JPH06194368A - Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原の抗原性を示す生産物に対する抗体およびその製造方法 - Google Patents

Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原の抗原性を示す生産物に対する抗体およびその製造方法

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JPH06194368A
JPH06194368A JP4283453A JP28345392A JPH06194368A JP H06194368 A JPH06194368 A JP H06194368A JP 4283453 A JP4283453 A JP 4283453A JP 28345392 A JP28345392 A JP 28345392A JP H06194368 A JPH06194368 A JP H06194368A
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virus
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マレー ケネス
Patricia Mackay
マッケイ パトリシア
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Biogen Inc
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Biogen NV
Biogen Inc
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原の抗原性を示すポリ
ペプチドに対する抗体およびその製造方法を得る。 【構成】 (a1)Ｂ型肝炎ウイルス核抗原の抗原性を示す
ポリペプチドの発現を特徴とする細菌宿主の抽出物を調
製し、(a2)前記抽出物を還元剤の存在下で還元剤耐性の
プロテアーゼで消化することによって製造され、また
は、(b1)Ｂ型肝炎ウイルス核抗原の抗原性を示すポリペ
プチドの発現を特徴とする細菌宿主の抽出物を調製し、
この抽出物は約６０％の前記Ｂ型肝炎ウイルス核抗原か
らなり、(b2)前記抽出物を解離条件下で還元剤により処
理することによって製造される、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗
原の抗原性を示すポリペプチドを特徴とするＢ型肝炎ウ
イルスｅ抗原に対する抗体を検出し、前記ポリペプチド
に対する抗体を得、この抗体を特徴とするＢ型肝炎ウイ
ルスｅ抗原を検出し、そしてＢ型肝炎ウイルスの診断お
よび検出を行う。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗
原（「ＨＢｅＡｇ」）の抗原性を示す生産物およびその
製造方法に関するものである。より詳細には、本発明
は、Ｂ型肝炎ウイルス核抗原（「ＨＢｃＡｇ」）の抗原
性を示すポリペプチドからの、またはＨＢｅＡｇの抗原
性を示すポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列で形質転
換された宿主からのＨＢｅＡｇの抗原性を示すポリペプ
チドおよびその製造に関するものである。以下の記載か
ら判るように、ＨＢｅＡｇの抗原性を示すポリペプチド
は、過去もしくは現在のＢ型肝炎ウイルス（「ＨＢ
Ｖ」）感染を検出するのに使用することができ、特にＨ
ＢＶ感染保菌者を検出し或いはＨＢＶ関連の活動肝臓病
の経過を評価するのに価値がある。
【０００２】
【従来の技術】Ｂ型肝炎ウイルス（すなわちＨＢＶ）
は、極めて高割合でヒトに感染する。アメリカ合衆国の
人口の１５％が感染されており、或るアフリカおよびア
ジア諸国においては成人人口の２０％以上が伝染性の慢
性ＨＢＶ保菌者であり、５０％以上が感染していると推
定される。
【０００３】ＨＢＶ感染は３種の一般的メカニズムによ
って伝染される：（１）感染血液もしくは体液を多量
（例えば輸血）に或いは少量（例えば遇発的な皮膚刺
傷）で接種することによるもの、（２）近親または性接
触によるもの、および（３）妊娠中に母親がウイルスを
子供に伝染させる感染によるものである。
【０００４】殆どのＨＢＶ感染は準臨床的であり、準臨
床的および臨床的感染からの回復は一般に完全である。
しかしながら、或る場合には重症の長期症状が生ずる：
（１）約５％の急性ＨＢＶ感染は慢性ＨＢＶ感染をもた
らし、第三者に対する感染症および重症の肝臓衰弱病に
対する恒久的潜在保菌者となり、また（２）ＨＢＶによ
る過去の感染は部分的にまたは全体的に閃光性肝炎、肝
硬変および一次肝臓癌の発生原因となりうる。たとえ
ば、一次肝臓癌の通常の発生率は１：１００，０００で
あるが、慢性ＨＢＶの患者についてはこの癌の発生率は
１：３００である。
【０００５】ＨＢＶの広範囲にわたる発生は、その発病
力および慢性もしくは致死的肝臓病との関連性と共に、
極めて重大な臨床問題を構成する。次の場合、絶えず危
険が伴う：（１）血液透析もしくは腎臓透析を受ける受
血患者、および収容患者、（２）その家族、および
（３）全ての健康な専門職（特に看護婦、外科医および
歯医者）。したがって、感染性ＨＢＶの保菌者を容易か
つ性格に同定しかつ治療することが特に重要である。
【０００６】ＨＢＶ感染の保菌者の同定は、従来、ウイ
ルスの性質およびその感染過程の両者のため困難であっ
た。感染性保菌者はしばしば感染の徴候を示さず、正規
の医療検査では同定することができない。生ウイルスの
直接的分析は、ウイルスが培養細胞において精々極めて
僅かしか繁殖せず、かつまた小実験動物には感染しない
という事実により妨げられる。しかしながら、ＨＢＶ感
染はウイルスの１部である蛋白質（抗原とも云う）に対
する抗体の発生をもたらす。したがって、これら抗原
〔Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎核抗原
（ＨＢｃＡｇ）、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡ
ｇ）〕またはその抗体の存在を検出するための分析法が
開発されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】残念乍ら血液中のＨＢ
ｓＡｇもしくはＨＢｃＡｇに対する抗体の存在は過去の
ＨＢＶの感染のみを示し、必ずしもＨＢＶ感染性に対す
る現在の潜在力を示さない。幾種かの抗原、Ｂ型肝炎ウ
イルスｅ抗原またはＨＢｅＡｇの群に実際になりうる第
三のＨＢＶ抗原〔マグニウスおよびエスプマーク、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１０９巻、第１０１７〜１０２３
頁（１９７２）〕も、この種の分析法において、より有
用になりうる。多くの臨床的証明は現在次のことを示唆
している：（１）血液中のＨＢｅＡｇの存在は伝染性Ｈ
ＢＶ感染の決定的指標であり、（２） ＨＢｅＡｇの存
在は潜在的なＨＢＶ関連肝臓病の特定経過を示し、した
がってこの病気の診断および治療に役立ち、（３）ＨＢ
ｅＡｇに対する抗体の存在はＨＢＶ関連肝臓病に対する
好適な診断の指標となる。
【０００８】潜在的なＨＢＶ感染性を正確に示しかつ肝
臓病の経過を予測する分析法にＨＢｅＡｇを使用する際
の問題は、有用な量のＨＢｅＡｇまたはその抗体を廉価
かつ効率的に製造または精製するのが従来不可能であっ
たことである。上記したように、ＨＢＶは組織培養にお
いて精々極めて僅かしか増殖せず、かつ小実験哺乳動物
には感染しない。したがって、これらウイルス抗原を得
るための慣用手段は、充分量のＨＢｅＡｇを製造かつ単
離するには効果的でない。さらに、この種の調製物は一
般に多量のＨＢｃＡｇで汚染されているため、これらか
らの抗体の製造はＨＢｃＡｇとＨＢｅＡｇとに対する抗
体の混合物をもたらす。したがって、この種の抗原と抗
体との混合物は種々の分析においてＨＢｃ含有試料とＨ
Ｂｅ含有試料との間の相違を有効に区別することができ
ず、それ故この種の分析はＨＢｅＡｇの存在を明確に検
出することができない。したがって、これら分析はＨＢ
Ｖの感染性保菌者の検出に有効でない。
【０００９】組換えＤＮＡ技術における最近の進歩は、
ＨＢｓＡｇ用の遺伝子およびＨＢｃＡｇ用の遺伝子をク
ローン化させて、これら蛋白質生産物を細菌中で合成す
ることを可能にした〔バレル等、ネイチャー誌、第２７
９巻、第４３〜４７頁（１９７９）；パセク等、ネイチ
ャー誌、第２８２頁、第５７５〜５７９頁（１９７
９）；エドマン等、ネイチャー誌、第２９１巻、第５０
３〜５０６頁（１９８１）〕。したがって、この種の技
術は精製Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原、すなわちＨＢｅＡｇ
の血清学的変種を示すポリペプチドを製造する手段を提
供しうるであろうことが示唆される〔たとえば、エドマ
ン等、上記参照〕。
【００１０】残念乍ら、ＨＢｅＡｇを暗号化するＨＢＶ
ＤＮＡ配列は同定されていない。たとえば、ＨＢｅＡ
ｇはＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼ酵素〔ジェー・エル・
メルニック等、「Ｂ型肝炎ウイルスの抑制方法」、ジャ
ーナル・インフェクチャス・デイジーズ、第１３３巻、
第２１０〜２１５頁（１９７６）〕、ＩｇＧの遺伝型
〔エー・アール・ニューラスおよびエヌ・ストリック、
「Ｂ型肝炎に対する血清指標の宿主特異性：ウイルスｅ
抗原が免疫グロブリンの性質を示す証明」、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７４巻、第１
７０２〜１７０６頁（１９７７）〕、小型ペプチドに関
連するＩｇＧの二量体〔エッチ・エー・フィールズ等、
「Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原の精製および部分特性化」、
インフェクション・アンド・イミュニティー、第２０
巻、第７９２〜８０３頁（１９７８）〕、乳酸デヒドロ
ゲナーゼイソ酵素Ｎｏ．５に関連するもの〔ジー・エヌ
・バイアス等、「Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原：乳酸デヒド
ロゲナーゼイソ酵素Ｎｏ．５との明白な関連性」、サイ
エンス誌、第１０８巻、第１０６８〜１０７０頁（１９
７７）〕、またはデーン粒子および管状型の表面に対す
る抗原指標〔ニューラス等（１９７６）〕に対し種々関
与している。したがって、組換えＤＮＡ技術を使用して
ＨＢｅＡｇを生産することは従来不可能であった。
【００１１】さらに、ＨＢｅＡｇは、血清から精製され
たＨＢＶ核粒子から〔タカハシ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．、第１１７巻、第１０２〜１０５頁（１９７６）〕
または肝臓から精製された同様な粒子から〔ブドウコウ
スカ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１２３巻、第１４１
５〜１４１６頁（１９７９）、ヨシザワ等、Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｖｉｒｏｌ．第４２巻、第５１３〜５１９頁（１９
７９）〕、プロナーゼでの処理〔ブドウコウスカ等〕、
プロナーゼと２−メルカプトエタノールとでの処理〔タ
カハシ等〕もしくはドテシル硫酸ナトリウムと２−メル
カプトエタノールとでの処理〔ブドウコウスカ等、タカ
ハシ等、ヨシザワ等〕により、或いは超音波での破壊に
よりおよびＣｓＣｌ中でのケオトロピック剤（ｃｈａｏ
ｔｒｏｐｉｃａｇｅｎｔｓ）での処理もしくは遠心分離
〔エッチ・オホリ等、「Ｂ型肝炎核粒子の分解によるＨ
ＢｃＡｇからＨＢｅＡｇへの抗原変換」、インターバイ
ロロジー、第１３巻、第７４〜８２頁（１９８０）〕に
よって遊離されることも報告されている。しかしなが
ら、これらの方法は、得られる生産物がＨＢＣとＨＢｅ
抗原との混合物であるため、ＨＢｅＡｇの大規模生産に
は適していない。さらに、これらの報告は、ＨＢｅＡｇ
がＨＢｃＡｇから誘導されるかどうか、或いはＨＢｅＡ
ｇがＨＢｃＡｇとは異なる蛋白質であるかどうかを示唆
しておらず、しかもこれらがウイルス蛋白質の内部に埋
め込まれていてＨＢｅＡｇの遊離にはＨＢｃＡｇの蛋白
質分解が必要なのかまたは遇発的であるのかについて示
唆していない。したがって、これらの報告は、ＨＢｅＡ
ｇおよびその抗体を効果的な分析法に使用する困難性、
またはＨＢｅＡｇの生産に対する組換えＤＮＡ技術の使
用を妨げていた問題を解決しない。さらに、ＨＢｅＡｇ
がＨＢｃＡｇ遺伝子の部分により或いは完全に分離され
た遺伝子により暗号化されるかどうか未知のままであ
る。したがって、組換えＤＮＡ技術は、ＨＢｅＡｇの生
産には一般的に使用されていない。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＨＢｅＡｇの
決定的供給源としてＨＢｃＡｇを同定することにより、
かつＨＢｃＡｇとＨＢｅＡｇとの関係（ＨＢｃＡｇは解
離条件下での蛋白質分解によりＨＢｅＡｇに変換させる
ことができる）に基づき、ＨＢｅＡｇおよびこれら抗原
に対する抗体を多量かつ効果的に生産しうる方法を提供
することにより、上記の諸問題を解決する。或いは、高
度に濃縮された実質的に純粋なＨＢｓＡｇの抽出物は、
蛋白質分解なしに、解離条件下で還元剤の存在下にＨＢ
ｅＡｇに変換することもできる。したがって、本発明に
より、今回、ＨＢｅＡｇおよびその抗体を、ＨＢＶ感染
保菌者の同定に使用するため、およびＨＢＶ関連肝臓病
の経過を決定し、したがってこの病気に対する治療法を
見出す際の診断用として、相当の量でしかも非汚染状態
で得ることが初めて可能になった。
【００１３】以下の記載から判るように、本発明の方法
は、Ｂ型肝炎ウイルス核抗原の抗原性を示すポリペプチ
ドの発現を特徴とする宿主の細菌抽出物を調製し、この
抽出物を還元剤の存在下で還元剤耐性のプロテアーゼに
より消化させることにより、ＨＢｃＡｇからのＨＢｅＡ
ｇの製造を可能にする。或いは、より濃厚かつ純粋な細
菌抽出物を用いて、ＨＢｃＡｇからＨＢｅＡｇへの変換
を解離条件下で還元剤により行うことができる。これら
は、さらに、ＨＢｅＡｇを暗号化するＤＮＡ配列の適当
な宿主中での発現によりＨＢｅＡｇの製造を可能にす
る。
【００１４】これらの方法により製造されるＨＢｅＡｇ
は、合成されたままで或いは適当に誘導体化もしくは改
変させた後に、ヒト血清中のＨＢｅＡｇに対する抗体を
検出するための、或いは潜在的に感染性のＨＢＳ保菌者
の血清もしくは肝臓におけるＨＢｅＡｇの検出に使用さ
れるこれらＨＢｅＡｇに対する抗体を製造するための組
成物および方法において有用である。ＨＢｅＡｇ自身ま
たはそれらの改変物もしくは誘導体およびそれから生成
される抗体は、別々にまたは一緒にして、ＨＢＶ診断用
キットもしくは分析法に使用することができる。さら
に、抗原もしくはその抗体またはその両者は、下記のも
のの１種もしくは組合せ物と共に、ＨＢＶ診断用キット
において、或いはＢ型肝炎ウイルスに対するワクチンに
おいて有効に使用することもできる：ＨＢｃＡｇまたは
その改変物もしくは誘導体、およびＨＢｃＡｇに対する
抗体またはその改変物もしくは誘導体、ＨＢｓＡｇまた
はその改変物もしくは誘導体、或いはＨＢｓＡｇまたは
その改変物もしくは誘導体に対する抗体。
【００１５】本明細書に記載した本発明を一層良く理解
するため、以下詳細に説明する。
【００１６】説明において次の用語を使用する：ポリペプチド ： 隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカ
リボキシ基との間のペプチド結合により互いに接続され
たアミノ酸の線状系列。
【００１７】蛋白質： 約５０個もしくはそれ以上のア
ミノ酸を有するポリペプチド。
【００１８】抗体： 外来蛋白質の存在に呼応して動物
により生成される蛋白質。抗体は、外来蛋白質へ極めて
強固かつ特異的に結合する。
【００１９】抗原： 幾らかの部分が抗体により結合さ
れうるポリペプチドもしくは蛋白質。
【００２０】血清： 赤血球を除去した後に残留する血
液の部分。これは、特に抗体と抗原とを含有する。
【００２１】ヌクレオチド： 糖部分（ペントース）と
燐酸化合物と含窒素複素環式塩基とよりなるＤＮＡもし
くはＲＮＡの単量体単位。塩基は、グリコシド炭素（ペ
ントースの１´炭素）を介して糖部分に結合され、塩基
と糖の組合せがヌクレオチドである。
【００２２】ＤＮＡ配列： 隣接するペントースの３´
炭素と５´炭素との間のホスホジエステル結合により互
いに接続されたヌクレオチドの線状系列。
【００２３】遺伝子： 特異性ポリペプチドもしくは蛋
白質に特性的なアミノ酸の配列を、雛型を介して暗号化
するＤＮＡ配列。
【００２４】発現： ポリペプチドもしくは蛋白質を生
産するため遺伝子により行われる過程。これは、転写と
翻訳との組合せである。
【００２５】発現制御配列： 遺伝子に作用結合された
際、これら遺伝子の発現を制御かつ調整するＤＮＡ配
列。
【００２６】クローン化用ベヒクルもしくはプラスミ
ド： 宿主動物中でそれ自体複製しうるＤＮＡ配列であ
って、１個もしくは少数のエンドヌクレアーゼ識別部位
を特徴とし、これら部位において前期ＤＮＡ配列をＤＮ
Ａの本質的な生物学的機能の付随的損失なしに決定可能
に切断することができ、かつ形質転換の前または後のい
ずれかに形質転換菌体の同定に使用するのに適した標
識、たとえばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン
耐性を有する。
【００２７】組換ＤＮＡ分子： 少なくとも２つのヌク
レオチド配列からなる混成ＤＮＡ配列であって、第１の
配列は性質上第２の配列と一緒には通常見出されない。
【００２８】試薬の調製 薬品 ： 全ての薬品と酵素とは次のものを除きシグマ・
ケミカル社から購入した：アガロース（マイルス・ラボ
ラトリース社）、エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１（ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリース社）、γ−Ｐ ３２−ア
デノシン三燐酸（ニュー・イングランド・ヌクレア
社）、ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー−マン
ハイム社）、Ｅｃｏ ＲＩおよびＰｓｔ Ｉ（ニュー・
イングランド・ビオラブス社）、Ｅｃｏ ＲＩ ＤＮＡ
リンカー（コラボラティブ・リサーチ社）、セファデッ
クスＧ−５０（ファルマシア社）、およびリホゲル（ベ
ルマン社、ホークスレー・アンド・サン、ランシング、
サセックス）。
【００２９】組換えプラスミド： 適当な宿主中に形質
転換させた際ＨＢｃＡｇを暗号化する遺伝子を発現する
プラスミドｐＨＢＶ−ＲＩ−１１は次のように作成し
た。全ＨＢｃＡｇ遺伝子を暗号化するプラスミドｐＨＢ
Ｖ１３９Ａ〔エム・パセク等、ネイチャー誌、第２８２
巻、第５７５〜５７９頁、（１９７９）〕、をＰｓｔＩ
により切断しうる断片上に有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）Ｋ−１２菌株ＨＢ１０１の培養物１ｌをＯ．Ｄ ５５
０＝１．０まで増殖させ、そしてプラスミドをディー・
クレウェルにより記載されたように〔ジャーナル・バク
テリオロジー、第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９
７２）〕収穫菌体から単離した。精製ｐＨＢＶ１３９Ａ
６０μｇを、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）
と５ｍＭのＭｇＣｌ ２と１ｍＭのジチオスレイトール
（ＤＴＴ）と５０ｍＭのＮａＣｌとの中で３７℃にて５
単位のＰｓｔ Ｉにより一晩消化させた。
【００３０】消化したプラスミドを製造用８％ポリアク
リルアミドゲル上で電気泳動にかけ、ＨＢｃＡｇ暗号化
配列を含有する切断ＤＮＡ断片をエー・マキサムおよび
ダブリュ・ギルバートの方法〔メソッド・エンチモロジ
ー、第６５巻、第４９９〜５６０頁（１９８０）〕によ
りＵＶ−シャドー化および溶出によってゲルから回収し
た。単離ＤＮＡ断片の末端部を、０．６ｍｌの２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）と１２ｍＭのＣａＣｌ ２と１
２ｍＭのＭｇＣｌ ２と６０ｍＭのＮａＣｌと１ｍＭのエ
チレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）との中でエキソ
ヌクレアーゼＢＡＬ３１により消化させた。反応を等容
量のフェノールでの抽出により停止させた。Ｅｃｏ Ｒ
ＩもしくはＨｉｎｄ III リンカー（それぞれ制限酵素
ＥｃｏＲＩもしくはＨｉｎｄ III の識別部位を暗号化
する）０．２μｇを、エー・マキサムおよびダブリュ・
ギルバートの方法〔メソッド・エンチモロジー、第６５
巻、第４９９〜５６０頁（１９８０）〕により、５：１
の比のアデノシン三燐酸（ＡＴＰ）とγ−Ｐ ３２−ＡＴ
Ｐとの存在下で１０μｌ容量にて１単位のポリヌクレオ
チドキナーゼにより燐酸化させた。
【００３１】燐酸化しかつ標識したリンカーを、２０ｍ
ｌの結紮用緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）と１０ｍＭのＭｇＣｌ ２と１０ｍＭのＤＴＴと
１ｍＭのＡＴＰ）中において１単位のリガーゼによりＢ
ＡＬ３１−消化断片０．２μｇに対し１５℃にて１時間
結紮させた。上記と同様にフェノール抽出により結紮を
停止させ、生成物を９０μｌの緩衝液（１０ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）と５０ｍＭのＮａＣｌと５ｍ
ＭのＭｇＣｌ ２と１ｍＭのＤＴＴと０．１５％のトリト
ンＸ−１００）を添加しながら１０単位のＥｃｏ ＲＩ
もしくはＨｉｎｄIII （必要に応じ）と１０単位のＢ
ａｍ ＨＩとにより３７℃にて一晩消化させた。この試
料を、２ｍｌのセファデックスＧ−５０を介し１０ｍＭ
のトリスＨＣｌ（ｐＨ８）および１ｍＭのＥＤＴＡとに
おいて卓上臨床用遠心分離器で１分間遠心分離した。
０．２μｇのｐＥＸｌａｃ１５０、すなわちクローン化
遺伝子を発現するのに適するＥｃｏ ＲＩもしくはＨｉ
ｎｄ III 制限部位を有しかつエッチ・ワイハー（ハイ
デルベルグ大学、博士論文（１９８０））により作成さ
れかつ上記ｐＨＢＶ１３９Ａについて記載したと同様に
単離したクローン化用ベヒクルを、上記と同様に１０μ
ｌの緩衝液中で１単位のＥｃｏ ＲＩもしくはＨｉｎｄ
III とＢａｍ ＨＩとにより消化させた。次いで、上
記で調製した断片を、２０μｌの結紮緩衝液中において
１単位のリガーゼと共に室温で４時間培養することによ
り、クローン化ベヒクル中に挿入した。
【００３２】大腸菌Ｋ−１２株ＨＢ１０１〔エッチ・ボ
イヤーおよびディー・ローランド−ヅソー、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．第５３巻、第１５９〜１６２頁（１９６
９）〕を、エム・マンデルおよびエー・ヒガ、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．第５３巻、第１５９〜１６２頁（１９７
０）により記載されたように、上記で調製した組換えプ
ラスミドにより形質転換させた。形質転換体は、リッチ
寒天板上において５０μｇ／ｍｌのアンピシリンに対す
る耐性により選択し、エス・ブルームおよびダブリュ・
ギルバートの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．（ＵＳＡ）、第７５巻、第２７４６〜２７４９頁
（１９７８）〕により、シー・バレル等の方法〔ネイチ
ャー誌、第２７９巻、第４３〜４８頁（１９７９）〕と
同様にＨＢｃＡｇの発現につきスクリーニングした。
【００３３】ＨＢｃＡｇを発現する宿主の１種により含
有される組換えプラスミド（ｐＨＢＶ−ＲＩ−１１と名
付けられ、Ｅｃｏ ＲＩリンカーを含有する）を、エー
・マキサムおよびダブリュ・ギルバートの方法〔メソッ
ド・エンチモロジー、第６５巻、第４９９〜５６０頁
（１９８０）〕により、ＨＢＶ ＤＮＡとｐＥｘｌａｃ
１５０のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子との間の融合域に
て配列決定した。このヌクレオチド配列と対応アミノ酸
配列とを第１図に示す。ヌクレオチド配列は、β−ガラ
クトシダーゼのアミノ酸８がＥｃｏ ＲＩリンカーによ
り暗号化された３個のアミノ酸によりＨＢｃＡｇのアミ
ノ酸３に融合されることを示している。β−ガラクトシ
ダーゼとＨＢｃＡｇとの間に種々の融合を有する他のプ
ラスミドも同様に単離することができる。
【００３４】抗原： ＨＢｃＡｇの抗原性を示す生成物
を次のように調製した。組換えプラスミドｐＨＢＶ−Ｒ
Ｉ−１１を有する大腸菌Ｋ−１２株ＨＢ１０１の培養物
２ｌをＯ．Ｄ ５５０＝１．０まで増殖させ、収穫しそし
て５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）と２５％蔗糖６
ｍｌ中に再懸濁した。０．２５Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８）中におけるリゾチーム５ｍｇ／ｍｌの１ｍｌを加
え、この混合物を氷上で５分間培養した。０．２５Ｍの
ＥＤＴＡ２．５ｍｌを加え、混合物をさらに５分間氷上
で培養した。１％トリトンＸ−１００と０．４％デオキ
シ胆汁酸ナトリウムと５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８）と６．２５ｍＭのＥＤＴＡとを含有する溶液１０ｍ
ｌとを加え、混合物を再び氷上にて１０分間時々振とう
しながら培養した。最後に、０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８）中の１ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ ２と０．２ｍｌ
の１０ｍｇ／ｍｌ膵臓ＤＮアーゼとを加えた。混合物を
３７℃にて１時間培養し、ＳＳ−３５ロータを備えるソ
ルバール遠心分離器において１０，０００ｒｐｍにて１
０分間遠心分離した。硝酸アンモニウムを加え（飽和度
５５％）、沈殿物を１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠
心分離して集めた。次いで、沈澱物を１０ｍＭのトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８）緩衝液中に再溶解させ、この緩衝液
に対して透析した。得られた溶液は、ＨＢｃＡｇの抗原
性を示す細菌合成されたポリペプチドを含有する。これ
らの細菌抽出物は約１％のＨＢｃＡｇを含有すると推定
される。さらに、慣用の蛋白質精製技術を使用する精製
は、ＨＢｃＡｇのより濃厚な溶液、すなわち約６０％純
度の製造を可能にする。これら抽出物のＨＢｃＡｇ関連
ポリペプチドのアミノ末端のアミノ酸配列を第１図に示
す。
【００３５】標準ＨＢｃＡｇを、ビー・コーヘンおよび
ワイ・コサルトに載せられたように〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐ
ａｔｈ．第３０巻、第７０９〜７１３頁（１９７
７）〕、持続性ＨＢｃＡｇ保菌者の剖検体肝臓から抽出
した。
【００３６】血清： 標準ＨＢｃＡｇだけに対する抗体
および標準ＨＢｃＡｇと標準ＨＢｅＡｇとの両者に対す
る抗体を含有する血清、ならびに標準ＨＢｅＡｇを含有
する血清は、エジンバラ大学におけるヘパチス・リフェ
レンス・ラボラトリーにより供給された。この血清を、
リホゲルでの処理によりゲル拡散で３倍に濃縮した。
【００３７】
【実施例】Ｂ型肝炎ウイルスＥ抗原の製造 実施例１ ＨＢｃＡｇ（純度約１％）の抗原性を示す細菌合成され
たポリペプチドを含有する上記のように調製した上澄液
の１部をプロナーゼ中で０．１％にし、或いはプロナー
ゼおよび０．１％２−メルカプトエタノール中０．１％
にし、次いで３７℃にて２時間培養した。各試料の１部
を、オーチターロニイの免疫拡散技術〔オー・オーチタ
ーロニイ、プログレス・イン・アレルギー、ピー・カロ
スおよびアール・ワクスマン（編）、カーガー、ニュー
ヨーク、第５巻、第１〜７８頁（１９５８）〕によりＨ
ＢｃＡｇもしくはＨＢｅＡｇの抗原性を示すポリペプチ
ドの存在につき試験した。第２図は、０．１Ｍバルビト
ン緩衝液（ｐＨ８．６）中に０．８％アガロースと０．
３％ ＥＤＴＡとを含有するペトリ皿の写真である。こ
のペトリ皿は直径５ｍｍかつ間隔２ｍｍの数個の穴部を
有する。上記の血清２５μｌまたは上記のように調製し
た細菌抽出物の上澄液２５μｌを穴部中に次のように充
填した：抗−ＨＢｃＡｇのみに対し陽性のヒト血清（穴
部１、２、４および５）、プロナーゼ処理なしのＨＢｃ
Ａｇを含有する細菌抽出物（穴部３）、０．１％の２−
メルカプトエタノール中で０．１％プロナーゼにより３
７℃にて２４時間処理した後のＨＢｃＡｇを含有する細
菌抽出物（穴部６）、抗−ＨＢｃＡｇおよび抗−ＨＢｅ
Ａｇに対し陽性のヒト血清（穴部７）、および抗−ＨＢ
ｃＡｇと抗−ＨＢｅＡｇとの両者に対し陽性のヒト血清
（穴部８）。次いで、充填板を４℃にて５日間培養し、
０．１％ ＮａＣｌで充分に洗浄し、４５％メタノール
−５％酢酸−５５％水の混合物における０．１％クーマ
シー・ブリリアント青色素にて室温で４時間染色し、次
いで同じ溶剤中で室温にて一晩脱色した。最後に、染色
板を撮影した。
【００３８】培養期間の際、各試料中の蛋白質はアガロ
ース中に拡散する。抗原とそれ自身の抗体とが互いに拡
散すればいつでも、これらは結合しかつ沈澱し、そして
色素はこれら抗原−抗体の錯体により形成されたプレシ
ピチン線の肉眼化を可能にする。本発明の方法により消
化しなかった抽出物はＨＢｅＡｇ反応性を示さなかっ
た。しかしながら、第２図が示すように、プロナーゼお
よび２−メルカプトエタノールによる細菌抽出物の処理
は、ＨＢｅＡｇを含有する血清（穴部７）とＨＢｅＡｇ
に対する抗体（穴部８）との間にプレシピチン線を有す
る免疫学的性質を示す抗原特異性（穴部６と８との間の
プレシピチン線）を与え、これは穴部６、８と穴部７、
８との間の線の連続性により示される。しかしながら、
プロナーゼのみでの処理は、細菌抽出物の核抗原活性に
対し効果を示さなかった。さらに、ＳＤＳのみ、ＳＤＳ
＋２−メルカプトエタノールまたは０．５％プロナーゼ
と０．１％２−メルカプトエタノールとによる１％細菌
抽出物の処理は、免疫拡散により測定して、抽出物の核
抗原もしくはｅ抗原の活性の全部を完全に破壊した。 ＊同様な結果が、肝臓抽出物の処理についても観察され
た。
【００３９】＊ より高度に濃縮した細菌抽出物（たと
えば約６０％のＨＢｃＡｇを含有するもの）を用いて、
ＨＢｃＡｇからＨＢｅＡｇへの変換をＳＤＳ＋２−メル
カプトエタノールの存在下で行うことができる〔実施例
２〕。
【００４０】上記の実施例（抽出物１％を用いる）は、
ＨＢｃＡｇをＨＢｅＡｇに変換するため２−メルカプト
エタノールの存在下でプロナーゼを使用するが、本発明
の方法のこの具体例によるＨＢｃＡｇからＡＢｅＡｇへ
の変換は他の還元剤（たとえばジチオスレイトール、ジ
チオエリスリトール、チオグリコレート、グルタチオン
および硼水素化ナトリウム）の存在下で他の還元剤耐性
プロテアーゼ（たとえばズブチリシン、パパイン、キモ
パパイン、プロメリン、トリプシン、テルモリシン、プ
ロテアーゼＫ、カルボキシペプチダーゼＡもしくはカル
ボキシペプチダーゼＢ）により達成することもできるこ
とを理解すべきである。さらに、本発明の方法のこの具
体例において有用なこの種のプロテアーゼと還元剤との
相対的量は、本明細書中に記載した方法を用いて当業者
により決定されうることを理解すべきである。
【００４１】本発明の方法のこの具体例によるＨＢｃＡ
ｇからＨＢｅＡｇへの変換はＨＢｃＡｇ凝集物の解きほ
ぐしと解離との他に蛋白質分解消化を含むと思われる
が、この変換はこのような変化の程度を規定しない。さ
らに、この変換は、本発明の方法の代替具体例（より高
度に濃縮された細菌抽出物、還元剤、解離条件）によっ
ても行われる〔実施例２〕。したがって、この理論に拘
束されるものではないが、本発明の方法は、それぞれが
ＨＢｅＡｇ反応性を示すような分解生成物の集団を生成
させうると思われる。これら生成物は、ＨＢｅＡｇの種
々な血清学的変種となりうる。
【００４２】本発明の方法は、ＨＢｃＡｇ遺伝子を発現
するプラスミドを有する細菌もしくはその他の適当な宿
主から或いは血液中にＨＢｃＡｇを有する患者の肝臓か
ら得られたＨＢｃＡｇを、還元剤耐性プロテアーゼ、好
ましくはプロナーゼと還元剤、好ましくは２−メルカプ
トエタノールとで処理すれば、或いはより高度に濃縮さ
れた出発物質を用いて還元剤および解離条件の存在下で
処理すれば、ＨＢｃＡｇがＨＢｅＡｇへ変換することを
示している。さらに、ＨＢｅＡｇは、別個の遺伝子によ
り暗号化される別個の蛋白質として存在するのでなくＨ
ＢｃＡｇから得られることも示している。何故なら、Ｈ
ＢｃＡｇを発現する宿主が有するＤＮＡ断片はＨＢｃＡ
ｇ遺伝子のみを含有するからである。したがって、ＨＢ
ｃＡｇの抗原性を示すポリペプチドを暗号化する遺伝子
を発現するようなプラスミドを有する宿主を多量に培養
することができ、抽出物を上記のように処理してＨＢｅ
Ａｇ抗原性を示すポリペプチドを廉価かつ効率的に製造
することができる。
【００４３】本発明の方法において有用であるために
は、ＨＢｃＡｇの抗原性を示すポリペプチドがＨＢｃＡ
ｇの１部のみ、ＨＢｃＡｇの全部または他の蛋白質に融
合された若干のもしくは全部のまたは全部のＨＢｃＡｇ
を含有するかどうかに関係なく、唯一の必要なことは、
実施例１の方法による抽出物の処理がＨＢｅＡｇ抗原性
を示すポリペプチドを生産するのに充分な量でＨＢｃＡ
ｇが存在することであり、ここでＨＢｅＡｇはＨＢＶ感
染保菌者の迅速かつ効果的な同定およびＨＢＶ関連肝臓
病の経過の予測を可能にするという重要な医療上の利点
を有する。たとえば、ＨＢｃＡｇのＣ末端における最初
の２個のアミノ酸とＨＢｃＡｇのＮ末端における最初の
２個のアミノ酸とは、本発明の方法によりこれらポリペ
プチドからのＨＢｅＡｇの製造に影響することなく除去
されている。
【００４４】実施例２ 実施例１で使用した上澄液の部分を、それらが約６０％
のＨＢｃＡｇを含有するよう慣用の手段および方法によ
って精製した。次いで、これら部分を約１％ＳＤＳとな
しそして１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを加え
た。３７℃にて２時間培養すると、この部分に存在する
ほぼ全部のＨＢｃＡｇはＨＢｅＡｇに変換された。
【００４５】実施例３ ＨＢｅＡｇがＨＢｃＡｇから得られることは、実施例１
および２から簡単である。したがって、ＨＢｃＡｇから
ＨＢｅＡｇへの変換の必要性は、ＨＢｃＡｇを暗号化す
る遺伝子を改変させてＨＢｅＡｇを暗号化するＤＮＡ配
列生成させることにより回避することができる。これ
は、両遺伝子に共通でないＨＢｃＡｇ遺伝子からそれら
の暗号化配列を除去して達成することができる。これ
は、たとえば、非共通の末端ヌクレオチドをエキソヌク
レアーゼＢＡＬ３１で消化除去して行うことができる。
或いは、ＨＢｅＡｇの抗原性示すポリペプチドを暗号化
する配列を備えた制限断片を、ＨＢｃＡｇ暗号化配列か
ら切除することもできるであろう。新たに単離されたＨ
ＢｅＡｇ暗号化配列（これもＨＢｅＡｇの血清学的変種
に対応するこの種の配列の実際上の集団である）を次い
でクローン化用ベヒクル中に挿入し、かつ発現制御配列
へ作用結合される。実施例１に詳記したと同様に、この
種の挿入の一方法は、新たに調製されたＨＢｅＡｇ遺伝
子を発現プラスミドｐＥｘｌａｃ１５０中に挿入するこ
とである。この作成は、適当な宿主中において、ＨＢｅ
Ａｇ抗原性を示すポリペプチドに結合された少数の細菌
性アミノ酸を含有した融合蛋白質の合成を可能にする。
かくして、本発明の方法により作成された、新たに調製
されたＨＢｅＡｇ遺伝子を含有するｐＥｘｌａｃ１５０
により或いはその他任意のプラスミドにより形質転換さ
れた宿主を多量かつ容易に培養して、ＨＢｅＡｇ抗原性
を示すポリペプチドを廉価かつ効率的に直接製造するこ
とができる。
【００４６】実施例１におけると同様、本発明の方法に
より製造されるポリペプチドはＨＢｅＡｇの１部のみ、
ＨＢｅＡｇの全部或いは他の蛋白質に融合したＨＢｅＡ
ｇの若干もしくは全部を含有するかどうかに関係なく、
唯一の必要なことは、抽出物がＨＢｅＡｇ抗原性を示す
ポリペプチドを含有するのに充分な量でＨＢｅＡｇ暗号
化配列が存在することである。次いで、このＨＢｅＡｇ
生成物を、ＨＢＶ感染保菌者の迅速かつ便利な同定およ
びＨＢＶ関連肝臓病の経過の予測を可能にするという重
要な医療上の用途に直接使用することができる。
【００４７】ＨＢｅＡｇおよびＨＢｅＡｇに対する抗体
の存在を検出する際のＨＢｅＡｇおよびその抗体の使用 ＨＢｃＡｇ、ＨＢｃＡｇに対する抗体、ＨＢｓＡｇ、Ｈ
ＢｓＡｇに対する抗体、ＨＢｅＡｇおよびＨＢｅＡｇに
対する抗体の存在を検出するよう設計された方法および
診断用キットを現在入手することができる。これらの方
法およびキットは、種々の血清学的標識の出現および消
失により、肝炎感染の経過の監視を可能にする。たとえ
ば、第３図に示したように、ＨＢｅＡｇの出現はウイル
スの感染期の開始を示し、また抗−ＨＢｅの消失は感染
期の終了を示す。
【００４８】本発明の方法により調製されたＨＢｅＡｇ
の抗原性を示すポリペプチドおよびそれにより生成され
た抗体もこれらの方法に使用して、ＨＢｅＡｇおよびＨ
ＢｅＡｇに対する抗体の存在を検出することができる。
これらポリペプチドおよびその抗体をそれぞれ単独で或
いはその他任意のＨＢＶ抗原および抗体と組合せて診断
用キット中に包装することができる。本発明のポリペプ
チドもしくは抗体を単独でまたは他のＨＢＶ抗原もしく
は抗体と組合せて使用するこれらの方法およびキット
は、ＨＢＶ感染保菌者の迅速かつ便利な同定およびＨＢ
Ｖ関連肝臓病の経過の予測を可能にする。
【００４９】たとえば、本発明の方法により製造された
ＨＢｅＡｇの抗原性を示すポリペプチドおよび抗体を、
ＨＢＶ抗原もしくは抗体の検出のため現在入手しうる免
疫学的診断試験、すなわち放射線免疫分析もしくはＥＬ
ＩＳＡ（酵素−結合免疫吸着分析）に使用することがで
きる。各分析においては、ＨＢｅＡｇ抗原性を示すポリ
ペプチドとこれらポリペプチドに対する抗体との両者を
使用する。これらの抗体は、実験動物に本発明のポリペ
プチドを適当な溶液たとえばフロイントのアジュバント
として注射し、次いでそのほぼ６週間後に動物を出血さ
せ、遠心分離により赤血球を除去しかつ得られた血清を
使用して製造される。２種の特定実施例を以下に示す。
【００５０】ＨＢｅＡｇを検出するための放射線免疫分
析 上記のように製造したＨＢｅＡｇに対する抗体を固相、
たとえば試験管の内側に付着させる。患者血清の試料
を、上記のように製造されかつ放射性妖素のような放射
性同位元素で標識したＨＢｅＡｇの抗原性を示すポリペ
プチドの既知量と共に試験管に加える。患者血清中のＨ
ＢｅＡｇは、ＨＢｅＡｇの抗原性を示す標識ポリペプチ
ドと競合して、ＨＢｅＡｇ抗体と結合する。過剰の液体
を除去し、試験管を洗浄し、そして放射能の量を計測す
る。陽性の結果、すなわち患者血清がＨＢｅＡｇを含有
することは試験管中に残存する低い放射能カウントによ
り示される。
【００５１】ＨＢｅＡｇに対する抗体を検出するための
ＥＬＩＳＡ マイクロ測定板を本発明により調製されたＨＢｅＡｇで
被覆し、これに患者血清の試料を加える。血清中に存在
するＨＢｅＡｇ抗体とＨＢｅＡｇとの相互作用を可能に
する培養期間の後、板体を洗浄する。半精製されたヒト
免疫グロブリンの注射により実験動物中に生成させ、次
いで酵素に結合させた抗ヒト抗体の調製物を加える。培
養して抗体−抗原反応を生ぜしめ、次いで板体を再洗浄
する。その後、酵素基質をマイクロ測定板に加え、酵素
を基質に作用させる時間にわたって培養し、そして最終
調製物の吸光度を測定する。吸光度における大きな変化
は、陽性の結果を示す。
【００５２】上述した放射線免疫分析およびＥＬＩＳＡ
の詳細は、本発明の方法によるＨＢｅＡｇの抗原性を示
すポリペプチドの製造が、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｃＡｇに対
する抗体、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇに対する抗体を
検出するための医療機関および研究室において既に日常
的に使用されている標準技術により、ＨＢｅＡｇおよび
ＨＢｅＡｇに対する抗体の検出を可能にすることを示し
ている。したがって、ＨＢｅＡｇの抗原性を示す実質的
に純粋なポリペプチドおよびその抗体の低価格かつ豊富
な供給源が、本発明の方法により可能になると共に、血
液供給センターおよび一般的医療機関がＨＢｅＡｇおよ
びＨＢｅＡｇに対する抗体を容易かつ日常的に検出する
ことを可能にし、かくしてＨＢＶの感染保菌者の正確な
同定が可能になり、さらにＨＢＶ関連肝臓病の経過の予
測が可能となる。
【００５３】以上、本発明の多くの具体例について説明
したが、この基本構成を変更させて、本発明の方法を利
用する他の具体例を提供しうることが明らかである。し
たがって、本発明は上記の特定実施例のみに限定されな
いことが了解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＨＢＶ−ＲＩ−１１のヌクレオチ
ド配列の１部を示し、さらにプラスミドｐＨＢＶ−ＲＩ
−１１により形質転換された宿主により発現された融合
蛋白質のアミノ酸配列の１部をも示す説明図であって、
この蛋白質は１１個の細菌性アミノ酸に融合されたＨＢ
ｃＡｇよりなり、このヌクレオチド配列およびその蛋白
質生産物を本発明の方法に使用してＨＢｅＡｇを製造す
ることができることを示すものである。
【図２】本発明の一方法で製造されたＨＢｅＡｇを使用
した種々の免疫拡散分析の状態を示す説明図である。
【図３】ＨＢＶ感染の経過とこの感染の種々の血清学的
指標の出現および濃度との間の大凡の関係を示す説明図
である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年６月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a1)Ｂ型肝炎ウイルス核抗原の抗原性を
    示すポリペプチドの発現を特徴とする細菌宿主の抽出物
    を調製し、(a2)前記抽出物を還元剤の存在下で還元剤耐
    性のプロテアーゼで消化することによって製造されるＢ
    型肝炎ウイルスｅ抗原の抗原性を示すポリペプチド、ま
    たは、(b1)Ｂ型肝炎ウイルス核抗原の抗原性を示すポリ
    ペプチドの発現を特徴とする細菌宿主の抽出物を調製
    し、この抽出物は約６０％の前記Ｂ型肝炎ウイルス核抗
    原からなり、(b2)前記抽出物を解離条件下で還元剤によ
    り処理することによって製造されるＢ型肝炎ウイルスｅ
    抗原の抗原性を示すポリペプチドであって、霊長類の血
    清ポリペプチドおよび霊長類の肝臓ポリペプチドを本質
    的に含まないことを特徴とするＢ型肝炎ウイルスｅ抗原
    の抗原性を示す少なくとも１種のポリペプチドを用いる
    ことを特徴とする血清試料中または肝臓組織中のＢ型肝
    炎ウイルスｅ抗原に対する抗体の検出または製造をする
    方法。
  2. 【請求項２】 (a1)Ｂ型肝炎ウイルス核抗原の抗原性を
    示すポリペプチドの発現を特徴とする細菌宿主の抽出物
    を調製し、(a2)前記抽出物を還元剤の存在下で還元剤耐
    性のプロテアーゼで消化することによって製造されるＢ
    型肝炎ウイルスｅ抗原の抗原性を示すポリペプチド、ま
    たは、(b1)Ｂ型肝炎ウイルス核抗原の抗原性を示すポリ
    ペプチドの発現を特徴とする細菌宿主の抽出物を調製
    し、この抽出物は約６０％の前記Ｂ型肝炎ウイルス核抗
    原からなり、(b2)前記抽出物を解離条件下で還元剤によ
    り処理することによって製造されるＢ型肝炎ウイルスｅ
    抗原の抗原性を示すポリペプチドであって、霊長類の血
    清ポリペプチドおよび霊長類の肝臓ポリペプチドを本質
    的に含まないことを特徴とするＢ型肝炎ウイルスｅ抗原
    の抗原性を示す少なくとも１種のポリペプチドに対する
    抗体。
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