trois mutations ponctuelles (substitutions).
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, présentant une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la modification de la structure secondaire de PARN transcrit correspondant à ladite séquence nucléotidique mutée et / ou à l'optimisation de la traduction dudit ARN transcrit.
Ces mutations supplémentaires ont en particulier pour but d'éviter les motifs suivants :
- les boîtes TATA, les sites Chi et les sites d'entrée du ribosome ;
- les séquences riches en AT ou riches en GC ;
- les séquences répétées et les structures secondaires relativement stables de l'ARN ;
- les sites donneurs et accepteurs d'épissage (cryptiques), les points de branchement.
En particulier, l'élimination des boîtes TATA permet de limiter la transcription, l'élimination des sites Chi permet de limiter la recombinaison. L'épissage est avantageusement évité dans la mesure où il peut permettre un changement du cadre de lecture.
De plus, les répétitions indirectes de plus de 8 nucléotides sont avantageusement évitées dans la mesure du possible afin d'éviter la constitution de structures secondaires stables sur l'ARN et de ce fait d'éviter les événements d'im'tiation interne. En outre, les " mutations supplémentaires peuvent avoir pour but d'éviter les codons rares, afin d'augmenter l'efficacité de la traduction (disponibilité relative des différents ARNt).
Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivée par mutation de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8 de la souche J de génotype Ib du virus de l'hépatite C, codant pour la protéine Core.
La souche J du génotype Ib a été décrite notamment par Kato et al., Proc. Natl. Acad. ScI USA 87:9524-9528 (1990).
Selon un mode de réalisation alternatif, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivée par mutation de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 9 de la souche J de génotype Ib du virus de l'hépatite C, codant pour la protéine Core et le peptide signal El.
L'ensemble constitué par la protéine Core et le peptide signal El (codé par exemple par SEQ ID NO : 9) est baptisé capside.
Selon un mode de réalisation alternatif, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivée par mutation de la séquence nucléotidique de la souche J de génotype Ib du virus de l'hépatite C représentée par SEQ ID NO : 10, codant pour la protéine Core et un fragment de El ou par SEQ ID NO : 11, codant pour la protéine Core et la protéine El ou par SEQ ID NO : 12, codant pour la protéine Core, la protéine El et la protéine E2.
L'expression « codant pour la protéine Core et un fragment de El » signifie dans le cas de la SEQ ID NO : 10 « codant pour la protéine Core, le peptide signal de El, et les 15 acides aminés de El suivant ce peptide signal ».
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 8 ou 9 ou 10 ou 11 ou 12, et présentant un ensemble de mutations portant sur l'un des triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 ou 293-295, ledit ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides du triplet de nucléotides susmentionné, introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO : 13 ou SEQ ID NO : 14 ou SEQ ID NO : 15.
La séquence représentée par SEQ ID NO : 13 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10, avec une substitution T-^G en position 66 pour introduire un codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 22/23).
La séquence représentée par SEQ ID NO : 14 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10, avec une substitution C-->A en position 139 pour introduire un codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 46/47), et une substitution C-->A en position 141 pour restaurer un codon synonyme.
La séquence représentée par SEQ ID NO : 15 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10, avec une substitution T-->A en position 295 pour introduire un codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 98/99), et deux substitutions pour restaurer un codon synonyme, à savoir C-->G en position 296 et A-->C en position 297.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 8 ou 9 ou 10 ou 11 ou 12, et présentant deux ensembles de mutations portant respectivement sur deux triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant, deux codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO : 16 ou SEQ ID NO : 17 ou SEQ ID NO : 18.
La séquence représentée par SEQ ID NO : 16 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10, avec une substitution T-->G en position 66 pour introduire un premier codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 22/23), une substitution C-->A en position 139 pour introduire un deuxième codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 46/47), et une substitution C-->A en position 141 pour restaurer un codon synonyme.
La séquence représentée par SEQ ID NO : 17 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10, avec une substitution T^G en position 66 pour introduire un premier codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 22/23), une substitution T-->A en position 295 pour introduire un deuxième codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 98/99), et deux substitutions (C ->G en position 296 et A->C en position 297) pour restaurer un codon synonyme.
La séquence représentée par SEQ ID NO : 18 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10, avec une substitution C-->A en position 139 pour introduire un premier codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 46/47) et une substitution C-->A en position 141 pour restaurer un codon synonyme, ainsi qu'une substitution T-->A en position 295 pour introduire un deuxième codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 98/99), et deux substitutions (C ->G en position 296 et A->C en position 297) pour restaurer un codon synonyme.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 8 ou 9 ou 10 ou 11 ou 12, et présentant trois ensembles de mutations portant respectivement sur les trois triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant trois codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO : 19.
La séquence représentée par SEQ ID NO : 19 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10, avec une substitution T-->G en position 66 pour introduire un premier codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 22/23), une substitution C-->A en position 139 pour introduire un deuxième codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 46/47) et une substitution C-->A en position 141 pour restaurer un codon synonyme, ainsi qu'une substitution T-->A en position 295 pour introduire un deuxième codon STOP dans le cadre de lecture +1 (codon 98/99), et deux substitutions ( C-->G en position 296 et A-->C en position 297) pour restaurer un codon synonyme.
Les STOP introduits aux codons 22/23 et 98/99 présentent a priori plutôt un intérêt pour les séquences dérivées d'une séquence de génotype la, tandis que le STOP introduit au codon 46/47 présente a priori plutôt un intérêt pour les séquences dérivées d'une séquence de génotype Ib.
Toutefois, il faut noter que les mécanismes décrits en introduction pour un génotype particulier de VHC (la ou Ib) ne sont pas nécessairement exclusifs. Cette idée est soutenue par le fait que le pourcentage des patients infectés par un VHC de génotype la qui présentent des réponses immunitaires anti-ARFP est trop élevé pour que l'expression d'ARFP soit régie uniquement par le signal AAA que l'on rencontre rarement dans les séquences du VHC de type la.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 8 et présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398-400, 464-466, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 9, et présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10 ou 11 ou 12, et présentant au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des trois triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10 ou 11 ou 12, présentant pour seules mutations, au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des trois triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581- 583, 590-592, 608-610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1 nucléotide de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10 ou 11 ou 12, présentant au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des trois triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608- 610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1 nucléotide de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, et présentant également des mutations correspondant à la restauration de codons synonymes dans le cadre de lecture 0, chacune de ces mutations consistant respectivement en une substitution portant sur un nucléotide situé en position p+1 par rapport à une mutation située en position p introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10 ou 11 ou 12, présentant au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des trois triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608- 610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1 nucléotide de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, et présentant également des mutations correspondant à la restauration de codons synonymes dans le cadre de lecture 0, chacune de ces mutations consistant respectivement en une substitution portant sur un nucléotide situé en position p+2 par rapport à une mutation située en position p introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par .
SEQ ID NO : 8 et présentant 7 ensembles de mutations portant respectivement sur les 7 triplets de nucléotides n°65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 7 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 9, et présentant 8 ensembles de mutations portant respectivement sur les 8 triplets de nucléotides n°65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10 ou 11 ou 12, et présentant 11 ensembles de mutations portant respectivement sur les 11 triplets de nucléotides n°65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 11 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être la séquence SEQ ID NO : 20.
La séquence représentée par SEQ ID NO : 20 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10 et présente 20 substitutions, dont 12 servent à obtenir 11 codons STOP dans le cadre de lecture +1, tandis que 8 servent à restaurer des codons synonymes.
Mutations destinées à introduire des codons STOP dans le cadre +1 :
- codon 22/23 : T-> G en position 66 ;
- codon 46/47 : C-->A en position 139 ;
- codon 98/99 : T-> A en position 295 ;
- codon 122/123 : C-> G en position 366 ;
- codon 126/127 : T-->G en position 378 ;
- codon 133/134 : C-->G en position 399 ;
- codon 155/156 : C-->G en position 465 et C-->A en position 466 ;
- codon 182/183 : T-> A en position 547 ; - codon 194/195 : C-->A en position 583 ;
- codon 197/198 : T-->A en position 592 ;
- codon 202/203 : C-->G en position 609.
Mutations destinées à restaurer des codons synonymes : C-->A en position 141 ; C-->G en position 296 ; A-->C en position 297 ; G-->A en position 468 ; C-->G en position 548 ; T-->C en position 549 ; C-->A en position 585 et C-->G en position 593.
Il faut également remarquer que deux codons STOP sont déjà naturellement présents dans le cadre de lecture +1, l'un sur le codon 162/163 (nucléotides 485-487) et l'autre sur le codon 185/186 (nucléotides 554-556).
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 8, et comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-l l, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 9, et comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-ll, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, dérivant de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10 ou 11 ou 12, et comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-l l, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174- 176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393- 395, 444-446, 516-518, 567-569, 576-578, 612-614, 615-617, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être la séquence SEQ ID NO : 21 ou la séquence SEQ ID NO : 22.
La séquence représentée par SEQ ID NO : 21 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10 et présente, outre toutes les substitutions déjà décrites à propos de la séquence représentée par SEQ ID NO : 20, 38 substitutions supplémentaires, dont 32 servent à obtenir 23 codons STOP dans le cadre de lecture +2, tandis que 6 servent à restaurer des codons synonymes.
Les substitutions supplémentaires destinées à obtenir des codons STOP dans le cadre +2 sont les suivantes :
- A-->T en position 9 (codon 3/4) ;
- C-->T en position 33 (codon 11/12) ;
- C-->T en position 45 (codon 15/16) ;
- C-->T en position 48 et C-->A en position 49 (codon 16/17) ;
- G-->T en position 114 et C-->A en position 115 (codon 38/39) ;
- C-->T en position 126 (codon 42/43) ;
- T-->A en position 157 et C-->G en position 158 (codon 52/53) ;
- C-->A en position 175 (codon 58/59) ;
- C-->T en position 213 (codon 71/72) ;
- C-->T en position 264 (codon 88/89) ;
- C-->T en position 300 et C-->A en position 301 (codon 100/101) ;
- C-->A en position 310 (codon 103/104) ;
- A-->T en position 330 (codon 110/111) ;
- C-->T en position 336 et C-->A en position 337 (codon 112/113) ;
- G-->T en position 348 et C-->A en position 349 (codon 116/117) ;
- C-->T en position 369 (codon 123/124) ;
- C-->T en position 393 (codon 131/132) ; •
- C-->T en position 444 (codon 148/149) ;
- C-->T en position 516, T-->A en position 517 et C-->G en position 518 (codon 172/173) ;
- T-->A en position 568 et C-->G en position 569 (codon 189/190) ;
- C-->T en position 576 (codon 192/193) ;
- G->T en position 612 (codon 204/205) ; et - C-->T en position 615 (codon 205/206).
Mutations destinées à restaurer des codons synonymes : C-->A en position 51 ; C-->A en position 117 ; C-->T en position 159 ; T-->A en position 177 ; T-->A en position 303 ; T-->C en position 519.
La séquence représentée par SEQ ID NO : 22 est dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO : 10 et présente, outre toutes les substitutions déjà décrites à propos de la séquence représentée par SEQ ID NO : 20 et de la séquence représentée par SEQ ID NO : 21, des mutations supplémentaires destinées à la modification de la structure secondaire de TARN transcrit correspondant à ladite séquence nucléotidique mutée et / ou à l'optimisation de la traduction dudit ARN transcrit.
Ces mutations supplémentaires figurant dans la séquence représentée par SEQ ID NO : 22 sont les suivantes :
Position 4 : A-->T ; position 5 G-->C; position 12 T-->C ; position 21 T-->C ; position 24 A-->G ; position 27 A-->G ; position 37 C-->A ; position 39 T-->G ; position 52 C-->A ; position 54 C-->G ; position 69 G-->A ; position 75 G-->A ; position 78 C-->A ; position 81 T-->A ; position 84 T-->A ; position 93 T-->G ; position 96 T-->A ; position 102 T-->G ; position 109 T-->C ; position 120 G-->A ; position 123 C-->A ; position 129 G-->A ; position 130 T-->C ; position 135 T-->A ; position 144 G-->A ; position 150 G-->A ; position 162 G-->A ; position 163 C-->A ; position 165 G-->A ; position 166 T-->A ; position 167 C-->G ; position 168 G-->C ; position 171 A-->G ; position 184 C-->A ; position 186 A-->G ; position 189 A-->G ; position 192 T-->A ; position 198 C-->A ; position 201 G-->A ; position 204 T-->A ; position 205 C-->A ; position 207 C-->A ; position 208 C-->A ; position 216 G-->A ; position 219 T-->A ; position 222 G-->A ; position 225 C-->A ; position 231 T-->A ; position 240 G-->A ; position 246 T-->A ; position 252 C-->A ; position 255 C-->G ; position 258 T-->C ; position 261 C-->A ; position 267 G-->A ; position 270 T-->A ; position 276 G-->A ; position 291 C-->G ; position 306 C-->G ; position 307 T-->A ; position 308 C-->G ; position 318 T-->C ; position 324 C-->A ; position 327 C-->A ; position 340 C-->A ; position 342 T-->A ; position 346 T-->A ; position 347 C-->G ; position 351 T-->G ; position 354 T-->C ; position 355 T-->C ; position 360 T-->A ; position 363 G-->A ; position 372 T-->C ; position 375 C-->A ; position 387 C-->A ; position 390 C-->T ; position 396 C-->T ; position 405 G-->A ; position 414 G-->A ; position 417 T-->G ; position 420 C-->G ; position 423 C-->A ; position 426 C-->A ; position 429 C-->T ; position 432 A-->G ; position 438 C-->A ; position 441 T-->A ; position 447 G-->A ; position 456 G-->A ; position 459 T-->C ; position 471 T-->G ; position 477 G-->A ; position 480 C-->T ; position 489 C-->T ; position 492 T-->C ; position 498 A-->C ; position 501 G-->A ; position 513 T-->A ; position 525 T-->A ; position 534 C-->G ; position 535 T-->C ; position 537 A-->G ; position 540 T-->A ; position 541 T-->C ; position 553 T-->C ; position 561 C-->T ; position 564 A-->C ; position 573 T-->A ; position 579 G-->A ; position 588 C-->T ; position 597 G-->C ; position 600 A-->C ; position 606 T-->C ; position 618 C-->T.
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée de l'une quelconque des séquences nucléotidiques mutées telles que définies ci-dessus, qui code dans son cadre de lecture 0 pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou par un fragment de la protéine Core, la séquence protéique de ladite protéine Core ou dudit fragment de la protéine Core ne présentant pas de mutation par rapport à la séquence protéique de la protéine Core normale ou du fragment correspondant de la protéine Core normale.
Par « protéine Core normale », on désigne toute protéine Core sauvage exprimée par les variants naturels des différents génotypes du virus de l'hépatite C.
La protéine comprenant ou constitué par la protéine Core, qui est codée par la séquence nucléotidique d'origine ou initiale (non mutée) peut être d'origine naturelle (produite par le virus de l'hépatite C) ou recombinante. La protéine comprenant ou • constitué par la protéine Core, qui est codée par la séquence nucléotidique mutée susmentionnée selon l'invention, est une protéine recombinante. Bien que ces deux protéines (codée par la séquence nucléotidique non mutée et codée par la séquence nucléotidique mutée) aient la même séquence protéique, c'est à dire présentent le même succession d'acides aminés, elles peuvent présenter des différences chimiques selon leur mode d'obtention, en particulier lorsque la première est naturelle et la seconde recombinante. Ces différences chimiques peuvent par exemple concerner les ponts disulfure ou se rapporter à la maturation par clivage protéolytique, à la modification co- ou post-traductionnelle d'origine lipidique et / ou glucidique.
L'invention concerne également une séquence nucléotidique présentant une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou un fragment de la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2 d'une souche du virus de l'hépatite C, permettant l'expression par une cellule vivante de la protéine Core et ne permettant pas l'expression par une cellule vivante d'une protéine ARJFP ou d'un fragment d'une protéine ARFP de plus de 11 acides aminés.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique de souche de génotype la, Ib, 2, 3, 4, 5 ou 6 du virus de l'hépatite C, codant dans le cadre de lecture 0 pour, une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou un fragment de la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, et ne codant pas pour une protéine ARFP ou pour un fragment de protéine ARFP de plus de 11 acides aminés dans le cadre de lecture +1.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique de souche de génotype la ou Ib du virus de l'hépatite C, codant dans le cadre de lecture 0 pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou un fragment de la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, et ne codant pas pour une protéine ARFP ou pour un fragment de protéine ARFP de plus de 11 acides aminés dans le cadre de lecture +1.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui est telle qu'un ou plusieurs codons STOP sont présents dans ledit cadre de lecture +1.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente une plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la restauration d'un ou de plusieurs codons synonymes dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la modification de la structure secondaire de PARN transcrit correspondant à ladite séquence nucléotidique mutée et / ou à l'optimisation de la traduction dudit ARN transcrit.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente un ensemble de mutations portant sur l'un des triplets de nucléotides n°65- 67, 137-139 ou 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID - NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, ledit ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre " de lecture O, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO : 13 ou SEQ ID NO : 14 ou SEQ ID NO : 15.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente deux ensembles de mutations portant respectivement sur deux triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant deux codons STOP respectifs dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO : 16 ou SEQ ID NO : 17 ou SEQ ID NO : 18.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente trois ensembles de mutations portant respectivement sur les trois triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant trois codons STOP respectifs dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO : 19.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377- 379, 398-400, 464-466, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1 , 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente un ou .plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente 7 ensembles de mutations portant respectivement sur les 7 triplets de nucléotides n°65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente 8 ensembles de mutations portant respectivement sur les 8 triplets de nucléotides n°65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui présente 11 ensembles de mutations portant respectivement sur les 11 triplets de nucléotides n°65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 11 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être représentée par SEQ ID NO : 20.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui comporte en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-l 1, 33- 35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309- 311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui comporte en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-l 1, 33- 35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309- 311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui comporte un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-l l, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309- 311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569, 576- 578, 612-614, 615-617 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être représentée par SEQ ID NO : 21 ou SEQ ID NO : 22.
Avantageusement, l'invention concerne la séquence nucléotidique susmentionnée, qui est telle que la séquence protéique de la protéine Core ou du fragment de la protéine Core codée par la séquence nucléotidique ne présente pas de mutation par rapport à la séquence protéique de la protéine Core normale (ou sauvage) ou du fragment correspondant de la protéine Core normale.
Toutes les séquences nucléotidiques • susmentionnées font référence à des molécules d'ADN simple brin ou à des molécules d'ADN doublé brin (auquel cas les positions sont données par rapport au brin codant).
Par ailleurs, l'invention concerne un ÂRN transcrit correspondant à l'une des séquences nucléotidiques sus-mentionnées ou une molécule d'acide nucléique (ADN ou ARN) monocaténaire complémentaire de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées.
L'invention concerne également un vecteur recombinant contenant une séquence nucléotidique selon l'invention.
Le vecteur recombinant ou vecteur d'expression peut notamment être sous forme de plasmide éventuellement couplé à des agents vectorisants (tels que des liposomes, des lipides cationiques...), ou sous forme de virus (tels que les poxvirus ou les adénovirus). De tels vecteurs et leurs méthodes de préparation sont décrits dans la littérature accessible à l'homme du métier (voir notamment « Nonviral Vectorsfor gène Therapy », 2001, édité par M. Findeis, Humana Press ; « Adenoviral Vectorsfor Gène Therapy », 2002, édité par Curiel et Douglas, Elsevier Science, Académie Press ; et « Vaccinia Virus -and poxvirology », 2004, édité par S. Isaacs, Humana Press ).
Avantageusement, ledit vecteur d'expression contient les éléments de contrôle de l'expression. Par «éléments de contrôle de l'expression», on entend désigner les éléments nécessaires afin d'assurer l'expression de la séquence nucléotidique selon l'invention après son transfert dans une cellule ou un organisme hôte. Les éléments de contrôle peuvent varier selon l'hôte, le vecteur d'expression, le niveau d'expression recherché. De tels éléments sont connus de l'homme de l'art. Parmi ces éléments, le promoteur revêt une importance particulière. Le promoteur utilisable dans le cadre de la présente invention peut être d'origine virale, cellulaire ou encore être synthétique. En outre, il peut être ubiquitaire ou spécifique par exemple d'un type cellulaire donné ou activable dans des conditions définies. On peut citer plus particulièrement dans le cadre de la présente invention les promoteurs précoces des virus RSV (Rous Sarcoma Virus), SV40 (Simian Virus), et CMV (Cytomegalovirus ; Boshart et al., 1985, CeIl 41, 521- 530), le promoteur TK (Thymidine kinase du virus HSV-I (Herpès Virus Simplex), le promoteur tardif de l'adénovirus (MLP pour Major Late Promoter) et les promoteurs du virus de la vaccine (promoteurs 7.5K, H5R, TK, p28, pl i et KlL) ou les promoteurs synthétiques décrits notamment par Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23, 1094- 1097), Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138). A titre d'exemples de promoteurs cellulaires on peut citer plus particulièrement les promoteurs des gènes phosphoglycero kinase (PGK ; Adra et al., 1987, Gène 60, 65-74), albumin (Pinkert et al., 1987, Gènes Dev. 1, 268-277), phosphoenol pyruvate carboxy kinase (PEPCK) (Eisenberger et al., 1992, Mol. CeIl Biol. 12, 1396-1403), cholestérol 7-alpha hydroylase (CYP-7) (Lee et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 14681-14689), alpha- 1 antitrypsin (Ciliberto et al, 1985, CeIl 41, 531-540), transferrine (Mendelzon et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18, 5717-5721); et facteur IX (US 5,814,716) qui confèrent une expression foie-spécifique.
En outre, le vecteur d'expression de l'invention peut comprendre un ou plusieurs éléments de contrôle permettant notamment d'optimiser la transcription de la séquence nucléotidique, la stabilité ou le transport des ARN messagers et/ou leur traduction en protéine. Ces éléments sont connus de l'homme de l'art, par exemple les séquences 5', 3' non codantes, introns, séquence d'épissage, séquence de terminaison de la transcription, séquence de Shine-Dalgarno, ou encore séquence de Kozak.
L'invention concerne également un hôte cellulaire transformé ou transfecté par le vecteur d'expression susmentionné. Le terme « transfection » fait référence à toute méthode conventionnelle d'introduction d'un vecteur dans un hôte cellulaire et inclut notamment l'infection par un virus. Par exemple, un vecteur viral peut être introduit dans l'hôte par transfection de son génome ou par infection de la particule virale.
Des exemples d'hôtes cellulaires transformés ou transfectés sont : les cellules procaryotes, les cellules eucaryotes, notamment d'insectes, de mammifères ou de plantes, les cellules primaires ou issues de lignées cellulaires, mais également les organismes transgéniques, notamment les mammifères transgéniques, tels que les souris transgéniques.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une séquence nucléotidique susmentionnée, ou un vecteur d'expression susmentionné, ou un hôte cellulaire transformé ou transfecté susmentionné, en tant que substance active, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont appropriées pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra-auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d'administration en une ou plusieurs fois. Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales injectables, des timbres transdermiques (« patch »), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres. Ces formes galëniques sont préparées selon les méthodes usuelles des domaines considérés. Lesdites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration journalière de 0,001 à 10 mg de substance active par kg de poids corporel, selon la forme galénique. S 'agissant de vecteur viral, les doses unitaires convenant à la présente invention comprennent de 10 à 1013 particules virales. Des doses unitaires comprenant de 10 à 5x10 pfu (unité formant des plaques) de virus de la vaccine (MVA) ou de 5x10 à 5xlOπ particules virales d'adénovirus sont particulièrement appropriées à la présente invention. Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse du patient.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la présente invention concerne également une méthode de traitement des pathologies associées au virus de l'hépatite C qui comprend l'administration, à un patient, d'une dose efficace d'un médicament (ou composition pharmaceutique) de l'invention.
Bien entendu, les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être associées à d'autres modalités thérapeutiques (radiation, chimiothérapie et/ou chirurgie) et/ou d'autres traitements thérapeutiques conventionnels pour traiter des pathologies associées au virus de l'hépatite C, par exemple des inhibiteurs de protéases, des antiviraux, des préparations vaccinales utilisant d'autres antigènes du VHC (notamment celles décrites dans WO2004/111082), ou encore des anticorps. Notamment, il peut être avantageux d'utiliser la composition selon l'invention en association avec le traitement à l'interféron alpha (par exemple IFN-α2a péguylé ou non) et/ou avec de la ribavirin.
L'invention concerne également un extrait et / ou surnageant cellulaire provenant d'une culture de cellules transfectées par une séquence nucléotidique susmentionnée ou un vecteur d'expression susmentionné, contenant, avant toute étape éventuelle de récupération des protéines, une protéine contenant la protéine Core ou un fragment de la protéine Core et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine El et / ou de la protéine E2, mais ne contenant pas de protéine ARFP ou de fragment de protéine ARFP de plus de 11 acides aminés.
L'invention concerne également un extrait de sérum ou de plasma d'un hôte, notamment humain ou animal, transfecté par une séquence nucléotidique susmentionnée ou un vecteur d'expression susmentionné, contenant, avant toute étape éventuelle de récupération des protéines, une protéine contenant la protéine Core ou un fragment de la protéine Core et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine El et / ou de la protéine E2, mais ne contenant pas de protéine ARFP ou de fragment de protéine ARFP de plus de 11 acides aminés.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une protéine contenant la protéine Core ou d'un fragment de la protéine Core et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine El et / ou de la protéine E2, mais ne contenant pas de protéine ARFP ou de fragment de protéine ARFP de plus de 11 acides aminés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de transformation de cellules hôtes appropriées avec un vecteur d'expression susmentionné, la mise en culture des cellules ainsi transformées, et la récupération, et le cas échéant la purification de la protéine susmentionnée. L'étape de transformation desdites cellules hôtes peut être réalisée par toute technique permettant d'introduire un vecteur ou une séquence nucléotidique dans une cellule.
L'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro, ou de pronostic, de pathologies liées à une infection par le virus de l'hépatite C, chez l'homme ou l'animal, comprenant :
- la mise en présence d'une protéine obtenue selon le procédé précédent, ou d'un anticorps préparé à partir de la protéine obtenue selon le procédé précédent, avec un échantillon biologique prélevé chez un sujet présentant ou susceptible de présenter une infection par le virus de l'hépatite C, — • la détection respectivement d'anticorps contre la protéine Core du virus de l'hépatite C éventuellement présents dans ledit échantillon biologique ou de protéines Core éventuellement présentes dans ledit échantillon biologique.
L'invention concerne aussi la vaccination prophylactique et thérapeutique, qui peut être mise en œuvre par injection d'un vaccin à base d'au moins un vecteur d'expression ou vecteur recombinant comprenant les séquences nucléotidiques de l'invention, injection suivie de rappels ou non. La vaccination peut également être mise en œuvre en injectant deux types de vecteurs d'expression de l'invention différents, par exemple tout d'abord un adénovirus, puis un poxvirus, de façon simultanée ou différée dans le temps, et vice et versa. Ces vecteurs peuvent être contenus dans un kit pharmaceutique.
Brève description des figures
Figure 1. Détection d'ARFP à la suite d'une transfection.
La détection se fait par Western Blot en utilisant des anticorps monoclonaux anti- ARFP (15E7F1) et anti-Core (19D9D6). Sur la figure IA la détection de Core et d'ARFP est simultanée, en présence d'inhibiteur de protéasome (MG-132). Sur la figure IB la détection de Core et d'ARFP est séparée, en présence ou en absence de MG-132. Les données sont représentatives de 4 expériences indépendantes.
Figure 2. Expression de Core et dΑRFP101 par les adénovirus recombinants.
Des cellules THP-I (figure 2A) et Huh7 (figure 2B) infectées ou non par les vecteurs adénoviraux recombinants (Ad) codant pour la β-galactosidase, CoreElE2 (CE1E2), Core et ARFP10I sont infectées à une multiplicité d'infection de 200 et 100 respectivement. 60 heures après infection, l'inhibiteur de protéasome est ajouté et on effectue une analyse par Western Blot à 72 heures en utilisant des anticorps monoclonaux anti-ARFP et Anti-Core. Les résultats représentent 5 expériences différentes.
Figure 3. Marquage par immunofluorescence de cellules THP-I.
Le marquage révèle une expression cytoplasmique diffuse d'ARFPioi- Des cellules THP-I sont infectées par Ad-ARFP101 (A), -Core (B), -CE1E2 (C) ou -β-Gal (D, E, F) à une multiplicité d'infection de 200 pendant 72 heures en présence de MG-132 pendant les dernières 12 heures. Les cellules sont ensuite marquées avec un anticorps monoclonal anti-ARFP (A, D) et anti-Core (B, C, E, F) puis un anticorps polyclonal antisouris de lapin conjugué à TRITC. Grossissement : 100x.
Figure 4. Expression de chimiokines. Le criblage de facteurs solubles est effectué sur le surnageant de cellules THP-I infectées pendant 72 heures par Ad-βGal, -CE1E2, -Core ou -ARFP101 (multiplicité d'infection = 200) en absence de MG- 132. Les facteurs solubles libérés sont mesurés en utilisant le Human Cytokine Array III. Les témoins positifs et négatifs sont en double aux positions a- 1/2, b-1/2 et 1-7/8 et les témoins négatifs aux positions c-1/2, d-1/2 et k-7/8. g- 3/4 ≈ interleukine 8 ; h-5/6 = RANTES.
Figure 5. Mise en évidence du blocage du glissement du cadre de lecture du ribosome par la séquence synthétique CΔARFP.
On analyse par cytométrie de flux l'expression de GFP par des cellules transfectées avec une séquence codant pour Core et la séquence codant pour la GFP insérée dans le cadre de lecture 0 (en haut à gauche) ou +1 (en haut à droite) par rapport à la première ; ou avec la séquence CΔARFP et la séquence codant pour la GFP dans le cadre +1 (en bas à gauche) ou +2 (en bas à droite) par rapport à la première.
Figure 6. Mise en évidence de la production endogène de Core par les cellules infectées par Ad-CΔARFP.
On étudie l'expression de la protéine Core par des cellules THP-I infectées par Ad-CΔARFP, -CE1E2, -Core ou -βGal.
- Figure 6A. Analyse par cytométrie de flux (FACScalibur, BD Biosciences) après marquage avec un anticorps anti-Core (19D9D6, dilution 1/10000) puis avec un anticorps anti-souris de chèvre conjugué à la FITC (1/100).
- Figure 6B. Analyse par Western Blot. Haut : Core ; bas : actine.
- Figure 6C. Analyse par microsopie de fluorescence en utilisant un anticorps monoclonal Anti-Core.
Figure 7. Mise en évidence de l'induction de MIP- lβ, MCP-I et IL-8 par l'expression endogène de Core et / ou ARFP.
On mesure par ELISA la production de MCP-I, MIP-I β et IL-8 par les cellules THP-I infectées par Ad-βgal, -CE1E2, -Core, -ARFP101 et -CΔARFP ou non-infectées après culture pendant 72 heures, lavage et incubation pendant : (A) 24 heures supplémentaires ou (B) 48 heures supplémentaires avant le prélèvement du surnageant. Les résultats sont exprimés en valeurs moyennes ± erreur type.
Analyse statistique :
Figure 7A, graphe IL-8 : P<0,001 entre Ad-CE1E2 et Ad-βGal et non significatif entre Ad-CΔARFP et Ad-CE1E2 ; Figure 7A5 graphe MlP-lβ : P=0,05 entre Ad-CE1E2 et Ad-βGal et P=0,007 entre Ad-CΔARFP et Ad-CE1E2 ;
Figure 7 A, graphe MCP-I : P=O,Ol entre Ad-CΔARFP et Ad-CE 1E2 ;
Figure 7B, graphe IL-8 : P<0,001 entre Ad-CE1E2 et Ad-βGal et P=0,008 entre Ad-CΔARFP et Ad-CE1E2 ;
Figure 7B, graphe MIP- lβ : P=0,002 entre Ad-CE 1E2 et Ad-βGal et PO,OOl entre Ad-CΔARFP et Ad-CE 1E2 ;
Figure 7B, graphe MCP-I : P=0,03 entre Ad-CΔARFP et Ad-CE1E2. .
Figure 8. Mise en évidence de l'induction d'IL-8, MIP-I β et MCP-I par la Core exogène.
On mesure la production de MCP-I, MIP-I β et IL-8 par des cellules THP-I qui sont : incubées avec de la protéine Core exogène à 5 μg/ml (m), 2,5 μg/ml (T) ou 1,25 μg/ml (•), les mesures étant effectuées dans le surnageant à différents temps (figure 8A), ou incubées avec la construction adénovirale pendant 72 heures, puis lavées et incubées dans 24 plaques à 106 cellules / ml pendant encore 48 heures en présence de Core exogène à 5 μg/ml (figure 8B).
Analyse statistique :
Figure 8B5 graphe IL-8 : P=O,OOl entre Ad-CE2E2 et Ad-βGal et non significatif entre Ad-CΔARFP et Ad-CE 1E2 ;
Figure 8B, graphe MCP-I : P=0,02 entre Ad-CE 1E2 et Ad-βGal et P=O5Ol entre Ad-CΔARFP et Ad-ARFP101.
Figure 9. Mise en évidence de Pimmunogénicité du produit d'expression de la séquence nucléotidique mutée CΔARFP dans les souris transgéniques HLA-A2.
La Figure 9A illustre l'évaluation de la réponse T CD8+ spécifique de l'épitope DLM (correspondant aux résidus 132-140 de la polyprotéine HCV) par test CTL après injection intra-musculaire des plasmides gWiz C206ΔARFP, gWiz C206 et gWiz. Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse spécifique en fonction du rapport effecteurs/cible par souris (3 souris immunisées pour gWiz C206ΔARFP et gWiz C206 ; 2 souris immunisées pour gWiz) en utilisant pour cible des cellules chargées avec l'épitope DLM. La Figure 9B illustre l'évaluation de la réponse T CD8+ spécifique de l'épitope DLM par test ELISPOT-IFNγ après injection intra-musculaire des plasmides gWiz C206ΔARFP , gWiz C206 et gWiz. Les résultats sont exprimés en nombre de spots (correspondant aux cellules productrices d' IFNγ) par rapport à 106 cellules pour les souris immunisées avec le plasmide gWiz C206ΔARFP (3 souris immunisées), le plasmide gWiz C206 (3 souris immunisées) ou le plasmide non recombinant gWiz (2 souris immunisées).
Figure 10. Trans-activation du promoteur à PIL-8 dans les cellules hépatocytaires Huh-7 co-trarisfectées avec les plasmides indiqués dans le tableau et un plasmide rapporteur exprimant la luciférase sous le contrôle du promoteur à l'IL-8. L'expression des protéines est détectée par Western blot à l'aide d'anticorps anti-ARFP, anti-Core et anti-actine (contrôle de transfection).
Partie expérimentale
Cultures cellulaires
On maintient des cellules d'hépatomes humaines Huh 7 à 370C dans une atmosphère à 5% de CO2 dans du milieu DMEM complet contenant du milieu Eagles modifié de Dulbecco auquel on a ajouté 10% de sérum fœtal de veau, 2 mM de L- glutamine et 100 IU/ml de pénicilline / streptamycine (Sigma). La lignée THP-I (de l'ATCC), une lignée cellulaire humaine de leucémie monocytaire, est cultivée dans du milieu RPMI complet contenant 10 % de sérum foetal de veau auquel on a ajouté 2 mM de L-glutamine et 100 IU /ml de pénicilline / streptomycine.
Plasmides et constructions d'adénovirus recombinants
Les plasmides pTGHisCElE2 et pTGHisCore sont construits par PCR en insérant une séquence poly-histidine tagcgccaccatgcatcaccatcaccatcaccatcacggtggtgtg (SEQ ID NO : 26) entre le codon d'initiation AUG et le second codon, dans les plasmides décrits dans Himoudi et al, J Virol, 76, 12735-12746 (2002).
Les plasmides pQBCore GFP (0) et pQBCore GFP (+1) sont tels que décrits dans Boulant et al., J. Biol. Chem., 278, 45785-45792 (2003).
La séquence CAARFP (ou CAARFP206) correspond à SEQ ID NO : 22. Elle a été synthétisée par GeneArt et code pour un polypeptide de 206 résidus (comprenant outre la methionine initiatrice, les 190 résidus de la protéine Core du VHC et les 15 premiers résidus de la protéine d'enveloppe El). Afin de vérifier qu'aucun glissement du cadre de lecture n'est produit à partir du cadre +1 et +2 de cette séquence codante, 3 plasmides contenant la séquence codant pour la GFP (green fluorescent protein) dans le cadre de lecture 0, +1 ou +2 de la séquence des nucléotides 1-420 (pQBl-CΔARFP- GFP(O)), 1-421 (pQBl-CΔARFP-GFP(+l)) ou 1-422 (pQBl-CΔARFP-GFP(+2)) de CΔARFP sont construits et utilisés dans des études d'expression in vitro.
Les adénovirus CE1E2, Core, GFP et β-galactosidase (β-Gal) ont été décrits dans Himoudi et al., J. Virol, 76, 12735-12746 (2002). Ad-ARFP101 et AdCΔARFP sont construits comme suit : la séquence ARFP101 qui couvre les nucléotides 470-775 (bornes incluses) par rapport au début du génome du VHC ou 128-433 (bornes incluses) par rapport au début du gène Core, flanquée d'un triplet initiateur ATG en 5', et correspondant à un polypeptide de 101 acides aminés du domaine ARFP du génotype Ib entre les codons 43 et 144 (séquence représentée par SEQ ID NO : 25) ainsi que la séquence CΔARFP (SEQ ID NO : 22), sont amplifiées par PCR. Chaque séquence est insérée dans un plasmide navette d'adénovirus (pTG13387) contenant une cassette d'expression sous le contrôle d'un promoteur de cytomégalovirus (CMV) afin de permettre la recombinaison homologue avec les séquences adénovirales du vecteur principal (pTG6624).
Les vecteurs pTG13387 et pTG6624 ont été fournis par TRANSGENE S.A. (France). La recombinaison homologue est effectuée chez E. coli et les préparations virales sont titrées par mimunofluorescence en utilisant un anticorps monoclonal spécifique de la protéine de liaison de l'ADN viral (Lusky et al. J Virol., 72, 2022- 2032, 1998 ; Reich et al. Virology, 128, 480-484, 1983). Le vecteur adénoviral est désigné Ad-CΔARFP ou Ad-C206ΔARFP. La séquence codant pour la protéine Core mutée selon l'invention est également introduite dans un plasmide d'expression gWiz (Gène Therapy System) sous le contrôle du promoteur CMV, pour donner gWiz CΔARFP (ou gWiz C206ΔARFP)
On a également construit des vecteurs codant pour une protéine Core CΔARFP de 191 résidus comprenant outre la méthionine initiatrice, les 190 résidus de la protéine Core du VHC mais dépourvue des premiers résidus de la protéine d'enveloppe El. Bien entendu, les mutations visant à abolir l'expression naturelle du polypeptide ARFP sont les mêmes que celles de la SEQ ID NO : 22. Pour différentier cette construction de la précédente, on fera spécifiquement référence au nombre de résidus 191 dans la dénomination des constructions; La séquence en nucléotides CAARFP191 est amplifiée à partir de la séquence CΔARPP2o6 décrite ci-dessus en utilisant les amorces sens gagatactcgagacctccactàaccctaaaccccagaggaaa (SEQ ID NO : 27) et antisens aacattcccgctagcgcatgagcggccgcagta (SEQ ID NO : 28). Comme précédemment, la séquence CΔARFP191 est introduite dans un vecteur adénoviral dans la région El et sous le contrôle du promoteur CMV ainsi que dans le plasmide d'expression gWiz (Gène Therapy System) également sous le contrôle du promoteur CMV, pour donner Ad- C191ΔARFP et gWiz C191ΔARFP, respectivement . Dans un souci de comparaison, la séquence nucléotidique sauvage codant pour la protéine Core de la souche J de génotype Ib du VHC dans sa version 191 ou 206 résidus a également été clonée dans les mêmes vecteurs (gWiz C191et gWiz C206).
Transfection de l'ADN et infection par les adénovirus
Les cellules Huh7 sont transfectées par les différentes constructions de plasmides décrites ci-dessus en présence de lipofectamine / Réactif Plus (Invitrogen) selon le protocole du fabricant. En bref, on mélange 2,8 μg d'ADN avec la lipofectamine et on incube à température ambiante pendant 15 minutes. Après l'ajout du réactif Plus, cette solution est mélangée avec 10 cellules / ml dans du DMEM sans sérum bovin fœtal. Après 3 heures d'incubation, on ajoute le milieu DMEM complet et on incube encore les cellules pendant 72 heures avant la purification de la protéine avec étiquette Histidine ou les analyses de la GFP.
On infecte des monocouches sous-confluentes de cellules Huh7 avec les adénovirus recombinants appropriés à une multiplicité d'infection de 100 unités infectieuses (IU) par cellule pendant 72 heures avant analyse par Western Blot (transfert de protéines). On infecte 10 millions de cellules THP-I à une multiplicité d'infection de 200 comme décrit dans Gerszten et al, J. Biol Chem., 276, 26846-26851 (2001). En bref, les cellules sont incubées dans 0,5 ml de milieu RPMI 1640 sans sérum contenant les différents adénovirus dans une plaque à 12 puits pendant 1 heure, le volume est ensuite complété à 3 ml avec du milieu RPMI complet. 72 heures après l'infection on récolte les cellules et soit on les lyse pour l'analyse par Western Blot, soit on les marque avec des anticorps monoclonaux appropriés pour le marquage d'immunofluoresence / de cytométrie de flux, soit on les lave et on les incube à 106 cellules / ml avec ou sans 5 μg/ml d' ARFP99 (polypeptide synthétique de 99 acides aminés issu d'ARFP, cf. Bain et al, J. Virol. 78:10460-10469, 2004), 5 μg/ml de protéine Core pendant 24/48 heures pour l'analyse des cytokines.
Purification des protéines avec étiquette histidine 72 heures après la transfection, on re-suspend 6x106 cellules Huh7 dans un tampon de lyse contenant 20 mM de Tris-HCl, à pH 8, 500 mM de NaCl3 8 M d'urée, un inhibiteur de protéase complet (Roche, un comprimé pour 40 ml), 10 ml de β- mercaptoéthanol (tampon A), on homogénéise par sonication, on congèle à — 80°C pendant 15 minutes et on centrifuge à 13000 tours par minute pendant 20 minutes. Le surnageant est récupéré et incubé avec 100 μl de billes de nickel paramagnétiques (Promega) préalablement équilibrées avec le tampon A, pendant 1 heure. Après 3 lavages avec le tampon A, les protéines - histidine sont éluées avec 100 μl de tampon A contenant 500 mM d'imidazole (élution 1). Après une seconde élution avec 100 μl (élution 2), on les sépare sur un gel d'électrophorèse à 15 % et on les analyse par Western Blot.
Western Blot (transfert de protéines)
On incube les cellules THP-I ou Huh7 infectées par les différents adénovirus dans du tampon de lyse glacé contenant du Triton X-100 à 1 % et un inhibiteur de protéase complet (Roche). Les cellules lysées sont centrifugées à 12000 g pendant 10 minutes, et on dose la concentration en protéine dans les fractions cytosoliques (Comassie Blue, Pierce), comme cela est décrit par le fabriquant. On charge les fractions cytoplasmiques sur un gel d'acrylamide à 7,5 % et le tout migre pendant 2 heures. Après le transfert électrophorétique, on sature en premier lieu des membranes de fluorure de polyvinylidène (membranes de transfert Hybond PVDF, Amersham) pendant 1 heure avec un tampon bloquant (lait sans graisses 5 %, Tween 20 0,3 % (v/v) dans du PBS, ou solution saline phosphate tamponnée) puis on incube avec un anticorps monoclonal anti-ARFP ou anti-Core pour saturer les sites de liaison, après quoi on incube avec de Panti-ARFP monoclonal de souris (15E7F1 produit par bioMérieux) ou de l'anticorps anti-Core monoclonal de souris (19D9D6, bioMérieux) dans du tampon bloquant. Après trois lavages dans du PBS avec 0,5 % de Tween 20, on incube les membranes pendant 2 heures avec des anticorps IgG anti-souris de chèvre conjugués à HRP dans un rapport 1:2000 dans le tampon bloquant (Dako). Après trois lavages finaux, on révèle les protéines par chimioluminescence (ECL Western-blotting détection System, Amersham). Le contenu en actine est évalué sur la même membrane après avoir appliqué le tampon Restore (Pierce) pendant 1 heure à température ambiante et incubé l'anticorps monoclonal anti-actine (Sigma). On réalise une évaluation semi-quantitative de l'expression des protéines en utilisant le programme Scion Image (Frederick, Maryland, USA). Marquage intracellulaire des protéines du VHC
On dispose des cellules THP-I à une concentration finale de 5x106 / puits dans des plaques à 24 puits et on les infecte avec différents adénovirus à une multiplicité d'infection de 200. 72 heures après l'infection, on lave les cellules deux fois dans du PBS glacé, on les fixe et on les perméabilise en utilisant le réactif cytofix / cytoperm (Becton Dickinson, France). Le marquage est effectué par incubation séquentielle avec d'abord l'anticorps monoclonal anti-ARFP (15E7F1 1/100) ou l'anticorps, monoclonal anti-Core (19D9D6, 1/100) puis l'anticorps anti-souris de lapin conjugué à TRITC (Dako Cytomation). Les cellules sont contre-marquées avec de PHoechst à 1/200 dilué dans du PBS et 80 % de glycérol et observées en utilisant la microscopie de fluorescence.
Analyses de cytométrie de flux
On transfecte des cellules Huh7 avec les plasmides pQBGFP pendant 72 heures et on analyse l'expression de la GFP par cytométrie de flux en utilisant un FACScalibur (BD Biosciences). Après 72 heures d'infection, on fixe les cellules THP-I et on les perméabilise avec Cytofix/cytoperm (Becton Dickinson), on incube avec l'anticorps monoclonal anti-Core (19D9D6, 1/10000) pendant 30 minutes à température ambiante. L'anticorps conjugué à FITC est ajouté pendant encore 30 minutes avant les analyses par cytométrie de flux.
Mesure de la production de facteurs solubles
Criblage des facteurs solubles. Les facteurs solubles libérés dans les surnageants cellulaires sont mesurés en utilisant à la fois le Human Cytokine Array III (RayBiotech) permettant la détection de 42 facteurs solubles et le kit de cytokines bioplex-17 (Biorad) en suivant les instructions du fabriquant.
Dosages d'immunoadsorbants liés à des enzymes (ELISA). L'évaluation quantitative d'interleukines sécrétées dans lès surnageants cellulaires est obtenue en utilisant le dosage d'immunoadsorbants liés à des enzymes (IL-8, MCP-I, BDBioscience, MIP-I β RD Bioscience). Les concentrations (en pg/ml) d'échantillons inconnus sont calculées en interpolant avec des courbes standard mises sur chaque plaque. La sensibilité de détection d'IL-8, de MCP-I et de MEP-I β est respectivement de 10, 7 et 30 pg/ml.
Statistiques
Des tests t de Student sont appliqués pour comparer les niveaux de cytokines.
Etudes d'immunogénicité sur des modèles de souris Protocole d'immunisation. Les expériences d'immunisation sont réalisées sur des souris transgéniques HLA-A2 (Pascolo et al., 1997, J. of Expérimental Médiane 185, 2043-2051). Les gènes codant pour les molécules murines de CMH de classe I sont invalidés (KO pour H2) et les souris transgéniques sont porteuses d'une molécule HLA ayant une chaîne légère chimère composée des chaînes αlet α2 humaines HLA- A2.1 et de la chaîne α3 murine H-2Db ainsi qu'une molécule β-2 microglobuline murine. Cinq jours avant l'injection de plasmides, les souris transgéniques HLA-A2 reçoivent une injection de cardiotoxine (50 μL à 10 μM ; Latoxan) par voie intramusculaire dans le but de provoquer une nécrose musculaire ponctuelle et de favoriser le recrutement des cellules dendritiques (DC) et donc une meilleure internalisation de l'ADN. Puis les souris sont immunisées au même site par deux injections intramusculaires à deux semaines d'intervalle de 100 μg de plasmide repris dans 100 μl de PBS Ix. Les plasmides testés sont le plasmide gWiz C206ΔARFP exprimant la protéine Core mutée selon l'invention, le plasmide gWiz exprimant la protéine Core sauvage (gWiz C206) et le plasmide gWiz non recombinant à titre de témoin négatif. Les préparations de plasmides sont purifiées de manière à éliminer les endotoxines bactériennes (Colonne endotoxin-free, Macherey-Nagel). Les animaux sont sacrifiés deux semaines après la seconde injection, les rates sont alors prélevées et broyées afin de récupérer les splénocytes et la réponse cellulaire est évaluée par ELISPOT et test CTL comme décrit dans Himoudi et al. (2002, J Virol. 76, 12753-12746).
Test CTL. Le test de cytotoxicité (CTL) repose sur la capacité des cellules effectrices induites de la rate des souris immunisées à lyser des cellules cibles présentant un épitope d'intérêt (Brinster, 2001, Hepatology 34, 1207-1217). Les splénocytes sont cultivés en plaque 24 puits en présence de l'épitope cible DLM (5 μM) et d'IL-2 recombinante murine (10 LVmL) pendant 5 jours dans du milieu essentiel alpha (αMEM). Les splénocytes sont alors re-stimulés par une co-culture avec des splénocytes irradiés de souris naïves incubés avec l'épitope DLM (10 μM). Au 7Ième jour, les splénocytes de souris immunisées ainsi cultivés (cellules effectrices) sont mis en présence de cellules EL4S3"Rob HHD (lignée cellulaire murine transfectée de manière stable pour exprimer la molécule HLA- A2) marquées au Cr51 (cellules cibles) et chargées ou non avec 10 μM de l'épitope DLM. On détermine la libération spontanée et la libération totale de Cr51 à partir des puits contenant les cellules cibles chargées ou non placées respectivement dans du milieu de culture ou du tampon de lyse (HCl IN). La quantification de Cr51 libéré est effectuée en utilisant un appareil de comptage y- Cobra II (Perkin Elmer, France). La cytotoxicité spécifique est calculée en appliquant la formule : (libération de chrome dans l'essai - libération spontanée) / (libération totale - libération spontanée) X 100. Chaque détermination est effectuée en triplicata et les. résultats donnés correspondent à une moyenne des trois valeurs. Les résultats sont représentés sous forme d'un graphe donnant le pourcentage de lyse spécifique en fonction du rapport effecteur/cible.
Test ELISPOT. Le test ELISPOT (pour Enzyme Linked Immunospot) a pour but de mesurer le nombre de cellules spécifiques d'un épitope produisant de l'IFNγ. Les splénocytes des souris immunisées (2x105) sont cultivés en triplicatas pendant 40 heures dans des plaques 96 puits « Multiscreen » (Millipore) préalablement incubées avec un anticorps monoclonal anti-IFNγ murin (Pharmingen ; 10 μg/mL). La culture se fait dans du milieu αMEM en présence d'interleukine-2 (IL-2) recombinante (PeproTech Inc ; 1 OU/ml) seule à titre de contrôle négatif ou avec 10 μM de peptide spécifique DLM contenu dans la Core (DLMGYIPLV correspondant aux résidus 132-140 de la polyprotéine HCV ; Himoudi et al, 2002, J. Virol. 16, 12753-12746). Les cellules incubées en présence de Concavaline A (5 μg/mL) constituent le contrôle positif de stimulation (activateur spécifique des lymphocytes T). Les cellules productrices d'IFNγ sont détectées grâce à un anticorps biotinylé anti-IgG de souris (Pharmingen, USA) qui lie la steptavidine couplée à la HRP (HorseRadish Peroxydase) et l'ajout du substrat de la peroxydase produit alors une réaction colorée. Le nombre de spots (un spot correspondant à une cellule productrice d'IFNγ) est quantifié de manière automatisée (microscope Zeiss couplé au logiciel KS-ELISpot). Le nombre de spots spécifiques correspondant à la production d'IFNγ par les cellules spécifiques de l'épitope DLM est obtenu en retranchant au nombre moyen de spots (moyenne des triplicatats) observés dans le puits où les cellules sont en présence de l'épitope DLM, le nombre moyen de spots du contrôle négatif (IL-2 seule). Les résultats sont rapportés à un million de cellules. Sont considérées comme positives les réponses excédant 40 spots spécifiques pour 106 cellules.
Etude de l'effet immunomodulateur des protéines Core et ARFP sur les cellules primaires
Transformation des monocytes en cellules dendritiques (mDC) : Les monocytes sont purifiés selon les techniques de l'art puis incubés pendant 6 jours en présence de GM-CSF (200 ng/ml) et d'interleukine 4 (200 ni/ml). L'état de maturation des DCmo est déterminé par l'analyse des marqueurs cellulaires en cytométrie en flux. Pour valider la transformation, les DC doivent présenter un phénotype CDIa positif, HLA-DR positif et CD 14 négatif. Les DC ne présentant pas les marqueurs de stimulation CD80, CD83 et CD86, sont qualifiées d'immatures (iDC). La maturation des DC est réalisée en les incubant avec du TNFα (200 ng/mL ; PreproTech) pendant 48h.
Transformation des monocytes en macrophages : Les monocytes sont purifiés puis incubés pendant 6 jours en présence de GM-CSF (10 ng/ml) et M-CSF (10 ng/ml). L'expression des marqueurs de surface cellulaire est analysée par cytométrie en flux. Pour valider la transformation, les macrophages doivent présenter un phénotype positif pour CD 1 a, CD 14, CD 11 c, et HLA-DR.
Protocole d'infection des DC et Macrophages : Les DC et les macrophages sont infectés par les adénovirus recombinants appropriés à une MOI (Multiplicity of Infection) de 500 pendant 48 heures. Ces conditions permettent d'infecter plus de 70% des cellules comme déterminé avec Padénovirus GFP en absence de lipofectamine.
Exemples
Les exemples suivants montrent :
1. Que les séquences Core ou C-E1-E2 sont capables d'exprimer une protéine ARFP +1 in vitro (cellules eucaryotes). C'est la première fois que ce fait est directement démontré en utilisant un anticorps anti-ARFP.
2. Qu'une séquence Core peut être modifiée afin d'exprimer avec succès une protéine Core sauvage sans expression d'ARFP (construction originale de CΔARFP).
3. Qu'il est possible d'attribuer des propriétés spécifiques et distinctes à Core, CΔARFP et ARFP par rapport à la modulation de l'expression de cytokines / chimiokines in vitro (en utilisant un système d'expression fondé sur un adénovirus). A savoir que :
- l'expression endogène de Core induit l'expression d'IL-8 ;
- l'expression endogène de CΔARFP induit une expression réduite d'IL-8 par rapport à Core et est dépourvue de la capacité à stimuler la production de MCP-I et MIP- lβ ;
- l'expression endogène d'ARFP induit des niveaux élevés d'IL-8, de MCP-I et de MIP-lβ.
Exemple 1 : expression d'ARFP dans le contexte des vecteurs codant pour Core ou CoreElE2 On montre qu'une ARFP (« alternative reading frame protein ») de 17 kDa est exprimée dans les cellules transfectées avec des plasmides codant soit pour His-Core soit pour His-CoreElE2. Cette protéine est très probablement produite à des niveaux très faibles puisque sa détection n'est possible par transfert de protéines (Western blot) qu'après purification des protéines marquées His sur colonnes Ni (voir figure 1).
Protocole : des Huh7 sont transfectées par pTG HisCElE2 ou pTG HisCore pendant 72 heures. Un inhibiteur de protéasome (MG132) est ajouté (A) ou non (B) dans le milieu de culture pendant les 6 dernières heures. Après séparation sur des billes magnétiques Ni et électrophorèse, on effectue un Western Blot en utilisant un anticorps monoclonal anti-ARFP (dilution 1/1000, 15E7F1 bioMérieux, obtenu à partir de souris immunisées par la protéine ΔF de génotype la (Komurian-Pradel et al., Hepatology, 40:900, 2004) ; l'épitope est totalement conservé entre le génotype la et Ib d' ARFP) et un anticorps anti-Core (dilution 1/40000, 19D9D6). On détecte à la fois Core avec l'étiquette His (21 kDa) et ARFP avec l'étiquette His (17 kDa) par Western Blot à partir de cellules transfectées par pTG His-Core ou pTG His-CE1E2. Les résultats sont représentatifs de quatre expériences indépendantes.
Les données présentées prouvent sans ambiguïté l'existence d'une ARFP codée par la séquence codant soit pour CoreElE2 soit pour Core. La protéine His-ARFP a un poids moléculaire apparent de 17 kDa et ne semble pas être sensible à la dégradation par le protéasome.
Exemple 2 : la protéine ARFP n'est pas détectée dans les lignées cellulaires infectées par Ad-Core ou Ad-CE1E2
Les lignées cellulaires Huh7 et THPl sont infectées avec les adénovirus recombinants codant pour β-Gal (témoin négatif), CE1E2, et le polypeptide de 101 acides aminés entre le codon 43 et le codon 144 du cadre de lecture +1 de Core (ARFP101). 72 heures après infection, on analyse les lysats cellulaires par Western Blot pour l'expression de Core et d'ARFP. A ce moment, plus de 80 % des cellules infectées par Ad-GFP sont positives pour la GFP. Comme attendu, et comme observé à la fois avec les extraits cellulaires de THP-I et Huh7, Core est détectée à la suite. de l'infection par Ad-CE1E2 et Ad-Core (Figures 2A et 2B). L'intensité de la bande spécifique de Core est bien plus importante dans les cellules infectées avec Ad-CE 1E2, ce qui reflète peut-être une stabilité plus élevée de la protéine Core dans ce contexte. De même, on détecte ARFP101 dans les cellules infectées par Ad-ARFP1Q1. Toutefois ce polypeptide n'est détecté que quand l'infection est effectuée en présence de l'inhibiteur de protéasome MG-132 (Figures 2A, B). Cependant, même en présence d'inhibiteur de protéasome, ARFP n'est pas détectée dans les cellules infectées par Ad-CE1E2 ou Ad- Core. Ces données suggèrent que si ARFP est exprimée par la séquence de génotype Ib de Core utilisée dans cette étude, la quantité de cette protéine doit être très faible et n'est pas détectable à moins que la protéine stabilisée par l'étiquette Histidine ne soit purifiée.
Puis on a analysé la localisation sub-cellulaire d'ARFP. Des cellules THP-I ont été infectées par les différents adénovirus et marquées avec un anticorps monoclonal spécifique anti-Core ou anti-ARFP. La protéine Core est facilement détectable dans les cellules infectées par Ad-CE1E2 ou -Core. Des structures de localisation subcellulaires en anneaux et en points sont observées (Figures 3B, C, flèches). Cependant, comme on peut s'y attendre à partir des résultats de Western blot, le marquage à l'anticorps anti- ARFP ne révèle pas de signal spécifique dans les cellules infectées par Ad-CE 1E2 ou - Core. Néanmoins une expression diffuse d'ARFP est observée lors de l'infection par Ad-ARFP101 (Figure 3A)
Exemple 3 : les chimiokines IL-8, MCP-I, et MlP-lβ sont produites par les cellules THP-I infectées avec un adénovirus codant pour Core, CE1E2 ou ARFP1Oi
On infecte des cellules TFJP-I avec Ad-Core, -CE1E2, -ARFP101, en parallèle avec Ad-βGal, comme témoin négatif, ou Ad-NS5a, comme témoin positif (Polyak et al, J. Virol, 75:60956106, 2001), en absence d'inhibiteur de protéasome (MG132) pendant 72 heures. Puis on lave les cellules et on les incube pendant encore 24 ou 48 heures dans du milieu de culture avant de prélever le surnageant.
Le criblage de facteurs solubles en utilisant des membranes Ray Biotech (membranes RayBio Human Cytokine Antibody Array III) ou des dosages Bio-Plex révèle que IL-8 (CXCL-8), MCP-I (CCL-2) et MEP-lβ (CCL-4) sont spécifiquement induits dans les cellules infectées par Ad-Core, -CE1E2 ou -ARFP101 en comparaison des cellules non infectées ou des cellules infectées avec Ad-βGal.
La figure 4 représente le résultat du criblage. Toutes les préparations adénovirales présentent des niveaux indédectables d'endotoxines. Seules deux cytokines sont détectées avec ce test : RANTES (CCL5) et IL-8 (CXCL-8). La production de RANTES n'est pas liée à l'expression antigénique du VHC car elle est observée dans les cellules infectées par tous les adénovirus. Au contraire, les cellules infectées par Ad- Core et -ARFP101 libèrent des niveaux plus élevés d'IL-8 que les cellules infectées par Ad-β-Gal ou par Ad-CE1E2.
Le tableau 1 suivant illustre une expérience dans laquelle les cellules THP-I sont infectés par Ad-βGal, -CE1E2, -Core et -ARFP101 pendant 72 heures, lavées et à nouveau incubées dans du milieu pendant encore 48 heures, puis analysées avec le panel 17-plex de cytokines humaines de Bioplex (concentrations exprimées en pg/ml ; n.d. = non déterminable, c'est à dire en dessous de la limite de détection).
Figure imgf000047_0001
On constate sur le tableau précédent que très peu de facteurs solubles sont produits par les cellules THP-I. Seules 3 chimiokines (IL-8 ou CXCL-8, MCP-I ou CCL-2, et MIP-I β ou CCL-4) sont sécrétées. Les niveaux sont faibles ou indétectables dans les cellules non-infectées par Ad-β-Gal. Quand les antigènes du VHC sont exprimés, les niveaux des 3 chimiokines sont accrus. Le niveau de MIP- lβ est équivalent avec Ad-CE1E2, -Core et -ARFP10I, niais pour IL-8 et MCP-I la tendance est à un niveau beaucoup plus élevé dans les cellules infectées par Ad-ARFP101 par rapport aux cellules infectées par Ad-Core, et dans les cellules infectées par Ad-Core par rapport aux cellules infectées par Ad-CE 1E2.
Ces données ont été confirmées en utilisant des kits ELISA spécifiques pour IL-8, MCP-I (BD Biosciences) et MIP-I β (R&D Systems). Alors que l'expression endogène d'ARFP est responsable sans ambiguïté de la sécrétion de chimiokines dans les cellules infectées par Ad-ARFP101, la contribution relative de Core et ARFP à la libération de chimiokines dans les cellules infectées par Ad-Core ou -CE1E2 est plus délicate. Cette question est à l'origine des exemples expérimentaux qui suivent.
Exemple 4 : Construction d'un adénovirus codant pour Core et dépiété vis à vis de l'expression d'ARFP
On a construit un adénovirus recombinant contenant une séquence Core modifiée (CΔARFP) de telle sorte que la protéine Core est exprimée normalement mais que toute protéine éventuellement issue d'un événement de glissement du cadre de lecture ou d'initiation interne est évitée (Ad-CΔARFP). La séquence correspondante est représentée par SEQ ID NO : 22.
Afin de vérifier l'absence de protéine traduite à partir d'un cadre de lecture alternatif, une séquence codant pour la GFP est insérée en aval de la séquence CΔARFP dans les cadres de lecture 0, +1 ou +2. Les plasmides correspondants sont transfectés dans des cellules Huh7 et l'expression de GFP est évaluée par cytométrie de flux (FACScalibur, BD Biosciences). Un événement de glissement du cadre de lecture ou d'initiation interne dans un cadre de lecture alternatif est donc visualisé par l'expression de la GFP dans les cellules transfectées par ies constructions correspondantes. Comme on le voit sur la figure 5, la GFP est seulement exprimée lorsqu'elle est insérée dans le cadre de lecture de la séquence codant pour Core (45 % de cellules positives), mais pas quand elle est insérée dans le cadre de lecture +1 ou +2 (0,04 et 0,01 % de cellules positives) de la séquence CΔARFP. Au contraire, quand la GFP est insérée en aval de la séquence codant pour Core de type sauvage dans le cadre de lecture +1, 1,2 % des cellules sont positives pour la GFP, ce qui confirme que dans ce contexte le glissement de cadre de lecture est rare mais réel.
Ces données démontrent qu'aucune protéine de cadre de lecture alternatif n'est produite dans les cellules transfectées par la séquence CΔARFP. De plus, les niveaux de protéine Core dans les cellules infectées par Ad-CΔARFP sont dans la gamme de ceux détectés dans les cellules infectées par Ad-Core ou -CE 12 (figure 6).
Exemple 5 : Absence d'induction de MlP-lβ ou de MCP-I dans les cellules THP-I infectées par Ad-CΔARFP ; l'expression d'ARFP et de Core participe à l'induction de la sécrétion d'IL-8 dans les cellules infectées par Ad-Core ou - CE1E2
On infecte des cellules THP-I en parallèle avec Ad-Core, -CE1E2, -ARFPioi et - CΔARFP pendant 72 heures, on les lave et on les incube dans du milieu pendant encore 24 ou 48 heures avant le prélèvement du surnageant. On mesure la sécrétion de MCP-I et MIP- lβ par ELISA. Comme cela est représenté à la figure 7, des quantités basales des deux chimiokines sont produits soit par les cellules non-infectées soit par les cellules THP-I infectées par Ad-βGal (allant de 50 à 500 pg/ml pour MCP-I et 150 à 500 pg/ml pour MIP-I β à 24 ou 48 heures). Comme précédemment observé, l'infection des cellules THP-I par Ad-ARFP101 stimule de manière significative la production de chimiokine MCP-I et MlP-lβ à 24 et 48 heures. Les niveaux de ces deux chimiokines sont également accrus dans les cellules infectées par Ad-Core ou -CE1E2. Mais quand les cellules sont infectées par Ad-CΔARFP, la sécrétion à la fois de MCP-I et de MIP- lβ est abolie, atteignant des niveaux comparables à ceux des cellules THP-I non- infectées ou infectées par Ad-βGal.
Etant donné qu'ARFP n'est pas produite dans les cellules infectées par Ad- CΔARFP, ces données démontrent clairement que l'expression d'ARFP et non celle de Core est responsable de l'induction de la libération de MCP-I et de MIP-I β dans les cellules infectées par Ad-Core ou -CE1E2.
La sécrétion d'IL-8 est également mesurée dans les surnageants de cellules THP- 1 infectées par Ad-Core, -CE1E2, -ARFP101 et -CΔARFP. Comme cela a été montré pour MCP-I et MlP-lβ, la sécrétion d'IL-8 est fortement accrue dans les cellules infectées par Ad-C, -CE1E2, -ARFP101 par rapport à des cellules non-infectées ou infectées par Ad-βGal (figure 7). Néanmoins, quand des cellules THP-I sont infectées par Ad-CΔARFP, bien que les niveaux d'IL-8 soient plus faibles par rapport aux cellules infectées par Ad-Core, -CE1E2 ou -ARFP101, ils demeurent plus élevés que les niveaux produits par les cellules non-infectées ou infectées par Ad-βGal. Ces données suggèrent fortement que, à la différence de la sécrétion de MCP-I et de MIP-I β qui dépend entièrement de l'expression endogène d'ARFP, les deux protéines Core et ARFP sont impliquées dans la stimulation de la libération d'IL-8 par les cellules THP-I infectées par Ad-Core ou -CE1E2.
Exemple 6 : la protéine Core exogène (mais non le polypeptide ARFP101) potentialise la production d'IL-8 et de MCP-I dans les cellules infectées par Ad- Core, -CE1E2 ou -ARFP101
On sait que les patients ayant une infection chronique par le VHC présentent une activation pro-inflammatoire accrue et que les protéines Core et NS3 déclenchent la production de cytokines pro-inflammatoirés dans les monocytes (Dolganiuc et al., J. Immunol, 170, 5615-5624, 2003 ; Dolagniuc et al, Gastroenterology, Ul, 1513-1524, 2004). Ici on montre que Core induit d'une façon dépendant de la dose la production de MCP-I, IL-8 et MlP-lβ avec un niveau maximal de MCP-I et MlP-lβ trouvé à 7 heures après l'incubation (respectivement 997 et 152 pg/ml, Figure 8A). La protéine ARFP101 n'induit pas de production de chimiokines. Cette induction de chimiokines par la protéine Core est causée par l'intermédiaire de l'interaction Core-TLR-2 et induit rapidement la phosphorylation de P38MAPK et P42-P44MAPK.
Afin d'étudier l'effet de la protéine Core sur les monocoytes infectés par les différents adénovirus, on infecte des cellules THP-I pendant 72 heures et on les incube avec de la Core exogène pendant 48 heures. Comme on le voit sur la figure 8B, les niveaux de MCP-I et IL-8 produits par les cellules infectées par l'adénovirus témoin sont plus élevés que par les cellules non-infectées, ce qui suggère une implication de la protéine adénovirale dans la potentialisation de la sécrétion de chimiokine induite par la protéine Core exogène (1462 et 1054 pg/ml pour IL-8 et MCP-I respectivement). Les cellules infectées par Ad-CE1E2, -Core et -ARFP101 et incubées avec de la protéine Core exogène produisent une quantité de IL-8 et de MCP-I trois fois plus élevée que les cellules infectées par le témoin adénovirus et incubées avec Core. Les cellules infectées avec Ad-CΔARFP et incubées avec de la Core exogène produisent des niveaux d'IL-8 comparables aux cellules infectées par Ad-CE1E2 et incubées avec de la Core exogène, tandis que le niveau de MCP-I est plus faible et. comparable aux cellules infectées avec le témoin adénovirus et incubées avec la Core exogène.
Finalement ces résultats prouvent que la production de MIP-I β, de MCP-I et d'IL-8 par la Core exogène est causée par l'intermédiaire de l'interaction Core-TLR-2 et que la Core exogène potentialise la production de MCP-I et d'IL-8 induite par l'expression endogène d'ARFP ou d'ARFP et de Core respectivement. Exemple 7 : Mise en évidence de Pimmunogénicité de Ia protéine Core chez la souris
L'immunogénicité de la protéine Core issue de la séquence CΔARFP mutée selon l'invention a été étudiée dans un modèle de souris transgéniques pour la molécule HLA- A2 et comparée à celle conférée par la protéine Core sauvage. Comme décrit dans la partie expérimentale, les souris transgéniques HLA-A2 sont immunisées par deux injections intramusculaires du plasmide gWiz C206ΔARFP selon l'invention ou du plasmide gWiz portant la séquence codant pour la protéine Core sauvage (gWiz C206) OU encore du plasmide gWiz non recombinant à titre de témoin négatif. Quinze jours après la seconde injection, la réponse cellulaire T-induite est analysée par CTL et ELISPOT en utilisant comme cible l'épitope DLM contenu dans la protéine Core.
Les résultats des tests CTL illustrés dans la Figure 9A montrent que le polypeptide Core codé par le plasmide gWiz C206ΔARFP induit une réponse CTL d'un niveau équivalent à la réponse induite par la protéine Core sauvage produite à partir du plasmide gWiz C206. On peut également noter une réponse CTL dans les 3 animaux injectés avec le plasmide gWiz C206ΔARFP alors que seuls deux animaux sur les trois testés répondent à l'injection du plasmide gWiz C206. Comme attendu, la réponse CTL relevée suite à l'injection du plasmide non recombinant gWiz est très faible.
Les résultats des tests- ELISPOT illustrés dans la Figure 9B confirment le bon pouvoir immunogène du polypeptide Core codé par le plasmide gWiz C206ΔARFP. En effet, on observe que le plasmide gWiz C206ΔARFP induit une production significative d'IFNγ dans deux souris traitées sur trois tout comme gWiz C206.
Ainsi, la protéine issue de la séquence Core mutée de manière à abolir la production du polypeptide ARFP induit bien une réponse à médiation cellulaire spécifique de l'antigène exprimé au moins équivalente en intensité à celle conférée par la Core sauvage, comme illustré dans les Figures 9 A et 9B.
Exemple 8 : La trans-activation du promoteur IL-8 par la protéine CE1E2 ou la protéine Core nécessite la présence de la protéine ARFP.
Capacité de la protéine Core sauvage à trans-activer le promoteur à l'IL-8.
Il a été observé à l'exemple 5 que la sécrétion d'IL-8 est fortement accrue dans des ;ellules infectées par des constructions exprimant la protéine Core sauvage (Ad-Core, Ad- CE1E2) et la protéine ARFP (Ad-ARFP1Oi) par rapport à des cellules infectées par Ad- C206ΔARFP. On a donc cherché à comprendre par quel(s) mécanisme(s) les protéines Core et ARFP sont impliquées dans la stimulation de la sécrétion d'IL-8 et la capacité de ces protéines à trans-activer le promoteur à l'IL-8 a été évaluée. Pour se faire, on transfecte les cellules Huh-7 avec l'un des plasmides permettant l'expression des protéines VHC, le plasmide pIL-8-Luc dans lequel le gène rapporteur Photinus pyralis (Firefly) luciferase est placé sous le contrôle du promoteur IL-8 (Omata et al, 2005, J. Infect Dis., 192, 266-275) et enfin un plasmide codant pour la GFP (Green Fluorescent Protein) exprimée constitutivement qui permet de normaliser l'efficacité des transfections. Les plasmides VHC testés sont gWiz- Core191, gWiz-CElE2, gWiz- ARFP101 et gWiz-C191ΔARFP. Les cellules transfectées par le plasmide gWiz vide constituent le contrôle négatif. L'activité luciferase relative à chaque plasmide VHC est mesurée par luminométrie (Luminometer Turner Design, DL Ready) après lyse des cellules tri-transfectées.
Le pourcentage de cellules GFP positives est de 89 à 90% dans tous les cas indiquant un niveau de transfection similaire des cellules indépendant des plasmides transfectés. L'activité luciferase dans les cellules Huh7 co-exprimaήt la protéine CE1E2 ou Core sauvage est 5 fois supérieure à celle obtenue dans les cellules contrôles. Une augmentation notable de l'activité luciferase par rapport au contrôle est également observée dans les cellules transfectées avec le plasmide gWiz-ARFP101. A l'inverse, l'expression de la protéine Core issue de la séquence mutée C191ΔARFP n'a pratiquement pas d'effet sur l'activité luciferase.
Ces données indiquent que la protéine Core sauvage produite par les constructions CE1E2 et Core exerce une action trans-activatrice sur le promoteur à l'IL-8 dans les cellules hépatocytaires Huh-7. Par contre, la protéine Core issue de la séquence C191ΔARFP (mutée de manière à abolir l'expression de la protéine ARFP) a perdu cette capacité trans-activatrice malgré le fait que sa séquence primaire soit identique à la Core sauvage. Il semble donc que l'effet trans-activateur de la protéine Core sauvage sur le promoteur IL-8 soit dépendant de l'expression naturelle de la protéine ARFP.
Complémentation entre CΔARFP et ARFP10I
L'implication respective des protéines Core et ARFP sur la transactivation du promoteur à PIL-8 a été étudiée par co-transfection des cellules hépatocytaires Huh-7 avec un plasmide d'expression VHC et le plasmide rapporteur pIL-8-Luc comme précédemment mais en présence de dose croissante de plasmide g WiZ-ARFP1O1 (0,1,. 0,3 et 0,5 μg). L'expression des protéines du VHC produites par les différentes constructions est confirmée par Western blot et les différentes transfections sont normalisées par l'expression de Pactine. Les résultats sont illustrés à la Figure 10. Comme attendu, la transfection du plasmide gWiz vide n'a aucun effet sur l'activité luciférase contrôlée par le promoteur IL-8 (colonne 1). Comme montré ci-dessus, l'expression de la Core sauvage permettant l'expression naturelle de ARPP (gWiz-Core191) induit la trans- activation du promoteur IL-8 (colonne 2) alors que l'expression de la Core issue de la séquence CΔARFP mutée n'a pas cet effet (colonne 3). Cependant l'absence d'effet trans- activateur de la protéine Core issue de g WiZ-C191A ARFP n'est pas compensée ou complémentée par l'addition du plasmide ARFP101 même à la dose la plus élevée, le niveau d'activité luciférase étant similaire à celui observé avec la construction gWiz-C191ΔARFP seule (colonnes 4, 5 et 6). Il est à noter que la bande correspondante à la protéine ARFP1O1 détectée par Western blot est nettement moins intense dans ce contexte de co-transfection. Par contre, la trans-activation du promoteur IL-8 par la protéine ARFP101 dans les Huh-7 est dose dépendante, l'activité luciférase augmentant avec la quantité de plasmide gWiz-ARFP101 introduit dans les cellules (colonnes 7, 8 et 9). Ces données suggèrent que la protéine Core issue de la séquence mutée C191ΔARFP exerce un effet dominant sur la protéine ARFP.
La protéine Core issue de la séquence CdARFP diminue la détection d'ARFPlOl sans modifier la détection de NS3 et de NS5b
Les expériences de co-transfection décrites ci-dessus ont mis en évidence que la protéine Core issue de la séquence mutée C191ΔARFP diminue l'expression de la protéine ARFP. On a donc recherché si cet effet délétère s'exerce également sur l'expression des autres protéines du VHC, comme par exemple les protéines non structurales NS3, NS4 et/ou NS 5B. Pour se faire, les cellules Huh-7 ont été co-transfectées d'une part avec le plasmide gWiz-Core191 exprimant la Core sauvage ou gWiz-C191ΔARFP exprimant la Core mutée et d'autre part avec le plasmide codant pour ARFP101 (gWiz-ARFP101) ou un plasmide exprimant une protéine de fusion NS3-NS4 ou encore un plasmide exprimant la protéine NS5b. L'expression des protéines virales est déterminée par Western blot à l'aide des anticorps correspondants (anticorps anti-ARFP, anti-Core, anti-NS3 et anti-NS5B).
Comme précédemment observé, l'expression de la protéine capsidaire est d'un niveau comparable que les cellules soient transfectées par le plasmide gWiz-Core191 ou gWiz- C191ΔARFP . L'effet délétère de la protéine Core mutée sur la protéine ARFP observé ci- dessus est confirmé. En effet, la production de la protéine ARFP101 est considérablement réduite dans les cellules co-transfectées par les plasmides gWiz-C191ΔARFP et gWiz-ARFP101 par rapport à la quantité d' ARFP1O1 produite dans les cellules co-transfectées avec les plasmides gWiz-Core191 et gWiz-ARFP101. A l'inverse la production des protéines non structurales NS3 etNS5b n'est pas affectée par la co-transfection avec gWiz-C191ΔARFP. Ainsi, l'incapacité à trans-activer le promoteur IL-8 par la protéine issue de la séquence Core mutée selon l'invention ne peut être complémentée en trans par la protéine ARFP101. Cependant, les mécanismes mis en place restent obscurs et pourraient être liés par exemple à une dégradation accrue de la protéine ARFP101, une traduction ralentie, une transcription inhibée ou ralentie et/ou une dégradation des ARNm.
Exemple 9 : Effet immunomodulateur des protéines Core et ARFP sur les cellules dendritiques (DC) et les macrophages.
On a recherché si l'effet immunomodulateur des protéines Core et ARFP du VHC observé précédemment dans la lignée monocytaire THP-I, pouvait être confirmé dans des cellules primaires, cellules dendritiques (DC) et macrophages dérivés de monocytes.
Effet immunomodulateur dans les cellules dendritiques immatures (iDC)
On a infecté des iDC à une MOI de 500 avec les différents vecteurs adénoviraux recombinants (Ad) décrits ci-dessus, codant pour la β-galactosidase (Ad-β-Gal) à titre de contrôle, CoreElE2 (Ad-CE 1E2), la protéine Core sauvage (Ad-Core), le polypeptide ARFP1O1 (Ad-ARFP101) et la protéine Core mutée de manière à ne pas exprimer ARFP (Ad- C191ΔARFP). 48 heures après l'infection, les cellules sont lysées et le lysat est soumis à une analyse par Western Blot en utilisant l'anticorps monoclonal anti-Core.
Comme attendu, la séquence C191ΔARFP code pour une protéine présentant une masse moléculaire identique à la protéine Core sauvage codée par Ad-CE1E2 ou Ad-Core. Cependant, comme observé précédemment dans la lignée THP-I, on détecte une quantité plus importante de protéine Core dans les DC infectées par Ad-CE 1E2 que dans les cellules infectées par Ad-Core. On peut noter que la quantité de Core détectée après infection des DC par le vecteur Ad-C191ΔARFP est équivalente à celle produite après infection par Ad-CE1E2.
Les marqueurs de surface ont également été analysés par cytométrie de flux, 48 heures après l'infection adénovirale. Dans tous les cas, les cellules présentent un phénotype positif pour les marqueurs CDIa, HLA-DR et CD40 et un phénotype négatif pour les marqueurs CD80, CD83 et CD86. Ainsi, les marqueurs de surface détectés sont typiques d'une cellule dendritique immature que les iDC soient infectées par les constructions adénovirales exprimant les protéines du VHC (Ad CE1E2, Ad-Core, Ad-ARFP101 et Ad- C191ΔARFP), par le vecteur contrôle Ad-β-Gal ou encore non infectées.
En parallèle, les facteurs solubles libérés dans les surnageants de culture des iDC infectées sont dosés en utilisant le kit de cytokines bioplex-17 (Biorad). Les quantités d'IL- Ib, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12p70, IL-13 et IL-17 libérées par les cellules infectées par les différentes constructions adénovirales exprimant les protéines du VHC sont inférieures au seuil de détection de l'appareil (<7pg/ml) tout comme dans les contrôles négatifs iDC infectées par Ad-β-Gal et iDC non infectées. Le Tableau 2 suivant montre les résultats des dosages d'IL-6, d'IL-8, de MCP-I et de MCP-Ib dans les surnageants de culture des iDC infectées par les constructions adénovirales VHC par rapport au niveau détecté pour chacune des cytokines dans les iDC infectées dans les mêmes conditions par le vecteur Ad-β-Gal (= représente un niveau de cytokine identique à celui déterminé pour le contrôle négatif et x N représente un niveau de cytokine N fois supérieur à celui déterminé pour le contrôle négatif) .
Figure imgf000055_0001
On observe donc que l'infection des iDC par l'Ad-CElE2 stimule la production d'IL-6, d'IL-8, de MCP-I et de MIP-Ib d'un facteur 2,4 à 7 selon la cytokine, par rapport aux niveaux détectés après infection par l'adénovirus contrôle Ad-β-Gal. Lorsque la protéine Core sauvage est produite dans les iDC (infection Ad-Core), seules les quantités d'IL-6 et MIP-Ib sont accrues mais à un niveau moindre qu'avec Ad-CE1E2. Contrairement à ce qui a été observé dans la lignée monocytaire THP-I (Exemple 3), la quantité de cytokines produite par les iDC infectées par l'adénovirus exprimant le polypeptide ARFP101 ne diffère pas de celle produite par les cellules contrôles infectées par Ad-β-Gal. De même, l'infection des iDC par Ad-C191ΔARFP ne révèle aucun effet stimulateur sur la production de cytokines (niveaux comparables à ceux déterminés pour les cellules contrôles). Ainsi, la production des cytokines IL-6, IL-8, MCP-I et MIP-Ib serait dépendante de l'expression naturelle de la protéine ARFP à partir de la Corë sauvage.
Effet immunomodulateur dans les cellules dendritiques (mDC)
Les mDC sont infectées avec les différents vecteurs adénoviraux recombinants pendant 48 heures puis incubées pendant 48 heures supplémentaires avec du TNFα (25 ng/mL). L'expression des marqueurs de surface cellulaire CD80, CD83 et CD86 est analysée par cytométrie en flux et les concentrations de cytokines libérées sont dosées en utilisant le kit de cytokines bioplex-17 (Biorad).
Les résultats illustrent qu'aucune modification phénotypique n'est associée à l'infection par les constructions adénovirales et à l'expression des polypeptides VHC. En effet, le pourcentage de cellules positives et l'intensité de fluorescence sont du même ordre de grandeur entre cellules infectées par les adénovirus Ad-CE1E2, Ad-Core, Ad-ARFP101 et Ad- C191ΔARFP, Padénovirus contrôle Ad-β-Gal et les cellules non infectées.
Comme dans le cas des iDC, les quantités d'IL-lb, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12p70, IL- 13 et IL- 17 libérées des cellules infectées par les différentes constructions adénovirales sont inférieures au seuil de détection de l'appareil (<7pg/ml) tout comme dans les mDC non infectées. Par contre, l'expression des antigènes du VHC dans les mDC ne modifie pas le profil de production des cytokines. En effet, les quantités de IFNγ, TNFα, G-CSF, MCP-I et MIP-Ib libérées dans les surnageants de culture après infection des adénovirus VHC Ad- CE1E2, Ad-Core, Ad-ARFP101 et Ad- C191ΔARFP sont identiques aux quantités produites par les cellules contrôles infectées par Ad-β-Gal.
Effet immunomodulateur dans les macrophages
Les macrophages sont obtenus à partir de monocytes comme décrit dans la partie expérimentale et infectés à une MOI 500 avec les différentes constructions adénovirales. 48 heures après l'infection, l'expression des marqueurs CDl Ic, CD14 et CD40 est analysée par cytométrie en flux et l'expression des protéines du VHC et les concentrations de cytokines libérées sont évaluées dans les surnageants de culture.
Les résultats de Western Blot confirment l'expression d'une protéine ayant la masse moléculaire attendue pour la protéine Core dans les surnageants de macrophages infectés par Ad-CE1E2, Ad-Core et Ad- C191ΔARFP . Comme dans le cas des iDC et de la lignée THP-I, on détecte une quantité plus importante de protéine Core produite dans les lysats infectés avec Ad-CE1E2 et Ad-C191ΔARFP qu'avec Ad-Core.
L'infection adénovirale et l'expression des protéines VHC ne modifient pas l'expression des antigènes de surface CDlIc, CD 14 et CD40, le profil d'expression étant similaire dans les macrophages infectés par les adénovirus VHC Ad-CE 1E2, Ad-Core, Ad-ARFPi01 et Ad- C191ΔARFP et dans les macrophages contrôles non infectés ou infectés par Ad-β-Gal.
Pour ce qui est du dosage des facteurs solubles libérés, comme cela a été observé avec les [Dc et mDC, les quantités d'IL-lb, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12p70, IL- 13 et IL- 17 ibérées des cellules infectées par les différentes constructions adénovirales sont inférieures au seuil de détection de l'appareil (<7pg/ml). Le Tableau 3 suivant montre les résultats des dosages d'IL-6, d'IL-8, de MCP-I et de MCP-Ib dans les surnageants de culture des macrophages infectés par les constructions adénovirales VHC par rapport au niveau détecté pour chacune des cytokines dans les surnageants de culture des macrophages contrôles nfectés dans les mêmes conditions par Ad-β-Gal (= représente un niveau de cytokine dentique à celui déterminé pour le contrôle Ad-β-Gal et x N représente un niveau de cytokine N fois supérieur à celui déterminé pour le contrôle) .
Figure imgf000057_0001
Comme dans le cas des DC, les macrophages infectés par de l'adénovirus synthétisent de 'IL-6, IL-8, MCP-I et MIP-Ib. Mais les niveaux d'IL-6, d'IL-8 et surtout de MIP-Ib sont )lus élevés dans les macrophages qui produisent de la protéine Core sauvage ou ARFP101 infectés par Ad-CE1E2, Ad-Core ou Ad-ARFP101). A l'inverse, la production de cytokines l'est pas affectée par l'expression de la protéine Core mutée (Ad-C191ΔARFP), les taux de ytokines étant identiques à ceux détectés dans les cellules contrôles. Ces résultats démontrent [ue la stimulation de la production d'IL-6, d'IL-8 et de MIP-Ib dans les macrophages infectés par les constructions Ad-CE1E2, Ad-Core produisant la protéine Core sauvage est dépendante le l'expression naturelle du polypeptide ARFP.
Effet immunomodulateur dans les macrophages activés
Comme précédemment, les macrophages sont infectés par les différentes constructions dénovirales puis incubés en présence de 200 ng/mL de TNFα pendant 48 heures upplémentaires et on évalue les facteurs solubles libérés dans les surnageants de culture. Les îacrophages activés infectés par de l'adénovirus synthétisent de l'IL-6, IL-10, IFNγ/TNFα et MIlP-lb. Si l'expression des protéines VHC ne modifie pas la production d'IL-6, TFNγ/TNFα et de MIP-Ib, à l'inverse on observe une nette diminution de la production d'IL-10 dans les macrophages activés infectés par Ad-CE1E2 (niveaux 3 fois inférieurs à ceux produits dans les cellules contrôles infectées par Ad-β-Gal), Ad-Core (réduction d'un facteur 3,8) ou Ad-ARFP101 (réduction d'un facteur 4,6). Par contre, l'infection des macrophages activés par Ad- C191ΔARFP ne procure pas cet effet immunomodulateur sur la production d'IL-10 (niveaux équivalents à ceux produits par les macrophages infectés par Ad- β-Gal), ce qui confirme le rôle de l'expression naturelle du polypeptide ARFP à partir de la séquence Core sauvage.
La présente invention met à la disposition du public une séquence codant pour une protéine Core ayant une séquence en acides aminés identique à la protéine Core sauvage produite par le virus VHC mais dont la séquence en- nucléotides a été modifiée de telle sorte qu'aucun polypeptide ne puisse être généré par initiation interne ou décalage de phase de lecture +1 et +2. La séquence Core mutée selon l'invention présente des propriétés immunomodulatrices très différentes de celles conférées par la séquence Core sauvage codée par le virus VHC. En particulier, la protéine Core issue de la séquence mutée n'est plus capable de stimuler la production des chimiokines MCP-I et MIP-Ib et réduit notamment la production d'IL-8 dans la lignée monocytaire THP-I (Exemple 5) ainsi que dans les cellules présentatrices d'antigènes cellules dendritiques et macrophages (Exemple 9). La réduction d'IL-8 peut être expliquée par une incapacité ou au moins une réduction de la capacité de cette séquence Core mutée à trans-activer le promoteur à l'IL~8 contrairement à la séquence Core sauvage (Exemple 8). De plus, la séquence mutée selon l'invention code pour une protéine Core qui reste immunogène et induit une réponse à médiation cellulaire spécifique (Exemple 7).
La séquence Core mutée selon l'invention présente entre autres l'avantage de coder pour une protéine Core ayant la même séquence en acides aminés que la Core sauvage mais qui n'induit pas ou peu la production de cytokines proinflammatoires (IL-6, IL-8, MCP-I et/ou MIP-Ib). Ainsi, une composition vaccinale comprenant la séquence nucléotidique selon l'invention ou son produit d'expression présente l'avantage de réduire la pathogénicité potentielle associée à la protéine Core sauvage sans altérer son immunogénicité.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée, cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou un fragment de la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2 du virus de l'hépatite C, ladite séquence nucléotidique mutée étant telle qu'elle code dans un cadre de lecture 0 pour la susdite protéine, mais qu'elle ne permet pas l'expression d'une protéine ARFP ou de fragments d'une protéine ARFP de plus de 11 acides aminés, codés dans le cadre de lecture +1 par la susdite séquence nucléotidique non mutée, pour la préparation d'un vaccin ou d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des infections liées au virus de l'hépatite C.
2. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 1, cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, de souches de génotype la, Ib, 2, 3, 4, 5 ou 6 du virus de l'hépatite C.
3. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 1 ou 2, cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine Ë2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, de souches de génotype la ou Ib du virus de l'hépatite C.
4. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 3, cette séquence mutée étant dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core et un fragment de la protéine El, représentée par la séquence générale du génotype la (SEQ ID NO : 1) ou par la séquence consensus du génotype la (SEQ ID NO : 23) ou par la séquence générale du génotype Ib (SEQ ID NO : 2) ou par la séquence consensus du génotype Ib (SEQ ID NO : 24) ou par une séquence présentant plus de 90 % d'homologie avec l'une de ces séquences, ou par la séquence consensus du génotype 2 (SEQ ID NO : 3) ou par la séquence consensus du génotype 3 (SEQ ID NO : 4) ou par la séquence consensus du génotype 4 (SEQ ID NO : 5) ou par la séquence consensus du génotype 5 (SEQ ID NO : 6) ou par la séquence consensus du génotype 6 (SEQ ID NO : 7) ou par une séquence présentant plus de 70 % d'homologie avec l'une de ces séquences.
5. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 4, présentant une ou plusieurs mutations par rapport à la séquence nucléotidique d'origine codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core du virus de l'hépatite C.
6. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle la ou les mutations correspondent à l'introduction d'un ou plusieurs codons STOP dans le cadre de lecture +1 de la séquence nucléotidique d'origine.
7. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 6, présentant une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la restauration d'un ou de plusieurs codons synonymes dans le cadre de lecture O.
8. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 7, présentant une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la modification de la structure secondaire de l'ARN transcrit correspondant à ladite séquence nucléotidique mutée et / ou à l'optimisation de la traduction dudit ARN transcrit.
9. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 8, cette séquence mutée étant dérivée par mutation de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8 de la souche J de génotype Ib du virus de l'hépatite C, codant pour la protéine Core.
10. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 8, cette séquence mutée étant dérivée par mutation de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 9 de la souche J de génotype Ib du virus de l'hépatite C, codant pour la protéine Core et le peptide signal El.
11. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 8, cette séquence mutée étant dérivée par mutation de la séquence nucléotidique de la souche J de génotype Ib du virus de l'hépatite C représentée par SEQ ID NO : 10, codant pour la protéine Core et un fragment de El ou par SEQ ID NO : 11, codant pour la protéine Core et la protéine El ou par SEQ ID NO : 12, codant pour la protéine Core, la protéine El et la protéine E2.
12. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 9 à 11, présentant un ensemble de mutations portant sur l'un des triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 ou 293-295, ledit ensemble de mutations consistant en la substitution de 1 , 2 ou 3 nucléotides du triplet de nucléotides susmentionné, introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO : 13 ou SEQ ID NO : 14 ou SEQ ID NO : 15.
13. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 9 à 11, présentant deux ensembles de mutations portant respectivement sur deux triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant deux codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée' par SEQ ID NO : 16 ou SEQ ID NO : 17 ou SEQ ID NO : 18.
14. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 9 à 11, présentant trois ensembles de mutations portant respectivement sur les trois triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant trois codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO : 19.
15. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 9, présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377- 379, 398-400, 464-466, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
16. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 10, présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377- 379, 398-400, 464-466, 545-547, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
17. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon la revendication 11, présentant au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des trois triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et au moins un ensemble de mutations portant sur l'un au moins des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608- 610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
18. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 9, présentant
7 ensembles de mutations portant respectivement sur les 7 triplets de nucléotides n°65- 67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 7 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
19. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 10, présentant
8 ensembles de mutations portant respectivement sur les 8 triplets de nucléotides n°65- 67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant
' pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
20. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 11, présentant 11 ensembles de mutations portant respectivement sur les 11 triplets de nucléotides n°65- 67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 11 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être la séquence SEQ ID NO : 20.
21. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée . selon l'une des revendications 9, 12 à 15 ou 18, comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-l l, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174- 176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393- 395, 444-446, 516-518, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
22. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 10, 12 à 14, 16 ou 19, comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-l l, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174- 176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393- 395, 444-446, 516-518, 567-569, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
23. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 11, 12 à 14, 17 ou 20, comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-l l, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174- 176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393- 395, 444-446, 516-518, 567-569, 576-578, 612-614, 615-617, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être la séquence SEQ ID NO : 21 ou la séquence SEQ ID NO : 22.
24. Utilisation d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 1 à 23, codant dans son cadre de lecture 0 pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou par un fragment de la protéine Core, la séquence protéique de ladite protéine Core ou dudit fragment de la protéine Core ne présentant pas de mutation par rapport à la séquence protéique de la protéine Core normale ou du fragment correspondant de la protéine Core normale.
25. Séquence nucléotidique présentant une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique codant pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core ou un fragment de la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2 d'une souche du virus de l'hépatite C, permettant l'expression par une cellule vivante de la protéine Core et ne permettant pas l'expression par une cellule vivante d'une protéine ARFP ou d'un fragment de protéine ARFP de plus de 11 acides aminés.
26. Séquence nucléotidique selon la revendication 25 présentant une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique de souche de génotype la, Ib, 2, 3, 4, 5 ou 6 du virus de l'hépatite C, codant dans le cadre de lecture 0 pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, et ne codant pas pour une protéine ARFP ou pour un fragment de protéine ARPP de plus de 11 acides aminés dans le cadre de lecture +1.
27. Séquence nucléotidique selon la revendication 25 ou 26 présentant une ou plusieurs mutations par rapport à une séquence nucléotidique de souche de génotype la ou Ib du virus de l'hépatite C, codant dans le cadre de lecture 0 pour une protéine comprenant ou constituée par la protéine Core, et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un ou des fragments de la protéine El et / ou de la protéine E2, et ne codant pas pour une protéine ARFP ou pour un fragment de protéine ARFP de plus de 11 acides aminés dans le cadre de lecture +1.
28. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 27, dans laquelle un ou plusieurs codons STOP sont présents dans ledit cadre de lecture +1.
29. Séquence nucléotidique selon la revendication 28, présentant une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la restauration d'un ou de plusieurs codons synonymes dans le cadre de lecture 0.
30. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 29, présentant une ou plusieurs mutations supplémentaires correspondant à la modification' de la structure secondaire de l'ARN transcrit correspondant à ladite séquence nucléotidique mutée et / ou à l'optimisation de la traduction dudit ARN transcrit.
31. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 30 présentant un ensemble de mutations portant sur l'un des triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 ou 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, ledit ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO : 13 ou SEQ ID NO : 14 ou SEQ ID NO : 15.
32. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 30 présentant deux ensembles de mutations portant respectivement sur deux triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou 1 SEQ ID NO : 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant deux codons STOP respectifs dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO : 16 ou SEQ ID NO : 17 ou SEQ ID NO : 18.
33. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 30 présentant trois ensembles de mutations portant respectivement sur les trois triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant trois codons STOP respectifs dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture O, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant être notamment représentée par SEQ ID NO : 19.
34. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 33 présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398- 400, 464-466, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
35. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 33 présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398- 400, 464-466, 545-547, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
36. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 33 présentant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°65-67, 137-139 et 293-295, et un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs des triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°365-367, 377-379, 398- 400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant au moins un codon STOP supplémentaire dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant'pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
37. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 34, présentant 7 ensembles de mutations portant respectivement sur les 7 triplets de nucléotides n°65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
38. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 33 ou 35, présentant 8 ensembles de mutations portant respectivement sur les 8 triplets de nucléotides n°65-67, 137-139, 293-295, 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 8 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
39. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 33 ou 36, présentant 11 ensembles de mutations portant respectivement sur les 11 triplets de nucléotides n°65-67, 137-139, 293-295,' 365-367, 377-379, 398-400, 464-466, 545-547, 581-583, 590-592, 608-610 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés, introduisant 11 codons STOP dans le cadre de lecture +1 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être représentée par SEQ ID NO : 20.
40. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 31 à 34 ou 37, comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-ll, 33- 35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309- 311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 8, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
41. Séquence nucléotidique mutée selon l'une des revendications 31 à 32, 35 ou 38, comportant en outre un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-l 1, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309-311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 9, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0.
42. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 31 à 33, 36 ou 39, comportant un ou plusieurs ensembles de mutations portant respectivement sur un ou plusieurs triplets de nucléotides choisis parmi les triplets de nucléotides n°9-l l, 33-35, 45-47, 48-50, 114-116, 126-128, 156-158, 174-176, 213-215, 264-266, 300-302, 309- 311, 330-332, 336-338, 348-350, 369-371, 393-395, 444-446, 516-518, 567-569, 576- 578, 612-614, 615-617 par rapport à la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 12, chaque ensemble de mutations consistant en la substitution de 1, 2 ou 3 nucléotides de l'un des triplets susmentionnés introduisant un codon STOP dans le cadre de lecture +2 et n'introduisant pas de codon STOP dans le cadre de lecture 0, ladite séquence nucléotidique mutée pouvant notamment être représentée par SEQ ID NO : 21 ou SEQ ID NO : 22.
43. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 42, dans laquelle la séquence protéique de la protéine Core ou du fragment de la protéine Core codée par la séquence nucléotidique ne présente pas de mutation par rapport à la séquence protéique de la protéine Core normale ou du fragment correspondant de la protéine Core normale.
44. Vecteur d'expression contenant l'une des séquences nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 43.
45. Vecteur d'expression selon la revendication 44 contenant les éléments de contrôle de l'expression.
46. Hôte cellulaire transformé ou transfecté par un vecteur d'expression selon la revendication 45.
47. Composition pharmaceutique comprenant la séquence nucléotidique de l'une des revendications 25 à 43, ou un vecteur d'expression selon la revendication 44 ou 45, ou un hôte cellulaire transformé ou transfecté selon la revendication 46, en tant que substance active, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
48. Extrait et / ou surnageant cellulaire provenant d'une culture de cellules transfectées par une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 43 ou un vecteur d'expression selon la revendication 44 ou 45, contenant, avant toute étape éventuelle de récupération des protéines, une protéine contenant la protéine Core ou un fragment de la protéine Core et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine El et / ou de la protéine E2, mais ne contenant pas de protéine ARFP ou de fragment de protéine ARFP de plus de 11 acides aminés.
49. Extrait de sérum ou de plasma d'un hôte, notamment humain ou animal, transfecté par une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 25 à 43 ou un vecteur d'expression selon la revendication 44 ou 45, contenant, avant toute étape éventuelle de récupération des protéines, une protéine contenant la protéine Core ou un fragment de la protéine Core et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine El et / ou de la protéine E2, mais ne contenant pas de protéine ARFP ou de fragment de la protéine ARFP de plus de 11 acides aminés.
50. Procédé de préparation d'une protéine contenant la protéine Core ou un fragment de la protéine Core et le cas échéant la protéine El et / ou la protéine E2 du virus de l'hépatite C et / ou un fragment de la protéine El et / ou de la protéine E2, mais ne contenant pas de protéine ARFP ou de fragment de protéine ARFP de plus de 11 acides aminés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de transformation de cellules hôtes appropriées avec un vecteur d'expression selon la revendication 44 ou 45, la mise en culture des cellules ainsi transformées, et la récupération, et le cas échéant la purification de la protéine susmentionnée.
51. Méthode de diagnostic in vitro, ou de pronostic, de pathologies liées à une infection par le virus de l'hépatite C, chez l'homme ou l'animal, comprenant :
- la mise en présence d'une protéine obtenue selon le procédé de la revendication 50, ou d'un anticorps préparé à partir de la protéine obtenue selon le procédé de la revendication 50, avec un échantillon biologique prélevé chez un sujet présentant ou susceptible de présenter une infection par le virus de l'hépatite C, la détection respectivement d'anticorps contre la protéine Core du virus de l'hépatite C éventuellement présents dans ledit échantillon biologique ou de protéines Core éventuellement présentes dans ledit échantillon biologique.
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