JPS5852228A - Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原の抗原性を示す生産物およびこれら抗原の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 Ｂ型肝炎りイルス書抗原の抗原性を示すポリペプチド、
これらポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列、これらポ
リペプチドに対する抗体。

ならびにこれらポリペプチド、抗体およびＤＮＡ配列の
製造および使用方法につき開示する。本発明のポリペプ
チドおよび抗体はｓ　”ｘｉｉ肝炎クイりス感染保菌者
の検出用組成物および方法に。

或いはＨＢＶ関連の慢性かつ活性の肝臓病の経過ｔ−評
価する際に使用する仁とを特徴とする。

本発明は、　Ｂ１１１肝炎ウイルスｅ抗原（「田ｈムｇ
」の抗原性を示す生産物およびその製造方法ｆＣ＠する
ものである。より詳細には１本発＠社、Ｂ履肝炎つィル
ス核抗原（ｒＨＢｃＡｇＪ　）の抗原性を示すポリペプ
チドからの、ま九はＨＢｅＡｇの抗原性を示すポリペプ
チドを暗号化するＤＮＡ配列で形質転換された宿主から
のＨＢ・ムｇの抗原性を示すポリペプチドおよびその製
造に関する、ものである。以下の記載から判るように。

ＨＢ＠Ａｇの抗原性を示すポリペプチド轄、過去もしく
Ｆｉ飄在のＢ型肝炎ウィルス（「ＨＢＶＪ）感染を検出
するのに使用することができ、特にＨＢＶ感染保藺者を
検出し或いはｎｎｖ関連の慢性かつ活性の肝臓病の経過
を評価するのに価値がある。

Ｂａｔ肝炎ウィルス（すナワちＨ”　ｖ）ａ、ｍめて高
割合でヒトに感染する。アメリカ合衆国の人口の／！慢
が感染されておＬ成るアフリカおよびアジア諸国におい
ては成人人口のコ。

−以上が伝染性の慢性ａＢｖ保菌者であｊ）、１０）４
以上が感染していると推定される。

ＨＢＶ感染は３種の１般的メカニズムによって伝染され
る：（１）感染血液もしくは体液を多量（たとえば輸血
）に或い鉱少量（九とえは遇発的表皮膚刺傷）で１ｉ！
種することにょる吃の、Ｑ）近！ｌまたは性接触による
もの、および（ｊ）妊娠中に母親がウィルスを子供に伝
染させる感染によるものである。

殆んどのＨＢＶ感染は準臨床的であシ、準臨床的および
臨床的感染からの回復は一般に完全である。しかしなが
ら、成る場合に社重症の長期症状が生ずる＝（１）約ｊ
％の急性ＨＢＶ感染は慢性ＨＢＶＩ＆染をも九らし、′
！＃王者に対する感染性訃よび重症の肝臓衰弱病に対す
る恒久的漕在保菌者となり、ｔた（コ））ＩＢＭによる
過去の感染“は部分的にまたは全体的に閃光性肝炎、肝
硬変および一次肝臓癌の発生の原因となシうる。

たとえば、−次肝臓癌の通常の発生率１ｉ／２ｉｏｏ、
ｏｏｏであるが、慢性ＨＢＶ患者についてはこの癌の発
生率Ｆｉ／　！　３００である。

ＨＢＶの広範囲にわたる発生は、その発病力および慢性
もしくＦｉ致死的肝臓病との関連性と共に、極めて重大
な臨床問題を構成する。次の場合、絶えず危険が伴カう
：（ｌ）血液透析もしくは腎臓透析を受ける憂慮患者、
および収容患者。

−）その家族、および（Ｊ）全ての健康な専門職（％に
看護婦、外科医および歯医者）。し友がって。

感染性ＨＢＶの保菌者を容易かつ正確に同定しかつ治療
することが特に重要である。

ＨＢＶ感染の保菌者の同定は、従来、ウィルスの性質お
よびその感染軽重の絢看の良め１難であった。感染性保
菌者はしばしば感染の徴候を示さず、正規の医療検査で
は同定することができない。生ウィルスの直接的分析は
、ウィルスが培養細胞において精々極めて僅かしか繁殖
せず、かつｔ７’ｈ小実験動物には感染しないという事
冥によ夕妨げられる。しかしながら、　１ｉＢＶ感染は
ウィルスの／Ｓである蛋白質（抗原とも云う）に対する
抗体の発生をもたらす。したがって、これら抗原〔Ｂ型
肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）。

Ｂｇ肝炎核抗原（ｋｉＢｍＡｇ　）、Ｂ型肝炎ウィルス
・抗原（ＨＢｅＡｇ　））ま次はその抗体の存在を検出
するための分析法が開発されている。

残念乍ら、血液中のＨＢ−ムｇもしくは１１ＢａＡＨに
対する抗体の存在は過去のＨＢＶ感染のみを示し、必ら
ずしもＨＢＶ感染性に対する現在の潜在力を示さない、
規程かの抗原、Ｂ型肝炎りイルス・抗原またはＨＢ・ム
ｇの群に実際になｐうる第三のＨＩｉＶｆｉ原〔マグニ
クスおよびエスプマーク、Ｊ、Ｉｍｍｕｍｏｌ、、　ｊ
Ｉ／　０２巻、第１０／７〜１０２１頁（７Ｐ７−ｚ）
）も、この種の分析法において、よル有用にな夛うる。

多くの臨床的証明は現在次のことを示唆している！（１
）ｍ液中のＨＢ＠ムｇの存在社伝染性ＨＢＶ感染の決足
的指標であり％（Ｊ）　ＨＢ　＠ムｇｏ存在は潜在的な
１ｉＢＹ関連肝臓病の特定経過を示し、シ危がって仁の
病気の診断および治療に役立ち、（Ｊ）ＨＢ・ムｇに対
する抗体の存在はＨＩＩＶ関連肝臓病に対する好適な診
断の指標となる。

潜在的な１ｉＢＶ感染性を正確に示しかつ肝臓病の経過
を予測する分析法ＫＨＢ・ムｇを便用する際の間ａｒｔ
、有用な量のＨＢ・ムｇｔた扛その抗体を廉価かつ効率
的に製造また線精製するのが従来不可能であったことで
ある。上記し友ように、ＨＢｖは組織培養において精々
極めて僅かしか増殖せず、かつ小実験哺乳動物には感染
し力い。し九がって、これらウィルス抗原を得るための
慣用手段は、充分量のＭＢ・ムｇ′ｔ−＃造かつ単離す
るには効果的でない。さらに、この種のＩｌＩ整物は一
般に多量のＨＢｏＡｇで汚象されてい゛る九め、これら
からの抗体の良造扛ＨＢａ人ｇとＨＢ−ムｇとに対する
抗体の混合物をもたらす。

したがって、この種の抗原と抗体との混合ｖＩＪ扛種々
の分析においてＨＢ　ｏ含有試料とＨＢ・含有試料との
間の相違を有効に区別することがで龜ず、それ故こ０＠
の分析１ｊＨＢ＠ムｇの存在を明確に検出することがで
龜ない、したがって。

これら分析［ＨＢＶの感染性保菌者の検出に有効でない
。

組換ＤＮム技術における最近の進歩は、　ＨＢｓムｇ用
の遺伝子およびＨＢｏムｇ用の遺伝子をクローン化させ
て、これら蛋白質生産物を細菌中で合成することを可能
にした〔バレル勢、ネイチャー誌、第２７Ｐ巻、凧１３
〜１７頁（ｌり７？）；パセク等、ネイチャー誌、第１
１２頁％　＃１１７１〜ｊ７り買（／Ｐ７り）逼ニドｉ
ン等、ネイチャー誌、＃！−タ／巻、纂１０１〜１０４
頁（ｌり”’）ＩＬしたがって、この種の技術は精製Ｂ
朧肝炎りイルス・抗原、すなわちＨＢ−ムｇの血清学的
変種を示すポリペプチドを製造する手段を提供しうるで
あろうことが示唆される〔たとえ＃ｉ、エドマン等、上
記参照〕。

残念乍ら、　ＨＢｏＡｇを暗号化するＨＢＶ　ＤＮム配
列は同定されていない。たとえば、　ＨＢｏＡｇはＨＢ
ＶのＤＮムポリメツーゼ＃素（ジエー・エル・メルニツ
ク勢＆　　ｒＢａ＋肝炎ウィルスの抑制方法」、ジャー
ナル・イン７エクデヤス・ディシーズ、第１１３巻、纂
コ／θ〜λｌ！頁（／９７４）〕。

ＩｇＧの遺伝ｔＪｃニー・アール・二ニー２スおよびエ
ヌ・ストリック、ｒｉｍ肝炎に対する血清指標の宿主特
異性富ウィルス・抗原が免疫グロブリンの性質を有する
証ｆＪ＃Ｊ　、　Ｐｔｏｔｓ、　Ｎａ１ｌ。

Ａａａｄ、　８ａｉ、　Ｕ８ム＠　ｇ７４’Ｌ　ＭＩＸ
／７０−２〜／７０４頁（／り７７））＆　　小蓋ペプ
チドに関連するＩｇＧの二量体〔エッチ・ニーΦフイー
ルズＬ　　ｒＢ型肝炎ウィルス・抗原のＮ製および部分
特性（ｔＪ。

イン７エクデヤス・アンド・イミユニティ−２馬、２０
巻、第７２λ〜ＩＯＪ頁（／り７ｒ））、乳酸デヒドロ
ゲナーゼイソ酵素ＡＩに関連するもの〔ジー・エヌ・バ
イアス等、「Ｂ型肝炎ウィルス・抗原工乳鐵デヒドロゲ
ナーゼイソ＃素ム！との明白な関連性Ｊ、サイエンス誌
ｓｌ／＋ｔｏｉ巻。

第１０４１〜１０７０頁（／Ｐ７７））ｍまた鉱ゾーン
粒子および管状朧の表面に対する抗原指標〔二５．−２
ス勢、（／り７６）〕に対し種々関与している。したが
って、組換ＤＮム技４Ｉｔ使用してＨＢ・ムｇを生産す
ること社従来不可能であった。

さらに、ＨＢｏＡｇ扛、血清から精１ｌｉ５れたＨＢＶ
核粒子から〔タカハシ等、Ｊ、　Ｉｍｍｗｎｏｌ、、第
ｉｉ’ｉ巻、第１０２〜ｉｏｚ員（ｌり７６）〕　ま良
拡肝臓から精製された同様な粒子から〔プドコウスカ等
、Ｊ、１ｍｍ％１１１ｏ１０、餓／、２Ｊ巻、第１４ｃ
１ｊ　〜１１１１４頁（ｌり７り）ｓ　　ｉｉシザｙ勢
、　　Ｊ、。

Ｑ＠ａ、Ｖｉｙｏｌ、　、第４！−２４１，第１／Ｊ〜
ｚｉｐ頁（／２７り）〕、グロナーゼでの処理〔プドコ
クスカ等〕、グロナーゼとコーメルカブトエタノールと
での処理〔タカハシ等〕もしくはドデシル硫酸ナトリウ
ムと２−メルカプトエタノールとでの処理〔ブドコウス
カ等、タカハシ等、Ｗシザワ勢〕により、或いは超音波
での破壊によりおよびＣｍＣ１中でのケオトロビック剤
（ｅｂａｏｔｒｏｐｉａ　ａｇ＠ｎロンでの処理もしく
は遠心分−〔エッチ・オホリ等＊　　ｒ［ｍ肝炎核粒子
の分解によるＨＢａＡｇからＨＢｅＡｇへの抗原変換」
、インターバイロロジーｓ　ＪＲ”　＊ｓ第７参〜ｔコ
）（（／り１０））によって遊離されることも報告され
ている。しかしながら、これらの方法は、得られる生産
物がＭＢＣとＨＢ・抗原との混合物であるため、ＨＢｓ
ＡｇＯ大規模生産には適していない。さらに、これらの
報告Ｆｉ。

ｋｉＢｍＡｇがＨＢｃＡｇから誘導含れるかどうか。

或いはＨＢ・ムｇがＩｉ　Ｂ　ｅ　Ａ　ｇとは異なる蛋
白質であるかどうかを示唆しておらず、しかもこれらが
ウィルス蛋白質の内部に纏め込まれていてＨＢａＡｇの
遊離にはＨＢｓＡｇの蛋白質分解が必畳なのかまたは遇
発的であるのかについて示唆していない。したがって、
これらの報告は、ＨＢｅＡｇおよびその抗体を効果的な
分析法に使用する困難性、またはＨＢｅＡｇの生産に対
する組換ＤＮム技術の使用を訪けていた問題を解決しな
い。さ名に、ＨＢａＡｇがＨＢｏＡｇ遺伝子の部分によ
夕或いは児全に分離された遺伝子によｐ暗号化されるか
どうか未知の１１である。したがって１組換ＤＮＡ技術
１ｄ、、ＨＢａムｇの生産には一般に使用されていない
。

本発明は、ＨＢｅＡｇの決是的供給源としてＨＢｅＡｇ
を同定することによシ、かつＨＢｏＡｇとＨＢｓＡｇと
の関係（ＨＢａＡｇは解離条件下での蛋白質分解により
ＨＢ＠Ａｇに変換させることができる）に基づき、ＨＢ
ｅＡｇおよびこれら抗原に対する抗体を多量かつ効果的
に住産しうる方法を提供することにより、上記の諸問題
を解決する。或いは、高度に一緒された実質的に純粋な
ＨＢｓＡｇの抽出物は、蛋白質分解なしに、解離条件下
で遍元剤の存在下にＩｉＢ・ムｇＫ変換することもでき
る。したがって１本発明により。

今回、ｉｉＢ・ムｇおよびその抗体ｔ−％ＨＢＶＪ１染
保菌者の同定に使用するため、およびＨＢＶ関連肝臓病
の経過を決定し、したがってこの病気に対する治療法を
見出す際の診断用として、相当の量でしか４非汚染状態
で得ることが初めて可能になった。

以下の記載から判るように５本発明の方法は。

ＢＪＩＪ肝炎ウ肝炎ウィル原核抗原性を示すポリペプチ
ドの発現を％黴とする宿主の細菌抽出物ｔｌＩＩ製し、
この抽出物を還元剤の存在下で還元剤耐性のプロテアー
ゼによシ消化させる仁とによシ、ＨＢａＡｇからのＨＢ
ａＡｇの製造を可能にする。或いは、より象厚かつ純粋
な細Ｉｒ抽出物を用いて、ＨＢａＡｇから）ｉＢｅλｇ
への変換を解離条件下で還元剤により行なう仁とがで龜
る。これら社、さらに、ＨＢ＋ｅＡｇを暗号化するＤＮ
ム配列の適轟な宿主中での発現によすｌｉＢ・ムＩｉＯ
製造を可能にする。

これらの方法によｐ製造されるＨＢ働Ａｇは。

合成されたままで或いは適尚に誘導体化もしくは改変さ
せた後に、ヒト血清中のＨＢ・ムｇに対する抗体を検出
するための、或いは潜在的に感染性のＨＢ８保菌者の血
清もしくは肝臓におけるＨＢ・ムｇの検出に使用される
これらＨＢａＡｇに対する抗体を製造する九めの組成物
および方法において有用である。　ＢＩＢ・ムｇ自身ま
たはそれらの改変物もしくは誘導体およびそれから生成
される抗体は、別々に１良は一緒にして、ＨＢＶ診断用
キットもしくは分析法に使用することができる。さらに
、抗原もしくはその抗体またはその両者は、下記のもの
の１種もしくは組合せ物と共に％ＨＢＶ診断用キットに
おいて、或いはＢ塵肝炎ウィルスに対するワクチンにお
いて有効に使用することもできる：　ＨＢａＡｇま九は
その改変物もしくは誘導体、およびＨＢｅＡｇに対する
抗体また線その改変物もしくは誘導体、ＨＢｓＡｇまた
はその改変物もしくは誘導体、或いはＨＢｓ人ｒｔたは
その改変物もしく扛誘導体に対する抗体。

本明細書に記載した本発明を一層嵐く運解す／るため、
以下詳細に説明する。

説明において次の用語を使用する： ポリペプチドＳ＠接するアミノ酸のα−７ｉノ基とカル
ボキシ基との間のペプチド結合により互いに接続され九
アミノ酸の１状系列。

蛋　白　質　：　約１０個もしくはそれ以上のアミノ酸
を有するポリペプチド。

抗　　　体　！　外来蛋白質の存在に呼応して動物によ
シ生成される蛋白質、抗体れ、外来蛋白質へ極めて強固
かつ％異的に結合する。

抗　　　原　ｔ　幾らかの部分が抗体に１９結合されう
るポリペプチド奄しく鉱量白質。

血　　　清　１　赤血球を除去した後に残留する血液（
０９分、これ社、特に抗体と抗原とを含有する。

ヌクレオチド；　糖部分（ペントース）と燐酸化合物と
含′ｉｊ１素複素穣式塩基とよルなるＤＮＡもしくｄｉ
ｌＬＮ人の単蓋体単位、塩基Ｆｉ、１グリコシド脚素（
ペントースのｌ′炭素）を介して棚部分く結合され、塩
基と糖との組合せがヌクレオチドである。

ＤＮＡ配列　：　隣接するペントースの３′炭素とｊ′
炭素との間のホスホジエステル結合によｐ互いに接続さ
れたヌクレオチドの線状系列。

遺　伝　子　Ｘ　特異性ポリペプチドもしく紘蛋白質に
特性的なアミノ酸の配列を、雛型を介して暗号化するＤ
ＮＡ配列。

発　　　３１１：　　ポリペプチドもしくは蛋白質を生
産するため遺伝子により行なわれる過程。

これ社、転写と翻訳との１合せである。

発現制御配列：　遺伝子に作用結合された際、これら遺
伝子の発現を制御かつ調整するＤＮＡ配列。

クローン化用ベヒクルもしくはプ２スンド：宿主動物中
でそれ自体複製しうるＤＮＡ配列であって、７個もしく
は少数のエンドヌクレアーゼ識別部位を特徴とし、これ
ら部位において前記ＤＮＡ配列をＤＮＡの本質的な生物
学的機能の付随的損失なしに決定可能に切断することが
でき、かつ形質転換の前ｔた紘後のいずれかに形質転換
菌体の内定に使用するのに適した標識、たとえばテトラ
サイクリン耐性ｔた祉アンピシリン耐性を有する。

組換ＤＮム分子寡　少なくともλつのヌクレオチド配列
からなる混成りＮム配列であって、第１の配列は性質上
路コの配りＵと一緒には通常見出されない。

除きシグマ争ケミカル社から購入し九８アガロース（ｉ
イルス・ラボットリース社）、エキソヌクレアーゼＢＡ
ＬＪ／（ペセスダ・リサーチ・２ボ２トリ一ス社）、ｒ
−Ｒ３２−７デノシン三燐酸（二ニー・イングランド・
ヌクレア社）。

ポリヌクレオチドキナーゼ（ペーリンガーーマンハイム
社）、ＥａｏＲＩおよびヱリｌにューインクランド・ビ
オラプス社）、Ｅ（ＩＯＲＩ　　ＤＮＡリンカ−（フラ
ボ２テイブ・リサーチ社）、セファデックスＧ−！０（
７アルマシア社）、およびリホゲル（ベルマン社、ホー
クスレーΦアンド・サン、２ンシング、ｔセックス）。

組換プラスミド：　適当な宿主中に形質転換させた際Ｈ
１ｉａムｇを暗号化する遺伝子を発現す’　　る７１ｘ
？）”ＰＨＢＶ−Ｒ１−／／ＩＩｉ次（Ｄように作成し
た。全ＨＢｏＡｇ遺伝子を暗号化するプラスミドｐＨＢ
Ｖ／ＪりＡ（エム・パセク等、ネイチャー誌、第コｌコ
巻、第ｊ７ｊ−１７２員。

（ｌり７り）〕、をジｓｔ　Ｉによｐ切断しうる断片上
に有する大腸菌（Ｊｃｏｌｉ　）Ｋ−／コ薗株ＨＢ１０
／の培養物／ｌをＯ，Ｄ、、。＝ｉ、ｏまで増殖させ、
そしてプラスミドをディー・フレフェルによ〕記載され
たように〔ジャーナル−バクテリオルジー、＠／１０巻
、　Ｎ４７７〜４７４頁（１２７λ）〕収穫菌体から単
離した。精製ｐＨＢＶ／ｊ２人６０μ９を、１０ｍＭの
トリ、ｃ　−ＨＣ／　（ＰＨ７，７Ｇ　）とｊ　ｗａ　
Ｍ　ＯＭｇＣｌ　ｚと／ｍＭのジチオスＬ／イトール（
ＤＴＴ）と１０ｍＭのＮａＣ１との中で３７℃にて！単
位の加１によシー晩消化させた。

消化したプラス建ドを製造用ｔチポリアクリルアミドゲ
ル上で電気泳動にかけ、ＨＢａＡｇ暗号化配列を含有す
る切断ＤＮム断片をニー・マキサムおよびダプリュ・ギ
ルバートの方法〔メソッド・エッチモロジー％ｊ１４７
巻、籐参デタ〜ｚｔｏ頁（／Ｐｒｏ））Ｋ！Ｊ）ＵＶ−
シャ）’　　（Ｌ＆よび溶出によってゲルから回収した
。単離ＤＮム断片の末端部を、０．４−のコＯａｓＭト
リス−ＨＣｊ（ＰＨｌ）とｌコｔｒ＊ＭＩｌ）ＣａＣ１
＊と／ＪｍＭのＭｌｉＣｌｌと６０　ｗｈ　Ｍ　ｑ）　
ＮａＣ１とｌｅａＭのエチｖンジアミンテトツ酢１１（
ＥＤＴム）との中でエキソヌクレアーゼＢＡＬＪ／によ
す消化させた０反応を勢容量のフェノールでの抽出によ
多停止させた。

Ｅａｏ　ＲＩもしく　ｕ　Ｈｉｎｄ　錫ｙンカー（それ
ぞれ制限酵素４狂ＲＩもし０１町す膳の識別部位を暗号
化する）Ｑ、−μｙｔ−，ニー・マキサムおよびダプリ
ュ・ギルバートの方法〔メソッド畷エンテモロジー、第
４ｊ巻、纂要り２〜Ｉ４０頁Ｃ／ｆ１０）〕によル、Ｊ
：／の比のアデノシフ三燐酸（ムＴＰ）とｒ　＋＋＋　
ｐ　ｈ　２−ムＴＰとの存在下でｉｏμｌ容量にてｌ単
位のポリヌクレオチドキナーゼにより燐酸化させた。

燐酸化しかつ標識したリンカ−ｔ−、λ０紅の結紮用緩
衝ｉ１（ｊＯｍＭのトリ、ｘ、−１１ＣＩ（ＰＩ′１７
．４）と１０ｍＭのＭｊ’ＣＺｇと／　ＯｍＭ（Ｄ　Ｄ
ＴＴとｊｍＭのＡＴＰ）　　中においてｌ単位のりガー
ゼによｔ）ＢＡＬｊ／−消化断片Ｏ，コμｌに対しｉｚ
℃にて１時間結集させた。上記と同様に７エノール抽出
によ）結集を停止させ、生成物をりＯμｌの緩衝液（１
０ｍＭのトリス−］Ｅｔｃノ（ｐＨ７，０と１０ｍＭの
ＮａＣ１とｊｍＭのＭｇＣ１，と／ａｉＭのＤＴＴと０
，１１％のトリトンＸ−１００）を添加しながらＩＯ年
単位ＥａｏＲＩもしく　ｉｊ　Ｈｉｎｄ　ｇ［（必要に
応じ）と７０単位のＢａｎ　ＨＩ　とによＦ）３７℃に
て一晩消化させた。

この試料を、２Ｎのセファデックスａ−ＳＯを介し１０
ｘｎＭのトリス＝　ＨＣＩ　（，４１）および／ｒａｍ
のＥＤＴ人とにおいて卓上臨床用遠心分離器で１分間遠
心分離した。　０．−２μｌｌ０ＰＥＸリリｉｚｏ、す
なわちクローン化遺伝子を発現するのに遥する上廿ＲＩ
もしくは坦閃層制限部位を有しかつエッチ・ワイハー（
ハイデルベルグ大学、博士論文（／りｔｏ））によル作
成されかつ上記ｐＨＢＶ／Ｊタムについて配転したと同
様に単一したクローン化用ベヒクルを、上記と同様にｉ
ｏμ２０叙１に液中でｌ単位のＥｏｏＲＩもしくは旦ｆ
ｄ（ｉとシミＭｌとにより消化させた。

次いで、上記で１４１！Ｉした断片を、ＪＯμｌの結集
緩衝液中においてｌ単位のりガーゼと共に室温でｖ時間
培養することによシ、りｐ−ン化ベヒクル中に挿入した
。

大腸菌に一／Ｊ株１１Ｂ１０／（エッチ・ボイヤーおよ
びディー・ロー２ンドーゾソー、Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、第ｊｉｐｓ第１！２〜／ｊＪ頁（／
り４り））ｔ−、エム・マンデルおよびニー・ヒガ、　
　Ｊ、Ｍｏｌ、　Ｂｔｏ１９Ｍｊ　Ｊ　ｊｌｌｌ、　ｊ
ｇ／　ｉｆ〜／４λ負（／９７０）〕によｐ記載きれた
ように、上記でｊｌｌｌ製し九組換フーシスンドにより
形質転換させた。形質転換体は、リッチ寒天板上におい
てｊＯμＩ／Ｍｌのアンピシリンに対する耐性にょシ選
択シ、ニス・プルームおよびダプリュ・ギルバートの方
法（Ｐｒｏａ、Ｎａ１ｌ、ムａｎｄ、　８ａｉ、（Ｕ８
ム）。

第７！巻、銀コ７ダｔ〜λ７ダタ頁（ｌり７１）〕にょ
）、シー・バレル勢の方法〔ネイチャー誌。

第２７り巻、ｇ≠３〜参１頁（ｌり７り）〕と同様にＨ
ＢａＡｇの発現につきスクリーニングした。

ＨＢａＡｇを発現する宿主の１種によｐ含有さｔＬｂｌ
ｉｉ換フ’）スｉ　）’（ｐＨＢＶ−Ｒ１−／／　、！
：名付けられ、ΔａｏＲＩリンカーを含有する）を。

ニー・マキサムおよびダプリュ・ギルバートの方法〔メ
ソッド・エッチモロジー＊　ｊｌ　’　ｚ　’Ｉｔｓ＠
参Ｙｆ　〜ｊ４０”Ｑ（／９１０））Ｋ！ｊｌ、ＨＢＶ
ＤＮムとｐｌｘ　ｌｅａ　／１０のβ−ガ２クトシダー
ゼ遺伝子との間の融合域にて配列決定した。

このヌクレオチド配列と対応アオノ駿配列とをＩＫ／Ｅ
に示す。ヌクレオチド配列は、β−ガ２クトシダーゼの
アミノ酸ｔがＥｏｏＲＩ　リンカ−により暗号化された
３個のアミノ酸によｊ）ＨＢａＡｇの７ンノ酸Ｊに融合
されることを示している。β−ガ２クトシダーゼとＨＢ
＠ムｇとの関に樵々の融合を有する他の１ラスミドも同
様に単離することができる。

抗　原！　　ＨＢｏＡｇの抗原性を示す生成物を次のよ
うに調製した０組換グ２スミドｐｌｉＢＶ−ＲＩ−／／
を有する大腸＠に一／コ株ｋｌｌ１１０／の培養物−ｊ
を０．Ｄ□。＝−／、０まで増殖させ、収穫しそしてｊ
ＯｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＪ（ｒ）とＪｊ−蔗糖４Ｍ
中に再懸濁した。Ｏ，コｊＭのトリス−ＨＣｊ（ｐＨ１
中にお妙るリゾチームＪａｙｌｎｌの／−を加え、この
混合物を氷上で５分間培養した。０．２１　ＭＣ）　Ｅ
ＤＴムＪ、ｊ−を加え、混合物をさらに１分間氷上で培
養しえ、ｌ−トリトンｘ−ｉｏｏとｏ、ｕ＠デオキシ胆
胆汁ナナトリウムｊＯｍＭ）すｘ−ＨＣＩ　（ｐｉ（ｊ
　）と４．２１　ｍＭ　ＥＤＴ＾とを含有する溶液１０
ａｌとを加え、混合物を再び氷上にて１０分間時々振と
うしながら培養した。最後に、Ｏ，、ＪｊＭ）リス−Ｍ
ｃｔ（ｙｒ＞中の／１１４の／　Ｍ　ＭＩＩＣＩ意とＯ
，コ一のｌＯダ／−膵臓ＤＮアーゼとを加え次。混合物
ｔＪ７℃にて１時間培髪し、８８−３１０−タを備える
ツルバール遠心分離器において１０，０００ｒｐａａに
てｉｏ分間遠心分離した硫酸アンモニウムを加え（飽和
ｆ、ｔｊ％）、沈殿物を１０，０００ｔｐｍにてｉｏ分
間達心分離して集めた。次いで、沈殿物を１０ｍＭのト
リス−ＨＣＩ　（−ｌ）緩衝液中にｈ溶解させ、この緩
衝液に対して透析した。得られた溶液は、ＨＢａＡｇの
抗原性を示す細菌合成されたポリペプチドを含有する。

これらの細菌抽出物は約／％のＨＢａＡｇを含有すると
推定される。さらに、慣用の蛋白質ｎ灸技術を使用する
精製は、ＨＢｏＡｇのよ〕鎖厚な溶液、すなわち約１．
０％純度の製造を可能にする。これら抽出物のＨＢａム
ｇ関連ポリペプチドの７ミノ末端の７ζノ麿ｖ畑管纂１
図に示す。

標準ＨＢ　ｅ　Ａ　ｇを、ビー・コーヘンおよヒワイ・
コサルトに載されたように（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａ４
ｂ。

１ｇＪＯ巻、第７０９〜７／Ｊｊｊ（１５Ｆ７７））、
持続性ＨＢａＡｇ保菌者の剖検体肝臓から抽出した。

血　清言　標準ＨＢａムｇだけに対する抗体および標準
ＨＢｏＡｇと標準ＨＢ＠Ａｇとの両者に対する抗体を含
有する血清、ならびに標準ＨＢ・ムｇを含有する血清は
、エジンパ２大学におけるヘパｆス・す７エレンス・２
ボラトリーにより供給された。この血清を、リホグルで
の処理によりゲル拡散で３倍に鍛縮した。

実施例１ ＨＢｅＡｇ（純度約／チ）の抗原性を示す細菌合成され
たポリペプチドを含有する上記のように調製した上澄液
の１部をプロナーゼ中で０．／チにし、或いはプロナー
ゼおよび０．／チコーメルカブトエタノール中Ｏ４ｌ優
にし１次いで３７℃にて２時間培養した。各試料の１部
を、オーチターロニイの免疫拡散技術〔オー・オーテタ
１−ロニイ、プログレス・インｅアレルギー、ピーｅカ
ロスおよび７〜ル・ワクスマン（編）、カーガー、ニュ
ーヨーク、Ｍｊ巻、ＩＩＸ／〜７を頁（／９１１）　）
によ５ＨＢａＡｇもしくはＨＢａＡｇの抗原性を示すポ
リペプチドの存在につき試験した。４２図は、０，１Ｍ
バルビトン緩衝液（ｐｉ−１１，６）中にｏ、ｒ　ｑｂ
アガロースとｏ、ｉｇｋｋ、ＤＴムとを含有するペトリ
皿の写真である。このベトリ皿は直径ｊａｍかつ間隔、
２閣の数個の穴部を有する。上記の血清コ！μｌまたは
上記のように調製した細菌抽出物の上澄液−２ｊμｌを
穴部中に次のように充填し７ｊｓ抗−ｊｉＢｏＡｇのみ
に対し陽性のヒト血清（穴部１％コ、ダおよびｊ）。

プロナーゼ処理なしのＨＢｃＡｇを含有する細菌抽出物
（穴部Ｊ）、０，１％のコーメルカブトエタノール中で
０．／　＊プロナーゼにより３７℃にてコダ時間処理し
た後のＨｊａｏＡｇを含有する細菌抽出物（穴ｓ６）、
抗−ＭＢａＡｇおよびＨＢａＡｇに対し陽性のヒト血清
（穴ｍ１．および抗−ＨＢｅＡｇと抗−ＨＢａＡｇ・と
の両者に対し陽性のヒト血清（穴８１）。次いで、充填
板を参℃にて！日間培養し、　ｏ、１−ＮａＣｊで充分
に洗浄し、ｌｊ−メタノール−ｊチ酢酸−ＪＪｓ水の混
合物における０、／％クーマシー・プリリ７ント青色素
にて室温で参時間染色し１次いで同じ溶剤中で室温にて
一晩脱色した。最後に、染色板を撮影し良。

培養期間の際、各試料中の蛋白質はアガａ　−ス中に拡
散する。抗原とそれ自身の抗体とが互いに拡散すればい
つでも、これらは結合しかつ沈殿し、そして色票はこれ
ら抗原−抗体の鎖体により形成されたプレシビチン線の
肉眼化を可能にする。本発明の方法により消化しなかっ
た抽出物はＨＢ・ムｇ反応性を示さながっ九、シかしな
がら、第２図が示すように、プロナーゼおよびコーメル
カブトエタノールによる細菌抽出物の処理は、ＨＢｅＡ
ｇを含有する血清（穴部７）とＨＢｅＡｇに対する抗体
（穴部ｌ）との間にプレシビチン線を有する免疫学的性
質を示す抗原％異性（穴部ｔとｔとの間のルシビチン！
りを与え、これは穴部１．１と穴部７．Ｉとの間の線の
連続性により示される。しかしながら。

プロナーゼのみでの処理は、細菌抽出物の核抗原活性に
対し効果を示さなかった。さらに、８Ｄ８のみ、８Ｄ８
＋４−メルカブトエタノールま友は０．１ｑｂグロナー
イと０゜ｌＬｓコーメルカブトエタノールとによるｌチ
細菌抽出物の処理は、免疫拡散に１９測定して、抽出物
の核抗原もしくは・抗原の活性の全部を完全に破壊した
。

同様な結果が、肝蔵抽出物の処理についても鎌察された
。

本　よル高度に濃縮した細菌抽出物（たとえば約４０９
１のＨＢｅＡｇを含有するもの）を用いて、ＨＢｏＡｇ
からＨＢｅＡｇへの変換を８ＤＢ＋−一メルカブトエタ
ノールの存在下で行うことができる〔実施例コ〕。

上記の実施例（抽出物ｌチを用いる）は、ＨＢｏＡｇを
ＨＢｅＡｇに変換するためコーメルヵ７’）エタノール
の存在下でプロナーゼを使用スるが１本発明の方法のこ
の具体例によるＨＢａＡｇからＡＢ＠ムｇへの変換は他
の還元剤（九とえばジチオスレイトール、ジチオエリス
リトール。

チオグリコレート、クルタチオンをよび硼水素化す）　
ＩＪウム）の存在下で他の還元剤耐性クロテアー−ｖＣ
ｆＬとえばズブチリシン、パパイン、キモパパイン、プ
ロメリン、トリプシン、テルモリシン、グロテアーゼに
、カルボキシベプチダーゼムもしくはカルポベプチダー
Ｊｋ！Ｂ）によシ達成することもできることを理解すべ
きである。さらに、本発明の方法のこの具体例において
有用なこの種のグロテアーゼと還元剤との相対的量は１
本明細書中に記載した方法を用いて当業者によシ決定さ
れうろことを理解すべきである。

本発明の方法の友の具体例によるＨＢａＡｇからＨＢ・
ムｇへの変換はＨＢ＠Ａｇ凝集物の解きほぐしと解離と
の他に蛋白質分解消化を含むと思われるが、この変換は
このような変化の程度を規定しない。さらに、この変換
は１本発明の方法の代替具体例（よシ高度に濃縮された
細菌抽出物、１１元剤、解離条件）によっても行なわれ
る〔実施例コ〕。し九がって、この理論に拘束されるも
のでないが１本発明の方法は、それぞれがＨＢ＠Ａｇ反
応性を示すような分解生成物の集団を生成させうると思
われる。これら先底物は、　）ｉＢｅムｇの種々な血清
学的変種となシうる。

本発明の方法は、　ＨＢａＡｇ遺伝子を発現するプラス
ミドを有する細菌もしくはその他の適当な宿主から或い
鉱車液中にＨＢａＡｇを有する患者の肝臓から得られた
ＨＩ３　ａ　Ａｇを、還元剤耐性グロテアーゼ、好まし
くはプロナーゼと還元剤。

好ましくはコーメルカブトエタノールとで処理すれば、
或いはより高度に濃縮された出発物質を用いて還元剤お
よび解離条件の存在下で処理すれば、ＨＢｃＡｇがＨＢ
ｅＡｇへ変換することを示している。さらに、ＨＢｅＡ
ｇｉｊ、別個の遺伝子により暗号化される別個の蛋白質
として存在するのでな（ＨＢｃＡｇから得られることも
示している。何故なら、ＨＢｅＡｇを発現する宿主が有
するＤＮＡ断片はｌ（ＢｏＡｇ遺伝子のみを含有するか
らである。したがって、ＨＢｏＡｇの抗原性を示すポリ
ペプチドを暗号化する遺伝子を発現するようなプラスミ
ドを有する宿主を多量に培養することができ、抽出物を
上記のように処理してＨＢ＠Ａｇ抗原性を示すポリペプ
チドを廉価かつ効率的に製造することができる。

本発明の方法において有用であるためには。

ＨＢｏＡｇの抗原性を示すポリペ１チドがＨＢ＠ムｇの
ｌｓのみ、ＨＢｅＡｇの全部ｔたは他の蛋白質に融合さ
れた若干のもしくｉｔ全全部ＨＢｏＡｇを含有するかど
うかに関係なく、唯一の必要なことは、実施例／の方法
による抽出物のＩＩ＆場がＨＢｓＡｇ抗原性を示すポリ
ペプチドを生産するのに充分な量でＨＢｏＡｇが存在す
ることでちゃ。

ここでＨＢ・ムｇＦｉＨＢＶ感染保菌者の迅速かつ効果
的な同定およびＨＢＶ関連肝臓病の経過の予ｍを可能に
するという重要な医療上の利点を有する。たとえば、Ｈ
ＢｏＡｇのＣ末端における最初の２個のアミノ酸とＨＢ
ｏＡｇｃ）Ｎ末端における最初の２個のアミノ酸とは１
本発明の方法によシこれらポリペプチドからのＨＢｅ’
ＡＨの製造に影響することなく除去されている。

実施例コ 実施例／で使用した上澄液の部分を、それら、が約ｔｏ
ｑｂのＨＢａＡｇを含有するよう慣用の手段および方法
によって精絢した。次いで、これら部分を約／％ＳＤＢ
となしそして１０ｍＭの２−メルカブトエタノールを加
えた。３７℃にて２時間培養すると、この部分に存在す
る＃１ぼ全部のＨＢａＡｇはＨＢ・ムｇに変換された。

実施例３ ＨＢ・ＡｇがＨＢａＡｇから得られること鉱、実施例／
およびコから簡単である。したがって。

ＨＢｓ＋ＡｇからＨＢ・ムｇへの変換の必要性は。

ＨＩＩｏＡｇを暗号化する遺伝享を改変させてＨＢａＡ
ｇを暗号化するＤＮム配列を生成させることにょ多回避
することができる。これは、両遺伝子に共通でないＨＢ
ａムｇ遺伝子からそれらの暗号化配列を除去して達成す
ることができる。これは。

たとえば、非共通の来電ヌクレオチドをエキソヌクレア
ーゼＢＡＬｊ／で消化除去して行なうことができる。或
いは、ＨＢａＡｇの抗原性を示すポリペプチドをｌｌＦ
号化する配列を備えた制限断片を、ＨＢｏＡｇＱ号化配
列から切除することもできるであろう。新たに単離され
九ＨＢ・ムｇ暗号化配列（これもＨＢｅＡｇの血清学豹
変′ｉに対応するこの種の配列の実際上の集団である）
を次いでクローン化用ベヒクル中に挿入し、かつ発現制
御配列へ作用結合させる。実施例／に詳記したと同様に
、この種の挿入の一方法祉。

新たに調製されたＨＢ・Ａｇ遺伝子を発現プラスミドｐ
ｌＡｘ　ｌａａ　／１０中に挿入することである。

この作成は、適当な宿主中において、ＨＢ＠Ａｇ抗原性
を示すポリペプチドに結合された少数の細菌性アミノ酸
を含有し九融合蛋白質の合成を可能にする。かくして、
本発明の方法により作成された。新たに調製されたＨＢ
ｅＡｇ遺祖子を含有するｐＥｘ　ｌａａ　／　１０によ
り或いはその他任意のプラスミドにより形質転換され九
宿主を多量かつ容易に培養して、ＨＢｅＡｇ゛抗原性を
示すポリペ１チドを廉価か２効率的に直接製造すること
ができる。

実″施例１におけると同様１本発明の方法により製造さ
れるポリペプチドはＨＢ＠Ａぎの１部のみ、　ＨＢｅＡ
ｇの全部或いは他の蛋白質に融合したＨＢａＡｇの若干
もしくは全部を含有するかどうかに関係なく、唯一の必
豪なことは、抽出物がＨＢ・ムｇ抗原性を示すポリペプ
チドを含有するめに充分な量でＨＢ・ムｇｉｉ号化配列
が存在することである０次いで、このＨＢ−ムロ生成物
を。

ＨＢＶ感染保菌者の迅速かつ便利な同定およびＨＢＶｉ
ｌｌ連肝臓病の経過の予測を可能にするという重要な医
嫌上の用途に直接使用することができる。

ＨＢａＡｇ、ＨＢｓ＋ＡｇＫ対する抗体ｓＨＢｓＡｇ。

ＨｌｓＡｇに対するｉ体、ＨＢａＡｇおよびＨＢａＡｇ
に対する抗体の存在を検出するよう設計された方法およ
び診断用キットを現在入手することができる。これらの
方法およびキットは％種々の血清学的標識の出現および
消失によｐ、肝炎感染の経過の監視を可能にする。たと
えば、第Ｊ図に示したように、ＨＢａＡｇの出現はウィ
ルスの感染期の開始を示し、ま九抗−ＨＢ・の消失は感
染期の終了を示す。

本発明の方法により調製されたＨＢ・ムｇの抗原性を示
すポリペプチドおよびそれによｐ生成された抗体もこれ
らの方法に使用して、ＨＢａＡｇおよびＨＢ・ムｇに対
する抗体の存在を検出することができる。これらポリペ
プチドおよびその抗体をそれぞれ単独で或いはその他任
意のＨＢＶ抗原および抗体と組合せて診断用キット中に
包装することができる０本発明のポリペプチドもしくは
抗体を単独で１＋は他のＨＢＶ抗原もしくは抗体と組合
せて使用するこれらの方法およびキットは、ＨＢＶ感染
保菌者の迅速かつ便利な同定およびＨＢＶ関連肝臓病の
経過の予測を可能にする。

たとえば、本発明の方法により製造され九ＨＢ・Ａｇの
抗原性を示すポリペプチドおよび抗体を、ＨＢＶ抗原も
しぐは抗体の検出の九め現在入手しうる免疫学的診断試
験、すなわち放射線免疫分析もしくはＩＬＩｓＡ（＠素
−結合免疫吸着分析）に使用することができる。各分析
においては、　１（Ｂｓムｇ抗原性を示すポリペプチド
とこれらポリペプチドに対する抗体との両者を使用する
。これらの抗体は、実験動物に本発明のポリペプチドを
適当な＃！液たとえばフロイントの７ジユパントとして
注射し５次いでそのほぼｔ遍閏後に動物を出血させ、遠
心分離によル赤血球を除去しかつ得られた血清を使用し
て製造される。一種の特定実施例を以下に示す。

ＨＢｅＡｇを検出するための放射線免疫分析上記のよう
に製造しｆｑＨＢｃ＋Ａｇに対する抗体な固相、たとえ
ば試験管の内側に付着させる。

患者血清の試料を、上記のように製造されかつ放射性沃
素のような放射性同位元素で標識し九ＨＢｅムｇの抗原
性を示すポリペプチドの既知量と共に試験管に加える。

患者血清中のＨＢ・ムｇは、Ｈｆ１ｅムｇの抗原性を示
す標識ポリペプチドと競合して、ＨＢ＠Ａｇ抗体と結合
する。過剰の液体を除去し、試験管を洗浄し、そして放
射能の量を針側する。＃性の結果、すなわち患者血清が
ＨＢ・ムｇを含有することは試験管中に残存する低い放
射能カウントによｐ示される。

ためのＥＬＩＳｋ マイクロ測定板を本発明によりｔＪ４Ｈされ九ＨＢ・ム
ｇで被覆し、これに患者血清の試料を加える。血清中に
存在するＨＢ＠Ａｇ抗体とＨＢｅＡｇとの相互作用を可
能にする培養期間の後、板体を洗浄する。本発明により
作られたＨＢ・ムｇの注射により実験動物中に生成させ
１次いで酵素に結合させた抗ヒト抗体のｖＩ４ａ物を加
える。培養して抗体−抗原反応を生ぜしめ１次いで板体
を再洗浄する。その後、＃素基質をマイクロ鉤定板に加
え、＃素を基質に作用させる時間にわ九って培養し、そ
して最終ｗａ物の吸光度を欄定する。吸光度における大
きな変化は、陽性の結果を示す。

上記した放射線免疫分析およびｋＬＩ８ムの詳細は１本
発明の方法によるｉＢ＊Ａｇの抗原性を示すポリペプチ
ドの製造が、ＨＢｏＡｇ、、ＨＢａＡｇに対する抗体、
ＨＢｓＡｇおよびＨＢ−ムｇに対する抗体を検出するた
めの医療機関および研究室において既に日常的に使用さ
れている標準技術によル、ＨＢ・ムｇおよびＨＢｅムｇ
Ｋ対する抗体の検出を可能にすることを示している。し
たがって、ＨＢａＡｇの抗原性を示す実質的に純粋なポ
リペプチドおよびその抗体の低価格かつ豊富な供給源が
１本発明の方法により可能になると共に、血液供給セン
ターおよび一般的医療機関がＨＢｓＡｇおよびＨＢ−ム
ｇに対する抗体を容易かつ日常的に検出することを可能
にし、かくしてＨＢＶの感染保菌者の正確な同定が可能
になシ、さらにＨＢＶ関連肝臓病の経過の予測が可能と
なる。

以上１本発明の多くの具体例について説明し九が、この
基本構成を変更させて１本発明の方法を利用する他の具
体例を提供しうることが明らかである。したがって、本
発明は上記の特定実施例のみに限定されないことが了解
されよう。

【図面の簡単な説明】

＊／ｍｌはプラスＱ　）”ｐＨＢＶ−ＲＩ−／１０Ｒク
レオチド配列の１部を示し、さらにプラスイドｐＨＢＶ
−ＲＩ−／／によシ形質転換された榴主により発現され
九融合蛋白質の７ζノ酸配列の１部をも示す図であって
、仁の蛋白質はン１個の細菌性アミノ酸に融合されたＨ
ＢｏＡｇよりな）、このヌクレオチド配列およびその蛋
白質生産物を本発明の方法に使用してＨＢ・ムｇを製造
することができ。 第２図は本発明の一方法で製造され九ＨＢｅムｇを使用
し九種々の免疫拡散分析の写真であ夛。 ＃ＩＪ図はＩＥＩＢＶ感染の経過とこの感染の種々の血
清学的指標の出現および―縦との間の大兄の関係を示す
図である。 手続補正書（匂 昭和５７年１０月２２日 特許庁長官　若杉　和犬　殿 ■、事件の表示　　昭和５７年特許願第　１４９３７７
　　号３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 ６、補正の内容 手続補正書（帥 昭和５７年１０月２２日 特許庁長官　若杉　和犬　殿 １．１ｑ牛の耘 昭和′５７５７年特許願第４９３７７　　号２、発明の
名称 ３、補正をする者 名称　　　バイオジエン　ナームローズ　ヘンノントシ
ャツブＧ面）　　　　　（オランダ領アンチル　）６、
？＊正の内容 ｆｌ、ｌ　　沖廠Ｕ妃載の通り。 特願昭５７−１４９３７７号 補　　　正　　　書 １、明細書第１頁第５行乃至第７頁第３行の特許請求の
範囲を次の通り補正する。 ［２、特許請求の範囲 （１）ｌａｌＢ型肝炎ウィルつ核抗原の抗原性を示すポ
リペプチドの発現を特徴とする宿主の細菌抽出物を調製
し、 （ｂｌ　　前記抽出物を還元剤の存在下で還元剤耐性の
プロテアーゼで消化する　　　− ことを特徴とするＢ型肝炎つィルスｅ抗原の抗原性を示
す少なくとも１種のポリペプチドの製造方法。 （２）　プロテアーゼをプロナーゼ、ズブチリシン、カ
ルボキシペプチダーゼＡ１カルボキシペプチダーゼＢ、
パパイン、トリプシン、キモパパイン、ブロメリン、プ
ロテアーゼにおよびテルモリシンよりなる群から選択す
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）　還元剤を２−メルカプトエタノール、ジチオス
レイトール、グルタチオン、ジチオエ１」スリトール、
チオグリコレートおよび硼水素化ナトリウムよりなる群
から選択する特許請求の範囲第１項記載の方法。 （４）　プロテアーゼがプロナーゼでありかつ還元剤が
２−メルカプトエタノールである特許請求の範囲第１項
記載の方法。 （５）　特許請求の範囲第１項乃至第４項のむ）ずれか
に記載の方法により製造される、Ｂ型肝炎つィルスｅ抗
原の抗原性を示すポリペプチド。 （６）（ａｌＢｌ肝炎ウ肝炎ウィル原核抗原性を示すポ
リペプチドの発現を特徴とする宿主の細菌抽出物を調製
し、この抽出物は約６０％の前記Ｂ型肝炎つィルス核抗
原からなり、山）　前記抽出物を解離条件下で還元剤に
より処理する ことを特徴とする、Ｂ型肝炎つィルスｅ抗原の抗原性を
示す少なくとも１種のポリペプチドの製造方法。 （７）　還元剤が２−メルカプトエタノールでありかつ
解離条件をドデシル硫酸ナトリウムで生せしめる特許請
求の範囲第６項記載の方法。 （８）　特許請求の範囲第６項または第７項記載の方法
により製造される、Ｂ型肝炎つィルスｅ抗原の抗原性を
示すポリペプチド。 （９）（ａｌＢ型肝炎ウィつス核抗原の抗原性を示すポ
リペプチドを暗号化するＤＮＡ配列から、Ｂ型肝炎つィ
ルス核抗原を暗号化するＤＮＡ配列とＢ型肝炎つィルス
ｅ抗原を暗号化するＤＮＡ配列との両者に共通でない少
なくとも暗号化配列を除去し、 伽）　前記ＤＮＡ配列の少なくとも１種またはその１部
をクローン化用ベヒクル中に挿入して発現制御配列に対
し機能的に付加させ、（Ｃ１挿入されたＤＮＡ配列を有
する前記クローン他用ヘヒクルにより宿主を形質転換さ
せ、 （ｄｉ　　前記形質転換された宿主を培養し、（ｅ）　
　前記培養物から、Ｂ型肝炎つィルスｅ抗原の抗原性を
示す少なくとも１ｍのポリペプチドを含有するフラクシ
ョンを回収することを特徴とする、Ｂ型肝炎つィルスｅ
抗原の抗原性を示す少なくとも１種のポリペプチドの製
造方法。 （１０）　（ａｌ　　発現制御配列に作用結合されたＢ
型肝炎つィルスｅ抗原の抗原性を示すポリペプチドにつ
き暗号化するＤＮＡ配列を特徴とする組換ＤＮＡ分子に
より形質転換された宿主を培養し、 （ｂｌ　　前記培養物から、Ｂ型肝炎つィルスｅ抗原の
抗原性を示す前記ポリペプチドを含有したフラクション
を回収する ことを特徴とする、Ｂ型肝炎つイＪレスｅ抗原の抗原性
を示すポリペプチドの製造方法。 （１１）　　特許請求の範囲第９項または第１０項記載
の方法により製造されるＢ型肝炎つィルスｅ抗原の抗原
性を示すポリペプチド。 （１２）　　Ｂ型肝炎つィルス核抗原の抗原性を示すポ
リペプチドを１１１号化するＤＮＡ配列から、Ｂ型肝炎
つィルス核抗原を暗号化するＤＮＡ配列とＢ型肝炎つィ
ルスｅ抗原を暗号化するＤＮＡ配列との両者に共通でな
い少なくとも暗号化配列を除去することを特徴とする、
Ｂ型肝炎゛ウィルスｅ抗原の抗原性を示すポリペプチド
を暗号化する少なくとも１種のＤＮＡ配列の製造方法。 （１３）　　特許請求の範囲第１２項記載の方法により
製造されるＢ型肝炎つィルスｅ抗原の抗原性を示す少な
くとも１種のポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列。 （１４）　　特許請求の範囲第５項、第８項または第１
１項記載の少なくとも１種のポリペプチドを特徴とする
、血清試料中のまたは肝臓組織中のＢ型肝炎つィルスｅ
抗原に対する抗体の検出手段。 （１５）　　特許請求の範囲第５項、第８項または第１
１項記載の少なくとも１種のポリペプチドに対する抗体
。 （１６）　　特許請求の範囲第５項、第８項または第１
１項記載の少なくとも１種のポリペプチドに対する抗体
を特徴とする、血清試料中また番よ肝臓組織中における
Ｂ型肝炎つィルスｅ抗原の検出手段。 （１７）　　特許請求の範囲第５項、第８項またしま第
１１項記載のポリペプチド、特許請求の範囲第１５項記
載の抗体、Ｂ型肝炎つィルス核抗原の抗　　　　″原性
を示すポリペプチド、Ｂ型肝炎つイＪレス核抗原の抗原
性を示すポリペプチドに対するの抗原性を示すポリペプ
チドに対する抗体ならびにそれらの組合せによりなる鮮
力）ら選択される少なくとも１種のポリペプチドを特徴
とするＢ型肝炎つィルス診断用キット。 （１８）　　特許請求の範囲第５項、第８項また番よ第
１１項記載のポリペプチド、特許請求の範囲第１５項記
載の抗体、Ｂ型肝炎つィル、ス核抗原の抗原性を示すポ
リペプチド、Ｂ型肝炎つィルス核抗原の抗原性を示すポ
リペプチドに対３−る抗体、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原
の抗原性を表面抗原の抗原性を示すポリペプチドに対す
る抗体ならびにそれらの組合せよりなる群から選択され
る少なくとも１種のポリペプチドを特徴とするＢ型肝炎
ウィルスの検出方法。」２、明細書第７頁第１３行 「慢性かつ活性の」を「活動」と補正する。 ３、同第８頁第９行 「慢性かつ活性の」を「活動」と補正する。 ４、同第４１頁第１θ行 「本発明により作られたＨＢｅＡｇＪを「半端製された
ヒト免疫グロブリン」と補正する。 特許出願人　バイオジエン　ナームローズベンノットシ
ャップ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（＆）　　Ｂａｔ肝炎ウィつス核抗原の抗原性を
   示すポリペプチドの発現を特徴とする宿主の細菌抽出物
   をＲ製し、 （ｂ）　　前記抽出物を還元剤の存在下で還元剤耐性の
   １０テアーゼで消化する ことを特徴とするＢＭｉ肝炎ウィつスｅ抗鳳の抗原性を
   示す少なくともｌ稽のポリペプチドの製造方法。 （２）　　プロテアーゼをプロナーゼ、ズブチリシン。 カルボキシペプチダーゼム、カルボ中シペグチダーゼｉ
   ｌ、ハ／＜イン、トリプシン、キ毫ノ（−・・パイン、
   プロメリン、プロテア−４ｔＫおよびテルモリシンより
   なる群から選択する特許請求の範囲第１ｆｊ記載の方法
   。 （３）還元剤をコーメルカブトエタノール、ジチオスレ
   イトール、グルタチオン、ジチオエリスリトール、チオ
   グリコレートおよび硼水素化ナトリウムよりなる許から
   選択する特許請求の範８＃Ｉ／項記教の方法。 （４）プロテアーゼがプロナーゼであ夕かつ還元剤がコ
   ーメルカブトエタノールである特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 （５）特許請求の範囲第１項乃至纂参項のい、すれかに
   記載の方法によル製造される。Ｂ＠肝炎ウィルス・抗原
   の抗原性を示すポリペプチド。 （６）（ａ）　　Ｂ型肝炎つィルス核抗原の抗原性を示
   すポリペプチドの発現を特徴とする宿主の細菌抽出物を
   調製し、この抽出物は約４０％の前記ＢＷ肝炎ウつルス
   核抗原からな多。 （ｂ）　　前記抽出物を解離条件下で還元剤によ多処理
   する ことを特徴とする。１ｇ肝炎ウィルス・抗原の抗原性を
   示す少なくとも１種のポリペプチドの製造方法。 （７）Ｒ元剤が２−メルカプトエタノールであシかつ解
   −条件をドデシル＊＊ナトリウムで生ぜしめる特許請求
   の範８ＩＮ４項記載の方法。 （８）特許請求の範８菖４項１九社第７項記載。 方法によル製造される。８ｇ肝炎ウィルス・抗原の抗原
   性を示すポリペプチド。 ＋９）（＆）　　Ｂ型肝炎つィルス核抗原の抗原性を示
   すポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列から。 Ｂｉ！！ｌ肝炎ウィルスつ抗原を暗号化するＤＮＡ配列
   とＢ［肝炎ウィルス−抗原を暗号化するＤＮＡ配列との
   両者に共通でない少なくとも暗号化配列を除去し。 （ｂ）　　前記ＤＮＡ配列の少なくと４７種オ九はその
   ７部をクローン化用ベヒクル中に挿入して発現制御配列
   に対し機能的に付加させ。 （０）　　挿入されたＤＮＡ配列を有する前記クローン
   化用ベヒクルにょ９宿主を形質転換させ、 （ｄ）　　前記形質転換された宿主を培養し。 （ｅ）　　前記培養物から、Ｂ型肝炎ウィルス−抗原の
   抗原性を示す少なくとも７種のポリペプチドを含有する
   ７５クシ曹ンを回収することを％徴とする。Ｂ［肝炎ウ
   ィルス・抗原の抗原性を示す少なくとも１１１１１１の
   ポリペプチドの製造方法。 ａ（１（ｓ）　　発現制御配列に作用結合され九１１ｇ
   肝炎ウィルス・抗原の抗原性を示すポリペプチドにつき
   暗号化するＤＮＡ配列を特徴とする組声ＤＮム分子にょ
   ル形質転換された宿主を培養し。 （ｂ）　　前記培養物から、Ｂ淑肝炎ウィルス・抗原の
   抗原性を示す前記ポリペプチドを含有した７ラクシ曹ン
   を回収する ことを特徴とする。Ｂ型肝炎ウィルス・抗原の抗原性を
   示すポリペプチドの製造方法。 αυ　特許請求の範囲第り項またはｊｉＩ／　０ｇ４記
   載の方法によシ製造されるＢ型肝炎ウィルス・抗原の抗
   原性を示すポリペプチド。 ｏ　Ｂ型肝炎つィルス核抗原の抗原性を示すポリペプチ
   ドを暗号化するＤＮＡ配列から、Ｂ厘肝炎つィルス核抗
   原を暗号化するＤＮＡ配列とＢｌｌ肝炎ウィルス・抗原
   を暗号化するＤＮＡ配列との両者に共通でない少なくと
   も暗号化配列を除去することを％徴とする。Ｂ型肝炎ウ
   ィルス・抗原の抗原性を示すポリペプチドを暗号化する
   少なくとも１種のＤＮＡ配列の製造方法。 ａ３　　特許請求の範囲１ＩＩＪ１２項記載の方法によ
   ）製造されるＢｗ肝炎ウィルス・抗原の抗原性を示す少
   なくとも１種のポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列・ α４Ｉ￥１許請求の範囲第３項、第１項または第１／項
   記載の少なくともｌａＩのポリペプチドを特徴とする、
   血清試料中のまた拡肝縁組織中のＢ［肝炎ウィルス・抗
   原に対する抗体の検出手段。 ａ！１　　％許請求の範囲第ｊ項、第を項または第１１
   項記載の少なくとも１Ｈのポリペプチドに対する抗体。 ａｅ　　特許請求の範囲第ｊ項、第を項または第１１項
   記載の少なくともｌａｌのポリペプチドに対する抗体を
   特徴とする。血清試料中または肝臓組織中におけるＢｍ
   ｍ肝炎クイ−スス抗原の検出手段。 顛　特許請求の範８纂！項、第ｔｇ４または第１１項記
   載のポリペプチド、４！許請求の範囲第１！項記載の抗
   体、Ｂ溢肝炎つィルス核抗原の抗原性を示すポリペプチ
   ド、ＩＪｉ肝炎肝炎ウィル面表面抗原原性を示すポリペ
   プチドに対する抗体、Ｂ型肝炎表面抗原の抗原性を示す
   ポリペプチドに対する抗体およびそれらの組合せよルな
   る群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを特
   徴とするＢ［肝炎ウィルス診断用キット。 特　特許請求の範囲第！項、第ｒ項または館／／項記載
   のポリペプチド、％許請求の範囲第１Ｉａ記載の抗体、
   　Ｂ’ｌｉｌ肝炎ウィルスつ抗原の抗原性を示すポリペ
   プチド、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原の抗原性を示すポリ
   ペプチドに対する抗体、ＢＷｉ肝炎表面抗原の抗原性を
   示すポリペプチドに対する抗体およびそれらの組合せよ
   ｐなゐ許から選択される少なくと４７種のポリペプチド
   を特徴とする８ｇ肝炎ウィルスの検出方法。