SU1740418A1 - Рекомбинантна плазмидна ДНК pGCS1-39 С-концевых аминокислот вируса гепатита В, с экспонированным на его поверхности эпитопом р S1(20-68), способ ее конструировани и штамм бактерии Е.CoLI - продуцент кор-антигена, лишенного 39 С-концевых аминокислот вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности эпитопом pS1(20-68) - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии, биотехнологии . Целью изобретени   вл етс  получение кор-антигена вируса гепатита В человека, не обладающего сродством к нуклеиновым кислотам, и, в конкретном случае, получение химерных белковых структур, экспонирующих на поверхности кор-антигена, лишенного 39 С-концевых аминокислот, фрагмент участка preSIHBV x 20 по 68-ю аминокислоту . Сконструирован рекомбинантный ген HBCAg A- preSI (20-68), кодирующий синтез соответствующего белка, плазмида pGCSI-140 дл  его экспрессии, а также штамм-продуцент E.coli/pGSI-140/ реком- бинантной капсидной структуры НВсАд Д- НВVpreS 1(20-68), обеспечивающий выход конечного продукта в количестве не менее 26,7% от суммарного белка. 3 с.п.ф-лы, 3 табл.

Description

Изобретение относитс  к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии, биотехнологии .

Целью изобретени   вл етс  получение кор-антигена вируса гепатита В человека, не обладающего сродством к нуклеиновым кислотам, и, в конкретном случае, получение химерных белковых структур, экспонирующих на поверхности кор-антигена, лишенного 39 С-концевых аминокислот, фрагмент участка preS1 НВУс20-й по 68-ю аминокислоту .

Сконструирован рекомбинантный ген HBcAg A-pre S1 (20-68), кодирующий синтез соответствующего белка, плазмида pGCSI-140 дл  его экспрессии, а также штамм-продуцент E.coli (pGCSI-140) реком- бинантной капсидной структуры HBcAg Д- HBV preSI(20-68), обеспечивающий выход конечного продукта в количестве не менее 26,7% от суммарного белка E.coli.

Рекомбинантна  плазмида pGCS-140 состоит из следующих элементов: ДНК плазмиды рНВс 1315, котора  представл ет собой вариант плазмиды рНВсЗ, содержащей ген HBcAg с оптимизированным

VJ

Јь О

00

участком инициации трансл ции, но с му- тантным геном НВсАд, содержащим пол- илинкерную вставку по 144-й аминокислоте и предназначенным дл  внедрени  чужеродных последовательностей по этому участку , прот женность 6900 п.о.; фрагмент генома HBV из плазмиды рНВ320, соответствующий последовательности между сайтами рестрикции Mstlhgos и BamHl2053 и кодирующий участок preSI (20-68) прот женностью 150 п.о.

Размер плазмиды 7050 п.о., мол.м. 4,5 МД.

В состав ДНК рекомбинантной плазмиды pGCSI-140 вход т следующие гены: ген HBcAg A-preSI (20-68), обеспечивающий синтез конечного продукта; ген Ыа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.

Ген HBcAg A-preS 1(20-68) находитс  под контролем тандема промоторов Ptrp.

Плазмида pGCSI-140 амплифицируетс  при добавлении в среду хлорамфеникола, неконьюгативна.

Сущность способа конструировани  плазмиды pGCS(-140 состоит в том, что фрагмент гена preSI, именуемый HBVpreSI (20-68), прот женностью 150 п.о. внедр ют по сайтам рестрикции Clal (по кодону 144-й аминокислоты) в векторную плазмиду рНВс1315 с образованием рекомбинантно- го гена HBcAg A-preSI (20-68). В результате изменени  рамки считывани  вправо от внедренного фрагмента наводитс  терминирующий кодон и нуклеотидна  последовательность , кодирующа  39 С-концевых аминокислот HBcAg, не транслируетс .

Штамм- продуцент HBcAg A-preSI (20- 68) получают трансформацией клеток E.coli К802 рекомбинантной плазмидной ДНК pGCSI-140.

Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные,

Культуральные признаки: клетки растут на обычно используемых питательных средах , образуют колонии средней величины.

Физико-биохимические признаки: оптимальна  температура культивировани  - 37°С, оптимум рН 7,0- 7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота - минеральные соли, а также органические соединени  в виде пептона , триптона, аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам:устойчив к ампициллину, что обусловлено наличием плазмиды. Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждаетс  путем проверки устойчивости к ампициллину, а также путем выделени  и анализа плазмидных ДНК экспресс-методом .

Штамм депонирован в коллекции Центрального музе  промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-4975.

П р и м е р.1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pGCSI-140.

10 мкг плазмиды рНВс1315, выделенной стандартным методом, расщепл ют 10 ед, рестриктазы Cla I в 25 мкл раствора А, содержащего 10 тМ трис-HCI, рН 7,5,50 тМ

NaCI, 10 тМ MgCte и 1 тМ дитиотрейтол (ДТТ) в течение 2 ч. Рестриктазу инактиви- руют 15-минутным прогреванием при 65°С. После очистки на агарозном геле (на бумаге ДЕ-81) известным методом фрагмент ДНК с

мол.м. 4,42 МД (размером 6900 п.о.) раствор ют в 20 мкл Н20 (ДНК 1)

50 мкг плазмиды рНВ 320, полученной очисткой на оксиапатите, расщепл ют 25 ед. рестриктазы Bgl II и 25 ед. рестриктазы

Есо81 II (Mst II) в 250 мкл раствора Б, содержащего 10 тМ трис-HCI, рН 8,5, 10 тМ MgCl2 и 1 тМ ДТТ, в течение 3 ч при 37°С. После очистки на агарозном геле известным методом фрагмент Bgl II 2534 - Mstlhgos с

мол.м. 0,4 МД (размером 626 п.о.) раствор ют в 20 мкл Н20 (ДНК 2).

2 мкг ДНК 2 расщепл ют 2 ед рестриктазы Bam HI в 20 мкл раствора А в течение 2 ч при 37°С. Фрагмент Bam HI2053 Mstlligos размером 145 п.о. после очистки на 2 %-ном агарозном геле раствор ют в 10 мкл Н20(ДНКЗ).

Заполнение липких концов вектора и клонируемого фрагмента провод т совместно , дл  чего 0,1 мкг ДНК 1 и 0,05 мкг ДНК 3 инкубируют с 0,бед. ДНП-полимеразы E.coli (фрагмент Кленова) в 10 мкл раствора В, содержащего 50 тМ трис-HCI, рН 7,5,10 тМ MgCl2, 33 ju M dATP, dCTP, dTTP и dGTP, в

течение 1 ч при 12°С. ДНК-полимеразу инак- тивируют 15-минутным прогреванием при 65°С.

После заполнени  липких концов за- шивку вектора и клонируемого фрагмента провод т в 12 мкл раствора Всдобавлением 10 ед, Т4 ДНК-лигазы и АТР до конечной концентрации 500 /л М в течение 12 ч при 4°С. К реакционной смеси добавл ют 100 мкл клеток E.coli RRI, образованных 100 тМ CaCIa (конечна  концентраци  5х109 клеток/мл ) дл  трансформации клеток путем рестрикционного анализа и секвенирова- ни  плазмидной ДНК, выделенной экс- пресс-методом, Плазмида с ожидаемой рестрикционной картой и нуклеотидной последовательностью получает наименование pGCSI-140.

2.Штамм-продуцент E.coli K802 (pGCSI- 140). Выделение и очистка рекомбинантно- го белка HBcAg A-preSI (20-68).

Штамм-продуцент получают трансформацией клеток E.coli K802 рекомбинантной плазмидой pGCSI-140. Клетки выращивают в солевой среде М9 с добавкой, г/л: казами- новые кислоты 10, глюкоза 2, ампициллин 0,02, до оптической плотности 4-5. Клетки собирают центрифугированием и лизируют в трехкратном объеме буфера, содержащего 0,05 М трис-HCI, рН 8,0, 0,15 М NaCI, 0,1% тритон Х100, 0,005 М ЭДТА, при 4°С клетки подвергают трехкратному замораживанию- оттаиванию, добавл ют дезоксирибонукле- азу и MgCIa до конечной концентрации 20 мкг/мл и 10 тМ соответственно и инкубируют 30 мин при 4°С. Лизат осветл ют центрифугированием (10 ОООхд, 4°С). НВсАд A-preSI(20-68) очищают следующим образом , Лизат подвергают фракционированию сульфатом аммони . HBcAg A-preSI(20-68) собирают в осадке, полученном при 30% насыщени  сульфатом аммони , Осадок раствор ют в 0,04 М фосфате натри , рН 8,0, 0,15 NaCI, 0,1% тритоне Х100 до конечной концентрации белка 25 - 50 мкг/мл, и 6 - 7 мл этого раствора нанос т на колонку с Се- фарозой CL4B (2,1x75 см), уравновешенную тем же буфером, но без тритона Х100. Фракции , про вл ющие HBcAg-активность собирают и используют либо непосредственно, либо после концентрировани  переосаждением 50% сульфатом аммони .

3.Определение HBcAg-активности методом РИД.

Титр HBcAg определ ют с помощью радиальной иммунодиффузии.

Дл  этого готов т двукратные серийные разведени  клеточного лизата и титруют против анти-НВс антител человека. В качестве стандарта используют очищенный HBcAg, полученный из рекомбинантных бактерий (1 мг/мл).

Результаты титровани  активности методом РИД приведены в табл.1,

4.Определение preSI-активности методом иммуноблотинга. Мол.м. белка HBcAg

A-preSI (20-68).

Дл  иммуноблотинга клетки (6 мг) суспензируют в 100 мкл буфера дл  нанесени  образцов на полиакриламидный гель, содержащего 2 %-ный додеци л сульфат натри  (ДСН) и 2 %-ный / -меркаптоэтанол, и лизируют 2 мин прогреванием на кип щей вод ной бане. Полученные лизаты (2-4 мг/мл белка) нанос т на полиакриламидный градиентный гель (12 - 18%) размером 150x150x0,75 мм. Электрофорез провод т в

течение 15 ч при силе тока 7 тА. После электрофореза белки перенос т на нитроцеллюлозу . Фильтры инкубируют с моно- клональными анти-preSI антителами мыши

МА18/7 в разведении 1:500 на буфере TBS, содержащем 50 трис-HCI, рН 7,8, 150 тМ NaCI, 0,1 % тритон Х100, 1 % БСА, в течение 15 ч при 20°С. После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при

20°С с конъюгатом пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов мыши в разведении 1:200. Фильтры отмывают TBS (3 - 5 раз) и про вл ют диаминобензидином. Лизаты клеток штамма-продуцента обнаруживают при этом по вление специфических зон окраски, соответствующих белку с мол.м. 23.2 КД (или длиной 221 аминокислота ), что соответствует схеме конструировани . Контрольные л.изаты клеток E.coli K802

(рНВсЗ) таких зон не обнаруживают.

5.Электронно-микроскопическа  характеристика рекомбинантных капсидных структур HBcAg A-preS 1(20-68). Препараты очищенного белка HBcAg A-pre (20-68) готов т методом негативного контрастировани  с применением 1 %-ного уранилацетата и исследуют на электронном микроскопе при ускор ющем напр жении 80 кВ и инструментальном увеличении 100 000 раз. Белок HBcAg A-preSI (20-68) образует капсиды диаметром 25 нм.

6.Определение preSI-активности в составе капсидных структур HBcAg A-preSI(20- 68) методом энзимоиммунологического

анализа на твердой фазе.

В качестве твердой фазы используют полистироловые 96-луночные планшеты дл  иммунологических реакций. Очищенный белок HBcAg A-pre 51(20-68) развод т до концентрации 10 мкг/мл в 50 тМ МаНСОз - NaaCOa рН 9,5 и внос т в лунки планшетов - по 100 мкл в каждую, Инкубируют 16ч при 37°С, после чего раствор удал ют из лунок. планшеты высушивают. В лунки внос т моноклональные анти-preSI антитела мыши МА18/7 в разведении 1:5000 на буфере TBS. После инкубации в течение 2 ч при 37°С планшеты отмывают 5-6 раз дистиллированной водой и внос т по 100 мкл конъюгата

пероксидазы хрена с белком S.aureus в разведении 1:5000 на буфере TBS. После инкубации в течение 1 ч планшеты отмывают и провод т цветную реакцию. В лунки внос т по 100 мкл 0,25%-ного раствора ортофенилендиамина .2НС1 в 0,1 М цитрате натри  рН 5,0, 0,02% На02, инкубируют 30 мин при 20°С, реакцию останавливают добавлением 100 мкл 0,1 H.HCI. По вление коричневой окраски свидетельствует о наличии preSIактивности . Дл  количественной оценки активности измер ют оптическую плотность при 492 нм и определ ют величину P/N (та 6л .2).

Отсутствие реакции в отрицательном контроле (НВсАд) свидетельствует о специфичности св зывани  анти-preSI антител рекомбинантными капсидными структурами НВсАд Л-preSI (20-68),

7.Иммуноэлектронна  микроскопи  капсидных структур с использованием коллоидного золота.

Капсиды HBcAg A-preS 1(20-68) сорбируют на никелевой сеточке, покрытой форм- варовой пленкой, в течение 15 мин, Сеточку промывают 0,5 мл раствора PBS, содержащего 0,05% Твин 20 (PBS-Твин 20), и инкубируют 15 мин в 0,03 мл 0,1 %-ного раствора БСА в воде, промывают 0,5 мл PBS-Твин 20, инкубируют 15 мин в 0,03 мл раствора моно- клональных анти-preSI антител МА18/7 в разведении 1:10, промывают 0,5 мл PBS- Твин 20, инкубируют 20 мин в 0,03 мл антител кролика против иммуноглобулинов мыши (в разведении 1:5), промывают 0,5 мл PBS-Твин 20. Сеточку помещают на 1 ч в 0,03 мл раствора рА-Au, содержащего белок А, который конъюгирован с частицами коллоидного золота диаметром 8-10 нм, промывают 0,5 мл PBS-Твин 20 и затем 1 мл НаО. Капсиды окрашивают методом негативного контрастировани  0,15 мл 2 %-ного уранилацетата. Все операции выполн ютс  при 20°С. В случае поверхностной локализации соответствующих эпитопов капсиды на электронной микрофотографии окружены венчиком частиц коллоидного золота. В качестве отрицательного контрол  использованы капсиды НВсАд, не несущие эпитоп preS 1(20-68). Эти капсиды на образуют комплексов с коллоидным золотом.

8.Иммуногенна  активность рекомби- нантных капсид НВсАд Л-preS 1(20-68).

Определ ют иммуногенность, рекомбинантными капсидами HBcAg A-preSi(20-68) иммунизируют кроликов. Дл  этого смешивают 2 мг антигена, растворенного в 1 мл физиологического раствора PBS, с 1,25 мл полного адъюванта Фрейнда и получают гомогенную эмульсию. Антиген ввод т подкожно . Инъекции антигена повтор ют на 14- й и 21-й день и с 28-го дн  начинают брать кровь. Специфичность антител определ ют методом ИФА с использованием двух антигенов: НВсАд (дл  определени  анти-НВс антител), fr-preS (белок оболочки РНК-фага fr, несущий весь участок preS) - дл  определени  анти-preSI антител.

Титры антител на 28 день иммунизации

приведены в табл.3.

Claims (3)

1.Рекомбинантна  плазмидна  ДНК pGCSI-140 размером 7049 п.о.{4,52 Мд) кодирующа  кор-антиген, лишенный 39 С-концевых аминокислот вируса гепатита В, с экспонированным на его поверхности эпи- топом pSI(20-68), содержаща : ДНК плазми- ды рНВс 1315 размером 6900 п.о.; Bam Hl2053-Mstll 1908-фрагментДНКплазмимиды рН В320 размером 149 п.о., кодирующего участок preSI(20-68) вируса гепатита В, уникальные сайты рестрикции и их координаты: BamHI(O), Sphl(191); Sall(276); Nrul(599), Snal(1871), Afl N1(2098), Psbl(3236),

Scal(3471), Xbal(5176), гены, регул торные участки; ген HBcAg Л-pre 51(20-68), обеспечивающий синтез рекомбинантных капсидных структур НВсАд А-рге 31(20-68) (координаты 5087-5722); тандем промоторов Ptrp; ген Ыа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину координаты 2918-3778.

2.Способ конструировани  плазмидной ДНК pGCSI-140, заключающийс  в том, что

кодирующую последовательность участка preSI размером 149 п.о, вырезают из плазмидной ДНК рНВ320 по рестрикционным сайтам BamHl2053 и Mstlhgos с заполнением липких концов ДНК-полимеразой E.coli и

встраивают в плазмиду рНВс1315 по сайту Clal за 144-й аминокислотой гена НВсАд, что приводит к терминации трансл ции, трансформируют рекомбинантной ДНК штамм Escherichia coli и отбирают клоны,

содержащие целевую плазмиду.

3.Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-4975 - продуцент кор-антигена, лишенного , 39 С-концевых аминокислот вируса гепатита В с экспонированным на его

поверхности эпитопом preSI(20-68).

Таблица 1

Синтез HBcAg A- pre SI (20-68) в бактери х E.coli K802, несущих рекомбинантную плазмидную ДНК pGCSI-140

Иммунологическа  активность рекомбинантных антигенов

Иммуногенность химерных капсид HBcAg A- preSI (20-68)

Таблица 2

Таблица 3